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CN103596974B - 多肽和多核苷酸及其用于治疗免疫相关失调和癌症的用途 - Google Patents

多肽和多核苷酸及其用于治疗免疫相关失调和癌症的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及LY6G6F、VSIG10、TMEM25以及LSR蛋白，它们是免疫疗法，癌症、感染性失调、和/或免疫相关失调的治疗，以及药物开发的适合的靶标。本发明进一步涉及可溶性LY6G6F、VSIG10、TMEM25以及LSR分子，LY6G6F、VSIG10、TMEM25以及LSR的细胞外结构域和偶联物，它们是针对免疫疗法，癌症、感染性失调、和/或免疫相关失调的治疗的适合的药物。本发明进一步涉及特异性针对LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR分子的抗体和抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代性支架，它们是针对免疫疗法，癌症、感染性失调、和/或免疫相关失调的治疗的适合的药物。

Description

多肽和多核苷酸及其用于治疗免疫相关失调和癌症的用途
发明领域
本发明涉及LY6G6F、VSIG10、TMEM25以及LSR蛋白连同可溶性分子和偶联物以及针对此类的抗体，LY6G6F、VSIG10、TMEM25以及LSR蛋白是免疫疗法，癌症、感染性失调、和/或免疫相关失调的治疗，以及药物开发的适合的靶标。
发明背景
为了变得有成效地活化，原始T细胞必须接受来自抗原呈递细胞(APC)的两个独立信号。第一信号1是抗原特异性的，并且当T细胞抗原受体碰到APC上的适当的抗原-MHC复合体时发生。免疫应答的命运是由第二、抗原独立性信号(信号2)决定的，该信号被通过一种T细胞共刺激分子来递送，该T细胞共刺激分子接合其APC-表达性配体。这种第二信号可以是刺激的(正向共刺激)亦或抑制的(负向共刺激或共抑制)。在共刺激信号不存在的情况下，或在共抑制信号存在的情况下，T-细胞活化是受损的或夭折的，这可以导致抗原特异性无反应性(称为T-细胞无反应性)的状态，或可以导致T-细胞凋亡性死亡。
共刺激分子对通常由APC上表达的配体和T细胞上表达的其同源受体组成。共刺激分子的原型配体/受体对是B7/CD28和CD40/CD40L。B7家族由结构上相关的细胞表面蛋白配体组成，这些细胞表面蛋白配体可以为免疫应答提供刺激性或抑制性输入。B7家族的成员是结构上相关的，其中细胞外结构域包含至少一个可变的或恒定的免疫球蛋白功能区。
正向和负向共刺激信号在细胞介导的免疫应答的调节中都发挥关键作用，并且已经证明介导这些信号的分子对于免疫调节是有效的靶标。基于这一知识，已经研发了若干种涉及共刺激分子的靶向的治疗途径，并且示出它们对于在癌症患者上通过开启或阻止免疫应答的关闭来预防和治疗癌症是有用的，并且对于自体免疫性疾病和炎性疾病连同同种异体移植的排斥的预防和治疗是有用的，每种都是通过在患有这些病理学病症的受试者上关闭不受控的免疫应答、或通过经由负向共刺激(或共抑制)来诱导“关闭信号”的。
已经示出由B7配体递送的这些信号的处理在自体免疫、炎性疾病、以及移植排斥的治疗中是有潜力的。治疗策略包括使用至一个共刺激对的配体或受体的单克隆抗体、或使用由可以结合并且阻断其适当配体的共刺激受体组成的可溶性融合蛋白来阻断共刺激。另一种途径是使用一种抑制性配体的可溶性融合蛋白来诱导共抑制。这些途径依赖，至少部分地依赖自体反应性T细胞或异体反应性T细胞(它们分别对自体免疫性疾病或移植中的致病过程负责)的最终缺失，大概因为在共刺激(诱导细胞存活基因)不存在的情况下，T细胞对凋亡的诱导变得高度易感。因此，能够调节共刺激信号而不使免疫系统对抗病原体的能力妥协的新颖试剂对于此类病理学病症的治疗和预防是高度有利的。
共刺激通路在肿瘤发展中发挥重要作用。有趣地，已经示出肿瘤通过以下来逃脱免疫破坏：通过抑制B7-CD28和TNF家族中的共刺激因子来阻碍T细胞的活化，连同通过吸引调节性T细胞(它们抑制抗肿瘤T细胞反应)(参见王(Wang)(2006)Immune Suppression byTumor Specific CD4+Regulatory T cells in Cancer(通过癌症中的肿瘤特异性CD4+调节性T细胞的免疫抑制)，Semin.Cancer.Biol.(《癌症生物学研讨会》)16：73-79；格林沃尔德(Greenwald)等人，(2005)The B7 Family Revisited.Ann.Rev.Immunol(《免疫学年报》)，23：515-48；瓦特(Watts)(2005)TNF/TNFR Family Members in Co-stimulation ofT Cell Responses(T细胞反应的共刺激中的TNF/TNFR家族成员)Ann.Rev.Immunol(《免疫学年报》)，23：23-68；赛杜姆(Sadum)等人，(2007)Immune Signatures of Murine andHuman Cancers Reveal Unique Mechanisms of Tumor Escape and New Targets forCancer Immunotherapy.(鼠科动物和人类的免疫特征标志揭示肿瘤逃逸的独特机制和用于癌症免疫疗法的新靶标)Clin.Cane.Res.(《临床癌症研究》)13(13)：4016-4025)。此类表达肿瘤的共刺激分子已经变为有吸引力的癌症生物标记并且可以充当肿瘤相关抗原(TAA)。此外，已经鉴定共刺激通路为免疫学检验点，在起始水平和肿瘤转移酶内的效应器功能方面，这些免疫学检验点减弱T细胞依赖性免疫应答。随着工程化癌症疫苗持续改善，此类免疫学检验点是这些疫苗诱导治疗性抗肿瘤反应的能力的一个主要障碍变得越来越清楚。在那方面，共刺激分子可以充当用于主动(疫苗接种)和被动(抗体介导的)癌症免疫疗法的佐剂，来提供阻碍免疫耐受性并且刺激免疫系统的策略。
此外，此类试剂在其他类型的癌症免疫疗法，例如过继性免疫治疗中可以是有用的，其中肿瘤特异性T细胞群体被扩大并且被引导以攻击并且杀死肿瘤细胞。能够增加此类抗肿瘤反应的试剂具有很大的治疗潜力，并且可以在克服肿瘤免疫疗法的障碍的尝试中是有价值的。最近，的确将调节若干共刺激通路的新颖试剂引入到了临床中来作为癌症免疫疗法。
来自对急性和慢性传染病的广泛研究的新兴数据为负向共刺激受体还有控制传染支持了一个重要作用。在急性病毒感染后产生的记忆CD8 T细胞是高度功能性的并且构成保护性免疫的一种重要组分。还已经证明通过将记忆T细胞反应限制在其保护能力之内来调节共刺激通路在优化抗病毒性免疫中是有效的(台亚若(Teijaro)等人，《免疫学杂志》(J Immunol.)2009：182；5430-5438)。这已经在流行性感冒传染的模型中得到了证明，在感染流行性感冒的初试的小鼠中用CTLA4-Ig抑制性初次免疫应答来抑制CD28共刺激，但是对流行性感冒的记忆CD4 T细胞介导的再次应答是显著有疗效的，这导致对流行性感冒激发的改善的临床结果和增加的存活。
慢性传染病通常特征在于病毒特异性T-细胞反应的不同程度功能性损伤，并且这种缺陷是宿主没有能力消除持久性病原体的主要原因。尽管在感染的早期阶段过程中最初产生了功能性效应器T细胞，但是由于持续性暴露于外源抗原，它们在慢性感染的过程中逐渐失去功能，这导致T细胞耗尽。耗尽的T细胞表达高水平的多重共抑制受体，例如CTLA-4、PD-1、以及LAG3(克劳福德(Crawford)等人，Curr Opin Immunol.(《免疫学当前观点》)2009；21：179-186；考夫曼(Kaufmann)等人，J Immunol(《免疫学杂志》)2009；182：5891-5897，夏普(Sharp)等人，Nat Immunol(《自然免疫学》)2007；8：239-245)。从遭受慢性病毒感染(包括HIV、HCV以及HBV)的患者中临床上观察到由于耗尽的T细胞的PD-1过表达(克劳福德(Crawford)等人，Curr Opin Immunol.(《免疫学当前观点》)2009；21：179-186；考夫曼(Kaufmann)等人，J Immunol(《免疫学杂志》)2009；182：5891-5897，夏普(Sharp)等人，NatImmunol(《自然免疫学》)2007；8：239-245)。已经存在对这条通路中的额外病原体(包括其他病毒、细菌、以及寄生虫)的一些调查研究(霍夫米易(Hofmeyer)等人，J BiomedBiotechnol.(《生物医学生物工程杂志》)Vol 2011，Art.ID 451694，巴德拉(Bhadra)等人，Proc Natl Acad Sci.(《美国科学院院刊》)2011；108(22)：9196-201)。例如，使用一种通过标准盲肠结扎术和穿孔方法诱导的败血症模型，已经示出控制细菌感染中涉及到了PD-1通路。在这个模型中，在敲除的小鼠中PD-1的不存在保护其免受败血症诱导的死亡(黄(Huang)等人，PNAS 2009：106；6303-6308)。
T细胞耗尽可以通过阻断共抑制通路(例如PD-1或CTLA-4)来逆转(里瓦斯(Rivas)等人，J Immunol.(《免疫学杂志》)2009；183：4284-91；金-梅森(Golden-Mason)等人，JVirol.(《病毒学杂志》)2009；83：9122-30；霍夫米易(Hofmeyer)等人，J BiomedBiotechnol.(《生物医学生物工程杂志》)Vol 2011，Art.ID 451694)，因此允许抗病毒性免疫功能的恢复。用于治疗病毒性感染的共抑制阻断的治疗潜力已经通过阻断PD-l/PD-L1通路而进行了广泛地研究，这在若干感染的动物模型中示出是有效的，包括恒河猴中的急性和慢性猴免疫缺陷病毒(SIV)感染(沃卢(Valu)等人，Nature(《自然》)2009；458：206-210)，和小鼠模型中的慢性病毒性感染，例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)(巴伯(Barber)等人，Nature.(《自然》)2006；439：682-7)，以及在SJL/J小鼠中的泰勒鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)模型(邓肯(Duncan)和米勒(Miller)PLoS One.2011；6：el 8548)。在这些模型中，PD-l/PD-L1阻断改善了抗病毒性反应并且促进了持久性病毒的清除。此外，PD-l/PD-L1阻断增加了体液免疫，如在血浆中的特异性抗病毒抗体的提高的产量所证明的，这与改善的细胞反应联合导致血浆病毒载量的减少和增加的存活。
阻断负向信号通路(例如PD-1和CTLA-4)可以恢复宿主免疫系统，使它能够对另外的刺激进行反应。将治疗性疫苗接种连同抑制性信号的阻断进行合并可以协同地增强慢性感染个体的功能性CD8 T-细胞应答，并且改善病毒控制，来为慢性病毒(例如人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒)感染的治疗提供一个有前途的策略(哈(Ha)等人，Immunol Rev.(《免疫学评论》)2008年6月；223：317-33)。一项最近的研究的结果表明PD-1通路的阻断改善了患有HCV感染的受试者对HBV疫苗接种的T细胞应答，并且提高了阻断这条通路可能改善在慢性病毒性感染的环境下的免疫法的成功率的可能性(穆尔曼(Moorman)等人，Vaccine(《疫苗》)，2011年4月12日；29(17)：3169-76)。作为与预防性和治疗性疫苗两者联合的有希望的候选物，PD-1和CTLA-4抗体目前在慢性丙型肝炎中处于临床试验中(代波尔德(Diepolder)和奥布斯特(Obst)，Expert Rev Vaccines(《疫苗专家评论》).2010三月；9(3)：243-7)。PD-1阻断还增强了预防接种的有效性，导致表位特异性T细胞的增加(范尼弗劳克(Finnefrock)等人，《免疫学杂志》(J Immunol)2009；182；980-987)
除了用于治疗慢性感染的共抑制通路的阻断之外，目前使用病毒感染模型的研究已经强调了正向共刺激信号在针对病毒的记忆应答过程中的重要性。共刺激分子(例如CD28、4-1BB、以及OX40)也已经被牵涉到病毒特异性记忆CD8+T细胞的存活、产生、维持、以及品质之中。共刺激信号的递送可以帮助增加病毒特异性记忆CD8+T细胞的产生和功能。在疫苗中使用作为佐剂的共刺激分子连同病毒抗原可以协助有效的抗原特异性记忆CD8+T-细胞应答的产生，并且可以因此导致改善的疫苗(达塔古普塔(Duttagupta)等人，Grit RevImmunol.(《免疫学关键性评论》)2009；29(6)：469-86)。
一项最近的研究还评估了作为PD-1和PD-L1的阻断的可溶性PD-1(sPD-1)在小鼠中对疫苗引起的(vaccine-elicited)抗原特异性T-细胞应答的作用。将sPD-1与一种DNA疫苗或与一种基于腺病毒的疫苗的共给予增加了抗原特异性CD8(+)T-细胞应答，表明了sPD-1的疫苗类型独立性佐剂作用(vaccine type-independent adjuvant effect)(宋(Song)等人，J Immunother.《免疫疗法杂志》2011年4月；34(3)：297-306)。这项研究的这些以及额外的结果提示，使用负向共刺激蛋白的可溶性细胞外结构域(ECD)作为佐剂的免疫策略，可以用来增加由疫苗接种引起的抗原特异性T-细胞免疫。
还一直认为B细胞在通过病原性自体抗体的产生的许多自体免疫性疾病(例如系统性红斑狼疮(SLE)和修格兰氏疾病)的发展和维持中具有关键作用。然而，清楚的是多个其他B细胞功能在器官特异性自体免疫性疾病的发病机制中也是关键性的，以前认为这些器官特异性自体免疫性疾病主要是T细胞介导的，例如类风湿性关节炎(RA)和1型糖尿病(T1D)(王(Wong)等人2010，Curr Opin Immunol.(《免疫学当前观点》)22：723-731)。T细胞辅助B细胞是获得性免疫应答的一个关键过程。滤泡辅助性T(Tfh)细胞是在B细胞辅助中特化的CD4+T细胞的一个亚群(由克罗蒂(Crotty)综述，Annu.Rev.Immunol.(《免疫学年报》)29：621-663，2011)。Tfh细胞表达B细胞归巢趋化因子受体CXCR5，CXCR5驱使Tfh细胞以一种CXCL 13-依赖性方式迁移至淋巴结中的B细胞卵泡中。Tfh细胞首先在T细胞-B细胞边界处与同源B细胞相互作用，并且随后在卵泡内诱导生发中心B细胞分化以及生发中心形成(由克罗蒂(Crotty)综述，Annu.Rev.Immunol.(《免疫学年报》)29：621-663，2011)。B细胞辅助和T细胞依赖性抗体反应对Tfh细胞的需求表明这种细胞类型对于针对不同类型的传染剂的保护性免疫连同对于合理的疫苗设计是十分重要的。毫不出人意料地，Tfh细胞的调节异常和异常累积也已经被与自体免疫性疾病(例如修格兰氏疾病和自体免疫性关节炎)联系起来(宇(Yu)和比努埃萨(Vinuesa)，2010，Cell.Mol.Immunol，(《细胞分子免疫学》)7：198-203)。
Tfh细胞选择性表达丰富的表面蛋白，这些表面蛋白涉及在其选择性定位(例如CXCR5)以及与B细胞的直接物理性相互作用来提供B细胞辅助。在后面的组中的是Tfh细胞中高度表达的共刺激蛋白家族的若干成员，包括可诱导性共刺激受体ICOS、以及负向共刺激分子(抑制性受体)PD-1和BTLA(克罗蒂(Crotty)，Annu.Rev.Immunol.(《免疫学年报》)29：621-663，2011)，因此这种细胞亚群还可以由共刺激通路和共抑制通路的调节来控制，这有助于对B细胞功能的作用。
使用不同共刺激蛋白的激动剂和/或拮抗剂来调节共刺激也已经作为治疗自体免疫性疾病、移植排斥、过敏症以及癌症的策略而被广泛地研究。这个领域已经由被批准用于RA的治疗的CTLA4-Ig(阿巴西普，)、用于预防急性肾脏移植排斥的突变的CTLA4-Ig(贝拉西普，)以及最近被批准用于黑色素瘤的治疗的抗-CTLA4抗体(易普利姆玛，)临床上首创。其他共刺激调节剂当前处于临床研发的晚期，包括抗-PD-1抗体((MDX-1106)，抗-PD-1抗体处于用于晚期/转移性透明细胞肾细胞癌(RCC)的治疗的研发；以及用于治疗肾脏同种异体移植物移植的抗-CD40L抗体(BG9588，)。此外，此类试剂也处于病毒感染的临床研发中，例如正在测试用于治疗丙型肝炎的抗PD-1 Ab、MDX-1106，以及在患有肝细胞癌、被丙型肝炎病毒感染的患者中处于临床试验中的抗-CTLA-4Ab CP-675，206(曲美木单抗(tremelimumab))；该研究的目的是测试其对癌和对病毒的复制的作用。
发明简要概述
根据至少一些实施例，本发明提供了包含以下的新颖的治疗组合物和诊断组合物：LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的胞外结构域或其可溶性形式或分泌形式、和/或变体和/或直向同源物和/或片段，和/或包含它们的偶联物，和/或对它们进行编码的核酸序列。
已知(野生型)LY6G6F蛋白(淋巴细胞抗原6复合基因座蛋白G6f，Genbank登录号：NP_001003693，SEQ ID NO：1)的全长氨基酸序列示出于图1A中。已知(野生型)VSIG10蛋白(包含V-set和免疫球蛋白功能区的蛋白10，Genbank登录号：NP_061959，SEQ ID NO：3)的全长氨基酸序列以及VSIG10新颖变体(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列分别展示出于图1B和1C中。VSIG10新颖变体(SEQ ID NO：5)和已知(野生型)VSIG10蛋白(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列比对示出于图2A中。已知(野生型)TMEM25蛋白(跨膜蛋白25，Swiss-Prot登录号：Q86YD3，SEQ ID NO：7)的全长氨基酸序列示出于图1D中。已知(野生型)LSR蛋白(刺激脂解的脂蛋白受体同种型2，Genbank登录号：NP_991403)的全长氨基酸序列被提供于SEQ ID NO：62中。LSR变体SEQ ID NO：11、13、15、16、17以及18的氨基酸序列分别示出于图1E、1F、1G、1H、1I、以及1J中。LSR变体SEQ ID NO：11、13、15、16、17以及18与预先已知的LSR序列(SEQ ID NO：62-67)的氨基酸序列比对分别展示于图2B、2C、2D、2E、2F、2G中。
根据至少一些实施例，提供了一种分离的多肽，这一分离的多肽包括一个选自下组的序列的可溶性胞外结构域的至少98个氨基酸，该组由SEQ ID NO：11、13、15-18、67、以及143组成；一个选自下组的序列的可溶性胞外结构域的至少62个氨基酸，该组由SEQ IDNO：1和58组成；一个选自下组的序列的可溶性胞外结构域的至少36个氨基酸，该组由SEQID NO：3和5组成；或SEQ ID NO：7的可溶性胞外结构域的至少46个氨基酸，或一种基本上由如在SEQ ID NO：5中所阐明的氨基酸序列或与其拥有至少95％序列一致性的变体组成的分离的多肽；或其变体、或直向同源物、或片段。
可任选地，这种分离的多肽只包括选自下组的序列的98至180个之间的氨基酸，该组由SEQ ID NO：11、13、15-18、67、以及143组成；选自下组的序列的62至228个之间的氨基酸，该组由SEQ ID NO：1和58组成；选自下组的序列的36与393个之间的氨基酸，该组由SEQID NO：3和5组成；或SEQ ID NO：7的46与216个之间的氨基酸。
还可任选地，这种分离的多肽选自下组，该组由只包括以下的多肽组成：选自下组的序列的98至118、135至155、以及160至180个之间的氨基酸，该组由SEQ ID NO：11、13、15-18、67、以及143组成；选自下组的序列的62至82、95至115、208至228个之间的氨基酸，该组由SEQ ID NO：1和58组成；选自下组的序列的36至70、80至100、170至200、265至290、365至393个之间的氨基酸，该组由SEQ ID NO：3和5组成；或SEQ ID NO：7的46至66、84至104、196至216个之间的氨基酸。
还可任选地，这种分离的多肽只包括：选自下组的序列的约72、106、或218个氨基酸，该组由SEQ ID NO：1和58组成；选自下组的序列的约108、145、或170个氨基酸，该组由SEQ ID NO：11、13、15-18、67、以及143组成；SEQ ID NO：7的约56、94、或206个氨基酸；或SEQID NO：3和5的约46、49、58、60、87、89、93、94、178、182、185、187、273、279、282、374或383个氨基酸。
还可任选地，这种分离的多肽基本上由与在任一SEQ ID NO：12、2、4-6、8、14、47-50、10、15-18、22、39、59-61；81-102中所列举的氨基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列组成。可任选地并且优选地，这种分离的多肽基本上由在任一SEQ ID NO：12、2、4-6、8、14、47-50、10、15-18、22、39、59-61；81-102中所列举的氨基酸序列组成。
可任选地，这种分离的多肽阻断或抑制LSR、TMEM25、VSIG10、LY6G6F、或其片段或变体与一种相对应的功能性对应物的相互作用。可任选地，这种分离的多肽替代或增加LSR、TMEM25、VSIG10、LY6G6F、或其片段或变体与一种相对应的功能性对应物的相互作用。
可任选地，这种分离的直向同源物是一种选自SEQ ID NO：9以及19-21的小鼠多肽。
根据至少一些实施例，本发明提供了包括VSIG10蛋白的不连续部分(片段)的分离多肽，对应于：
A.一种分离的嵌合体多肽，包括一个与以下至少95％同源的第一氨基酸序列MAAGGSAPEPRVLVCLGALLAGWVAVGLEAVVIGEVHENVTLHCGNISGLRGQVTWYRNNSEPVFLLSSNSSLRPAEPRFSLVDATSLHIESLSLGDEGIYTCQEILNVT QWFQVWLQVA对应于已知VSIG10蛋白(SEQ ID NO：3)的氨基酸1-120，它还对应于VSIG10变体(SEQ ID NO：5)的氨基酸1-120；一个包括N的第二桥联氨基酸序列；以及一个与以下至少95％同源的第三氨基酸序列PPPSAPQCWAQMASGSFMLQLTCRWDGGYPDPDFLWIEEPGGVIVGKSKLGVEMLSESQLSDGKKFKCVTSHIVGPESGASCMVQIRGPSLLSEPMKTCFTGGNVTLTCQVSGAYPPAKILWLRNLTQPEVIIQPSSRHLITQDGQNSTLTIHNCSQDLDEGYYICRADSPVGVREMEIWLSVKEPLNIGGIVGTIVSLLLLGLAIISGLLLHYSPVFCWKVGNTSRGQNMDDVMVLVDSEEEEEEEEEEEEDAAVGEQEGAREREELPKEIPKQDHIHRVTALVNGNIEQMGNGFQDLQDDSSEEQSDIVQEEDRPV对应于已知VSIG10蛋白(SEQ ID NO：3)的氨基酸223-540，它还对应于VSIG10变体(SEQ ID NO：5)的氨基酸122-439；其中所述第一氨基酸序列、第二桥联氨基酸序列以及第三氨基酸序列是连续的并且以一种顺序的次序。
B.VSIG10变体(SEQ ID NO：5)的边缘部分的分离多肽，包括一种具有长度为“n”的多肽，其中n至少10个氨基酸长，可任选是至少约20个氨基酸长，优选是至少约30个氨基酸长，更优选是至少约40个氨基酸长并且最优选是至少约50个氨基酸长，其中至少3个氨基酸包括具有如下结构的ANP(根据VSIG10变体(SEQ ID NO：5)编号)：一种起始于任一氨基酸号120-x至120并且终止于任一氨基酸号122+((n-3)-x)的序列，其中x从0至n-3变化。
根据至少一些实施例，本主题发明进一步提供了一种对应于以下的氨基酸残基的序列的分离多肽：VSIG10蛋白的不连续部分，VSIG10变体(SEQ ID NO：5)的新接合处和边缘部分。VSIG10变体(SEQ ID NO：5)的新接合处的独特序列展示于图2A中的蛋白序列比对中。
根据至少一些实施例，本主题发明提供了包括LSR蛋白的不连续部分(片段)的分离多肽，对应于：
A.一种分离的嵌合体多肽，包括一个与以下至少95％同源的第一氨基酸序列MALLAGGLSRGLGSHPAAAGRDAVVFVWLLLSTWCTAPARAIQVTVSNPYHVVILFQPVTLPCTYQMTSTPTQPIVIWKYKSFCRDRIADAFSPASVDNQLNAQLAAGNPGYNPYVECQDSVRTVRVVATKQGNAVTLGDYYQGRRITITGNADLTFDQTAWGDSGVYYCSVVSAQDLQGNNEAYAELIVLGRTSGVAELLPGFQAGPIE对应于已知LSR蛋白(SEQID NO：62)的氨基酸49-258，它还对应于LSR变体同种型f(SEQ ID NO：18)的氨基酸1-210；一个包括V的第二桥联氨基酸序列；以及一个与以下至少95％同源的第三氨基酸序列YAAGKAATSGVPSIYAPSTYAHLSPAKTPPPPAMIPMGPAYNGYPGGYPGDVDRSSSAGGQGSYVPLLRDTDSSVASEVRSGYRIQASQQDDSMRVLYYMEKELANFDPSRPGPPSGRVERAMSEVTSLHEDDWRSRPSRGPALTPIRDEEWGGHSPRSPRGWDQEPAREQAGGGWRARRPRARSVDALDDLTPPSTAESGSRSPTSNGGRSRAYMPPRSRSRDDLYDQDDSRDFPRSRDPHYDDFRSRERPPADPRSHHHRTRDPRDNGSRSGDLPYDGRLLEEAVRKKGSEERRRPHKEEEEEAYYPPAPPPYSETDSQASRERRLKKNLALSRESLVV对应于已知LSR蛋白(SEQ ID NO：62)的氨基酸309-649，它还对应于LSR变体同种型f(SEQ ID NO：18)的氨基酸212-552；其中所述第一氨基酸序列、第二桥联氨基酸序列以及第三氨基酸序列是连续的并且以一种顺序的次序。
B.LSR变体同种型f(SEQ ID NO：18)的边缘部分的分离多肽，包括一种具有长度为“n”的多肽，其中n至少10个氨基酸长，可任选是至少约20个氨基酸长，优选是至少约30个氨基酸长，更优选是至少约40个氨基酸长并且最优选是至少约50个氨基酸长，其中至少3个氨基酸包括具有如下结构的EVY(根据SEQ ID NO：18编号)：一种起始于任一氨基酸号210-x至210并且终止于任一氨基酸号212+((n-3)-x)的序列，其中x从0至n-3变化。
C.一种分离的嵌合体多肽，包括一个与以下至少95％同源的第一氨基酸序列MALLAGGLSRGLGSHPAAAGRDAVVFVWLLLSTWCTAPARAIQVTVSNPYHVVILFQPVTLPCTYQMTSTPTQPIVIWKYKSFCRDRIADAFSPASVDNQLNAQLAAGNPGYNPYVECQDSVRTVRVVATKQGNAVTLGDYYQGRRITITGNADLTFDQTAWGDSGVYYCSVVSAQDLQGNNEAYAELIVL对应于已知LSR蛋白(SEQ ID NO：66)的氨基酸49-239，它还对应于LSR变体同种型f(SEQ ID NO：18)的氨基酸1-191；一个与具有序列GRTSGVAELLPGFQAGPIE的多肽至少80％、优选是至少85％、更优选是至少90％并且最优选是至少95％同源的第二氨基酸序列，对应于LSR变体同种型f(SEQ ID NO：18)的氨基酸192-218；以及一个与以下至少95％同源的第三氨基酸序列VYAAGKAATSGVPSIYAPSTYAHISPAKTPPPPAMIPMGPAYNGYPGGYPGDVDRSSSAGGQGSYVPLLRDTDSSVASEVRSGYRIQASQQDDSMRVLYYMEKELANFDPSRPGPPSGRVERAMSEVTSLHEDDWRSRPSRGPALTPIRDEEWGGHSPRSPRGWDQEPAREQAGGGWRARRPRARSVDALDDLTPPSTAESGSRSPTSNGGRSRAYMPPRSRSRDDLYDQDDSRDFPRSRDPHYDDFRSRERPPADPRSHHHRTRDPRDNGSRSGDLPYDGRLLEEAVRKKGSEERRRPHKEEEEEAYYPPAPPPYSETDSQASRERRLKKNLALSRESLVV对应于已知LSR蛋白SEQ ID NO：66的氨基酸240-581，它还对应于LSR变体同种型f(SEQID NO：18)的氨基酸211-552；其中所述第一氨基酸序列、第二氨基酸序列以及第三氨基酸序列是连续的并且以一种顺序的次序。
D.一种LSR变体同种型f(SEQ ID NO：18)的边缘部分的分离多肽，包括一个与LSR变体同种型f(SEQ ID NO：18)的序列GRTSGVAELLPGFQAGPIE至少约80％、优选是至少约85％、更优选是至少约90％并且最优选是至少约95％同源的氨基酸序列。
根据至少一些实施例，本主题发明进一步提供了一种对应于以下的氨基酸残基的序列的分离多肽：LSR的不连续部分，LSR变体LSR同种型f(SEQ ID NO：18)的新接合处和边缘部分。LSR同种型-f(SEQ ID NO：18)的新接合处的独特序列展示于图2G中的蛋白序列比对中。
根据至少一些实施例，本主题发明提供了包括一个对应于LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的不连续部分的氨基酸残基的序列的多肽，包括对应于以下的细胞外结构域的不同部分：LY6G6F(SEQ ID NO：1)的残基17-234，对应描述于SEQ ID NO：2中的氨基酸序列；VSIG10(SEQ ID NO：3)的残基31-413，对应描绘于SEQ ID NO：4中的氨基酸序列；VSIG10(SEQ ID NO：5)的残基31-312，对应描绘于SEQ ID NO：6中的氨基酸序列；TMEM25(SEQ IDNO：7)的残基27-232，对应描绘于SEQ ID NO：8中的氨基酸序列；LSR(SEQ ID NO：11，和/或SEQ ID NO：143)的残基42-211，对应描绘于SEQ ID NO：12中的氨基酸序列；LSR(SEQ IDNO：13)的残基42-192，对应描绘于SEQ ID NO：14中的氨基酸序列；LSR(SEQ ID NO：15)的残基42-533，对应描绘于SEQ ID NO：47中的氨基酸序列；LSR(SEQ ID NO：16)的残基42-532，对应描绘于SEQ ID NO：48中的氨基酸序列；LSR(SEQ ID NO：17)的残基42-493，对应描绘于SEQ ID NO：49中的氨基酸序列；LSR(SEQ ID NO：18)的残基42-552，对应描绘于SEQ ID NO：50中的氨基酸序列；和/或与其拥有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的其片段和/或变体。根据仍另外的实施例，如在所描述，LY6G6F ECD片段选自任一SEQID NO：81、96及其变体。根据仍另外的实施例，如在此描述，VSIG10 ECD片段选自任一SEQID NO：82-93、97-100及其变体。根据仍另外的实施例，如在此描述，LSR ECD片段选自任一SEQ ID NO：95、102及其变体。根据仍另外的实施例，如在此描述，TMEM25 ECD片段选自任一SEQ ID NO：94、101及其变体。根据仍另外的实施例，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的不连续部分可以包括或可以不包括一个信号(前导序列)肽(SP)序列(图1)。根据本发明的至少一些实施例，提供了包括LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的SP序列的ECD部分的实例。包括LY6G6F蛋白(SEQ ID NO：1)的SP序列的ECD部分的一个实例是在SEQ ID NO：59中所阐明的氨基酸序列。包括VSIG10蛋白(SEQ ID NO：3)的SP序列的ECD部分的一个实例是在SEQ ID NO：60中所阐明的氨基酸序列。包括VSIG10蛋白(SEQ ID NO：5)的SP序列的ECD部分的一个实例是在SEQ ID NO：61中所阐明的氨基酸序列。包括TMEM25蛋白(SEQ ID NO：7)的SP序列的ECD部分的一个实例是在SEQ ID NO：39中所阐明的氨基酸序列。包括LSR蛋白(SEQ ID NO：11)的SP序列的ECD部分的一个实例是在SEQ ID NO：10中所阐明的氨基酸序列。包括LSR蛋白(SEQ ID NO：14)的SP序列的ECD部分的一个实例是在SEQ ID NO：22中所阐明的氨基酸序列。
根据另外的实施例，本发明提供了包括一个对应于SEQ ID NO：18中描绘的可溶性LSR蛋白的氨基酸残基的序列的多肽，包括与其拥有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的其不同部分或其变体。根据另外的实施例，本发明提供了包括一个对应于任一SEQ ID NO：15-16中描绘的可溶性LSR蛋白的氨基酸残基的序列的多肽，包括与其拥有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的其不同部分或其变体。根据另外的实施例，本发明提供了包括一个对应于任一SEQ ID NO：15-18中描绘的可溶性LSR蛋白的氨基酸残基的序列的多肽。根据仍另外的实施例，在任一SEQ ID NO：15-18中描绘的可溶性LSR蛋白可以包括或可以不包括信号(前导序列)肽序列(图1G、G、I以及J)。
根据仍另外的实施例，本发明提供了包括一个对应于TMEM25、LY6G6F、VSIG10、LSR变体1和/或LSR变体2蛋白的氨基酸残基的序列的多肽，特别是小鼠直向同源物(分别是SEQID NO：28、29、30、31和/或32)，包括但不局限于：对应SEQ ID NO：9、19-21中描绘的氨基酸序列的小鼠直向同源物细胞外结构域，或与其拥有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的其部分或变体。
根据仍另外的实施例，本发明提供了包括一个对应于任一VSIG10(SEQ ID NO：5)和LSR(SEQ ID NO：11、13、15、16以及18)的新颖变体的氨基酸序列的多肽。
根据至少一些实施例，本发明提供了一种融合蛋白，该融合蛋白包括连接至一种异源序列的任一上述多肽。可任选地，这种异源序列包括免疫球蛋白分子的至少一个部分。可任选地并且优选地，这种免疫球蛋白分子部分是一个免疫球蛋白重链恒定区Fc片段。可任选地并且更优选地，这种免疫球蛋白重链恒定区来源于一种选自下组的免疫球蛋白同种型，该组由以下各项组成：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA以及IgD。可任选地并且最优选地，这种融合蛋白具有在任一SEQ ID NO：71-80、172-181中所阐明的或在任一SEQ IDNO：23-26中所阐明的氨基酸序列，并且还可任选地在体外或在体内调节免疫细胞反应。
根据至少一些实施例，本主题发明提供了分离的核酸序列，这些分离的核酸序列对以下进行编码：TMEM25、VSIG10、和/或LSR的任一前述新颖变体，和/或任一前述LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR细胞外结构域多肽或其片段或同系物或直向同源物。
根据至少一些实施例，提供了一种选自下组的分离的核酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：33-37、40-46、132、155、182-198，或与其拥有至少95％序列一致性的其变体，或其退化变体。
根据至少一些实施例，本主题发明提供了一种对以下进行编码的分离的多核苷酸：一种包括任一在SEQ ID NO：2、4、5、6、8-16、18-22、39、47-50、59-61、143中所阐明的氨基酸序列的多肽，与其拥有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的其片段或变体，或其退化变体。
根据至少一些实施例，本主题发明提供了一种分离的多核苷酸，这一分离的多核苷酸包括如在任一SEQ ID NO：33-37、40-46、132、145、155、182-188中所阐明的核酸、或其序列同源物或其退化变体。根据另一个实施例，这一分离的多核苷酸与如在任一SEQ IDNO：33-37、40-46、145中所阐明的核酸序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
根据至少一些实施例，提供了一种表达载体或病毒，该表达载体或病毒包含至少一种如在此所描述的分离的核酸序列。根据至少一些实施例，提供了一种重组细胞，该重组细胞包括一种表达载体或病毒，该表达载体或病毒包含一种如在此所描述的分离的核酸序列，其中该细胞组成性地表达或可诱导地表达由该DNA区段编码的多肽。根据至少一些实施例，提供了一种生产LSR、TMEM25、VSIG10、LY6G6F可溶性胞外结构域多肽、或其片段或融合蛋白的方法，该方法包括将如在此所描述的重组细胞在由此该细胞表达由该DNA区段或核酸编码的多肽的条件下培养，并且回收所述多肽。
根据本发明的至少一些实施例，提供了一种药物组合物，该药物组合物包括一种任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25、LSR蛋白、或变体或直向同源物或片段或包含它们的偶联物的胞外结构域的分离的氨基酸序列或其可溶性形式或分泌形式。
根据至少一些实施例，本发明提供了LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的可溶性和/或细胞外结构域的一种分离的或纯化的氨基酸序列或对其进行编码的核酸序列，这一分离的或纯化的氨基酸序列或对其进行编码的核酸序列可以可任选地被直接地或间接地附接至非LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白或核酸序列，例如可溶性免疫球蛋白功能区或片段。
根据至少一些实施例，本发明提供了载体(例如质粒和重组病毒载体)以及包含载体的宿主细胞，它们表达LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的分泌形式或可溶性形式和/或其ECD、或其片段或变体或其直向同源物或包含任一前述项的多肽偶联物。
根据至少一些实施例，本发明提供了这些载体(例如质粒和重组病毒载体)以及包含载体的宿主细胞的用途，它们表达任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR、分泌形式和/或可溶性形式和/或ECD和/或其片段和/或变体、和/或其直向同源物和/或包含任一前述项的多肽偶联物来生产所述LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白。
根据至少一些实施例，本发明提供了包含任何前述项的药物组合物或诊断组合物。
根据至少一些实施例，本发明提供了任一以下化合物或药物组合物作为用于治疗或预防如在此所列举的癌症、如在此所列举的感染性失调、和/或免疫相关失调(包括但不局限于如在此所列举的自体免疫性疾病、移植排斥和移植物抗宿主疾病)，和/或用于阻断或促进由任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽介导的免疫共刺激、如在此所列举的免疫相关疾病和/或用于免疫治疗(促进或抑制免疫共刺激)的疗法的用途；这些化合物包含LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR胞外结构域、其可溶性形式或分泌形式或片段或直向同源物或变体、或偶联物、或对其进行编码的核酸序列中至少之一，这些药物组合物包括这些化合物。根据至少一些实施例，该自体免疫性疾病包括任何自体免疫性疾病，并且可任选地并优选地包括但不局限于任一以下的任一类型和亚型：多发性硬化症、类风湿性关节炎、I型糖尿病、银屑病、系统性红斑狼疮、炎性肠病、葡萄膜炎、或修格兰氏综合征。
