CN103602592B - 一株纤维素降解真菌及其菌剂的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株纤维素降解真菌及其菌剂的制备和应用，本发明自泰山林地腐殖土中经人工富集、筛选得到一株，该菌株鉴定为草酸青霉菌（Penicillium oxalicum），命名为草酸青霉菌C2，该菌株具有较好的纤维素降解能力，产纤维素酶活力高，摇瓶发酵3d后滤纸纤维素酶活力达到132.26U/mL；利用草酸青霉菌C2菌株制备的分生孢子菌剂应用于蚕沙堆肥中，能够提高堆体温度、延长高温期，有助于降低含水率，促进有机质的分解、全氮相对含量的增加，降低C/N比和提高种子发芽指数，加速堆肥进程，提高腐熟效率和肥料质量；菌剂的制备方法工艺简单，成本低，利于工业化生产。

Description

一株纤维素降解真菌及其菌剂的制备和应用

技术领域

本发明涉及一株纤维素降解真菌及其菌剂的制备和应用，属于微生物技术领域。

背景技术

纤维素是自然界中含量最丰富的一类可再生能源物质，广泛存在于农作物秸秆、畜禽粪便、城市生活垃圾和造纸厂废水中。据报道，全世界每年通过光合作用产生的纤维素约高达4.0×10¹⁰吨，其中农作物秸秆产量约为22亿多吨，我国作为农业大国，农作物秸秆资源非常丰富，每年可达6.5亿吨以上，占世界秸秆总产量的20%～30%。但是，由于纤维素分子的结构复杂，自然降解过程极其缓慢，目前我国的纤维素类资源利用效率很低，除少部分用于造纸、建筑、纺织等行业外，其余大部分被当做燃料直接焚烧，或被随意堆积、丢弃，不仅浪费了资源，更造成了环境污染和生态破坏。

作为宝贵的可再生资源，纤维素的降解不仅在自然界的碳循环中起到重要作用，而且在很多方面都具有重要的潜在应用价值。研究表明，纤维素类物质可以被降解为葡萄糖，并进一步转化为生物燃料、菌体蛋白、优质饲料、食品等物质。因此，如果可以将这些农业废弃物大规模加以转化和充分利用，这不仅能缓解能源紧张问题，更能解决环境污染的难题。

蚕沙作为我国蚕桑生产的主要副产物之一，产量巨大且含有丰富的营养物质，是一种具有良好开发应用前景的资源。在蚕沙资源利用的诸多领域中，蚕沙的堆肥处理是目前应用最广泛且经济有效的方法。但是由于蚕沙中含有大量难以降解的纤维素，单纯依赖蚕沙中微生物降解难以达到预期效果。因此，寻找和开发高效纤维素降解微生物，成为纤维素资源能否高效利用的关键。环境中的纤维素降解菌可以通过分泌纤维素酶有效降解纤维素且不会对环境造成污染，具有其他处理方式不可替代的优点，应用前景广阔。目前，从环境中分离和选育纤维素酶高产菌株，挖掘纤维素酶产生菌资源，利用微生物的酶解作用，解决环境污染甚至是转化为能源已经成为国内外的研究热点之一。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一株纤维素降解真菌及其菌剂的制备和应用，可用于蚕沙的堆肥腐熟。

一株纤维素降解真菌，来源于泰山林地腐殖土，经人工富集、筛选得到。该菌株鉴定为草酸青霉菌（Penicillium oxalicum），命名为草酸青霉菌C2，菌落平坦，结成外壳，菌丝初为白色后逐渐变为暗绿色，分生孢子梗顶端形成扫帚状的分枝，分生孢子椭圆形，光滑。

一株草酸青霉（Penicillium oxalicum），已于2013年10月15日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.8335。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所邮编100101。

利用上述草酸青霉菌C2生产的微生物菌剂，其活性成分为草酸青霉菌C2分生孢子及其产生的纤维素酶。所述的微生物菌剂为固体粉剂。

草酸青霉菌C2分生孢子菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）种子液的制备：取PDA平板培养的草酸青霉菌C2菌株圆形菌块，接种液体PDA培养基中，30、℃200r/min振荡培养18h～20h作为纤维素降解菌C2种子液。

（2）发酵培养：将种子液按照相对固体培养基质量分数5%的接种量接种到产孢子固体培养基上，在相对湿度60%～80%条件下，28℃培养4～6d，将培养物自然风干后粉碎过筛，即得到草酸青霉菌C2分生孢子菌剂。

