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CN103608450A - 基因工程改造的代谢木糖的微生物 - Google Patents

基因工程改造的代谢木糖的微生物 Download PDF

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CN103608450A CN201280022031.6A CN201280022031A CN103608450A CN 103608450 A CN103608450 A CN 103608450A CN 201280022031 A CN201280022031 A CN 201280022031A CN 103608450 A CN103608450 A CN 103608450A
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Abstract

本发明提供了使用木糖作为固定碳源来培养产油微生物的方法。还提供了经过了基因工程改造以便代谢作为固定碳源的木糖以允许其将木糖转化成油的微生物。本发明所提供的方法的特定优点包括通过利用木糖的微生物发酵方法来生产油而不是生产醇。

Description

基因工程改造的代谢木糖的微生物
相关申请的交叉引用
根据美国法典35篇119条(e)款，本申请要求享有2011年5月6日提交的美国临时专利申请号61/483,550和2011年6月15日提交的美国临时专利申请号61/497,501的权益。这些申请中的每一个都以引用的方式整体并入本文。
序列表引用
本申请包括如详述结尾处所示的序列表。
政府利益
本发明在加利福尼亚州政府的支持下在加利福尼亚州能源委员会授权号PIR-08-018下完成。所述能源委员会享有本发明的某些权力。
发明领域
本发明涉及产油微生物中木糖代谢途径的表达以允许它们代谢木糖以便生产脂类或其它有用的生物质，并且涉及由所述生物质生产的油类化学品、食品、燃料以及其它产品。
发明背景
在生物技术中一个重要且困难的挑战在于释放纤维素材料中碳捕获的巨大潜能用于转化成有价值的物质如液体燃料、化学品、食品和其它产品。一个特定的挑战涉及使用通常发现于解聚的的半纤维素中的木糖作为微生物异养培养的碳源。尽管在使用酵母来将木糖用于生产乙醇方面已做了很多工作，但是大多数酵母菌株不能利用木糖抑或仅能非常低效地利用木糖(参见Jeffries,2006,Curr.Op.Biotech.17:320-326；和Wang等,2004,Biotechnol.Lett.26(11):885-890)。
某些产油微生物(例如，产油酵母和产油微藻)能够使固定碳能源转化成更高价值的产品，如甘油三酯、脂肪酸、碳水化合物以及蛋白质。此外，微藻自身可以作为食品来源体现价值。例如，已对产油微藻的某些物种进行了基因工程改造以生产“调制油”，这意味着其甘油三酯含量显示出脂肪酸链长度和饱和度的分布相对于它们所来源的品种发生了改变。参见PCT公布号2008/151149、2009/126843、2010/045358、2010/063031和2010/063032以及PCT申请号US11/038,463和US11/038,464。
使用产油微生物将木糖转化成有意义量的脂类和其它产品的能力将具有重要的环境意义，因为它可降低我们对化石燃料的依赖并降低微生物油的成本。
发明概述
一方面，本发明提供了一种植物界的微生物，所述微生物包含可操作以产生活性木糖代谢途径酶的重组核酸。在一些情况下，所述微生物在基本上由木糖组成的碳源上培养时能够增加细胞数量或产生脂类。在一些情况下，所述微生物将木糖转化成甘油三酯。在一些情况下，所述微生物在使用葡萄糖作为碳源来培养时能够积累按干细胞重量计10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。在一些情况下，所述微生物在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。在一些情况下，所述微生物在作为碳源的葡萄糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少50%的甘油三酯并且在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少20%的甘油三酯。在一些情况下，所述微生物在氮限制条件下在60%为葡萄糖且40%为木糖的碳源上培养，如通过同位素示踪所测量，这些细胞产生其中碳原子的至少5%、10%、20%、30%、40%、或50%来源于木糖的碳原子的脂类。在一些情况下，所述微生物在少于或等于21天、14天或7天中在具有2.5%木糖作为唯一碳源的培养基中能够消耗至少90%的木糖。
在一些情况下，所述重组核酸可操作以编码以下一种或多种：活性木糖转运体、木酮糖-5-磷酸转运体、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖醇脱氢酶或木糖还原酶。在一些情况下，所述重组核酸编码可操作地连接有质体靶向信号序列的木酮糖-5-磷酸转运体并且其中所述木酮糖-5-磷酸转运体可操作以转运木酮糖-5-磷酸到质体中。在一些情况下，所述重组核酸可操作以编码(a)具有质体靶向信号序列以便使木酮糖-5-磷酸转运到质体中的木酮糖-5-磷酸转运体蛋白、(b)木酮糖激酶以及(c)木糖异构酶抑或木糖醇脱氢酶与木糖还原酶二者。
在一些情况下，所述微生物属于绿色植物亚界(subkingdomViridiplantae)。在一些情况下，所述微生物属于绿藻下界(infrakingdomChlorophyta)或绿藻门(phyla Chlorophytae)、属于利藻亚门(subphylumTetraphytina)、四胞藻纲(class Trebouxiophyceae)或者小球藻目(orderChlorellale)。在一些情况下，所述微生物属于小球藻属(genus Chlorella)或原藻属(genus Prototheca)。在一些情况下，所述微生物属于桑椹形原藻或原壳小球藻种。
在一些情况下，所述微生物进一步包含可操作以改变由微生物产生的脂类的脂肪酸特性的重组修饰。在一些情况下，所述重组修饰包含编码活性酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去饱和酶或者可操作以减少或消除酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去饱和酶的外源基因。
另一方面，本发明提供了一种用于生产微生物生物质或者生产由生物质产生的产品的方法，其中所述方法包括如上文或本文所讨论的，在包含木糖的培养基中异养地培养重组微生物以便将木糖转化成微生物生物质。在一些情况下，所述微生物生物质包含微生物脂类。在一些情况下，所述脂类用于制造选自由以下组成的组的产品：化学品、润滑剂、清洁剂、燃料、食用油以及化妆品成分。在一些情况下，所述产品是选自生物柴油或可再生柴油的燃料。
在一些情况下，所述培养基包含多于50%为木糖的碳源。在一些情况下，所述碳源的多于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%为木糖。
另一方面，本发明提供了一种由如上文或本文所讨论的任何微生物生产或者通过上文或本文所讨论的任何方法生产的天然油。
另一方面，本发明提供了由上文所讨论的天然油生产的油类化学品、食用油、燃料或其它产品。
另一方面，本发明提供了利用木糖作为碳源的重组产油微生物。在一个实施方案中，所述产油微生物是微藻、产油酵母、产油真菌或产油细菌。在另一个实施方案中，所述重组微生物是微藻细胞，包括但不限于原藻属细胞，其包含允许细胞利用或者更有效地利用木糖作为碳源的一个或多个外源基因。在一些实施方案中，所述细胞是桑椹形原藻、克鲁格尼原藻(Prototheca krugani)、大型原藻(Prototheca stagnora)或小型原藻(Protothecazopfii)种的品种，并且在其它实施方案中，所述细胞具有与SEQ ID No:1至9中的一个或多个具有至少70%、75%、80%、85%或95%核苷酸同一性的23S rRNA序列。所述外源基因包含可操作地连接有启动子的编码序列，并且在一些实施方案中，所述启动子是来自原藻属物种的内源性基因。在另外的实施方案中，所述编码序列编码选自由以下组成的组的蛋白质：氧化还原酶途径蛋白、木糖异构酶途径蛋白、木糖易位体蛋白和木糖转运体蛋白。
在各种实施方案中，所述微藻细胞包含允许细胞利用或者更有效地利用木糖作为碳源的一个或多个外源基因。例如，本发明的微藻细胞包括已经过工程改造以包含以下的那些细胞：(i)编码木糖异构酶途径蛋白的一个或多个基因；或者(ii)编码氧化还原酶途径蛋白的一个或多个基因；或者(iii)编码木糖异构酶途径蛋白的一个或多个基因；(iv)编码木糖转运体蛋白的一个或多个基因；或者(v)编码木糖易位体蛋白一个或多个基因；或者(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)的组合。在一个实施方案中，所述微生物细胞经过工程改造以表达木糖转运体蛋白和木糖异构酶途径蛋白。在另一个实施方案中，所述微生物细胞经过工程改造以表达木糖转运体蛋白和氧化还原酶途径蛋白。在又一个实施方案中，所述微生物细胞经过工程改造以表达木糖转运体蛋白、氧化还原酶途径蛋白和木糖异构酶蛋白。在另一个实施方案中，所述微生物细胞经过工程改造以表达木糖转运体蛋白、氧化还原酶途径蛋白和木糖易位体蛋白。在另一个实施方案中，所述微生物细胞经过工程改造以表达木糖转运体蛋白、木糖异构酶途径蛋白和木糖易位体蛋白。在另一个实施方案中，所述微生物细胞经过工程改造以表达木糖转运体蛋白、木糖异构酶途径蛋白、木糖异构酶途径蛋白和木糖易位体蛋白。
在本发明的一些实施方案中，重组产油微生物包含编码选自GPT-A-XPT(SEQ ID NO:45)、GPT-F-XPT(SEQ ID NO:47)或S106SAD-XPT(SEQ ID NO:49)的木糖易位体蛋白的第一外源基因、编码选自SUT1(SEQ ID NO:37)、GXS1(SEQ ID NO:39)、XLT1(SEQ ID NO:43)或同向转运体(SEQ ID NO:41)的木糖转运体蛋白的第二外源基因、编码选自XylA(SEQ ID NO:15)或XYL3(SEQ ID NO:51)的氧化还原酶途径蛋白的第三外源基因以及编码选自XYL1(SEQ ID NO:35)、XYL2(SEQ IDNO:50)或XYL3(SEQ ID NO:51)的木糖异构酶途径蛋白的第四外源基因。
在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XylA、XYL3、SUT1和GPT-F-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XylA、XYL2、XYL3、XLT1和S106SAD-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XylA、XYL1、XYL3、XLT1和S106SAD-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XylA、XYL1、XYL3、GXS1和GPT-A-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XYL1、XYL2、XYL3、同向转运体和GPT-F-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XYL1、XYL2、XYL3、GXS1和GPT-F-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XYL2、XYL3、同向转运体和S106SAD-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XYL2、XYL3、XLT1和S106SAD-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油包含编码XYL2、XYL3、GXS1和GPT-A-XPT的外源基因。
在一些情况下，在包含多于50%为木糖的碳源的培养基中繁殖或培养重组产油微生物。在一些情况下，在包含多于55%、多于60%、多于65%、多于70%、多于75%、多于80%、多于85%、多于90%、多于95%为木糖的碳源的培养基中繁殖或培养所述微生物。在一些情况下，在包含木糖作为唯一碳源的培养基中繁殖或培养所述微生物。在一些情况下，所述微生物在包含多于50%为木糖的碳源的培养基中或者在包含木糖作为唯一碳源的培养基中繁殖或培养时，产生由在包含葡萄糖作为唯一碳源的培养基中进行繁殖或培养并且缺乏一个或多个外源基因的类似微生物细胞所产生的脂类的至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%或至少60%。
除非另外指出，否则上文和本说明书通篇所提及的编码指定蛋白质的外源基因是指可操作以编码指定蛋白质的基因。
本发明的另一个实施方案是通过在木糖存在下繁殖或培养重组产油微生物而产生的微生物脂类组合物。在一个实施方案中，在包含木糖的纤维素材料存在下繁殖和/或培养本文所讨论的重组产油微生物。任选地，所述纤维素材料可进一步包含葡萄糖和蔗糖。所述微生物脂类组合物是通过裂解所述微生物细胞并分离所述油来产生。
发明详述
I.定义
“活性”是指在细胞中具有功能的核酸。例如，用于驱动抗生素抗性基因以赋予微藻抗生素抗性的启动子在微藻中具有活性。
“面积百分比”是指在实验期间产生的色谱峰、光谱峰和其它峰的面积百分比的测定。峰的曲线下面积和特定峰的面积百分比的测定通常由本领域的技术人员来完成。例如在其中将样品中的脂肪酸分子转化成为脂肪酸甲酯(FAME)的FAME GC/FID检测方法中，与其它任何脂肪酸如C14:1相比，对于14个碳原子的饱和脂肪酸(C14:0)观察到单独的峰。每种FAME的峰面积与其在混合物中的百分含量是成正比的，并且其可以基于样品中存在的所有峰的总和来计算(即[特定峰下面积/所有被测峰的总面积]×100)。当涉及本发明的油类和细胞的脂类特性时，“C8-C14含量为至少4%”是指细胞中或者提取的甘油脂组合物中总脂肪酸的至少4%具有包括8、10、12或者14个碳原子的链长度。
“生物柴油”是利用生物学方法产生的脂肪酸烷基酯，其适于在柴油发动机中用作燃料。
“生物质”是通过细胞生长和/或繁殖产生的物质。生物质可以包含细胞和/或胞内内含物以及胞外物质，其包括但不限于由细胞分泌的化合物。
“生物反应器”是封闭或者半封闭腔体，细胞培养于其中，任选地以悬浮形式。
“纤维素材料”是纤维材料的消化产物，其通常包括葡萄糖和木糖(例如来自半纤维素)，以及任选地另外的化合物(例如二糖、寡糖、木质素、糠醛和其它化合物)。纤维素材料来源的非限制性实例包括甘蔗渣、甜菜浆、玉米秸秆、木片、锯末和柳枝稷。
“表达载体”或者“表达构建体”或者“质粒”或者“重组DNA构建体”是指通过人为干涉制备的核酸，包括利用使得宿主细胞中特定核酸进行转录和/或翻译的一系列特定核酸元件通过重组方法或者直接的化学合成来制备。表达载体可以是质粒、病毒或者核酸片段的一部分。表达载体通常包含需要转录的核酸，其与启动子可操作地连接。
“外源基因”是编码被引入(“转化”)到细胞中的RNA和/或蛋白质表达的核酸。经转化的细胞可以被称为重组细胞，其中可以引入额外的外源基因。相对于被转化的细胞，外源基因可以来源于不同物种(因而是异源的)，或者来源于相同物种(因而是同源的)。因此，外源基因可以包括相对于基因的内源拷贝在细胞基因组中占据不同位置或者处于不同控制下的同源基因。外源基因可以在细胞中存在多于一个拷贝。外源基因可以通过插入基因组或者作为附加分子存在于细胞中。
“外源提供”是指提供到细胞培养物的培养基中的分子。
“脂肪酸特性”应意指脂肪酸就链长度和/或饱和型态而言在细胞和来源于细胞的油中的分布。在此上下文中，饱和型态可包括饱和酸相对于不饱和酸的指标或者在细胞的各种脂肪酸中的双键位置分布的更详细分析。
“固定碳源”是一种含碳分子，通常是有机分子，其在环境温度和压力下以固体或者液体形式存在于培养基中，可以被培养于培养基中的微生物使用。
“异养培育”和其变体如“异养培养”和“异养发酵”是指在固定碳源存在下对生长的有意促进(细胞大小、细胞含量和/或细胞活性增加)。通常，异养培养在没有光的情况下进行。然而没有光对于异养培养来说不是必须的。在没有光的情况下培养意指在完全没有或者近似完全没有光的情况下培养微生物细胞。
“脂类产率增加”是指微生物培养物产量增加，例如通过增加每升培养物的细胞干重、增加生产脂类的细胞的百分比或者增加每单位时间内每升培养物体积的脂类总量。
“可操作地连接”是两个核酸序列之间的功能性连接，所述核酸序列例如控制序列(通常是启动子)和相连序列(通常是编码蛋白的序列，也被称为编码序列)。如果启动子可以介导外源基因转录，那么启动子与外源基因可操作地连接。
“微藻”是含有叶绿体和或者质体并且任选地能够进行光合作用的真核微生物，或者是能够进行光合作用的原核微生物。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光能自养生物以及完全依靠固定碳源生存的异养生物。微藻包括细胞分裂后即刻与姐妹细胞分离的单细胞生物(例如衣藻(Chlamydomonas))以及例如团藻(Volvox，两种不同细胞类型简单多细胞光合微生物)的微生物。微藻包括例如小球藻、杜氏藻(Dunaliella)和原藻的细胞。微藻还包括显示细胞-细胞粘附的其它光合微生物，例如阿格门氏藻(Agmenellum)、鱼腥藻(Anabaena)和桑椹藻(Pyrobotrys)。微藻还包括丧失进行光合作用的能力的专性异养微生物，例如某些双鞭甲藻和原藻属中的物种。
“微生物(Microorganism)”和“微生物(microbe)”是用显微镜可以看见的单细胞生物体。
“天然油”应主要意指从生物体中获得的甘油三酯油，其中所述油还没有经过与另外的天然油或合成油混合或者没有经过分馏以便大致上改变所述甘油三酯的脂肪酸特性。在此，术语“分馏”意指以相对于由生物体产生的特性(然而已完成)来改变其脂肪酸特性的方式从油中移除物质。天然油包含了从生物体中获得的这种油，其中所述油已经过最低程度的处理，包括精炼、漂白和/或脱胶，这大致上没有改变其甘油三酯特性。天然油还可以为“非酯交换型天然油”，这意指天然油没有经过一个过程，在所述过程中脂肪酸的与甘油的酰基连接已重新分布并且脂肪酸基本上保持与从生物体中回收时相同的结构。
提及两种蛋白质或者基因时的“天然共表达”意指蛋白质或者其基因天然共表达于其来源的组织或者生物体中，例如由于编码这两种蛋白的基因处于共同调控序列的控制下，或者由于其响应于相同刺激物而表达。
“氧化还原酶途径”是能够经由木糖醇和木酮糖中间体将木糖转化成木酮糖5-磷酸的蛋白质和/或编码所述蛋白质的基因，其包括但不限于木糖还原酶(将木糖转化成木糖醇)、木糖醇脱氢酶(将木糖醇转化成木酮糖)以及木酮糖激酶(将木酮糖转化为木酮糖5-磷酸)。说明性氧化还原酶途径基因包括但不限于来自树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的XYL1、XYL2和XYL3基因。
“启动子”是指导核酸转录的核酸控制序列。本文中使用的启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，在II型聚合酶启动子的情况下如TATA元件。任选地，启动子还包括远端的增强子或者抑制子元件，其可以位于离转录起始位点远至数千碱基对的位置。
“重组”是由于引入外源核酸或者改变天然核酸而被修饰的细胞、核酸、蛋白质或者载体。因此，例如重组细胞表达细胞天然(非重组)形式中没有的基因或者表达与由非重组细胞表达的那些基因不同的天然基因。“重组核酸”是一般通过对核酸进行处理(例如利用聚合酶和核酸内切酶)最初于体外形成的核酸，或者除此之外以通常天然不存在的形式。可以产生重组核酸，例如用以使两种或者更多种核酸可操作地连接。因此，就本发明的目的而言，认为通过使通常天然不会连接的DNA分子相连接而于外体形成的分离的核酸或者表达载体是重组的。重组核酸一经制备并引入到宿主细胞或者生物体中，其可以利用宿主细胞体内的细胞体系进行复制；但是，这些核酸一经重组产生，尽管其随后在胞内进行复制，就本发明的目的而言仍然认为其是重组的。类似地，“重组蛋白”是利用重组技术制备的蛋白质，即通过重组核酸的表达。
“可再生柴油”是烷烃(例如C10:0、C12:0、C14:0、C16:0和C18:0)的混合物，其通过脂类的加氧作用和脱氧作用产生。
“糖化”是使生物质(通常是纤维素生物质或者木质纤维素生物质)转化成为单糖(例如葡萄糖和木糖)的过程。“糖化的”或者“解聚的”是指通过糖化作用已经转化成为单糖的纤维素材料或者生物质。
“蔗糖利用基因”是当表达时帮助细胞能够利用蔗糖作为能量(碳)来源的基因。本文中由蔗糖利用基因编码的蛋白被称为“蔗糖利用酶”，并且其包括蔗糖转运体、蔗糖转化酶和己糖激酶(例如葡糖激酶和果糖激酶)。
“木糖异构酶途径”是能够经由木糖中间体将木糖转化成木酮糖-5-磷酸的蛋白质和/或编码蛋白质的基因，其包括但不限于木糖异构酶(将木糖转化成木酮糖)和木酮糖激酶(将木酮糖转化成木酮糖-5-磷酸)。说明性木糖异构酶途径基因包括但不限于梨囊鞭菌属(Piromyces sp)基因XylA和树干毕赤酵母基因XYL3。
“木酮糖-5-磷酸易位体”、“木酮糖-5-磷酸转运体”或者“质体戊糖磷酸易位体”是转运木酮糖-5-磷酸的质体膜蛋白和编码这些蛋白质的家族。木糖易位体的非限制性实例是编码来自拟南芥的木酮糖-5-磷酸易位体的XPT基因。
“木糖转运体”是将木糖从细胞培养基中转运到细胞中的蛋白质和编码这些蛋白质的基因并且其包括但不限于被动转运体和主动转运体和易位体。被动转运体在不消耗能量的情况下帮助沿着浓度梯度(从较高浓度区域到较低浓度区域)转运分子，并且其包括但不限于树干毕赤酵母SUT1、SUT2和SUT3转运体以及酿酒酵母(S.cerevisiae)HXT转运体。主动转运体消耗能量以逆浓度梯度(并因此从较低浓度区域转运到较高浓度区域)地转运分子。主动转运体包括但不限于使用ATP作为能量来源的初级主动转运体(即ATP结合序列盒(ABC)转运体)和使用来自化学渗透梯度的能量的次级主动转运体，并且所述次级主动转运体包括但不限于逆向转运体和同向转运体，即中间假丝酵母(Candida intermedia)的GXS1蛋白、来自拟南芥的H+-同向转运体样蛋白(例如At5g59250n)以及来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的XLT1蛋白。
“木糖利用基因”是在表达时帮助细胞利用木糖作为碳源(例如用于产生能量和/或合成代谢)的能力的基因。在本文中由木糖利用基因编码的蛋白质被称为“木糖利用酶”并且包括木糖转运体、木糖易位体、氧化还原酶途径蛋白和木糖异构酶途径蛋白。
II.综述
本发明的说明性实施方案通过将木糖利用途径工程改造到原先缺乏代谢木糖的能力的生物体中而克服了在使用细胞培养物来将木糖转化成高价值的细胞生物质方面长期存在的挑战。在各种方面，本公开内容允许将活性木糖代谢途径工程改造到植物界的生物体中并且尤其是到微生物(在本文中也被称为微生物)中。这些生物体包括微藻。另一方面，本公开内容允许将活性木糖代谢途径工程改造到具有质体和II型脂肪酸生物合成途径二者的生物体中并且尤其是微生物中。
尽管其他人已经在啤酒酵母(Saccharomyce)中使用木糖获得了乙醇生产，但是这些生物体不适用于脂类的商业规模生产。与此相反，微生物如产油酵母和产油微藻可积累按干细胞重量计多于20%的脂类(主要为甘油三酯)。尽管产油酵母适用于生产脂类，但是微藻具有II型脂肪酸生物合成途径，其有助于使用基因工程改造来定制脂类并且尤其是甘油三酯(由细胞产生)的脂肪酸特性。参见PCT公布WO2011/151149、WO2010/063032和WO2011/15040。除生产脂类之外，本文所述的生物体可用于生产蛋白质、维生素、纤维以及其它天然产生的物质或者可用作进一步基因工程改造的结果。
根据本发明的一个实施方案，外源核酸被引入到具有可操作以产生木酮糖-5-磷酸转运体(例如，木酮糖-5-磷酸易位体)蛋白的质体的细胞中，所述转运体蛋白可操作以引起木酮糖-5-磷酸转运到细胞的质体中。在一个特定的实施方案中，所述细胞用编码可操作地连接有质体靶向序列的木酮糖-5-磷酸转运体的外源DNA转化。所述质体靶向序列可将转运体蛋白引到质体膜(优选内部质体膜)中以便将木酮糖5-磷酸有效地转运到可代谢它并且可能使之代谢成脂肪酸的质体中。例如，所述生物体在代谢木酮糖-5-磷酸的质体中可具有內源性戊糖代谢途径。如以下实施例所示的，已发现这是在细胞生长和/或脂类产生的同时促进木糖利用的有效方法。
任选地或者此外，这些细胞能够从外部环境中摄取木糖并将木糖转化成木酮糖-5-磷酸。可能需要外源基因来产生执行这些功能的活性蛋白。例如且如以下实施例所述，这些细胞可以用可操作以编码用于将木糖从外部培养基中转运到细胞中的活性木糖转运体和用于将木糖转化成木酮糖-5-磷酸的途径的DNA转化。例如，用于将木糖转化成木酮糖-5-磷酸的途径可以是用于将木酮糖转化成木酮糖-5-磷酸的木酮糖激酶与用于将木糖转化成木酮糖的途径的组合。用于将木糖转化成木酮糖的途径可包括木糖异构酶或者木糖还原酶与木糖醇脱氢酶的组合。可选地，木糖转运到细胞中可依赖于天然蛋白(如己糖转运体蛋白)的活性。
任选地，在任何以上实施方案的另一改进中，可以转化这些细胞以表达活性木糖醇脱氢酶。这个修改可用于减小或消除木糖醇对木糖异构酶的抑制。
各种基因可整合到生物体的染色体中或者可以是游离基因。优选地，这些基因稳定的表达并且可以是多个拷贝。在各种实施方案中，这些基因处于可调节启动子或者组成型启动子的控制下。转化之后并且任选地为了维持稳定性，这些细胞可以用可筛选标记转化。
这些细胞在异养生长的条件下能够繁殖和/或积累脂类。任选地，这些细胞可以为专性异养生物的细胞(如微藻原藻属的细胞)。例如这些细胞可以为桑椹形原藻的那些细胞。在以下实施例中，转化原藻细胞以表达活性木糖代谢途径。然而应注意，本发明的实施方案适用于很多其它物种。优选物种包括植物界、绿色植物亚界、绿藻下界或绿藻门、利藻亚门、四胞藻纲或者小球藻目的那些物种。特定实例包括桑椹形原藻(Protothecamoriformis)和原壳小球藻(Chlorella protothecoides)。
在一个优选实施方案中，所获得的重组生物体在使用葡萄糖作为碳源来培养时能够积累按干细胞重量计至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。另外，所述生物体在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。例如，微生物在作为碳源的葡萄糖上培养时可以能够积累按干细胞重量计至少50%的甘油三酯并且在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少20%的甘油三酯。在另一个实施方案中，当重组生物体的细胞在氮限制条件下在60%为葡萄糖且40%为木糖的碳源上培养时，如通过同位素示踪所测量，这些细胞产生其中碳原子的至少5%、10%、20%、30%、40%或50%来源于木糖的碳原子的脂类。在另一个实施方案中，所述重组生物体的细胞在少于或等于35天、28天、21天、14天或7天中在具有2.5%木糖作为唯一碳源的培养基中能够消耗至少90%的木糖。