根据至少一些实施例，本发明提供了任一以下化合物或药物组合物用于作为抗癌疫苗、作为抗癌疫苗的佐剂、和/或用于过继性免疫治疗、和/或用于如在此所列举的癌症免疫治疗来给予的用途；这些化合物包含LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR胞外结构域、其可溶性形式或分泌形式或片段或直向同源物或变体、或偶联物、或对其进行编码的核酸序列中至少之一，这些药物组合物包括这些化合物。
根据至少一些实施例，本发明提供了任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白、和/或核酸序列作为用于药物研发的靶标的用途，这些靶标特异性结合至任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白和/或药物，这些蛋白和/或药物激动或拮抗其他部分与LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的结合。
根据至少一些实施例，本发明提供了以下药物，这些药物调节(激动或拮抗)LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR相关生物活性中至少之一。通过举例，此类药物包括抗体、小分子、肽、核酶、适体、反义分子、siRNA等。这些分子可以直接结合或调节由任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白或LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR DNA或其部分或变体引起的活性，或可以间接调节任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR相关活性，或将分子结合至任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR及其部分和变体，例如通过调节任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR至其反受体(counter receptor)或内源配体。
根据至少一些实施例，本发明提供了新颖的单克隆抗体或多克隆抗体和抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代支架，它们特异性结合任一如在此所描述的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白或与其具有至少95％同源性的多肽。可任选地，此类抗体结合至选自下组的蛋白，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：1-8、10-18、22、39、47-50、59-61、9、19-21，或对应于任一SEQ ID NO：5和18的独特边缘的氨基酸序列；特别地，其中对这些抗体、抗原结合片段和包含它们的偶联物、和/或替代支架进行适配来用作治疗剂和/或诊断剂(在体外和体内诊断方法两者中)，特别是用于如在此所列举的感染性失调、和/或免疫相关失调(包括但不局限于如在此所列举的自体免疫性疾病、如在此所列举的免疫相关疾病、移植排斥以及移植物抗宿主疾病)、；连同如在此所列举的癌症和恶性肿瘤的治疗和/或诊断。
根据至少一些实施例，提供了抗体，其中该抗原结合位点包括一个构象的或线性的表位，并且其中该抗原结合位点包含约3-7个连续的或非连续的氨基酸。可任选地，该抗体是一种完全人类抗体、嵌合抗体、人化或灵长化抗体。
还可任选地，该抗体选自下组，该组由以下各项组成：Fab、Fab′、F(ab′)2、F(ab′)、F(ab)、Fv或scFv片段和最小识别单位。
还可任选地，，该抗体被偶联至一个选自以下的部分：一种药物、放射性核素、荧光团、酶、毒素、治疗剂、或化学治疗剂；并且其中该可检测的标记是一种放射性同位素、金属螫合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物。
还可任选地，该抗体阻断或抑制任一LSR、TMEM25、VSIG10、LY6G6F多肽、或其片段或变体与一种对应物的相互作用。
还可任选地，该抗体替代或增加LSR、TMEM25、VSIG10、LY6G6F多肽、或其片段或变体与一种对应物的相互作用。
还可任选地，该抗体引起癌细胞的凋亡或溶解，这些癌细胞表达任一LSR、TMEM25、VSIG10、LY6G6F蛋白。
还可任选地，凋亡或溶解涉及该抗体的CDC或ADCC活性，其中CDC(补体依赖性细胞毒性)或ADCC(抗体依赖性细胞毒性)活性被用来靶向这些免疫细胞。
根据至少一些实施例，本发明提供了针对LY6G6F蛋白的不连续部分的抗体和抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代支架，LY6G6F蛋白的不连续部分包括对应于以下的细胞外结构域的不同部分：LY6G6F(SEQ ID NO：1)的残基17-234，阐明于SEQ ID NO：2中，和/或对应任一SEQ ID NO：81和96中阐明的氨基酸序列。根据另外的实施例，本发明提供了针对小鼠LY6G6F蛋白(SEQ ID NO：29)的不连续部分的抗体、抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代支架，小鼠LY6G6F蛋白的不连续部分包括对应于SEQ ID NO：20的细胞外结构域的不同部分。
根据至少一些实施例，本发明提供了针对VSIG10蛋白的不连续部分的抗体和抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代支架，VSIG10蛋白的不连续部分包括对应于以下细胞外结构域的不同部分：VSIG10(SEQ ID NO：3)的氨基酸残基31-413，描绘于SEQ IDNO：4中；VSIG10(SEQ ID NO：5)的氨基酸残基31-312，描绘于SEQ ID NO：6中，和/或对应任一SEQ ID NO：82-93、97-100中所阐明的氨基酸序列。根据另外的实施例，本发明提供了针对小鼠VSIG10蛋白(SEQ ID NO：30)的不连续部分的抗体、抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代支架，小鼠VSIG10蛋白的不连续部分包括对应于SEQ ID NO：19的细胞外结构域的不同部分。根据至少一些实施例，如在此所描述的，本发明提供了针对VSIG10蛋白的不连续部分的抗体、抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代支架，VSIG10蛋白的不连续部分包括VSIG10变体(SEQ ID NO：5)的边缘部分。
根据至少一些实施例，本发明提供了针对TMEM25蛋白的不连续部分的抗体、抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代支架，TMEM25蛋白的不连续部分包括对应于以下的细胞外结构域的不同部分：TMEM25(SEQ ID NO：7)的氨基酸残基27-232，描绘于SEQ IDNO：8中，和/或对应任一SEQ ID NO：94、101中阐明的氨基酸序列。根据另外的实施例，本发明提供了针对小鼠TMEM25蛋白(SEQ ID NO：28)的不连续部分的抗体和抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代支架，小鼠TMEM25蛋白的不连续部分包括SEQ ID NO：9中所阐明的细胞外结构域的不同部分。
根据至少一些实施例，本发明提供了针对LSR蛋白的不连续部分的抗体和抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代支架，LSR蛋白的不连续部分包括对应于以下的细胞外结构域的不同部分：LSR(SEQ ID NO：11)的氨基酸残基42-211，描绘于SEQ ID NO：12中；LSR(SEQ ID NO：13)的氨基酸残基42-192，描绘于SEQ ID NO：14中，LSR(SEQ ID NO：15)的氨基酸残基42-533，描绘于SEQ ID NO：47中，LSR(SEQ ID NO：16)的氨基酸残基42-532，描绘于SEQ ID NO：48中，LSR(SEQ ID NO：17)的氨基酸残基42-493，描绘于SEQ ID NO：49中，LSR(SEQ ID NO：18)的氨基酸残基42-552，描绘于SEQ ID NO：50，和/或对应任一SEQ IDNO：95、102中所阐明的氨基酸序列。根据另外的实施例，本发明提供了针对小鼠LY6G6F蛋白(SEQ ID NO：31-32)的不连续部分的抗体和抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代支架，小鼠LY6G6F蛋白的不连续部分包括对应于SEQ ID NO：21的细胞外结构域的不同部分。
根据至少一些实施例，如在此所描述的，本发明提供了针对LSR蛋白的不连续部分的抗体和抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代支架，LSR蛋白的不连续部分包括LSR变体同种型-f(SEQ ID NO：18)的独特边缘部分。
根据至少一些实施例，本发明提供了针对可溶性LSR蛋白的不连续部分的抗体和抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代支架，可溶性LSR蛋白的不连续部分包括SEQ ID NO：15-18、47-50中所描绘的LSR蛋白的不同部分。
根据至少一些实施例，本发明涉及具有类似于特异性抗体的范围的特异性和亲和性的蛋白支架。根据至少一些实施例，本发明涉及一种抗原结合构建体，这种抗原结合构建体包括一个被连接至一个或多个表位结合结构域的蛋白支架。此类工程化蛋白支架通常是通过设计一个具有聚焦于环区或另外的可允许表面区域的诱变的随机文库并且通过经由噬菌体展示或相关技术针对给定的靶标选择变体来获得的。根据至少一些实施例，本发明涉及替代支架，包括，但不局限于：anticalin、DARPin、犰狳重复序列蛋白(Armadillorepeat proteins)、蛋白A、脂质运载蛋白、纤维连接蛋白结构域、锚蛋白共有序列重复结构域(ankyrin consensus repeat domain)、硫氧还蛋白、化学约束肽(chemicallyconstrained peptides)等。根据至少一些实施例，本发明涉及替代支架，这些替代支架被用作治疗以下的治疗剂：如在此所列举的癌症、如在此所列举的免疫相关疾病、如在此所列举的自体免疫性疾病和传染病，连同用于体内诊断学。
根据本发明的至少一些实施例，提供了一种药物组合物，该药物组合物包括一种如在此所描述的分离的多肽、或如在此所描述的融合蛋白；如在此所描述的核苷酸序列；如在此所描述的表达载体；如在此所描述的宿主细胞、或如在此所描述的抗体，并且进一步包括一种药学上可接受的稀释剂或运载体。
根据至少一些实施例，提供了任一以下的用途：任一种如在此所描述的分离的多肽、或如在此所描述的融合蛋白；如在此所描述的核苷酸序列；如在此所描述的表达载体；如在此所描述的宿主细胞、或如在此所描述的抗体或如在此所描述的药物组合物，其中将此类给予至受试者来抑制或减少T细胞活化。
根据至少一些实施例，提供了任一以下项用于治疗癌症的用途：任一种如在此所描述的分离的多肽、或如在此所描述的融合蛋白；如在此所描述的核苷酸序列；如在此所描述的表达载体；如在此所描述的宿主细胞、或如在此所描述的抗体或如在此所描述的药物组合物。
根据至少一些实施例，提供了以下项用于治疗感染性失调的用途：一种如在此所描述的分离的多肽、或如在此所描述的融合蛋白；如在此所描述的核苷酸序列；如在此所描述的表达载体；如在此所描述的宿主细胞、或如在此所描述的抗体或如在此所描述的药物组合物。
根据至少一些实施例，提供了一种在受试者上进行以下的一种或多种的方法：
a.上调细胞因子；
b.诱导T细胞的增殖；
c.促进抗原特异性T细胞免疫；
d.促进CD4+和/或CD8+T细胞活化；该方法包括向该受试者给予任何一种如在此所描述的分离的多肽、或如在此所描述的融合蛋白；如在此所描述的核苷酸序列；如在此所描述的表达载体；如在此所描述的宿主细胞、或如在此所描述的抗体或如在此所描述的药物组合物。
根据至少一些实施例，提供了一种用于治疗或预防免疫系统相关病症的方法，该方法包括向一个对其有需要的受试者给予一个有效量的任何一种如在此所描述的分离的多肽、或如在此所描述的融合蛋白；如在此所描述的核苷酸序列；如在此所描述的表达载体；如在此所描述的宿主细胞、或如在此所描述的抗体或药物组合物。
可任选地，该免疫系统相关病症包括一种免疫相关病症、如在此所列举的自体免疫性疾病、移植排斥和移植物抗宿主疾病和/或用于阻断或促进由任一LSR、TMEM25、VSIG10和/或LY6G6F多肽介导的免疫共刺激、如在此所列举的免疫相关疾病和/或用于免疫疗法(促进或抑制免疫共刺激)。
可任选地，将这种治疗与另一个用于治疗免疫相关病症的部分进行合并。
可任选地，该部分选自下组，该组由以下各项组成：免疫抑制剂(例如皮质类固醇、环孢霉素、环磷酰胺、泼尼松、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、西罗莫司、他克莫司)，生物剂(例如TNF-α阻断剂或拮抗剂、或靶向任何炎性细胞因子的任何其他生物剂)，非甾体抗炎药物/Cox-2抑制剂，羟基氯喹，柳氮磺胺吡啶(sulphasalazopryine)，氯金酸钠，依那西普，英利昔单抗，吗替麦考酚酯，巴利昔单抗，阿塞西普，利妥昔单抗，环磷酰胺，干扰素β-la，干扰素β-lb，醋酸格拉默，盐酸米托蒽醌，阿那白滞素和/或其他生物制剂和/或静脉注射免疫球蛋白(IVIG)，干扰素类(例如IFN-β-la(和)以及IFN-β-lb)；醋酸格拉默多肽；那他珠单抗米托蒽醌细胞毒素剂，钙调神经磷酸酶抑制剂(例如环孢霉素A或FK506)；一种免疫抑制大环内酯，例如西罗莫司或其衍生物；例如40-O-(2-羟基)乙基-西罗莫司，一种淋巴细胞归巢试剂，例如FTY720或其类似物，皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；来氟米特或其类似物；咪唑立宾；麦考酚酸；吗替麦考酚酯；15-deoxyspergualine或其类似物；免疫抑制单克隆抗体，例如，白细胞受体的单克隆抗体，例如，MHC、CD2、CD3、CD4、CD11a/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BB或其配体；或其免疫调节化合物，例如CTLA4-Ig(阿巴西普，)、CD28-Ig、B7-H4-Ig、或其他共刺激试剂，或粘附分子抑制剂，例如mAbs或低分子量抑制剂(包括LFA-1拮抗剂、选择素拮抗剂以及VLA-4拮抗剂)，或另一种免疫调节试剂。
可任选地，这种免疫病症选自自体免疫性疾病、移植排斥、或移植物抗宿主疾病。
可任选地，该自体免疫性疾病选自下组，该组由以下各项组成：多发性硬化症，包括复发型多发性硬化症，原发性进展型多发性硬化症，以及继发进展型多发性硬化症；牛皮癣；类风湿性关节炎；牛皮癣关节炎，系统性红斑狼疮(SLE)；溃疡性结肠炎；克罗恩病；良性淋巴细胞脉管炎，血小板减少性紫癜，特发性血小板减少，特发性自体免疫性溶血性贫血，纯红细胞再生失调，修格兰氏综合征，风湿性疾病，结缔组织疾病，炎性风湿病，退行性风湿病，关节外风湿病，幼年型类风湿性关节炎，痛风性关节炎(arthritis uratica)，肌肉性风湿病，慢性多关节炎，冷球蛋白血症性脉管炎(cryoglobulinemic vasculitis)，ANCA-关联性脉管炎，抗磷脂综合征，重症肌无力，自体免疫性溶血性贫血，格林-巴利综合征，慢性免疫多神经病，自体免疫性甲状腺炎，胰岛素依赖型糖尿病，I型糖尿病，阿狄森病，膜性肾小球性肾病，古德帕斯丘病(Goodpasture′s disease)，自体免疫性胃炎，自体免疫性萎缩性胃炎，恶性贫血，天疱疮，寻常型天疱疮，肝硬化，原发性胆汁性肝硬化，皮肌炎，多肌炎，纤维肌炎，肌硬化，腹腔疾病，免疫球蛋白A肾病，过敏性紫癜，埃文斯综合征(Evanssyndrome)，异位性皮炎，牛皮癣，关节病性牛皮癣(psoriasis arthropathica)，Graves氏病，Graves氏眼病，硬皮病，系统性硬皮病，进行性系统性硬皮病，哮喘，过敏症，原发性胆汁性肝硬化，桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)，原发性粘液性水肿，交感性眼炎，自体免疫性葡萄膜炎，肝炎，慢性活动性肝炎，胶原病，强直性脊柱炎，肩周炎，结节性全身动脉炎，软骨钙质沉着病，韦格纳氏肉芽肿病，显微镜下多血管炎，慢性荨麻疹，大疱性皮肤病，类天疱疮，异位性湿疹，德维克病(Devic′s disease)，儿童自体免疫性溶血性贫血，难治性或慢性自体免疫性血细胞减少，在获得性A型血友病中阻止自体免疫性抗VIII因子抗体的发展，冷凝集素病，视神经脊髓炎，僵人综合征，牙龈炎，牙周炎，胰腺炎，心肌炎，脉管炎，胃炎，痛风，痛风性关节炎，以及炎性皮肤失调，选自下组，该组由以下各项组成：牛皮癣，异位性皮炎，湿疹，酒渣鼻，荨麻疹，和痤疮，normocomplementemic荨麻疹性脉管炎，心包炎，肌炎，抗合成酶综合征，巩膜炎，巨噬细胞活化综合征，贝凯特综合征，PAPA综合征，布劳综合征，痛风，成年和少年斯蒂尔氏病(adult and juvenile Still′s disease)，cryropyrinopathy，穆克勒-威尔斯综合征(Muckle-Wells syndrome)，家族性寒冷诱导自体炎症综合征，新生儿发病多系统炎性疾病，家族性地中海热，慢性小儿神经系统、皮肤和关节综合征，系统性幼年特发性关节炎，超IgD综合征(Hyper IgD syndrome)，施尼茨勒综合征(Schnitzler′s syndrome)，自体免疫性视网膜病，年龄相关性黄斑变性，动脉硬化，慢性前列腺炎以及TNF受体-关联性周期性综合征(TRAPS)。
可任选地，该自体免疫性疾病选自下组，该组由任何以下各项的任何类型和亚型组成：多发性硬化症、类风湿性关节炎、I型糖尿病、银屑病、系统性红斑狼疮、炎性肠病、葡萄膜炎以及修格兰氏综合征。
根据至少一些实施例，提供了一种用于治疗或预防一种传染病的方法，该方法包括向一个对其有需要的受试者给予一个有效量的任何一种如在此所描述的分离的多肽、或如在此所描述的融合蛋白；如在此所描述的核苷酸序列；如在此所描述的表达载体；如在此所描述的宿主细胞、或如在此所描述的抗体或药物组合物。
可任选地，该传染病选自由细菌感染、病毒感染、真菌感染和/或其他寄生虫感染导致的疾病。
可任选地，该传染病选自乙型肝炎、丙型肝炎、感染性单核细胞增多症、EBV、巨细胞病毒、AIDS、HIV-1、HIV-2、结核病、疟疾以及血吸虫病。
根据至少一些实施例，提供了一种用于治疗或预防癌症的方法，该方法包括向一个对其有需要的受试者给予一个有效量的任何一种如在此所描述的分离的多肽、或如在此所描述的融合蛋白；如在此所描述的核苷酸序列；如在此所描述的表达载体；如在此所描述的宿主细胞、或如在此所描述的抗体或药物组合物。
可任选地，将这种治疗与另一个用于治疗癌症的部分或疗法进行合并。
可任选地，该疗法是放射疗法、抗体疗法、化学疗法、光动力学疗法、过继性T细胞疗法、Treg耗尽、手术或与常规药物的联合疗法。
可任选地，该部分选自下组，该组由以下各项组成：免疫抑制剂、细胞毒类药物、肿瘤疫苗、抗体(例如贝伐单抗、爱必妥)、肽、百普素体(pepti-bodies)、小分子、化学治疗剂(例如细胞毒素剂以及细胞生长抑制剂(例如紫杉醇、顺铂、长春瑞宾、多西他赛、吉西他滨、替莫唑胺、伊立替康、5FU、卡铂))、免疫学修饰剂(例如干扰素和白细胞介素)、免疫刺激抗体、生长激素或其他细胞因子、叶酸、维生素、矿物质、芳香酶抑制药、RNAi、组蛋白脱酰酶抑制剂、以及蛋白酶抑制剂。
可任选地，这种癌症选自下组，该组由以下各项组成：乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、骨髓性白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病、甲状腺癌、甲状腺滤泡癌、骨髓增生异常综合症(MDS)、纤维肉瘤和横纹肌肉瘤、黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、恶性胶质瘤、皮肤的良性瘤、角化棘皮瘤、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、滤泡树突细胞癌、肠癌、肌肉浸润性癌、精囊肿瘤、表皮癌、脾癌、膀胱癌、头颈癌、胃癌、肝癌、骨癌、脑癌、视网膜癌、胆道癌、小肠癌、唾液腺癌、子宫癌、睾丸癌、结缔组织癌、前列腺肥大、脊髓发育不良、瓦尔登斯特巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia)、鼻咽癌、神经内分泌癌、骨髓增生异常综合症、间皮瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、良性肿瘤、食管癌、输卵管癌、腹膜癌、乳头状浆液性勒氏癌、恶性腹水、胃肠道间质瘤(GIST)、李弗劳明综合征以及希佩尔-林道综合征(VHL)，并且其中该癌症是非转移性的、浸润性的或转移性的。
可任选地，这种癌症是黑色素瘤、肝癌、肾癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、胰脏癌、前列腺癌、胃癌、多发性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、急性和慢性淋巴性白血病以及急性和慢性骨髓性白血病中之一。
根据至少一些实施例，提供了一种用于在一个患者上加强对一种抗原再次免疫应答的方法，该方法包括向一个受试者给予有效量的任何一种如在此所描述的分离的多肽、或如在此所描述的融合蛋白；如在此所描述的核苷酸序列；如在此所描述的表达载体；如在此所描述的宿主细胞、或如在此所描述的抗体或药物组合物。
可任选地，这种抗原是一种癌症抗原、病毒性抗原或细菌性抗原，并且其中该患者已经接受了使用一种抗癌剂疫苗或病毒性疫苗的治疗。
一种在一个患者上的免疫疗法，包括：
体内或离体耐受性诱导，包括为了诱导耐受原性调节细胞的分化，向一个患者或向从该患者分离的白细胞给予有效量的任何以下各项：一种如在此所描述的分离的多肽、或如在此所描述的融合蛋白；如在此所描述的核苷酸序列；如在此所描述的表达载体；如在此所描述的宿主细胞、或如在此所描述的抗体或药物组合物；
所述细胞的离体富集和增殖；
向所述患者再输注这些耐受原性调节细胞。
一种使用以下至少之一作为癌症疫苗佐剂的方法：任何一种如在此所描述的分离的多肽、或如在此所描述的融合蛋白；一种如在此所描述的核苷酸序列；一种如在此所描述的表达载体；一种如在此所描述的宿主细胞，或一种如在此所描述的抗体；或一种药物组合物，该方法包括向一个患者给予一个免疫原性量的感兴趣的肿瘤相关抗原制剂；以及一种适合于免疫法的配制品中的癌症疫苗佐剂，其中在该癌症疫苗佐剂存在的情况下，针对该肿瘤相关抗原的免疫反应比在该癌症疫苗佐剂不存在的情况下要强。
根据至少一些实施例，提供了一种将使用抗原的治疗疫苗接种连同任一以下项的给予进行合并来治疗感染的方法：一种如在此所描述的分离的多肽、或如在此所描述的融合蛋白；如在此所描述的核苷酸序列；如在此所描述的表达载体；如在此所描述的宿主细胞、或如在此所描述的抗体或药物组合物。
根据至少一些实施例，为了增加免疫应答，提供了一种将任一以下各项与一种佐剂、以及一种疫苗中的抗原进行合并的方法：一种如在此所描述的分离的多肽、或如在此所描述的融合蛋白；如在此所描述的核苷酸序列；如在此所描述的表达载体；如在此所描述的宿主细胞、或如在此所描述的抗体或药物组合物。
可任选地，这种抗原是一种病毒性抗原、细菌性抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、和/或其他病原体的抗原。
根据至少一些实施例，任何一种根据本发明的至少一些实施例所述的前述治疗剂可以用于过继性免疫疗法，包括针对以下的抗体和抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代支架：任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白；LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR分泌形式或可溶性形式或ECD和/或其变体、和/或直向同源物、和/或偶联物。免疫耐受(immune tolerance或immunological tolerance)是通过它免疫系统不攻击一种抗原的过程。它可以是‘天然的’或‘自体耐受’，其中身体不加载对自体抗原的免疫应答；或‘诱导耐受’，其中对外部抗原的耐受性可以通过处理免疫系统产生。它以三种形式出现：中心耐受、外周耐受以及获得性耐受。不希望被单一理论所束缚，除了自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞、树突细胞(DC)以及细胞之外，耐受性还采用调节性免疫细胞-包括Tregs-直接抑制自体反应细胞，连同一些其他的具有免疫调节特性的细胞亚群-包括CD8+T细胞以及其他类型的CD4+T细胞(Tr1、Tr3)。
可以通过阻断共刺激或使共抑制性B7与其反受体接合来诱导耐受性。耐受性的转移涉及已经在体内(即细胞分离之前)亦或离体用于耐受性的诱导的细胞的分离，这些细胞离体的富集和增殖，随后是将这些增殖的细胞向该患者再输注。这种方法可以被用来治疗如在此所列举的自体免疫性疾病、如在此所列举的免疫相关疾病、移植排斥(transplantation rejection和graft rejection)。因此，根据至少一些实施例，为了诱导耐受原性调节细胞的分化，本发明提供了用于耐受性诱导的方法，这些方法包括向一个患者或向从该患者分离的白细胞体内或离体治疗给予有效量的以下各项：任一分离的可溶性LY6G6F、VSIG10、TMEM25、LSR多肽，或包括LY6G6F、VSIG10、TMEM25、LSR、或其片段、或其至一种异源序列的融合物的细胞外结构域的多肽，和/或一种特异性针对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体或抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代支架，随后是所述细胞的离体富集和增殖以及向所述患者再输注这些耐受原性调节细胞。
根据至少一些实施例，本发明提供了用于在体外或在体内检测一个生物样品或个体中的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的存在的测定，包括使该样品与一种对于LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽具有特异性的抗体和/或抗原结合片段和/或包含它们的偶联物、和/或替代支架进行接触，并且检测在该样品和/或个体中LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的结合。
根据至少一些实施例，提供了在一个样品中，用于检测任一具有任一SEQ ID NO：1-8、11-18、47-50、58、143的多肽，或与其至少95％相同的变体的存在的测定。
根据至少一些实施例，提供了一种用于诊断一个患者的疾病的方法，包括在该受试者或从所述受试者获得的样品中检测任一具有任一SEQ ID NO：1-8、11-18、47-50、58、143的多肽，或与其至少95％相同的变体、或其片段。
可任选地，在体内或体外进行该多肽的检测。
可任选地，该检测是通过免疫测定进行的。
可任选地，使用如在此所描述的抗体或片段进行该检测。
根据至少一些实施例，本发明提供了用于检测一种疾病、诊断一种疾病、监测一种疾病的疾病进展或疗效或复发、或为一种疾病选择一种疗法、检测被前述疾病感染的细胞的方法，包括检测LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的表达，其中这种疾病选自癌症、如在此所列举的感染性失调、和/或免疫相关失调。
根据一个实施例，检测这种多肽的存在指示该疾病的存在和/或其严重性和/或其进展。根据另一个实施例，与在一个健康受试者或从其获得的一个样品中该多肽的表达和/或水平相比，其表达和/或水平的变化指示该疾病的存在和/或其严重性和/或其进展。根据一个另外的实施例，与更早期在所述受试者或从其获得的一个样品中该多肽的表达和/或水平相比，其表达和/或水平的变化指示该疾病的进展。根据仍另外的实施例，检测该多肽的存在和/或其在表达和/或水平上的相对变化对于选择一种治疗和/或监测该疾病的治疗来说是有用的。
附图简要说明
图1呈现了以下的氨基酸序列：LY6G6F(图1A，SEQ ID NO：1)、VSIG10(图1B、SEQ IDNO：3，和1C，SEQ ID NO：5)、TMEM25(图1D，SEQ ID NO：7)、LSR(图1E(SEQ ID NO：11)、1F(SEQID NO：13)、1G(SEQ ID NO：15)、1H(SEQ ID NO：16)、1I(SEQ ID NO：17)、和1J(SEQ ID NO：18)蛋白、片段、ECD以及对其进行编码的相对应的核酸序列。对应于信号肽(SP)的氨基酸残基以粗斜体出现。Ig-V和/或Ig-C结构域示于框中。对应于跨膜区(TM)的氨基酸残基以粗体和下划线形式出现。对应于一些亚型(在图1B、和1E中)中的替代外显子跳跃的氨基酸残基以斜体和加下划线形式出现。对应于VSIG10(跳跃外显子3)和LSR(同种型-e，跳跃外显子3、4以及5)的替代外显子跳跃变体的核酸序列分别以粗体出现在图1C、和1I中。对应于跨膜区(TM)的核酸序列以粗体和下划线形式出现在图1C中。对应于信号肽(SP)的核酸序列以粗斜体出现在图1C、1E、1G、1H、1I、以及1J中。TGA终止密码子突出于图1C、和1I中。
图2呈现了以下之间的氨基酸序列比较：VSIG10变体SEQ ID NO：5与已知的VSIG10蛋白，SEQ ID NO：3(genbank登录号NP_061959.2)(图2A)；LSR_同种型-a，SEQ ID NO：11与已知的LSR蛋白，genbank登录号NP_991403 SEQ ID NO：62(图2B-1)；LSR_同种型-a，SEQ IDNO：11与已知的LSR蛋白，genbank登录号XP_002829104，SEQ ID NO：68(图2B-2)；LSR_同种型-b，SEQ ID NO：13与已知的LSR蛋白，genbank登录号NP_057009，SEQ ID NO：63(图2C-1)；LSR_同种型-b，SEQ ID NO：13与已知的LSR蛋白，genbank登录号BAC11614，SEQ ID NO：65(图2C-2)；LSR_同种型-c，SEQ ID NO：15与已知的LSR蛋白，genbank登录号NP_991404，SEQID NO：66(图2D-1)；LSR_同种型-c，SEQ ID NO：15与已知的LSR蛋白，genbank登录号XP_002829105.1，SEQ ID NO：69(图2D-2)；LSR_同种型-d，SEQ ID NO：16与已知的LSR蛋白，genbank登录号NP_991404，SEQ ID NO：66(图2E-1)；LSR_同种型-d，SEQ ID NO：16与已知的LSR蛋白，genbank登录号XP 002829105.1，SEQ ID NO：69(图2E-2)；LSR_同种型-e，SEQ IDNO：17与已知的LSR蛋白，genbank登录号BAG59226.1，SEQ ID NO：67(图2F)；LSR_同种型-f，SEQ ID NO：18与已知的LSR蛋白，genbank登录号NP_991403，SEQ ID NO：62(图2G-1)；LSR_同种型-f，SEQ ID NO：18与已知的LSR蛋白，genbank登录号NP_991404，SEQ ID NO：66(图2G-2)。VSIG10变体(SEQ ID NO：5)和LSR变体(SEQ ID NO：18)的独特边缘部分(独特接合处)的序列是粗体并且是突出的(分别是图2A和2G)。
图3示出了一幅散点图，使用MED发现引擎在所有组织和病症的虚拟面板上展示了编码VSIG10蛋白的VSIG10转录本的表达，展示了在来自免疫系统的若干组细胞(主要是在白细胞)中，以及在不同癌症病症的若干组细胞(例如来自ALL的CD10+白细胞以及来自AML的BM-CD34+细胞)中VSIG10转录本的差异表达。
图4示出了一幅散点图，使用MED发现引擎在所有组织和病症的虚拟面板上展示了编码LSR蛋白的LSR转录本的表达，展示了在来自免疫系统的若干组细胞(主要是在骨髓细胞)中，以及在不同组织的癌性病症的若干组细胞(例如在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌以及皮肤癌中)中LSR转录本的差异表达。
图5A呈现了LY6G6F人类(SEQ ID NO：1)和小鼠(reflNP_001156664.1，SEQ ID NO：29)的氨基酸序列比较。图5B呈现了VSIG10人类(SEQ ID NO：3)和小鼠(splD3YX43.2，SEQID NO：30)的氨基酸序列比较。图5C呈现了LSR人类(SEQ ID NO：11)和小鼠(reflNP_059101.1，SEQ ID NO：31)亦或小鼠(reflNP_001157656.1，SEQ ID NO：32)的氨基酸序列比较.图5D显示了TMEM25人类(SEQ ID NO：7)和小鼠(ref：lcll4109，SEQ ID NO：28)的氨基酸序列比较。
图6呈现了一个表，该表汇总了用来克隆融合至EGFP的LY6G6F转录本的引物。基因特异序列以黑体字示出；用于克隆目标的限制位点延伸是斜体的；并且Kozak序列是加下划线的。
图7呈现了融合至EGFP的LY6G6F全长DNA序列。对应于LY6G6F的全长序列的基因特异序列以黑体字标示，对应于EGFP序列的基因特异序列是非加粗斜体加下划线的。
图8呈现了融合至EGFP的生成的LY6G6F的全长氨基酸序列。对应于LY6G6F的全长序列的基因特异序列以黑体字标示；对应于EGFP序列的基因特异序列是非加粗斜体加下划线的。
图9A和9B呈现了在HEK293T细胞中瞬时表达的G6F_EGFP融合蛋白的细胞定位。这个图像是使用共聚焦显微镜的40x物镜获得的。
图10呈现了如下融合至小鼠IgG2a Fc的小鼠ECD：小鼠LY6G6F(也称为LY6G6F-Ig，图10A)，小鼠VSIG10(图10B)，小鼠TMEM25(也称为TMEM25-Ig，图10C)或小鼠LSR(也称为LSR-Ig，图10D)ECD-mIgG2aFc融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25、或26)。对应于信号肽(SP)的氨基酸残基以斜体示出。对应于ECD序列的氨基酸残基是加下划线的。对应于小鼠IgG2a Fc的氨基酸残基以黑体字示出(SEQ ID NO：27)。
图11呈现了融合至人类IgG1 Fc的人类ECD的氨基酸序列，其中在位置220处的Cys(根据全长人类IgG1，SEQ ID NO：70中的位置5)被一个Ser(SEQ ID NO：156)所替代，如下：融合至人类IgG1 Fc的人类LY6G6F(图11A)，人类VSIG10(图11B)，人类VSIG10-跳跃外显子3变体(图11C)，人类TMEM25(图11D)，人类LSR同种型a(图11E)，人类LSR同种型b(图11F)，人类LSR同种型c(图11G)，人类LSR同种型d(图11H)，人类LSR同种型e(图11I)，人类LSR同种型f(图11J)ECD(分别是SEQ ID NO：71-80)。对应于信号肽(SP)的氨基酸残基以粗斜体示出。对应于人类ECD序列的氨基酸残基是加下划线的。对应于人类IgG1 Fc的氨基酸残基是未标示的，其中在位置220处的Cys被一个Ser所替代(SEQ ID NO：156)。
图12是一个直方图，示出了通过或根据相对于正常样品的癌性卵巢样品中的LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID NO：140)可检测的LSR转录本的过表达。
图13是一个直方图，示出了通过或根据相对于正常样品的癌性乳腺样品中的LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID NO：140)可检测的LSR转录本的过表达。
图14是一个直方图，示出了通过或根据相对于正常样品的癌性肺样品中的LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID NO：140)可检测的LSR转录本的过表达。
图15是一个直方图，示出了通过或根据相对于癌性样品的正常组织样品中的LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID NO：140)可检测的LSR转录本的过表达。
图16是一个直方图，示出了通过或根据相对于正常样品的癌性肾脏样品中的LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID NO：140)可检测的LSR转录本的过表达。
图17是一个直方图，示出了通过或根据相对于正常样品的癌性肝脏样品中的LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID NO：140)可检测的LSR转录本的过表达。
图18展示了在稳定转染的重组HEK293T细胞中LSR_P5a_Flag_m蛋白(SEQ ID NO：144)的表达的蛋白印迹分析，如用如下抗Flag(Sigma cat#A8592)(图18A)和抗LSR抗体所检测的：Abnova，cat#H00051599-B01P(图18B)，Abeam，cat ab59646(图18C)以及Sigmacat#HPA007270(图18D)。条带1：HEK293T_pIRESpuro3；条带2：HEK293T_pIRESpuro3_LSR_P5a_Flag。
图19展示了LSR_P5a_Flag_m的亚细胞定位。LSR_P5a_Flag_m(SEQ ID NO：144)主要定位至细胞的细胞质，但是也可以在细胞表面检测到，如用如下抗Flag(Sigma cat#A9594)(图19A)和抗LSR抗体所检测的：Abeam，cat ab59646(图19B)，Abnova，cat#H00051599-B01P(图19C)以及Sigma cat#HPA007270(图19D)。
图20展示了在不同细胞系中的LSR的内源表达。在以下的提取物中用抗LSR抗体检测到了对应于LSR的72kDa的一个条带：(1)Caov3，(2)ES2，(3)OV-90，(4)OVCAR3，(5)SK-OV3，(6)TOV112D，(7)CaCo2，(8)HeLa，(9)Hep G2，(10)MCF-7，(11)SkBR3以及(12)293T_LSR_P5a_Flag(图20A)。抗GAPDH(Abeam cat#ab9484)充当一个上样对照(图20B)。
图21是一个直方图，示出了通过或根据在正常和癌性乳腺组织中的eg21-27-TMEM25_seg_21-27_200-344/346_扩增子(SEQ ID NO：123)可检测的TMEM25转录本的表达。
图22是一个直方图，示出了通过或根据在不同正常组织中的eg21-27-TMEM25_seg_21-27_200-344/346_扩增子(SEQ ID NO：123)可检测的TMEM25转录本的表达。