其中所述的培养基配方如下：

PDA培养基：马铃薯200.0g，(NH₄)₂SO₄1.0g，葡萄糖20.0g，牛肉膏5.0g，MgSO₄1.0g，KH₂PO₄0.6g，CaCO₃3.0g，琼脂15g（液体PDA培养基不加琼脂），蒸馏水1000mL；

产孢子固体培养基：麸皮40g，玉米粉20g，蔗糖5g，KNO₃1g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄0.1g，蒸馏水300mL。

所述的草酸青霉菌C2分生孢子菌剂中含草酸青霉菌C2的分生孢子数为(4.8～5.6)×10⁸个/g。

本发明还提供了该草酸青霉菌在蚕沙堆肥中的应用，能够加速堆肥进程，提高腐熟效率和肥料质量。

本发明具有以下优点：

1.草酸青霉菌C2具有较好的纤维素降解能力，对滤纸条进行5d的降解处理后滤纸条溃烂成团糊状。

2.该草酸青霉菌具有较好的产滤纸纤维素酶能力，液体发酵3d后滤纸纤维素酶活力达到132.26U/mL。

3.该草酸青霉菌生长迅速、发酵性状优良。

4.该种制备方法的发酵工艺简单、成本低，利于工业化生产。

5.该草酸青霉菌应用到蚕沙堆肥中，能够加速堆肥进程，提高腐熟效率和肥料质量。

附图说明

图1为该菌株的菌落、分生孢子及分生孢子梗形态观察图，图中A为菌落形态图，B为分生孢子形态图，C为分生孢子梗形态图；

图2为该菌株18S rDNA片段1%琼脂糖凝胶电泳结果，从图中可以看出，C2菌株18SrDNA片段长度约为600bp，符合常规的18S rDNA序列长度；

图3为利用18S rDNA同源性序列和邻接法构建的该菌株的系统发育树，从图中可以看出C2菌株与青霉属的遗传进化距离最近；

图4为分生孢子菌剂处理蚕沙堆肥温度的变化，从图中可以看出，实验组堆体第3天温度达到54℃进入高温期，最高温度达到65.5，℃高温期持续13d，在堆肥中试验组比对照组普遍高出5～9，℃说明接种分生孢子菌剂后，能够加速堆体升温，延长高温期。

图5为分生孢子菌剂处理蚕沙堆肥中的含水率变化，从图中可以看出，实验组含水率下降幅度较大，含水率降低了23.56%，大于对照组的含水率降低量19.24%；

图6为分生孢子菌剂处理蚕沙堆肥中总有机碳含量的变化，从图中可以看出，试验组总有机碳含量的下降幅度为13.03%，大于对照组下降的幅度10.53%；

图7为分生孢子菌剂处理蚕沙堆肥中全氮含量的变化，从图中可以看出，在堆肥过程中试验组的含氮量始终高于对照组，这说明接种该菌剂对于堆肥保氮具有一定的作用；

图8为分生孢子菌剂处理蚕沙堆肥中的C/N比的变化，从图中可以看出，试验组和对照组的碳氮比存在显著差异，这说明试验组加入C2菌剂能够加速堆肥腐熟进程；

图9为分生孢子菌剂处理蚕沙堆肥对种子发芽指数的影响，从图中可以看出，在堆肥第17天，试验组的种子发芽指数达到53.14%，堆肥基本腐熟，而对照组则在堆肥第21天，种子发芽指数才达到51.05%，比试验组晚了4d；试验组在堆肥第29天，种子发芽指数达到81.24%，说明产品已经完全腐熟，而对照组比实验组晚了12d才达到完全腐熟。

具体实施方式

本发明所涉及的培养基如下：

1.富集培养基：蛋白胨10.0g，CMC-Na10.0g，K₂HPO₄1.0g，Na₂CO₃5.0g,MgSO₄·7H₂O0.1g，FeSO₄·7H₂O0.015g，MnSO₄0.05g，酵母膏10g，蒸馏水1000mL，pH值6.0；

2.羧甲基纤维素培养基（CMC培养基）：CMC-Na15.0g，NH₄NO₃1.0g，酵母膏1.0g，MgSO₄·7H₂O0.5g，KH₂PO₄1.0g，蒸馏水1000mL，琼脂15g；

3.纤维素刚果红培养基：K₂HPO₄0.5g，微晶纤维素1.88g，MgSO₄0.25g，明胶2.0g，刚果红0.2g，琼脂14.0g，蒸馏水1000mL，琼脂15g；