除了引入木糖代谢途径之外，还可以通过引入可操作以改变由微生物产生的脂类的脂肪酸特性的基因来对所述生物体进行基因工程改造。因此，木糖可以转化成具有改变的脂肪酸特性的酰基甘油酯。例如，这些细胞可具有包含编码活性酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或者脂肪酸去饱和酶的一个或多个外源基因的重组修饰。可选地或者除此之外，这些细胞可具有可操作以减少或消除酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或者脂肪酸去饱和酶的重组修饰。用于执行这些基因操作的方法提供于PCT公布WO2011/151149、WO2010/063032和WO2011/15040中。
在一个优选实施方案中，在含有木糖的培养基中培养这些木糖代谢细胞。因此，产生了生物质。在一个特定实施方案中，木糖被转化成细胞生物质并且具体地说是甘油三酯。这可以通过同位素示踪来显示，例如使用同位素标记的木糖。为了产生甘油三酯，可以在营养物受限的条件下(例如在氮限制下)培养产油微生物。收获所生成的天然油。收获可包括用于释放油的细胞裂解。然后所述油可用于生产油类化学品、润滑剂、清洁剂、燃料、食品、化妆品成分或其它产品。例如，所述油可用于生产生物柴油(脂肪酸酯)或者可再生柴油(通过裂化由油产生的燃料)。
在一个实施方案中，所述方法包括在包含多于50%为木糖的碳源的培养基中培养这些细胞。例如，所述碳源可以多于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%为木糖。
因此，本发明的一个特定实施方案包括具有质体和通过引入和表达外源基因而产生的可操作的木糖代谢途径的微生物。这些基因具有将木糖转化成木酮糖-5-磷酸并将木酮糖-5-磷酸转运到质体中以用于进一步代谢的活性。所述微生物任选地具有将木糖从外部环境中转运到细胞中的木糖转运体。作为表达外源基因的结果，所述细胞能够在纯木糖上生长并且在例如21天、14天或7天或更少天数内在具有2.5%木糖作为唯一碳源的培养基中优选可以消耗至少90%的木糖。
III.培养
本发明大体涉及产油微生物的培养，所述微生物包括但不限于微藻、产油酵母、产油真菌以及产油细菌。在一些实施方案中，微藻品种特别是重组小球藻和原藻品种适于生产脂类。为了便于阅读，本章分为几节。第1节描述了原藻物种和品种，以及如何通过基因组DNA的比较来鉴定新的原藻物种和品种以及相关微藻。第2节描述了用于培养的生物反应器。第3节描述了培养基。第4节描述了依照本发明的说明性培养方法生产油类。
1.原藻物种和品种
原藻是用于生产脂类的标志性微生物，因为其可以产生大量脂类，特别是适用于生产燃料的脂类。与由其它微藻生产的脂类相比，由原藻生产的脂类具有更短长度和更高饱和度的碳氢链。此外，原藻脂类一般不含色素(叶绿素和某些类胡萝卜素低至不可检出水平)，而且在任何情况下其色素含量远远少于来源于其它微藻的脂类。此外，相对于由其它微藻生产脂类，本发明中提供的重组原藻细胞基于它们增加的利用木糖作为碳源的能力，其可以以更高产率和效率以及更低成本生产脂类。此外，这种微藻可以异养生长并且可以经过基因工程改造。本发明方法中使用的说明性原藻品种包括魏氏原藻(Prototheca wickerhamii)、大型原藻(包括UTEX327)、波多黎各原藻(Prototheca portoricensis)、桑椹形原藻(包括UTEX品种1441,1435)和小型原藻。原藻属的物种是专性异养型。
可以通过扩增基因组的特定靶区域来鉴定本发明中使用的原藻物种。例如，可以通过利用引物和利用基因组任意区域的方法(例如利用Wu等，Bot.Bull.Acad.Sin.(2001)42:115-121Identification of Chlorella spp.isolatesusing ribosomal DNA sequences中描述的方法)对核和/或绿叶体DNA进行扩增和测序，来鉴定特定的原藻物种或者品种。本领域技术人员使用公认的系统发生学分析方法(例如对核糖体内转录间隔区(ITS1和ITS2rDNA)、23S rRNA、18S rRNA和其它保守的基因组区域进行扩增和测序)，不仅可以鉴定原藻物种，还可以鉴定具有相似脂类特性和生产能力的生产碳氢化合物和脂类的其它生物体。对藻类进行鉴定和分类的方法实例还可以见于例如Genetics,2005年8月;170(4):1601-10和RNA,2005年4月;11(4):361-4。
因此，可以利用基因组DNA比较来鉴定本发明中使用的适宜微藻物种。可以从微藻物种中扩增基因组DNA的保守区域(例如但不限于编码23SrRNA的DNA)，并比较共有序列，用以筛选与本发明中使用的优选微藻在分类学上相关的微藻物种。对于原藻属物种的这种DNA序列比较的实例显示于下面。基因组DNA比较还可以用于鉴定品种保藏中错误鉴定的微藻物种。品种保藏通常基于表型特征和形态特征鉴定微藻物种。使用这些特征可能导致对微藻属或者物种进行错误分类。使用基因组DNA比较是基于系统发生学关系对微藻物种进行分类的较好方法。
本发明中使用的微藻通常具有编码与SEQ ID NO:1-9中列出的至少一个序列具有至少99%、至少95%、至少90%或者至少85%核苷酸同一性的23S rRNA的基因组DNA序列。
对于使用序列比较来确定核苷酸或者氨基酸同一性，通常以一种序列作为参照序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果需要)，并且指定序列算法的程序参数。随后基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
可以例如通过局部同源性算法(Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981))、同源性比对算法(Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970))、相似性搜索方法(Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444(1988))、计算机实施的这些方法(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)或者通过目检(一般见于上文Ausubel等)来进行比较序列的最佳比对。
适于确定序列同一性和序列相似性百分比的另外一种算法实例是BLAST算法，其描述于Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。进行BLAST分析的软件可以在National Center for BiotechnologyInformation上(网址是www.ncbi.nlm.nih.gov)公开获得。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短词来鉴定高分数序列对(HSPs)，所述短词在与数据库序列中具有相同长度的词比对时匹配或满足某些正值的阈值分数T。T是指邻域词分数阈值(上文Altschul等)。这些初始邻域词命中作为种子启动搜索，用以寻找含有它们的较长HSP。接着该词命中沿着每条序列在两个方向延伸，远至能够提高累积比对分数。对于核苷酸序列，利用参数M(一对匹配残基的奖励分数，通常>0)和N(非配对残基的罚分，通常<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用分数矩阵计算累积分数。每个方向上词命中的延伸在下列情况时停止：当累积比对分数由其达到的最大值降低数量X；由于一个或者多个残基比对负值的积累而使累积分数降至0或者以下；或者达到任一序列的末端。对于鉴定核酸或者多肽是否在本发明的范围内，BLAST程序的默认参数是合适的。BLAST程序(对于核苷酸序列)使用的默认值是词长(W)为11，期望值(E)为10，M=5，N=-4和进行两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认值是词长(W)为3，期望值(E)为10和BLOSUM62分数矩阵。TBLATN程序(对于核苷酸序列，利用其蛋白序列)使用的默认值是词长(W)为3，期望值(E)为10和BLOSUM62分数矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))。
除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还可以进行两个序列之间相似性的统计学分析(例如参见Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测定是最小总和概率(P(N))，其表示通过两个核苷酸或者核酸序列之间偶然发生配对的概率。例如，如果测试核酸与参照核酸比较的最小总和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与参照序列是相似的。
除了生产合适的脂类或者碳氢化合物以生产油类、燃料和油脂化工产品之外，影响对本发明中使用的微生物进行选择的其它考虑因素包括：(1)脂类含量高(以细胞重量计算)；(2)易于生长；(3)易于进行基因工程改造；(4)易于对生物质进行处理。在特定的实施方案中，野生型或者经基因工程改造的微生物生产具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%或者至少70%或者更多的脂类。优选生物体是异养生长型(不存在光下生长于糖类中)。
2.生物反应器
以进行遗传学操作和生产碳氢化合物(例如脂类、脂肪酸、醛、醇和烷烃)二者为目的培养微生物。前面一种类型的培养以小规模并且最初至少在起始微生物可以生长的条件下进行。以生产碳氢化合物为目的的培养通常以大规模(例如10,000L、40,000L、100,000L或者更大的生物反应器)在生物反应器中进行。通常利用本发明的方法在生物反应器内的含有木糖的液体培养基中对原藻进行培养。在一个实施方案中，在生物反应器中使用分批补料法对微藻(如原藻)进行培养。生物反应器通常不允许光进入，并且在大致上没有光的情况下对所述微生物进行异养培养，以代谢固定碳源。
使用生物反应器或者发酵罐来培养微藻细胞，通过其生理周期的多个阶段。在异养生长和繁殖方法中使用生物反应器提供很多优势。为了生产用于食品中的生物质，优选在液体中(例如在悬浮培养基中)大量发酵微藻。生物反应器(例如不锈钢发酵罐)可以容纳非常大的培养体积(本发明的多个实施方案中使用具有40,000升和更大能力的生物反应器)。生物反应器通常还使得可以控制培养条件，例如温度、pH值、氧压和二氧化碳水平。例如，生物反应器通常是可配置的，例如利用与管道连接的接口，以允许气体组分(例如氧气或者氮气)通过液体培养物起泡。利用生物反应器还可以更容易地对其它培养参数(例如培养基的pH值、微量元素的类型和浓度以及其它培养基组分)进行控制。
生物反应器可以配置成使培养基在微藻复制和数量增加期间流过生物反应器。例如在一些实施方案中，可以在接种后但是在细胞达到期望密度之前将培养基注入生物反应器中。在其它情况下，培养初始时将培养基充满生物反应器，并且在接种培养物后不再注入培养基。换言之，使微藻生物质在液体培养基中培养一段时间，其间微藻复制并且数量增加；但是，在这期间没有大量的液体培养基流过生物反应器。因此在一些实施方案中，接种后没有液体培养基流过生物反应器。
可以利用装配有例如旋转刀和旋桨、振荡器、搅拌棒、用于将气体增压注入的装置等设备的生物反应器使微藻培养物混合。混合可以是连续性的或者周期性的。例如，在一些实施方案中，没有维持气体进入和培养基进入的紊流条件，直至所述微藻数量的增加达到期望水平。
可以使用生物反应器接口引入或者提取气体、固体、半固体和液体至含有微藻的生物反应室中。由于很多生物反应器具有多于一个接口(例如一个用于培养基进入，另一个用于取样)，仅使一种物质进入或者保留一个接口是没有必要的。例如，可以使用一个接口使培养基流入生物反应器中并且随后用于取样、进气、排气或者其它目的。优选可以重复使用取样口，不会改变妥协培养物的无菌性质。取样口可以配置成具有阀门或者具有使样品停止和开始流动或者提供连续取样装置的其它设备。通常生物反应器具有允许接种培养物的至少一个接口，并且这种接口还可以用于其它目的，例如培养基进入或者气体进入。
生物反应器接口使得可以控制微藻培养物的气体含量。举例而言，生物反应器的部分体积可以是气体而非液体，并且生物反应器的气体入口允许将气体泵入生物反应器中。可以有益地泵入生物反应器中的气体包括空气、空气/CO2混合物、隋性气体(例如氩气)和其它气体。通常生物反应器装配成使得使用者能够控制气体进入生物反应器的速率。如上面提到，可以通过增加流入生物反应器的气体来促进培养物混合。
气体流动增加还影响培养物的浊度。通过在液体培养基层下放置一个进气口以使进入生物反应器的气体在培养物表面起泡，可以产生紊流。一个或者多个排气口使气体可以泄漏，因此防止生物反应器中压力累积。优选排气口通向防止杂质微生物进入生物反应器的止回管道。
3.培养基
微藻培养基通常含有例如固定氮源、固定碳源、微量元素、任选地维持pH值的缓冲液和磷酸类物质(通常以磷酸盐提供)等组分。其它组分可以包括盐(例如氯化钠)，特别是对于海水微藻。氮源包括有机和无机氮源，其例如包括但不限于分子氮、硝酸、硝酸盐、氨(纯氨水或者盐形式，例如(NH4)2SO4和NH4OH)、蛋白质、大豆粉、玉米浆和酵母提取物。微量元素的实例包括锌、硼、钴、铜、锰和钼，例如分别以ZnCl2、H3BO3、CoCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、MnCl2·4H2O和(NH4)6Mo7O24·4H2O的形式提供。
一般可以从多种来源获得固体和液体生长培养基，而且可以适用于多种微生物品种的特定培养基的制备方法可以在http://www.utex.org/(由Austin,1University Station A6700,Austin,Texas,78712-0183处的University of Texas维护的站点)中的藻类培养物保藏中心(UTEX)在线找到。例如，多种淡水和盐水培养基包括描述于PCT公布号为2008/151149中的培养基，其以引入方式并入本文。
在一个特定的实施例中，Proteose培养基适用于进行无菌培养，并且可以通过将1g蛋白胨加入到1升Bristol培养基中来制备1L体积的培养基(pH～6.8)。Bristol培养基包含水溶液中的2.94mM NaNO3、0.17mMCaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.43mM、1.29mM KH2PO4和1.43mM NaCl。对于1.5%的琼脂培养基，可以将15g琼脂加入到1L溶液中。将培养基盖好并进行高压灭菌，并且随后在使用前储存于冷藏温度中。另一个实例是原藻分离培养基(PIM)，其包含10g/L苯二甲酸氢钾(KHP)、0.9g/L氢氧化钠、0.1g/L硫酸镁、0.2g/L磷酸氢钾、0.3g/L氯化铵、10g/L葡萄糖、0.001g/L盐酸硫胺素、20g/L琼脂、0.25g/L5-氟胞嘧啶，pH值范围是5.0至5.2(参见Pore,1973,App.Microbiology,26:648-649)。通过咨询上面显示的URL或者通过咨询保藏微生物培养物的其它组织(例如SAG、CCAP或者CCALA)，可以容易地鉴定适用于本发明方法中的其它培养基。SAG是指在University of
Figure BDA0000408990500000211
(
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Germany)处的Culture Collection of Algae，CCAP是指由Scottish Association for MarineScience(Scotland,United Kingdom)管理的藻类和原生动物培养物保藏中心，并且CCALA是指在Institute of Botany(
Figure BDA0000408990500000213
Czech Republic)处的藻类培养物保藏实验室。此外，美国专利号5,900,370描述了适合原藻物种异养发酵的培养基配方和条件。
对于油类生产，选择固定碳源十分重要，因为固定碳源的成本必须足够低，以经济地进行油类生产。在一个实施方案中，固定碳源是木糖。木糖是作为半纤维素的组分发现的五碳单糖。半纤维素是在几乎所有的植物细胞壁(包括约30%的全部植物物质)中发现的复合多糖。除木糖之外，也可包括其它碳源，例如乙酸酯、红藻糖苷、果糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、鼠李糖、蔗糖和/或木糖时，选择含有这些化合物(特别是木糖)的原料是本发明方法中的一个重要方面。
根据本发明使用的其它适宜原料包括例如黑液、玉米淀粉、解聚的纤维素材料、奶浆、糖蜜、马铃薯、高粱、蔗糖、甜菜、甜菜汁、甘蔗、甘蔗汁、浓甘蔗汁、稻米和小麦。还可以以混合物形式提供碳源，如蔗糖或木糖与解聚的甜菜浆、解聚的纤维素材料等的混合物。可以在一种或多种外源提供的固定碳源的浓度为至少约50μM、至少约100μM、至少约250μM、至少约500μM、至少约1mM、至少约2.5mM、至少约5mM、至少约10mM、至少约25mM、至少约50mM、至少约100mM、至少约250mM以及至少约500mM的情况下供应所述一种或多种碳源。在一些情况下，可以在外源提供的固定碳源的浓度为至少约100g/L、至少约200g/L、至少约300g/L、至少约400g/L、至少约500g/L、至少约600g/L、至少约700g/L、至少约800g/L或者更大的情况下将作为分批发酵的原料的一种或多种碳源供应到发酵培养物中。对于本发明目的特别优选的碳源包括木糖、解聚的纤维素材料、甘油、葡萄糖、蔗糖和高粱，下面对其中的每一种进行更加详细的讨论。
根据本发明，可以利用解聚的纤维素生物质作为原料来培养微生物。纤维素生物质(例如干草，如玉米干草)是廉价并且易于获得的。微藻可以在经过加工的纤维素材料上生长，并且本发明的微藻被特别设计成高效地利用木糖作为碳源。纤维素材料一般包括约40-60%的纤维素、约20-40%的半纤维素和10-30%的木质素。
适宜的纤维素材料包括来源于草本和木本能源作物以及农作物的剩余物(不是从主要的食物或者纤维产品田地中取下的)，即植物器官、初生茎和初生叶。实例包括农业废弃物(例如甘蔗渣、稻米壳、玉米纤维(包括茎、叶、壳和棒)、小麦秸秆、稻米秸秆、甜菜浆、柑橘浆、柑橘皮)、林业废弃物(例如硬木和软木间伐材以及木材处理时的硬木和软木剩余物)、木材废弃物(例如锯木厂废弃物(木片、锯末)和纸浆厂废弃物)、城市废弃物(例如城市固体废弃物的纸质部分、城市木质废弃物和城市绿色废弃物(例如城市剪草))和木材建筑废弃物。其它纤维素材料包括专门的纤维素作物，例如柳枝稷、杂交白杨木和芒草、纤维甘蔗和纤维高粱。从这些材料中生产的五碳糖包括木糖。
可以对纤维素材料进行处理，以增加微生物利用这些物质中所含糖类的效率。如上面所讨论，木质纤维素生物质由多种组分组成，包括纤维素(β-1,4连接的葡萄糖(一种六碳糖)的一种晶体多聚物)、半纤维素(较松散连接的多聚物，主要由木糖(一种五碳糖)组成并且含有少量的甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖)、木质素(一种复杂的芳香族多聚物，由芥子醇和其衍生物组成)和果胶(α-1,4连接的直链多聚半乳糖醛酸)。由于纤维素和半纤维素具有多聚结构，其中所含糖类(例如单糖葡萄糖和木糖)的形式不能被很多微生物有效利用。对于这些微生物，对纤维素生物质进行进一步加工以产生构成多聚物的单糖有助于保证纤维素材料作为原料(碳源)能够被有效利用。
纤维素或纤维素生物质可以经受被称为“汽爆”的过程，其中在高温和高压下用稀硫酸(或者其它)处理生物质。该过程使得生物质中的纤维素和半纤维素组分能够被有效地酶促水解成为葡萄糖和木糖单体。所得到的单糖被称为纤维素糖。随后纤维素糖被微生物利用，产生大量代谢物(例如脂类)。酸汽爆步骤使得半纤维素组分部分水解成为组成其的单糖。进一步处理后，这些糖类可以完全从生物质中释放出来。在一些实施方案中，进一步处理是热水处理，其包括用热水对经汽爆的材料进行清洗，去除杂质(例如盐)。该步骤对于纤维素乙醇发酵来说是不必要的，因为该过程中使用较高稀释度的糖浓度。在其它实施方案中，进一步处理是额外的酸处理。在其它实施方案中，进一步处理是对经汽爆的材料进行酶促水解。这些处理还可以结合使用。处理类型可以影响释放的糖类型(例如五碳糖对六碳糖)和处理过程中糖类释放的阶段。因此，可以产生不同的糖流，无论其主要是五碳糖或者六碳糖。这些经富集的五碳糖或者六碳糖流因而可以针对具有不同碳利用能力的特定微生物。在本发明的方法的某些实施方案中，优选富含五碳木糖的物流。在其它实施方案中，可以组合已糖化的含有五碳糖、六碳糖或者五碳糖/六碳糖的组合的不同糖流，以用于在微生物发酵中生产高细胞密度的产生脂类的微生物生物质。
涉及脂类生产的本发明的实施方案可包括发酵以产生高于乙醇发酵中所达到的细胞密度的细胞密度。由于用于异养纤维素油类生产的培养物密度较高，优选固定碳源(例如纤维素来源的糖流)呈浓缩形式。例如，在培养步骤之前在原料中解聚的纤维素材料中的葡萄糖浓度、或木糖浓度或者葡萄糖和木糖的总浓度可以是至少约100g/升、至少约200g/升、至少约300g/升、至少约400g/升、至少约500g/升、至少约600g/升、至少约700g/升、至少约800g/升或者更多的葡萄糖或者木糖或者葡萄糖与木糖的组合，所述培养步骤任选地是分批补料式培养，其中随着细胞生长和积累脂类的时间将材料供给到细胞中。这些糖化方法的各种方法和用于加工纤维素材料以在微生物发酵中使用的其它方法描述在美国专利申请公布20100151112中。
纤维素物质的汽爆处理过程利用大量的硫酸、热和压力，因而释放碳水化合物的副产物，称为糠醛和羟甲基糠醛。糠醛和羟甲基糠醛在半纤维素水解过程期间通过木糖降解成为糠醛和水而产生。然而在本发明的方法的很多实施方案中这种木糖损失是不希望的，这样使得在使用它们时采用非汽爆过程抑或使糠醛和羟甲基糠醛的产生减至最少，在引入生物反应器之前，可以从糖化的木质纤维素材料中去除这些副产物(例如糠醛和羟甲基糠醛)，并且通过美国专利申请公布20100151112中描述的方法可以减小由汽爆过程引起的纤维素材料的导电性。
在其它实施方案中，对汽爆过程自身进行改变，以避免产生出乎意料地高水平的盐。例如，纤维素生物质的硫酸(或者其它酸)汽爆的适宜替代步骤是机械浆化，以使纤维素生物质能够进行酶促水解(糖化)。在其它实施方案中，使用能够抵抗高水平盐的微生物天然品种或者能够抵抗高水平盐的基因工程改造的品种。处理纤维素糖以使得其适合用作本发明的浓缩原料的方法的一个非限制性实例描述在美国专利申请公布20100151538中，所述申请以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，糖化的木质纤维素糖经过处理以减少毒素(例如，糠醛和羟甲基糠醛)和盐二者的水平并且然后将其浓缩至浓缩糖流或者固定碳源原料中至少600g/L或更多糖单体的浓度。在其它实施方案中，这些浓缩的糖化木质纤维素糖具有小于700mM钠等同物的盐水平。在其它实施方案中，这些浓缩的糖化木质纤维素糖具有小于100mM钠等同物、小于200mM钠等同物、小于300mM钠等同物、小于400mM钠等同物、小于500mM钠等同物、小于600mM钠等同物、小于700mM钠等同物或者小于1000mM钠等同物的盐水平。在其它实施方案中，这种浓缩的糖化木质纤维素糖原料具有小于20,000μS/cm、小于15,000μS/cm、小于10,000μS/cm、小于7,500μS/cm、小于5,000μS/cm、小于1000μS/cm、小于500μS/cm、小于300μS/cm或者小于200μS/cm的导电率的导电性。在其它实施方案中，这种浓缩糖化的木质纤维素糖原料富含五碳糖单体或者六碳糖单体或者五碳与六碳糖单体的组合。
在本发明方法的另一个实施方案中，碳源包括甘油，例如由生物柴油转酯基作用产生的酸化和未酸化的甘油副产物。在一个实施方案中，碳源包括甘油和木糖。在一些情况下，在发酵开始时将所有的甘油和木糖提供给微生物。在一些情况下，将甘油和木糖以预定比率同时提供给微生物。在一些情况下，在发酵过程中将甘油和木糖以预定比率供给微生物。
一些微藻在甘油存在下比在另一种碳源如葡萄糖存在下的细胞分裂更快(参见PCT公布号2008/151149)。在这对于甘油和木糖确实如此的情况下，两阶段生长方法(其中首先将甘油供给细胞以使其细胞密度快速增长，并且随后将木糖供给细胞，以积累脂类)可以提高脂类生产的效率。利用转酯基方法的甘油副产物当投回到生产过程中时具有显著的经济优势。还提供了其它供给方法，例如将甘油和木糖混合。供给这种混合物也具有相同的经济益处。因此，本发明提供了以替代糖类(如木糖与甘油的各种组合)供给微藻的方法。
在本发明的方法的各种实施方案中，碳源是木糖，包括含有木糖的复合原料，如来源于纤维素的材料。在一个实施方案中，培养基进一步包含至少一种木糖利用酶。使用含有木糖的复合原料可以显著节省碳氢化合物和其它油类生产的成本。
4.油类生产
对于根据本发明的方法进行油类生产，优选在黑暗中(或者在大致上没有光的情况下)培养细胞，例如当使用不允许光照射培养物的极大(40,000升或者更大)发酵罐时就是如此。专性异养生物物种如原藻物种在含有固定碳源的培养基中且在没有光的情况下生长和繁殖，以生产油类；已知这种生长是异养生长。
作为实例，将产脂微藻细胞的接种物引入培养基中；细胞开始繁殖前存在延迟期(延迟相)。延迟期后，繁殖速率稳定增加，进入对数期或者指数期。指数期后，由于营养物质(例如氮)减少、毒性物质增加以及群体感应机制，繁殖减慢。减慢后，繁殖停止，依赖于向细胞提供的特定环境，细胞进入静止期或者平稳生长状态。为了获得脂类富集的生物质，通常在指数期结束之后收集培养基，可以通过使氮或者另一种关键营养物质(除了碳之外)耗尽从而迫使细胞将过量存在的碳源转化成为脂类，使指数期较早终止。可以控制培养条件参数，以使总体油类生产、所产生的脂类组合物和/或特定油类的生产达到最佳。
如上面所讨论，使用生物反应器或者发酵罐，以使细胞进入其生长循环的多个时期。作为实例，将产脂细胞的接种物引入培养基中，随后在细胞开始生长前进入延迟时期(延迟期)。延迟期后，繁殖速率平稳增加，进入对数期或者指数期。指数期后，由于营养物质减少和/或毒性物质增加，生长减慢。减慢后，生长停止，依赖于向细胞提供的特定环境，细胞进入静止期或者平稳状态。本文公开的细胞的脂类生产可以发生于对数期过程中或者其后，包括静止期，其中提供或者仍然可获得营养成分，以使细胞在不分裂的情况下能够持续生产脂类。
优选地，利用本文中描述且本领域已知的条件生长的微生物包含至少约20%重量的脂类、至少约40%重量、至少约50%重量、至少约60%重量以及至少约70%重量。可以调整工艺条件，以增加适合特定用途的脂类的产率和/或减少生产成本。例如，在某些实施方案中，在具有限制性浓度的一种或者多种营养物质(例如氮、磷或者硫)存在下培养微藻，同时提供过量的固定碳能(例如葡萄糖)。与在过量提供氮的培养物中微生物的脂类产率相比，限制氮倾向于使微生物的脂类产率增加。在特定的实施方案中，脂类产率增加为至少约：大于氮充满条件下获得的产率的10%、50%、100%、200%或者500%。可以在总培养期的一部分或者整个时期中在限制量的营养物质存在下培养微生物。在特定的实施方案中，在总培养期期间，营养物质的浓度在限制性浓度和非限制性浓度之间至少循环2次。可以通过在延长的时期内持续加入培养基同时提供过量碳但是提供限制性氮或者不提供氮，使细胞的脂类含量增加。