图23展示了蛋白印迹结果，示出了(A)兔抗TMEM25抗体与TMEM25_P5蛋白(SEQ IDNO：7)和TMEM25_P5_Flag(SEQ ID NO：129)而不是HEK_293T_pRp3之间的特异性相互作用。(B)TMEM25_P5_Flag蛋白(SEQ ID NO：129)与抗-Flag抗体之间的特异性相互作用。条带1：HEK293T_pIRESpuro3；条带2：HEK293T_pIRESpuro3_TMEM25-P5；条带3：HEK293T_pIRESpuro3_TMEM25-P5-Flag。
图24呈现了使用抗TMEM25抗体的TMEM25_P5(SEQ ID NO：132)(图24A)和TMEM25_P5_Flag(SEQ ID NO：129)(图24B)的细胞表面定位。图24C展示了使用抗flag抗体(Sigma，目录号：A9594)的TMEM25_P5_Flag(SEQ ID NO：129)定位。
图25展示了与被用作阴性对照的小鼠血清(1∶2250)(图25B)相比，在表达TMEM25_P5_Flag蛋白(1∶2250)(图25A)的HEK293T重组细胞中，抗TMEM25抗体结合至全长TMEM25蛋白，表明TMEM25蛋白的膜定位。
图26呈现了蛋白印迹结果，示出了在不同细胞系种内源TMEM25蛋白的表达：(1)：HEK293T_pIRESpuro3，(2)HEK293T_pIRESpuro3_TMEM25-P5-Flag，(3)KARPAS，(4)G-361，(5)RPMI8226，(6)DAUDI，(7)Jurkat。
图27展示了使用抗TMEM25抗体(Sigma，cat#HPA012163)，与稳定表达TMEM25_P5_FLAG、被乱序-SiRNA(Scrambled-SiRNA)(条带1)(Dharmacon，D-001810-10-05)转染的HEK293T细胞相比，在稳定表达TMEM25_P5_Flag(SEQ ID NO：129)、被TMEM25_P5 siRNA(L-018183-00-0005，Dharmacon)(条带2)转染的HEK293T细胞中TMEM25_P5_Flag蛋白(SEQ IDNO：129)的特异性敲减。
图28展示了在pH 9抗原检索方法中，与阴性对照细胞系空载体HEK293T细胞(第2列，图B、D以及F)相比，在阳性对照细胞系(LSR_P5a_Flag_m转染的HEK293T细胞)的切片中分别处于剂量依赖性浓度3ug/ml、1ug/ml和0.3ug/ml的抗LSR(Cat no.ab59646，Abeam)(第1列，图A、C以及E)示出了特异免疫反应性。
图29展示了在pH 9抗原检索方法中，与阴性对照细胞系空载体HEK293T细胞(第2列，图B、D以及F)相比，在阳性对照细胞系(TMEM25_P5_Flag转染的HEK293T细胞)的切片中分别处于剂量依赖性浓度3ug/ml、1ug/ml和0.3ug/ml的抗TMEM25(Cat no.HPA012163，Sigma)(第1列，图A、C以及E)示出了特异免疫反应性。
图30A-E示出了可溶性LY6G6F-Ig(SEQ ID NO：23)、TMEM25-Ig(SEQ ID NO：25)以及LSR-Ig(SEQ ID NO：26)对小鼠T细胞活化的体外抑制作用。在来自充当APC的Balb/c小鼠的经辐射处理的脾细胞的存在下，用20ug/ml(图30A-C、E)或2ug/ml(图D)的OVA323-339来诱导从DO11.10小鼠的脾脏分离的T细胞的活化。在这些研究中，CTLA4-Ig或B7-H4-Ig被用作阳性对照，而小鼠IgG2a被用作Ig对照。
图31示出了珠粒结合的LSR-Ig(SEQ ID NO：26)对由抗-CD3和抗-CD28包衣的珠粒诱导的T细胞增殖的体外抑制作用。
图32示出了LY6G6F、VSIG10、TMEM25以及LSR融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23-26)对CD4 T细胞活化的作用，如通过减少的IFNγ分泌(A)和活化标记CD69(B)减少的表达所证明的。每个条是两份培养的平均值，误差条表示标准差(与对照mIgG2a相比，学生t检验，*P＜0.05，**p＜0.01)。
图33示出了表达对人类LY6G6F、TMEM25或LSR(分别是SEQ ID NO：1、7或11)进行编码的cDNA的刺激细胞(一种鼠科胸腺瘤细胞系，Bw5147，将其工程化以表达膜结合的抗人类CD3抗体片段)对bulk人类T细胞(图33A)、CD4+人类T细胞(图33B)、CD8+人类T细胞(图33C)、或原始CD4CD45RA+人类T细胞(图33D)的增生(CPM)的作用。结果显示为6个(图33A)或3个(图33B、C、以及D)实验的平均数+/-SEM。*P＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、并且#p＜0.0001(学生t检验)表示与空载体相比的显著不同结果。
图34示出了LSR-Ig(SEQ ID NO：26)或TMEM25-Ig(SEQ ID NO：25)治疗在SJL小鼠中的PLP139-151-诱导的R-EAE模型中的治疗效果。将LSR-Ig(SEQ ID NO：26)或TMEM25-Ig(SEQ ID NO：25)以100microg/只小鼠从疾病缓解开始(第18天)以治疗方式给予，i.p.(腹腔注射)每周3次，持续两周。LSR-Ig和TMEM25-Ig对临床症状的治疗效果展示为平均临床分数的减少(图34A)。此外，在R-EAE诱导后的第35天(图34B)，LSR-Ig和TMEM25-Ig治疗抑制诱导表位(PLP139-151)或扩展表位(PLP178-191)的DTH应答。在这项研究中，与类似于测试蛋白的方案来给予的mIgG2a Ig阴性对照和CTLA4-Ig阳性对照相比，研究了LSR-Ig或TMEM25-Ig的作用。
图35示出了在SJL小鼠中的R-EAE模型中TMEM25-Ig(SEQ ID NO：25)的作用的剂量依赖性和作用方式。在这项研究中，从疾病缓解开始(第19天)以100、30或10microg/只小鼠给予治疗，i.p.(腹腔注射)每周3次，持续两周，与以一种类似计划给予的10microg/只小鼠IgG2a对照进行比较，示出的是TMEM25-Ig治疗对疾病进程(图35A)、在R-EAE诱导后第45天和第76天对扩展表位PLP178-191和MBP84-104的DTH应答(图35B)、在疾病诱导后第45天和第75天分离的脾细胞的离体召回应答(recall response)(图35C)以及、在疾病诱导后第45天分离的LN细胞(图35D)的作用，如通过TMEM25-Ig治疗对细胞增殖和细胞因子(IFNg、IL-17、IL-10以及IL-4)分泌的作用所证明的。用100ug/剂量的TMEM25-Ig处理时，TMEM25-Ig对脾脏、淋巴结和CNS连同CNS中存在的不同谱系(lineage)的细胞计数的作用示出于图35E中。
图36示出了VSIG10-Ig(SEQ ID NO：24)治疗在SJL小鼠中的PLP139-151-诱导的R-EAE模型中的治疗效果。将VSIG10-Ig(SEQ ID NO：24)以100microg/只小鼠从疾病缓解开始(第19天)以治疗方式给药，i.p.(腹腔注射)每周3次，持续两周。VSIG10-Ig对临床症状的治疗效果展示为平均临床分数的减少(图36A)。另此外，VSIG10-Ig治疗抑制在R-EAE诱导后第45天和第76天对扩展表位(PLP178-191和MBP MBP84-104)的DTH应答(图36B)。还示出了VSIG10-Ig对在疾病诱导后第45天和第75天分离的脾细胞的离体召回应答(recallresponse)(图36C)以及在疾病诱导后第45天分离的LN细胞(图36D)的作用，如通过VSIG10-Ig治疗对细胞增殖和细胞因子(IFNg、IL-17、IL-10以及IL-4)分泌的作用所证明的。用100ug/剂量的VSIG10-Ig处理后，VSIG10-Ig对脾脏、淋巴结和CNS以及每种这些组织内存在的不同谱系(lineage)的细胞计数的作用示出于图36E中。在这项研究中，与类似于VSIG10-Ig的剂量和方案来给予的mIgG2a Ig对照相比，研究了VSIG10-Ig的作用。
图37示出了以100microg/只小鼠给予的LSR-Ig(SEQ ID NO：26)，i.p.(腹腔注射)每周3次，持续10天，在类风湿性关节炎的胶原诱导的关节炎(CIA)模型中的治疗效果。对临床分数(A)、爪肿胀(B)以及组织学损害(C)进行了测量，使用CTLA4-Ig(100microg/只小鼠)和TNFR-Ig(依那西普)作为阳性对照，而使用mIgG2a Ig对照(100microg/只小鼠)作为阴性对照。
图38示出了以25mg/kg给予的LY6G6F-Ig(SEQ ID NO：23)，i.p.(腹腔注射)每周3次，持续2周，在类风湿性关节炎的胶原诱导的关节炎(CIA)模型中的治疗效果，其中根据临床分数给出测量值。
对于图12-17、21、22，将其分为单独的部分“A”、“B”等，仅是由于空间的原因，以便能够示出所有结果。
发明详细说明
在至少一些实施例中，本发明涉及任一被称为LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的蛋白，及其相对应的核酸序列，及其部分和变体和包含它们的融合蛋白以及偶联物，和/或多克隆抗体和单克隆抗体和/或抗原结合片段和/或包含它们的偶联物，和/或其结合LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR和/或其部分和/或变体的替代支架，和它们作为治疗剂和/或诊断剂的用途，以及如在此所描述的不同用途。
转让给Genentech公司的美国专利申请号US 2009117566、US 20090017473、以及其他同族成员披露了一种在残基234-254与354-374之间具有一个跨膜结构域的382个氨基酸的LY6G6F蛋白序列(DNA 234441，肿瘤相关抗原靶标(TAT)TAT201，SEQ ID NO：92在其中)。来自这个专利家族的′566、′473申请以及其他申请披露TAT201在结肠癌和直肠癌中是过表达的。PCT申请号WO 2003083074和WO 2004046342披露了一种382个氨基酸的LY6G6F蛋白序列，该蛋白序列作为在结肠癌细胞中过表达的许多基因之一。这些专利申请进一步据称涉及使用LY6G6F用于检测和治疗结肠癌的方法。然而，这些专利申请没有教导或提示或提供指导技术人员使用特异性针对LY6G6F和/或LY6G6F ECD的抗体用于治疗和/或诊断除了结肠直肠癌之外的癌症、和/或感染性失调、和/或免疫相关失调的任何动机。这些专利申请没有描述LY6G6F ECD并且没有教导或提示或提供指导技术人员使用LY6G6F ECD用于治疗癌症和/或感染性失调、和/或免疫相关失调的任何动机。
作为许多(数以百计至数以千计)对于诊断、预防、和治疗与这些蛋白的异常表达或活性相关联的失调而言有用的蛋白之一，TMEM25被披露于PCT申请号WO 9958642和WO2003087300，以及美国专利申请号US 2007041963和US 2005202526中。然而，这些申请没有教导或提示或提供指导技术人员使用特异性针对TMEM 25和/或TMEM25 ECD的抗体来治疗和/或诊断癌症、和/或感染性失调、和/或免疫相关失调的任何动机。作为对于诊断、治疗、预防或缓解疾病或失调(例如癌症、贫血症、关节炎、哮喘、炎性肠病或阿耳茨海默病)而言有用的数以百计的白蛋白融合蛋白之一，TMEM25还被披露于美国专利申请号US2004010134中。然而，这个申请没有教导或提示或提供指导技术人员使用特异性针对TMEM25和/或TMEM25 ECD的抗体来治疗和/或诊断癌症、和/或感染性失调、和/或免疫相关失调的任何动机。作为一种对于乳腺癌诊断有利的预后性以及预测性生物标记，TMEM25还被披露于杜兰P(Doolan P)等人，《肿瘤生物学》(Tumour Biol)30(4)：200-9中。然而，这个出版物没有教导或提示或提供指导技术人员使用特异性针对TMEM25和/或TMEM25 ECD的抗体来治疗癌症、和/或感染性失调、和/或免疫相关失调的任何动机。
为了使不同实施例中的本发明可更容易理解，首先定义某些术语。额外的定义贯穿详细说明而阐明。
如在此使用，术语“分离的”是指一种处于不同于它天然发生的环境中的感兴趣的化合物(例如多核苷酸或多肽)，例如分离自其天然的环境，例如通过将一种肽浓缩成一种在自然界中未发现的浓缩物。“分离的”包括样品中的化合物，这些样品实质上富含感兴趣的化合物和/或其中这种感兴趣的化合物被部分地或充分地纯化。
“免疫细胞”是指任何来自造血源的细胞，包括但不局限于T细胞、B细胞、单核细胞、树突细胞、以及巨噬细胞。
如在此使用，术语“多肽”是指一个任意长度的氨基酸链，无论是否被修饰(例如，磷酸化或糖基化)。
如在此使用，“共刺激多肽”或“共刺激分子”是一种一旦与T细胞上的细胞表面分子相互作用便调节T细胞应答的多肽。
如在此使用，“共刺激信号”是在抗原特异性T细胞应答过程中，来源于抗原递呈细胞上的共刺激多肽与T细胞上的其受体之间的相互作用的信号活性。不希望受单一假设限制，相信抗原特异性T细胞应答由两种信号介导：1)T细胞受体(TCR)与在MHC的背景下呈递的抗原性肽的接合，(信号1)，以及2)通过在不同共刺激受体/配体对之间的接触递送的一个第二抗原独立性信号(信号2)。不希望受单一假设限制，此“第二信号”在决定T细胞应答的类型(活化vs抑制)以及该应答的强度和持续时间中是关键的，并且此“第二信号”由来自共刺激分子(例如B7蛋白家族)的正信号和负信号两者调节。
如在此使用，术语“B7”多肽是指共刺激T细胞的B7蛋白家族的一个成员，包括但不局限于：B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H5、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-S3以及其生物活性的片段和/或变体。代表性生物活性片段包括共刺激T细胞的细胞外结构域或细胞外结构域片段。
如在此使用，与相对应的野生型多肽的氨基酸序列相比，“变体”多肽包含至少一个氨基酸序列改变。
如在此使用，“保守的”氨基酸取代是指其中取代的氨基酸具有类似结构特性或化学特性的取代。如在此使用，术语“宿主细胞”是指可以向其中引入一个重组载体的原核细胞和真核细胞。
如在此使用，术语“边缘部分”或“新接合处”是指根据本发明所述的剪接变体的两个部分之间的连接，这两个部分在野生型或已知蛋白中没有被连接。例如，归因于一种变体的上面“已知蛋白”部分与尾部之间的连接，一个边缘能可任选地出现，和/或如果野生型序列的内部部分不再存在，边缘可以出现，这样使得在该剪接变体中该序列的两个部分现在是连续的，在已知蛋白中，这两个部分是不连续的。“桥接”能可任选地是一种如上所述的边缘部分，但是还可以包括头部与一种变体的“已知蛋白”部分之间的一个连接、或尾部与一种变体的“已知蛋白”部分之间的一个连接、或一个插入与一种变体的“已知蛋白”部分之间的一个连接。
在一些实施例中，一个尾部或头部或独特插入与一种变体的“已知蛋白”部分之间的桥接包括至少约10个氨基酸，或在一些实施例中至少约20个氨基酸、或在一些实施例中至少约30个氨基酸、或在一些实施例中至少约40个氨基酸，其中至少一个氨基酸来自尾部/头部/插入并且至少一个氨基酸来自一种变体的“已知蛋白”部分。在一些实施例中，该桥接可以包括从约10至约40个氨基酸的任意数目的氨基酸(例如，长为10、11、12、13...37、38、39、40个氨基酸、或中间的任意数目)。
应该指出的是，桥接不能在任一方向延伸超过该序列的长度，并且应该假设的是每个桥接描述都应以这样的方式来解读，使得该桥接的长度不延伸超过该序列自身。
此外，在下面的某些背景下，相对于滑动窗口对桥接进行了描述。例如，这些桥接的某些描述按以下格式为特征：两个边缘之间的桥接(其中已知蛋白的一个部分在变体中不存在)能可任选地描述如下：CONTIG-NAME_Pl(代表该蛋白的名称)的一个桥接部分，包括一个具有长度“n”的多肽，其中n至少长约10个氨基酸，可任选地是至少长约20个氨基酸、至少长约30个氨基酸、至少长约40个氨基酸、或至少长约50个氨基酸，其中至少两个氨基酸包括具有如下结构的XX(位于该桥接中心的2个氨基酸，一个来自该边缘的每个末端)，具有如下结构(根据CONTIG-NAME_Pl的序列进行编码)：起始于任一氨基酸号49-x至49(例如)并且终止于任一氨基酸号50+((n-2)-x)(例如)的序列，其中x从0至n-2变化。在这个实例中，应该还被解读为包括其中n是长为10-50个氨基酸之间的任意数目的氨基酸的桥接。此外，该桥接多肽不能延伸超过该序列，因此应该这样解读，这样使得49-x(例如)不小于1，而50+((n-2)-x)(例如)不大于总序列长度。
如在此使用，术语“癌症”应该被理解为涵盖任何肿瘤疾病(无论是浸润性的还是转移性的)，这种肿瘤疾病特征在于导致恶性生长或肿瘤的异常的并且不受控的细胞分裂。可以用根据本发明的至少一些实施例所述的化合物来治疗的癌症的非限制性实例是实体瘤、肉瘤以及血液恶性肿瘤，包括但不局限于：乳腺癌(例如乳腺肿瘤)、宫颈癌、卵巢癌(卵巢肿瘤)、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌(膀胱肿瘤)、肺癌(例如腺癌和非小细胞肺癌)、胰腺癌(例如胰腺肿瘤，例如外分泌胰腺肿瘤)、结肠癌(例如结肠直肠肿瘤，例如结肠腺癌和结肠腺瘤)、前列腺癌(包括晚期疾病)、淋巴谱系的造血肿瘤(包括白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤)、骨髓性白血病(例如，急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病)、甲状腺癌、甲状腺滤泡癌、骨髓增生异常综合症(MDS)、间充质源的肿瘤(例如纤维肉瘤和横纹肌肉瘤)、黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、恶性胶质瘤、皮肤的良性瘤(例如角化棘皮瘤)、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、滤泡树突细胞癌、肠癌、肌肉浸润性癌、精囊肿瘤、表皮癌、脾癌、膀胱癌、头颈癌、胃癌、肝癌、骨癌、脑癌、视网膜癌、胆道癌、小肠癌、唾液腺癌、子宫癌、睾丸癌、结缔组织癌、前列腺肥大、脊髓发育不良、瓦尔登斯特巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia)、鼻咽癌、神经内分泌癌、骨髓增生异常综合症、间皮瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、良性肿瘤、食管癌、输卵管癌、腹膜癌、乳头状浆液性勒氏癌、恶性腹水、胃肠道间质瘤(GIST)，以及遗传性癌症综合征，例如李弗劳明综合征以及希佩尔-林道综合征(VHL)，并且其中这种癌症可以是非转移性的、浸润性的或转移性的。
根据本发明的至少一些优选的实施例，这种癌症选自下组，该组由以下各项组成：黑色素瘤、肝症、肾症、脑症、乳腺症、结肠症、肺症、卵巢症、胰腺症、前列腺症、胃症、多发性骨髓瘤以及造血性癌症，包括但不局限于淋巴瘤(何杰金氏和非何杰金氏)、急性和慢性淋巴性白血病以及急性和慢性骨髓性白血病，并且其中这种癌症可以是非转移性的、浸润性的或转移性的。
如在此使用，术语“自体免疫性疾病”应该被理解为涵盖任何自体免疫性疾病以及慢性炎性病症。根据本发明的至少一些实施例，这些自体免疫性疾病应该被理解为涵盖选自下组的任何疾病失调或病症，包括但不局限于：多发性硬化症，包括复发型多发性硬化症，原发性进展型多发性硬化症，以及继发进展型多发性硬化症；牛皮癣；类风湿性关节炎；牛皮癣关节炎，系统性红斑狼疮(SLE)；溃疡性结肠炎；克罗恩病；良性淋巴细胞脉管炎，血小板减少性紫癜，特发性血小板减少，特发性自体免疫性溶血性贫血，纯红细胞再生失调，修格兰氏综合征，风湿性疾病，结缔组织疾病，炎性风湿病，退行性风湿病，关节外风湿病，幼年型类风湿性关节炎，痛风性关节炎(arthritis uratica)，肌肉性风湿病，慢性多关节炎，冷球蛋白血症性脉管炎(cryoglobulinemic vasculitis)，ANCA-关联性脉管炎，抗磷脂综合征，重症肌无力，自体免疫性溶血性贫血，格林-巴利综合征，慢性免疫多神经病，自体免疫性甲状腺炎，胰岛素依赖型糖尿病，I型糖尿病，阿狄森病，膜性肾小球性肾病，古德帕斯丘病(Goodpasture′s disease)，自体免疫性胃炎，自体免疫性萎缩性胃炎，恶性贫血，天疱疮，寻常型天疱疮，肝硬化，原发性胆汁性肝硬化，皮肌炎，多肌炎，纤维肌炎，肌硬化，腹腔疾病，免疫球蛋白A肾病，过敏性紫癜，埃文斯综合征(Evans syndrome)，异位性皮炎，牛皮癣，关节病性牛皮癣(psoriasis arthropathica)，Graves氏病，Graves氏眼病，硬皮病，系统性硬皮病，进行性系统性硬皮病，哮喘，过敏症，原发性胆汁性肝硬化，桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)，原发性粘液性水肿，交感性眼炎，自体免疫性葡萄膜炎，肝炎，慢性活动性肝炎，胶原病，强直性脊柱炎，肩周炎，结节性全身动脉炎，软骨钙质沉着病，韦格纳氏肉芽肿病，显微镜下多血管炎，慢性荨麻疹，大疱性皮肤病，类天疱疮，异位性湿疹，德维克病(Devic′s disease)，儿童自体免疫性溶血性贫血，难治性或慢性自体免疫性血细胞减少，在获得性A型血友病中阻止自体免疫性抗VIII因子抗体的发展，冷凝集素病，视神经脊髓炎，僵人综合征，牙龈炎，牙周炎，胰腺炎，心肌炎，脉管炎，胃炎，痛风，痛风性关节炎，以及炎性皮肤失调，选自下组，该组由以下各项组成：牛皮癣，异位性皮炎，湿疹，酒渣鼻，荨麻疹，和痤疮，normocomplementemic荨麻疹性脉管炎，心包炎，肌炎，抗合成酶综合征，巩膜炎，巨噬细胞活化综合征，贝凯特综合征，PAPA综合征，布劳综合征，痛风，成年和少年斯蒂尔氏病(adult and juvenile Still′s disease)，cryropyrinopathy，穆克勒-威尔斯综合征(Muckle-Wells syndrome)，家族性寒冷诱导自体炎症综合征，新生儿发病多系统炎性疾病，家族性地中海热，慢性小儿神经系统、皮肤和关节综合征，系统性幼年特发性关节炎，超IgD综合征(Hyper IgD syndrome)，施尼茨勒综合征(Schnitzler′s syndrome)，自体免疫性视网膜病，年龄相关性黄斑变性，动脉硬化，慢性前列腺炎以及TNF受体-关联性周期性综合征(TRAPS)。
可任选地并且优选地，该自体免疫性疾病包括但不局限于任何以下各项的任何类型和亚型：多发性硬化症、类风湿性关节炎、I型糖尿病、银屑病、系统性红斑狼疮、炎性肠病、葡萄膜炎、或修格兰氏综合征。
如在此使用，“多发性硬化症”包括以下各项中的一种或多种：多发性硬化症、良性多发性硬化症、复发缓和多发性硬化症、继发进展型多发性硬化症、原发性进展型多发性硬化症、进展型复发多发性硬化症、慢性进展型多发性硬化症、过渡性/进展型多发性硬化症、迅速恶化多发性硬化症、临床上确切的多发性硬化症、恶性多发性硬化症(也被称为马尔堡的变体(Marburg′s Variant))、以及急性多发性硬化症。可任选地，“涉及多发性硬化症的病症”包括，例如，德维克病(也被称为视神经脊髓炎)；急性播散性脑脊髓炎、急性脱髓鞘性视神经炎、脱髓鞘横贯性脊髓炎、米勒费歇尔综合征(Miller-Fisher syndrome)、脑脊髓神经根神经病(encephalomyelradiculoneuropathy)、急性脱髓鞘多神经病、肿瘤样多发性硬化症以及巴洛同心圆硬化症。
如在此使用，“类风湿性关节炎”包括以下各项中的一种或多种：类风湿性关节炎、痛风和假性痛风、幼年特发性关节炎、幼年类风湿性关节炎、斯蒂尔病、强直性脊柱炎、类风湿性脉管炎。任选地，与类风湿性关节炎有关的病状包括例如骨关节炎、肉状瘤病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、银屑病性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、脓毒性关节炎、血色病、肝炎、脉管炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)、莱姆氏病(Lyme disease)、家族性地中海热、具有回归热的高免疫球蛋白血症D、TNF受体相关周期性综合征，以及与炎性肠病相关的肠病性关节炎。
如在此使用，“葡萄膜炎”包括以下各项中的一种或多种：葡萄膜炎、前葡萄膜炎(或虹膜睫状体炎)、中间型葡萄膜炎(睫状体扁平部炎)、后葡萄膜炎(或脉络膜视网膜炎)以及全葡萄膜炎(panuveitic)形式。
如在此使用，“炎性肠病”包括以下各项中的一种或多种：炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎(UC)、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转向性结肠炎、白塞氏病、不确定性结肠炎。
如在此使用，“银屑病”包括以下各项中的一种或多种：银屑病，非脓包型银屑病(包括寻常型银屑病和银屑病性红皮病(红皮病型银屑病))，脓包型银屑病(包括泛化脓包型银屑病(冯宗布什(von Zumbusch)的脓包型银屑病))，掌跖脓疱病(持续性掌跖脓疱病、巴伯类型的脓包型银屑病、肢末端的脓包型银屑病)，环形脓疱型银屑病，连续性肢末端皮炎，疱疹样脓疱病。可任选地，与银屑病有关的病症包括例如药物诱导的银屑病、皮褶银屑病、尿布区银屑病、脂溢性皮炎样银屑病、滴状银屑病、指甲银屑病、银屑病性关节炎。
如在此使用，“1型糖尿病”包括以下各项中的一种或多种：1型糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病、特发性糖尿病、幼年1型糖尿病、青年的成熟型发病型糖尿病、成人的隐匿性自体免疫糖尿病、妊娠期糖尿病。与1型糖尿病有关的病症包括：神经病变，包括多神经病变、单神经病变、周围神经病变以及自主神经病变；眼睛并发症：青光眼、白内障、视网膜病。
如在此使用，“修格兰氏综合征”包括以下各项中的一种或多种：修格兰氏综合征、原发性修格兰氏综合征和继发性修格兰氏综合征、以及涉及修格兰氏综合征的病症，包括结缔组织病，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、或硬皮病。其他并发症包括肺炎，肺纤维化，间质性肾炎，肾脏过滤器周围组织的炎症，肾小球性肾炎，肾小管性酸中毒，腕管综合征，周围神经病变，颅神经病变，原发性胆汁性肝硬变(PBC)，肝硬化，食道、胃、胰腺以及肝脏的炎症(包括肝炎)，多肌炎，雷诺氏现象(Raynaud′s phenomenon)，脉管炎，自体免疫甲状腺问题，淋巴瘤。
如在此使用，“系统性红斑狼疮”包括以下各项中的一种或多种：系统性红斑狼疮、盘状狼疮、狼疮性关节炎、狼疮性肺炎、狼疮性肾炎。与全身性红斑狼疮有关的病状包括骨关节结核、抗磷脂抗体综合征、心脏各个部分的炎症(例如心包炎、心肌炎以及心内膜炎)、肺以及胸膜炎症、胸膜炎、胸膜腔积液、慢性弥散性间质性肺病、肺动脉高压、肺栓塞、肺出血，以及肺萎缩综合征、狼疮性头痛、格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)、无菌性脑膜炎、脱髓鞘性综合征、单神经病变、多发性单神经炎、重症肌无力、脊髓病变、颅神经病变、多神经病变、脉管炎。
如在此使用，“免疫相关疾病(或失调或病症)”应该被理解为涵盖任何选自下组的疾病失调或病症，包括但不局限于：自体免疫性疾病，与移植物移植排斥反应相关联的炎性失调和免疫失调，例如器官移植、同种异体干细胞移植、自体干细胞移植、骨髓移植的急性和慢性排斥反应，以及移植物抗宿主疾病。
如在此使用，可交换使用的术语“炎性失调”和/或“炎症”包括特征在于对有害刺激(例如病原体、受损细胞、或刺激物)的失调的免疫应答的炎性异常。炎性失调构成非常多的人类疾病的基础。在炎性过程中具有病因学源的非免疫性疾病包括癌症、动脉硬化、以及缺血性心脏病。与炎症相关联的失调的实例包括：慢性前列腺炎，肾小球肾炎，超敏反应，盆腔炎，再灌注损伤，结节病，脉管炎，间质性膀胱炎，normocomplementemic荨麻疹性脉管炎，心包炎，肌炎，抗合成酶综合征，巩膜炎，巨噬细胞活化综合征，白塞氏综合征，PAPA综合征，布劳氏综合征，痛风，成人和幼年斯蒂尔病，cryropyrinopathy，穆克勒-威尔斯综合征(Muckle-Wells syndrome)，家族性寒冷诱导自体炎症综合征，新生儿发病多系统炎性疾病，家族性地中海热，慢性婴儿型神经系统，皮肤和关节综合征，系统性幼年特发性关节炎，超IgD综合征(Hyper IgD syndrome)，施尼茨勒综合征(Schnitzler′s syndrome)，TNF受体-关联性周期性综合征(TRAPSP)，牙龈炎，牙周炎，肝炎，肝硬化，胰腺炎，心肌炎，脉管炎，胃炎，痛风，痛风性关节炎，以及选自下组的炎性皮肤失调，该组由以下各项组成：银屑病、异位性皮炎、湿疹、红斑痤疮、荨麻疹、以及痤疮。
如在此使用，可交换使用的术语“感染性失调和/或疾病”和/或“感染”包括由在一个单独的宿主有机体中的病原性生物剂的存在和/或生长导致的任何失调、疾病和/或病症。如在此使用，术语“感染”包括如上的展示出临床上明显的疾病(即，疾病的典型医学征象和/或症状)和/或在其许多或全部过程中是无症状的失调、疾病和/或病症。如在此使用，术语“感染”还包括由外源抗原的存留导致的失调、疾病和/或病症，该外源抗原导致耗尽T细胞表型，耗尽T细胞表型特征在于减少的增殖以及细胞因子生产所证明的受损的功能性。如在此使用，术语“感染性失调和/或疾病”和/或“感染”进一步包括由细菌感染、病毒感染、真菌感染和/或寄生虫感染导致的任何以下所列的感染性失调、疾病和/或病症。
如在此使用，术语“病毒感染”由病毒导致的任何感染，可任选地包括但不局限于：逆转录病毒(例如人类免疫缺陷病毒，例如HIV-1或HIV-2，获得性免疫缺陷(AIDS)(也被称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV、或HIV-III)；以及其他隔离群，例如HIV-LP；小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒；肠道病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(例如导致肠胃炎的品系)；披膜病毒科(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(例如冠状病毒)；弹状病毒科(例如水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(例如汉坦病毒、布尼亚病毒(bunga virus)、白蛉病毒以及Nairo病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如呼肠孤病毒、环状病毒以及轮状病毒)；双核糖核酸病毒科；噬肝病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(herpesviridae)(单纯性疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲猪瘟病毒)；以及未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原学试剂，δ肝炎的试剂(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星)，the agents of非甲型、非乙型肝炎的试剂(类别1-内部传输的；类别2-肠道外传输的(即，丙型肝炎)；诺瓦克和相关病毒，以及星状病毒)连同严重急性呼吸综合征病毒和呼吸道合胞体病毒(RSV)。
如在此使用，术语“真菌感染”包括由真菌导致的任何感染，可任选地包括但不局限于：新型隐球菌，荚膜组织胞浆菌，粗球孢子菌，皮炎芽生菌，沙眼衣原体，白色念珠菌。
如在此使用，术语“寄生虫感染”包括由寄生虫导致的任何感染，可任选地包括但不局限于：原生动物，例如阿米巴原虫(Amebae)、鞭毛虫、恶性疟原虫、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、纤毛虫、球虫、微孢子虫、孢子虫；蠕虫，线虫(蛔虫)，绦虫(带虫(Tapeworm))，吸虫(吸虫(Fluke))，节肢动物，以及被称为朊病毒的异常蛋白。
由细菌导致的感染性失调和/或疾病能可任选地包括以下各项中的一种或多种：败血症，感染性休克，鼻窦炎，皮肤感染，肺炎，支气管炎，脑膜炎，细菌性阴道炎，泌尿道感染(UCI)，细菌性肠胃炎，脓疱病和丹毒，丹毒，蜂窝组织炎，炭疽，百日咳，莱姆氏病(lymedisease)，布鲁菌病，肠炎，急性肠炎，破伤风，白喉，伪膜性结肠炎，气性坏疽，急性食品中毒，厌氧性蜂窝组织炎，医院内感染，腹泻，婴儿脑膜炎，旅行者腹泻(Traveller′sdiarrhea)，出血性结肠炎，溶血性尿毒症综合征，兔热病，胃溃疡，胃和十二指肠溃疡，莱金奈尔病，庞蒂亚克热，钩末端螺旋体病，李斯特菌病，麻风病(韩森氏病(Hansen′sdisease))，结核病，淋病，新生儿眼炎，脓毒性关节炎，脑膜炎球菌病(包括脑膜炎、沃-弗综合征)，假单胞菌感染，落矶山斑点热，伤寒型沙门氏菌病，肠胃炎和小肠结肠炎沙门氏菌病，杆菌性痢疾/细菌性痢疾，凝固酶阳性金黄色葡萄球菌感染(coagulase-positivestaphylococcal infection)：局部皮肤感染，包括弥漫性皮肤感染(脓疱病)、深层局部感染，急性感染性心内膜炎，败血症，坏死性肺炎，Toxinoses(例如中毒性休克综合征和葡萄球菌性食物中毒)，膀胱炎，子宫内膜炎，中耳炎，链球菌性咽炎，猩红热，风湿热，产褥热，坏死性筋膜炎，霍乱，瘟疫(包括腺鼠疫和肺鼠疫)；以及由选自但不局限于以下的细菌导致的任何感染：幽门螺杆菌，伯氏疏螺旋体，嗜肺军团菌，分枝杆菌属(例如，结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌(M gordonae))，金黄色葡萄球菌，淋球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，单核细胞增生李斯特氏菌，酿脓链球菌(A组链球菌属)，无乳链球菌(B组链球菌属)，链球菌属(绿色群(viridans group))，粪链球菌，牛链球菌，链球菌属(厌氧属)，肺炎链球菌，致病性弯曲杆菌属，肠球菌属，流感嗜血杆菌，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)，白喉棒状杆菌，棒状杆菌属，红斑丹毒丝菌，产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringers)，破伤风梭菌，产气肠杆菌，肺炎克雷伯氏菌，多杀性巴氏杆菌，拟杆菌属，具核梭杆菌，Sreptobacillus moniliformis，梅毒螺旋体，雅司螺旋体，钩末端螺旋体，以及Actinomeyces israelii。
由病毒导致的感染性失调和/或疾病的非限制性实例选自下组，该组由以下各项组成，但不局限于：获得性免疫缺陷(AIDS)，西尼罗河脑炎(West Nile encephalitis)，冠状病毒感染，鼻病毒感染，流感，登革热，出血热；耳科感染；严重急性呼吸道综合症(SARS)，急性发热性咽炎，咽结膜热，流行性角膜结膜炎，婴儿肠胃炎，感染性单核细胞增多症，伯基特淋巴瘤，急性肝炎，慢性肝炎，肝硬化，肝细胞癌，原发性HSV-1感染(儿童龈口炎、成人扁桃体炎和咽炎，角膜结膜炎)，潜伏型HSV-1感染(唇疱疹(herpes labialis、cold sores))，无菌脑膜炎，巨细胞病毒感染，巨细胞包涵体病，卡波西肉瘤，卡斯尔曼病(Castlemandisease)，原发性渗出性淋巴瘤，流感，麻疹，脑炎，感染后脑脊髓炎，腮腺炎，增生性上皮病变(常见的平坦足底和肛门生殖器疣、喉部乳头状瘤，疣状表皮发育不良)，义膜性喉炎，肺炎，细支气管炎，脊髓灰质炎，狂犬病，细支气管炎，肺炎，德国风疹，先天性风疹，出血热，水痘，登革热，埃博拉病毒感染，埃可病毒感染，EBV感染，五号病(Fifth Disease)，纤丝病毒，黄病毒，手足口病，带状疱疹病毒(带状疱疹(Shingle))，人类乳头状瘤病毒相关的表皮病变，拉沙热，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，副流感病毒感染，副粘病毒，细小病毒B19感染，小核糖核酸病毒，痘病毒感染，轮状病毒腹泻，风疹，麻疹，水痘，天花感染。
由真菌导致的感染性失调和/或疾病可任选地包括但不局限于：过敏性支气管肺曲霉病，曲霉病(aspergilloma、aspergillosis)，蛙粪霉病(basidiobolomycosis)，芽生菌病，念珠菌病，慢性肺曲菌病，壶菌病，球孢子菌病，耳霉病(Conidiobolomycosis)，覆盖黑穗病(covered smut)(大麦)，隐球菌病，皮肤癣菌(dermatophyte)，癣菌疹(dermatophytid)，皮肤真菌病，毛内癣菌(endothrix)，昆虫病原真菌，流行性淋巴管炎，流行性溃疡综合征，食管念珠菌病，Exothrix，真菌血症，组织胞浆菌病，洛博芽生菌病(Lobomycosis)，Massospora cicadina，霉菌病，草莓球腔菌(Mycosphaerellafragariae)，鼓膜霉菌病(Myringomycosis)，副球孢子菌病，致病性真菌，青霉菌病，千溃疡病(Thousand cankers disease)，癣，Zeaspora，接合菌病。由寄生虫导致的感染性失调和/或疾病的非限制性实例选自下组，该组由以下各项组成，但不局限于：棘阿米巴属，阿米巴病，蛔虫病，钩虫病，异尖线虫病，巴贝虫病，小袋虫病，Baylisascariasis，Blastocystosis，寄生鲇(Candiru)，美洲锥虫病，支睾吸虫病，锥蝇属(Cochliomyia)，球虫，中国肝吸虫隐孢子虫病，双核阿米巴病(Dientamoebiasis)，裂头绦虫病，肾膨结线虫感染(Dioctophyme renalis infection)，龙线虫病，棘球蚴病，象皮肿，蛲虫病，片吸虫病，姜片虫病，丝虫病，贾弟虫病，腭口线虫病，膜壳绦虫病，片吸虫病综合征(HalzounSyndrome)，等孢球虫病，片山热(Katayama fever)，利什曼病，淋巴丝虫病，疟疾，后殖吸虫病，蝇蛆病，蟠尾丝虫病，虱病，原发性阿米巴脑膜炎，寄生性肺炎，肺吸虫病，疥疮，血吸虫病，昏睡病，类圆线虫病，裂头蚴病，鼻孢子菌病，盘尾丝虫病，绦虫病(囊尾蚴病的原因)，弓蛔虫病，弓形体病，旋毛虫病，滴虫病，鞭虫病，锥体虫病，带虫感染(Tapeworm infection)。
传染病的一个优选实例是由任一以下项导致的疾病：乙型肝炎、丙型肝炎、传染性单核细胞增多症、EBV、巨细胞病毒、AIDS、HIV-1、HIV-2、结核病、疟疾以及血吸虫病。
如在此使用，术语“疫苗”是指改善对一种具体疾病的免疫性的一种生物制剂，其中该疫苗包括一种抗原，例如削弱形式或杀死形式的病原体，引起针对其毒素或其表面蛋白之一的免疫应答。一种疫苗典型地包括一种作为免疫增强剂来刺激免疫系统的佐剂。如在此使用，术语“治疗疫苗”和/或“治疗疫苗接种”是指一种用于治疗持续性疾病(例如传染病或癌症)的疫苗。
如在此使用，术语“佐剂”是指一种用于刺激免疫系统并且增加对一种疫苗的应答、而本身不具有任何特异性抗原作用的试剂。
如在此使用，术语LY6G6F和/或一种或多种LY6G6F蛋白是指在SEQ ID NO：1中所阐明的任一蛋白、和/或其变体、和/或其直向同源物和/或片段、和/或对其进行编码的核酸序列，它们在如在此所列举的癌症和/或在如在此所列举的感染性失调、和/或如在此所列举的免疫相关失调中分化表达，和/或在癌症、和/或在感染性失调、和/或免疫相关失调的病因学中发挥作用。