4.赫奇逊培养基：KH₂PO₄1.0g，CaCl₂0.1g，MgSO₄·7H₂O0.3g，NaCl0.1g，FeCl₃0.01g，NaNO₃2.5g，pH7.2～7.3，蒸馏水1000mL；

5.发酵产酶培养基：CMC-Na0.5g，蛋白胨1.0g，麸皮3.0g，NaCl0.5g，KH₂PO₄0.1g，MgSO₄·7H₂O0.02g，(NH₄)₂SO₄0.3g，蒸馏水1000mL；

6.产孢子固体培养基：麸皮40g，玉米粉20g，蔗糖5g，KNO₃1g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄0.1g，蒸馏水300mL。

本发明中所涉及到的草酸青霉菌C2菌株种子液制备方法如下：

用打孔器打取PDA培养基平板培养的草酸青霉菌C2菌株圆形菌块（直径5mm）2块，接种到50mL液体PDA培养基中，30、℃200r/min振荡培养18～20h作为种子液。

实施例一

纤维素降解菌的富集与分离

取5g采集的泰山林地腐殖土土样加入到45mL富集培养基中，在30、℃180r/min下振荡培养3d后，移取5mL培养液至另一盛有新鲜富集培养基的三角瓶中继续培养3d。

取富集后的培养液，用无菌水稀释成10^-4、10^-5、10^-6、10^-74个浓度梯度。用移液器吸取四种浓度的土壤稀释液各100μL涂布在CMC培养基平板上，每个浓度进行3次重复涂布试验，28℃恒温培养2d，从培养基上挑取单菌落于CMC培养基平板上划线分离纯化。

将CMC培养基平板上纯化得到的菌株转接于纤维素刚果红培养基平板上，每个菌株3个重复，28℃培养2d，能分解纤维素的菌株周围会出现清晰的透明圈，根据纤维素刚果红平板透明圈直径（D）与菌落直径（d）的大小，初步判断菌株降解纤维素能力的大小。经过多次重复试验，获得一株透明圈直径最大且生长迅速的菌株，命名为草酸青霉菌C2。

实施例二

1.滤纸条降解试验

取六个250mL的锥形瓶，分别编号为1～6号；其中1～3号锥形瓶中分别放入1cm×6cm的滤纸条，各加入50mL赫奇逊培养基，并分别接种1mL纤维素降解菌C2的种子液作为试验组；4～6号锥形瓶中分别放入1cm×6cm的滤纸条，各加入50mL赫奇逊培养液而不接种纤维素降解菌C2的种子液作为对照组；将六个锥形瓶均置于30℃恒温摇床，200r/min下振荡培养5d，目测1～3号锥形瓶中滤纸条溃烂成团糊状。

2.滤纸纤维素酶活力的测定

本发明选用3,5-二硝基水杨酸（DNS），在碱性条件下，与还原糖反应生成有色化合物，通过分光光度计进行比色测定，确定低分子糖的量的方法来测定纤维素酶的活力。DNS黄色试剂在碱性条件下与还原糖共热反应生成的棕红色氨基化合物3-氨基-5-硝基水杨酸为比色法的测定基础物。

粗酶液的制备：取草酸青霉菌C2菌株种子液1mL加入到发酵产酶培养基中，28，℃180r/min振荡培养3d，取5mL培养液于锥形瓶中，加入45mL柠檬酸钠缓冲液（柠檬酸10.5g，氢氧化钠5.0g，蒸馏水1000mL），200r/min震荡30min后，5000r/min离心10min，收集上清液即为粗酶液，4℃下保存备用。

滤纸纤维素酶活力测定：在25mL具塞试管中加入滤纸条，再加1.0mL的柠檬酸盐缓冲 液浸润滤纸条，置于50水℃浴锅中水浴平衡10min，然后加入0.5mL已适当稀释的粗酶液和5mL的水，电磁振荡3s～5s，50℃水浴中保温60min，加入2mL的DNS试剂，然后在沸水浴中煮沸5min，冷却至室温，用水定容至25mL,以0μg/mL的葡萄糖标准溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定吸光度A1，同时测定酶液空白样的吸光度A2，对照标准曲线计算酶活力。在50，℃pH5.5条件下，将1mL粗酶液在1min内降解滤纸产生1μg葡萄糖作为1个酶活力单位，以（U/mL）表示。

滤纸纤维素酶活性计算公式：

$X=\frac{[(A1-A2)\×K+b]\×D}{t}$

式中：

X——样品纤维素酶活力(U/mL);