在另一个实施方案中，通过在脂类途径酶(例如脂肪酸合成酶)的一种或者多种辅助因子存在下培养产脂微生物(例如微藻)，使脂类产率增加。一般来讲，辅助因子的浓度足以使微生物脂类(例如脂肪酸)产率与不存在辅助因子时的微生物脂类产率相比增加。在特定的实施方案中，通过将含有编码辅助因子的外源基因的微生物(例如微藻)加入到培养基中，向培养基提供辅助因子。任选地，可以通过加入含有编码参与辅助因子合成的蛋白的外源基因的微生物(例如微藻)向培养基提供辅助因子。在某些实施方案中，合适的辅助因子包括脂类途径酶所需的任何维生素，例如：生物素、泛酸盐。编码适用于本发明中的辅助因子的基因或者参与这些辅助因子合成的基因是已知的，并且可以利用例如上面描述的质粒和技术引入到微生物(例如微藻)中。
可以以任何合适的方式将本文中描述的生物反应器、培养条件以及异养生长和繁殖方法的特定实例进行组合，以促进微生物生长以及提高脂类和/或蛋白生产的效率。
利用本领域已知的(参见PCT公布号2008/151149)的不同培养方法已经产生了具有按干重计的高比率油类/脂类积累的微藻生物质。利用本文中描述的培养方法产生并且根据本发明使用的微藻生物质包含按干重计至少10%的微藻油。在一些实施方案中，微藻生物质包含按干重计至少25%、至少50%、至少55%、至少60%的微藻油、或者至少70%的微藻油。在一些实施方案中，微藻生物质含有按干重计10-90%的微藻油、25-75%的微藻油、45-75%的微藻油或者50-70%的微藻油。
用于本发明的方法和组合物中的本文中描述的生物质的微藻油或者从生物质中提取的微藻油可以包含具有一个或者多个不同脂肪酸酯支链的甘油脂。甘油脂由与一个、两个或者三个脂肪酸分子发生酯化的甘油分子组成，所述脂肪酸分子可以具有不同的长度和不同的饱和度。通过如下面第V章更加详细描述的培养条件或者脂类途径工程，可以控制脂肪酸分子(和微藻油)的长度和饱和度性质，以对本发明微藻油中的脂肪酸分子的特性或者比例进行修饰。因此，可以通过将来源于两个或者多个微藻物种的生物质或者藻油混合，在单个微藻物种内制备特定的藻油混合物，或者通过将本发明的藻油与其它来源的油类混合来制备特定的藻油混合物，所述其它来源例如大豆、油菜籽、加拿大油菜、棕榈叶、棕仁、椰子、玉米、废植物、乌桕油、橄榄、向日葵、棉花籽、鸡脂肪、牛脂、微藻、大型藻类、微生物、萼距花、亚麻、花生、精选白色动物油脂、猪油、亚麻芥油、芥菜籽、腰果、燕麦、羽扇豆、洋麻、金盏花、大麻、咖啡豆、亚麻仁(亚麻籽)、榛子、大戟属、南瓜籽、香菜、山茶、芝麻、红花、稻米、油桐树、可可、干椰子肉、阿片罂粟、蓖麻籽、碧根果、加州希蒙得木、夏威夷果、巴西坚果、鳄梨、石油或者上述油类中任意一种的馏分。
还可以通过将来源于至少两种不同的微藻物种的生物质或者油类混合，来控制油类组成，即甘油脂中脂肪酸成分的性质和比例。在一些实施方案中，至少两种不同的微藻物种具有不同的甘油脂谱。如本文中所描述，优选在异养条件下对不同的微藻物种进行共同培养或者分离培养，以产生各自的油类。不同微藻物种细胞的甘油脂中可以含有不同比例的不同脂肪酸成分。
一般来讲，野生型原藻品种几乎没有或者没有链长度为C8-C14的脂肪酸。例如桑椹形原藻(UTEX1435)、克鲁格尼原藻(UTEX329)、大型原藻(UTEX1442)和小型原藻(UTEX1438)不含(或者不可检出量的)C8脂肪酸，含有0-0.01%之间的C10脂肪酸、0.03-2.1%之间的C12脂肪酸和1.0-1.7%之间的C14脂肪酸。
微藻油还可以包括由微藻产生的或者培养基中与微藻油混合的其它成分。这些其它成分可以以不同量存在，这取决于培养微藻时使用的培养条件、微藻物种、从生物质中回收微藻油时使用的提取方法和可能影响微藻油组合物的其它因素。这些成分的非限制性实例包括以0.1-0.4微克/ml存在的类胡萝卜素、以0-0.02毫克/千克油存在的叶绿素、以0.4-0.6毫克/100克油存在的γ-生育酚和以0.2-0.5毫克/克油存在的总生育三烯酚。
其它成分可以包括但不限于磷脂、生育酚、生育三烯酚、类胡萝卜素(例如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素等)、叶黄素(例如叶黄素、玉米黄质、α-隐黄质和β-隐黄质)和多种有机或者无机化合物。
在一些情况下，从原藻物种中提取的油类包含不多于0.02mg/kg的叶绿素。在一些情况下，从原藻物种中提取的油类包含不多于0.4mg/ml的类胡萝卜素。在一些情况下，每100克原藻油中包含0.40-0.60毫克之间的γ-生育酚。在其它情况下，每克原藻油中包含0.2-0.5毫克之间的总生育三烯酚。
IV.基因工程改造方法和材料
本发明的实施方案提供了用于对适用于本发明方法中的细胞和重组宿主细胞进行基因修饰的方法和材料，所述重组宿主细胞包括但不限于重组产油微生物、微藻、和产油微藻，如桑椹形原藻、小型原藻、克鲁格尼原藻和大型原藻宿主细胞。为了便于阅读，对这些方法和材料的描述分为几节。在第1节中描述了转化方法。在第2节中描述了同源重组方法。在第3节中描述了表达载体和载体组分。
1.转化方法
可以通过任何合适的技术转化细胞，所述技术包括例如基因枪法、电穿孔(参见Maruyama等，(2004),Biotechnology Techniques8:821-826)、玻璃珠转化法和碳化硅晶须转化法。可以使用的另一种方法涉及形成原生质体以及利用CaCl2和聚乙二醇(PEG)将重组DNA引入微藻细胞中(参见Kim等，(2002),Mar.Biotechnol.4:63-73，其报道利用这种方法转化Chorellaellipsoidea)。可以通过共转化微藻将两种不同的载体分子同时引入细胞中(参见例如Protist2004Dec;155(4):381-93)。
还可以使用基因枪法(参见例如Sanford,Trends In Biotech.(1988)6:299302，美国专利号4,945,050)、电穿孔(Fromm等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.(USA)(1985)82:58245828)、使用激光束、显微注射或者能够将DNA引入微藻中的任何其它方法转化原藻细胞。
2.同源重组方法
同源重组是指宿主细胞中的互补DNA序列对准并交换同源区域的能力。将含有与被靶向的基因组序列(“模板”)同源的序列的转基因DNA(“供体”)引入到宿主细胞中，并接着在相应的基因组同源序列位点重组到基因组中。在大多数情况下，该过程的机械步骤包括：(1)使同源DNA片段配对；(2)使供体DNA分子发生双链断裂；(3)使供体DNA的游离末端插入到模板DNA分子中，随后进行DNA合成；和(4)发生双链断裂修复事件，其产生最终的重组产物。
在宿主生物体中进行同源重组的能力具有许多实践意义，其可以在分子遗传学水平进行并且可以用于制备能够生产特制油的产油微生物。同源重组本质上是精确的基因靶向事件；因此，由相同的靶向序列制备的大多数转基因株在表型上是基本一致的，需要筛选极少的转化事件。同源重组还将基因插入到宿主染色体中，产生极好的基因稳定性，甚至在不存在基因选择的情况下。由于不同的染色体座位可影响基因表达，甚至是异源启动子/UTRs介导的基因表达，因此同源重组可以是在未知基因组环境中查找座位和评估这些环境对基因表达的影响的方法。
利用同源重组的特别有用的基因工程应用是选择特异的宿主调控元件(例如启动子/UTRs)以高度特异的方式驱动异源基因的表达。例如，预期用异源C12:0特异性FATB(硫酯酶)基因盒和合适的筛选标记去除内源性硬脂酰基ACP去饱和酶基因能够显著地降低C18:1脂肪酸的内源水平，同时使C12:0脂肪酸的水平增加。参见美国专利公布20100151112。
由于同源重组是精确的基因靶向事件，所以其可以用于对目的基因或者目的区域内的任意核苷酸进行精确修饰，只要已经鉴定出足够的侧翼区域。因此，可以利用同源重组方法对影响RNA和/或蛋白表达的调控序列进行修饰。在对酶活性(例如底物特异性、亲和性和Km)进行修饰的尝试中，其还可以用于修饰蛋白编码区域，因而使宿主细胞的代谢发生期望变化。同源重组提供了控制宿主基因组的强效方法，其导致发生基因靶向、基因转换、基因缺失、基因复制、基因倒置和基因表达调控元件(如启动子、增强子和3’UTR)的交换。
可以通过利用含有内源序列片段的靶向质粒靶向宿主细胞内源基因组内部的目的基因或者目的区域来达成同源重组。这种靶向序列可以位于目的基因或者目的区域的5’端、目的基因/区域的3’端或者可以位于目的基因/区域的侧翼。这种靶向质粒可以以具有额外的载体骨架的超螺旋质粒DNA形式或者无载体骨架的PCR产物形式或者线性分子形式转化到宿主细胞中。在一些情况下，首先利用限制性酶使转基因DNA(供体DNA)内部的同源序列暴露是有利的。该步骤可以增加重组效率并且减少不期望有的事件的发生。增加重组效率的其它方法包括利用PCR产生转化转基因DNA，所述DNA含有与被靶向的基因组序列同源的线性末端。
3.载体和载体组分
根据本文中公开的内容，可以通过本领域技术人员熟悉的已知技术制备本发明中用于转化微生物的载体。载体通常含有一个或者多个基因，其中每个基因编码期望产物(基因产物)的表达，并且可操作地连接至(或含有)调控基因表达或者使基因产物靶向重组细胞内部特定位点的一个或多个控制序列。为了有助于阅读，该节分为几个小节。A小节描述了载体中通常含有的控制序列以及特别用于在微藻如原藻中使用的控制序列。B小节描述了载体中通常含有的基因以及特别用于在微藻如原藻中使用的密码子优化方法和利用其制备的基因。
A.控制序列
控制序列是调控编码序列的表达或者指导基因产物至细胞内部或者外部特定位点的核酸。调控基因的控制序列包括例如调控编码序列转录的启动子和使编码序列转录终止的终止子。另一个控制序列是位于编码多聚腺苷酸尾链信号的编码序列末端的3’非翻译序列。指导基因产物至特定位点的控制序列包括编码信号肽的序列，其指导与其连接的蛋白至细胞内部或者外部的特定位点。
因此，设计用于在微藻中表达外源基因的示例性载体含有期望基因产物(例如可筛选标记、脂途径修饰酶或者木糖利用酶)的编码序列，其与在微藻中具有活性的启动子可操作地连接。任选地，如果载体不含与目的编码序列可操作地连接的启动子，可以将编码序列转化到细胞中，以使其在载体整合点处与内源性启动子可操作地连接。
许多启动子在微藻中具有活性，包括被转化的微藻的内源性启动子以及被转化的藻类的非内源性启动子(即其它藻类的启动子、高等植物的启动子和植物病毒或者藻类病毒的启动子)。在微藻中具有活性的说明性外源和/或内源启动子(以及在微藻中具有功能的抗生素抗性基因)描述于PCT公布号2008/151149和其中引用的参考文献中。也参见美国专利申请公布20100151112。
用于表达外源基因的启动子可以是与该基因天然连接的启动子或者可以是异源启动子。一些启动子在多于一种微藻物种中具有活性。其它启动子是物种特异性的。说明性启动子包括例如下面实施例中使用的莱茵衣藻β-微管蛋白的启动子和病毒启动子，例如已经表明在多个微藻物种中具有活性的花椰菜花叶病毒(CMV)启动子和小球藻病毒启动子(参见例如Plant Cell Rep.2005Mar;23(10-11):727-35;J Microbiol.2005Aug;43(4):361-5;Mar Biotechnol(NY).2002Jan;4(1):63-73)。适用于在原藻中表达外源基因的另一个启动子是耐热性小球藻(Chlorella sorokiniana)谷氨酸脱氢酶启动子/5’UTR(SEQ ID NO:10)。任选地，使用这些序列中含有启动子的至少10、20、30、40、50或者60个或者更多核苷酸。用于在原藻中表达外源基因的说明性启动子列于本申请的序列表中，例如小球藻HUP1基因的启动子(SEQ ID NO:11)和椭圆形小球藻(Chlorella ellipsoidea)硝酸还原酶启动子(SEQ ID NO:12)。还可以利用小球藻病毒启动子在原藻中表达基因，例如美国专利号6,395,965中的SEQ ID NO:1-7。还可以在例如Biochem Biophys Res Commun.1994Oct14;204(1):187-94、Plant Mol Biol.1994Oct;26(1):85-93;Virology.2004Aug15;326(1):150-9和Virology.2004Jan5;318(1):214-23中发现在原藻中具有活性的额外的启动子。
启动子一般可以表征为组成型或者诱导型。组成型启动子一般在所有时间(或者在细胞生命周期的某些时间)均具有相同水平的驱动表达的活性或者功能。相反，诱导型启动子仅响应于刺激物而具有活性(或使其失活)，或者显著上调或下调。这两种类型的启动子均可以用于本发明的方法中。用于本发明中的诱导型启动子包括响应于刺激物而介导可操作地连接的基因转录的启动子，所述刺激物例如外源提供的小分子(例如SEQ IDNO:11中的葡萄糖)、温度(热或者冷)、培养基中缺少氮等。合适的启动子可以激活基本沉默的基因的转录，或者优选大幅度上调低水平转录的可操作地连接基因的转录。
任选含有终止区控制序列，如果使用该序列，那么首先选择便利的序列，因为终止区相对可以交叉使用。终止区可以与转录起始区(启动子)同源、可以与目标DNA序列同源或者可以从其它来源获得。参见例如Chen和Orozco,Nucleic Acids Res.(1988)16:8411。
本发明还提供了控制序列和重组基因以及含有二者并且使目的基因分隔表达的载体。被靶向的细胞器是叶绿体、质体、线粒体和内质网。此外，本发明提供了控制序列和重组基因以及含有二者并且使蛋白分泌到细胞外的载体。
可以利用质体靶向信号使原藻核基因组中表达的蛋白靶向质体。小球藻内源性质体靶向序列是已知的，例如小球藻核基因组中编码靶向质粒的蛋白的基因，参见例如GenBank保藏编号AY646197和AF499684。在一个实施方案中，本发明的载体中使用这种控制序列，以使表达蛋白靶向原藻质体。
已经描述了使用藻类质体靶向序列使异源蛋白靶向宿主细胞中的正确代谢区。参见美国专利申请公布20100151112的实施例11和12。在一个实施方案中，使用异源蛋白的天然质体靶向序列来将异源蛋白运输到质体/叶绿体中。在一些实施方案中，将天然质体靶向序列置换为异源质体靶向序列以便增加重组蛋白或异源蛋白到质体/叶绿体中的运输。在一些实施方案中，将天然质体靶向序列置换为微藻蛋白的质体靶向序列。对序列进行BLAST比对，并分析与运输至质体/叶绿体中的已知蛋白质的同源性。对编码这些蛋白质的cDNA进行克隆，并且从这些cDNA中分离质体靶向序列。这些藻类质体靶向序列可用于适用于本发明的细胞和方法中的表达载体。
在本发明的另一个实施方案中，使原藻中表达的多肽靶向内质网。表达载体中含有合适的滞留或者分选信号确保蛋白滞留于内质网(ER)中，不进入下游的高尔基体。例如，Wageningen UR-Plant Research International的载体IMPACTVECTOR1.3包含熟知的KDEL滞留或者分选信号。利用该载体使滞留于ER中具有实践优势，因为已报道其可以使表达水平提高5倍或者更多。主要原因似乎是与细胞质相比，ER中含有较低浓度和/或不同的负责已表达蛋白翻译后降解的蛋白酶。在绿微藻中具有功能的ER滞留信号是已知的。例如参见Proc Natl Acad Sci U S A.2005Apr26;102(17):6225-30。
在本发明的另一个实施方案中，使多肽靶向分泌到细胞外至培养基中。参见例如Hawkins等，Current Microbiology Vol.38(1999),pp.335-341中在小球藻中具有活性的分泌信号，根据本发明的方法，其可以在原藻中使用。
B.基因和密码子优化
通常基因包含启动子、编码序列和终止控制序列。当通过重组DNA技术组装时，基因被称为表达盒，其侧面具有限制性位点，以便于插入到用于将重组基因引入宿主细胞中的载体中。表达盒侧翼可以具有帮助表达盒通过同源重组稳定融入到基因组中的基因组DNA序列或者其它核酸。任选地，载体和其表达盒可以保持未整合状态，在这种情况下，载体通常含有能够使异源载体DNA进行复制的复制起点。
载体中存在的共有基因是编码一种蛋白的基因，所述蛋白的表达使得能够将含有该蛋白的重组细胞与没有表达该蛋白的细胞区别开来。这种基因和其相应的基因产物称为可筛选标记。用于转化原藻的转基因质粒中可以使用可筛选标记。合适的可筛选标记的实例包括G418抗性基因、硝酸还原酶基因(参见Dawson等，(1997),Current Microbiology35:356-362)、潮霉素磷酸转移酶基因(HPT；参见Kim等(2002),Mar.Biotechnol.4:63-73)、新霉素磷酸转移酶基因和赋予脉霉素抗性的ble基因(Huang等(2007),Appl.Microbiol.Biotechnol.72:197-205)。测定微藻对抗生素的敏感性的方法是已知的。例如，Mol Gen Genet.1996Oct16;252(5):572-9。
出于本发明的目的，用于制备本发明的实施方案的重组宿主细胞的表达载体可包含至少2个、并且通常是3个基因，如果其中一个基因是可筛选标记的话。例如，可以通过用本发明中的载体进行转化来制备本发明中经过基因工程改造的原藻，所述载体除了可筛选标记外还包含一个或多个外源基因，例如像木糖利用基因或者木糖利用基因和酰基ACP硫酯酶基因。可以利用诱导型启动子使一个或者两个基因表达，所述启动子允许控制这些基因表达的相对时机，以提高脂类产率和促进其转化成为脂肪酸酯。两个或更多个外源基因的表达可以处于同一诱导型启动子的控制下，或者处于不同诱导型(或者组成型)启动子的控制下。在后者情况下，可以诱导第一外源基因表达持续第一时间段(其间第二外源基因可以被诱导或者不被诱导)并且可以诱导第二外源基因表达持续第二时间段(其间第一外源基因可以被诱导或者不被诱导)。
在其它实施方案中，两个或更多个外源基因(除了任意可筛选标记之外)是木糖利用基因、脂肪酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶、硬脂酰-ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶和脂肪酰基-CoA/醛还原酶，它们的组合作用能够产生醇类产物。进一步提供了外源基因的其它组合，除木糖利用酶之外，还包括但不限于脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂肪酰基-CoA还原酶，以产生醛类。在一个实施方案中，载体除木糖利用基因之外还提供脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA还原酶和脂肪醛脱羰基酶的组合，以产生烷烃。在这些实施方案中的每个中，可以利用诱导型启动子来表达一个或多个外源基因。
表达两个或更多个外源基因的其它说明性载体包括同时编码木糖利用酶和可筛选标记的载体。用本发明的载体转化的重组原藻由于具有经过工程改造的利用木糖作为碳源的能力，因而可以用于以较低的制造成本生产脂类。插入如上文所述的外源基因可以与通过定向和/或随机诱变来破坏多糖生物合成相结合，这使得引导甚至更大的碳流进行脂类生产。个别地和组合地利用营养型转变、改变脂类生产的工程改造和用外源酶进行处理，使得由微生物生产的脂类组合物发生改变。这种改变可以是所生产的脂类的量、所生产的一种或者多种碳氢化合物的量(相对于其它脂类)和/或微生物中生产的脂类类型的变化。例如，可以对微藻进行工程改造，以生产较高量和/或百分比的TAG。
为了使重组蛋白最佳表达，使用具有被转化宿主细胞优先使用的密码子的产生mRNA的编码序列是有益的。因此，转基因的适当表达需要转基因的密码子使用与转基因表达的生物体中的特异性密码子偏倚性相符。这种作用精确的潜在机制有许多，包括可用的氨基酰tRNA库与细胞中合成的蛋白之间的适当平衡，以及需要时使转基因信使RNA(mRNA)更加有效地翻译。当转基因中的密码子使用未经优化时，可用的tRNA库不足以使异源mRNA有效翻译，导致核糖体中止和终止以及转基因mRNA可能不稳定。
本发明提供了经密码子优化的核酸，其使得原藻中的重组蛋白成功表达。通过研究从桑椹形原藻分离的cDNA序列，对原藻物种中的密码子使用进行分析。该分析对超过24,000密码子进行查询，其结果显示于下面表1中。
表1.原藻品种中的优选密码子使用
Figure BDA0000408990500000361
Figure BDA0000408990500000371
在其它实施方案中，根据除原藻品种以外的另一种微藻品种对重组载体中的基因进行密码子优化。例如，使基因重编码以在微藻中表达的方法描述于美国专利7,135,290中。可以在例如GenBank的密码子使用数据库中获得密码子优化的另外的信息。
虽然本发明的方法和材料允许将任何外源基因引入到原藻中，但是如下面几章所讨论，特别感兴趣的是与木糖利用和脂类途径修饰相关的基因。
V.木糖利用
本发明的一个实施方案还提供了已经过修饰来改变微生物代谢不同原料的能力的重组产油微生物，所述原料包括戊糖，如在纤维素来源中富含的木糖。这些重组产油微生物包括具有质体和II型脂肪酸合成途径且属于植物界、微藻、产油酵母、产油细菌和产油真菌的微生物。在一些实施方案中，重组产油微生物是微藻。在其它实施方案中，重组产油微生物是原藻属的微藻。在一个实施方案中，重组产油微生物被基因工程改造成含有木糖利用中所涉及的一个或多个外源基因。在下文中详细描述了木糖利用中所涉及的基因。在本发明的一个或多个实施方案中包括了：木糖利用中所涉及的基因可单独使用或者与涉及木糖利用的其它基因(对这些基因的数量或组合没有限制)组合使用。在本发明的一个或多个实施方案中包括了：木糖利用中所涉及的基因可与涉及其它碳源的利用或者脂类生产的其它外源基因(对这些基因的数量或组合没有限制)组合使用。
在一个实施方案中，本发明的重组细胞进一步包含一个或多个外源木糖利用基因。真核生物体利用两种不同途径来代谢木糖。一个这样的途径为氧代还原(氧化还原酶)途径或者醛酮还原酶途径。在此途径的第一步骤中，木糖还原酶将D-木糖还原成木糖醇。然后木糖醇脱氢酶将木糖醇氧化成木酮糖。随后木酮糖激酶将木酮糖转化成木酮糖-5-磷酸并且随后经由戊糖磷酸途径进行代谢。用于代谢木糖的另一个途径是木糖异构酶途径。在木糖异构酶途径的第一个步骤中，木糖异构酶使木糖异构化成木酮糖。随后木酮糖激酶将木酮糖转化成木酮糖-5-磷酸。然后经由戊糖磷酸途径来代谢木酮糖-5-磷酸。
在一些生物体中，存在这些途径中的一种或多种并且联合利用。在一些生物体中，存在氧代还原途径和木糖异构酶途径二者。在这些生物体中，木糖醇的产生可以抑制木糖异构酶的活性。在这些情况下，表达木糖醇脱氢酶以解除这种抑制。
在不利用木糖或者不能以有效方式利用木糖的生物体中，以上途径中的一种或两种可能不存在或者部分存在于这些生物体中。基因工程改造这些生物体以有效利用木糖可包括引入这些途径中的一种或两种中的一个或若干个(或全部)的成员。转运体蛋白的引入对于将木糖从细胞外部环境中转运到细胞中或者将木糖更有效地转运到细胞中可能是必需的。包括对戊糖(如木糖)具有特异性的转运体蛋白在内的转运体蛋白是细胞膜蛋白和编码这些蛋白质的基因的家族，它们将糖(如木糖)从细胞外部环境中(如培养基)转运到细胞溶质中。转运体可以是主动的或被动的。被动转运体在不消耗能量的情况下帮助分子沿着浓度梯度(从较高浓度区域到较低浓度区域)转运。在一些实施方案中，所述转运体是对戊糖具有特异性的戊糖转运体。在其它实施方案中，转运体是来源于树干毕赤酵母的转运体。在其它实施方案中，转运体来源于树干毕赤酵母SUT1(不限于GenBank保藏编号XP_001387，其以引用的方式并入本文)(SEQ ID NO:37)、SUT2和/或SUT3转运体或者来源于酿酒酵母HXT转运体。主动转运体在通常逆浓度梯度地转运分子时消耗能量。主动转运体包括但不限于使用ATP作为能量来源的初级主动转运体((即ATP结合序列盒(ABC)转运体)和使用来自化学渗透梯度的能量的次级主动转运体，并且所述次级主动转运体包括但不限于逆向转运体和同向转运体，即中间假丝酵母的GXS1蛋白(SEQ ID NO:39)(不限于GenBank保藏编号CAI44932.1，其以引用的方式并入本文)和H+-同向转运体样蛋白(例如SEQ ID NO:41)。在一些实施方案中，所述转运体来源于来自拟南芥的At5g59250n基因。在其它实施方案中，所述转运体来源于编码来自里氏木霉的XLT1蛋白(SEQ ID NO:43)的基因。
此外，引入转运体蛋白(例如木酮糖-5-磷酸易位体)也可能是必需或优选的以便将正确底物分布到微生物的正确亚代谢区中。戊糖代谢被认为是通过戊糖磷酸途径来发生，其主要发生在质体中。这些易位体是质体膜蛋白和编码这些蛋白质的基因的家族，它们将己糖、丙糖或戊糖或者这些分子的磷酸化形式从细胞溶质中转运到质体中。在一个实施方案中，这种易位体对戊糖或戊糖磷酸分子较之对己糖/己糖磷酸或者丙糖/丙糖磷酸具有偏好。在另一个实施方案中，所述易位体来源于编码木酮糖5-磷酸易位体蛋白的基因。在另一个实施方案中，所述易位体来源于来自拟南芥的XPT基因。在一些情况下，所述易位体是包含被工程改造以利用木糖的微生物的内源性转运肽的嵌合蛋白。例如，具有原藻的内源性转运肽(例如SEQ IDNO:45、47和49)的嵌合易位体适用于一些实施方案中。
在一些实施方案中，引入到微生物中的异源外源基因是氧代还原途径或者醛酮还原酶途径的一部分。在一些情况下，异源外源基因是木糖还原酶。在其它情况下，异源外源基因是木糖醇脱氢酶。在其它实施方案中，木糖醇脱氢酶是来自树干毕赤酵母的XYL2基因。
在其它实施方案中，引入到微生物中的异源外源基因是木糖异构酶途径的一部分。在一些情况下，所述异源外源基因是木糖异构酶。在一些实施方案中，所述木糖异构酶由来自梨囊鞭菌属的XYLA基因进行编码。在其它实施方案中，所述异源外源基因是木酮糖激酶。在一些实施方案中，所述木酮糖激酶由来自树干毕赤酵母的XYL3基因进行编码。
在一些实施方案中，异源外源基因编码易位体蛋白。在其它实施方案中，这种易位体是戊糖磷酸易位体。在其它实施方案中，所述戊糖磷酸易位体由来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的XPT基因进行编码。在其它实施方案中，基因工程改造的微生物包含上述外源异源基因中的一个或多个。在其它实施方案中，基因工程改造的微生物包含所有的上述外源异源基因。
以下实施例3表明木糖异构酶途径蛋白、氧代还原途径酶和木糖易位体的不同成员被成功引入到微藻中以产生在异养条件下生长时可以利用木糖作为固定碳源的基因工程改造的微藻细胞。
实施例7表明木糖转运体、木糖氧化还原酶/异构酶合成酶以及木糖易位体的不同组合(参见表6)被引入到原藻中。实施例8表明若干选定品种生产脂类的能力。
在一些实施方案中，细胞可进一步包含一个或多个外源蔗糖利用基因，如美国专利申请公布20100151112所述。这种细胞可同时代谢木糖和蔗糖。
VI.脂类途径工程改造
除了改变原藻利用原料(如含有木糖的原料)的能力之外，本发明还提供了经过进一步修饰以改变所生产脂类的性质和/或比例的重组原藻。可以进一步或者任选地对该途径进行修饰，以改变通过对脂肪酸途径中的脂类和中间产物进行酶促加工而产生的多种脂类分子的性质和/或比例。在多个实施方案中，本发明的重组原藻细胞相对于其未经转化的对应物能够优化单位体积和/或单位时间的脂类产率、碳链长度(例如对于可再生柴油生产或者需要脂类原料的工业化学品应用)，使双键或者三键数量减少(任选地至零)，增加特定脂类型或者不同脂类群的氢:碳比率。
在特定的实施方案中，控制代谢向脂肪酸合成方向进行的一种或者多种关键酶被“上调”或者“下调”，以促进脂类生产。可以例如通过用表达构建体转化细胞来达成上调，所述表达构建体中例如利用强启动子和/或使转录增加的增强子元件使编码目标酶的基因表达。这种构建体可以包括可筛选标记，以使得能够对转化子进行筛选，这可以使得构建体得到维持或者扩增并使得所编码的酶的表达水平增加。根据本发明的方法，适于上调的酶的实例描述在美国专利申请公布20100151112中。
基因的上调和/或下调可以应用于控制脂肪酸生物合成途径的基因表达的全局调控因子。因此，脂肪酸合成中的一种或者多种全局调控因子可以适宜地被上调或者下调，以分别抑制或者增强多种脂肪酸合成基因的表达并最终增加脂类的产生。其实例包括类固醇调控元件结合蛋白(SREBP)，例如SREBP-1a和SREBP-1c(例如参见GenBank保藏编号NP_035610和Q9WTN3)。