根据优选实施例，一个LY6G6F片段包括在任一SEQ ID NO：2、59、81、96中所阐明的LY6G6F胞外结构域的氨基酸序列，和/或其变体。根据优选实施例，一种LY6G6F直向同源物包括任一SEQ ID NO：20、29。根据优选实施例，一种编码LY6G6F蛋白的核酸序列包括SEQ IDNO：33、57或182。
如在此使用，术语VSIG10和/或一种或多种VSIG10蛋白是指在任一SEQ ID NO：3、5中所阐明的任一蛋白、和/或其变体、和/或其直向同源物和/或片段、和/或对其进行编码的核酸序列，它们在如在此所列举的癌症和/或在如在此所列举的感染性失调、和/或如在此所列举的免疫相关失调中分化表达，和/或在癌症和/或在感染性失调、和/或免疫相关失调的病因学中发挥作用。
根据优选实施例，一个VSIG10片段包括在任一SEQ ID NO：4、6、60、61、82-93、97-100中所阐明的VSIG10胞外结构域的氨基酸序列，和/或其变体，和/或包括展示于图2A中的VSIG10变体(SEQ ID NO：5)独特边缘部分的氨基酸序列。根据优选实施例，一种VSIG10直向同源物包括任一SEQ ID NO：19、30。根据优选实施例，一种编码VSIG10蛋白的核酸序列包括任一SEQ ID NO：34、35、36、183、或184。
如在此使用，术语TMEM25和/或一种或多种TMEM25蛋白是指在任一SEQ ID NO：7、39中所阐明的任一蛋白、和/或其变体、和/或其直向同源物和/或片段、和/或对其进行编码的核酸序列，它们在如在此所列举的癌症和/或在如在此所列举的感染性失调、和/或如在此所列举的免疫相关失调中分化表达，和/或在癌症和/或在感染性失调、和/或免疫相关失调的病因学中发挥作用。
根据优选实施例，一个TMEM25片段包括在任一SEQ ID NO：8、39、94、101中所阐明的TMEM25胞外结构域的氨基酸序列，和/或其变体。根据优选实施例，一种TMEM25直向同源物包括具有根据任一SEQ ID NO：9、和/或28的序列的蛋白。根据优选实施例，一种编码TMEM25蛋白的核酸序列包括任一SEQ ID NO：37或185。
如在此使用，术语LSR和/或一种或多种LSR蛋白是指在任一SEQ ID NO：11、13、15-18、143中所阐明的任一蛋白、和/或其变体、和/或其直向同源物和/或片段、和/或对其进行编码的核酸序列，它们在如在此所列举的癌症和/或在如在此所列举的感染性失调、和/或如在此所列举的免疫相关失调中分化表达，和/或在癌症和/或在感染性失调、和/或免疫相关失调的病因学中发挥作用。
根据优选实施例，一个LSR片段包括在任一SEQ ID NO：10、12、14、22、47-50、95、102中所阐明的LSR胞外结构域的氨基酸序列，和/或其变体，和/或包括展示于图2G中的LSR变体(SEQ ID NO：18)独特边缘部分的氨基酸序列。LSR直向同源物的一个实例呈现于任一SEQ ID NO：21、31、32中。根据优选实施例，一种编码LSR蛋白的核酸序列包括任一SEQ IDNO：40-46、132、155、188、186、187、145、154。
不希望受单一假设限制，根据本发明的至少一些实施例，每种LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白被预测为一种免疫共刺激蛋白，例如在B7免疫共刺激中涉及的B7蛋白家族成员(包括例如针对癌细胞引起的T细胞应答)，以及引起对免疫性的作用(例如自体免疫作用的触发)的B7蛋白家族成员。
如在此使用，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的“可溶性胞外结构域(ECD)”或“胞外结构域”或“一种或多种可溶性LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白/分子”是指非细胞表面结合的(即循环的)LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR分子或其任何部分，包括但不局限于：LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR-Ig融合蛋白，其中LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的细胞外结构域被融合至一个免疫球蛋白(Ig)部分，使得该融合分子可溶，或其片段和衍生物；具有与一部分生物活性或化学物活性蛋白融合或与其连接的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的细胞外结构域的蛋白，例如乳头状瘤病毒E7基因产物、黑色素瘤相关抗原p97或HIV env蛋白，或其片段和衍生物；杂种(嵌合体)融合蛋白，例如LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR-Ig，或其片段和衍生物。此类融合蛋白在下面更加详细地进行了描述。
“一种或多种可溶性LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白/分子”还包括其中跨膜结构域被除去以使得该蛋白可溶的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR分子，或其片段和衍生物；其片段、部分或衍生物，以及可溶性LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR突变分子。在根据本发明的至少一些实施例所述的方法中使用的可溶性LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR分子可以包括或可以不包括信号(前导序列)肽序列。
LY6G6F多肽的片段
术语LY6G6F的“可溶性胞外结构域(ECD)”或“胞外结构域”或“可溶性”形式还指对LY6G6F“可溶性胞外结构域(ECD)”或“胞外结构域”或“可溶性LY6G6F蛋白/分子”)的相对应的蛋白进行编码的核酸序列。可任选地，LY6G6F ECD是指任一下面的多肽序列和/或任一在下表A中所列的多肽序列，和/或与其拥有至少80％序列同一性，更优选至少90％序列同一性并且甚至更优选至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的其片段或变体，和/或其偶联物，和/或对其进行编码的多核苷酸：
SEQ ID NO：2，氨基酸残基17-234(不包括信号肽，直到跨膜)(图1A)：ADNMQAIYVALGEAVELPCPSPPTLHGDEHLSWFCSPAAGSFTTLVAQVQVGRPAPDPGKPGRESRLRLLGNYSLWLEGSKEEDAGRYWCAVLGQHHNYQNWRVYDVLVLKGSQLSARAADGSPCNVLLCSVVPSRRMDSVTWQEGKGPVRGRVQSFWGSEAALLLVCPGEGLSEPRSRRPRIIRCLMTHNKGVSFSLAASIDASPALCAPSTGWDMP，
以及与其拥有至少80％序列一致性、更优选至少90％序列一致性并且甚至更优选至少95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的其片段和变体。SEQ ID NO：59代表LY6G6FECD(包括信号肽)的一个实例。
表A
可任选地，这个片段具有在SEQ ID NO：1中所阐明的LY6G6F蛋白的细胞外结构域的至少约62个、63个、64个、65个等氨基酸，高达LY6G6F蛋白细胞外结构域的228个氨基酸，可任选地包括长为62个与228个氨基酸之间的任何整数值。优选地，这个片段具有LY6G6F蛋白细胞外结构域的至少约62个以及高达82个氨基酸，可任选地包括长为62个与82个氨基酸之间的任何整数值。还优选地，这个片段具有LY6G6F蛋白细胞外结构域的至少约95个至高达115个氨基酸，可任选地包括长为95个与115个氨基酸之间的任何整数值。还优选地，这个片段具有LY6G6F蛋白细胞外结构域的至少约208个至高达228个氨基酸，可任选地包括长为208个与228个氨基酸之间的任何整数值。更优选地，这个片段是约72个或106个或218个氨基酸。根据本发明的至少一些实施例，LY6G6F片段可以包括或可以不包括一个信号肽序列，并且可以包括或可以不包括来自LY6G6F跨膜结构域的1个、2个、3个、4个、或5个连续氨基酸。
具体地，LY6G6F的细胞外结构域片段可以包括对应于LY6G6F的细胞外结构域的任何部分或包括其IgV结构域的任何序列，该片段具有对应起始于14与27之间的任何位置并且终止于112与132之间的任何位置的LY6G6F(SEQ ID NO：1)的残基的任何序列。
LY6G6F蛋白在细胞外结构域，图1A中的框中示出的IgV结构域(或V结构域)内包含一个免疫球蛋白结构域，该结构域和抗体的可变结构域相关。IgV结构域可以通过类比其他B7家族成员为受体结合负责。细胞外结构域的Ig结构域包括一个形成于结构域内半胱氨酸残基之间的二硫键，该二硫键对这种折叠是典型的并且对结构功能会是重要的。在SEQ IDNO：1中，这些半胱氨酸位于残基35和106处。
在一个实施例中，提供了LY6G6F的一个可溶性片段；如关于融合蛋白的部分在下面更加详细地进行了描述，这样的一个可溶性片段能可任选地被描述为一个第一融合配偶体。有用的片段是保留结合其一种或多种天然受体的能力和/或保留抑制T细胞活化的能力的那些。与全长LY6G6F相比，作为全长LY6G6F的片段的LY6G6F多肽典型地具有结合其一种或多种天然受体的能力和/或抑制T细胞活化的能力的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、100％、或甚至大于100％。可溶性LY6G6F多肽片段是可以从生产细胞脱落、分泌或以另外的方式提取的LY6G6F多肽的片段。在其他实施例中，LY6G6F多肽的可溶性片段包括保留LY6G6F生物活性的LY6G6F细胞外结构域的片段，例如保留结合其一种或多种天然受体的能力和/或保留抑制T细胞活化的能力的片段。该细胞外结构域可以包括来自跨膜结构域的1个、2个、3个、4个、或5个连续氨基酸，和/或来自信号序列的1个、2个、3个、4个、或5个连续氨基酸。可替代地，该细胞外结构域可以有1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸被从C-末端、N-末端、或这两个末端除去。
在一些实施例中，LY6G6F细胞外结构域多肽包括如在任一SEQ ID NO：81中所阐明的IgV结构域的氨基酸序列，或其片段或变体，或位于全长蛋白SEQ ID NO：1的残基35和106处的IgV结构域的保守半胱氨酸之间的区域，这对应于SEQ ID NO：96中所阐明的序列：CPSPPTLHGDEHLSWFCSPAAGSFTTLVAQVQVGRPAPDPGKPGRESRLRLLGNYSLWLEGSKEEDAGRYWC。在其他实施例中，LY6G6F细胞外结构域多肽基本上由如任一SEQ ID NO：81和96中所阐明的IgV结构域的氨基酸序列组成。
通常，LY6G6F多肽片段表达自包括对一个信号序列进行编码的序列的核酸。通常将该信号序列从不成熟的多肽剪切以产生缺少该信号序列的成熟多肽。LY6G6F的信号序列可以使用标准分子生物学技术由另一个多肽的信号序列来替代，以影响该多肽的表达水平、分泌、溶解度、或其他特性。用来替代LY6G6F信号肽序列的信号肽序列可以是本领域已知的任何信号肽序列。
可任选地，LY6G6F ECD是指编码LY6G6F ECD多肽的任一核酸序列，可任选地是指在SEQ ID NO：33中所阐明的核酸序列、或其片段和/或其退化变体，编码SEQ ID NO：2中所阐明的LY6G6F ECD多肽。
可任选地，LY6G6F ECD是指直源性ECD多肽。可任选地，LY6G6F ECD是指SEQ IDNO：20中所阐明的小鼠LY6G6F ECD多肽，和/或SEQ ID NO：23中所阐明的小鼠LY6G6F ECD-IgG2a-Fc-融合多肽。
VSIG10多肽的片段
术语VSIG10的“可溶性胞外结构域(ECD)”或“胞外结构域”或“可溶性”形式还指对VSIG10“可溶性胞外结构域(ECD)”或“胞外结构域”或“可溶性VSIG10蛋白/分子”)的相对应的蛋白进行编码的核酸序列。可任选地，VSIG10 ECD是指任一下面的多肽序列和/或任一在下表B中所列的多肽序列，和/或与其拥有至少80％序列同一性，更优选地至少90％序列同一性并且甚至更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的其片段或变体，和/或其偶联物，和/或对其进行编码的多核苷酸：SEQ ID NO：4，氨基酸残基31-413(不包括信号肽，直到跨膜)(图1B)：VVIGEVHENVTLHCGNISGLRGQVTWYRNNSEPVFLLSSNSSLRPAEPRFSLVDATSLHIESLSLGDEGIYTCQEILNVTQWFQVWLQVASGPYQIEVHIVATGTLPNGTLYAARGSQVDFSCNSSSRPPPVVEWWFQALNSSSESFGHNLTVNFFSLLLISPNLQGNYTCLALNQLSKRHRKVTTELLVYYPPPSAPQCWAQMASGSFMLQLTCRWDGGYPDPDFLWIEEPGGVIVGKSKLGVEMLSESQLSDGKKFKCVTSHIVGPESGASCMVQIRGPSLLSEPMKTCFTGGNVTLTCQVSGAYPPAKILWLRNLTQPEVIIQPSSRHLITQDGQNSTLTIHNCSQDLDEGYYICRADSPVGVREMEIWLSVKEPLNIGG；
SEQ ID NO：6，氨基酸残基31-312(跳跃外显子3变体，不包括信号肽，直到跨膜)(图1C)：VVIGEVHENVTLHCGNISGLRGQVTWYRNNSEPVFLLSSNSSLRPAEPRFSLVDATSLHIESLSLGDEGIYTCQEILNVTQWFQVWLQVANPPPSAPQCWAQMASGSFMLQLTCRWDGGYPDPDFLWIEEPGGVIVGKSKLGVEMLSESQLSDGKKFKCVTSHIVGPESGASCMVQIRGPSLLSEPMKTCFTGGNVTLTCQVSGAYPPAKILWLRNLTQPEVIIQPSSRHLITQDGQNSTLTIHNCSQDLDEGYYICRADSPVGVREMEIWLSVKEPLNIGG，
以及与其拥有至少80％序列一致性、更优选至少90％序列一致性并且甚至更优选至少95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的其变体。SEQ ID NO：60-61代表VSIG10 ECD(包括信号肽)的实例。
表B
可任选地，这个片段具有在SEQ ID NO：3中所阐明的VSIG10蛋白的细胞外结构域的至少约36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个等氨基酸，高达VSIG10蛋白的细胞外结构域的393个氨基酸，可任选地包括长为36个与393个氨基酸之间的任何整数值。优选地，这个片段具有VSIG10蛋白细胞外结构域的至少约36个至高达70个氨基酸，可任选地包括长为36个与70个氨基酸之间的任何整数值。还优选地，这个片段具有VSIG10蛋白细胞外结构域的至少约80个至高达100个氨基酸，可任选地包括长为80个与100个氨基酸之间的任何整数值。还优选地，这个片段具有VSIG10蛋白细胞外结构域的至少约170个至高达200个氨基酸，可任选地包括长为170个与200个氨基酸之间的任何整数值。还优选地，这个片段具有VSIG10蛋白细胞外结构域的至少约265个至高达290个氨基酸，可任选地包括长为265个与290个氨基酸之间的任何整数值。还优选地，这个片段具有VSIG10蛋白细胞外结构域的至少约365个至高达393个氨基酸，可任选地包括长为365个与393个氨基酸之间的任何整数值。更优选地，这个片段是约46个、49个、58个、60个、87个、89个、93个、94个、178个、182个、185个、187个、273个、279个、282个、374个、383个氨基酸。根据本发明的至少一些实施例，VSIG10片段可以包括或可以不包括一个信号肽序列，并且可以包括或可以不包括来自VSIG10跨膜结构域的1个、2个、3个、4个、或5个连续氨基酸。
具体地，VSIG10的细胞外结构域的片段可以包括任何对应于VSIG10的细胞外结构域的任何部分或包括其一个或多个IgC2结构域的序列，它们具有对应于以下的VSIG10(SEQID NO：3)的残基的任何序列：起始于28与41之间的任何位置并且终止于109与122之间的任何位置或起始于120与133之间的任何位置并且终止于205与222之间的任何位置或起始于216与233之间的任何位置并且终止于299与310之间的任何位置或起始于310与321之间的任何位置并且终止于394与414之间的任何位置或起始于28与41之间的任何位置并且终止于205与222之间的任何位置或起始于28与41之间的任何位置并且终止于299与310之间的任何位置或起始于28与41之间的任何位置并且终止于394与414之间的任何位置或起始于120与133之间的任何位置并且终止于299与310之间的任何位置或起始于120与133之间的任何位置并且终止于394与414之间的任何位置或起始于216与233之间的任何位置并且终止于394与414之间的任何位置；或具有对应于以下的VSIG10_变体_跳跃_外显子_3_T95617_P6(SEQ ID NO：5)的残基的任何序列：起始于28与41之间的任何位置并且终止于198与209之间的任何位置或起始于28与41之间的任何位置并且终止于293与313之间的任何位置。
VSIG10蛋白在细胞外结构域内包含一个免疫球蛋白结构域，IgC2结构域(或Ig-样C2结构域或Ig C2-固定结构域)，该免疫球蛋白结构域和抗体的恒定结构域相关。这些结构域图示于图1B(针对SEQ ID NO：3)和图1C(针对SEQ ID NO：5)中。细胞外结构域的Ig结构域包括一个形成于结构域内半胱氨酸残基之间的二硫键，该二硫键对这种折叠是典型的并且对结构功能会是重要的。在SEQ ID NO：3中，这些半胱氨酸位于残基44和103处以及残基153和201处以及残基245和290处以及残基331和388处。在SEQ ID NO：5中，这些半胱氨酸位于残基44和103处以及残基144和189处以及残基230和287处。
在一个实施例中，提供了VSIG10的一个可溶性片段，该可溶性片段能可任选地在下面关于融合蛋白的部分被描述为一个第一融合配偶体。有用的片段是保留结合其一种或多种受体的能力和/或保留抑制T细胞活化的能力的那些。与全长VSIG10相比，作为全长VSIG10的片段的VSIG10多肽典型地具有结合其一种或多种天然受体的能力和/或抑制T细胞活化的能力的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、100％、或甚至大于100％。可溶性VSIG10多肽片段是可以从生产细胞脱落、分泌或以另外的方式提取的VSIG10多肽的片段。在其他实施例中，VSIG10多肽的可溶性片段包括保留VSIG10的生物活性的VSIG10细胞外结构域的片段，例如保留结合其一种或多种天然受体的能力和/或保留抑制T细胞活化的能力的片段。该细胞外结构域可以包括来自跨膜结构域的1个、2个、3个、4个、或5个连续氨基酸，和/或来自信号序列的1个、2个、3个、4个、或5个连续氨基酸。可替代地，该细胞外结构域可以有1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸被从C-末端、N-末端、或这两个末端除去。
在一些实施例中，VSIG10细胞外结构域多肽包括如在任一SEQ ID NO：82、83、84以及85中所阐明的IgC2结构域中至少之一的氨基酸序列，或其片段或变体，或位于全长蛋白SEQ ID NO：3的残基44和103处的IgC2结构域的保守半胱氨酸之间的区域，对应于SEQ IDNO：97中所阐明的序列：CGNISGLRGQVTWYRNNSEPVFLLSSNSSLRPAEPRFSLVDATSLHIESLSLGDEGIYTC，或位于全长蛋白SEQ ID NO：3的残基153和201处的IgC2结构域的保守半胱氨酸之间的区域，对应于SEQ ID NO：98中所阐明的序列：CNSSSRPPPVVEWWFQALNSSSESFGHNLTVNFFSLLLISPNLQGNYTC或位于全长蛋白SEQ ID NO：3的残基245和209处的IgC2结构域的保守半胱氨酸之间的区域，这对应于SEQ ID NO：99中所阐明的序列：CRWDGGYPDPDFLWIEEPGGVIVGKSKLGVEMLSESQLSDGKKFKC或位于全长蛋白SEQ ID NO：3的残基331和388处的IgC2结构域的保守半胱氨酸之间的区域，这对应于SEQ ID NO：100中所阐明的序列：CQVSGAYPPAKILWLRNLTQPEVIIQPSSRHLITQDGQNSTLTIHNCSQDLDEGYYIC。在一些另外的实施例中，VSIG10细胞外结构域多肽基本上由SEQ ID NO：82-93、97-100中至少之一的氨基酸序列组成。
通常，VSIG10多肽片段表达自包括对一个信号序列进行编码的序列的核酸。通常将该信号序列从不成熟的多肽剪切以产生缺少该信号序列的成熟多肽。VSIG10的信号序列可以使用标准分子生物学技术由另一个多肽的信号序列来替代，以影响该多肽的表达水平、分泌、溶解度、或其他特性。用来替代VSIG10信号肽序列的信号肽序列可以是本领域已知的任何信号肽序列。
可任选地，VSIG10 ECD还指编码VSIG10 ECD多肽的任一核酸序列，可任选地是指在SEQ ID NO：34、36中所阐明的核酸序列、或其片段和/或其退化变体，分别编码SEQ IDNO：4、6中所阐明的VSIG10 ECD多肽。
可任选地，VSIG10 ECD是指直源性ECD多肽。可任选地，VSIG10 ECD是指SEQ IDNO：19中所阐明的小鼠VSIG10 ECD多肽，和/或SEQ ID NO：24中所阐明的小鼠VSIG10 ECD-IgG2a-Fc-融合多肽。
TMEM25多肽的片段
术语TMEM25的“可溶性胞外结构域(ECD)”或“胞外结构域”或“可溶性”形式还指对TMEM25“可溶性胞外结构域(ECD)”或“胞外结构域”或“可溶性TMEM25蛋白/分子”)的相对应的蛋白进行编码的核酸序列。可任选地，TMEM25 ECD是指任一下面的多肽序列和/或任一在下表C中所列的多肽序列，和/或与其拥有至少80％序列同一性，更优选地至少90％序列同一性并且甚至更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的其片段或变体，和/或其偶联物，和/或对其进行编码的多核苷酸：SEQ ID NO：8，氨基酸残基27-232(不包括信号肽，直到跨膜)(图1D)：ELEPQIDGQTWAERALRENERHAFTCRVAGGPGTPRLAWYLDGQLQEASTSRLLSVGGEAFSGGTSTFTVTAHRAQHELNCSLQDPRSGRSANASVILNVQFKPEIAQVGAKYQEAQGPGLLVVLFALVRANPPANVTWIDQDGPVTVNTSDFLVLDAQNYPWLTNHTVQLQLRSLAHNLSVVATNDVGVTSASLPAPGLLATRVE，
以及与其拥有至少80％序列一致性、更优选至少90％序列一致性并且甚至更优选至少95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的其变体。SEQ ID NO：39代表TMEM25 ECD(包括信号肽)的实例。
表C
可任选地，这个片段具有在SEQ ID NO：7中所阐明的TMEM25蛋白的细胞外结构域的至少约46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个等氨基酸，高达TMEM25蛋白的细胞外结构域的216个氨基酸，可任选地包括长为46个与216个氨基酸之间的任何整数值。优选地，这个片段具有TMEM25蛋白细胞外结构域的至少约46个至高达66个氨基酸，可任选地包括长为46个与66个氨基酸之间的任何整数值。还优选地，这个片段具有TMEM25蛋白细胞外结构域的至少约84个至高达104个氨基酸，可任选地包括长为84个与104个氨基酸之间的任何整数值。还优选地，这个片段具有TMEM25蛋白细胞外结构域的至少约196个至高达216个氨基酸，可任选地包括长为196个与216个氨基酸之间的任何整数值。更优选地，这个片段是约56个或94个或206个氨基酸。根据本发明的至少一些实施例，TMEM25片段可以包括或可以不包括一个信号肽序列，并且可以包括或可以不包括来自TMEM25跨膜结构域的1个、2个、3个、4个、或5个连续氨基酸。
具体地，TMEM25的细胞外结构域片段可以包括任何对应于TMEM25的细胞外结构域的任何部分或包括其IgC2结构域的序列，该片段具有任何对应起始于27与40之间的任何位置并且终止于113与133之间的任何位置的TMEM25(SEQ ID NO：7)的残基的序列。
TMEM25蛋白在细胞外结构域的IgC2结构域(或Ig-样C2结构域或Ig C2-固定结构域)内包含一个免疫球蛋白结构域，该结构域和抗体的恒定结构域相关。该结构域示于图1D中的框中。细胞外结构域的Ig结构域包括一个形成于结构域内半胱氨酸残基之间的二硫键，该二硫键对这种折叠是典型的并且对结构功能会是重要的。在SEQ ID NO：7中，这些半胱氨酸位于残基52和107处。
在一个实施例中，提供了TMEM25的一个可溶性片段，该可溶性片段能可任选地例如在下面关于融合蛋白的细节部分被描述为一个第一融合配偶体。有用的片段是保留结合其一种或多种受体的能力和/或保留抑制T细胞活化的能力的那些。与全长TMEM25相比，作为全长TMEM25的片段的TMEM25多肽典型地具有结合其一种或多种天然受体的能力和/或抑制T细胞活化的能力的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、100％、或甚至大于100％。可溶性TMEM25多肽片段是可以从生产细胞脱落、分泌或以另外的方式提取的TMEM25多肽的片段。在其他实施例中，TMEM25多肽的可溶性片段包括保留TMEM25的生物活性的TMEM25细胞外结构域的片段，例如保留结合其一种或多种天然受体的能力和/或保留抑制T细胞活化的能力的片段。该细胞外结构域可以包括来自跨膜结构域的1个、2个、3个、4个、或5个连续氨基酸，和/或来自信号序列的1个、2个、3个、4个、或5个连续氨基酸。可替代地，该细胞外结构域可以有1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸被从C-末端、N-末端、或这两个末端除去。
在一些实施例中，TMEM25细胞外结构域多肽包括如在任一SEQ ID NO：94中所阐明的IgC2结构域的氨基酸序列，或其片段或变体，或位于全长蛋白SEQ ID NO：7的残基52和107处的IgC2结构域的保守半胱氨酸之间的区域，这对应于SEQ ID NO：101中所阐明的序列：CRVAGGPGTPRLAWYLDGQLQEASTSRLLSVGGEAFSGGTSTFTVTAHRAQHELNC。在其他实施例中，TMEM25细胞外结构域多肽基本上由如任一SEQ ID NO：94和101中所阐明的IgC2结构域的氨基酸序列组成。
通常，TMEM25多肽片段表达自包括对一个信号序列进行编码的序列的核酸。通常将该信号序列从不成熟的多肽剪切以产生缺少该信号序列的成熟多肽。TMEM25的信号序列可以使用标准分子生物学技术由另一个多肽的信号序列来替代，以影响该多肽的表达水平、分泌、溶解度、或其他特性。用来替代TMEM25信号肽序列的信号肽序列可以是本领域已知的任何信号肽序列。
可任选地，TMEM25 ECD还指编码TMEM25 ECD多肽的任一核酸序列，可任选地是指在SEQ ID NO：37中所阐明的核酸序列、或其片段和/或其退化变体，编码SEQ ID NO：8中所阐明的TMEM25 ECD多肽。
可任选地，TMEM25 ECD是指直源性ECD多肽。可任选地，TMEM25 ECD是指SEQ IDNO：9中所阐明的小鼠TMEM25 ECD多肽，和/或SEQ ID NO：25中所阐明的小鼠TMEM25 ECD-IgG2a-Fc-融合多肽。
LSR多肽的片段
术语LSR的“可溶性胞外结构域(ECD)”或“胞外结构域”或“可溶性”形式还指对LSR“可溶性胞外结构域(ECD)”或“胞外结构域”或“可溶性LSR蛋白/分子”)的相对应的蛋白进行编码的核酸序列。可任选地，LSR ECD是指任一下面的多肽序列和/或任一在下表D中所列的多肽序列，和/或与其拥有至少80％序列同一性，更优选地至少90％序列同一性并且甚至更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的其片段或变体，和/或其偶联物，和/或对其进行编码的多核苷酸：
SEQ ID NO：12，LSR同种型A ECD(不包括信号肽，直到跨膜)氨基酸残基42-211(图1E)：IQVTVSNPYHVVILFQPVTLPCTYQMTSTPTQPIVIWKYKSFCRDRIADAFSPASVDNQLNAQLAAGNPGYNPYVECQDSVRTVRVVATKQGNAVTLGDYYQGRRITITGNADLTFDQTAWGDSGVYYCSVVSAQDLQGNNEAYAELIVLGRTSGVAELLPG FQAGPIED；
SEQ ID NO：14，LSR同种型B ECD(不包括信号肽，直到跨膜)氨基酸残基42-192(图1F)：IQVTVSNPYHVVILFQPVTLPCTYQMTSTPTQPIVIWKYKSFCRDRIADAFSPASVDNQLNAQLAAGNPGYNPYVECQDSVRTVRVVATKQGNAVTLGDYYQGRRITITGNADLTFDQTAWGDSGVYYCSVVSAQDLQGNNEAYAELIVLD；
SEQ ID NO：47，LSR同种型C分泌变体，氨基酸残基42-533(图1G)：IQVTVSNPYHVVILFQPVTLPCTYQMTSTPTQPIVIWKYKSFCRDRIADAFSPASVDNQLNAQLAAGNPGYNPYVECQDSVRTVRVVATKQGNAVTLGDYYQGRRITITGNADLTFDQTAWGDSGVYYCSVVSAQDLQGNNEAYAELIVLVYAAGKAATSGVPSIYAPSTYAHLSPAKTPPPPAMIPMGPAYNGYPGGYPGDVDRSSSAGGQGSYVPLLRDTDSSVASEVRSGYRIQASQQDDSMRVLYYMEKELANFDPSRPGPPSGRVERAMSEVTSLHEDDWRSRPSRGPALTPIRDEEWGGHSPRSPRGWDQEPAREQAGGGWRARRPRARSVDALDDLTPPSTAESGSRSPTSNGGRSRAYMPPRSRSRDDLYDQDDSRDFPRSRDPHYDDFRSRERPPADPRSHHHRTRDPRDNGSRSGDLPYDGRLLEEAVRKKGSEERRRPHKEEEEEAYYPPAPPPYSETDSQASRERRLKKNLALSRESLVV；
SEQ ID NO：48，LSR同种型D分泌变体，氨基酸残基42-532(图1H)：IQVTVSNPYHVVILFQPVTLPCTYQMTSTPTQPIVIWKYKSFCRDRIADAFSPASVDNQLNAQLAAGNPGYNPYVECQDSVRTVRVVATKQGNAVTLGDYYQGRRITITGNADLTFDQTAWGDSGVYYCSVVSAQDLQGNNEAYAELIVLVYAAGKAATSGVPSIYAPSTYAHLSPAKTPPPPAMIPMGPAYNGYPGGYPGDVDRSSSAGGQGSYVPLLRDTDSSVASVRSGYRIQASQQDDSMRVLYYMEKELANFDPSRPGPPSGRVERAMSEVTSLHEDDWRSRPSRGPALTPIRDEEWGGHSPRSPRGWDQEPAREQAGGGWRARRPRARSVDALDDLTPPSTAESGSRSPTSNGGRSRAYMPPRSRSRDDLYDQDDSRDFPRSRDPHYDDFRSRERPPADPRSHHHRTRDPRDNGSRSGDLPYDGRLLEEAVRKKGSEERRRPHKEEEEEAYYPPAPPPYSETDSQASRERRLKKNLALSRESLVV；
SEQ ID NO：49，LSR同种型E分泌变体，氨基酸残基42-493(图1I)：IQVTVSNPYHVVILFQPVTLPCTYQMTSTPTQPIVIWKYKSFCRDRIADAFSPASVDNQLNAQLAAGNPGYNPYVECQDSVRTVRVVATKQGNAVTLGDYYQGRRITITGMYAAGKAATSGVPSIYAPSTYAHLSPAKTPPPPAMIPMGPAYNGYPGGYPGDVDRSSSAGGQGSYVPLLRDTDSSVASEVRSGYRIQASQQDDSMRVLYYMEKELANFDPSRPGPPSGRVERAMSEVTSLHEDDWRSRPSRGPALTPIRDEEWGGHSPRSPRGWDQEPAREQAGGGWRARRPRARSVDALDDLTPPSTAESGSRSPTSNGGRSRAYMPPRSRSRDDLYDQDDSRDFPRSRDPHYDDFRSRERPPADPRSHHHRTRDPRDNGSRSGDLPYDGRLLEEAVRKKGSEERRRPHKEEEEEAYYPPAPPPYSETDSQASRERRLKKNLALSRESLVV；
SEQ ID NO：50，LSR同种型F分泌变体，氨基酸残基42-552(图1J)：IQVTVSNPYHVVILFQPVTLPCTYQMTSTPTQPIVIWKYKSFCRDRIADAFSPASVDNQLNAQLAAGNPGYNPYVECQDSVRTVRVVATKQGNAVTLGDYYQGRRITITGNADLTFDQTAWGDSGVYYCSVVSAQDLQGNNEAYAELIVLGRTSGVAELLPGFQAGPIEVYAAGKAATSGVPSIYAPSTYAHLSPAKTPPPPAMIPMGPAYNGYPGGYPGDVDRSSSAGGQGSYVPLLRDTDSSVASEVRSGYRIQASQQDDSMRVLYYMEKELANFDPSRPGPPSGRVERAMSEVTSLHEDDWRSRPSRGPALTPIRDEEWGGHSPRSPRGWDQEPAREQAGGGWRARRPRARSVDALDDLTPPSTAESGSRSPTSNGGRSRAYMPPRSRSRDDLYDQDDSRDFPRSRDPHYDDFRSRERPPADPRSHHHRTRDPRDNGSRSGDLPYDGRLLEEAVRKKGSEERRRPHKEEEEEAYYPPAPPPYSETDSQASRERRLKKNLALSRESLVV，
以及与其拥有至少80％序列一致性、更优选至少90％序列一致性并且甚至更优选至少95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的其变体。SEQ ID NO：10、22代表LSR ECD(包括信号肽)的实例。
可任选地，这个片段具有在SEQ ID NO：11和/或143中所阐明的LSR蛋白的细胞外结构域的至少约100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个等氨基酸，高达细胞外结构域的198个氨基酸，可任选地包括长为100个与198个氨基酸之间的任何整数值。根据本发明的至少一些实施例，LSR片段可以包括或可以不包括一个信号肽序列，并且可以包括或可以不包括来自LSR跨膜结构域的1个、2个、3个、4个、或5个连续氨基酸。
表D
可任选地，这个片段具有在SEQ ID NO：11中所阐明的LSR蛋白的细胞外结构域的至少约98个、99个、100个、101个、102个等氨基酸，高达LSR蛋白的细胞外结构域的180个氨基酸，可任选地包括长为98个与180个氨基酸之间的任何整数值。优选地，这个片段具有LSR蛋白细胞外结构域的至少约98个至高达118个氨基酸，可任选地包括长为98个与118个氨基酸之间的任何整数值。还优选地，这个片段具有LSR蛋白细胞外结构域的至少约135个至高达155个氨基酸，可任选地包括长为135个与155个氨基酸之间的任何整数值。还优选地，这个片段具有LSR蛋白细胞外结构域的至少约160个至高达180个氨基酸，可任选地包括长为160个与180个氨基酸之间的任何整数值。更优选地，这个片段是约108个或145个或170个氨基酸。根据本发明的至少一些实施例，LSR片段可以包括或可以不包括一个信号肽序列，并且可以包括或可以不包括来自LSR跨膜结构域的1个、2个、3个、4个、或5个连续氨基酸。
LSR蛋白在细胞外结构域的IgV结构域(或V结构域)中包含一个免疫球蛋白结构域，该结构域和抗体的可变结构域相关。分别针对SEQ ID NO：11、13、15、16、以及18的Ig结构域示于图1E、1F、1G、1H、以及1J中的框中。细胞外结构域的Ig结构域包括一个形成于结构域内半胱氨酸残基之间的二硫键，该二硫键对这种折叠是典型的并且对结构功能会是重要的。在SEQ ID NO：11中，这些半胱氨酸位于残基63和170处。
在一个实施例中，提供了LSR的一个可溶性片段，该可溶性片段能可任选地例如在下面关于融合蛋白的部分被描述为一个第一融合配偶体。有用的片段是保留结合其一种或多种受体的能力和/或保留抑制T细胞活化的能力的那些。与全长LSR相比，作为全长LSR的片段的LSR多肽典型地具有结合其一种或多种天然受体的能力和/或抑制T细胞活化的能力的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、100％、或甚至大于100％。可溶性LSR多肽片段是可以从生产细胞脱落、分泌或以另外的方式提取的LSR多肽的片段。在其他实施例中，LSR多肽的可溶性片段包括保留LSR的生物活性的LSR细胞外结构域的片段，例如保留结合其一种或多种天然受体的能力和/或保留抑制T细胞活化的能力的片段。该细胞外结构域可以包括来自跨膜结构域的1个、2个、3个、4个、或5个连续氨基酸，和/或来自信号序列的1个、2个、3个、4个、或5个连续氨基酸。可替代地，该细胞外结构域可以有1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸被从C-末端、N-末端、或这两个末端除去。
在一些实施例中，LSR细胞外结构域多肽包括如在任一SEQ ID NO：95中所阐明的IgV结构域的氨基酸，或其片段或变体，或位于全长蛋白SEQ ID NO：11的残基63和170处的IgV结构域的保守半胱氨酸之间的区域，这对应于SEQ ID NO：102中所阐明的序列：CTYQMTSTPTQPIVIWKYKSFCRDRIADAFSPASVDNQLNAQLAAGNPGYNPYVECQDSVRTVRVVATKQGNAVTLGDYYQGRRITITGNADLTFDQTAWGDSGVYYC。
在一些另外的实施例中，LSR细胞外结构域多肽基本上由如任一SEQ ID NO：95、和SEQ ID NO：102中所阐明的IgV结构域的氨基酸组成。
通常，LSR多肽片段表达自包括对一个信号序列进行编码的序列的核酸。通常将该信号序列从不成熟的多肽剪切以产生缺少该信号序列的成熟多肽。LSR的信号序列可以使用标准分子生物学技术由另一个多肽的信号序列来替代，以影响该多肽的表达水平、分泌、溶解度、或其他特性。用来替代LSR信号肽序列的信号肽序列可以是本领域已知的任何信号肽序列。
可任选地，LSR ECD还指编码LSR ECD多肽的任一核酸序列，可任选地是指在SEQID NO：40、41、132、44、155、188中所阐明的核酸序列、或其片段和/或其退化变体，分别编码SEQ ID NO：12、14、47、48、49、50中所阐明的LSR ECD多肽。
可任选地，LSR ECD是指直源性ECD多肽。可任选地，LSR ECD是指SEQ ID NO：21中所阐明的小鼠LSR ECD多肽，和/或SEQ ID NO：26中所阐明的小鼠LSR ECD-IgG2a-Fc-融合多肽。
LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽的变体
本发明涵盖LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽的有用变体，包括如在此所描述的任何测定所指示增加生物活性，或增加该蛋白的半衰期或稳定性的那些变体。可溶性LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白或片段，或具有LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白活性的其融合物可以被分别工程化以增加生物活性。在一个另外的实施例中，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白或融合蛋白是通过增加该分子与免疫细胞(例如T细胞)的结合并且将一个抑制信号传输至该T细胞中的至少一种氨基酸取代、缺失或插入来修饰的。其他任选的变体是被工程化以便相对于其他免疫细胞选择性地结合至一种类型T细胞的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白。例如，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽可以被工程化以便可任选地结合至Treg、Th0、Th1、Th17、Th2或Th22细胞。优先结合是指对于一种类型的细胞超过另一种类型的细胞至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大的结合。LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的仍其他变体可以被工程化以便相对于野生型LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白，对免疫细胞分别具有减少的结合。这些变体可与具有更强的结合特性的变体组合使用以便以中度影响来调节免疫应答。
还可任选地，变体LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白可以被工程化以便相对于野生型具有增加的半衰期。这些变体典型地经过修饰以便抵抗酶性降解。示例性修饰包括抵抗酶性降解的修饰的氨基酸残基以及修饰的肽键。实现这一目标的各种修饰是本领域中已知的。
LY6G6F蛋白(SEQ ID NO：1)也具有如在表E中所列的下列非沉默SNP(单核苷酸多态性)，(根据其在氨基酸序列上的位置来给出，其中列出替代氨基酸)，在LY6G6F蛋白(SEQID NO：1)序列中存在的SNP为根据本发明所述的这种蛋白的一种或多种替代序列提供支持。SEQ ID NO：58是这样一种替代序列的一个实例，具有使用下面的SNP的部分的替代氨基酸。
表E-氨基酸突变
LSR蛋白(SEQ ID NO：11)也具有如在表F中所列的下列非沉默SNP(单核苷酸多态性)，(根据其在氨基酸序列上的位置来阐明，其中列出替代氨基酸)，在LSR蛋白(SEQ IDNO：11)序列中存在的SNP为根据本发明所述的这种蛋白的一种或多种替代序列提供支持。SEQ ID NO：143是这样一种替代序列的一个实例，具有使用下面的SNP的部分的替代氨基酸。
表F-氨基酸突变
VSIG10蛋白(SEQ ID NO：3)也具有如在表G中所列的下列非沉默SNP(单核苷酸多态性)，(根据其在氨基酸序列上的位置来阐明，其中列出替代氨基酸)，在VSIG10蛋白(SEQID NO：3)序列中存在的SNP为根据本发明所述的这种蛋白的一种或多种替代序列提供支持。
表G-氨基酸突变
氨基酸序列上的SNP位置 替代氨基酸
333 V-＞M
435 H-＞Y
TMEM25蛋白(SEQ ID NO：7)也具有如在表H中所列的下列非沉默SNP(单核苷酸多态性)，(根据其在氨基酸序列上的位置来阐明，其中列出替代氨基酸)，在TMEM25蛋白(SEQID NO：7)序列中存在的SNP为根据本发明所述的这种蛋白的一种或多种替代序列提供支持。
表H-氨基酸突变
氨基酸序列上的SNP位置 替代氨基酸
25 W-＞C
342 Q-＞R
本发明的不同方面在以下小节中进一步详细描述。
核酸
“核酸片段”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”在此可互换地使用，来指代一种核酸残基的聚合物。本发明的多核苷酸序列是指单或双链核酸序列，它以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，以上的组合)形式分离和提供。
因此，本发明涵盖在上文中描述的核酸序列；其片段、与其杂交的序列、与其同源的序列[例如与在此阐明的核酸序列至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％或更大程度一致]、编码具有不同密码子使用的类似多肽的序列、以一个或多个核苷酸的天然发生的或者随机亦或以靶向方式人工诱导的突变为特征的改变序列，所述突变例如缺失、插入或取代。本发明还涵盖包括本发明的多核苷酸独特的序列区的同源核酸序列(即，形成本发明的多核苷酸序列的一部分)。
因此，本发明还涵盖由本发明的多核苷酸序列编码的多肽。本发明还涵盖这些多肽的同系物，这类同系物可与以下阐明的氨基酸序列至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％或更大程度同源，如可使用国家生物技术信息中心(National Center ofBiotechnology Information；NCBI)的BlastP软件使用缺省参数来确定的。如在上文中提到的，本发明的生物分子序列可有效地用作组织或病理标记以及作为治疗或预防疾病的假定药物或药物靶标。
被设计成针对在此提供的任何序列来进行本发明方法(如上所述来设计)的寡核苷酸可根据在本领域中已知的任何寡核苷酸合成法，例如酶促合成或固相合成来产生。根据本发明的这一方面使用的寡核苷酸是具有选自从约10至约200个碱基、优选地从约15至约150个碱基、更优选地从约20至约100个碱基、最优选地从约20至约50个碱基的范围的长度的那些寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸可包含由嘌呤和嘧啶碱基组成的杂环核苷，这些碱基以3′至5′磷酸二酯键来键结。
优选的寡核苷酸是在骨架、核苷间键或碱基中经过修饰的那些寡核苷酸，如下文中广泛描述。这类修饰可时常促进寡核苷酸吸收以及对于细胞内条件的抵抗性。
根据本发明的这一方面使用的优选寡核苷酸的具体实例包括包含经过修饰的骨架或非天然核苷间键的寡核苷酸。具有经过修饰的骨架的寡核苷酸包括在该骨架中保留一个磷原子的那些寡核苷酸，如美国专利号：4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；以及5,625,050中所披露的。
优选的修饰的寡核苷酸骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基以及其他烷基膦酸酯(包括3′-亚烷基膦酸酯以及手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯以及氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基膦酸三酯，以及具有正常3′-5′键、这些键的2′-5′连接类似物的硼烷磷酸酯，以及具有其中相邻对的核苷单位以3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′来连接的反向极性的那些硼烷磷酸酯。也可使用不同盐、混合盐以及游离酸形式。
可替代地，其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸骨架具有通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子以及烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些骨架包括具有吗啉键(部分地由核苷的糖部分形成)的那些骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜以及砜骨架；甲酰基以及硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基以及硫代甲酰基骨架；包含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基以及亚甲基肼基骨架；磺酸酯以及磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S以及CH2组成部分的其他骨架，如在美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439中所披露。
根据本发明可使用的其他寡核苷酸是核苷酸单位的糖和核苷间键(即，骨架)替换为新颖的基团而修饰的那些寡核苷酸。保持碱基单位以便与适当的多核苷酸目标互补。这类寡核苷酸模拟物的实例包括肽核酸(PNA)。PNA寡核苷酸是指其中糖-骨架替换为包含酰胺的骨架，特别是氨乙基甘氨酸骨架的寡核苷酸。碱基得以保持并且直接或间接地结合至骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。传授PNA化合物的制备的美国专利包括但不局限于美国专利号5,539,082；5,714,331；以及5,719,262，它们各自通过引用结合在此。可用于本发明的其他骨架修饰披露于美国专利号：6,303,374中。
本发明的寡核苷酸还可包括碱基修饰或取代。如在此使用，“未修饰的”或“天然的”碱基包括嘌呤碱腺嘌呤(A)和乌嘌呤(G)，以及嘧啶碱胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。修饰碱基包括但不局限于其他合成以及天然碱基例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶以及2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶以及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-氢硫基、8-硫烷基、8-羟基以及其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基尤其5-溴、5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的碱基包括在美国专利号：3,687,808中披露的那些碱基、在《聚合物科学与工程简明百科全书》(The ConciseEncyclopedia Of Polymer Science and Engineering)，第858-859页，克洛舍维奇(Kroschwitz)，J.I.编辑，约翰威利父子出版公司(John Wiley and Sons)，1990年中披露的那些碱基、在恩利施(Englisch)等人，《应用化学》(Angewandte Chemie)，国际版，1991，30，613中披露的那些碱基、以及在赛格维(Sanghvi)，Y.S.，第15章，《反义研究与应用》(Antisense Research and Applications)，第289-302页，克鲁克(Crooke)，S.T.和拉布列(Lebleu)，B.编辑，CRC出版社，1993中披露的那些碱基。这类碱基尤其适用于增加根据本发明的至少一些实施例所述的低聚化合物的结合亲和性。这些碱基包括5-取代嘧啶、6-氮嘧啶以及N-2、N-6以及O-6取代嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已经示出5-甲基胞嘧啶取代可将核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃[桑格维(Sanghvi)YS等人(1993)《反义研究与应用》(Antisense Research and Applications)，CRC出版社，博卡拉顿(Boca Raton)276-278]，并且是目前优选的碱基取代，甚至更具体地当与2′-O-甲氧基乙基糖修饰结合时。
根据本发明的至少一些实施例，寡核苷酸的另一种修饰涉及将增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收的一种或多种部分或偶联物化学连接至该寡核苷酸。这类部分包括但不局限于脂质部分(例如胆固醇部分)、胆酸、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醚)、巯基胆固醇、脂肪链(例如十二烷二醇或十一基残基)、磷脂(例如二-十六基-rac-甘油或1，2-二-O-十六基-rac-甘油-3-H-膦酸三乙基铵)、多胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸、棕榈基部分，或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分，如美国专利号：6,303,374中所披露。
不需要给定寡核苷酸分子中的所有位置被均匀地修饰，并且事实上多于一种的上述修饰可并入单一化合物中或甚至一个寡核苷酸内的单一核苷处。
肽
术语“多肽”、“肽”以及“蛋白”在此可互换地使用，来指代一种氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然发生氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，以及天然发生的氨基酸聚合物。多肽可例如通过添加碳水化合物残基以便形成糖蛋白来修饰。术语“多肽”、“肽”以及“蛋白”包括糖蛋白、以及非糖蛋白。
多肽产物可例如通过使用标准固相技术来生化合成。这类方法包括排阻固相合成、部分固相合成方法、片段缩合、经典溶液合成。这些方法优选地当肽相对较短(即，10kDa)和/或当它不能通过重组技术来产生(即，未由核酸序列来编码)并且因此涉及不同化学时使用。
固相多肽合成程序在本领域中是熟知的，并且进一步由约翰 莫罗 斯图尔特(John Morrow Stewart)以及詹尼斯 迪拉哈 杨(Janis Dillaha Young)，《固相肽合成》(Solid Phase Peptide Syntheses)(第2版，Pierce Chemical Company公司，1984)描述。
合成多肽可以通过制备型高效液相色谱法进行纯化[克赖顿(Creighton T.)(1983)《蛋白，结构和分子原理》(Proteins，structures and molecular principles).弗里曼(WH Freeman)和Co.N.Y.]并且其组合物可以经由氨基酸测序进行确认。
在希望大量的多肽的情况下，可以通过例如由以下所描述的重组技术来产生：毕特尔(Bitter)等人，(1987)《酶学方法》(Methods in Enzymol)，153：516-544，斯迪友迪尔(Studier)等人(1990)《酶学方法》(Methods in Enzymol)，185：60-89，布里松(Brisson)等人(1984)《自然》(Nature)310：511-514，高松(Takamatsu)等人(1987)《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)6：307-311，科鲁茨(Coruzzi)等人(1984)《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)3：1671-1680以及布罗利(Brogli)等人，(1984)《科学》(Science)224：838-843，格利(Gurley)等人(1986)《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)6：559-565。
将理解，根据本发明的传授内容鉴定的肽可以是降解产物、合成肽或重组肽以及拟肽物，典型地是作为肽类似物的合成肽以及类肽以及半类肽，它们可具有例如使得肽在处于体内时更稳定或更能够渗透至细胞中的修饰。这类修饰包括但不局限于N末端修饰、C末端修饰、肽键修饰(包括但不局限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH)、骨架修饰以及残基修饰。用于制备拟肽物化合物的方法在本领域中是熟知的，并且在例如定量药物设计(Quantitative Drug Design)，C.A.Ramsden(拉姆斯登)Gd.，第17.2章，F.Choplin Pergamon Press出版社(1992)中加以规定，该文献通过引用结合在此，如同完全在此阐明一样。此方面的进一步细节提供于下文。
肽内的肽键(-CO-NH-)可例如被以下键取代：N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)(其中R是任何烷基例如甲基)、carba键(-CH2-NH-)、羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯系双键(-CH＝CH-)、逆向酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是天然呈现于碳原子上的“正常”侧链。
这些修饰可沿着肽链在任何键处出现并且甚至同时在若干(2-3)个键处出现。
天然芳香族氨基酸Trp、Tyr以及Phe可由合成非天然酸来取代，所述合成非天然酸例如苯甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或o-甲基-Tyr。
除了上述以外，本发明的肽还可包含一种或多种修饰氨基酸或一种或多种非氨基酸单体(例如脂肪酸，复合碳水化合物等)。
如在此说明书以及以下权利要求部分中使用，术语“一种或多种氨基酸”应该被理解为包括20种天然发生的氨基酸；在体内通常在翻译后被修饰的那些氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸以及二氧膦基苏氨酸(phospho threonine)；以及其他不寻常氨基酸，包括但不局限于2-氨基脂肪酸、羟基赖氨酸、异锁链素、去甲-缬氨酸、去甲-亮氨酸以及鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸两者。
由于本发明的肽优选地用于要求肽呈可溶性形式的治疗剂中，本发明的肽优选地包含一种或多种非天然或天然极性氨基酸，这些氨基酸包括但不局限于归因于其含羟基的侧链而能够增加肽溶解性的丝氨酸和苏氨酸。
表达系统
为了使得本发明的多核苷酸能够进行细胞表达，可使用根据本发明的核酸构建体，它包括以上核酸序列之一的至少一个编码区，并且进一步包括至少一种顺式作用调控元件。如在此使用，短语“顺式作用调节元件”是指一种多核苷酸序列，优选是一种启动子，这种顺式作用调节元件结合一种反式作用调节子并且调节位于其下游的编码序列的转录。
任何适合的启动子序列可由本发明的核酸构建体来使用。
优选地，本发明的核酸构建体使用的启动子在所转化的具体细胞群中是活性的。细胞类型特异性和/或组织特异性启动子的实例包括启动子，例如肝特异性的白蛋白[平克特(Pinkert)等人，(1987)《基因发育》(Genes Dev.)1：268-277]，淋巴特异性启动子[卡里莫(Calame)等人，(1988)《高级免疫学》(Adv.Immunol.)43：235-275]；特别是T-细胞受体[维纳图(Winoto)等人，(1989)《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)8：729-733]和免疫球蛋白的启动子；[巴纳吉(Banerji)等人(1983)《细胞》(Cell)33729-740]，神经元-特异性启动子，例如神经丝启动子[伯恩(Byrne)等人(1989)《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 86：5473-5477]，胰腺-特异性启动子[爱德兰驰(Edlunch)等人(1985)《科学》(Science)230：912-916]或乳腺-特异性启动子，例如乳乳清启动子(美国专利号4,873,316以及欧洲申请公开号264,166)。本发明的核酸构建体可进一步包括增强子，该增强子可相邻于或远离启动子序列并且可起作用以便上调由其进行的转录。
本发明的核酸构建体优选地进一步包括一个适当的选择标记和/或复制起点。优选地，所使用的核酸构建体是穿梭载体，它可在大肠杆菌中繁殖(其中该构建体包含适当的选择标记和复制起点)并且适合于在细胞中繁殖、或整合于所选择的基因和组织之中。根据本发明的构建体可以是例如质粒、杆粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。
适合的构建体的实例包括但不局限于pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、PzeoSV2(+/-)、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto，它们各自可购自英杰生命技术有限公司(Invitrogen Co.)(www.invitrogen.com)。逆转录病毒载体以及包装系统的实例是由加利福尼亚州圣迭戈Clontech公司(Clontech，San Diego(圣迭戈)，Calif.(加利福尼亚州))出售的那些，包括Retro-X载体pLNCX以及pLXSN，这些载体允许克隆至多个克隆位点中并且该转基因从CMV启动子来转录。还包括来源于Mo-MuLV的载体，例如pBabe，其中该转基因将从5′LTR启动子来转录。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒或非病毒构建体来转染，所述构建体例如腺病毒、慢病毒、单纯性疱疹I病毒，或腺伴随病毒(AAV)以及基于脂质的系统。用于基因的脂质介导的转移的有用脂质是例如DOTMA、DOPE以及DC-Choi[Tonkinson(托金森)等人，癌症研究(Cancer Investigation)，14(1)：54-65(1996)]。用于基因疗法中的最优选构建体是病毒，最优选为腺病毒、AAV、慢病毒、或逆转录病毒。例如逆转录病毒构建体的病毒构建体包含至少一种转录启动子/增强子或基因座界定元件，或通过例如选择性剪接、核RNA输出或信使的翻译后修饰的其他手段来控制基因表达的其他元件。这类载体构建体还包括一个包装信号、多个长末端重复序列(LTR)或其部分，以及适合于所用病毒的正和负链引物结合位点，除非它已经存在于病毒构建体中。此外，这种构建体典型地包括用于使肽从它所安放的宿主细胞中分泌的一个信号序列。优选地，用于这一目标的信号序列是哺乳动物信号序列或本发明的多肽的信号序列。任选地，该构建体还可包括引导多聚腺苷酸化的一个信号，以及一个或多个限制位点和一个翻译终止序列。例如，这类构建体通常包括一个5′LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点，以及3′LTR或其一部分。可使用非病毒性的其他载体，例如阳离子脂质、聚赖氨酸，以及树枝状化合物。
重组表达载体和宿主细胞
本发明的另一个方面涉及包含编码根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白、或其衍生物、片段、类似物或同源物的核酸的载体，优选是表达载体。如在此使用，术语“载体”是指一个能够转运它已经被连接至其上的另一个核酸的核酸分子。载体类型的实例是质粒和病毒载体。某些载体能够在它们被引入至其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入至宿主细胞中时被整合进该宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导它们可操作连接的基因的表达。这类载体在此被称为“表达载体”。本发明旨在包括充当同等功能的这类形式的表达载体，例如质粒、病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒以及腺相关病毒)。
根据本发明的至少一些实施例所述的重组表达载体包括呈适合于在宿主细胞中表达核酸的形式的根据本发明的至少一些实施例所述的核酸，这意味着这些重组表达载体包括基于待用于表达的宿主细胞来选择的一种或多种调控序列，这些调控序列可操作地连接至待表达的核酸序列。在重组表达载体中，“可操作地连接”旨在意味着感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至这些调节序列(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到一个宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。
术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子以及其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调节序列例如描述于高埃德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法：(GeneExpression Technology：Methods in Enzymology)185，Academic Press(学术出版社)，San Diego(圣迭戈)，Calif.(加利福尼亚州)(1990)中。调控序列包括引导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成性表达的那些序列以及引导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异性调控序列)。将被本领域的普通技术人员所理解的是，表达载体的设计取决于这些因素，例如有待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白的表达水平等。根据本发明的至少一些实施例所述的表达载体可以被引入进宿主细胞，以由此产生由如在此所描述的核酸编码的蛋白原或肽(包括融合蛋白或肽)。
根据本发明的至少一些实施例所述的重组表达载体可被设计成在原核或真核细胞中产生变体蛋白。例如，根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白可表达于例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中。适合的宿主细胞进一步描述于Goeddel(高埃德尔)，《基因表达技术：酶学方法》(Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology)185，Academic Press(学术出版社)，San Diego(圣迭戈)，Calif.(加利福尼亚州)(1990)中。可替代地，重组表达载体可在体外例如使用T7启动子调控序列以及T7聚合酶来转录和翻译。
蛋白在原核生物中的表达最经常在大肠杆菌中用包含引导融合或非融合蛋白的表达的组成性或可诱导性启动子的载体来进行。融合载体将许多氨基酸添加至其中所编码的蛋白，添加至重组蛋白的氨基或C末端。这类融合载体通常用于三个目的：(i)增加重组蛋白的表达；(ii)增加重组蛋白的溶解性；以及(iii)通过在亲和性纯化中充当配体来帮助纯化重组蛋白。通常，在融合表达载体中，将蛋白剪切位点引入至融合部分与重组蛋白的接合处以使得能够在纯化融合蛋白之后将重组蛋白与融合部分分离。这类酶、以及其同源识别序列包括因子Xa、凝血酶、PreScission、TEV以及肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech Inc)；史密斯(Smith)和约翰逊(Johnson)，1988.《基因》(Gene)67：31-40)、pMAL(New England Biolabs(新英格兰实验室)，Beverly(贝弗利)，Mass.)以及pRIT5(法玛西亚公司(Pharmacia)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、或蛋白A融合至靶向重组蛋白。
在另一个实施例中，编码本发明的蛋白的表达载体是一种酵母表达载体。用于在酵母酿酒中表达的载体的实例包括pYepSecl(巴尔戴利(Baldari)等人，1987.《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J)6：229-234)，pMFa(库尔坚(Kurjan)和赫斯库伍特兹(Herskowitz)，1982.《细胞》(Cell)30：933-943)，pJRY88(舒尔茨(Schultz)等人，1987.《基因》(Gene)54：113-123)，pYES2(Invitrogen Corporation(英杰公司)，San Diego(圣迭戈)，Calif(加利福尼亚州))，以及picZ(Invitrogen Corp(英杰公司)，San Diego(圣迭戈)，Calif(加利福尼亚州))。
可替代地，本发明的多肽可在昆虫细胞中使用杆状病毒表达载体来产生。可用于在培养的昆虫细胞(例如，SF9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(史密斯(Smith)等人，1983.《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)3：2156-2165)和pVL系列(拉克楼(Lucklow)和萨摩兹(Summers)，1989.《病毒学》(Virology)170：31-39)。
在又一个实施例中，本发明的核酸在哺乳动物细胞中使用哺乳动物表达载体来表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(斯德(Seed)，1987.《自然》(Nature)329：840)和pMT2PC(考夫曼(Kaufman)等人，1987.《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)6：187-195)，pIRESpuro(Clontech公司)，pUB6(英杰公司(Invitrogen))，pCEP4(英杰公司(Invitrogen))，pREP4(英杰公司(Invitrogen))，pcDNA3(英杰公司(Invitrogen))。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能经常由病毒调控元件来提供。例如，通常使用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒、劳斯肉瘤病毒以及猿病毒40。对于用于原核细胞和真核细胞两者的其他适合的表达系统参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人的《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.)(第2版)的第16和第17章2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，N.Y.，1989。
在另一个实施例中，重组哺乳动物表达载体能够引导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异性调控元件来表达核酸)。组织特异性调控元件在本领域中是已知的。组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝-特异性的；平克特(Pinkert)等人，1987.《基因发育》(Genes Dev.)1：268-277)，淋巴-特异性启动子(卡里曼(Calame)和伊顿(Eaton)，1988.《高级免疫学》(Adv.Immunol)43：235-275)，特别是T细胞受体(维纳图(Winoto)和巴尔迪莫(Baltimore)，1989.《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J)8：729-733)和免疫球蛋白(巴纳吉(Banerji)等人，1983.《细胞》(Cell)33：729-740；奎恩(Queen)和巴尔迪莫(Baltimore)，1983.《细胞》(Cell)33：741-748)的启动子，神经元-特异性启动子(例如，神经丝启动子；伯恩(Byrne)和鲁德尔(Ruddle)，1989.《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci USA)86：5473-5477)，胰腺-特异性启动子(艾德兰德(Edlund)等人，1985.《科学》(Science)230：912-916)，以及乳腺-特异性启动子(例如，乳乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。还涵盖发育性调节启动子，例如，鼠科动物同源框蛋白(hox)启动子凯赛尔((Kessel)和格鲁斯(Gruss)，1990.《科学》(Science)249：374-379)和α-胎蛋白启动子(卡姆皮斯(Campes)和泰尔夫曼(Tilghman)，1989.《基因发育》(Genes Dev.)3：537-546)。
根据至少一些实施例，本发明进一步提供了一种重组表达载体，它包括以反义取向克隆至该表达载体中的根据本发明的至少一些实施例所述的DNA分子。也就是说，该DNA分子以允许表达(通过DNA分子的转录)一种RNA分子的方式被可操作地连接至一个调控序列，该RNA分子与编码根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白的mRNA呈反义。可操作地连接至以反义取向克隆的核酸的调控序列可被选择成引导反义RNA分子在各种细胞类型中的连续表达，例如病毒启动子和/或增强子，或调控序列可被选择成引导反义RNA的组成性、组织特异性或细胞类型特异性表达。反义表达载体可呈重组质粒、噬菌粒或减毒病毒形式，其中反义核酸在一个高效率调控区的控制下产生，该高效率调控区的活性可由将载体引入其中的细胞类型来确定。关于使用反义基因来调控基因表达的讨论，参见例如温特劳布(Weintraub)等人，《作为遗传分析的分子工具的反义RNA》(“Antisense RNA as amolecular tool for genetic analysis)”，《遗传学评论-进展》(Reviews-Trends inGenetics)，Vol.1(1)1986。
根据至少一些实施例，本发明涉及向其中已经引入根据本发明的至少一些实施例所述的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和”重组宿主细胞”可以在此可互换地使用。应理解这类术语不仅涉及具体对象细胞，而且涉及这种细胞的子代或潜在子代。因为某些变化可在后代中由于突变或环境影响而发生，这种子代可能在事实上与亲代细胞不同，但是仍然包括在如在此使用的术语范围内。
宿主细胞可为任何原核或真核细胞。例如，根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白可在例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞、酵母、植物或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS或293细胞)中产生。其他适合的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
载体DNA可经由常规转化或转染技术而引入原核或真核细胞中。如在此使用，术语“转化”和“转染”旨在包括用于向一个宿主细胞中引入外源核酸(例如，DNA)的多种领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖介导的转染法、脂质转染法、或电穿孔法。用来转化或转染宿主细胞的适合的方法可以发现于萨姆布鲁克(Sambrook)等人《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.)2nd ed.(第二版)，ColdSpring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，N.Y.，1989)，以及其他实验室手册中。
为了稳定转染哺乳动物细胞，已知取决于所使用的表达载体以及转染技术，只有小部分的细胞可将外源DNA并入其基因组中。为了鉴定并且选择这些构成组分(integrant)，通常将编码选择标记(例如，抗生素抗性)的基因与所感兴趣的基因一起引入宿主细胞中。各种选择标记包括赋予对于例如G418、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素以及甲氨喋呤的药物的抗性的那些标记。编码选择标记的核酸可与编码根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白的核酸在相同的载体上被引入至宿主细胞中或可引入独立载体中。用所引入的核酸稳定转染的细胞可通过药物选择来鉴定(例如，并入有选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞将死亡)。
培养中的根据本发明的至少一些实施例所述的宿主细胞，例如原核或真核宿主细胞，可用于产生(即，表达)根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白。因此，本发明进一步提供了使用根据本发明的至少一些实施例所述的宿主细胞来生产根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白的方法。在一个实施例中，该方法包括在适合的培养基中培养本发明的宿主细胞(编码根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白的重组表达载体已引入其中)，这样使得产生根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白。在另一个实施例中，该方法进一步包括将根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白从该培养基或该宿主细胞中分离。
为了有效产生蛋白，优选的是将编码根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白的核苷酸序列置于表达控制序列的控制之下，被优化用于在所希望宿主中表达。例如，这些序列可包括优化的转录和/或翻译调控序列(例如改变的Kozak序列)。
应该指出的是，根据本发明的至少一些实施例，根据本发明的至少一些实施例所述的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白可以作为天然发生的多肽被分离或来自任何来源(无论是天然的、合成的、半合成的还是重组体)。因此，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白可以从任何物种，特别是哺乳动物，包括牛、羊、猪、鼠科动物、马，并且优选是人类，作为天然发生的蛋白被分离。可替代地，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白可以作为在原核生物或真核生物宿主细胞中表达的重组多肽被分离，或作为化学合成的多肽被分离。
技术人员可以容易地采用标准分离方法来获得分离的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白。分离的性质和程度取决于所分离分子的来源以及期望的用途。