A1——酶反应液的吸光度；

A2——酶空白样的吸光度；

K——标准曲线的斜率；

b——标准曲线的截距；

D——试样的总稀释倍数；

t——反应时间（min）。

经测定，纤维素降解菌C2菌株粗酶液的纤维素酶活力达到132.26U/mL，高于许多已经报道的真菌菌株，且远超过国家农业部颁布的《微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求》中对于纤维素降解菌产纤维素酶活力在70U/mL以上的规定，说明该菌具有较好的产纤维素酶能力。

实施例三

纤维素降解菌C2的鉴定

1.菌落特征和菌体形态特征

（1）菌落特征

该菌株在PDA平板上生长迅速，菌丝浓密，菌落平坦，结成外壳，菌丝初始时为白色，随着培养时间的增加，菌丝逐渐变为暗绿色，培养基背面为淡黄色；在CMC平板上生长较慢，菌丝稀疏，菌丝体也较短，菌丝平坦，菌丝初始时为白色，随着培养时间的增加，菌丝逐渐变为蓝绿色（见图1）。

（2）菌体形态特征

营养菌丝有隔膜，分生孢子梗从菌丝垂直生出，顶端生排列成扫帚状的间枝，小梗7～9个，（11.5～14.8）μm×（3.0～3.4）μm，分生孢子椭圆形，光滑，大小（4.8～6.0）μm×（3.2～ 3.9）μm(见图1)。

2.18S rDNA序列及同源性分析

提取纤维素降解菌C2菌株基因组DNA，采用真菌核糖体DNA转录间隔区(ITS)通用引物ITS1和ITS4进行18S rDNA片段扩增；引物序列为：ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′），ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）；PCR反应体系（50μL）：10×PCR Buffer5.0μL，MgCl₂(25m mol/L)5.0μL，dNTP（10m mol/L）2μL，Taq酶（5U/μL）0.4μL，引物ITS1、ITS4各1μL，模板DNA1μL，ddH₂O34.6μL；反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环，然后72℃延伸10min，4℃终止反应；利用引物ITS1/ITS4扩增得到的C2菌株18S rDNA序列长度约为600bp（图2），符合常规的18S rDNA序列长度，回收该片段进行测序，序列长度为595bp，其18S rDNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

将C2菌株的18S rDNA测序结果在GenBank数据库中进行Blast比对，从结果中选取10株与测定菌株序列相似性高的菌株进行系统发育分析，用Mega4.0软件采取Neighbor-joining法构建系统进化树（见图3）。由图可以看出，C2菌株与青霉属的遗传进化距离最近，与已知菌株草酸青霉菌（Penicillium oxalicum GU183174）的18S rDNA同源性达到99%。结合其菌体形态和菌落特征观察结果，将其鉴定为青霉属（Penicillium sp.）。

实施例四

分生孢子菌剂的制备及在蚕沙堆肥中的应用

1.分生孢子菌剂的制备

用打孔器打取PDA培养基平板培养的草酸青霉菌C2菌株圆形菌块（直径5mm）2块，接种到50mL液体PDA培养基中，30、℃200r/min振荡培养18～20h作为种子液。将种子液按照相对产孢子固体培养基质量比5%的接种量接种到产孢子固体培养基上，在相对湿度60%～80%条件下，28℃培养4～6d，将培养物自然风干后粉碎过筛，即得到草酸青霉菌C2菌株的分生孢子菌剂，采用稀释涂布平板法测得制备的分生孢子菌剂中草酸青霉菌C2的分生孢子含量为(4.8～5.6)×10⁸个/g。

2.分生孢子菌剂在蚕沙堆肥中的应用

设置蚕沙四份进行堆肥试验，每份蚕沙100kg，并将其含水量调整至60%；将两份蚕沙中分别接种相对蚕沙质量分数0.3%的草酸青霉菌C2菌株分生孢子菌剂作为为试验组（即处理T₁、处理T₂）；将另两份蚕沙中分别添加蚕沙质量分数为0.3%的灭活C2菌株分生孢子菌剂作为对照组（即CK₁、CK₂）；每组堆体均4d翻堆一次。