本发明的实施方案还提供了经过修饰以含有一个或多个外源基因的重组微藻细胞，所述外源基因编码脂类修饰酶，如脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛脱羰基酶、脂肪醛还原酶和角鲨烯合成酶(参见美国专利申请公布20100151112)。
因此，在特定的实施方案中，对本发明的微生物进行基因工程改造，以表达木糖利用基因以及一个或多个外源基因，所述外源基因选自由酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶或者天然共表达的酰基载体蛋白。与脂酶基因表达相关的适宜表达方法描述于上面，除了其它方法之外，其包括诱导型表达和分隔型表达。脂肪酰基-ACP硫酯酶在脂类合成过程中使脂肪酸与酰基载体蛋白(ACP)裂解。通过进一步的酶促加工，裂解的脂肪酸接着与辅酶相结合，以产生酰基-CoA分子。该酰基-CoA分子是脂肪酰基-CoA还原酶酶活性的底物(产生醛)以及脂肪酰基-CoA/醛还原酶酶活性的底物(产生醇)。上面鉴定的脂肪酰基-CoA还原酶作用产生的醛进一步是脂肪醛还原酶酶活性的底物(产生醇)或者是脂肪醛脱羰基酶酶活性的底物(产生烷烃或者烯烃)。
在一些实施方案中，利用本文中描述的方法产生的脂肪酸、甘油脂或者相应的一元醇、醛、烷烃或者烯烃含有8、10、12或者14个碳原子。优选用于生产柴油、生物柴油、可再生柴油或者喷气燃料的脂肪酸或者应用于工业中的相应一元醇、醛、烷烃或者烯烃含有8至14个碳原子。在某些实施方案中，上述脂肪酸以及其它相应的碳氢化合物分子是饱和的(没有碳-碳双键或者三键)、单不饱和的(单个双键)、多不饱和的(两个或者多个双键)，是直链(不是环状)或者支化的。对于燃料生产，优选较大的饱和度。
上文直接描述的酶具有优先水解含有特定数量的碳原子的底物的特异性。例如，脂肪酰基-ACP硫酯酶能够优先使具有12个碳原子的脂肪酸与ACP裂解。在一些实施方案中，ACP和长度特异性硫酯酶相互具有亲和性，使得其特别地作为组合物使用(例如外源的ACP和硫酯酶基因可以在其来源的特定组织或者生物体中天然共表达)。因此，在各种实施方案中，本发明的一个实施方案的重组细胞可以含有外源基因，所述外源基因编码根据底物中所含的碳原子数量和饱和型态特异性催化酶促活性(例如使脂肪酸与ACP裂解、将酰基-CoA还原成为醛或者醇、或者将醛转化成为烷烃或KAS、SAD或FAD基因的基因产物)的蛋白质。关于表达外源硫酯酶的各种载体和方法，请参见美国专利申请公布20100151112。因此，在本发明的一个实施方案中，基因修饰的细胞同时代谢木糖并产生改变的脂肪酸特性(即由细胞产生的脂肪酸中的链长度的分布和/或饱和型态)。
因此，本发明提供了经过基因工程改造以表达木糖利用酶和一种或多种脂途径酶的细胞(并且在特定实施方案中为原藻细胞)，所述酶的表达水平与相同物种的野生型细胞相比发生改变。在一些情况下，当两种细胞在相同条件下生长时，该细胞与野生型细胞相比生产更多脂类。在一些情况下，对细胞进行基因工程改造和/或筛选，以使其以高于野生型细胞的水平表达脂途径酶。在一些情况下，脂途径酶选自由丙酮酸脱氢酶、酰基-CoA羧化酶、酰基载体蛋白和甘油-3-磷酸酰基转移酶组成的组。在一些情况下，对细胞进行基因工程改造和/或筛选，以使其以低于野生型细胞的水平表达脂途径酶。在细胞以较低水平表达脂途径酶的至少一个实施方案中，脂途径酶包括柠檬酸合成酶。
在一些实施方案中，对细胞进行基因工程改造和/或筛选，以使其表达脂肪酸合成中的全局调控因子，所述全局调控因子的表达水平与野生型细胞相比发生改变，因而多种脂肪酸合成基因的表达水平与野生型细胞相比发生改变。在一些情况下，脂途径酶包括修饰脂肪酸的酶。在一些情况下，脂途径酶选自由硬脂酰基-ACP去饱和酶和甘油脂去饱和酶组成的组。
在其它实施方案中，本发明涉及含有一个或多个外源基因的产油微生物，其中所述外源基因编码选自木糖利用酶的蛋白质以及选自由脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和酰基载体蛋白组成的组的蛋白质。在一个实施方案中，外源基因与响应于刺激物而可诱导或者可抑制的启动子可操作地连接。在一些情况下，所述刺激物选自由外源提供的小分子、热、冷和培养基中限制氮或者没有氮组成的组。在一些情况下，外源基因在细胞代谢区中表达。在一些实施方案中，细胞代谢区选自由叶绿体、质体和线粒体组成的组。在一些实施方案中，微生物是桑椹形原藻、克鲁格尼原藻、大型原藻或者小型原藻。用于脂途径修饰的各种外源基因和基因组合描述在美国专利申请公布20100151112中。
本发明的一个实施方案还提供了用于生产醇的方法，其包括在培养基中培养重组原藻细胞群，其中所述细胞含有：编码木糖利用酶的第一外源基因；编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的第二外源基因；以及编码脂肪酰基-CoA/醛还原酶的第三外源基因，并且所述细胞合成与酰基载体蛋白(ACP)连接的脂肪酸，脂肪酰基-ACP硫酯酶催化使脂肪酸与ACP裂解，以通过进一步加工产生脂肪酰基-CoA，并且脂肪酰基-CoA/醛还原酶催化将酰基-CoA还原成为醇。
本发明的一个实施方案还提供了在原藻细胞中生产醛类的方法。在一个实施方案中，该方法包括在培养基中培养原藻细胞群，其中所述细胞含有：编码木糖利用酶的第一外源基因；编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的第二外源基因；以及编码脂肪酰基-CoA还原酶的第三外源基因，并且所述细胞合成与酰基载体蛋白(ACP)连接的脂肪酸，脂肪酰基-ACP硫酯酶催化使脂肪酸与ACP裂解，以通过进一步加工产生脂肪酰基-CoA，并且脂肪酰基-CoA还原酶催化将酰基-CoA还原成为醛。
本发明的一个实施方案还提供了在含有外源木糖利用基因的原藻细胞中生产具有指定碳链长度的脂肪酸分子的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在培养基中培养产油原藻细胞群，其中所述微生物含有编码外源木糖利用酶和脂肪酰基-ACP硫酯酶的第一外源基因，所述脂肪酰基-ACP硫酯酶特异地或者优先地对特定碳链长度(如8、10、12或者14个碳原子)具有活性，并且其中所述微生物合成与酰基载体蛋白(ACP)连接的脂肪酸，并且当脂肪酸被合成为具有特定碳链长度时，硫酯酶催化使脂肪酸与ACP裂解。
在上面描述的各种实施方案中，所述细胞可以含有编码脂类途径酶的至少一个外源基因。在一些情况下，脂类途径酶选自由硬脂酰基-ACP去饱和酶、甘油脂去饱和酶、丙酮酸脱氢酶、酰基-CoA羧化酶、酰基载体蛋白和甘油-3-磷酸酰基转移酶组成的组。在其它情况下，所述细胞含有脂类修饰酶，其选由脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和/或酰基载体蛋白组成的组。
VII.燃料和化学品或者其它产品的生产
对于根据本发明的实施方案的燃料生产，通过任何便利的方法收获或者以其它方式收集由本发明的细胞产生的脂类。可以通过全细胞提取分离脂类。首先将细胞破坏，接着可以从细胞质中分离出胞内的脂类和与细胞膜/细胞壁相连的脂类以及胞外的碳氢化合物，例如通过利用上面描述的离心作用。在一些实施方案中，使微生物的细胞裂解之后提取微生物中产生的胞内脂类。一经提取，即对脂类进行进一步提炼，以产生油类、燃料或者油化学品。
培养结束后，可以从发酵液中分离微生物。任选地，通过离心以产生浓缩糊状物来实现分离。接着任选地用清洗液(例如DI水)对生物质进行清洗，以去除发酵液和碎片。任选地，在细胞破坏前还可以使经过清洗的微生物生物质干燥(烘干、冻干等)。任选地，当发酵完成时，细胞无需从一些或者所有发酵液中分离就可以进行裂解。例如，当裂解细胞时，细胞与胞外液体的v:v比率可以小于1:1。
可以使含有脂类的微生物裂解，以产生裂解物。如本文中所详细描述，可以通过任意便利的方法来完成裂解微生物的步骤，包括热诱导的裂解、加入碱、加入酸、利用酶(如蛋白酶和多糖降解酶)、利用超声作用、机械裂解、利用渗透压休克、用溶解性病毒感染和/或表达一个或多个裂解基因。进行裂解，以释放由微生物产生的胞内分子。裂解微生物的这些方法中的每一种可以作为单独的方法使用，或者同时或依次组合使用。可以通过显微镜分析来观察细胞破裂的程度。利用本文描述的一种或者多种方法，通常可以观察到多于70%的细胞破裂。优选细胞破裂多于80%、更优选多于90%且最优选约100%。
在特定的实施方案中，使微生物在生长后裂解，例如以增加细胞脂类和/或碳氢化合物的暴露，将其提取或者进一步加工。可以调整脂酶表达(例如通过诱导型启动子)或者细胞裂解的时机，以优化脂类和/或碳氢化合物的产率。下面描述了一些裂解技术。这些技术可以单独使用或者组合使用。
在本发明的一个实施方案中，裂解微生物的步骤包括对含有微生物的细胞悬液进行加热。在该实施方案中，对含有微生物的发酵液(或者从发酵液中分离的微生物悬液)进行加热直至微生物即微生物的细胞壁和细胞膜降解或者分解。通常所使用的温度是至少50℃。更有效的细胞裂解使用较高温度，例如至少60℃、至少70℃、至少80℃、至少90℃、至少100℃、至少110℃、至少120℃、至少130℃或者更高温度。可以通过煮沸微生物进行通过热处理的细胞裂解。任选地，可以在高压灭菌锅中进行热处理(不煮沸)。可以使经过热处理的裂解物冷却，以用于进一步处理。还可以通过蒸汽处理进行细胞破裂，即通过加入加压蒸汽。使细胞破裂的微藻蒸汽处理描述于例如美国专利号6,750,048中。在一些实施方案中，可以通过向发酵罐中喷射蒸汽并且使发酵液在期望温度保持少于约90分钟、优选少于约60分钟、更优选少于约30分钟来进行蒸汽处理。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的步骤包括向含有微生物的细胞悬液中加入碱。该碱应该足够强效，以使所用微生物的至少一部分蛋白质类化合物水解。用于溶解蛋白的碱是化学领域已知的。用于本发明方法中的示例性碱包括但不限于锂、钠、钾、钙的氢氧化物、碳酸盐和重碳酸盐以及其混合物。优选的碱是KOH。使细胞破裂的微藻碱处理描述于例如美国专利号6,750,048中。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的步骤包括向含有微生物的细胞悬液中加入酸。可以利用浓度为10-500mN或者优选40-160mN的酸完成酸裂解。优选在高于室温的温度下(例如40-160℃，优选50-130℃的温度)进行酸裂解。对于中等温度(例如室温至100℃，具体地室温至65℃，酸处理可以与声波处理或者其它细胞破裂方法结合使用。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的步骤包括利用酶使微生物裂解。优选用于裂解微生物的酶是蛋白酶和多糖降解酶，例如半纤维素酶(例如来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的半纤维素酶，Sigma Aldrich,St.Louis,MO;#H2125)、果胶酶(例如来源于根霉(Rhizopus sp.)的果胶酶，Sigma Aldrich,St.Louis,MO;#P2401)、Mannaway4.0L(Novozymes)、纤维素酶(例如来源于绿色木霉(Trichoderma viride)的纤维素酶;Sigma Aldrich,St.Louis,MO;#C9422)和崩溃酶(例如来源于担子菌属(Basidiomycetes sp.)的崩溃酶，Sigma Aldrich,St.Louis,MO;#D9515)。
在本发明的其它实施方案中，利用酶来完成裂解，所述酶例如纤维素酶(例如任选地来源于小球藻或者小球藻病毒的多糖降解酶)、或者蛋白酶(例如灰色链球菌(Streptomyces griseus)蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、列于Degradation of Polylactide by Commercial Proteases,Oda Y等,Journalof Polymers and the Environment,第8卷,第1期,2000年1月，第29-32(4)页中的蛋白酶、Alcalase2.4FG(Novozymes)和Flavourzyme100L(Novozymes)。还可以使用蛋白酶和多糖降解酶的任意组合物，包括上述蛋白酶和多糖降解酶的任意组合物。
可以利用压榨机进行裂解。在该过程中，在高压力下挤压生物质通过螺旋型设备，以使细胞裂解并使胞内质类释放并与细胞中的蛋白和纤维(以及其它组分)分离。参见PCT专利申请号US10/031108，其以引用的方式并入本文。
在一些情况下，通过利用超声波(即声波作用)进行裂解微生物的步骤。因此，还可以利用高频率声波裂解细胞。可以电动产生声波，并通过金属件传送至经过适当浓缩的细胞悬液中。这种声波作用(或者超声作用)基于在细胞悬液中产生气泡而破坏细胞的完整性。
在一些情况下，通过机械裂解进行裂解微生物的步骤。可以机械地裂解细胞，任选地进行匀浆，以帮助收集碳氢化合物(例如脂类)。例如，可以使用压力破碎器将含有浆液的细胞泵入限制性阻尼阀中。使用高压(高至1500巴，接着通过出口喷嘴瞬间扩散。通过三种不同的机制完成细胞破裂：对阀门的冲击、阻尼的高液体切力和流出时压力的突然下降，这使得细胞爆裂。该方法使胞内分子释放。任选地，可以使用球磨机。在球磨机中，用小研磨颗粒(例如珠)搅动细胞悬液。由于切力、珠之间的研磨和与珠碰撞，细胞破裂。珠使细胞破裂，以释放细胞内含物。还可以通过切力使细胞破裂，例如利用混合(例如用高速度或者Waring混合器)、弗氏细胞压碎器，或者甚至当细胞壁脆弱时使用离心使细胞破裂。
在一些情况下，通过应用渗透压休克进行裂解微生物的步骤。
在一些情况下，裂解微生物的步骤包括用溶解性病毒感染微生物。已知多种病毒适用于本发明中以使微生物裂解，对于特定的微生物，选择和利用特定的溶解性病毒在本领域的技术水平内。例如，绿昌履虫绿球藻(paramecium bursaria chlorella)病毒(PBCV-1)是大型二十面体成斑双链DNA病毒组(藻类DNA病毒(Phycodnaviridae)科，绿藻病毒属)的原型，其可以在某些单细胞真核小球藻样绿藻中复制并使其裂解。因此，通过用合适的小球藻病毒感染，可以裂解任何易感的微藻。用小球藻病毒感染小球藻物种的方法是已知的。参见例如Adv.Virus Res.2006;66:293-336;Virology,1999Apr25;257(1):15-23;Virology,2004Jan5;318(1):214-23;Nucleic AcidsSymp.Ser.2000;(44):161-2;J.Virol.2006Mar;80(5):2437-44和Annu.Rev.Microbiol.1999;53:447-94。
在一些情况下，裂解微生物的步骤包括自溶。在该实施方案中，根据本发明的微生物经基因工程改造，以产生裂解微生物的裂解蛋白。可以利用诱导型启动子使裂解基因表达，以使细胞可以首先在发酵罐中生长至合适密度，随后诱导启动子，使裂解基因表达，以裂解细胞。在一个实施方案中，裂解基因编码多糖降解酶。在某些其它的实施方案中，裂解基因是来源于溶解性病毒的基因。因此，例如可以使来源于小球藻病毒的裂解基因在藻类细胞中表达，参见Virology260,308-315(1999);FEMSMicrobiology Letters 180(1999)45-53;Virology263,376-387(1999)和Virology230,361-368(1997)。优选利用诱导型启动子使裂解基因表达，例如在微藻中具有活性并且可被刺激物(例如小分子的存在、光、热和其它刺激物)诱导的启动子。
可以使用多种方法将脂类从由上述方法中产生的细胞裂解物中分离出来。例如，可以用疏水性溶剂(例如己烷，参见Frenz et al.1989,EnzymeMicrob.Technol.,11:717)提取脂类和脂类衍生物，例如脂肪醛、脂肪醇和碳氢化合物(例如烷烃)。还可以利用液化(参见例如Sawayama等，1999,Biomass and Bioenergy17:33-39和Inoue等，1993,Biomass Bioenergy6(4):269-274)、油类液化(参见例如Minowa等，1995,Fuel74(12):1735-1738)和超临界CO2提取法(参见例如Mendes等，2003,Inorganica Chimica Acta356:328-334)提取脂类和脂类衍生物。Mial和Su描述了从Chlorellaprototheocoides培养物中回收微藻脂类的方法，其中通过离心收集细胞，用蒸馏水清洗并使其冷冻干燥。得到的细胞粉在研钵中磨碎，接着用n-己烷进行提取。Miao和Wu,Biosource Technology(2006)97:841-846。
因此，可以通过用有机溶剂萃取对由本发明的微生物生产的脂类、脂类衍生物和碳氢化合物进行回收。在一些情况下，优选的有机溶剂是己烷。通常将有机溶剂直接加入到裂解物中，不需要提前分离裂解物组分。在一个实施方案中，使上面描述的一种或者多种方法中产生的裂解物与有机溶剂接触一段时间，所述时间足以使脂类和/或碳氢化合物组分与有机溶剂形成溶液。在一些情况下，接着可以进一步提炼溶液，以回收特定的期望脂类或者碳氢化合物组分。己烷提取方法是本领域熟知的。
可以利用一种或者多种酶(包括如上面描述的脂酶)对由本文中描述的细胞生产的脂类和脂类衍生物(例如脂肪醛、脂肪醇和碳氢化合物(例如烷烃))进行修饰。当碳氢化合物处于细胞胞外环境中时，可以在一定条件下将一种或者多种酶加入到该环境中，在所述一定条件中，酶可以对碳氢化合物进行修饰，或者由碳氢化合物前体完成其合成。任选地，加入一种或者多种催化物(例如酶)之前，可以将碳氢化合物部分地或者完全地从细胞材料中分离。这种催化物是外源加入的，其活性发生于细胞外或者体外。
因此，任选地，可以通过常规方法对如本文中所描述由细胞体内生产的或者经体外酶促修饰的脂类和碳氢化合物进行进一步加工。所述加工可以包括“裂化”以减少大小，因而增加碳氢化合物分子的氢:碳比率。碳氢化合物和甘油三酯油类加工中常规使用催化和热学裂化方法。催化方法涉及利用催化剂，例如固体酸催化剂。例如，所述催化剂可以是硅-铝或者沸石，其导致碳-碳键发生异裂或者不对称断裂，产生碳阳离子和氢阴离子。这些反应的中间产物随后发生重排或者与另一种碳氢化合物发生氢转移。因此，反应重新产生中间产物，形成自我繁殖链机制。还可以对碳氢化合物进行加工，以将其中碳-碳双键或者三键的数量减少，任选地至零。还可以对碳氢化合物进行加工，以去除或者消除其中的环或者环状结构。还可以对碳氢化合物进行加工，以增加氢:碳比率，其包括将氢(“氢化作用”)和/或裂化的碳氢化合物加到较小的碳氢化合物中。
热学方法涉及利用高温和高压，以减少碳氢化合物的大小。可以使用约800℃的高温和约700Kpa的高压。这些条件产生“轻”烃，有时该术语用于指富含氢的碳氢化合物分子(与光子通量不同)，其还可以通过缩合产生氢含量相对减少的较大碳氢化合物分子。该方法提供均裂或者对称断裂并且产生烯烃，所述烯烃任选地可以如上面所描述被酶促饱和。
催化方法和热学方法是植物中对碳氢化合物进行加工和提炼油的标准方法。因此，可以通过常规方法对如本文中所描述由细胞产生的碳氢化合物进行收集和加工或者提炼。参见Hillen等(Biotechnology andBioengineering,Vol.XXIV:193-205(1982)关于对微藻产生的碳氢化合物进行加氢裂化的报道。在任选的实施方案中，用另一种催化剂处理组分，例如有机化合物、加热和/或无机化合物。对于将脂类加工成为生物柴油，可以如本文中第V章所描述地使用转酯基工艺。
通过本发明的方法产生的碳氢化合物适用于多种工业应用中。例如，直链烷基苯磺酸(LAS)，用于几乎所有的去污剂和清洁制品类型中的一种阴离子表面活化剂，利用一般包含10-14个碳原子链的碳氢化合物。参见例如美国专利号6,946,430、5,506,201、6,692,730、6,268,517、6,020,509、6,140,302、5,080,848和5,567,359。表面活性剂(例如LAS)可以用于生产个人护理组合物和去污剂，例如描述于美国专利号5,942,479、6,086,903、5,833,999、6,468,955和6,407,044的表面活性剂。
由于可以获得能够取代化石燃料起始材料的可再生生物起始材料并且其用途是理想的，对生物来源的碳氢化合物组分在燃料(例如生物柴油、可再生柴油和喷气燃料)中的用途的兴趣不断增加。迫切需要从生物材料中生产碳氢化合物组分的方法。本发明通过利用由本文中描述的方法产生的脂类作为生物材料以生产生物柴油、可再生柴油和喷气燃料，提供了生产生物柴油、可再生柴油和喷气燃料的方法，满足了这种需要。
传统的柴油燃料是富含石蜡烃的石油馏出物。其具有370°至780°F的宽沸点范围，适用于在压缩点火发动机(例如柴油发动机车辆)中燃烧。The American Society of Testing and Materials(ASTM)根据沸点范围以及其它燃料性质(例如十六烷数量、浊点、燃烧点、粘度、苯胺点、含硫量、含水量、含灰量、铜片腐蚀度和炭渣)的可允许范围建立了柴油级别。可以将符合ASTM适当规格的、来源于生物质或者其它物质的任何碳氢化合物馏出物质定义为柴油燃料(ASTM D975)、喷气燃料(ASTM D1655)，或者如果是脂肪酸甲酯则定义为生物柴油(ASTM D6751)。
提取后，可以对从本文中描述的微生物生物质中回收的脂类和/或碳氢化合物组分进行化学处理，以生产用于柴油车和喷气式发动机的燃料。
生物柴油是一种颜色在金色和深棕色之间变化的液体，所述变化取决于生产原料。其几乎不可与水混合，具有高沸点和低蒸汽压。生物柴油是指与柴油等同加工的燃料，可以用于柴油发动机车辆中。生物柴油是生物可降解的并且无毒的。生物柴油与传统柴油相比的额外益处是发动机磨损较低。通常生物柴油包含C14-C18烷基酯。多个过程使如本文中所描述产生并分离的生物质或者脂类转化成为柴油燃料。生产柴油的优选方法是通过如本文中所描述脂类的转酯基作用。用作生物柴油的优选烷基酯是甲酯或者乙酯。
通过本文中描述的方法产生的生物柴油可以在大多数现代柴油发动机车中以任意浓度单独使用或者与传统柴油燃料混合使用。当与传统柴油燃料(石化柴油)混合使用时，生物柴油可以以从约0.1%至约99.9%存在。世界上大多数地方使用称为“B”因子的系统来表示生物柴油在任何燃料混合物中的量。例如，将含有20%生物柴油的燃料标记为B20。纯生物柴油被称为B100。
生物柴油还可以在家用和商用锅炉中用作加热燃料。现有的的燃油锅炉可能含有橡胶部件，需要进行转换以使其利用生物柴油运转。该转换过程通常相对简单，其涉及将橡胶部件换成合成部件，因为生物柴油是强效溶剂。由于其溶解力很强，燃烧生物柴油将会增加锅炉的效率。生物柴油可以用作柴油制剂的添加剂，以增加纯超低硫柴油(ULSD)燃料的润滑性，这是有利的，因为其几乎不含硫。与石化柴油相比，生物柴油是较好的溶剂，其可用于分解之前利用石化柴油运转的车辆燃料管中的残留沉积物。
可以通过富含油类的生物质中含有的甘油三酯的转酯基作用生产生物柴油。因此，在本发明的另一个方面中提供了生产生物柴油的方法。在一个优选的实施方案中，生产生物柴油的方法包括以下步骤(a)利用本文中公开的方法培养含脂微生物；(b)使含脂微生物裂解，以产生裂解物；(c)从已裂解的微生物中分离脂类；和(d)使脂类组合物转酯基化，从而产生生物柴油。上面已经描述了微生物生长的方法、使微生物裂解以产生裂解物的方法、在含有有机溶剂的介质中处理裂解物以形成异源混合物的方法和使经处理的裂解物分离成为脂类组合物的方法，这些方法也可以用于生产生物柴油的方法中。
生物柴油的脂类特性通常与原料油的脂类特性高度类似。可以使由本发明的方法和组合物提供的其它油类进行转酯基作用，以产生脂类特性包含(a)至少4%C8-C14；(b)至少0.3%C8；(c)至少2%C10；(d)至少2%C12；和(3)至少30%C8-C14的生物柴油。
可以使脂类组合物进行转酯基作用，以产生用作生物柴油的长链脂肪酸酯。优选的转酯基反应概述于下面，其包括碱催化的转酯基作用和利用重组脂酶的转酯基作用。在碱催化的转酯基过程中，在碱性催化剂(通常是氢氧化钾)存在下，甘油三酯与醇(例如甲醇或者乙醇)反应。该反应形成甲酯或者乙酯，以及副产物丙三醇(甘油)。
动物油和植物油通常由甘油三酯构成，其是游离脂肪酸与三元醇甘油形成的酯。在转酯基作用中，甘油三酯(TAG)中的甘油被短链醇(例如甲醇或者乙醇)取代。通常反应图解如下：
在该反应中，用碱使醇去质子化，以使其成为较强的亲核物质。通常过量(至50倍)使用乙醇或者甲醇。一般该反应进行地非常慢或者不进行。可以通过加热以及使用酸或者碱帮助反应进行得更快。转酯基反应不会消耗酸或者碱，因此其不是反应物而是催化剂。几乎所有的生物柴油均利用碱催化技术生产，因为其仅仅需要低温和低压，并且能够产生超过98%的产率(在起始油类具有低水平的湿度和游离脂肪酸的情况下)。
如上面所讨论，还可以利用酶(如脂酶)代替碱进行转酯基反应。例如可以在室温和80℃的温度下进行脂酶催化的转酯基反应，其中TAG对低级醇的摩尔比率大于1:1，优选约3:1。适用于转酯基反应中的脂酶包括但不限于列于表7中的脂酶。用于转酯基反应中的其它脂酶实例描述于例如美国专利号4,798,793、4,940,845、5,156,963、5,342,768、5,776,741和WO89/01032中。这些脂酶包括但不限于由微生物酒曲菌、曲霉菌、假丝酵母、毛霉菌、假单胞菌、根毛霉、假丝醇母和腐质霉产生的脂酶以及胰脂酶。适用于转酯基反应的脂酶描述在美国专利申请公布20100151112的表7中。
利用脂酶生产适用于柴油中的脂肪酸酯的一个挑战是脂酶的价格远远高于强碱过程中使用的氢氧化钠(NaOH)的价格。已经利用可以回收的固定化脂酶来应对这种挑战。但是，进行最小数量的回收循环后必须保持固定化脂酶的活性，以使基于脂酶的过程在生产成本方面能够与强碱过程竞争。通常用于转酯基反应中的低级醇对固定化脂酶有害。美国专利号6,398,707(2002年6月4日颁发给Wu等)描述了增强固定化脂酶的活性并且使活性降低的固定化脂酶再生的方法。一些适宜的方法包括将固定化脂酶在碳原子数不少于3的低级醇中浸泡一段时间，优选0.5-48小时，更优选0.5-1.5小时。一些适宜的方法还包括用碳原子数不少于3的低级醇对失活的固定化脂酶进行清洗，并随后将失活的固定化脂酶在植物油中浸泡0.5-48小时。
在特定的实施方案中，重组脂酶表达于生产脂酶所作用的脂类的相同微生物中。适宜的重组脂酶包括列于上面表7中的脂酶和/或具有美国专利申请公布20100151112的表7中所列GenBank保藏编号的脂酶，或者与所述表7中列出的一种脂酶具有至少70%氨基酸同一性的多肽以及显示脂酶活性的多肽。在附加的实施方案中，酶活性存在于与上面描述的序列之一具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或者至少约99%同一性的序列中，所有这些序列在此通过引用并入，如同被完全公开。编码脂酶和可筛选标记的DNA优选是经密码子优化的cDNA。重新编码基因以在微藻中表达的方法描述于本文中和美国专利号7,135,290中。
生物柴油的通用国际标准是EN14214.ASTM D6751，是美国和加拿大参考的最常用的生物柴油标准。德国使用DIN EN14214，英国要求符合BS EN14214。确定产品是否符合这些标准的基本工业测试通常包括气相色谱、HPLC和其它。符合质量标准的生物柴油是无毒的，其毒性度(LD50)大于50mL/kg。