转基因动物和植物
根据至少一些实施例，本发明还提供了转基因非人类动物和转基因植物，它们包括一种或多种根据本发明的至少一些实施例所述的核酸分子，它们可以用来生产根据本发明的至少一些实施例所述的多肽。这些多肽可以在山羊、牛、马、猪、大鼠、小鼠、兔、仓鼠或其他哺乳动物的组织液或体液(例如乳、血液或尿液)中产生并且从其中回收。参见，例如美国专利号5,827,690、5,756,687、5,750,172、以及5,741,957。
非人类转基因动物和转基因植物是通过将根据本发明的至少一些实施例所述的一种或多种核酸分子经由标准转基因技术引入到该动物或植物内来产生的。用于制造转基因动物的转基因细胞可以是胚胎干细胞、体细胞或受精卵细胞。转基因的非人类有机体可以是嵌合体的、非嵌合体的杂合子，以及非嵌合体的纯合子。参见，例如，霍根(Hogan)等人，《小鼠胚胎操作指南》(Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual)第二版Cold Spring Harbor Press(冷泉港出版社)(1999)；杰克逊(Jackson)等人，《小鼠遗传学和转基因学：实用方法》(Mouse Genetics and Transgenics：A Practical Approach)，Oxford University Press(牛津大学出版社)(2000)；以及平克特(Pinkert)，《转基因动物技术手册》(Transgenic Animal Technology：A Laboratory Handbook)，Academic Press(学术出版社)(1999)。
基因疗法
根据本发明的至少一些实施例，编码可溶性LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的核酸序列可以用于治疗感染性失调、和/或免疫相关失调、和/或癌症的基因疗法中。
如在此使用，“基因疗法”是通过基因操作来治疗一种疾病的过程，这样使得核酸的一个序列被转移至一个细胞中，然后该细胞表达由该核酸编码的任何基因产物。例如，如被本领域普通技术人员所熟知的，核酸转移可以经由多种方法通过离体或在体外将包含感兴趣的核酸的表达载体插入到细胞中来进行，例如包括磷酸钙沉淀、二乙基氨基乙基葡聚糖、聚乙二醇(PEG)、电穿孔、直接注射、脂质转染或病毒感染(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(Cold Spring HarborLaboratory Press(冷泉港实验室出版社)1989)；克里格勒尔(Kriegler)M.《基因转移和表达：实验室手册》(Gene Transfer ad Expression：A Laboratory Manual)(W.H.弗里曼(Freeman)和Co，New York(纽约)，N.Y.，1993)以及武(Wu)，Methods in Enzymology(《酶学方法》)(Academic Press(学术出版社)，New York(纽约)，1993)。可替代地，感兴趣的核酸序列可在体内在各种载体中以及通过各种方法转移至细胞中，这些各种方法包括例如将核酸直接给予至受试者体内，或将核酸插入病毒载体中并用该病毒感染受试者。用于体内转移的其他方法包括将核酸封装至脂质体中，以及将脂质体、或与红血球凝集性仙台病毒(Sendai virus)组合的脂质体直接转移至受试者。转染或感染的细胞表达由核酸编码的蛋白产物以便改进疾病或疾病症状。
抗体和免疫系统应答
如在此使用，术语“免疫学的”(immunologic、immunological)或“免疫”应答是直接针对受者患者中的肽的有益的体液(抗体介导的)和/或细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的)应答的发展。这种应答可为通过给予免疫原来诱导的主动应答或通过给予抗体或致敏T-细胞来诱导的被动应答。不希望受单一假设限制，细胞免疫应答通过结合I类或II类MHC分子来呈递多肽表位以便活化抗原特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞来引起。该应答还可涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、星形细胞、小神经胶质细胞、嗜酸性粒细胞的活化、嗜中性粒细胞或先天性免疫的其他组分的活化或募集。细胞介导的免疫应答的存在可通过增殖测定(CD4+T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定来确定。体液和细胞应答对于免疫原的保护或治疗效果的相对贡献可通过单独地将抗体以及T-细胞从免疫接种的同系动物中分离并且测量在第二受试者中的保护或治疗效果来区分。
“免疫原性试剂”或“免疫原”能够在给予至一个哺乳动物时诱导针对其自体的免疫应答，可任选地连同一种佐剂。
“信号转导通路”是指多种信号转导分子之间的生化关系，这些信号转导分子在将一个信号从细胞的一个部分传递到一个细胞的另一个部分中发挥作用。
如在此使用，短语“细胞表面受体”包括例如能够接受一个信号并且将这样的一个信号跨过细胞的质膜传递的分子以及分子的复合体。
如在此所指的术语“抗体”包括全部多克隆抗体和单克隆抗体以及任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”是指包括由二硫键互相连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白、或其抗原结合部分。每个重链包括一个重链可变区(在此缩写为VH)和一个重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域，CH1、CH2以及CH3。每个轻链包括一个轻链可变区(在此缩写为VL)和一个轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域，CL。VH和VL区可以被进一步细分为散布有更保守区(被命名为构架区(FR))的高变异度区(被命名为互补性决定区(CDR))。每个VH和VL包括三个CDR和四个FR，以下列顺序从氨基末端排到羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含一个与抗原相互作用的结合结构域。这些抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白对宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)以及经典补系统统的第一组分(Clq)。
如在此使用，术语一个抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)是指保留了特异性结合一种抗原(例如，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR分子，和/或其片段)的能力的一个抗体的一个或多个片段。已经示出抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。涵盖在术语一个抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，一个由V轻、V重、恒定轻(CL)以及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′).2片段，一个在铰链区包括由二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由一种抗体的单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(华德(Ward)等人，(1989)《自然》(Nature)341：544-546)，由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是它们可以使用重组方法经由一个合成接头来连接，其中这个合成接头使它们能够被制备为一个单一的蛋白链，其中VL和VH区组成一对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如，博尔德(Bird)等人(1988)《科学》(Science)242：423-426；以及休斯顿(Huston)等人(1988)《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85：5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在术语一个抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域普通技术人员所知的常规技术来获得的，并且以和完整抗体相同的方式针对效用对这些片段进行筛选。
如在此使用，“分离的抗体”旨在指代基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，分别特异性结合LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR蛋白和/或其片段的分离的抗体，并且基本上不含特异性结合除了LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR之外的抗原的抗体)。然而，分别特异性结合LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR蛋白的分离的抗体可以对其他抗原(例如来自其他物种的LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR分子)具有交叉反应性，。此外，分离的抗体可基本上上不含其他细胞材料和/或化学品。
如在此使用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指一种单个分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物针对具体表位展示出单一结合特异性和结合亲和性。
如在此使用，术语“人类抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区两者都来源于人类种系免疫球蛋白序列。此外，如果该抗体包含一个恒定区，那么该恒定区也来源于人类种系免疫球蛋白序列。根据本发明的至少一些实施例所述的人类抗体可以包括不是由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机诱变或位点专一诱变或通过在体内体细胞突变来引入的突变)。然而，如在此使用，术语“人类抗体”不旨在包括其中的CDR序列来源于另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的抗体，这些CDR序列已经被移植到人类构架序列上。
术语“人类单克隆抗体”是指具有可变区、展示出单一结合特异性的抗体，其中构架区和CDR区两者都来源于人类种系免疫球蛋白序列。在一个实施例中，人类单克隆抗体是由一种杂交瘤产生的，该杂交瘤包括从转基因非人类动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞、具有一个融合至无限增殖化细胞的包括人类重链转基因和轻链转基因的基因组。
如在此使用，术语“重组人类抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如(a)从一种动物(例如，小鼠)分离的抗体，这种动物对于人类免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的，或自其制备的杂交瘤(下面进一步描述)；(b)从被转化以表达人类抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的抗体；(c)从重组、组合人类抗体文库分离的抗体，；以及(d)通过任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体，这些手段涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列。此类重组人类抗体具有可变区，其中构架区和CDR区来源于人类种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施例中，此类重组人类抗体可以经受体外诱变(或，当使用针对人类Ig序列是转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且因此对这些重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列进行测序(虽然来源于并且与人类种系VH序列和VL序列相关)，这些氨基酸序列在体内人类抗体种系表达谱中可能不天然地存在。
如在此使用，“同种型”是指由重链恒定区编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“针对抗原特异性的抗体”与术语“特异性结合抗原的抗体”在此是可互换使用的。
如在此使用，“特异性结合人类LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白”的抗体旨在指分别结合LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR蛋白的抗体，例如具有5X10-8M、3X10-8M、1X10-9M或更小的KD的抗体。
如在此使用，术语“K-assoc”或“Ka”旨在指一个具体抗体-抗原相互作用的结合速率；而如在此使用，术语“Kdiss”或“Kd”旨在指一个具体抗体-抗原相互作用的离解速率。如在此使用，术语“KD”旨在指离解常数，它获得自Kd与Ka的比值(即，Kd/Ka)并且被表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域完善建立的方法来确定。确定抗体的KD值的一个优选方法是通过使用表面等离振子共振，优选是使用一个生物传感器系统，例如BiacoreRTM系统。
如在此使用，术语针对一种IgG抗体的“高亲和性”是指针对一个靶标抗原具有10-8M或更小、更优选是10-9M或更小并且甚至更优选是10-10M或更小的KD的抗体。然而，针对不同抗体同种型的“高亲和性”结合可以变化。例如，针对IgM同种型的“高亲和性”结合是指具有10-7M或更小、更优选是10-8M或更小的KD的抗体。
如在此使用，术语“受试者”或“患者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物毛利润哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25以及抗-LSR抗体
根据本发明的至少一些实施例所述的抗体包括具有具体种系序列的那些，同源抗体、具有保守修饰的抗体、工程化并且修饰的抗体，特征在于这些抗体的具体功能特征或特性。例如，这些抗体特异性结合人类LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR。优选地，根据本发明的至少一些实施例所述的抗体以高亲和性，例如以10-8M或更小或10-9M或更小或甚至10-10M或更小的KD与对应的LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR结合。根据本发明的至少一些实施例所述的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25以及抗-LSR抗体展示出一种或多种以下特征：
(i)以5.X10-8M或更小的KD与相对应的人类LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR结合；
(ii)调节(增强或抑制)B7免疫共刺激以及相关活性和功能，这样的T细胞应答涉及抗肿瘤免疫和自体免疫；和/或
(iii)与由癌细胞表达的LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR抗原结合，这些癌细胞包括例如黑色素瘤、肝癌、肾癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、多发性骨髓瘤、以及造血细胞癌(包括但不局限于淋巴瘤(何杰金氏和非何杰金氏)、急性和慢性淋巴性白血病以及急性和慢性骨髓性白血病)，但基本上不与正常细胞结合。另外，优选地，这些抗体及其偶联物将在引起选择性杀死此类癌细胞并且对调节自体免疫和癌症中涉及的免疫应答中是有效的。
更优选地，该抗体以3X10-8M或更小的KD、或以1X10-9M或更小的KD、或以0.1X10-9M或更小的KD、或以0.05X10-9M或更小的KD或以1X10-9与1X10-11M之间的KD与相对应的人类LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR抗原结合。
用于评估这些抗体对LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR的结合能力的标准测定在本领域是已知的，包括例如ELISA、蛋白印迹以及RIA。适合的测定详细地描述于实例中。这些抗体的结合动力学(例如结合亲和性)也可以通过本领域已知的标准测定来评估，例如通过Biacore分析。
一旦产生抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25以及抗-LSR抗体，来自抗体的序列可以与LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR结合，VH和VL序列可以被“混合并且匹配”以产生其他根据本发明的至少一些实施例所述的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25以及抗-LSR结合分子。此类“混合并且匹配”的抗体的LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR结合可以使用以上描述的结合测定(例如ELISA)来测试。优选地，当VH和VL链混合并且匹配时，来自一个具体VH/VL配对的VH序列被一个结构类似的VH序列所替代。同样，优选地，来自一个具体VH/VL配对的VL序列被一个结构类似的VL序列所替代。例如，同源抗体的VH和VL序列是特别适合用于混合和匹配的。
具有具体种系序列的抗体
在某些实施例中，本发明的抗体包括一个来自具体种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或一个来自具体种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
如在此使用，如果一个抗体的可变区是从使用人类种系免疫球蛋白基因的系统获得的，那么这种人类抗体包括作为具体种系序列的“产物”的或自其“起源的”重链或轻链可变区。此类系统包括用感兴趣的抗原对携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫，或用感兴趣的抗原对噬菌体上展示的人类免疫球蛋白基因库进行筛选。作为人类种系免疫球蛋白序列的“产物”的或自其“起源的”人类抗体可以像这样进行鉴定，通过将人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并且选择与该人类抗体的序列在序列上最接近的(即，最大百分比同一性)的人类种系免疫球蛋白序列。
作为具体人类种系免疫球蛋白序列的“产物”的或自其“起源的”人类抗体可以包含与种系序列相比的氨基酸差异，例如由于天然发生的体细胞突变或定点突变的刻意引入。然而，选择的人类抗体与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上典型地是至少90％一致的，并且当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠科种系序列)相比时，包含鉴定该人类抗体是人类的氨基酸残基。在某些情况下，人类抗体与由该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上典型地可以是至少95％、96％、97％、98％或99％，或甚至至少96％、、97％、、98％、、或99％一致的。典型地，来源于具体人类种系序列的人类抗体将展示出与由该人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于10个氨基酸的差异。在某些情况下，这种人类抗体可以展示出与由该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于5个，或甚至不多于4个、3个、2个、或1个氨基酸的差异。
同源抗体
在仍另一个实施例中，本发明的抗体包括重链和轻链可变区，这些重链和轻链可变区分别包括与优选的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体的分离的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR氨基酸序列同源的氨基酸序列，其中这些抗体保留母本抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体的所希望的功能特性。
如在此使用，两种氨基酸序列之间的百分比同源性等于这两种序列之间的百分比同一性。考虑了裂隙的数目以及每个裂隙的长度，这两种序列之间的百分比同一性是由这些序列共享的相同位置的数目的函数(即，百分比同源性＝相同位置的数目/位置的总数目X100)，在这两种序列的优化比对中需要引入百分比同一性。序列的比较和两种序列之间的百分比同一性可以使用数学算法来完成，如下面非限制性实例中所描述。
两种氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用迈耶斯(E.Meyers)和米勒(W.Miller)的算法(《生物科学中的计算机应用》(Comput.Appl.Biosci.)，4：11-17(1988))来确定，该算法已经被合并进ALIGN程序(版本2.0)中，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分是12并且空位罚分是4。另外，两种氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)(《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)48：444-453(1970))算法来确定，这种算法已经被合并进GCG软件包(可商购的)中的GAP程序中，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，并且空位权重是16、14、12、10、8、6、或4并且长度权重是1、2、3、4、5、或6。
额外地或可替代地，本发明的蛋白序列可以被进一步用作“查询序列”以进行针对公共数据库的检索，例如鉴定相关序列。此类检索可以使用阿尔丘尔(Altschul)等人(1990)《分子生物学杂志》(J Mol.Biol.)215：403-10的XBLAST程序。BLAST蛋白检索可以用XBLAST程序来进行，分数＝50、字长＝3以获得与根据本发明的至少一些实施例所述的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目标的有缺口的比对，可以利用如在阿尔丘尔(Altschul)等人，(1997)《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)中所述的有缺口的BLAST。当利用BLAST和有缺口的BLAST程序时，可以使用对应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
具有保守修饰的抗体
在某些实施例中，本发明的抗体包括一个重链可变区(包括CDR1、CDR2以及CDR3序列)和一个轻链可变区(包括CDR1、CDR2以及CDR3序列)，其中这些CDR序列中的一个或多个包括基于优选的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体的特定的氨基酸序列，这些抗体是使用在此的方法分离和产生的；或其保守修饰，并且其中这些抗体分别保留根据本发明的至少一些实施例所述的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体的所希望的功能特性。
在不同实施例中，抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如在此使用，术语“保守序列修饰”旨在指不显著地影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如位点定向诱变和PCR-介导的诱变)来向根据本发明的至少一些实施例所述的抗体中引入修饰。保守氨基酸取代是其中的氨基酸残基被一个具有类似侧链的氨基酸残基替代的取代。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有以下的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-支链的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，根据本发明的至少一些实施例所述的抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基家可以被来自相同侧链族的氨基酸残基替代，并且可以使用在此所描述的功能性测定针对保留的功能(即，上面在(c)至(j)中所阐明的功能)对这个改变的抗体进行测试。
与根据本发明的至少一些实施例所述的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR结合相同表位的抗体。
在另一个实施例中，本发明提供了与人类LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR上的优选表位结合的抗体，这些抗体拥有所希望的功能特性，例如B7共刺激的调节和相关功能。可以选择具有所希望的表位特异性的其他抗体，并且对于与LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR抗原结合，它们将具有与所希望的抗体交叉竞争的能力。
工程化并且修饰的抗体
根据本发明的至少一些实施例所述的抗体可以进一步使用具有一个或多个VH和/或VL序列的抗体来制备，这些VH和/或VL序列来源于抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体起始材料以工程化一个修饰的抗体，这个修饰的抗体可以具有来自起始抗体的改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)内(例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个构架区内)的一个或多个残基来使一个抗体工程化。额外地或可替代地，可以通过修饰恒定区内的残基来使一个抗体工程化，例如用来改变该抗体的效应物功能。
可以进行的一类可变区工程化是CDR移植。抗体主要通过以下氨基酸残基与靶标抗原相互作用，这些氨基酸残基位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中。由于这个原因，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列在单独抗体之间更加多样化。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此通过构建表达载体来表达模拟特定天然发生的抗体的特性的重组抗体是可能的，这些表达载体包括被移植到来自具有不同特性的不同抗体的构架序列上的来自该特定天然发生的抗体的CDR序列(参见，例如，Riechmann，L.(瑞艾克曼，L.)等人(1998)Nature(《自然》)332：323-327；琼斯(Jones，P.)等人(1986)《自然》(Nature)321：522-525；奎(恩Queen，C.)等人(1989)《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.U.S.A.)参见86：10029-10033；温特(Winter)的美国专利号5,225,539，以及奎恩(Queen)等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370)。
适合的构架序列可以从公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的公开参考文件中获得。例如，针对人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以发现于“VBase”人类种系序列数据库(在因特网上可获得)，连同发现于以下：卡巴特(Kabat，E.A.)等人(1991)《免疫学感兴趣的蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，Fifth Edition(第五版)，U.S.Department of Health and Human Services(美国卫生和人类服务部)，NIH公开号91-3242；汤姆林森(Tomlinson，I.M.)等人(1992)“约五十组具有不同高变环的VH区段揭示的人类种系VH序列的表达谱”(“The Repertoire of HumanGermline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments withDifferent Hypervariable Loops”)《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)227：776-798；以及考克斯(Cox，J.P.L.)等人(1994)“在其使用中揭示出强烈偏好的人类种系VH区的目录”(“ADirectory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in theirUsage”)《欧洲免疫学杂志》(Eur.J Immunol.)24：827-836；其每个的内容都通过引用专门结合在此)。
另一种类型的可变区修饰是使VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基突变，以由此改善感兴趣的抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和性)。为了引入突变，可以进行位点定向诱变或PCR-介导的诱变，并且可以影响抗体结合、或其他感兴趣的功能特性可以在体外或体内测定中适当地进行评估。优选地，引入保守修饰(如上所讨论的)。这些突变可以是氨基酸取代、添加或缺失，但是优选是取代。此外，典型的是改变CDR区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个残基。
根据本发明的至少一些实施例所述的工程化抗体包括其中对在VH和/或VL内的构架残基做了修饰的那些，例如用来改善该抗体的特性。典型地，做出此类构架修饰以减少该抗体的免疫原性。例如，一个途径是“回复突变”相对应的种系序列的一个或多个构架残基。更确切地，已经历体细胞突变的抗体可以包含不同于该抗体自其起源的种系序列的构架残基。此类残基可以通过将该抗体构架序列与该抗体自其起源的种系序列进行比较来鉴定。
除了在构架或CDR区内做出的修饰之外或其替代方案，根据本发明的至少一些实施例所述的抗体可以被工程化以便在Fc区内包括修饰，典型的是改变该抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原-依赖性细胞毒性。此外，根据本发明的至少一些实施例所述的抗体可以是化学上修饰的(例如，可以将一个或多个化学部分附接至该抗体)或可以是被修饰以改变其糖基化，再一次用来改变该抗体的一种或多种功能特性。此类实施例将在下面进一步描述。Fc区中的残基的编号是卡巴特(Kabat)的EU指数的编号。
在一个实施例中，将CH1的铰链区进行修饰这样使得在该绞链区中的半胱氨酸残基的数目改变，例如，增加或减少。这个途径进一步描述于博德默尔(Bodmer)等人的美国专利号5,677,425中。将CH1的绞链区中的半胱氨酸残基的数目改变，以例如协助轻链和重链的组装或以增加或减少该抗体的稳定性。
在另一个实施例中，将抗体的Fc铰链区进行突变以减小该抗体的生物半衰期。更确切地，在Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域的界面区中引入一个或多个氨基酸突变，这样使得该抗体具有相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合的受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。这个途径进一步详细地描述于华德(Ward)等人的美国专利号6,165,745中。
在另一个实施例中，将该抗体进行修饰以增加其生物半衰期。不同的途径是可能的。例如，可以引入以下突变中的一种或多种：T252L、T254S、T256F，如华德(Ward)的美国专利号6,277,375中所描述的。可替代地，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区内对该抗体进行改变以包含取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环中的补救受体结合表位，如韩华(Presta)等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所描述的。
在另外的其他实施例中，Fc区是通过将至少一个氨基酸残基用一个不同氨基酸残基进行替代而改变的，以改变该抗体的效应物功能。例如，可以将一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320以及322的氨基酸用一个不同氨基酸进行替代，这样使得该抗体具有针对效应物配体的改变的亲和性，但是保留母本抗体的抗原结合能力。亲和性被改变的效应物配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这个途径进一步详细地描述于温特(Winter)等人的美国专利号5,624,821和5,648,260两者中。
在另一个实例中，可以将一个或多个选自氨基酸残基329、331以及322的氨基酸用一个不同氨基酸进行替代，这样使得该抗体具有改变的Clq结合和/或减少的或废除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这个途径进一步详细地描述于伊杜索奇(Idusogie)等人的美国专利号6,194,551中。
在另一个实例中，可以将一个或多个氨基酸位置231和239内的氨基酸残基进行改变，以由此改变该抗体固定补体的能力。这个途径进一步描述于博德默尔(Bodmer)等人的PCT公开案WO 94/29351中。
在仍另一个实例中，将Fc区进行修饰以增加该抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或增加该抗体对Fey受体的亲和性的能力，通过修饰以下位置处的一个或多个氨基酸：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这个途径进一步描述于韩华(Presta)的PCT公开案WO 00/42072中。此外，在人类IgG1针对FcγRI、FcγRII、FcγRIII以及FcRn的结合位点已经被绘制出，并且具有改善的结合的变体已经被描述(参见希尔兹(Shields，R.L.)等人(2001)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)276：6591-6604)。示出位置256、290、298、333、334以及339处的特定突变可改善对FcyRIII的结合。额外地，示出以下组合突变体可改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A以及S298A/E333A/K334A。此外，突变(例如M252Y/S254T/T256E或M428L/N434S)改善对FcRn的结合并且增加了抗体的循环半衰期(参见陈(Chan CA)和卡特(Carter PJ)(2010)《自然评论免疫学》(Nature RevImmunol)10：301-316)。
在仍另一个实施例中，对抗体的糖基化进行修饰。例如，可以制备去糖基化(aglycoslated)抗体(即，该抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化作用例如以增加该抗体对抗原的亲和性。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变该抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，这导致一个或多个可变区构架糖基化位点的消除，以由此在那个位点处消除糖基化作用。此类去糖基化作用(aglycosylation)可以增加该抗体对抗原的亲和性。这样的一个途径进一步详细地描述于寇(Co)等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中。
额外地或可替代地，可以制备一种具有改变类型的糖基化作用的抗体，例如一种具有减少量的岩藻糖(fucosyl)残基的低岩藻糖化(hypofucosylated)抗体或一种具有增加的平分(bisecting)GlcNac结构的抗体。已经证明这样的改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可以通过例如在一个具有改变的糖基化机械的宿主细胞中表达该抗体来完成。在本领域中已经对具有改变的糖基化机器(glycosylationmachinery)的细胞进行了描述，并且它们可以用作其中表达根据本发明的至少一些实施例所述重组抗体的宿主细胞，以由此产生具有改变的糖基化作用的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705、以及Ms709缺乏岩藻糖转移酶(fucosyltransferase)基因，FUT8(α(1，6)岩藻糖转移酶(α(1，6)fucosyltransferase))，这样使得在Ms704、Ms705、以及Ms709细胞系中表达的抗体关于其碳水化合物缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705、以及Ms709 FUT8.7-细胞系是通过使用两个置换型载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因来产生的(参见山根(Yamane)等人的美国专利公开号20040110704和山根(Yamane)-大贯(Ohnuki)等人(2004)《生物技术与生物工程》(Biotechnol Bioeng)87：614-22)。作为另一个实例，哈奈(Hanai)等人的EP 1,176,195描述了一种具有功能上破坏的编码岩藻糖转移酶的FUT8基因的细胞系，这样通过减少或消除α1，6键-相关酶(alpha 1，6 bond-related enzyme)使得在这样的一种细胞系中表达的抗体展示出低岩藻糖化(hypofucosylation)。哈奈(Hanai)等人还描述了具有低的用于将岩藻糖添加至与该抗体的Fc区结合的N-乙酰氨基葡萄糖的酶活性或不具有这种酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。韩华(Presta)的PCT公开案WO 03/035835描述了一种具有减少的将岩藻糖附接至Asn(297)-连接的碳水化合物的能力的变体CHO细胞系，Led 3细胞，这也导致在那种宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(hypofucosylation)(还参见希尔兹(Shields，R.L.)等人(2002)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)277：26733-26740)。乌马纳(Umana)等人的PCT公开案WO 99/54342描述了被工程化以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(GnTIII))的细胞系，这样使得在该被工程化的细胞系中表达的抗体展示出增加的平分GlcNac结构，这导致这些抗体的增加的ADCC活性(还参见乌马纳(Umana)等人(1999)《自然生物技术》(Nat.Biotech.)17：176-180)。可替代地，该抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶而被剪切掉。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶将岩藻糖残基从抗体中除去(塔伦蒂诺(Tarentino，A.L.)等人(1975)《生物化学》(Biochem.)14：5516-23)。