温度测定时，选择堆体中心处为测温点，测点深度为30cm，每天9:00和16:00进行温 度测定，分别取试验组和对照组温度的平均值作为堆肥温度，同时测定环境温度（见图4）。结果表明，接种C2菌株分生孢子菌剂后，能够加速堆体升温，第3天温度达到54℃进入高温期，最高温度达到65.5，℃高温期持续13d，在升温期和高温期中试验组比对照组普遍高出5～9，℃试验组和对照组堆肥的温度存在显著差异（p<0.05）；含水率测定采用常压干燥法，结果显示（见图5），试验组和对照组的堆体含水率均呈下降趋势，在高温期含水率下降最快，这是因为高温期有利于水分蒸发；实验组含水率下降幅度较大，含水率降低了23.56%，对照组的含水率降低了19.24%。统计分析表明，两组处理堆肥的含水率存在极显著差异（p<0.01），这与试验组中添加的C2菌剂能够加速堆体升温和延长高温时间有关。

每隔四天对两组堆肥（四个堆体）分别采样一次，采样时，取堆体四周4点和顶部中心处为采样点，采样深度25～35cm，各点采样量100g，混匀后进行参数测定（数值均采用各组的平均值）。有机碳测定采用重铬酸钾容量法，全氮测定采用半微量凯氏定氮法。结果显示，试验组和对照组的总有机碳含量都随着堆肥的进行而降低（见图6），试验组总有机碳含量的下降幅度为13.03%，对照组下降幅度为10.53%，经统计分析表明，试验组和对照组有机碳含量差异极显著（p<0.01），这说明C2菌剂在堆肥过程中促进了蚕沙中有机物的快速分解。试验组和对照组的全氮含量变化趋势基本一致（见图7），统计分析表明，实验组和对照组堆肥的含氮量差异不显著（p>0.05），但是试验组的含氮量始终高于对照组，这说明接种C2菌剂对于堆肥保氮具有一定的作用。随着堆肥进行中有机物不断的分解和全氮相对含量不断的上升，C/N比不断下降，最后试验组和对照组的C/N比分别为13.5和14.7，都基本腐熟。但是试验组C/N比下降更快，在第25天降到20以下，对照组在第29天才降到20以下，比试验组晚了4d（见图8）。试验组和对照组的碳氮比存在显著差异（p<0.05），这说明试验组加入C2菌剂能够加速堆肥腐熟进程。

在进行种子发芽指数测定时，取20g堆肥鲜样加入到200mL蒸馏水中，充分振荡后浸提过滤。取6mL滤液，加入到铺有滤纸的培养皿中。每个培养皿中点播20粒饱满的白菜种子，黑暗培养48h后，计算发芽率，测定根长。每个处理重复3次，对照为蒸馏水。种子发芽指数（GI）的计算方法为种子发芽指数存在极显著差异，在堆肥第17天，试验组的种子发芽指数达到53.14%，堆肥基本腐熟，而对照组则在堆肥第21天，种子发芽指数才达到51.05%，比试验组晚了4d；试验组在堆肥第29天，种子发芽指数达到81.24%，说明产品已经完全腐熟，而对照组比实验组晚了12d才达到完全腐熟（见图9）。

从堆体外观观察，试验组和对照组堆体体积在堆肥前后体积都有所下降，试验组的堆体体积减少约30%，对照组堆体体积减少量小于试验组，约20%。从颜色上看，试验组的堆体 外观干爽，质地松散、均匀，且由于真菌的大量生长呈现灰白色；而对照组则相对潮湿，呈灰黑色。在堆肥过程初期，试验组和对照组堆肥都有臭味产生，随着堆肥的进行试验组的臭味逐渐减轻并消失，后期有桑叶的香味及泥土气息；对照组在堆肥过程中一直有臭味产生，且堆肥过程中产生大量的蝇蛆。以上结果表明，添加C2菌株后能够明显加速堆肥进程，提高腐熟效率和肥料质量。

Claims (3)

1.一株保藏号为CGMCC NO.8335的草酸青霉菌C2(Penicillium oxalicum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；其18S rDNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.利用如权利要求1所述的草酸青霉菌C2制备分生孢子菌剂的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)种子液的制备：用打孔器打取PDA平板培养的C2菌株圆形菌块两块，接种到50mL液体PDA培养基中，28～30℃、180～220r/min振荡培养18～20h作为种子液；

(2)发酵培养：将种子液按照相对产孢子固体培养基质量分数5％的接种量接种到产孢子固体培养基上，在相对湿度60％～80％条件下，28℃培养4～6d；将培养好的物料自然风干后粉碎过筛，即得到草酸青霉菌C2菌株的固体孢子菌剂；

所述的产孢子固体培养基组分为：麸皮40g，玉米粉20g，蔗糖5g，KNO₃1g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄0.1g，蒸馏水300mL。

3.根据权利要求2所述方法制备的草酸青霉菌C2分生孢子菌剂在蚕沙堆肥腐熟中的应用。