尽管符合ASTM标准的生物柴油应该是无毒的，仍然存在杂质，其可能结晶和/或析出以及作为沉淀物从溶液中落下。当在较低温度下使用柴油时，沉淀物的形成尤其成为难题。沉淀物或者析出物可以引起很多问题，例如降低燃料流动、堵塞燃料管、堵塞过滤器等。专门去除生物柴油中这些杂质和沉淀物以产生质量较高的产物的过程是本领域熟知的。这种过程的实例包括但不限于对油进行预处理以去除杂质(例如磷酸脂和游离脂肪酸)(例如水洗、碱法净化和二氧化硅吸附过滤)和冷却过滤。冷却过滤是专门开发用以去除生产后生物柴油中存在的任何微粒和沉淀物的过程。该过程使生物柴油冷却并过滤出较低温度下使用柴油时可能形成的任何沉淀物或者析出物。这种过程是本领域熟知的，其描述于美国专利申请公布号2007-0175091中。适宜的方活可以包括使生物柴油冷却至低于约38℃的温度，以使污染物和杂质在生物柴油液体中以微粒形式析出。接着将硅藻土或者其它过滤材料加入到经冷却的生物柴油中，以形成浆液，随后通过加压叶片或者其它类型的过滤器对浆液进行过滤，以去除微粒。随后使经过滤的生物柴油通过精密过滤器，以去除任何残留的沉淀物和硅藻土，产生最终的生物柴油产品。
美国专利申请公布20100151112的实施例14描述了利用来源于桑椹形原藻的甘油三酯油类生产生物柴油。通过ASTM D6751A1方法测定，所述实施例14中生产的生物柴油的低温适应过滤性是300ml体积120秒。该测试包括过滤300ml的B100，在16小时内冷却至40°F，加热至室温，并利用具有不锈钢支撑的0.7微米玻璃纤维过滤器在真空条件下进行过滤。可以对本发明的油类进行转酯基作用，以产生低温适应时间少于120秒、少于100秒和少于90秒的生物柴油。
如果在特别低的温度下使用生物柴油，还可以使用后续步骤。这些步骤包括防冻处理和分馏。设计这两种过程，以通过降低浊点(生物柴油开始结晶的温度)提高燃料的冷流和冰冻性能。有几种使生物柴油防冻的方法。一种方法是将生物柴油与石化柴油混合。另一种方法是使用能够使生物柴油浊点降低的添加剂。另一种方法是任意地通过加入添加剂使饱和物结晶并随后过滤出结晶体来去除饱和的甲酯。分馏选择性地将甲酯分离成为单独的组分或者部分，使得能够去除或者含有特定的甲酯。分馏方法包括尿素分馏、溶剂分馏和热蒸馏。
由本发明方法提供的另一种有价值的燃料是可再生柴油，其包含烷烃，例如C10:0、C12:0、C14:0、C16:0和C18:0，因此其不同于生物柴油。高质量的可再生柴油符合ASTM D975标准。通过本发明的方法产生的脂类可以用作生产可再生柴油的原料。因此，在本发明的另一个方面中提供了生产可再生柴油的方法。可以通过至少三个过程生产可再生柴油：热水处理(加氢处理)、氢化处理和间接液化。这些过程产生非酯馏出物。在这些过程中，如本文中描述产生并分离的甘油三酯被转化成为烷烃。
在一个实施方案中，生产可再生柴油的方法包括(a)利用本文中公开的方法培养含脂微生物(b)使微生物裂解，以产生裂解物，(c)从已裂解的微生物中分离脂类和(d)对脂类进行脱氧和加氢处理，以产生烷烃，从而生产可再生柴油。可以通过利用有机溶剂(例如己烷)或者通过其它方法(例如描述于美国专利号5,928,696中的方法)从微生物生物质中提取从而获得适于生产可再生柴油的脂类。一些适宜的方法可以包括机械加压和离心。参见PCT专利申请US10/031108，其以引用的方式并入本文。
在一些方法中，首先使微生物脂类裂化并进行加氢处理，以分别减少碳链长度和使双键饱和。随后使材料异构化，同时进行加氢处理。接着可以通过蒸馏法去除石脑油组分，随后通过额外蒸馏使柴油燃料中的期望组分汽化并蒸馏，以使其符合ASTM D975标准，而剩余比符合D975标准的期望组分更重的组分。对经化学修饰的油类(包括甘油三酯油类)进行加氢处理、加氢裂化、脱氧和异构化的方法是本领域熟知的。参见例如欧洲专利申请EP1741768(A1)、EP1741767(A1)、EP1682466(A1)、EP1640437(A1)、EP1681337(A1)、EP1795576(A1)和美国专利号7,238,277、6,630,066、6,596,155、6,977,322、7,041,866、6,217,746、5,885,440、6,881,873。
在生产可再生柴油的方法的一个实施方案中，通过对脂类组合物进行加氢处理来对脂类进行处理，以产生烷烃。在热水处理中，通常生物质在高温和高压下在水中反应，以形成油灰和残留固体。转化温度通常是300°至660°F，压力是100至170个标准大气压(atm)，其足以使水基本保持液态。反应时间是15至30分钟。反应完成后，从水中分离有机物。从而产生适用于柴油的蒸馏物。
在制备可再生柴油的一些方法中，对甘油三酯进行处理的第一个步骤是进行氢化处理，以使双键饱和，随后在氢和催化剂存在下于高温发生脱氧作用。在一些方法中，氢化作用和脱氧作用发生在同一反应中。在其它方法中，氢化作用之前发生脱氧作用。接着任选地还在氢和催化剂存在下进行异构化作用。优选通过蒸馏去除石脑油组分。例如参见美国专利号5,475,160(甘油三酯的氢化作用)、5,091,116(脱氧作用、氢化作用和脱气)、6,391,815(氢化作用)和5,888,947(异构化作用)。
甘油三酯氢化作用的一种适宜方法包括制备铜、锌、镁和镧盐的液体溶液以及另一种碱金属溶液或者优选地是碳酸铵。可以将这两种溶液加热至约20℃至约85℃的温度，以一定比率在沉淀容器中混合，使沉淀容器中的pH值保持在5.5和7.5之间，以形成催化剂。在沉淀容器中最初使用水或者使水与盐溶液和沉淀溶液顺流加入。接着对得到的沉淀物进行彻底清洗、干燥、于约300℃煅烧并在约100℃至约400℃的温度范围下用氢活化。随后在反应器中存在上面描述的催化物的情况下使一种或者多种甘油三酯与氢接触并与其反应。反应器可以是喷淋床反应器、固定床气固反应器、鼓泡塔反应器、连续搅拌槽反应器、浆液反应器或者本领域已知的任何其它适宜的反应器类型。该过程可以以分批式或者以连续性方式进行。反应温度通常在约170℃至约250℃的范围内，而反应压力通常在约300psig至约2000psig的范围内。此外，在本发明的反应过程中，氢对甘油三酯的摩尔比率通常在约20:1至约700:1的范围内。该过程通常在约0.1hr-1至约5hr-1范围内的质量时空速度(WHSV)下进行。本领域技术人员知晓反应所需的时间根据所使用的温度、氢对甘油三酯的摩尔比率和氢分压而变化。由这种氢化过程产生的产物包括脂肪醇、甘油、微量的石蜡油和未反应的甘油三酯。通常通过常规方法分离这些产物，例如蒸馏、萃取、过滤、结晶等。
石油提炼利用氢化处理，通过用氢对补料进行处理来去除杂质。氢化处理的转化温度通常是300°至700°F。压力通常是40至100atm。反应时间通常是10至60分钟。使用固体催化剂，以增加某个反应的速率，增强对某些产物的选择性，并且优化氢的消耗。
油类脱氧作用的适宜方法包括使油类加热至约350°F至约550°F范围内的温度，并在至少约上述大气压范围的压力下使经加热的油与氮接触至少约5分钟。
异构化的适宜方法包括利用碱的异构化作用和本领域已知的其它油类异构化方法。
加氢处理和氢化处理最终使甘油三酯原料的分子量减少。在氢化处理条件下甘油三酯分子减少至4个碳氢化合物分子：1个丙烷分子和3个较重的碳氢化合物分子，通常在C8至C18范围内。
因此，在一个实施方案中，对本发明的脂类组合物进行的一种或者多种化学反应的产物是烷烃混合物，其中包含ASTM D975可再生柴油。微生物的碳氢化合物生产综述于Metzger等，Appl Microbiol Biotechnol(2005)66:486-496和A Look Back at the U.S.Department of Energy’s AquaticSpecies Program:Biodiesel from Algae,NREL/TP-580-24190,John Sheehan,Terri Dunahay,John Benemann和Paul Roessler(1998)中。
柴油燃料的蒸馏性质以T10-T90描述(分别是指蒸馏体积为10%时和90%时的温度)。可再生柴油可以从桑椹形原藻甘油三酯油类中产生，如美国专利申请公布20100151112的实施例14所描述的。在所述实施例14中产生的材料的T10-T90是57.9℃。可以实施加氢处理方法、异构化方法和本文中公开的对油类进行其它共价修饰的方法以及本文中公开的蒸馏和分馏(例如冷却过滤)方法，以利用根据本文中公开的方法产生的甘油三酯油类产生具有其它T10-T90范围(例如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃和65℃)的可再生柴油组合物。
美国专利申请公布20100151112的实施例14中产生的材料的T10是242.1℃。可以实施加氢处理方法、异构化方法和本文中公开的对油类进行其它共价修饰的方法以及本文中公开的蒸馏和分馏(例如冷却过滤)方法，以产生具有其它T10值的可再生柴油组合物，例如T10值在180和295之间、在190和270之间、在210和250之间、在225和245之间以及至少290。
在美国专利申请公布20100151112的实施例14中产生的材料的T90是300℃。可以实施加氢处理方法、异构化方法和本文中公开的对油类进行其它共价修饰的方法以及本文中公开的蒸馏和分馏(例如冷却过滤)方法，以产生具有其它T90值的可再生柴油组合物，例如T90值在280和380之间、在290和360之间、在300和350之间、在310和340之间以及至少290。
在美国专利申请公布20100151112的实施例14中产生的材料的FBP是300℃。可以实施加氢处理方法、异构化方法和本文中公开的对油类进行其它共价修饰的方法以及本文中公开的蒸馏和分馏(例如冷却过滤)方法，以产生具有其它FBP值的可再生柴油组合物，例如FBP值在290和400之间、在300和385之间、在310和370之间、在315和360之间以及至少300。
可以对由本发明的方法和组合物提供的其它油类联合进行加氢处理、异构化和其它共价修饰，包括脂类特性包含(a)至少4%C8-14、(b)至少0.3%C8、(c)至少2%C10、(d)至少2%C12和(3)至少30%C8-C14的油类。
可以通过两个步骤的过程从任何形式的生物质中生产传统的超低硫柴油。首先，将生物质转化成为合成气(一种富含氢和一氧化碳的气体混合物)。接着将合成气催化转化成为脂类。通常利用Fisher-Tropsch(FT)合成法生产脂类。该技术可以应用于煤、天然气和重油中。因此，在生产可再生柴油之方法的另一个优选实施方案中，通过使脂类组合物间接液化对脂类组合物进行处理，以产生烷烃。
本发明还提供了生产喷气燃料的方法。喷气燃料是清澈的淡黄色。最常用的燃料是不含铅/基于石蜡油的燃料，其被分类为Aeroplane A-1，根据一组国际标准规格生产。喷气燃料是大量不同碳氢化合物的混合物，可能多至上千种或者更多。其大小(分子量或者碳原子数量)范围受到产品需要的限制，例如凝固点或者发烟点。Kerosone型Aeroplane燃料(包括Jet A和Jet A-1)具有约8至16个碳原子数量之间的碳原子数量分布。宽馏分或者石脑油型Aeroplane燃料(包括Jet B)通常具有约5至15个碳原子之间的碳原子数量分布。
两种Aeroplane(Jet A和Jet B)可以含有一些添加剂。可用的添加剂包括但不限于抗氧化剂、抗静电试剂、阻蚀剂和燃料系统防冰(FSII)试剂。抗氧化剂防止结胶，通常基于经烷基化的苯酚，例如AO-30、AO-31或者AO-37。抗静电剂消除静电并且防止产生火花，例如以二壬基萘磺酸(DINNSA)作为活性成分的Stadis450。阻蚀剂，例如DCI-4A，可以用于民用燃料和军用燃料，DCI-6A用于军用燃料。FSII试剂包括例如Di-EGME。
在本发明的一个实施方案中，通过将藻类燃料与现有的喷气燃料混合来生产喷气燃料。通过本发明的方法产生的脂类可以用作生产喷气燃料的原料。因此，在本发明的另一个方面中提供了生产喷气燃料的方法。在此提供了两种从由本发明的方法产生的脂类中生产喷气燃料的方法：流化催化裂化(FCC)和加氢脱氧作用(HDO)。
流化催化裂化(FCC)是一种用于生产烯烃的方法，特别是重质原油组分中的丙烯。通过本发明的方法产生的脂类可以转化成为丙烯。该过程包括使产生的脂类流过FCC区并收集包含用作喷气燃料的丙烯的产物流。产生的脂类在裂化条件下与裂化催化剂接触，以提供包含用作喷气燃料的丙烯和碳氢化合物的产物流。
在一个实施方案中，用于生产喷气燃料的方法包括(a)利用原藻细胞和本文所公开的方法在含有木糖的培养基中培养含脂微藻，(b)使含脂微生物裂解，以产生裂解物，(c)从裂解物中分离脂类和(d)对脂类组合物进行处理，从而生产喷气燃料。在生产喷气燃料的方法的一个实施方案中，可以使脂类组合物流过流化催化裂化区，在一个实施方案中，其可以包括使脂类组合物在裂化条件下与裂化催化剂接触，以提从包含C2-C5丙烯的产物流。
在该方法的某些实施方案中，去除脂类组合物中存在的任何杂质是理想的。因此，使脂类组合物流过流化催化裂化区之前，对脂类组合物进行预处理。预处理可以包括使脂类组合物与离子交换树脂接触。离子交换树脂可以是酸性离子交换树脂(例如AmberlystTM-15，其可以在脂类组合物向上或者向下流过的反应器中用作床体。其它预处理可以包括通过使脂类组合物与酸(例如硫酸、乙酸、硝酸或者盐酸)接触进行弱酸清洗。一般在环境温度和大气压下用稀释的酸溶液进行接触。
任选地使经预处理的脂类组合物流至FCC区，在此处含烃组分裂化成为烯烃。通过使脂类组合物在反应区中与包含微粒材料的催化剂接触来完成催化裂化。该反应是催化裂化，其与加氢裂化相对，在不加入氢或者不消耗氢的情况下进行。随着裂化反应的进行，大量焦炭沉积在催化剂上。通过在再生区中使催化剂上的焦炭燃烧，在高温下使催化剂再生。含有焦炭的催化剂(在本文中被称为“焦炭催化剂”)持续地从反应区运送至再生区，以使其再生并被再生区中基本不含焦炭的再生催化剂取代。通过多种气流对催化剂颗粒进行的流化使得催化剂能够在反应区和再生区之间运送。在催化剂的流化流中使碳氢化合物(例如本文中描述的脂类组合物)裂化的方法、在反应区和再生区之间运送催化剂的方法以及在再生器中燃烧焦炭的方法是FCC过程领域的技术人员熟知的。示例性FCC应用和用于使脂类组合物裂化以产生C2-C5烯烃的催化剂描述于美国专利号6,538,169和7,288,685中，其以引用的方式整体并入本文。
适宜的FCC催化剂一般包含处于或者没有处于相同基质上的至少两种组分。在一些实施方案中，两种组分均在整个反应管中循环。第一种组分一般包括用于流化催化裂化领域的任何已知催化剂，例如活性非晶态粘土型催化剂和/或高活性晶态分子筛。分子筛催化剂有时优于非晶态催化剂，因为其大大提高了对期望产物的选择性。在一些优选的实施方案中，在FCC过程中可以使用沸石作为分子筛。优选第一种催化剂组分包含大孔径的沸石(例如Y型沸石)、活性氧化铝材料、包含二氧化硅或者氧化铝的粘结材料和隋性填料(例如高岭土)。
在一个实施方案中，本发明的脂类组合物的裂化发生在FCC区的提升段或者上升段中。通过使脂类组合物快速汽化的喷嘴将脂类组合物引入提升段中。在与催化剂接触之前，通常脂类组合物具有约149℃至约316℃(300°F至600°F)的温度。催化剂从混合管流至提升段，在此处其与脂类组合物接触约2秒或者更短时间。
接着通过出口将催化剂混合物和已反应的脂类组合物从提升段顶端排出，并分离成为包含烯烃的裂化产物蒸汽流和覆盖大量焦炭一般称为“焦炭催化剂”的催化剂颗粒收集物。在使脂类组合物和催化剂的接触时间(可能促进期望产物进一步转化成为不期望的其它产物)最小化的尝试中，可以使用分离器装置(例如旋转臂装置)，以从产物流中快速去除焦炭催化剂。分离器(例如旋转臂分离器)位于反应室的上部，所述反应室的下部具有提馏区。由旋转臂装置分离的催化剂滴落入提馏区中。包含经裂化的碳氢化合物(含有轻烯烃)的裂化产物蒸汽流和一些催化剂通过与旋流器相连的管道排出反应室。旋流器去除产物蒸汽流中的残留催化剂颗粒，使颗粒浓度降至极低水平。随后产物蒸汽流从分离器顶端排出。由旋流器分离的催化剂返回至分离器中，随后进入提馏区。提馏区通过与蒸汽逆流接触去除催化剂表面吸附的碳氢化合物。
运行碳氢化合物的低分压，以使有利于轻烯烃的产生。因此，将提升段压力设定为约172至241kPa(25至35psia)，其中碳氢化合物的分压是约35至172kpa(5至25psia)，优选碳氢化合物的分压是约69至138kpa(10至20psia)。通过利用蒸汽作为稀释剂并且使稀释剂占脂类组合物的10-55wt-%，优选脂类组合物的约15wt-%，来达到碳氢化合物相对低的分压。可以使用其它稀释剂(例如干燥气体)来达到相同的碳氢化合物分压。
提升段出口处的裂化流温度是约510℃至621℃(950°F至1150°F)。但是，提升段出口温度高于566℃(1050°F)使得产生更多干燥气体和更多烯烃。而提升段出口温度低于566℃(1050°F)使得产生较少乙烯和丙烯。因此，优选在约566℃至约630℃的优选温度以及约138kPa至约240kPa(20至35psia)的优选压力下下进行FCC过程。该过程的另一个条件是催化剂对脂类组合物的比率，其可以在约5至约20之间变化，优选约10至约15。
在生产喷气燃料的方法的一个实施方案中，将脂类组合物引入FCC反应器的上升段。上升段中的温度非常高，其范围是约700℃(1292°F)至约760℃(1400°F)，催化剂对脂类组合物的比率是约100至约150。可以预期将脂类组合物引入上升段中会产生大量的丙烯和乙烯。
在利用如本文中所描述产生的脂类组合物和脂类生产喷气燃料的方法的另一个实施方案中，脂类组合物或者脂类的结构被称为脱氧加氢(HDO)的过程破坏。HDO是指利用氢去除氧，即去除氧的同时破坏材料的结构。使烯烃的双键加氢，并去除任何硫和氮的化合物。硫的去除被称为加氢脱硫(HDS)。对原材料(脂类组合物或者脂类)进行预处理和纯化有助于延长催化剂的使用寿命。
一般在HDO/HDS步骤中，将氢与原料(脂类组合物或者脂类)混合，接着使混合物以单相进料或者双向进料方式顺流通过催化剂床。HDO/MDS步骤后，分离产物组分，并且将其运送至单独的异构化反应器。生物起始材料的异构化反应器描述于文献(FI100248)中(顺流反应器)。
还可以通过使脂类组合物或者脂类与氢气顺流通过第一加氢区，并随后通过将氢气顺流(相对于碳氢化合物流出液)送至第二加氢区在第二加氢区中对碳氢化合物流出液进行进一步加氢，从而进行通过使碳氢化合物原料(例如本文中的脂类组合物或者脂类)加氢来生产燃料的过程。示例性HDO应用和用于使脂类组合物裂化以产生C2-C5烯烃的催化剂描述于美国专利号7,232,935中，其作为整体通过引用并入本文。
通常在加氢脱氧步骤中，使生物组分(例如本文中的脂类组合物或者脂类)的结构分解，去除氧、氮、磷和硫化合物和轻碳氢化合物，并使烯烃键加氢。在该过程的第二个步骤中，即在异构化步骤中，进行异构化，以使碳氢化合物的链支化，并且提高低温下石蜡油的性能。
在裂化过程的第一个步骤即HDO步骤中，将氢气和需要加氢的本文中的脂类组合物或者脂类顺流或者逆流运送至HDO催化剂床系统，所述催化剂床系统包含一个或者多种催化剂床，优选1-3个催化剂床。通常以顺流方式进行HDO步骤。在HDO催化剂床系统包含两种或者更多催化剂床的情况下，利用逆流原则对一个或者多个床进行操作。在HDO步骤中，压力在20和150巴之间变化，优选在50和100巴之间，温度在200至500℃之间变化，优选300-400℃的范围内。在HDO步骤中，可以使用含有元素周期表中第VII族和/或第VIB族金属的已知加氢催化剂。优选加氢催化剂是负载型Pd、Pt、Ni、NiMo或者CoMo催化剂，所述负载是氧化铝和/或二氧化硅。通常使用NiMo/Al2O3和CoMo/Al2O3催化剂。
HDO步骤之前，任选地通过在较温和条件下进行预加氢，对本文中的脂类组合物或者脂类进行处理，从而避免双键的副反应。在预加氢催化剂存在下，在50-400℃的温度和1200bar的氢气压下进行这种预加氢过程，优选温度在150和250℃之间，氢气压在10和100巴之间。催化剂可以含有元素周期表中第VIII族和/或第VIB族的金属。优选预加氢催化剂是负载型Pd、Pt、Ni、NiMo或者CoMo催化剂，所述负载是氧化铝和/或二氧化硅。
使HDO步骤中含有氢的气流冷却，并接着从中去除一氧化碳、二氧化碳、氮、磷和硫化合物、气态轻碳氢化合物和其它杂质。压缩后，经纯化的氢或者经回收的氢返回至第一催化剂床和/或催化剂床之间，以补偿释放的气流。从压缩的液体中去除水。将液体运送至第一催化剂床或者催化剂床之间。
HDO步骤后，使产物进行异构化步骤。在碳氢化合物与异构化催化剂接触之前尽可能去除杂质对于该过程是重要的。异构化步骤包括任选的洗脱步骤，其中通过用水蒸汽或者适宜气体(例如轻碳氢化合物气体、氮气或者氢气)洗脱，对HDO步骤中的反应产物进行纯化。以逆流方式在异构化催化剂的上游装置中进行任选的洗脱步骤，其中气体和液体相互接触，或者利用逆流原则在实际的异构化反应器之前在单独的洗脱装置中进行任选的洗脱步骤。
洗脱步骤后，将氢气和经加氢的本文中的脂类组合物或者脂类以及任选地n-石蜡油混合物运送至包含一个或者数个催化剂床的异构化反应装置中。异构化步骤的催化剂床可以以顺流或者逆流方式运行。
在异构化步骤中应用逆流原则对于该过程是重要的。在异构化步骤中，这通过以逆流方式进行任选的洗脱步骤或者异构化反应步骤或者这两个步骤来进行。在异构化步骤中，压力在20-150bar的范围内变化，优选在20-100bar范围内，温度在200和500℃之间，优选在300和400℃之间。在异构化步骤中，可以使用本领域已知的异构化催化剂。适宜的异构化催化剂含有分子筛和/或第VII族的金属和/或载体。优选异构化催化剂含有SAPO-11或者SAPO41或者ZSM-22或者ZSM-23或者镁碱沸石以及Pt、Pd或者Ni以及Al2O3或者SiO2。通常异构化催化剂是例如Pt/SAPO-11/Al2O3、Pt/ZSM-22/Al2O3、Pt/ZSM-23/Al2O3和Pt/SAPO-11/SiO2。可以在相同的压力容器或者单独的压力容器中进行异构化步骤和HDO步骤。在单独的压力容器中或者在与HDO和异构化步骤中使用的相同压力容器中进行任选的预加氢步骤。
因此，在一个实施方案中，一个或者多个化学反应的产物是包含ASTMD1655喷气燃料的烷烃混合物。在一些实施方案中，符合ASTM1655喷气燃料规格的组合物含有少于10ppm的硫。在其它实施方案中，符合ASTM1655喷气燃料规格的组合物具有低于205℃的分馏曲线T10值。在另一个实施方案中，符合ASTM1655喷气燃料规格的组合物具有低于300℃的终沸点(FBP)。在另一个实施方案中，符合ASTM1655喷气燃料规格的组合物具有至少38℃的燃烧点。在另一个实施方案中，符合ASTM1655喷气燃料规格的组合物具有775K/M3和840K/M3之间的密度。而在另一个实施方案中，符合ASTM1655喷气燃料规格的组合物具有低于-47℃的凝固点。在另一个实施方案中，符合ASTM1655喷气燃料规格的组合物具有至少42.8MJ/K的净燃烧热。在另一个实施方案中，符合ASTM1655喷气燃料规格的组合物具有至少13.4质量%的氢含量。在另一个实施方案中，如通过重量定量JFTOT于260℃所测定，符合ASTM1655喷气燃料规格的组合物具有低于3mm Hg的热稳定性。在另一个实施方案中，符合ASTM1655喷气燃料规格的组合物具有低于7mg/dl的实际胶质。
因此，本发明公开了多种方法，其中对微藻脂类进行化学修饰，以产生用于多种工业和其它应用中的产物。对由本文中公开的方法产生的油类进行修饰的过程实例包括但不限于油类的水解、油类的氢化处理和油类的酯化。微藻油的修饰产生基本的油脂化工产品，其可以进一步修饰成为指定的衍生型油脂化工产品，以具有期望功能。以与上面描述的燃料生产过程类似的方式，还可以对从本文中描述的微生物培养物中产生的油类进行这些化学修饰。基本油脂化工产品的实例包括但不限于脂肪酸盐、脂肪酸、脂肪酸甲酯和甘油。衍生型油脂化工产品包括但不限于脂族腈、酯、二聚酸、季铵盐、表面活性剂、脂肪酸链烷醇酰胺、脂肪醇硫酸盐、树脂、乳化剂、脂肪醇、烯烃和高级烷烃。
通过本发明方法产生的甘油脂中的脂肪酸成分水解产生游离脂肪酸，可以使其衍生化，以产生其它有用的化学品。在水和催化剂(或者是酸或者是碱)存在下发生水解。可以使释放的游离脂肪酸衍生化，以产生如下列文献报道的多种产物：美国专利号5,304,664(高度硫酸化的脂肪酸)；7,262,158(清洁组合物)；7,115,173(织物柔软剂组合物)；6,342,208(用于皮肤的乳化剂)；7,264,886(防水组合物)；6,924,333(涂料添加剂)；6,596,768(富含脂类的反刍动物原料)和6,380,410(用于洗涤剂和清洁剂的表面活性剂)。
对于水解，在本发明的一个实施方案中，任选地，首先在液体介质(例如水或者氢氧化钠)中使甘油三酯油类水解，以获得甘油和脂肪酸盐。有多种适宜的甘油三酯水解方法，其包括但不限于皂化、酸水解、碱水解、酶促水解(本文中称为分裂)和利用热压缩水的水解。本领域技术人员应当知晓为了生产油脂化工产品，不需要对甘油三酯进行水解，而是可以通过其它已知的过程将油类直接转化成为期望的油脂化工产品。例如，可以通过酯化作用将甘油三酯油类直接转化成为脂肪酸甲酯。
在一些实施方案中，通过将油类分裂成为甘油和脂肪酸，对通过本文中公开的方法产生的油类进行催化水解。如上面所讨论，接着通过几种其它的修饰作用对脂肪酸进行进一步加工，以获得衍生型油脂化工产品。例如在一个实施方案中，使脂肪酸进行胺化反应，以产生含氮的脂肪族化合物。在另一个实施方案中，使脂肪酸进行臭氧分解作用，以产生一元酸和二元酸。
在其它实施方案中，通过使本文中产生的油类分裂来进行水解，以产生油脂化工产品。在本发明一些优选的实施方案中，在进行其它过程前使甘油三酯油类分裂。本领域技术人员应当知晓有很多使甘油三酯分裂的适宜方法，其包括但不限于酶促分裂和压力分裂。
通常油类的酶促分解方法使用酶，脂酶，作为作用于水/油混合物的生物催化剂。接着酶促分解使油类或者脂肪分别分解成为甘油和游离脂肪酸。随后甘油迁移至水相中，由此有机相富含游离脂肪酸。
酶促分解反应一般发生在有机相和水相之间的相界面中，其中酶仅存在于相界面中。到达相界面的甘油三酯随后进行或者参与分解反应。随着反应的进行，与游离脂肪酸相比，相界面中仍然以甘油酯形式化学结合的脂肪酸的占有密度或者浓度减少，以使反应减慢。在某些实施方案中，在室温下发生酶促分解。本领域技术人员知晓使油类分解成为期望脂肪酸的适宜条件。
作为实例，可以通过增加界面表面使反应速度加快。反应一经完成，接着从不含酶的有机相中分离游离脂肪酸，将仍然含有以甘油酯形式化学结合的脂肪酸的残余物送回或者回收，并且与即将进行分解的新鲜油类或者脂肪混合。用这种方法，接着使回收的甘油酯进行进一步酶促分解过程。在一些实施方案中，用这种方法从从部分分解的油类或者脂肪中提取游离脂肪酸。以那种方法，如果将化学结合的脂肪酸(甘油三酯)返回或者送回至分解过程，可以使酶的消耗显著减少。
用对于特定油类或者脂肪计算出的理论上可能的酸值除以所测定的酸值得到的比率来确定分解程度。优选根据标准的常用方法通过滴定测定酸值。任选地，可以用液态甘油相的密度测定分解程度。
在一个实施方案中，本文中所描述的分解过程还适用于使所产生油类的碱提炼过程中产生的皂料中含有的一元、二元和甘油三酯分解。用这种方法，可以使皂料定量转化，不需要将中性油类事先皂化成为脂肪酸。为此目的，优选在分解过程之前通过加入酸使在脂肪酸盐中化学结合的脂肪酸释放。在某些实施方案中，除了水和酶之外，分解过程中使用缓冲溶液。