由本发明在此考虑抗体的另一种修饰是聚乙二醇化作用。可以将一个抗体聚乙二醇化以例如增加该抗体的生物(例如，血清)半衰期。为了将一个抗体聚乙二醇化，典型的是在其中一个或多个PEG基团被附接至该抗体或其片段的条件下，将该抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)进行反应。优选地，聚乙二醇化作用是经由与一种反应性PEG分子(或类似反应性水可溶聚合物)的酰化反应或烷化反应来进行的。如在此使用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已经用来衍生其他蛋白的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施例中，有待聚乙二醇化的抗体是一种去糖基化的抗体。用于聚乙二醇化蛋白的方法在本领域中是已知的，并且可以被应用于根据本发明的至少一些实施例所述的抗体。参见例如西村(Nishimura)等人的EP 0 154 316和Ishikawa(石川)等人的EP 0 401 384。
工程化抗体的方法
如上所讨论，具有在此所披露的VH和VK序列的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体可以通过修饰VH和/或VL序列、或附接至其上的恒定区来分别产生新的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体。因此，在根据本发明的至少一些实施例所述的另一个方面中，根据本发明的至少一些实施例所述的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体的结构特征可以用来产生结构上相关的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体，这些抗体保留根据本发明的至少一些实施例所述的抗体的至少一种功能特性，例如分别与人类LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR结合。例如，LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR抗体或其突变体的一个或多个CDR区可以与已知框架区和/或其他CDR重组地合并以产生额外的、重组工程化的、如上所讨论的、根据本发明的至少一些实施例所述的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体。其他类型的修饰包括在先前部分中所描述的那些。用于工程化方法的起始材料是在此所提供的一个或多个VH和/或VK序列、或其一个或多个CDR区。为了产生工程化的抗体，实际上制备(即，表达为一种蛋白)具有一个或多个在此所提供的VH和/或VK序列、或其一个或多个CDR区的抗体是没有必要的。当然，包含在这些序列中的信息被用作产生来源于原始序列的“第二代”序列的起始材料，并且将这些“第二代”序列进行制备并且表达为一种蛋白。
可以使用标准分子生物学技术来制备并且表达改变的抗体序列。
优选地，由改变的抗体序列编码的抗体是由此在所提供的方法和序列生产的、分别保留抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体的一种、一些或全部的功能特性的抗体，这些功能特性包括以特定KD水平或更少KD水平与LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR抗原结合和/或调节B7共刺激和/或选择性地与表达LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原的所希望的靶细胞结合，这些靶细胞例如像黑色素瘤、肝症、肾症、脑症、乳腺症、结肠症、肺症、卵巢症、胰腺症、前列腺症、胃症、多发性骨髓瘤以及造血性癌症，包括但不局限于淋巴瘤(何杰金氏和非何杰金氏)、急性和慢性淋巴性白血病以及急性和慢性骨髓性白血病。
这些改变的抗体的功能特性可以使用本领域可用的和/或在此所描述的标准测定来评估。
在根据本发明的至少一些实施例所述的工程化抗体的方法的某些实施例中，可以沿着全部或部分的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体编码序列随机性地或选择性地引入突变，并且可以针对结合活性和/或其他所希望的功能特性对生成的修饰抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体进行筛选。
在本领域中已经对突变方法进行了描述。例如，绍特(Short)的PCT公开案WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接组装(synthetic ligation assembly)、或其组合来产生并筛选抗体突变的方法。可替代地，拉扎尔(Lazar)等人的PCT公开案WO 03/074679描述了使用计算筛选方法来优化抗体的理化性质的方法。
编码抗体的核酸分子
本发明的另一方面涉及对根据本发明的至少一些实施例所述的抗体进行编码的核酸分子。这些核酸可以存在于全细胞中、细胞溶解产物中、或部分纯化或充分纯的形式中。当通过标准技术被从其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白)纯化开时，核酸是“分离的”或“显现充分纯的”，这些标准技术包括碱/SDS处理、CsCl条带(banding)、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳以及其他本领域熟知的技术。参见，奥苏贝尔(F.Ausubel)等人编辑(1987)《分子生物学实验指南》(Current Protocols in MolecularBiology)，Greene Publishing and Wiley Interscience(跨学科的威利格林出版社)，NewYork(纽约)。根据本发明的至少一些实施例所述的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含或可以不包含内含子序列。在一个优选实施例中，该核酸是cDNA分子。
可以使用标准分子生物学技术来获得根据本发明的至少一些实施例所述的核酸。对于由杂交瘤(例如，从如下进一步描述的携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体而言，可以通过标准PCR扩增或克隆技术来获得对由该杂交瘤制备的抗体的轻链和重链进行编码的cDNA。对于从免疫球蛋白基因库(例如，使用噬菌体展示技术)获得的抗体而言，编码该抗体的核酸可以从该库中回收。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，这些DNA片段可以通过标准重组DNA技术来进行进一步操作，例如用来将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL的或编码VH的DNA片段操作性地连接至另一个编码另一种蛋白的DNA片段，例如抗体恒定区或柔性连接物。
如在此背景下使用，术语“操作性地连接”旨在意味着将这两个DNA片段连接，这样使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列仍然在框架内。
可以通过将编码VH的DNA操作性地连接至编码重链恒定区(CH1、CH2以及CH3)的另一个DNA分子来将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见，例如，卡巴特(Kabat，E.A.)等人(1991)《免疫学感兴趣的蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，Fifth Edition(第五版)，U.S.Department of Health and Human Services(美国卫生和人类服务部)，NIH公开号91-3242)，并且涵盖这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增来获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选地是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因而言，编码VH的DNA可以被操作性地连接至另一个只编码重链CH1恒定区的DNA分子。
可以通过将编码VL的DNA操作性地连接至另一个编码轻链恒定区，CL的DNA分子来将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(连同Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见，例如，卡巴特(Kabat，E.A.)等人(1991)《免疫学感兴趣的蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，Fifth Edition(第五版)，U.S.Department of Health and Human Services(美国卫生和人类服务部)，NIH公开号91-3242)，并且涵盖这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增来获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但是最优选地是κ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH的和编码VL的DNA片段操作性地连接至另一个编码柔性连接物(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的片段，，这样使得VH和VL序列可以被表达为连续的单链蛋白，VH和VL区由该柔性连接物连接(参见，例如，博尔德(Bird)等人(1988)《科学》(Science)242：423-426；休斯顿(Huston)等人(1988)《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85：5879-5883；麦卡弗蒂(McCafferty)等人，(1990)《自然》(Nature)348：552-554)。
抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR单克隆抗体的生产
本发明的单克隆抗体(mAb)可以通过多种技术来生产，包括常规单克隆抗体方法学，例如科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)(1975)《自然》(Nature)256：495的标准体细胞杂交技术。尽管原则上体细胞杂交程序是优选的，但是可以采用其他用于生产单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒性或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的一个优选动物系统是鼠科系统。在小鼠中杂交瘤的生产是一种非常完善建立的程序。用于分离免疫脾细胞用于融合的免疫方案和技术在本领域中是已知的。融合配偶体(例如，鼠科动物骨髓瘤细胞)以及融合程序也是已知的。
本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以基于如上所述制备的鼠科动物单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从感兴趣的鼠科动物杂交瘤获得，并且可以使用标准分子生物学技术来工程化以包含非鼠科动物(例如，人类)免疫球蛋白序列。例如，为了制备嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠科动物可变区连接至人类恒定区(参见例如，卡比乌伊(CabiUy)等人的美国专利号4,816,567)。为了制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠科动物CDR区插入至人类构架(参见例如，温特(Winter)的美国专利号5,225,539，以及奎恩(Queen)等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370)。
根据本发明的至少一些实施例，这些抗体是人类单克隆抗体。此类直接针对LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的人类单克隆抗体可以使用携带人类免疫系统而非小鼠系统的部分的转基因小鼠或转染色体小鼠来产生。这些转基因小鼠和转染色体小鼠在此分别被称为HuMAb小鼠RTM和KM小鼠RTM，并且在此被统称为“人类Ig小鼠”。HuMAb小鼠TM(Medarex.公司)包含对非重排人类重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列进行编码的人类免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，连同使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如，兰博尔格(Lonberg)等人(1994)《自然》(Nature)368(6474)：856-859)。因此，这些小鼠展示出小鼠IgM或κ的减少的表达，并且响应免疫作用，引入的人类重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和性的人类IgGκ单克隆抗体(兰博尔格(Lonberg，N.)等人(1994)，同上；(兰博尔格(Lonberg，N.)中的综述)(1994)《实验药理学手册》(Handbookof Experimental Pharmacology)113：49-101；兰博尔格(Lonberg，N.)和胡萨尔(Huszar，D.)(1995)《国际免疫学评论》(Intern.Rev.Immunol.)13：65-93，以及哈丁(Harding，F.)和兰博尔格(Lonberg，N.)(1995)《纽约科学院年刊》(Ann.N.Y.Acad.Sci.)764：536-546)。HuMab小鼠RTM的制备和用途以及由此类小鼠携带的基因组修饰进一步描述于以下之中：泰勒(Taylor，L.)等人(1992)《核酸研究》(Nucleic Acids Research)20：6287-6295；陈(Chen，J.)等人(1993)《国际免疫学》(International Immunology)5：647-656；团昂(TuaiUon)等人(1993)《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：3720-3724；崔(Choi)等人(1993)《自然遗传学》(Nature Genetics)4：117-123；陈(Chen，J.)等人(1993)《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)12：821-830；团昂(TuaiUon)等人(1994)《免疫学杂志》(J.Immunol.)152：2912-2920；泰勒(Taylor，L.)等人(1994)《国际免疫学》(International Immunology)6：579-591；以及费什瓦尔德(Fishwild，D.)等人(1996)《自然生物技术》(Nature Biotechnology)14：845-851，其全部内容通过引用而特此确切地以其全文结合。进一步参见，全部属于兰博尔格(Lonberg)和凯(Kay)的美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299、以及5,770,429；苏拉尼(Surani)等人的美国专利号5,545,807；全部属于兰博尔格(Lonberg)和凯(Kay)的PCT公开号WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884以及WO 99/45962；以及袁冰(Korman)等人的PCT公开号WO 01/14424。
在另一个实施例中，根据本发明的至少一些实施例所述的人类抗体可以使用在转基因和转染色体上携带人类免疫球蛋白序列的小鼠(例如携带人类重链转基因和人类轻链转染色体的小鼠)来进行培养。在此被称为“KM小鼠TM.”的此类小鼠被详细描述于石田太郎(Ishida)等人的PCT公开案WO 02/43478中。
再者，表达人类免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统在本领域是可用的，并且可以被用来培养根据本发明的至少一些实施例所述的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体。例如，可以使用被称为Xenomouse(Abgenix公司)的替代转基因系统；此类小鼠描述于例如库切拉帕提(Kucherlapati)等人的美国专利号5,939,598、6,075,181、6,114,598、6,150,584以及6,162,963中。
此外，表达人类免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统在本领域是可用的的，并且可以被用来培养根据本发明的至少一些实施例所述的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体。例如，可以使用被称为“TC小鼠”、携带人类轻链转染色体和人类重链转染色体两者的小鼠；此类小鼠描述于富冢(Tomizuka)等人(2000)《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad Sci.USA)97：722-727中。此外，在本领域中对携带人类重链和轻链转染色体的牛已经进行了描述(库劳伊娃(Kuroiwa)等人(2002)《自然生物技术》(NatureBiotechnology)20：889-894)，并且可以用来培养根据本发明的至少一些实施例所述的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体。
根据本发明的至少一些实施例所述的人类单克隆抗体还可以使用筛选人类免疫球蛋白基因库的噬菌体展示方法来制备。此类用于分离人类抗体的噬菌体展示方法在本领域是完善建立的。参见例如：拉德纳(Ladner)等人的美国专利号5,223,409、5,403,484、以及5,571,698；道威尔(Dower)等人的美国专利号5,427,908以及5,580,717；麦卡弗蒂(McCafferty)等人的美国专利号5,969,108以及6,172,197；以及格里菲斯(Griffiths)等人的美国专利号5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915以及6,593,081。
根据本发明的至少一些实施例所述的人类单克隆抗体还可以使用SCID小鼠来制备，在其中已经重构了人类免疫细胞，这样使得当免疫时可以产生人类抗体应答。此类小鼠描述于例如威尔逊(Wilson)等人的美国专利号5,476,996以及5,698,767中。
人类IG小鼠(HUMAN IG MICE)的免疫
当使用人类Ig小鼠来培养根据本发明的至少一些实施例所述的人类抗体时，此类小鼠可以如以下所描述的用LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原和/或重组体LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR、或LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR融合蛋白的纯化制剂或浓缩制剂来免疫：兰博尔格L(onberg，N.)等人.(1994)《自然》(Nature)368(6474)：856-859；费斯威尔德(Fishwild，D.)等人.(1996)《自然生物技术》(Nature Biotechnology)14：845-851；以及PCT公开WO 98/24884和WO 01/14424。优选地，在第一次输注时，这些小鼠是6-16周龄。例如，可以使用LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原的纯化制剂或重组制剂(5-50.mu.g)来腹腔内地免疫人类Ig小鼠。
其他人用不同抗原的先前经验已经示出当首先用完全弗氏佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫，随后用完全弗氏佐剂中的抗原每隔一周IP免疫(共有6次)时，转基因小鼠会响应。然而，发现除弗氏佐剂以外的佐剂也是有效的。此外，发现没有佐剂存在下的全细胞是高度免疫原性的。可以在免疫方案的过程中通过眶后取血获得的血浆样品来对免疫应答进行监测。可以通过ELISA筛选血浆(如下所述)，并且具有足够滴定度的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR人类免疫球蛋白的小鼠可以用于融合。在处死并且移出脾脏之前的3天，可以使用抗原来静脉内地使小鼠增强免疫。期望的是对于每次免疫都需要进行2-3次融合。对于每种抗原典型地免疫6与24只之间的小鼠。通常使用HCo7和HCo12两种品系。此外，HCo7和HCo12两种转基因可以被一起繁殖进一只具有两种不同人类重链转基因(HCo7/HCo12)的单个小鼠中。可替代地或额外地，可以使用KM小鼠RTM.品系。
生产人类单克隆抗体的杂交瘤的产生
为了产生生产根据本发明的至少一些实施例所述的人类单克隆抗体的杂交瘤，可以从免疫小鼠分离到脾细胞和/或淋巴结细胞，并且可以被融合至一个适当的无限增殖化细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。可以针对抗原特异性抗体的生产对这些生成的杂交瘤进行筛选。例如，可以将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液用50％的PEG融合至六分之一数目的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)。将细胞以约2X10-5在平底微量滴定板上涂板，随后是在包含以下的选择培养基中孵育两周：20％胎儿克隆血清(fetal Clone Serum)，18％“653”条件培养基，5％origen(IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮钠，5mM HEPES，0.055mM 2-巯基乙醇，50单位/ml青霉素，50mg/ml链霉素，50mg/ml庆大霉素以及1X HAT(Sigma公司，在融合后24小时添加HAT)。在约两周之后，可以将细胞在将HAT用HT替代的培养基中进行培养。然后可以通过ELISA针对人类单克隆IgM和IgG抗体对单独的孔进行筛选。一旦大量的杂交瘤生长出现，通常在10-14天之后可以对培养基进行观察。抗体分泌杂交瘤可以被重新涂板、再次筛选，并且如果对人类IgG仍然是阳性的，那么这些单克隆抗体可以通过有限稀释法被至少亚克隆两次。然后可以将稳定的亚克隆在体外培养，以在用于表征的组织培养基中产生少量抗体。
为了纯化人类单克隆抗体，可以使选择的杂交瘤生长在用于单克隆抗体的纯化的两升的转瓶中。在用蛋白A-琼脂糖(法玛西亚公司(Pharmacia)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)亲和层析之前，可以将上清液过滤并且浓缩。为了保证纯度，可以通过凝胶电泳和高效液相色谱法对洗脱的IgG进行检查。可以将缓冲溶液换成PBS，并且可以使用1.43消光系数通过OD280来对浓度进行确定。这些单克隆抗体可以在-80℃下等分并且储存。
生产单克隆抗体的转染瘤的产生
根据本发明的至少一些实施例所述的抗体还可以使用例如本领域中所熟知的重组DNA技术和基因转染方法的组合来在宿主细胞转染瘤中生产(例如，莫里森(Morrison，S.)(1985)《科学》(Science)229：1202)。
例如，为了表达这些抗体、或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如，PCR扩增或使用表达感兴趣的抗体的杂交瘤的cDNA克隆)来获得编码部分的或全长的轻链和重链的DNA，并且这些DNA可以被插入进表达载体中，这样使得这些基因被操作性地连接至转录和翻译控制序列。在此背景下，术语“操作性地连接”旨在意味着抗体基因被连接至一个载体，这样使得该载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节该抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择的表达载体和表达控制序列与所使用的表达宿主细胞是能兼容的。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入进单独的载体，或更典型地，这两种基因被插入进同一表达载体。通过标准方法将抗体基因插入进表达载体(例如，抗体基因片段和载体上的互补限制位点的连接，或如果不存在限制位点，平末端连接)。可以使用在此所描述的这些抗体的轻链和重链可变区，来通过将它们插入表达载体来产生任何抗体同种型的全长抗体基因，这些表达载体已经编码了所希望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区，这样使得VH区段被操作性地连接至该载体内的CH区段并且VK区段被操作性地连接至该载体内的CL区段。额外地或可替代地，这种重组表达载体可以对协助该抗体从宿主细胞中分泌的信号肽进行编码。可以将该抗体链基因克隆进该载体，这样使得信号肽被框架内地连接至该抗体链基因的氨基末端。该信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因之外，根据本发明的至少一些实施例所述的重组表达载体携带控制这些抗体链基因在宿主细胞中的表达的调节序列。术语“调节序列”旨在包括控制这些抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子以及其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调节序列例如描述于高埃德尔(Goeddel)《基因表达技术：酶学方法》(GeneExpression Technology：Methods in Enzymology)185，Academic Press(学术出版社)，San Diego(圣迭戈)，Calif.(加利福尼亚州)(1990)中。将被本领域的普通技术人员所理解的是，表达载体的设计(包括调节序列的选择)取决于这些因素，如有待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平的蛋白表达的病毒元件，例如来源于以下的启动子和/或增强子：巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)以及多瘤病毒。可替代地，可以使用非病毒调节序列，例如泛素蛋白启动子或β珠蛋白启动子。再者，调节元件由来自不用来源，例如包含来自SV40早期启动子的序列和人类T细胞白血病病毒类型1的长末端重复的SRα、启动子系统的序列组成(泰克倍(Takebe，Y.)等人(1988)《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)8：466-472)。
除了这些抗体链基因和调节序列之外，根据本发明的至少一些实施例所述的重组表达载体可以携带额外的序列，例如在宿主细胞中调节该载体的复制的序列(例如，复制起点)以及选择性标记基因。选择性标记基因协助已经向其中引入该载体的宿主细胞的选择(参见例如，全部是阿克塞尔(Axel)等人的美国专利号4,399,216、4,634,665以及5,179,017)。例如，典型地，选择性标记基因赋予已经向其中引入该载体的宿主细胞对药物，例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在用甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中使用)和neo基因(用于G418选择)。
为了轻链和重链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染进宿主细胞中。不同形式的术语“转染”旨在涵盖多种多样的通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管理论上在原核亦或真核宿主细胞中表达根据本发明的至少一些实施例所述的抗体是可能的，但是在真核细胞、并且最优选是哺乳动物宿主细胞中的抗体的表达是最优选的，因为此类真核细胞、并且特别是哺乳动物细胞比原核细胞更容易组装并且分泌适当折叠的并且有免疫学活性的抗体。已经报道抗体基因的原核表达对于生产高产量的活性抗体是无效的(波斯.(Boss，M.A)和伍德(Wood，C.R.)(1985)《今日免疫学》(Immunology Today)6：12-13)。
用于表达根据本发明的至少一些实施例所述的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括与例如描述于考夫曼(R.J.Kaufman)和夏普(P.A.Sharp)(1982)《分子生物学》(Mol.Biol.)159：601-621中的DHFR选择性标记一起使用的描述于乌尔劳布(Urlaub)和查森(Chasin)，(1980)《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77：4216-4220中的dhfr-CHO细胞)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞以及SP2细胞。具体地，用于与NSO骨髓瘤细胞一起使用的另一个优选的表达系统是披露于WO87/04462、WO 89/01036以及EP 338,841中的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体引入进哺乳动物宿主细胞中时，这些抗体是通过将这些宿主细胞培养一段足够允许在这些细胞中的抗体的表达或更优选地，允许该抗体分泌至这些宿主细胞生长的培养基中的时间来产生的。可以使用标准蛋白纯化方法将抗体从该培养基中回收。
与抗原结合的抗体的表征
可以通过标准ELISA针对与LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的结合对根据本发明的至少一些实施例所述的抗体进行测试。简言之，将微量滴定板用PBS中的0.25.μg/ml的纯化LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR进行包衣，并且然后用PBS中的5％的牛血清白蛋白封闭。将抗体的稀释物(例如，来自免疫小鼠的血浆的稀释物)添加至每个孔并且在37℃孵育1-2小时。将这些平板用PBS/Tween进行洗涤，并且然后用与碱性磷酸酯酶偶联的二级试剂(例如，对于人类抗体，一种山羊抗人IgG Fc-特异性多克隆试剂)在37℃孵育1小时。洗涤之后，将这些平板用pNPP底物(1mg/ml)进行显影，并且在405-650的OD下进行分析。优选地，显露出最高滴定度的小鼠将用于融合。
还可以使用如上所述的ELISA测定来筛选示出与LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR免疫原的阳性反应性的杂交瘤。将以高亲合力与LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR结合的杂交瘤进行亚克隆并且进一步表征。可以选择来自每个杂交瘤的一个保留母体细胞的反应性(通过ELISA)的克隆，用于制备在-140℃下储存的5-10个小瓶细胞库，并且用于抗体纯化。
为了纯化抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体，可以使选择的杂交瘤生长在用于单克隆抗体的纯化的两升的转瓶中。在用蛋白A-琼脂糖(法玛西亚公司(Pharmacia)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)亲和层析之前，可以将上清液过滤并且浓缩。为了保证纯度，可以通过凝胶电泳和高效液相色谱法对洗脱的IgG进行检查。可以将缓冲溶液换成PBS，并且可以使用1.43消光系数通过OD280来对浓度进行确定。这些单克隆抗体可以在-80℃下等分并且储存。
为了确定选择的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR单克隆抗体是否与独特的表位结合，可以使用可商购的试剂(皮尔斯公司(Pierce)，罗克福德(Rockford)，I11)使每个抗体生物素化。可以使用如上所述的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR包衣的-ELISA平板进行使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争性研究。可以用链球菌抗生物素蛋白碱性磷酸酯酶探针检测生物素化的mAb结合。
为了确定纯化抗体的同种型，可以使用特异性针对一种具体同种型的抗体的试剂来进行同种型ELISA。例如，为了确定人类单克隆抗体的同种型，可以将微量滴定板的孔用1μg/ml的抗人类免疫球蛋白在4℃下包衣过夜。在用1％的BSA封闭之后，将这些平板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在周围温度下反应一至两小时。然后这些孔可以与人类IgG1亦或人类IgM-特异性碱性磷酸酯酶偶联探针进行反应。将平板如上所述进行显影和分析。
可以通过蛋白印迹法分别针对与LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原的反应性对抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR IgG进行进一步测试。简言之，可以制备LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原并且让其经受十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，将这些分离的抗原转移至硝酸纤维素滤膜，用10％胎牛血清进行封闭，并且用有待测试的单克隆抗体进行探测。可以使用抗人类IgG碱性磷酸酯酶对人类IgG结合进行检测，并且用BCIP/NBT底物片剂(西格玛化学有限公司(Sigma Chem.Co.)，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州)进行显影。
替代支架
根据至少一些实施例，本发明涉及具有类似于特异性抗体的范围的特异性和亲和性的蛋白支架。根据至少一些实施例，本发明涉及一种抗原结合构建体，这种抗原结合构建体包括一个被连接至一个或多个表位结合结构域的蛋白支架。此类工程化蛋白支架通常是通过设计一个聚焦于环区或另外的可允许表面区域的随机突变库并且通过经由噬菌体展示或相关技术针对给定的靶标对变体进行选择来获得的。根据至少一些实施例，本发明涉及替代支架，包括，但不局限于：anticalin、DARPin、犰狳重复序列蛋白(Armadillo repeatproteins)、蛋白A、脂质运载蛋白、纤维连接蛋白结构域、锚蛋白共有序列重复结构域(ankyrin consensus repeat domain)、硫氧还蛋白、化学约束肽(chemicallyconstrained peptides)等。根据至少一些实施例，本发明涉及可以用作治疗癌症、自体免疫和传染病连同用于体内诊断学的治疗剂的替代支架。
根据至少一些实施例，本发明进一步提供了一种药物组合物，包括一种如在此所述的抗原结合构建体、一种药学上可接受的载体。
如在此使用，术语“蛋白支架”包括但不局限于免疫球蛋白(Ig)支架，例如IgG支架，可以是四链或双链抗体，或可以只包括抗体的Fc区，或可以包括来自抗体的一个或多个恒定区(其恒定区可以是人类的或灵长类源的)，或可以是人类和灵长类恒定区的人造嵌合体。此类蛋白支架除了一个或多个恒定区之外还可以包括抗原结合位点，例如其中该蛋白支架包括一个完整IgG。此类蛋白支架能够被连接至其他蛋白结构域，例如具有抗原结合位点的蛋白结构域，例如表位结合结构域或ScFv结构域。
“结构域”是一种具有独立于蛋白的其他部分的三级结构的折叠的蛋白结构。通常，结构域负责蛋白的离散功能特性，并且在许多情况下，可以被添加至、除去或转移至其他蛋白而不失去该蛋白的剩余物和/或该结构域的功能。“单个抗体可变结构域”是一种包括抗体可变结构域的序列特征的折叠的多肽结构域。因此，它包括完全抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如其中的一个或多个环已经被不是抗体可变结构域的特征的序列所替代，或已经被平截或包括N末端或C末端延伸的抗体可变结构域，连同至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。
术语“免疫球蛋白单个可变结构域”是指与独立于不同V区或结构域的抗原或表位特异性结合的抗体可变结构域(VH、V HH、V L)。免疫球蛋白单个可变结构域能以与其他不同可变区或可变结构域一起(例如，同多聚体或异多聚体)的方式存在，其中该单个免疫球蛋白可变结构域不需要这些其他区或结构域结合抗原(即，其中该免疫球蛋白单个可变结构域独立于额外的可变结构域地结合抗原)。“结构域抗体”或“dAb”与如在此所使用能够结合抗原的“免疫球蛋白单个可变结构域”是相同的。免疫球蛋白单个可变结构域可以是人类抗体可变结构域，但是还包括来自其他物种的单个抗体可变结构域，例如啮齿类动物(例如，如在WO 00/29004中所披露)、铰口鲨以及骆驼科动物V HH dAb。骆驼科动物V HH是来源于包括以下物种、产生天然缺乏轻链的重链抗体的免疫球蛋白单个可变结构域多肽：骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼、以及原驼。此类V HH结构域可以根据本领域可用的标准技术人源化，并且根据本发明此类结构域仍被认为是“结构域抗体”。如在此使用，“VH”包括骆驼科动物V HH结构域。NARV是另一类在软骨鱼类(包括铰口鲨)中鉴定出的免疫球蛋白单个可变结构域。这些结构域也称为新颖抗原受体(Novel Antigen Receptor)可变结构域(通常缩写为V(NAR)或NARV)。进一步的细节参见《分子免疫学》(Mol.Immunol.)44，656-665(2006)和US 20050043519 A。