在一个实施方案中，还可以对根据本发明的方法产生的油类进行皂化作用(一种水解方法)。动物油和植物油通常由甘油三酯(TAGs)组成，其是脂肪酸与三元醇甘油形成的酯。在碱水解反应中，TAG中的甘油被去除，剩余3个羧酸阴离子，其可以与碱金属阳离子(例如钠或者钾)结合，以产生脂肪酸盐。在这种方案中，使羧酸成分与甘油基裂解，并用羟基代替。通过期望的皂化程度确定反应中使用的碱(例如KOH)量。如果例如目的是生产包含最初TAG组合物中存在的一些油类的皂化产品，将不足以使所有TAGs转化成为脂肪酸盐的碱量加入到反应混合物中。通常在水溶液中进行该反应，反应缓慢进行，但是可以通过加热使其加快。通过向反应混合物中加入盐(例如水溶性碱金属卤化物(例如NaCl或者KCl))可以帮助脂肪酸盐析出。优选碱是碱金属氢氧化物，例如NaOH或者KOH。任选地，反应方案中可以使用其它碱，例如链烷醇胺，其包括例如三乙醇胺和氨甲基丙醇。在一些情况下，优选使用这些替代品生产纯净的皂化产品。
在一些方法中，化学修饰的第一个步骤可以是氢化处理，以使双链饱和，随后在氢和催化剂存在下于高温进行脱氧作用。在其它方法中，氢化作用和脱氧作用发生在同一反应中。在其它方法中，氢化作用之前发生脱氧作用。接着任选地也在氢和催化剂存在下进行异构化。最后，如果需要，可以去除气体和石脑油组分。例如参见美国专利号5,475,160(甘油三酯的氢化作用)、5,091,116(脱氧作用、氢化作用和脱气)、6,391,815(氢化作用)和5,888,947(异构化作用)。
在本发明的一些实施方案中，使甘油三酯油类部分或者完全脱氧。脱氧反应形成期望产物，其包括但不限于脂肪酸、脂肪醇、多元醇、酮或者醛。一般来讲，不受任何特定理论的限制，脱氧反应包括多种不同反应途径的组合，包括但不限于：水解、加氢、连续性氢化-氢解反应、连续性氢解-氢化反应和氢化-氢解联合反应，使得从脂肪酸或者脂肪酸酯中至少部分地去除氧，以产生反应产物，例如脂肪醇，其通过进一步加工可以容易地转化成为期望的化学品。例如在一个实施方案中，可以通过FCC反应将脂肪醇转化成为烯烃或者通过缩合反应转化成为高级烷烃。
这种化学修饰之一是氢化作用，其将氢加入到甘油脂或者游离脂肪酸的脂肪酸成分的双键中。加氢过程使得可以将液体油类转化成为半固体或者固体脂肪，其更适用于特定应用中。
通过本文中描述的方法产生的油类的氢化作用可以与本文中提供的一种或者多种方法和/或材料结合使用，如下列文献所报道：美国专利号7,288,278(食品添加剂或者药物)、5,346,724(润滑产品)、5,475,160(脂肪醇)、5,091,116(食用油)、6,808,737(用于人造黄油和涂抹品的结构脂肪)、5,298,637(低卡路里脂肪成分)、6,391,815(加氢催化剂和硫吸附剂)、5,233,099和5,233,100(脂肪醇))、4,584,139(加氢催化剂)、6,057,375(防沫剂)和7,118,773(食用乳液)。
本领域技术人员应当知晓可以使用多个过程使油类加氢。一种适宜的方法包括在加氢反应器中足以形成加氢产物的条件下使油类与氢或者与适宜气体和催化剂混合的氢接触。加氢催化剂一般可以包含Cu、Re、Ni、Fe、Co、Ru、Pd、Rh、Pt、Os、Ir以及合金或者其任意组合，其以单独形式或者具有促进剂，例如W、Mo、Au、Ag、Cr、Zn、Mn、Sn、B、P、Bi以及合金或者其任意组合。其它有效的加氢催化剂材料包括负载型镍或者用铼修饰的钌。在一个实施方案中，取决于催化剂期望的功能，加氢催化剂还包含任意一种负载。可以用本领域普通技术人员已知的方法制备加氢催化剂。
在一些实施方案中，加氢催化剂包括负载型第VIII族金属催化剂和金属海绵材料(例如海绵镍催化剂)。适用于本发明的经活化的海绵镍催化剂的一个实例是Raney镍。在其它实施方案中，利用包含镍-铼催化剂或者经钨修饰的镍催化剂的催化剂进行本发明的加氢反应。用于本发明的加氢反应的适宜催化剂的一个实例是碳负载型镍-铼催化剂。
在一个实施方案中，可以通过用碱性水溶液(例如含有约25重量%的氢氧化钠)对镍和铝大约等重的合金进行处理，来制备适宜的Raney镍催化剂。铝选择性地被碱性水溶液溶解，产生海绵形材料，其主要包含镍，还包括少量铝。初始合金包含促进剂金属(即钼或者铬)，其含量使其在所形成的海绵镍催化剂中剩余约1至2重量%。在另一个实施方案中，通过将亚硝酰硝酸钌(III)水溶液、氯化钌(III)水溶液注入适宜的支持材料中来制备加氢催化剂。接着使溶液干燥，以形成水含量少于约1%的固体。随后该固体在旋转式圆形炉中在氢气流气压下于300℃(未锻烧)或者400℃(锻烧)还原4小时。冷却并用氮使催化剂隋化后，使氮气中的5%体积的氧气通过催化剂2小时。
在某些实施方案中，所描述的催化剂包含催化剂载体。该催化剂载体使催化剂稳定并且提供支持。所使用的催化剂载体的类型取决于所选择的催化剂和反应条件。用于本发明的适宜载体包括但不限于碳、二氧化硅、二氧化硅-氧化铝、氧化锆、二氧化钛、二氧化铈、氧化钒、氮化物、氮化硼、杂多酸、羟磷灰石、氧化锌、chromia、沸石、碳钠米管、碳富勒烯和其任意组合。
可以利用本领域技术人员已知的常规方法制备用于本发明的催化剂。适宜的方法可以包括但不限于初期润湿、蒸汽式注入、化学气相沉积、防水涂层、磁控溅射技术和类似。
进行加氢反应的条件基于起始材料和期望产物的类型而变化。本领域普通技术人员在本公开的利益下应当知晓合适的反应条件。一般来讲，在80℃至250℃的温度下进行加氢反应，优选90℃至200℃，最优选100℃至150℃。在一些实施方案中，在500KPa至14000KPa的压力下进行加氢反应。
本发明的氢解反应中使用的氢可以包括外部氢、回收的氢、原位产生的氢和其任意组合。如本文中所使用，术语“外部氢”是指不是来源于生物质反应本身而是从另一种来源加入到系统中的氢。
在本发明的一些实施方案中，使起始甘油三酯或脂肪酸转化成为较小分子是理想的，所述较小分子更易于转化成为期望的高级碳氢化合物。用于这种转化的一种适宜方法是通过氢解反应。已知多种过程可以进行油类的氢解作用。一种适宜的方法包括在氢解反应器中，在足以形成包含较小分子或者多元醇的反应产物的条件下，使油类与氢或者与适宜气体和氢解催化剂接触。如本文中所使用，术语“较小分子或者多元醇”包括具有较小分子量(包括碳原子数量或者氧原子数量少于起始油类)的任何分子。在一个实施方案中，反应产物包含较小分子，所述较小分子包括多元醇和醇。本领域普通技术人员可以容易地选择合适的方法来进行氢解反应。
在一些实施方案中，利用氢解催化剂可以将5和/或6碳糖或者糖醇转化成为丙二醇、乙二醇和甘油。氢解催化剂可以包括Cr、Mo、W、Re、Mn、Cu、Cd、Fe、Co、Ni、Pt、Pd、Rh、Ru、Ir、Os以及合金或者其任意组合，其以单独形式或者具有促进剂，例如Au、Ag、Cr、Zn、Mn、Sn、Bi、B、O以及合金或者其任意组合。氢解催化剂还可以包括含有过渡金属(例如钼、铬、钨、铼、锰、铜、镉)或者第VIII族金属(例如铁、钴、镍、铂、钯、铑、钌、铱和锇)的碳焦化聚合物催化剂。在某些实施方案中，氢解催化剂可以包括与碱土金属氧化物结合的或者附着在经催化活化的载体中的上面任意一种金属。在某些实施方案中，氢解反应中描述的催化剂可以包括上面加氢反应中描述的催化剂载体。
进行氢解反应的条件基于起始材料和期望产物的类型而变化。本领域普通技术人员在本公开的利益下应当知晓用于进行该反应的合适的反应条件。一般来讲，在110℃至300℃的温度下进行氢解反应，优选170℃至220℃，最优选200℃至225℃。在一些实施方案中，在碱性条件下进行氢解反应，优选pH值为8至13，甚至更优选pH为10至12。在一些实施方案中，在60KPa和16500KPa之间范围内的压力下进行氢解反应，优选在1700KPa和14000KPa之间范围内，更优选在4800KPa和11000KPa之间范围内。
本发明的氢解反应中使用的氢可以包括外部氢、回收的氢、原位产生的氢和其任意组合。
在一些实施方案中，可以在缩合反应器中通过缩合反应将上面讨论的反应产物转化成为高级碳氢化合物。在这些实施方案中，在能够形成高级碳氢化合物的催化剂存在下对反应产物进行缩合。不受理论限制，据信通过逐步式加入反应产生高级碳氢化合物，包括碳-碳键或者碳-氧键的形成。得到的反应产物包括任意数量的化合物，其含有下面更加详细描述的基团。
在某些实施方案中，适宜的缩合催化剂包括酸催化剂、碱催化剂或者酸/碱催化剂。如本文中所使用，术语“酸/碱催化剂”是指同时具有酸功能和碱功能的催化剂。在一些实施方案中，缩合催化剂可以包括但不限于沸石、碳化物、氮化物、氧化锆、氧化铝、二氧化硅、铝硅酸盐、磷酸盐、氧化钛、氧化锌、氧化钒、氧化镧、氧化钇、氧化钪、氧化镁、氧化铈、氧化钡、氧化钙、氢氧化物、杂多酸、无机酸、酸修饰的树脂、碱修饰的树脂和其任意组合。在一些实施方案中，缩合催化剂还可以包含一种修饰剂。适宜的修饰剂包括La、Y、Sc、P、B、Bi、Li、Na、K、Rb、Cs、Mg、Ca、Sr、Ba和其任意组合。在一些实施方案中，缩合催化剂还可以包含一种金属。适宜的金属包括Cu、Ag、Au、Pt、Ni、Fe、Co、Ru、Zn、Cd、Ga、In、Rh、Pd、Ir、Re、Mn、Cr、Mo、W、Sn、Os、合金和其任意组合。
在某些实施方案中，缩合反应中描述的催化剂可以包含上面加氢反应中描述的催化剂载体。在某些实施方案中，缩合催化剂是自身负载的。如本文中所描述，术语“自身负载”是指催化剂不需要其它材料作为载体。在其它实施方案中，缩合催化剂与适于支持催化剂的单独载体结合使用。在一个实施方案中，缩合催化剂的载体是二氧化硅。
进行缩合反应的条件基于起始材料和期望产物的类型而变化。本领域普通技术人员在本公开的利益下应当知晓用于进行该反应的合适的反应条件。在一些实施方案中，在对计划进行的反应的热力学有利的温度下进行缩合反应。缩合反应的温度根据特定起始多元醇或者醇而变化。在一些实施方案中，缩合反应的温度在80℃至500℃的范围内，优选125℃至450℃，最优选125℃至250℃。在一些实施方案中，在0KPa和9000KPa之间范围内的压力下进行缩合反应，优选在0KPa和7000KPa之间范围内，更优选在0KPa和5000KPa之间范围内。
通过本发明的某些方法形成的高级烷烃包括但不限于具有4至30个碳原子的支化或者直链烷烃、具有4至30个碳原子的支化或者直链烯烃、具有5至30个碳原子的环烷烃、具有5至30个碳原子的环烯烃、芳香族、稠合芳香族、醇和酮。适宜的烷烃包括但不限于丁烷、戊烷、戊烯、2-甲基丁烷、己烷、己烯、2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷、庚烷、庚烯、辛烷、辛烯、2,2,4-三甲基戊烷、2,3-二甲基己烷、2,3,4-三甲基戊烷、2,3-二甲基戊烷、壬烷、壬烯、癸烷、癸烯、十一烷、十一烯、十二烷、十二烯、十三烷、十三烯、十四烷、十四烯、十五烷、十五烯、十九烷、十九烯、二十烷、二十烯、二十一烷、二十一烯、二十二烷、二十二烯、二十三烷、二十三烯、二十四烷、二十四烯和其异构体。这些产物中的一些适用作燃料。
在一些实施方案中，环烷烃和环烯烃是未取代的。在其它实施方案中，环烷烃和环烯烃是单取代的。在其它实施方案中，环烷烃和环烯烃是多取代的。在包含经取代的环烷烃和环烯烃的实施方案中，取代基团包括但不限于具有1至12个碳原子的支化或者直链烷基、具有1至12个碳原子的支化或者直链烃基、苯基和其任意组合。适宜的环烷烃和环烯烃包括但不限于环戊烷、环戊烯、环己烷、环己烯、甲基-环戊烷、甲基-环戊烯、乙基-环戊烷、乙基-环戊烯、乙基-环己烷、乙基-环己烯、其异构体和其任意组合。
在一些实施方案中，所形成的芳香族化合物是未取代的。在另一个实施方案中，所形成的芳香族化合物是单取代的。在包含经取代的芳香族化合物的实施方案中，取代基团包括但不限于具有1至12个碳原子的支化或者直链烷基、具有1至12个碳原子的支化或者直链烃基、苯基和其任意组合。用于本发明的适宜芳香族化合物包括但不限于苯、甲苯、二甲苯、乙基苯、对二甲苯、间二甲苯和其任意组合。
在本发明的某些方法中产生的醇具有4至30个碳原子。在一些实施方案中，醇是环状的。在其它实施方案中，醇是支化的。在另一个实施方案中，醇是直链的。用于本发明的适宜醇包括但不限于丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、十二醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、十七醇、十八醇、十九醇、二十醇、二十一醇、二十二醇、二十三醇、二十四醇和其异构体。
在本发明的某些方法中产生的酮具有4至30个碳原子。在一些实施方案中，酮是环状的。在其它实施方案中，酮是支化的。在另一个实施方案中，酮是直链的。用于本发明的适宜酮包括但不限于于丁酮、戊酮、己酮、庚酮、辛酮、壬酮、癸酮、十一酮、十二酮、十三酮、十四酮、十五酮、十六酮、十七酮、十八酮、十九酮、二十酮、二十一酮、二十二酮、二十三酮、二十四酮和其异构体。
可对通过本发明的方法产生的微藻油进行的另一种化学修饰是酯交换作用。天然产生的甘油脂中脂肪酸成分分布不一致。对于油类，酯交换作用是指将不同甘油脂的两个酯基之间的酰基进行交换。转酯基过程提供了一种机制，其中甘油脂混合物中的脂肪酸成分可以重新排列，以对分布格局进行修饰。酯交换是熟知的化学过程，一般包括在催化剂(例如碱金属或者碱金属烷基化物(例如甲氧基钠))存在下将油类混合物加热(至约200℃)一段时间(例如30分钟)。该过程可以用于使油类混合物中脂肪酸成分的分布格局随机化，或者可以指导产生期望的分布格局。可以对本文中提供的材料(例如脂类百分比(以细胞干重计算)为至少20%的微生物生物质)进行这种对脂类进行化学修饰的方法。
可以通过使油类混合物保持在可能发生熔化的一些TAGs的熔点以下的温度，来进行以脂肪酸的特定分布格局为目的的定向酯交换作用。这使得这些TAGs选择性结晶，随着TAGs结晶有效地从反应混合物中将其去除。该过程可以持续直至例如油中的大部分脂肪酸已经析出。定向酯交换作用可以用于例如通过用短链脂肪酸取代长链脂肪酸来生产具有较低卡路里含量的产品。定向酯交换作用还可以用于生产具有脂肪混合物的产品，所述脂肪混合物可以提供食品添加剂或者产品(例如人造黄油)中期望的熔化特性和结构性质，而无需进行可以产生不期望的反式异构体的氢化作用。
通过本文中描述的方法产生的油类的酯交换作用可以与一种或者多种方法和/或材料同时使用，或者用于生产产品，例如下列文献中所报道：美国专利号6,080,853(不易消化的脂肪的替代品)、4,288,378(花生酱稳定剂)、5,391,383(食用喷淋油)、6,022,577(用于食品的食用脂肪)、5,434,278(用于食品的食用脂肪)、5,268,192(低卡路里的坚果产品)、5,258,197(卡路里减少的食用组合物)、4,335,156(食用脂肪产品)、7,288,278(食品添加剂或者药物)、7,115,760(分馏过程)、6,808,737(结构脂肪)、5,888,947(发动机润滑剂)、5,686,131(食用油混合物)和4,603,188(可治愈的尿烷组合物)。
根据本发明，在一个实施方案中，如上面所描述的油类转酯基作用后使经转酯基的产物与多元醇发生反应，如美国专利号6,465,642中所报道，以产生多元醇脂肪酸多聚酯。这种酯化和分离过程可以包括下列步骤：在皂料存在下使低级烷基酯与多元醇反应、从产物混合物中去除剩余的皂料、对产物混合物进行水洗并使其干燥以去除杂质、将产物混合物预煮以用于提炼、将产物混合物中的多元醇脂肪酸多聚酯和至少一部分未反应的低级烷基酯分离开来和对经分离的未反应的低级烷基酯进行回收。
还可以对具有短链脂肪酸酯的微生物生物质进行转酯基作用，如美国专利6,278,006中所报道。一般来讲，可以通过在适宜催化剂存在下将短链脂肪酸酯加入到油中并对该混合物进行加热，来进行转酯基作用。在一些实施方案中，油类占反应混合物的至少5%至至少90%(以重量计算)。在一些实施方案中，短链脂肪酸酯可以是反应混合物的约10%至约50%(以重量计算)。催化剂的非限制性实例包括碱催化剂、甲氧基钠、酸催化剂(包括无机酸(例如硫酸和经酸化的粘土)、有机酸(例如甲磺酸、苯磺酸和甲苯磺酸)和酸性树脂(例如Amberlyst15))。金属(例如钠和镁)和金属氢化物也是有用的催化剂。
另一种这种化学修饰是羟基化作用，其包括将水加入到双键中，以使其饱和并引入羟基基团。羟基化过程提供了将甘油脂的一个或者多个脂肪酸成分转化成为羟基脂肪酸的机制。例如可以通过美国专利号5,576,027报道的方法进行羟基化作用。经羟基化的脂肪酸，包括蓖麻油和其衍生物，可以用作几种工业应用(包括食品添加剂、表面活性剂、颜料润湿剂、防沫剂、耐水添加剂、增塑剂、美容乳化剂和/或除臭剂)以及电学、制药学、涂料、墨水、黏合剂和润滑剂中的组分。如何进行甘油酯的羟基化作用的一个实例如下：可以将脂肪与庚烷一起加热，优选至约30-50℃，并在室温下保持30分钟或者更长时间；接着将乙酸加入到混合物中，随后加入硫酸水溶液，随后以较小增量在1小时内将过氧化氢水溶液加入到混合物中；加入过氧化氢水溶液后，接着将温度增加至至少约60并搅拌至少6小时；搅拌后，使溶液静置，去除反应中形成的较低水层，而用温度为60℃的热水对反应中形成的上部庚烷层进行清洗；接着用氢氧化钾中和已清洗的庚烷层至pH值为约5至7，并随后在真空中通过蒸馏将其去除；接着在真空下于100℃使反应产物干燥，已干燥的产物在真空条件下蒸汽除臭，并利用硅藻土于约50℃至60℃进行过滤。
通过本文中描述的方法产生的微生物油类的羟基化作用可以与一种或者多种方法和/或材料同时使用，或者用于生产产品，例如下列文献中所报道：美国专利号6,590,113(基于油的涂层和墨水)、4,049,724(羟基化过程)、6,113,971(橄榄油脂)、4,992,189(润滑剂和润滑油添加剂)、5,576,027(经羟基化的牛奶)和6,869,597(美容产品)。
经羟基化的甘油脂可以转化成为酸酐。酸酐包含甘油脂，在所述甘油脂中，经羟基化的脂肪酸成分酯化至另一个脂肪酸分子。可以通过对甘油脂和脂肪酸混合物进行加热并使该混合物与无机酸接触，来使经羟基化的甘油脂转化成为酸酐，如Isbell等，JAOCS71(2):169-174(1994)中所描述。酸酐可以用于多种应用中，包括但不限于下列文献中所报道的应用：美国专利号7,196,124(弹性体材料和楼面覆盖层)、5,458,795(用于高温应用中的厚油)、5,451,332(用于工业应用的液体)、5,427,704(燃料添加剂)和5,380,894(润滑剂、润滑脂、增塑剂和印刷油墨)。
可以对微生物油类进行的其它化学反应包括使甘油三酯与环丙烷化试剂反应以增加流动性和/或氧化稳定性，如美国专利号6,051,539中所报道；从甘油三酯中生产蜡，如美国专利号6,770,104中所报道；和甘油三酯的环氧化作用，如在"The effect of fatty acid composition on the acrylationkinetics of epoxidized triacylglycerols",Journal of the American Oil Chemists'Society,79:1,59-63,(2001)和Free Radical Biology and Medicine,37:1,104-114(2004)中所报道。
如上面所描述，用于燃料和化学产品的含油微生物生物质的产生使得能够产生脱脂生物质粉。脱脂粉是制备藻油中的副产物，其可以用作耕畜动物(例如反刍动物、家禽、猪和水产养殖动物)的饲料。得到的粉虽然其油类含量减少，但是仍然含有高质量的蛋白、碳水化合物、纤维、灰、残留油类和适用于动物饲料中的其它营养物质。由于通过油类分离过程使细胞绝大多数裂解，脱脂粉易于被这些动物消化。任选地，在动物饲料中，脱脂粉可以与其它成分结合，例如谷物。由于脱脂粉具有粉末状的稠度，可以利用市售的压出机或者扩张器或者另一种类型的机器挤压成丸状。
在下列实施例中对上面详细描述的本发明举例说明，其仅用于说明，并不对本发明的权项构成限制。
VIII.实施例
实施例1：培养原藻的方法
对原藻品种进行培养，以产生高百分比(以细胞干重计算)的油类。使低温保藏的细胞于室温解冻，并将500μl细胞和2%葡萄糖加入到4.5ml培养基(4.2g/L K2HPO4、3.1g/L NaH2PO4、0.24g/L MgSO4·7H2O、0.25g/L柠檬酸一水化合物、0.025g/L CaCl2·2H2O、2g/L酵母提取物)中，并使细胞在6孔板中于28℃振荡(200rpm)生长7天。通过使培养物在预称重的Eppendorf管中于14,000rpm离心5min来测定细胞干重。弃去培养物上清液，用1ml去离子水清洗细胞沉淀。再将使培养物离心，弃去上清液，并将细胞沉淀置于-80℃直至冷冻。接着使样品冻干24小时并计算细胞干重。
为了确定培养物中的总脂量，取出3ml培养物并利用Ankom系统(Ankom Inc.,Macedon,NY)根据厂商的说明进行分析。利用Amkom XT10萃取器根据厂商说明对样品进行溶剂萃取。以经酸水解的干燥样品与经溶剂萃取的干燥样品之间的质量差异确定总脂量。以细胞干重计算的油类百分比测定显示于表2中。
表2.以细胞干重计算的油类百分比
物种 品种 %油类
大型原藻 UTEX327 13.14
桑椹形原藻 UTEX1441 18.02
桑椹形原藻 UTEX1435 27.17
对来自美国专利申请公布20100151112的表22中列出的品种的微藻样品进行基因型测定。用下列方法从藻类生物质中分离基因组DNA。将液体培养物中的细胞(约200mg)以14,000×g离心5分钟。接着在无菌蒸馏水中重悬细胞，以14,000×g离心5分钟并弃去上清液。将直径～2mm的单个玻璃珠加入到生物质中，并且试管于-80℃放置至少15分钟。移出样品，并加入150μl研磨缓冲液(1%肌氨酰、0.25M蔗糖、50mM NaCl、20mM EDTA、100mM Tris-HCl(pH8.0)、RNase A0.5ug/ul)。通过简短振荡使沉淀重悬，随后加入40μl的5M NaCl。简短振荡样品，随后加入66μl5%CTAB(溴代十六烷基三甲铵)并进行最后的简短振荡。接着使细胞于65℃孵育10分钟，其后以14,000×g离心10分钟。将上清液转移至新管中并用300μl12:12:1的苯:氯仿:异戊醇萃取一次，随后以14,000×g离心5分钟。将得到的水相转移至含有0.7体积异丙醇(～190μl)的新管中，颠倒混合并于室温孵育30分钟或者于4℃过夜。通过以14,000×g离心10分钟回收DNA。接着得到的沉淀用70%乙醇清洗两次，随后用100%乙醇进行最后的清洗。将沉淀于室温风干20-30分钟，随后重悬于50μl10mM TrisCl，1mM EDTA(pH8.0)中。
将如上面所描述制备的5μl总藻类DNA在10mM Tris(pH8.0)中以1:50稀释。终体积为20μl的PCR反应设定如下。将10μl2×iProof HFmaster mix(BIO-RAD)加入到0.4μl引物SZ02613(5’-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3’(SEQ ID NO:13)，储存液浓度为10mM)中。该引物序列在Gen Bank保藏编号L43357中的567-588位点。L43357在高等植物和藻类质体基因组中高度保守。随后加入0.4μl引物SZ02615(5’-CAGTGAGCTATTACGCACTC-3’(SEQ ID NO:14)储存液浓度为10mM)。该引物序列与Gen Bank保藏编号L43357的1112-1093位互补，并且在在高等植物和藻类质体基因组中高度保守。接着加入5μl经稀释的总DNA和3.2μl dH2O。PCR反应运行如下：98℃，45’’；98℃，8’’；53℃，12’’；72℃，20’’进行35个循环，随后72℃1min并保存于25℃。为了纯化PCR产物，每个反应中加入20μl10mM Tris(pH8.0)，随后用40μl的12:12:1的苯:氯仿:异戊醇进行萃取，振荡并以14,000×g离心5分钟。在S-400柱(GE Healthcare)中进行PCR反应，并以3,000×g离心2分钟。随后将经过纯化的PCR产物TOPO克隆到PCR8/GW/TOPO中，并在LB/Spec板上筛选阳性克隆。
利用M13正向和反向引物对纯化的质粒DNA进行双向测序。总共对12个原藻品种进行筛选，对其23S rRNA DNA进行测序，这些序列列于序列表中。下面包括品种和序列表序号的概览。对这些序列与UTEX1435(SEQ ID NO:5)序列的总体差异进行分析。出现了两对差异最大的序列(UTEX329/UTEX1533和UTEX329/UTEX1440)。在这两种情况下，成对比对的结果是75.0%的成对序列同一性。下面也包括与UTEX1435的序列同一性百分比。
Figure BDA0000408990500000791
Figure BDA0000408990500000801
利用HPLC对上面所列品种的子代的脂类样品进行脂类特性分析。结果显示于下面表3中。
表3.微藻物种中脂链的多样性
Figure BDA0000408990500000802
实施例2：转化原藻的方法
A.基因枪转化原藻的一般方法
根据厂商说明制备SeaShell Technology的S550d金载体。使线性化质粒(20μg)与50μl结合缓冲液以及60μl(30mg)S550d金载体混合，并于冰上孵育1min。加入沉淀缓冲液(100μl)，并将混合物于冰上再孵育1min。振荡后，通过在Eppendorf5415C微量离心管中以10,000rpm旋转10秒钟，使包裹DNA的颗粒沉淀。用500μl冰冻100%乙醇清洗金沉淀物一次，在微量管中简短旋转使其沉淀，并用50μl冰冻乙醇重悬。简短(1-2秒)超声后，立刻将10μl包裹DNA的颗粒转移至载体膜上。
原藻品种在回转振荡器中生长于朊间质培养基(2g/L酵母提取物、2.94mM NaNO3、0.17mM CaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.4mMK2HPO4、1.28mM KH2PO4、0.43mM NaCl)中直至其细胞密度达到2×106细胞/ml。收集细胞，用无菌蒸馏水清洗一次，并重悬于50μl培养基中。将1×107个细胞涂于非选择性朊间质培养板的中间三分之一区域。用PDS-1000/HeBiolistic Particle Delivery系统(Bio-Rad)轰击细胞。使用爆破片(1100psi和1350psi)，并将板置于屏/巨载体配件的下面9和12cm处。使细胞于25℃复苏12-24h。复苏后，用橡皮刮从板上将细胞刮下，与100培养基混合，并涂于含有合适抗生素筛选的板上。于25孵育7-10天后，在1100psi和1350psi爆破片上和9和12cm距离的板上可以看到代表细胞被转化的菌落。挑取菌落，并点样于选择性琼脂板上进行第二轮筛选。
实施例3：能够代谢木糖的微藻品种的产生
在原藻物种中表达异源外源基因的方法和作用(包括例如密码子优化和染色体重组位点)先前已经描述在PCT申请号PCT/US2009/66142中，关于这些教导，所述申请以引用的方式并入本文。本实施例表明产生了来源于桑椹形原藻(UTEX1435)且含有代谢和转运木糖的外源基因的转基因品种。所产生的所得转基因原藻品种具有在含有木糖作为唯一碳源的培养基上生长的能力。如上文所讨论的，代谢木糖的能力是很重要的，因为木糖(一种戊糖)是纤维素来源的原料的重要组分。木糖是半纤维素的主要糖单体组分，所述半纤维素与纤维素一起形成大多数植物物质的主要结构组分。
初步结果显示桑椹形原藻(UTEX1435)可以将少量的木糖转化成木糖醇，如通过分析测量随着时间的推移在液体培养基中糖的水平所指示。在如以上实施例1所述的培养基和条件中在4%木糖和0.25%葡萄糖作为碳源的培养基中培养桑椹形原藻(UTEX1435)。还包括未添加细胞的阴性对照和作为生长的阳性对照和木糖醇生产的阴性对照的4%葡萄糖条件。表4显示在阴性对照条件中没有产生木糖醇，然而培养5天后具有原藻细胞的含木糖培养基在培养物上清液中产生可检测量的木糖醇。在仅葡萄糖的条件中存在细胞的强劲生长，但是没有产生可检测水平的木糖醇。
表4.
Figure BDA0000408990500000821
这个结果可指示经由桑椹形原藻中的醛-酮还原酶的酶促活性，木糖可以被转化成木糖醇。属于NAPDH依赖性氧化还原酶的这个家族的酶驻留在质膜的界限内，并且如果这种酶负责将木糖转化成木糖醇，那么培养基中的木糖必须经由外源性糖转运体而进入到细胞中。
在可以代谢木糖的生物体中，木糖被转化成木酮糖-5-磷酸，所述木酮糖-5-磷酸进一步经由戊糖磷酸途径来代谢。桑椹形原藻能够从其周围环境中摄取木糖，但是其能力不足以将木糖有效地转化成木酮糖-5-磷酸。在以上表4中显示的结果表明这可能是这种情况。为了检测这个假设，本发明提供了用于表达首先将木糖转化成木酮糖的木糖异构酶和将木酮糖转化成木酮糖-5-磷酸的木酮糖激酶的方法和试剂。这种转基因微藻细胞的一个示例性说明在使用桑椹形原藻(UTEX1435)的下文中描述。
使用先前描述在PCT专利公布号WO2010/063031和WO2010/063032中的方法和转化来产生表达来自梨囊鞭菌属的异构酶(XylA)基因和来自树干毕赤酵母的木酮糖激酶(XYL3)基因以及来自酿酒酵母的转化酶基因(suc2，可筛选标记)的桑椹形原藻转基因受体品种，所述专利各自以引用的方式并入本文以用于教导这些方法。在含有蔗糖的培养基和培养板上筛选阳性克隆。梨囊鞭菌属XylA的一级氨基酸序列(Gen Bank保藏编号CAB76571，其以引用的方式并入本文)如SEQ ID NO:15所列。树干毕赤酵母XYL3的一级氨基酸序列(Gen Bank保藏编号CAA39066.1，其以引用的方式并入本文)如SEQ ID NO:51所列。梨囊鞭菌属XylA/树干毕赤酵母XYL3转化序列盒的相关部分列在下文中。这个序列盒含有用于基因组整合的5’和3’桑椹形原藻KE858同源重组靶向序列并且如SEQ ID NO:16和17所列。还含有(1)在莱茵衣藻(C.reinhardtii)β-微管蛋白启动子和普通小球藻(Chlorella vulgaris)硝酸还原酶3’UTR(SEQ ID NO:18)控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶基因；(2)在原壳小球藻EF1a启动子和3’UTR控制下的树干毕赤酵母XYL3；以及(3)在原壳小球藻肌动蛋白启动子和EF1a3’UTR控制下的梨囊鞭菌属XylA。在含有蔗糖的培养基和培养板上筛选阳性克隆并且使用在蛋白质印迹中针对XylA或XYL3产生的兔多克隆抗体来确认转基因的表达。
Figure BDA0000408990500000831
一旦产生XylA/XYL3受体品种并使用蛋白质印迹法得到确认，那么用两个序列盒之一来重新转化所述品种。第一个序列盒是携带赋予抗生素G418抗性的基因和来自拟南芥的另一磷酸/戊糖磷酸易位体基因XPT的整合型转化载体，在所述拟南芥中质体转运肽被置换为来自属于来自桑椹形原藻的相同易位体家族的直向同源基因的转运肽。一级氨基酸序列(包括置换的转运肽SEQ ID NO:25)在SEQ ID NO:24中列出。还尝试了替代的质体转运肽SEQ ID NO:26并且同样也成功了。第二个序列盒是含有赋予抗生素G418抗性的基因和来自拟南芥的另一磷酸/戊糖磷酸易位体基因XPT以及树干毕赤酵母XYL2基因(木糖醇脱氢酶)的附加型(非整合型)转化载体，在所述拟南芥中质体转运肽被置换为属于来自桑椹形原藻的相同易位体家族的直向同源基因的转运肽。在酵母(如毕赤酵母属)中，在一定程度上木糖醇可以抑制XylA。在上文中描述的检查具有未转化原藻细胞的培养物上清液的初步实验显示培养基中可检测的低水平的木糖醇，指示直接从木糖生成木糖醇的內源还原酶活性。含有XYL2木糖醇脱氢酶的这个第二构建体提供了用于减轻这些木糖醇对XylA的抑制的方法。这两种载体各自的相关部分与以下个别序列盒组分一起分别列出为SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:23。单独XPT整合型序列盒含有在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子和普通小球藻硝酸还原酶3’UTR控制下的5’和3’桑椹形原藻6S同源重组靶向序列和新霉素(neomycin)抗性基因以及在原壳小球藻肌动蛋白启动子和EF1a3’UTR控制下的具有置换的转运肽序列(如上文所述)的拟南芥XPT基因。附加型序列盒含有在耐热性小球藻Gdh启动子和普通小球藻硝酸还原酶3’UTR控制下的新霉素抗性基因；在原壳小球藻肌动蛋白启动子和EF1a3’UTR控制下的树干毕赤酵母XYL2基因；以及在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子和原壳小球藻EF1a3’UTR控制下的拟南芥XPT基因。
Figure BDA0000408990500000841
使用添加有50μg/ml G418的含有蔗糖的培养基/培养板筛选来自两种转化的阳性克隆。
筛选来自转化的多个阳性克隆中的两个品种(每个转化一个)以用于更详细地表征。两个品种都在含有2%木糖作为唯一碳源的固体培养基板上生长。孵育3至4周之后，测量这些转基因品种的生长并观察两个转基因品种的生长，而不是观察仅含有XylA和XYL3转基因的亲本受体品种的生长。对这些结果进行确认以使用液体培养基环境来检测木糖消耗。使用2%木糖作为唯一碳源来建立含有转基因品种(XylA、XYL3、XPT和XYL2；XylA XYL3和XPT)和亲本受体品种(仅XylA和XYL3)二者的液体培养物。在培养期间的不同时间点测量生长(通过OD750读数来测量)和木糖消耗(测量培养基中剩余的木糖量)。在亲本受体品种中没有观察到生长或木糖消耗，而两个转基因品种显示生长和木糖消耗。表5总结了生长和木糖消耗的结果。
表5.生长和木糖消耗结果
Figure BDA0000408990500000861
实施例4：表达将木糖转运到细胞质中的转运体的工程改造微藻品种的产生
四种木糖特异性转运体(SUT1、GXS1、同向转运体以及XLT1分别为SEQ ID NO:37、39、41以及43)，其中一些主动转运木糖并且一些允许木糖被动扩散到细胞中，它们在桑椹形原藻中作为转基因被表达。对每种木糖转运体的基因进行密码子优化(密码子优化编码区分别显示在SEQ IDNO:36、38、40和42中)以允许在桑椹形原藻得到最大程度的表达并且插入到微藻细胞的基因组中受到原壳小球藻肌动蛋白启动子和EF1a3’UTR的控制。确认四种基因各自的表达，同样确认它们的插入和在细胞膜上的定位。对细胞膜上的定位的确认包括将编码荧光蛋白的DNA序列同框融合到每个转运体转基因的羧基端并且利用荧光显微术来观察表达构建体的细胞。
表达具有融合到转运体羧基端的荧光蛋白的四种转运体中每一种的细胞的显微照片显示这些转运体表达并定位在细胞膜上。
实施例5：表达用于将木糖转化成木酮糖-5-磷酸的酶的工程改造微藻品种的产生
工程改造桑椹形原藻以表达编码氧化还原酶途径酶XYL1、XYL2或XYL3(分别为SEQ ID NO:34、32和20)或者异构化酶途径酶XylA或者XYL3(分别为SEQ ID NO:23和20)的密码子优化基因，所述途径酶与用于将木糖生物化学转化成木酮糖-5-磷酸的两种替代途径相对应。所述两种途径共享相同末端酶(XYL3)。在RNA水平上确认每种基因的表达。此外，产生针对每种基因产物的抗体以允许在蛋白质水平上使用蛋白质印迹分析法来进一步监控表达。在由含有相应插入的转基因的转基因品种(而不是未转化的亲本细胞)制成的提取物中观察到与预期大小的条带相对应的蛋白质。
尽管负责将木糖转化成木酮糖-5-磷酸的酶的表达最初似乎没有赋予桑椹形原藻细胞代谢木糖的能力，但是通过增加转基因的拷贝数量赋予了在木糖上生长的能力。编码这些酶的基因的拷贝数量使用可筛选标记进行增加。原始亲本细胞的所有三种转基因(suc2、XylA和XYL3)具有一个的拷贝数量并且似乎不能在木糖上生长，但是在筛选(其中与编码木糖代谢酶的基因邻近的基因(suc2)赋予了在蔗糖上生长的能力)下生长之后，表征的三种独立分离株的所有三种转基因的拷贝数量已经增加到三倍至五十倍。评估具有增加的拷贝数量的这些分离株在木糖上的生长。显示拷贝数量增加最多(约50倍)的分离株A已获得在木糖上生长的能力。原始亲本不能在木糖上生长，显示拷贝数量仅中等增加(约3至4倍)的两种分离株(B和C)同样不能。分离株A在木糖上生长的能力表明转基因获得表达，在异源生物体中保留了它们的酶促活性并且可以赋予所述生物体利用木糖的能力。
实施例6：表达用于将木酮糖-5-磷酸递送到戊糖磷酸代谢途径中的易位体的工程改造微藻品种的产生
工程改造桑椹形原藻以表达特异性转运木酮糖-5-磷酸的三种嵌合植物易位体之一。通过用在桑椹形原藻或者原壳小球藻的SAD基因中发现的內源易位体中识别的三种转运肽之一置换由植物易位体基因(拟南芥XPT)编码的转运肽来产生嵌合基因以便提高木酮糖-5-磷酸到最终细胞目的地/代谢区的输出。通过在来自重叠群装配的桑椹形原藻中选择易位体直向同源物的部分DNA序列并且扩增所选序列来识别內源原藻转运肽。克隆由扩增产生的产物并测序，并且由所获得的序列获得信号肽。嵌合基因产物被定位到质体的内膜；这通过将荧光蛋白融合到易位体嵌合体的羧基端并且利用荧光显微术检查表达融合体的细胞来确定。荧光信号似乎被集中在细胞内的细胞器样结构周围，与质体的内膜中定位一致。三种嵌合易位体GPT-A-XPT、GPT-F-XPT和S106SAD-XPT分别在SEQ ID NO:45、47和49中示出。
实施例7：表达用于木糖代谢的基因的组合的工程改造微藻品种的产生
如本文的实施例所证实的，编码木糖代谢酶的个别转基因被成功地插入到桑椹形原藻中。为了研究将这些不同转基因在单个细胞中进行组合的作用，制备含有实施例4至6中讨论的转基因的某些组合(参见表6中的基因型)的桑椹形原藻品种并筛选以用于代谢木糖。
对每种独特基因型的十个独立转化体进行克隆纯化并评估它们在仅含有2.5%木糖作为唯一碳源的固体培养基上的生长。在含有木糖作为唯一碳源的液体培养基中进一步检测可能的阳性克隆。通过测量培养物的光密度来监测细胞的生长。在实验结束时，分析培养物上清液的木糖含量。表6示出与阴性对照(品种A、B和C)相比十个最佳品种(品种D至M)的最终生长和木糖消耗。品种D至M明显能够消耗木糖，因为培养基中的全部木糖在实验结束时已经消失了。相比之下，在实验结束时，含有阴性对照品种A、B和C的培养基中仍检测到与开始实验时所存在的相同量的木糖。木糖的消失伴随着细胞密度的增加，表明来自木糖的糖正在用于支持细胞生长。相比之下，阴性对照在整个实验过程中细胞密度没有增加，并且在实验结束时，培养基含有的木糖的量与实验开始时已存在于培养基中的木糖的量大致相同，这表明木糖完全没有被消耗或者木糖被消耗的量非常小。
表6.与阴性对照相比工程改造的品种的木糖利用和生长。
Figure BDA0000408990500000891
具有独特基因型的多种品种显示使用木糖作为唯一碳源时生物量明显增加。这些结果表明经由用将木糖转运到细胞中、将木糖生物化学转化成木酮糖-5-磷酸和将木酮糖-5-磷酸递送到內源的中心代谢途径中多种转基因或者转基因组转化对微藻进行工程改造使其在木糖上生长。
实施例8：木糖代谢品种的脂类生产能力
评价来自实施例7的木糖代谢品种A至M在使用木糖作为唯一碳源时产生油类的能力。对木糖代谢品种连同阴性对照品种一起进行脂类生产测定。使细胞首先生长在含有葡萄糖的培养基中并且随后使用葡萄糖抑或木糖作为唯一碳源来使之进行脂类生产阶段。在培养物中的糖耗尽时，供给更多相应的糖直到停止消耗。此时，终止实验并分析细胞的脂类含量。表7示出脂类分析的结果。所有品种根据在葡萄糖上的品种A的性能进行标准化，其表示为脂类的干细胞重量百分比。当将葡萄糖供给到培养物中时，所有工程改造的品种的性能与未工程改造的亲本对照品种相似。阴性对照品种(A、B、C)在木糖上培养时产生少量脂类(通常由葡萄糖中的品种A产生的量的6%至8%)。与之相反，全部十个木糖代谢品种在木糖中培养时都能够产生大量的脂类。最好的品种L在葡萄糖上生长时积累了通常由品种A产生的脂类的量的高达60%。
表7.在葡萄糖或木糖中生长的木糖代谢品种的脂类生产。
Figure BDA0000408990500000901
Figure BDA0000408990500000911
这些结果显示所插入的途径可以将碳从木糖中转移并利用它来生产脂类。
虽然已经对本发明结合其特定实施方案进行了描述，但是应当理解，能够对其进行进一步修改。本申请意欲涵盖大体依照本发明的原理的对本发明进行的任何变化、使用或者调整，并且包括本文公开内容的这些偏离属于本发明所属领域中已知或者惯用的惯例，并且同样适用于上文中阐述的必要特征。
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Claims (90)

1.一种植物界(kingdom Plantae)的微生物，所述微生物包含可操作以产生活性木糖代谢途径酶的重组核酸。
2.如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物在基本上由木糖组成的碳源上培养时能够增加细胞数量或者产生脂类。
3.根据权利要求1或2所述的微生物，其中所述微生物将木糖转化成甘油三酯。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的微生物，其中所述微生物在使用葡萄糖作为碳源来培养时能够积累按干细胞重量计10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的微生物，其中所述微生物在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述微生物在作为碳源的葡萄糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少50%的甘油三酯并且在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少20%的甘油三酯。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中当所述微生物在氮限制条件下在60%为葡萄糖且40%为木糖的碳源上培养时，如通过同位素示踪所测量，这些细胞产生其中碳原子的至少5%、10%、20%、30%、40%或50%来源于木糖的碳原子的脂类。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述微生物在少于或等于21天、14天或7天中在具有2.5%木糖作为唯一碳源的培养基中能够消耗至少90%的所述木糖。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的微生物，其中所述重组核酸可操作以编码以下一种或多种：活性木糖转运体、木酮糖-5-磷酸转运体、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖醇脱氢酶或木糖还原酶。
10.根据权利要求9所述的微生物，其中所述重组核酸编码可操作地连接有质体靶向信号序列的活性木酮糖-5-磷酸转运体并且其中所述木酮糖-5-磷酸转运体可操作以将木酮糖-5-磷酸转运到质体中。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的微生物，其中所述重组核酸可操作以编码(a)具有质体靶向信号序列以便使木酮糖-5-磷酸转运到质体中的木酮糖-5-磷酸转运体蛋白、(b)木酮糖激酶以及(c)木糖异构酶抑或木糖醇脱氢酶与木糖还原酶二者。
12.如以上权利要求中任一项所述的微生物，其中所述微生物属于绿色植物亚界(subkingdom Viridiplantae)。
13.如以上权利要求中任一项所述的微生物，其中所述微生物属于绿藻下界(infrakingdom Chlorophyta)或绿藻门(phyla Chlorophytae)、属于利藻亚门(subphylum Tetraphytina)、四胞藻纲(class Trebouxiophyceae)或者小球藻目(order Chlorellale)。
14.如以上权利要求中任一项所述的微生物，其中所述微生物属于小球藻属(genus Chlorella)或原藻属(genus Prototheca)。
15.如以上权利要求中任一项所述的微生物，其中所述微生物属于桑椹形原藻(Prototheca moriformis)或原壳小球藻(Chlorella protothecoide)种。
16.如以上权利要求中任一项所述的微生物，其进一步包含可操作以改变由所述微生物产生的脂类的脂肪酸特性的重组修饰。
17.如权利要求16所述的微生物，其中所述重组修饰包括编码活性酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去饱和酶或者可操作以减少或消除酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去饱和酶的外源基因。
18.一种用于生产微生物生物质或者生产由所述生物质生产的产品的方法，所述方法包括在包含木糖的培养基中异养地培养如权利要求1至17中任一项所述的重组微生物以便使木糖转化成所述微生物生物质。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述微生物生物质包括微生物脂类。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述脂类用于制备选自由以下组成的组的产品：化学品、润滑剂、清洁剂、燃料、食用油以及化妆品成分。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述产品是选自生物柴油或可再生柴油的燃料。
22.如权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述培养基包含多于50%木糖的碳源。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述碳源的高于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%为木糖。
24.一种利用权利要求1至17所述的微生物或权利要求18至23所述的方法中的任一项生产的天然油。
25.一种由权利要求24所述的天然油生产的油类化学品、食用油、燃料或其它产品。
26.一种重组产油微生物，其包含可操作以编码木糖易位体蛋白的外源基因。
27.如权利要求26所述的微生物，其选自由以下组成的组：微藻、产油酵母、产油真菌以及产油细菌。
28.如权利要求27所述的微生物，其为微藻。
29.如权利要求28所述的微藻，其为原藻属的物种。
30.如权利要求29所述的微藻，其为桑椹形原藻。
31.如权利要求26至30中任一项所述的微生物，其中已对所述外源基因进行了密码子优化以用于在所述重组产油微生物中表达。
32.如权利要求26所述的微生物，其中所述木糖易位体的天然质体靶向序列已置换为来自微藻的质体靶向序列。
33.如权利要求26至32中任一项所述的微生物，其中所述木糖易位体包含来自拟南芥属(genus Arabidopsis)的XPT蛋白质的氨基酸序列。
34.一种重组产油微生物，其包含一个或多个外源基因，其中所述一个或多个外源基因可操作以编码以下一种或多种：氧化还原酶途径蛋白、木糖异构酶途径蛋白或者木糖转运体蛋白。
35.如权利要求34所述的微生物，其中所述微生物进一步包含至少一个另外的外源基因，其中所述另外的外源基因可操作以编码选自由以下组成的组的蛋白质：蔗糖转化酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羧酶、酰基载体蛋白、去饱和酶、多糖降解酶以及赋予抗生素抗性的蛋白质。
36.如权利要求34或35所述的微生物，其中所述微生物选自由以下组成的组：微藻、产油酵母、产油真菌以及产油细菌。
37.如权利要求36所述的微生物，其为微藻。
38.如权利要求37所述的微藻，其为原藻属的物种。
39.如权利要求38所述的微藻，其为桑椹形原藻。
40.如权利要求34至39中任一项所述的微生物，其中所述一个或多个外源基因可操作以编码选自由以下组成的组的氧化还原酶途径蛋白：木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶。
41.如权利要求40所述的微生物，其中所述一个或多个外源基因可操作以编码木酮糖激酶。
42.如权利要求41所述的微生物，其中所述木酮糖激酶包含来自毕赤酵母属(genus Pichia)的XYL3蛋白质的氨基酸序列。
43.如权利要求40所述的微生物，其中所述一个或多个外源基团可操作以编码木糖醇脱氢酶。
44.如权利要求43所述的微生物，其中所述木糖醇脱氢酶包含来自所述毕赤酵母属的XYL2蛋白质的氨基酸序列。
45.如权利要求40所述的微生物，其中所述一个或多个外源基团可操作以编码木糖还原酶。
46.如权利要求45所述的微生物，其中所述木糖还原酶包含来自所述毕赤酵母属的XYL1蛋白质的氨基酸序列。
47.如权利要求34至39中任一项所述的微生物，其中所述一个或多个外源基因可操作以编码选自由木糖异构酶和木酮糖激酶组成的组的木糖异构酶途径蛋白。
48.如权利要求47所述的微生物，其中所述木糖异构酶途径蛋白是木糖异构酶。
49.如权利要求48所述的微生物，其中所述木糖异构酶包含来梨囊鞭菌属(genus Piromyces)的XYLA蛋白质的氨基酸序列。
50.如权利要求47所述的微生物，其中所述木糖异构酶途径蛋白是木酮糖激酶。
51.如权利要求50所述的微生物，其中所述木酮糖激酶包含来自所述毕赤酵母属的所述XYL3蛋白质的所述氨基酸序列。
52.如权利要求34至39中任一项所述的微生物，其中所述一个或多个外源基因可操作以编码选自由XYLA、XYL2、XYL3和XPT组成的组的蛋白质。
53.如权利要求52所述的微生物，其中所述木糖易位体的天然质体靶向序列已置换为来自微藻的质体靶向序列。
54.如权利要求53所述的微生物，其中所述木糖转运体包含来自所述拟南芥属的所述XPT蛋白质的所述氨基酸序列。
55.如权利要求34至39中任一项所述的微生物，其中所述一个或多个外源基因可操作以编码木糖转运体。
56.如权利要求55所述的微生物，其中所述木糖转运体包含来自木霉属(genus Trichoderma)的XLT1蛋白质的氨基酸序列。
57.一种重组产油微生物，其包含编码选自GPT-A-XPT(SEQ ID NO:45)、GPT-F-XPT(SEQ ID NO:47)或S106SAD-XPT(SEQ ID NO:49)的一种或多种木糖易位体蛋白的第一外源基因、编码选自SUT1(SEQ ID NO:37)、GXS1(SEQ ID NO:39)、XLT1(SEQ ID NO:43)或同向转运体(SEQ IDNO:41)的一种或多种木糖转运体蛋白的第二外源基因、编码选自XylA(SEQ ID NO:15)或XYL3(SEQ ID NO:51)的一种或多种氧化还原酶途径蛋白的第三外源基因以及编码选自XYL1(SEQ ID NO:35)、XYL2(SEQ IDNO:50)或XYL3(SEQ ID NO:51)的一种或多种木糖异构酶途径蛋白的第四外源基因。
58.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XylA、XYL3、SUT1和GPT-F-XPT的外源基因。
59.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XylA、XYL2、XYL3、XLT1和S106SAD-XPT的外源基因。
60.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XylA、XYL1、XYL3、XLT1和S106SAD-XPT的外源基因。
61.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XylA、XYL1、XYL3、GXS1和GPT-A-XPT的外源基因。
62.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XYL1、XYL2、XYL3、同向转运体和GPT-F-XPT的外源基因。
63.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XYL1、XYL2、XYL3、GXS1和GPT-F-XPT的外源基因。
64.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XYL2、XYL3、同向转运体和S106SAD-XPT的外源基因。
65.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XYL2、XYL3、XLT1和S106SAD-XPT的外源基因。
66.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XYL2、XYL3、GXS1和GPT-A-XPT的外源基因。
67.如权利要求26至66中任一项所述的微生物，所述微生物在包含多于50%为木糖的碳源的培养基中能够生长或产生脂类。
68.如权利要求67所述的微生物，其中所述微生物在包含多于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%为木糖的碳源的培养基中能够生长或产生脂类。
69.如权利要求68所述的微生物，其中所述微生物在包含木糖作为唯一碳源的培养基中能够生长或产生脂类。
70.如权利要求69所述的微生物，所述微生物能够产生由在包含葡萄糖作为唯一碳源的培养基中进行培养并且缺乏所述一个或多个外源基因的类似微生物细胞所产生的脂类的至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%或至少60%。
71.一种微生物脂类组合物，其是通过繁殖或培养如权利要求26至66中任一项所述的微生物而产生，包括以下步骤：
(a)在包含木糖的培养基中繁殖或培养所述微生物；以及
(b)裂解所述微生物并分离所述微生物脂类组合物。
72.如权利要求71所述的微生物脂类组合物，其中所述培养基进一步包含葡萄糖。
73.如权利要求71所述的微生物脂类组合物，其中所述培养基包含多于50%为木糖的碳源。
74.如权利要求73所述的微生物脂类组合物，其中所述碳源的多于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%为木糖。
75.如权利要求74所述的微生物脂类组合物，其中所述培养基包含木糖作为唯一碳源。
76.一种微生物脂类组合物，其是通过繁殖或培养如权利要求26至66中任一项所述的微生物而产生，包括以下步骤：
(a)在培养基中提供所述微生物；
(b)将解聚的纤维素材料添加到所述培养基中，其中所述纤维素材料包含木糖；
(c)繁殖或培养所述微生物直到所述微生物积累其干重的至少约20%作为脂类；以及
(d)裂解所述微生物并分离所述微生物脂类组合物。
77.如权利要求76所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的木糖浓度为至少约100g/L。
78.如权利要求77所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的木糖浓度为至少约400g/L。
79.如权利要求77所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料进一步包含葡萄糖。
80.如权利要求79所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的葡萄糖浓度为至少约100g/L。
81.如权利要求79所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的葡萄糖浓度为至少约400g/L。
82.如权利要求81所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的木糖和葡萄糖的总浓度为至少约100g/L。
83.如权利要求76所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的木糖和葡萄糖的总浓度为至少约400g/L。
84.如权利要求76所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的木糖和葡萄糖的总浓度为至少约600g/L。
85.如权利要求76所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的木糖和葡萄糖的总浓度为至少约800g/L。
86.一种生产微生物脂类组合物的方法，其包括繁殖或培养如权利要求26至66中任一项所述的微生物，包括以下步骤：
(a)在包含木糖的培养基中繁殖或培养所述微生物；以及
(b)裂解所述微生物并分离所述微生物脂类组合物。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述培养基包含多于50%为木糖的碳源。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述碳源的多于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%为木糖。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述培养基包含木糖作为唯一碳源。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述微生物产生由在包含葡萄糖作为唯一碳源的培养基中进行繁殖或培养并且缺乏所述一个或多个外源基因的类似微生物细胞所产生的脂类的至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%或至少60%。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107849514A (zh) * 2015-07-13 2018-03-27 玛拉可再生能源公司 增强木糖的微藻代谢
CN110616239A (zh) * 2019-08-23 2019-12-27 华南师范大学 固定化酶催化法合成d-木酮糖
CN111302892A (zh) * 2020-02-27 2020-06-19 浙江工业大学 一种利用柑橘皮制备木糖醇的方法
CN111690549A (zh) * 2020-05-18 2020-09-22 天津大学 利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株及构建方法和应用
CN112912489A (zh) * 2018-10-23 2021-06-04 玛拉可再生能源公司 微生物在半纤维素衍生碳水化合物中生长的适应和工艺优化
CN117660189A (zh) * 2024-02-01 2024-03-08 杭州楠大环保科技有限公司 一种微藻混合培养生产油脂的方法

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010063031A2 (en) 2008-11-28 2010-06-03 Solazyme, Inc. Manufacturing of tailored oils in recombinant heterotrophic microorganisms
EP2152849B1 (en) 2007-06-01 2013-02-20 Solazyme, Inc. Production of oil in microorganisms
US20100303989A1 (en) 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. Microalgal Flour
ES2718489T3 (es) 2010-05-28 2019-07-02 Corbion Biotech Inc Método para producir aceites a partir de Prototheca
KR102065526B1 (ko) 2010-11-03 2020-01-14 테라비아 홀딩스 인코포레이티드 유동점이 낮은 미생물 오일, 이 오일로 제조된 유전성 유체 및 관련 방법
KR101964965B1 (ko) 2011-02-02 2019-04-03 테라비아 홀딩스 인코포레이티드 재조합 유지성 미생물로부터 생산된 맞춤 오일
WO2012154626A1 (en) 2011-05-06 2012-11-15 Solazyme, Inc. Genetically engineered microorganisms that metabolize xylose
US9719114B2 (en) 2012-04-18 2017-08-01 Terravia Holdings, Inc. Tailored oils
SG11201406711TA (en) 2012-04-18 2014-11-27 Solazyme Inc Tailored oils
US9096876B2 (en) 2012-06-22 2015-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Engineered microbes and methods for microbial oil overproduction from cellulosic materials
US10098371B2 (en) 2013-01-28 2018-10-16 Solazyme Roquette Nutritionals, LLC Microalgal flour
US9816079B2 (en) 2013-01-29 2017-11-14 Terravia Holdings, Inc. Variant thioesterases and methods of use
US9567615B2 (en) 2013-01-29 2017-02-14 Terravia Holdings, Inc. Variant thioesterases and methods of use
US9290749B2 (en) 2013-03-15 2016-03-22 Solazyme, Inc. Thioesterases and cells for production of tailored oils
US9783836B2 (en) 2013-03-15 2017-10-10 Terravia Holdings, Inc. Thioesterases and cells for production of tailored oils
BR112015026948A8 (pt) 2013-04-26 2017-10-03 Solazyme Inc "composições, lubrificante, tensoativo, solvente, formulação de limpeza, composição de borracha reticulável ou reticulada, tira de pneu, espuma de poliuretano e seu método de preparação
FR3009619B1 (fr) 2013-08-07 2017-12-29 Roquette Freres Compositions de biomasse de microalgues riches en proteines de qualite sensorielle optimisee
WO2015051319A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Solazyme, Inc. Tailored oils
US9926347B2 (en) 2013-11-05 2018-03-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for engineering sugar transporter preferences
US9394550B2 (en) 2014-03-28 2016-07-19 Terravia Holdings, Inc. Lauric ester compositions
US9695223B2 (en) 2014-05-21 2017-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered xylose transporters with reduced glucose inhibition
EP3167053B1 (en) 2014-07-10 2019-10-09 Corbion Biotech, Inc. Novel ketoacyl acp synthase genes and uses thereof
WO2016014968A1 (en) 2014-07-24 2016-01-28 Solazyme, Inc. Variant thioesterases and methods of use
US10125382B2 (en) 2014-09-18 2018-11-13 Corbion Biotech, Inc. Acyl-ACP thioesterases and mutants thereof
CN107960101A (zh) 2015-04-06 2018-04-24 柯碧恩生物技术公司 具有lpaat消融的产油微藻
CN104988132B (zh) * 2015-06-19 2018-05-22 杭州师范大学 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法
CN105199976B (zh) * 2015-11-05 2020-12-18 山东大学 一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用
US20180066288A1 (en) 2016-08-05 2018-03-08 Kuehnle Agrosystems, Inc. Producing and altering microbial fermentation products using non-commonly used lignocellulosic hydrolysates
US20180142218A1 (en) 2016-10-05 2018-05-24 Terravia Holdings, Inc. Novel acyltransferases, variant thioesterases, and uses thereof
CN108504616B (zh) * 2018-04-03 2020-05-29 广西科学院 一种高效发酵蔗糖的重组拜氏梭菌以及提高拜氏梭菌蔗糖发酵性能的方法
US11618890B2 (en) 2018-08-22 2023-04-04 Corbion Biotech, Inc. Beta-ketoacyl-ACP synthase II variants
KR102108190B1 (ko) 2018-10-02 2020-05-08 한국과학기술연구원 자일로스 이용능을 갖는 효모 균주
US20220287245A1 (en) * 2019-08-09 2022-09-15 Bright Yeti, Inc. Electromagnetic treatment of crops
US12098331B2 (en) 2019-10-31 2024-09-24 Saudi Arabian Oil Company Enhanced hydroprocessing process with ammonia and carbon dioxide recovery
US20230037413A1 (en) 2019-11-20 2023-02-09 Corbion Biotech, Inc. Sucrose invertase variants
US20240002824A1 (en) * 2022-06-29 2024-01-04 Clara Foods Co. Protein compositions and methods of production

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060048240A1 (en) * 2004-04-01 2006-03-02 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
WO2010014632A2 (en) * 2008-07-28 2010-02-04 University Of Massachusetts Methods and compositions for improving the production of products in microorganisms
CN101765661A (zh) * 2007-06-01 2010-06-30 索拉兹米公司 在微生物中生产油
WO2011026008A1 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 Phycal Llc Biofuel from recombinant oleginous algae using sugar carbon sources

Family Cites Families (250)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2383602A (en) 1943-03-04 1945-08-28 Colgate Palmolive Peet Co Process for treatment of fatty glycerides
US2967700A (en) 1955-03-01 1961-01-10 Morris B Kallison Whipping and aerating apparatus
US2874171A (en) 1957-02-20 1959-02-17 Upjohn Co Recovery of ergosterol
US3142135A (en) 1962-02-13 1964-07-28 Grain Processing Corp Production of carotenoids by the cultivation of algae
US3280502A (en) 1962-11-07 1966-10-25 Hoffmann La Roche Process for the preparation of lutein
US3320693A (en) 1964-09-11 1967-05-23 Kk Method of industral cultivation of unicellular green algae such as chlorella
US3475274A (en) 1967-08-07 1969-10-28 Commercial Solvents Corp Production of riboflavin
DE1938186A1 (de) 1969-07-28 1971-02-11 Kohlenstoffbiologische Forschu Anwendung von planktonischen Meeres- und Suesswasseralgen fuer medizinische und diaetetische Zwecke
US3962466A (en) 1972-11-10 1976-06-08 Dai-Nippon Sugar Manufacturing Co., Ltd. Method for treatment of microorganisms
JPS5328989B2 (zh) 1974-05-27 1978-08-17
US4005062A (en) 1974-08-16 1977-01-25 Standard Oil Company (Indiana) Process of preparing water-soluble whippable extract from microorganism protein material
US3957578A (en) 1975-01-03 1976-05-18 Hokkaido Sugar Co., Ltd. Method for manufacture of α-galactosidase by microorganism
US4103039A (en) 1976-08-18 1978-07-25 Fuji Oil Company, Limited Method for producing improved shea fat
US4104460A (en) 1976-09-14 1978-08-01 Nobuyasu Hasebe Method for treating seaweed with hydrogen peroxide or hydrogen peroxide compound
US4182777A (en) 1977-03-01 1980-01-08 Standard Oil Company (Indiana) Co-dried yeast whey food product and process
US4140805A (en) 1977-03-11 1979-02-20 Edwards George W Process of producing useful materials from plants
IL57712A (en) 1979-07-03 1984-02-29 Yissum Res Dev Co Cultivation of halophilic algae of the dunaliella species for the production of fuel-like product
US4273790A (en) 1979-11-19 1981-06-16 Standard Brands Incorporated Low-fat liquid spread and process
US4373434A (en) 1980-11-24 1983-02-15 Simon-Rosedowns Limited Apparatus for the expansion of oil bearing seeds
JPS57150379A (en) 1981-03-14 1982-09-17 Kikujiro Ishiwatari Crushing of cell membrane of chlorella
US4390561A (en) 1981-11-04 1983-06-28 The Procter & Gamble Company Margarine oil product
JPS5955172A (ja) 1982-09-22 1984-03-30 Yamagataya Noriten:Kk 藻類を原料とする加工食品の製造方法
JPS606799A (ja) 1983-06-07 1985-01-14 北畠　三之丞 汚れ落しに効果を発揮する米糠を原料とする洗剤の製法
US4744996A (en) 1985-03-01 1988-05-17 Rakow Allen L Method for producing microalgae based foodstuff
US5792631A (en) 1985-07-01 1998-08-11 Dcv, Inc. Microbial process for the production of ascorbic acid using Chlorella protothecoides
US5900370A (en) 1985-07-01 1999-05-04 Bio-Technical Resources Process for the production of ascorbic acid with prototheca
US5001059A (en) 1985-07-01 1991-03-19 Bio-Technical Resources, Inc. L-ascorbic acid production in microorganisms
JPS6261568U (zh) 1985-10-02 1987-04-16
JPH0775557B2 (ja) 1986-04-25 1995-08-16 富士レビオ株式会社 脂質結合性シアル酸の測定法
US5360730A (en) 1987-06-05 1994-11-01 Universal Foods Corporation Zeaxanthin producing strains of Neospongiococcum Excentricum
US4992605A (en) 1988-02-16 1991-02-12 Craig Wayne K Production of hydrocarbons with a relatively high cetane rating
JPH01215262A (ja) 1988-02-25 1989-08-29 Yoshio Tanaka 真空包装ドナリエラ藻体含有食品の製造法
US4901635A (en) 1988-04-08 1990-02-20 Anderson International Corp. Apparatus and method for the continuous extrusion and partial deliquefaction of oleaginous materials
JPH078217Y2 (ja) 1988-07-07 1995-03-01 日立電線株式会社 発光ダイオードヘッド
US20060094089A1 (en) 1988-09-07 2006-05-04 Martek Biosciences Corporation Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5130242A (en) 1988-09-07 1992-07-14 Phycotech, Inc. Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5340742A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
US6680426B2 (en) 1991-01-07 2004-01-20 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US5693507A (en) 1988-09-26 1997-12-02 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US5407957A (en) 1990-02-13 1995-04-18 Martek Corporation Production of docosahexaenoic acid by dinoflagellates
US7053267B2 (en) 1990-03-16 2006-05-30 Calgene Llc Plant seed oils
US5244921A (en) 1990-03-21 1993-09-14 Martek Corporation Eicosapentaenoic acids and methods for their production
US5866382A (en) * 1990-04-06 1999-02-02 Xyrofin Oy Xylose utilization by recombinant yeasts
US5298421A (en) 1990-04-26 1994-03-29 Calgene, Inc. Plant medium-chain-preferring acyl-ACP thioesterases and related methods
US5164308A (en) 1990-05-21 1992-11-17 Martek Corporation Preparation of labelled triglyceride oils by cultivation of microorganisms
JPH04108374U (ja) 1990-10-11 1992-09-18 アスモ株式会社 小型モ−タのブラシ装置
US5945585A (en) 1990-12-20 1999-08-31 E. I. Du Pont De Nemours And Company Specific for palmitoyl, stearoyl and oleoyl-alp thioesters nucleic acid fragments encoding acyl-acp thiosesterase enzymes and the use of these fragments in altering plant oil composition
AU662506B2 (en) 1990-12-20 1995-09-07 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleotide sequences of soybean acyl-ACP thioesterase genes
US5455167A (en) 1991-05-21 1995-10-03 Calgene Inc. Medium-chain thioesterases in plants
US5270175A (en) 1991-07-12 1993-12-14 Dna Plant Technology Corporation Methods and compositions for producing metabolic products for algae
JP3143636B2 (ja) 1991-09-11 2001-03-07 株式会社サン・クロレラ 細胞破裂によるクロレラ細胞壁の破砕方法
DE4130986A1 (de) 1991-09-18 1993-03-25 Bayer Ag Pinosylvinsynthase-gene
FR2686619B1 (fr) 1992-01-28 1995-07-13 Commissariat Energie Atomique Procede de production selective de lipides poly-insatures a partir d'une culture de micro-algues du type porphyridium et cuve utilisee dans ce procede.
US5236721A (en) 1992-02-12 1993-08-17 Columbia Laboratories, Inc. Sustained flavorant release composition, chewable structure incorporating same and method for making same
US5395455A (en) 1992-03-10 1995-03-07 Energy, Mines And Resources - Canada Process for the production of anhydrosugars from lignin and cellulose containing biomass by pyrolysis
US5656310A (en) 1992-10-02 1997-08-12 Santillo, Jr.; Humbart D. Process for producing a powdered food supplement
JP3090810B2 (ja) 1993-03-09 2000-09-25 日本碍子株式会社 パルミトオレイン酸の製造方法
GB2277052A (en) 1993-04-14 1994-10-19 Du Pont Canada Polyurethane foam laminates
JPH078215A (ja) 1993-04-30 1995-01-13 Kawasaki Steel Corp ドコサヘキサエン酸含有海洋性微細藻類食品素材およびその製造方法
CA2176137A1 (en) 1993-11-10 1995-05-18 Alois Toni Voelker Plant acyl acp thioesterase sequences
US5910630A (en) 1994-04-06 1999-06-08 Davies; Huw Maelor Plant lysophosphatidic acid acyltransferases
ATE368118T1 (de) 1994-05-18 2007-08-15 Bayer Bioscience Gmbh Für enzyme, die die fähigkeit besitzen lineare alpha 1,4-glucane in pflanzen, pilzen und mikroorganismen zu synthesieren, kodierende dna sequenzen
IL110396A (en) 1994-07-21 2000-07-16 Univ Ben Gurion Coloring materials derived from red microalgae their preparation and compositions containing them
US5756135A (en) 1994-09-15 1998-05-26 Robert D. Seeley Trust Water insoluble yeast solids product and process of making same
US5680812A (en) 1995-01-23 1997-10-28 Linsgeseder; Helmut Apparatus and method for the extraction of vegetable oils
US5685218A (en) 1995-07-14 1997-11-11 The French Oil Mill Machinery Co. Method for treating oil-bearing material
US6255505B1 (en) 1996-03-28 2001-07-03 Gist-Brocades, B.V. Microbial polyunsaturated fatty acid containing oil from pasteurised biomass
AR006830A1 (es) 1996-04-26 1999-09-29 Du Pont Aceite de soja con alta estabilidad oxidativa
US5595965A (en) 1996-05-08 1997-01-21 The Lubrizol Corporation Biodegradable vegetable oil grease
US6312623B1 (en) 1996-06-18 2001-11-06 Abb Power T&D Company Inc. High oleic acid oil compositions and methods of making and electrical insulation fluids and devices comprising the same
IL134242A (en) 1997-08-01 2003-06-24 Martek Biosciences Corp Dha-containing nutritional compositions and methods for their production
EP1016708B1 (en) 1997-09-29 2006-11-29 Japan Tobacco Inc. Yeast extract composition, yeast for obtaining the same, and process for producing yeast extract composition
JP2002500868A (ja) 1998-01-21 2002-01-15 ユニバーシティ・オブ・メリーランド・バイオテクノロジー・インスティテュート 稚魚に不可欠な栄養素で生飼料を栄養強化する方法
US6139897A (en) 1998-03-24 2000-10-31 Kao Corporation Oil or fat composition containing phytosterol
US20020012979A1 (en) 1998-06-08 2002-01-31 Alan Berry Vitamin c production in microorganisms and plants
EP2305825B1 (en) 1998-07-06 2015-01-14 DCV Inc. doing business as Bio-Technical Resourses Method of vitamin production
DK2100963T3 (da) 1998-07-06 2012-04-02 Dcv Inc Fremgangsmåde til vitaminfremstilling.
US7511190B2 (en) 1999-11-17 2009-03-31 Mendel Biotechnology, Inc. Polynucleotides and polypeptides in plants
US6762345B1 (en) 1998-12-03 2004-07-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Plant stearoyl desaturases
JP2000175696A (ja) 1998-12-14 2000-06-27 Yoshio Tanaka ドナリエラ藻体の抽出方法
US6166231A (en) 1998-12-15 2000-12-26 Martek Biosciences Corporation Two phase extraction of oil from biomass
AU4211600A (en) 1999-04-10 2000-11-14 Maxygen, Inc. Modified lipid production
AU4231600A (en) 1999-04-12 2000-11-14 Monsanto Technology Llc Transgenic plants containing altered levels of sterol compounds and tocopherols
CA2374107A1 (en) 1999-06-04 2000-12-14 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Use of high oleic high stearic oils
DE10000978A1 (de) 2000-01-12 2001-07-26 Gvs Ges Fuer Erwerb Und Verwer Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an Fettsäuren in Pflanzen und Mikroorganismen
WO2001053512A1 (en) 2000-01-19 2001-07-26 Omegatech, Inc. Solventless extraction process
WO2010063031A2 (en) 2008-11-28 2010-06-03 Solazyme, Inc. Manufacturing of tailored oils in recombinant heterotrophic microorganisms
US6338866B1 (en) 2000-02-15 2002-01-15 Applied Food Biotechnology, Inc. Pet foods using algal or fungal waste containing fatty acids
CN1322493A (zh) 2000-04-11 2001-11-21 谢新辞 螺旋藻即溶食品的制造方法
JP2001292751A (ja) 2000-04-13 2001-10-23 Yaeyama Shokusan Kk クロレラ飲料用粉末
DE60130447T2 (de) 2000-04-21 2008-06-12 Martek Biosciences Corp. Trophische umwandlung von obligat phototropischen algen durch metabolische manipulation
US20020178467A1 (en) 2000-05-12 2002-11-28 Katayoon Dehesh Plastid transit peptide sequences for efficient plastid targeting
US6706950B2 (en) 2000-07-25 2004-03-16 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding β-ketoacyl-ACP synthase and uses thereof
EP1178118A1 (en) 2000-08-02 2002-02-06 Dsm N.V. Isolation of microbial oils
JP2002125601A (ja) 2000-10-25 2002-05-08 Kurorera Kogyo Kk 動物性プランクトン用餌料とその製造方法及び動物性プランクトンの培養方法
WO2002034931A2 (en) 2000-10-26 2002-05-02 Guyer Joe E Method of generating and recovering gas from subsurface formations of coal, carbonaceous shale and organic-rich shales
WO2002041698A1 (en) 2000-11-21 2002-05-30 Unilever N.V. Edible spread containing a natural fat phase
US7081567B2 (en) 2000-12-03 2006-07-25 Lexun Xue Transgenic dunaliella salina as a bioreactor
AU2002307432A1 (en) 2001-04-20 2002-11-05 Cargill, Incorporated Production of alpha-lipoic acid
US6620427B2 (en) 2001-04-24 2003-09-16 Abbott Laboratories Method for improving bone mineralization
DE60325457D1 (de) 2002-01-23 2009-02-05 Royal Nedalco B V Fermentation von pentosezuckern
US7314974B2 (en) 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
JP4095392B2 (ja) 2002-03-11 2008-06-04 水澤化学工業株式会社 バイオ燃料の製造方法
US20030229237A1 (en) 2002-04-02 2003-12-11 Haas Michael J. In situ production of fatty acid alkyl esters
EP2921155B1 (en) 2002-05-03 2020-01-08 DSM IP Assets B.V. Methods for producing high-quality lipids by enzymatic liberation from biomass
CN1735690A (zh) 2002-06-21 2006-02-15 孟山都技术有限公司 硫酯酶相关核酸序列及方法
JP2004049079A (ja) 2002-07-18 2004-02-19 Ishikawa Tennen Yakko Busshitsu Kenkyu Center ウルトラミクロ化クロレラ製剤
US20040074760A1 (en) 2002-10-17 2004-04-22 Carnegie Mellon University Production of biofuels
EP1566999A4 (en) 2002-11-18 2007-11-21 Monsanto Technology Llc MORE PRODUCTION OF OIL AND PROTEIN IN PLANTS BY INTERRUPTION OF THE PHENYLPROPANOID PATH
CA2514517A1 (en) 2003-01-28 2004-08-12 Cellectis Use of meganucleases for inducing homologous recombination ex vivo and in toto in vertebrate somatic tissues and application thereof
JP2004275173A (ja) 2003-03-17 2004-10-07 Teruo Kumagai 生大豆の微粉末を用いた豆乳の製造法。
US7032664B2 (en) 2004-06-02 2006-04-25 Halliburton Energy Services, Inc. Nanocomposite particulates and methods of using nanocomposite particulates
US7259255B2 (en) 2003-06-25 2007-08-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase promoters for gene expression in oleaginous yeast
US7468267B2 (en) 2003-08-25 2008-12-23 Funzyme Biotechnologies Sa Fungal proteins and nucleic acids encoding same
PE20050398A1 (es) 2003-09-22 2005-06-03 Rosales Jose Antonio Socla Proceso y purificacion de las xantofilas de marigold
KR20060081714A (ko) 2003-10-02 2006-07-13 미시시피 주립대학 폐수 처리 플랜트 슬러지로부터의 바이오-디젤 및 다른귀중한 화학물질의 제조방법
US7504259B2 (en) 2003-11-12 2009-03-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ12 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeast
CN1898389A (zh) 2003-12-23 2007-01-17 巴斯福植物科学有限公司 植物中的糖及脂质代谢调节剂vi
CN1238469C (zh) 2004-01-16 2006-01-25 清华大学 有机介质反应体系中脂肪酶转化油脂生产生物柴油新工艺
US8003367B2 (en) * 2004-03-16 2011-08-23 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids by fermentation using bacteria having enhanced expression of xylose utilization genes
US7063957B2 (en) 2004-03-26 2006-06-20 The University Of Hong Kong Methods for production of astaxanthin from the green microalgae Chlorella in dark-heterotrophic cultures
US7364883B2 (en) 2004-05-07 2008-04-29 Yeastern Biotech Co., Ltd. Process for producing poly-unsaturated fatty acids by oleaginous yeasts
EP1766037B1 (en) 2004-05-12 2015-07-01 Transworld Technologies Limited Generation of hydrogen from hydrocarbon-bearing materials
US7214297B2 (en) 2004-06-28 2007-05-08 Applied Materials, Inc. Substrate support element for an electrochemical plating cell
JP2006014700A (ja) 2004-07-05 2006-01-19 Masahiro Ogaki クロレラ属の新規株
US20060075522A1 (en) * 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
GB0421937D0 (en) 2004-10-02 2004-11-03 Univ York Acyl CoA synthetases
US7678931B2 (en) 2004-10-22 2010-03-16 Martek Biosciences Corporation Process for preparing materials for extraction
US7550286B2 (en) 2004-11-04 2009-06-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Docosahexaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US8685679B2 (en) 2004-11-04 2014-04-01 E I Du Pont De Nemours And Company Acyltransferase regulation to increase the percent of polyunsaturated fatty acids in total lipids and oils of oleaginous organisms
US7879591B2 (en) 2004-11-04 2011-02-01 E.I. Du Pont De Nemours And Company High eicosapentaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US20060225341A1 (en) 2004-12-20 2006-10-12 Rodolfo Rohr Production of biodiesel
US7803740B2 (en) 2004-12-30 2010-09-28 Sun Drilling Products Corporation Thermoset nanocomposite particles, processing for their production, and their use in oil and natural gas drilling applications
PT1681337E (pt) 2005-01-14 2010-12-24 Neste Oil Oyj Método para a produção de hidrocarbonetos
DE102005003624A1 (de) 2005-01-26 2006-07-27 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh Herstellung und Anwendung eines antioxidativ wirksamen Extraktes aus Crypthecodinium sp.
US7692049B2 (en) 2005-01-31 2010-04-06 Exxonmobil Chemical Patents Inc. Hydrocarbon compositions useful for producing fuels and methods of producing the same
AU2006219823A1 (en) 2005-03-02 2006-09-08 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals
CN103589650A (zh) 2005-03-18 2014-02-19 米克罗比亚公司 产油酵母和真菌中类胡萝卜素的产生
US20060223153A1 (en) 2005-04-05 2006-10-05 Luca Technologies, Llc Generation of materials with enhanced hydrogen content from anaerobic microbial consortia
US7426960B2 (en) 2005-05-03 2008-09-23 Luca Technologies, Inc. Biogenic fuel gas generation in geologic hydrocarbon deposits
WO2006122299A2 (en) 2005-05-11 2006-11-16 Advanced Bionutrition Corporation Fish oil in stabilized form
CA2624616A1 (en) 2005-05-12 2006-11-23 Martek Biosciences Corporation Biomass hydrolysate and uses and production thereof
CN101175409B (zh) 2005-05-19 2012-11-14 荷兰联合利华有限公司 营养制品
HUE025943T2 (en) 2005-07-04 2016-05-30 Neste Oil Oyj A method for producing hydrocarbons in the form of diesel fuels
JP2009505660A (ja) 2005-08-25 2009-02-12 エイ２ビーイー カーボン キャプチャー エルエルシー 藻類からバイオディーゼルを生産するする方法、装置およびシステム
WO2007027669A1 (en) 2005-08-29 2007-03-08 Cps Biofuels, Inc. Improved biodiesel fuel, additives, and lubbricants
FR2890961B1 (fr) 2005-09-21 2007-11-23 Inst Francais Du Petrole Procede perfectionne de fabrication d'esters ethyliques a partir de corps gras d'origine naturelle
CN100408656C (zh) 2005-09-28 2008-08-06 中国科学院大连化学物理研究所 一种生物柴油的制备方法
US20070160728A1 (en) 2005-10-13 2007-07-12 Noel Rudie Gluten-free food products including deflavored bean powder
US8163675B2 (en) 2005-10-20 2012-04-24 Akzo Nobel N.V. Emulsifier based on polyamines and fatty acid/maleic anhydride
US20070167396A1 (en) 2006-01-19 2007-07-19 Solazyme, Inc. Methods and compositions for cholesterol reduction in mammals
US20090274736A1 (en) 2006-01-19 2009-11-05 Solazyme Inc. Nutraceutical Compositions From Microalgae And Related Methods of Production And Administration
JP2007215507A (ja) 2006-02-17 2007-08-30 Kobayashi Pharmaceut Co Ltd スピルリナおよびクロレラ含有食品組成物
AU2007226510B2 (en) 2006-03-15 2013-09-19 Dsm Ip Assets B.V. Polyunsaturated fatty acid production in heterologous organisms using pufa polyketide synthase systems
CN100590186C (zh) 2006-03-17 2010-02-17 中国科学院大连化学物理研究所 一种生产生物油脂和生物柴油的方法
CN101460141A (zh) 2006-04-03 2009-06-17 先进生物营养公司 包含二十二碳六烯酸的饲料制剂
US20100248322A1 (en) 2006-04-05 2010-09-30 Luca Technologies, Inc. Chemical amendments for the stimulation of biogenic gas generation in deposits of carbonaceous material
BRPI0709946A2 (pt) 2006-04-13 2011-08-02 Ambrozea Inc composições e métodos para produzir produtos e resìduos de fermentação
WO2007134294A2 (en) 2006-05-12 2007-11-22 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Az Acting For & On Behalf Of Az State Unviversity Novel chlorella species and uses therefor
CA2893168C (en) 2006-06-28 2017-11-07 Nucelis Inc. Fatty acid blends and uses therefor
CN101108997B (zh) 2006-07-19 2010-07-21 中国科学院大连化学物理研究所 一种微生物油脂的制备方法
EP2064304A2 (en) 2006-08-16 2009-06-03 BIOeCON International Holding N.V. Production of linear alkanes by hydrotreating mixtures of triglycerides with vacuum gasoil
EA200970304A1 (ru) 2006-09-18 2009-10-30 Дзе Аризона Борд Оф Риджентс, Э Боди Корпорейт Оф Дзе Стейт Оф Аризона Эктинг Фор Энд Он Бихаф Оф Аризона Стейт Юниверсити Жирные кислоты и углеводороды водорослей со средней длиной цепи
US8367395B2 (en) 2006-09-28 2013-02-05 Dsm Ip Assets B.V. Production of sterols in oleaginous yeast and fungi
US9101161B2 (en) 2006-11-02 2015-08-11 The Coca-Cola Company High-potency sweetener composition with phytoestrogen and compositions sweetened therewith
US8088614B2 (en) 2006-11-13 2012-01-03 Aurora Algae, Inc. Methods and compositions for production and purification of biofuel from plants and microalgae
JP4820277B2 (ja) 2006-12-20 2011-11-24 花王株式会社 ケトン体及び／又は２級アルコールの製造法
US7977076B2 (en) 2006-12-29 2011-07-12 Genifuel Corporation Integrated processes and systems for production of biofuels using algae
WO2008083351A2 (en) 2006-12-29 2008-07-10 Genifuel Corporation Controlled growth environments for algae cultivation
JPWO2008093847A1 (ja) 2007-02-02 2010-05-20 キリンホールディングス株式会社 キシリトールデヒドロゲナーゼをコードするｄｎａ
JP2008253146A (ja) 2007-03-30 2008-10-23 Adeka Corp 焼プリン用ミックス液
US8129512B2 (en) 2007-04-12 2012-03-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of identifying and creating rubisco large subunit variants with improved rubisco activity, compositions and methods of use thereof
NZ578234A (en) 2007-05-02 2012-12-21 Ouro Fino Participacoes E Empreendimentos S A Process to produce biodiesel and/or fuel oil
CN101743263A (zh) 2007-05-15 2010-06-16 陶氏环球技术公司 高回弹性泡沫体
US8801975B2 (en) 2007-05-17 2014-08-12 Cooper Industries, Llc Vegetable oil dielectric fluid composition
US7914832B2 (en) 2007-06-01 2011-03-29 Kyoto Eiyo Co., Ltd. Method for producing chlorella fermented food
ES2607795T3 (es) * 2007-06-12 2017-04-04 Cps Biofuels, Inc. Producción de gasolina a partir de materias primas fermentables
US20090018300A1 (en) 2007-07-11 2009-01-15 Archer-Daniels-Midland Company Monomers and polymers from bioderived carbon
JP4526575B2 (ja) 2007-08-06 2010-08-18 株式会社メタルカラー クロレラ抽出物含有飲料
CN101130513A (zh) 2007-08-24 2008-02-27 北京科技大学 一种从小球藻藻粉中提取纯化叶黄素的方法
CA2698311C (en) 2007-08-31 2016-07-12 Martek Biosciences Corporation Polyunsaturated fatty acid-containing solid fat compositions and uses and production thereof
JP4642050B2 (ja) 2007-09-04 2011-03-02 クロレラ工業株式会社 新規クロレラ及びその製造方法並びにそのクロレラを含有する健康食品
US20090176272A1 (en) 2007-09-12 2009-07-09 Kuehnle Agrosystems, Inc. Expression of nucleic acid sequences for production of biofuels and other products in algae and cyanobacteria
KR20100067111A (ko) * 2007-09-12 2010-06-18 마텍 바이오싸이언스스 코포레이션 생물학적 오일 및 생산 및 이의 용도
EP2211881A4 (en) 2007-11-01 2012-01-04 Wake Forest University School Of Medicine COMPOSITIONS AND METHODS FOR PREVENTING AND TREATING DISEASES AFFECTING MAMMALS
FR2924126B1 (fr) 2007-11-28 2011-04-15 Roquette Freres Nouveau procede de culture d'une microalgue heterotrophe
US20090145392A1 (en) 2007-11-30 2009-06-11 Clark Richard Hugh Fuel formulations
US8815567B2 (en) 2007-11-30 2014-08-26 E I Du Pont De Nemours And Company Coenzyme Q10 production in a recombinant oleaginous yeast
US20090298143A1 (en) 2007-12-11 2009-12-03 Roessler Paul Gordon Secretion of fatty acids by photosynthetic microorganisms
GB0724720D0 (en) 2007-12-19 2008-01-30 Ici Plc Triglyceride macromonomers
JP5219074B2 (ja) * 2008-01-24 2013-06-26 独立行政法人産業技術総合研究所 キシロース発酵能が優れた六炭糖・五炭糖同時発酵酵母およびそれを用いたエタノールの高効率生産方法
WO2009105620A1 (en) 2008-02-20 2009-08-27 Cco Technology, Ltd. Selective short chain monounsaturated oils
CN101230364A (zh) 2008-02-25 2008-07-30 清华大学 一种利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法
US8048654B2 (en) 2010-06-09 2011-11-01 Joule Unlimited Technologies, Inc. Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of fatty acids and esters
CA2715147A1 (en) * 2008-03-07 2009-09-11 Dsm Ip Assets B.V. A pentose sugar fermenting cell
US8598378B2 (en) 2008-03-14 2013-12-03 University Of Hawaii Methods and compositions for extraction and transesterification of biomass components
US8043496B1 (en) 2008-03-18 2011-10-25 Peter Allen Schuh System for extracting oil from algae
EP2271742A4 (en) 2008-03-31 2011-05-25 Kuehnle Agrosystems Inc GENE EXPRESSION ON A NUCLEAR BASIS FOR BIOFUELS PRODUCTION AND TREATMENT OF COPRODUCTS IN ALGAE
US20100170144A1 (en) 2008-04-09 2010-07-08 Solazyme, Inc. Hydroprocessing Microalgal Oils
RU2542374C2 (ru) 2008-04-09 2015-02-20 Солазим, Инк. Способ химической модификации липидов микроводорослей, способ получения мыла и мыло, включающее соли жирных кислот омыленных липидов микроводорослей
US20110065821A1 (en) 2008-05-13 2011-03-17 Cargill, Incorporated Polyol made from partialy hydrogenated, fully epoxidized natural oils
FR2931071B1 (fr) 2008-05-14 2010-08-13 Roquette Freres Confiserie aux algues pour la prevention des infections buccodentaires
CN101280328B (zh) 2008-05-27 2011-06-29 清华大学 一种从自养到异养两步培养小球藻生产生物柴油的方法
FR2933848B1 (fr) 2008-07-18 2019-08-09 Roquette Freres Composition de fibres indigestibles solubles et d'organismes eucaryotes dotes d'une paroi polysaccharidique utilisees dans le domaine du bien etre
US8435790B2 (en) 2008-07-25 2013-05-07 The Regents Of The University Of California Methods of modulating lipid concentrations in eukaryotic cells
US8273694B2 (en) 2008-07-28 2012-09-25 Jeffrey A Brown Synthetic compositions obtained from algae
US20100035309A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Luca Technologies, Inc. Analysis and enhancement of metabolic pathways for methanogenesis
WO2010019813A2 (en) 2008-08-13 2010-02-18 Sapphire Energy, Inc. Production of fatty actds by genetically modified photosynthetic organisms
CA2738575C (en) 2008-10-03 2018-08-14 Steven Fabijanski Production of modified fatty acids in plants by rdna targeted integration of heterologous nucleic acids
US8097439B2 (en) 2008-10-07 2012-01-17 Ls9, Inc. Methods and compositions for producing fatty aldehydes
US20100303957A1 (en) 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. Edible Oil and Processes for Its Production from Microalgae
US20100297295A1 (en) 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Microalgae-Based Beverages
US20100303989A1 (en) 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. Microalgal Flour
CN102271525B (zh) 2008-10-14 2015-01-07 索拉兹米公司 微藻生物质的食品组合物
US20100297323A1 (en) 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Gluten-free Foods Containing Microalgae
US20100303961A1 (en) 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. Methods of Inducing Satiety
US20100297292A1 (en) 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Reduced Pigmentation Microalgae Strains and Products Therefrom
US20130122180A1 (en) 2008-10-14 2013-05-16 Solazyme, Inc. Microalgal Food Compositions
US20100297325A1 (en) 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Egg Products Containing Microalgae
US20120128851A1 (en) 2008-10-14 2012-05-24 Solazyme, Inc Novel microalgal food compositions
US20100303990A1 (en) 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. High Protein and High Fiber Algal Food Materials
WO2010120923A1 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Solazyme, Inc. Novel microalgal food compositions
US20100297296A1 (en) 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Healthier Baked Goods Containing Microalgae
US20100297331A1 (en) 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Reduced Fat Foods Containing High-Lipid Microalgae with Improved Sensory Properties
CN110129296A (zh) 2008-12-23 2019-08-16 Reg生命科学有限责任公司 硫酯酶相关的方法和组合物
US20100196575A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Solae, Llc Melting Vegetable Protein Based Substitute Cheese
US20100248321A1 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Luca Technologies, Inc. Surfactant amendments for the stimulation of biogenic gas generation in deposits of carbonaceous materials
EP3093324A1 (en) 2009-03-27 2016-11-16 E. I. du Pont de Nemours and Company Dielectric heat-transfer fluid
EP2419520B1 (en) 2009-04-14 2019-06-26 Corbion Biotech, Inc. Methods of microbial oil extraction and separation
WO2011038134A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Ls9, Inc. Production of fatty acid derivatives
US9334483B2 (en) 2009-12-18 2016-05-10 Cargill, Incorporated Brassica plants with mutant FATA2 alleles yielding oils with a low total saturated fatty acid content
ES2651313T3 (es) * 2009-12-28 2018-01-25 Dsm Ip Assets B.V. Traustoquítridos recombinantes que crecen en xilosa, y composiciones, métodos de preparación y usos de los mismos
WO2011082253A2 (en) 2009-12-30 2011-07-07 Board Of Trustees Of Michigan State University A method to produce acetyldiacylglycerols (ac-tags) by expression ofan acetyltransferase gene isolated from euonymus alatus (burning bush)
WO2011130573A1 (en) 2010-04-14 2011-10-20 Solazyme, Inc. Fuel and chemical production from oleaginous yeast
WO2011130576A1 (en) 2010-04-14 2011-10-20 Solazyme, Inc. Oleaginous yeast food compositions
MX347228B (es) 2010-04-14 2017-04-19 Solazyme Roquette Nutritionals Llc Composiciones alimenticias de harina de microalgas ricas en lípidos.
ES2718489T3 (es) 2010-05-28 2019-07-02 Corbion Biotech Inc Método para producir aceites a partir de Prototheca
KR102065526B1 (ko) 2010-11-03 2020-01-14 테라비아 홀딩스 인코포레이티드 유동점이 낮은 미생물 오일, 이 오일로 제조된 유전성 유체 및 관련 방법
CN101999567A (zh) 2010-12-10 2011-04-06 广东石油化工学院 螺旋藻营养果冻
EP2655615A4 (en) 2010-12-23 2014-04-23 Exxonmobil Res & Eng Co ACYL-ACP PROKARYOTIC THIOESTERASES FOR THE PRODUCTION OF FATTY ACIDS IN GENETICALLY MODIFIED MICROORGANISMS
KR101964965B1 (ko) 2011-02-02 2019-04-03 테라비아 홀딩스 인코포레이티드 재조합 유지성 미생물로부터 생산된 맞춤 오일
WO2012154626A1 (en) 2011-05-06 2012-11-15 Solazyme, Inc. Genetically engineered microorganisms that metabolize xylose
WO2013073529A1 (ja) 2011-11-15 2013-05-23 公益財団法人北九州産業学術推進機構 燃料油の製造方法
WO2013082186A2 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Solazyme, Inc. Genetically engineered microbial strains including prototheca lipid pathway genes
US20130157917A1 (en) 2011-12-20 2013-06-20 Rhodia Operations Industrial cleaning compositions and methods for using same
SG11201403419SA (en) 2011-12-23 2014-07-30 Solazyme Inc Algal thermoplastics, thermosets, paper, adsorbants and absorbants
US9719114B2 (en) 2012-04-18 2017-08-01 Terravia Holdings, Inc. Tailored oils
SG11201406711TA (en) 2012-04-18 2014-11-27 Solazyme Inc Tailored oils
US8617317B1 (en) 2012-07-31 2013-12-31 Ecolab Usa Inc. All-purpose cleaners with natural, non-volatile solvent
WO2015051319A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Solazyme, Inc. Tailored oils

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060048240A1 (en) * 2004-04-01 2006-03-02 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
CN101765661A (zh) * 2007-06-01 2010-06-30 索拉兹米公司 在微生物中生产油
WO2010014632A2 (en) * 2008-07-28 2010-02-04 University Of Massachusetts Methods and compositions for improving the production of products in microorganisms
WO2011026008A1 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 Phycal Llc Biofuel from recombinant oleginous algae using sugar carbon sources

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
黄骥等: "植物戊糖磷酸途径及其两个关键酶的研究进展", 《植物学通报》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107849514A (zh) * 2015-07-13 2018-03-27 玛拉可再生能源公司 增强木糖的微藻代谢
CN112912489A (zh) * 2018-10-23 2021-06-04 玛拉可再生能源公司 微生物在半纤维素衍生碳水化合物中生长的适应和工艺优化
CN110616239A (zh) * 2019-08-23 2019-12-27 华南师范大学 固定化酶催化法合成d-木酮糖
CN110616239B (zh) * 2019-08-23 2020-11-06 华南师范大学 固定化酶催化法合成d-木酮糖
CN111302892A (zh) * 2020-02-27 2020-06-19 浙江工业大学 一种利用柑橘皮制备木糖醇的方法
CN111302892B (zh) * 2020-02-27 2023-11-07 浙江工业大学 一种利用柑橘皮制备木糖醇的方法
CN111690549A (zh) * 2020-05-18 2020-09-22 天津大学 利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株及构建方法和应用
CN117660189A (zh) * 2024-02-01 2024-03-08 杭州楠大环保科技有限公司 一种微藻混合培养生产油脂的方法
CN117660189B (zh) * 2024-02-01 2024-05-24 杭州楠大环保科技有限公司 一种微藻混合培养生产油脂的方法

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