术语“表位结合结构域”是指与独立于不同V区或结构域的抗原或表位特异性结合的结构域，这可以是一种结构域抗体(dAb)(例如人类、骆驼科动物或鲨鱼免疫球蛋白单个可变结构域)或它可以是一种作为选自下组的支架的衍生物的结构域，该组由以下各项组成：CTLA-4(Evibody)；脂质运载蛋白；蛋白A衍生的分子，例如蛋白A的Z-结构域(Affibody，SpA)，A-结构域(Avimer/Maxibody)；热激蛋白，例如GroEI和GroES；转移酶(反式体(trans-body))；锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)；肽适体；C-类凝集素结构域(四连接素)；人类&#947-晶体蛋白以及人类泛素蛋白(affilins)；PDZ结构域；人类蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz型结构域；犰狳重复序列蛋白、硫氧还蛋白、以及纤维连接蛋白(adnectin)；该结构域已经经受蛋白工程化以获得与除了天然配体之外的配体的结合。
对应于抗体的CDR的环可以被异源序列取代以赋予不同结合特性，即Evibodies。进一步的细节参见《免疫学方法杂志》(Journal of Immunological Methods)248(1-2)，31-45(2001)。脂质运载蛋白是一种转运疏水性小分子(例如甾体、后胆色素、类视黄醇以及脂质)的细胞外蛋白家族。它们具有刚性的二级结构，在圆锥形结构的开口末端有多个环，它们可以被工程化以与不同靶抗原结合。Anticalin大小是160-180个之间的氨基酸，并且来源于脂质运载蛋白。进一步的细节参见《生物化学与生物物理学学报》(Biochim BiophysActa)1482：337-350(2000)、US 7250297B 1以及US 20070224633。affibody是一种来源于金黄色葡萄球菌的蛋白A的支架，它可以被工程化以结合抗原。该结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化生成了文库。进一步的细节参见《蛋白工程设计与选择》(Protein Eng.Des.Sel.)17，455-462(2004)和EP 1641818 A1。Avimer是来源于A-结构域支架家族的多畴蛋白。约35个氨基酸的天然结构域采取限定的二硫化物键合结构。通过由A-结构域家族展示的天然变异的改组产生多样性。进一步的细节参见《自然生物技术》(Nature Biotechnology)23(12)，1556-1561(2005)以及《调研药物的专家评论》(Expert Opinion on Investigational Drugs)16(6)，909-917(June 2007)。转铁蛋白是一种单体血清转运糖蛋白。转铁蛋白可以通过将肽序列插入自由表面环中而被工程化以结合不用靶抗原。工程化转铁蛋白支架的实例包括反式体(Trans-body)。进一步的细节参见《生物化学杂志》(J.Biol.Chem)274，24066-24073(1999)。
设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)来源于锚蛋白，锚蛋白是一种介导整合膜蛋白附接至细胞骨架的蛋白家族。单个的锚蛋白重复序列是一种由两个α螺旋；β-转角组成的33个残基的基序。它们可以通过随机化在每个重复序列的第一α-螺旋和β-转角中的残基而被工程化，以结合不同的靶抗原。可以通过增加模块的数目来增加其结合界面(亲和性成熟的方法)。进一步的细节参见《分子生物学杂志》(J.MoT Biol.)332，489-503(2003)，PNAS100(4)，1700-1705(2003)和《分子生物学杂志》(J.MoT Biol.)369，1015-1028(2007)以及US 20040132028 A1。
纤维连接蛋白是一种可以被工程化以结合抗原的支架。Adnectin由15个重复单位的人类III型纤维连接蛋白(FN3)的第10结构域的天然氨基酸序列的骨架组成。位于β夹层的一个末端的三个环可以被工程化以使Adnectin能够特异性识别感兴趣的治疗靶标。进一步的细节参见《蛋白工程设计与选择》(Protein Eng.Des.Sel.)18，435-444(2005)、US20080139791、WO 2005056764以及US 6818418 B1。
肽适体是由恒定的支架蛋白、典型地是硫氧还蛋白(TrxA)组成的组合识别分子，这种恒定的支架蛋白包含在活性位点处插入的约束可变肽环。进一步的细节参见《生物疗法的专家意见》(Expert Opin.Biol.Ther.)5.783-797(2005)。
微体来源于长为25-50个氨基酸的天然发生的微量蛋白，这些微量蛋白包含3-4个半胱氨酸桥-微量蛋白的实例包括KalataBI和科诺毒素(cono toxin)以及knottin。这些微量蛋白具有一个环，该环可以被工程化以包括高达25个氨基酸而不影响该微量蛋白的整体折叠。工程化knottin结构域的进一步细节参见WO 2008098796。
结合结构域的其他表位包括已经作为支架被用于工程化不同靶抗原结合特性的蛋白，包括人类&#947；β-晶体蛋白和人类泛素蛋白(affilin)，人类蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域，Ras-结合蛋白AF-6的PDZ-结构域，蝎毒素(卡律蝎毒素(charybdotoxin)，C-型凝集素结构域(四连接素)，综述于第7章-来自治疗性抗体手册的非抗体支架(Non-AntibodyScaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies)(2007，由斯蒂芬迪贝尔(StefanDubel)编辑)和《蛋白科学》(Protein Science)15：14-27(2006)。本发明的表位结合结构域可以来源于任何这些替代蛋白结构域。
偶联物或免疫偶联物
本发明涵盖用于在免疫治疗中使用的偶联物，这些偶联物包括LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原及其可溶性部分，这些抗原及其可溶性部分包括其胞外结构域或部分或变体。例如，本发明涵盖以下偶联物，其中LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原的ECD被附接至一个免疫球蛋白或其片段。本发明考虑它们用于促进或抑制LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原活性(例如免疫共刺激)的用途以及它们在治疗移植、自体免疫、以及在此所描述的癌症适应症的用途。
在另一个方面中，本发明突出了被连接至一种有效负载药物(通常是细胞毒性的)、用于例如癌症的治疗、由一种抗体(或抗体片段，例如单链可变片段)组成的抗体-药物偶联物。抗体导致ADC结合至靶癌细胞。通常然后ADC被该细胞内化并且该药物被释放进该细胞。由于靶向，副作用被降低了并且给出一个更宽的治疗窗。亲水性连接物(例如，PEG4Mal)帮助阻止该药物通过MDR(多重抗药性)转运蛋白而被具有抗性的癌细胞泵出。虽然基于可剪切的连接物的ADC被认为具有更不利的治疗窗，但是不被有效地内化的靶标(肿瘤细胞表面抗原)似乎更适合作为可剪切的连接物。
在另一个方面中，本发明突出了免疫偶联物，这些免疫偶联物包括被偶联于一个治疗部分(例如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素)的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体、或其片段。此类偶联物在此被称为“免疫偶联物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫偶联物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒素剂包括任何对细胞有害(例如，杀死)的试剂。实例包括紫杉酚、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普罗卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌罗霉素及其类似物或同系物。治疗剂还包括例如，抗代谢药(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)，烷化剂(例如，氮芥、thioepa、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C、以及顺-二氯二氨铂(cis-dichlorodiamine platinum)(II)(DDP)顺铂)，蒽环类(例如，柔红霉素(原来是道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，更生霉素(原来是放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、以及安曲霉素(AMC))，以及抗有丝分裂试剂(例如，长春新碱和长春碱)。
可以偶联于根据本发明的至少一些实施例所述的抗体的治疗性细胞毒素的其他优选实例包括多卡米新、刺孢霉素、美登素和auristatin、及其衍生物。刺孢霉素抗体偶联物的一个实例是可商购的(Mylotarg.TM.；惠氏药厂(Wyeth))。
可以使用本领域中可用的连接物技术使细胞毒素偶联于根据本发明的至少一些实施例所述的抗体。已经用于将细胞毒素偶联于抗体的连接物类型的实例包括，但不局限于：腙、硫醚、酯、二硫化物以及包含肽的连接物。可以选择例如易于被溶酶体分隔区内低pH剪切或易于被蛋白酶(例如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶，例如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D))剪切的连接物。
为了进一步讨论细胞毒素的类型，用于将治疗剂偶联于抗体的连接物和方法还参见齐藤(Saito，G.)等人(2003)《先进药物输送评论》(Adv.Drug Deliv.Rev.)55：199-215；特雷尔(Trail，P.A.)等人(2003)《癌症免疫学，免疫疗法》(Cancer Immunol.Immunother.)52：328-337；佩恩(Payne，G.)(2003)《癌细胞》(Cancer Cell)3：207-212；艾伦(Allen，T.M.)(2002)《癌症自然评论》(Nat.Rev.Cancer)2：750-763；帕斯坦(Pastan，I.)和科莱特曼(Kreitman，R.J.)(2002)《研究药物新见》(Curr.Opin.Investig.Drugs)3：1089-1091；森特(Senter，P.D.)和斯普林格(Springer，C.J.)(2001)《先进药物输送评论》(Adv.DrugDeliv.Rev.)53：247-264。
本发明的抗体还可以被偶联于放射性同位素以产生细胞毒性放射性药物，也被称为放射免疫偶联物。可以被偶联于诊断或治疗用途的抗体的放射性同位素的实例你看，但不局限于：碘131、铟111、钇90以及镥177。用于制备放射免疫偶联物的方法在本领域中是建立的。放射免疫偶联物的实例是可商购的，包括泽娃灵(Zevalin)(IDEC制药公司)和托西莫(Bexxar)(Corixa制药公司)，并且可以使用类似方法来制备使用根据本发明的至少一些实施例所述的抗体的放射免疫偶联物。
根据本发明的至少一些实施例所述的抗体偶联物可以被用来修饰一种给定的生物应答，并且药物部分不被理解为局限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是拥有所希望的生物活性的蛋白或多肽。此类蛋白可以包括例如，酶促活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素；一种蛋白，例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或，生物学反应修饰剂，例如像淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其他生长因子。
用于将此类治疗部分偶联于抗体的技术是熟知的，参见例如，《单克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)中的阿尔农(Arnon)等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”(“用于在癌症治疗中免疫靶向药物的单克隆抗体”)，雷斯菲尔德(Reisfeld)等人(编辑)，pp.243-56(艾伦R·利斯公司(Alan R.Liss，Inc.)1985)；《药物缓释》(Controlled DrugDelivery)(第二版)中的赫尔斯特伦(Hellstrom)等人，“Antibodies For Drug Delivery”(“用于药物递送的抗体”)，罗宾逊(Robinson)等人(编辑)，pp.623-53(马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)1987)；《单克隆抗体′84：生物学应用和临床应用》(MonoclonalAntibodies′84：Biological And Clinical Applications)中的索普(Thorpe)，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”(“在肿瘤治疗中细胞毒素剂的抗体运载体：综述”)，平凯拉(Pinchera)等人(编辑)，pp.475-506(1985)；《用于癌症检测和治疗的单克隆抗体》(Monoclonal Antibodies For Cancer Detection AndTherapy)中的“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic UseOf Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”(“放射性标记的抗体在癌症治疗中的治疗用途的分析、结果、以及未来展望”)，鲍德温(Baldwin)等人(编辑)，pp.303-16(AcademicPress(学术出版社)1985)，以及索普(Thorpe)等人，“The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates”(“抗体-毒素偶联物的制备和细胞毒性特性”)，《免疫学评论》(Immunol.Rev.)，62：119-58(1982)。
双特异性分子
在另一个方面中，本发明突出了双特异性分子，这些双特异性分子包括根据本发明的至少一些实施例所述的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体、或其片段。根据本发明的至少一些实施例所述的抗体、或其抗原结合部分可以被衍生化或被连接至另一种功能分子，例如，另一种肽或蛋白(例如，受体的另一种抗体或配体)，以产生与至少两个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。根据本发明的至少一些实施例所述的抗体还可以被实际衍生化或被连接至一种其他的功能分子以产生与多于两个的不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；此类多特异性分子也旨在由如在此使用的术语“双特异性分子”所涵盖。为了产生根据本发明的至少一些实施例所述的双特异性分子，可以将一种抗体功能上地连接至(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价联合或以另外的方式)一个或多个其他结合分子，例如另一个抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，这样使得生成一种双特异性分子。
因此，本发明包括以下双特异性分子，这些双特异性分子包括至少一种对LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的第一结合特异性以及对一种第二靶向表位的第二结合特异性。根据本发明的至少一些实施例，这种第二靶向表位是一种Fc受体，例如人类FcγRI(CD64)或人类Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括能够与FcγR、FcαR或FcεR表达效应细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))，以及与分别表达LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的靶细胞两者结合的双特异性分子。这些双特异性分子将LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR表达细胞靶向于效应细胞并且触发Fc受体介导的效应细胞活性，例如LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR表达细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放、或超氧化物阴离子的产生。
根据本发明的至少一些实施例，其中这种双特异性分子是多特异性的，该分子除了抗-Fc结合特异性和抗-6f结合特异性之外，还可以进一步包括一种第三结合特异性。在一个实施例中，该第三结合特异性是一种抗增强因子(EF)蛋白，例如与细胞毒性活性中涉及的表面蛋白结合并且由此增加对靶细胞的免疫应答的分子。
术语“抗增强因子部分”可以是与给定分子(例如，抗原或受体)结合的抗体、功能性抗体片段或配体，并且由此导致Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇的作用的增强。“抗增强因子部分”可以结合Fc受体或靶细胞抗原。可替代地，抗增强因子部分可以与一种实体结合，该实体不同于第一和第二结合特异性结合的实体。例如，抗增强因子部分可以结合细胞毒性T-细胞(例如，经由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或导致针对靶细胞的增加的免疫应答的其他免疫细胞)。
根据本发明的至少一些实施例，这些双特异性分子包括作为结合特异性的至少一种抗体、或其抗体片段，包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、或单链Fv。这种抗体还可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，例如Fv或在拉德纳(Ladner)等人美国专利号4,946,778中所描述的单链构建体，其内容通过引用专门结合。
在一个实施例中，对Fey受体的结合特异性是由一种单克隆抗体提供的，这种结合不被人类免疫球蛋白G(IgG)所阻断。如在此使用，术语“IgG受体”是指位于染色体1上的八种γ-链基因的任一种。这些基因编码总数为十二的跨膜或可溶性受体同种型，这些同种型被分为三个Fcγ受体种类：FcγRl(CD64)、FcγRII(CD32)、以及Fcγ.RIII(CD16)。在一个优选实施例中，Fcγ受体是一种人类高亲和性FcγRI。人类FcγRI是一种对单体IgG(10 8-10-9 M.-1)示出高亲和性的72kDa的分子。
某些优选的抗-Fcγ单克隆抗体的生产和表征描述于范格(Fanger)等人的PCT公开案WO 88/00052中和美国专利号4,954,617中，其传授内容通过引用而完全结合在此。这些抗体在一个不同于该受体的Fcγ结合位点的位点处与FcγRl、FcyRII或FcyRIII的表位结合，因此，其结合不被生理水平的IgG实质阻断。在本发明中有用的特异性抗-FcγRl抗体是mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62以及mAb 197。生产mAb 32的杂交瘤从美国种质保存中心，ATCC登录号HB9469是可获得的。在其他实施例中，抗-Fcy受体抗体是单克隆抗体22(H22)的人源化形式。H22抗体的生产和表征描述于葛致诺(Graziano，R.F.)等人(1995)《免疫学杂志》(J.Immunol.)155(10)：4996-5002和PCT公开案WO 94/10332中。生产H22抗体的细胞系保藏于美国种质保存中心的HA022CLI名下并且具有登录号CRL 11177。
在仍其他优选实施例中，对Fc受体的结合特异性是由与人类IgA受体(例如，Fc-α受体(FcαRI(CD89)))结合的抗体提供的，其结合优选地不被人类免疫球蛋白A(IgA)所阻断。术语“IgA受体”旨在包括位于染色体19上的α-基因(FcαRI)的基因产物。已知这个基因编码若干55kDa至10kDa的可变剪接的跨膜同种型。
FcαRI(CD89)组成性地表达于单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜中性粒细胞上，但是不在非效应细胞群体上表达。FcαRI对IgA1和IgA2两者具有中等亲和性(约5X10-7 M-l)，这种亲和性当暴露于细胞因子(例如G-CSF或GM-CSF)时增加(莫尔顿(Morton，H.C.)等人(1996)《免疫学关键评论》(Critical Reviews in Immunology)16：423-440)。已经对结合IgA配体结合结构域外的FcαRI、被鉴定为A3、A59、A62以及A77的四种FcαRI-特异性单克隆抗体进行了描述(蒙泰罗(Monteiro，R.C.)等人(1992)《免疫学杂志》(J.Immunol.)148：1764)。
FcαRI和FcγRI是用于在根据本发明的至少一些实施例所述的双特异性分子中使用的优选触发受体，因为它们(1)主要在免疫效应细胞中表达，例如，单核细胞、PMN、巨噬细胞以及树突细胞；(2)以高水平表达(例如，5,000-100,000/细胞)；(3)是细胞毒性活性的介质(例如，ADCC、吞噬作用)；(4)介导抗原的增强的抗原递呈，包括靶向它们的自体抗原。
尽管人类单克隆抗体是优选的，但是可以在根据本发明的至少一些实施例所述的双特异性分子中采用的其他抗体是鼠科动物的、嵌合体的以及人源化的单克隆抗体。
本发明的双特异性分子可以使用本领域中已知的方法通过使组分结合特异性，例如抗-FcR和抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR结合特异性偶联来制备。例如，双特异性分子的每种结合特异性可以分别产生并且然后彼此偶联。当结合特异性是蛋白或肽时，可以使用多种偶联剂或交联剂来用于共价轭合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、o-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基-二硫)丙酸酯(SPDP)、以及硫代琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(硫代-SMCC)(参见例如，卡普夫斯基(Karpovsky)等人(1984)《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)160：1686；刘(Liu，M A)等人(1985)《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82：8648)。其他方法包括保卢斯(Paulus)(1985)贝林研究所通讯(Behring Ins.Mitt.)No.78，118-132；布伦南(Brennan)等人(1985)《科学》(Science)229：81-83)、和格伦尼(Glennie)等人(1987)《免疫学杂志》(J.Immunol.)139：2367-2375)中描述的那些。优选的偶联剂是SATA和硫代-SMCC，两者都从皮尔斯化学有限公司(Pierce Chemical Co.)(罗克福德，I11.)可获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以经由两个重链的C-末端绞链区的巯基键合来偶联。在一个特别优选的实施例中，在轭合之前，将绞链区进行修饰以包含奇数的巯基残基，优选是一个。
可替代地，两种结合特异性可以在同一载体中编码并且在同一宿主细胞中表达和组装。当双特异性分子是mAbXmAb、mAbXFab、FabXF(ab′)2或配体XFab融合蛋白时，这种方法是特别有用的。根据本发明的至少一些实施例所述的双特异性分子可以是一种包括一个单链抗体和一个结合决定簇的单链分子，或一种包括两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包括至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；以及美国专利号5,482,858中。
这些双特异性分子与其特异性靶标的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(IA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)、或蛋白印迹测定来进行确认。每种这些测定通常通过采用对感兴趣的复合体特异的标记试剂(例如，抗体)来检测特别感兴趣的蛋白-抗体复合体的存在。例如，可以使用例如识别并且与抗体-FcR复合体特异性结合的酶连抗体或抗体片段对FcR-抗体复合体进行检测。可替代地，可以使用多种其他免疫测定对这些复合体进行检测。例如，可以将该抗体放射性标记并且在放射性免疫测定(RIA)中使用(参见例如，温特劳布(Weintraub，B.)，Principles ofRadioimmunoassays(放射性免疫测定的原则)，Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques(关于放射性配体测定技术的第七次培训课程)，TheEndocrine Society(内分泌学会)，1986年3月，将其通过引用结合在此)。可以通过这样的手段，如使用γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影来对放射性同位素进行检测。
蛋白修饰
融合蛋白
根据至少一些实施例，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR融合多肽具有包括LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的全部或一部分的第一融合配偶体，该第一融合配偶体融合至第二多肽，融合是直接的或经由对于连接这两种蛋白有用的连接物肽序列或化学连接物的。LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽能可任选地被融合至一个第二多肽以形成如在此所描述的融合蛋白。该第二多肽的存在可以改变LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR融合多肽的溶解性、稳定性、亲和性和/或化合价。如在此使用，“化合价”是指每个分子可供使用的结合位点的数目。在一个实施例中，该第二多肽是来自不同来源或不同蛋白的多肽。
根据至少一些实施例，针对其对于治疗免疫相关失调和/或感染性失调、和/或如在此所描述的癌症的活性对LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白或片段进行选择。
在一个实施例中，第二多肽包含一个免疫球蛋白重链恒定区的一个或多个结构域，该恒定区优选具有对应于人类免疫球蛋白Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4链的铰链、CH2以及CH3区或对应于鼠科动物免疫球蛋白Cγ2a链的铰链、CH2以及CH3区的氨基酸序列。SEQ IDNO：70提供了人类免疫球蛋白Cγ1的铰链、CH2以及CH3区的示例性序列。
根据至少一些实施例，该融合蛋白是一种二聚体融合蛋白。在一个任选的二聚体融合蛋白中，二聚体由两个Ig重链的铰链区中的Cys残基的共价键结产生，这些Cys残基是二聚化的正常Ig重链中以二硫键连接的相同Cys残基。此类蛋白被称为LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽、或其片段或融合蛋白。
在一个实施例中，免疫球蛋白恒定结构域可以包含增强LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽、其融合蛋白或片段的与具体细胞类型的结合、增加其生物利用度或增加其稳定性的一个或多个氨基酸插入、缺失或取代。适合的氨基酸取代包括如上所述的保守以及非保守取代。
这些融合蛋白任选地包含起作用以便使两个或更多个融合蛋白二聚化或多聚化的一个结构域。肽/多肽连接物结构域可以是一种单独的结构域，亦或可替代地，可以被包含在该融合蛋白的其他结构域之一(LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽或第二多肽)内。类似地，发挥作用以便使融合蛋白二聚化或多聚化的这个结构域可以是一种单独的结构域，亦或可替代地，可以被包含于该融合蛋白的其他结构域之一(LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽、第二多肽或肽/多肽连接物结构域)内。在一个实施例中，二聚化/多聚化结构域以及肽/多肽连接物结构域是相同的。二聚化/多聚化结构域以及连接物的进一步的具体、说明性以及非限制实例在下文阐明。
根据本发明的至少一些实施例，在此所披露的融合蛋白具有式I：N-R1-R2-R3-C，其中“N”表示该融合蛋白的N-末端，“C”表示该融合蛋白的C-末端。在另外的实施例中，“R1”是LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽，“R2”是可任选的肽/多肽或化学连接物结构域，并且“R3”是第二多肽。可替代地，R3可以是LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽并且R1可以是第二多肽。连接物的不同的非限制性实例更加详细地描述于以下。
任选地，该融合蛋白包括可任选地经由一个或多个氨基酸的连接物肽(例如GS)被融合至一个或多个“半衰期延长的部分”的如在此所描述的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽片段。“半衰期延长的部分”是当被附加到蛋白上时延长该蛋白在受试者的身体内(例如，在该受试者的血浆内)的体内半衰期的任何部分，例如一种多肽、小分子或聚合物，例如，半衰期延长部分在本发明的一个实施例中是聚乙二醇(PEG)、单甲氧基PEG(mPEG)或免疫球蛋白(Ig)。在本发明的一个实施例中，PEG是5、10、12、20、30、40或50kDa的部分或更大或包含约12000个乙二醇单元(PEG 12000)。
融合蛋白也可任选地通过化学合成方法来制备并且在合成或合成后过程中用化学方法实现“连接”。可任选地使用交联以及其他这类方法(任选地还使用以上描述的基因水平融合方法)，如例如在Wallner(瓦尔纳)等的美国专利号5,547,853中描述，该专利只作为非限制性实例通过引用结合在此，其引用程度如同完全在此阐明一样。
根据本发明，融合蛋白可用本发明的蛋白通过与包含一种免疫球蛋白的恒定区的免疫球蛋白的一部分融合来制备。更优选地，该免疫球蛋白的该部分包含任选地并且更优选地为人重链恒定区的重链恒定区。该重链恒定区最优选地为IgG重链恒定区，并且任选地以及最优选地为Fc链，最优选地为包含铰链、CH2以及CH3结构域的IgG Fc片段。该Fc链能可任选地为已知或“野生型”Fc链，或可替代地可以是突变的或平截的。融合蛋白的Fc部分可任选地按照同种型或子类而不同，可以是嵌合体或杂合体，和/或可经过修饰以便例如改进效应子功能、控制半衰期、组织可接近性、增进生物物理特性例如稳定性，并且改进产生效率(并且成本更小)。在构建所披露的融合蛋白中有用的许多修饰以及制备它们的方法在本领域是已知的，参见例如穆勒(Mueller)等人，《分子免疫学》(Mol.Immun.)，34(6)：441-452(1997)，斯旺(Swann)等人，《免疫学当前观点》(Cur.Opin.Immun.)，20：493-499(2008)，以及普雷斯塔(Presta)，《免疫学当前观点》(Cur.Opin.Immun.)20：460-470(2008)。在一些实施例中，该Fc区为原生IgG1、IgG2或IgG4 Fc区。在一些实施例中，该Fc区是杂合体，例如由IgG2/IgG4 Fc恒定区组成的嵌合体。
该Fc区的修饰包括但不局限于：IgG4被修饰以阻止与Fcγ受体和补体的结合，IgG1被修饰以改善与一种或多种Fcγ受体的结合，IgG1被修饰以最小化效应因子功能(氨基酸变化)，具有改变的/不具有多糖的IgG1(典型地通过改变表达宿主或取代位置297处的Asn)，以及具有对FcRn的改变的pH-依赖性结合的IgG1。该Fc区可以包括整个铰链区，或不足整个铰链区。
在另一个实施例中，Fc结构域可以包含一个或多个氨基酸插入、缺失或取代，这些插入、缺失或取代减少与低亲和性抑制的Fc受体CD32B(FcγRIIB)的结合并且保持野生型水平的与低亲和性活化Fc受体CD16A(FcγRIIIA)的结合或增强与之的结合。
另一个实施例包括IgG2-4杂合体和IgG4突变体，它们具有降低的与FcR(Fc受体)的结合，从而增加其半衰期。代表性IgG2-4杂合体和IgG4突变体描述于安盖尔(Angal，S.)等人，《分子免疫学》(Molecular Immunology)，30(1)：105-108(1993)；穆勒(Mueller，J.)等人，《分子免疫学》(Molecular Immunology)，34(6)：441-452(1997)；以及王(Wang)等人的美国专利号6,982,323中。在一些实施例中，IgG1和/或IgG2结构域被缺失；例如，Angal(安盖尔)等人描述具有丝氨酸241替换为脯氨酸的IgG1和IgG2。
在另外的实施例中，该Fc结构域包含增强与CD16A的结合的氨基酸插入、缺失或取代。在人类IgG1的Fc结构域内增加与CD16A的结合并且减少与CD32B的结合的大量取代在本领域是已知的并且描述于斯塔文哈根(Stavenhagen)等人，《癌症研究》(Cancer Res.)，57(18)：8882-90(2007)中。具有降低的与CD32B的结合和/或增加的与CD16A的结合的人类IgG1 Fc结构域的示例性变体包含F243L、R929P、Y300L、V305I或P296L取代。这些氨基酸取代可按任何组合存在于人IgG1 Fc结构域中。
在一个实施例中，该人IgG1 Fc结构域变体包含F243L、R929P以及Y300L取代。在另一个实施例中，人IgG1 Fc结构域变体包含F243L、R929P、Y300L、V305I以及P296L取代。在另一个实施例中，人IgG1 Fc结构域变体包含N297A/Q取代，因为这些突变消除FcγR结合。非限制、说明性、示例性类型的突变描述于2006年2月16日公开的美国专利申请号20060034852中，该申请通过引用结合在此，其引用程度如同完全在此阐明一样。术语“Fc链”还可任选地包括任何类型的Fc片段。
已经鉴定对于IgG子类中的抗体恒定区介导的活性而言重要的几个特定氨基酸残基。因此，包含、取代或排除这些特定氨基酸允许包含或排除特定免疫球蛋白恒定区介导的活性。此外，特定变化可产生例如去糖基化和/或Fc链的其他所希望变化。可任选地产生至少一些变化以便阻断被认为不合需要的Fc功能，例如不合需要的免疫系统效应，如下文更详细描述的。
可以突变至Fc以调节该融合蛋白的活性的非限制性、示意性实例包括以下变化(关于如由卡巴特(Kabat)给出的Fc序列命名法而给出，来自卡巴特(Kabat EA)等人：《免疫学感兴趣的蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，USDepartment of Health and Human Services(美国卫生和人类服务部)，NIH，1991)：220C-＞S；233-238ELLGGP-＞EAEGAP；265D-＞A，优选地与434N-＞A组合；297N-＞A(例如用来阻断N-糖基化)；318-322 EYKCK-＞AYACA；330-331AP-＞SS；或其组合(参见例如克拉克(M.Clark)，“Chemical Immunol and Antibody Engineering”(“化学免疫学和抗体工程”)，pp 1-31来得到这些突变及其作用的说明)。特征为以上变化的Fc链的构建体任选地并且优选地包括铰链区与CH2和CH3结构域的组合。
以上突变可任选地实施以便增强所希望的特性或替代地阻断不希望的特性。例如，已显示抗体的去糖基化可在阻断T-细胞的耗尽或触发细胞因子释放的同时维持所希望的结合功能性，此举可任选地为不希望有的功能(参见M.Clark(M.克拉克)，“ChemicalImmunol and Antibody Engineering”(“化学免疫学和抗体工程”)，pp 1-31)。将331脯氨酸取代为丝氨酸可以阻断活化补体的能力，这能可任选地被认为是不希望有的功能(参见M.Clark(克拉克)，“Chemical Immunol and Antibody Engineering”(“化学免疫学和抗体工程”)，pp 1-31)。结合此变化将330丙氨酸改变成丝氨酸也可以增强阻断活化补体的能力的所希望的作用。
已显示残基235和237涉及到抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，使得如果ADCC被认为是不合需要的功能，如所描述改变233-238残基区块也可阻断这种活性。
残基220通常是来自IgG1的Fc的半胱氨酸，它是重链与轻链形成共价键的位点。可任选地，可以将此残基改变为另一种氨基酸残基(例如，丝氨酸)，以避免任何类型的共价键(参见克拉克(M.Clark)，“Chemical Immunol and Antibody Engineering”(“化学免疫学和抗体工程”)，pp 1-31)或通过缺失或平截。
残基265和434的以上变化可任选地实施以便减少或阻断与Fc受体的结合，这可任选地阻断Fc的与其免疫系统功能相关的不希望有的功能(参见“Binding site on HumanIgG1 for Fc Receptors”“人类IgG1上Fc受体的结合位点”，希尔兹(Shields)等人，Vol276，pp 6591-6604，2001)。
以上变化只用来说明任选的变化并且不欲以任何方式具有限制性。此外，以上解释只出于描述目的而提供，而不希望受单一假设限制。
在一个另外的实施例中，该融合蛋白包括融合至Ig Fc区的LY6G6F、或其片段的细胞外结构域。重组体IgLY6G6F多肽、其片段或融合蛋白，融合蛋白可以通过如前所述地将LY6G6F或其片段的细胞外结构域的编码区融合至人类IgG1或小鼠IgG2a的Fc区来制备(沙波瓦尔(Chapoval)等人，《分子药学方法》(Methods MoT Med)，45：247-255(2000))。
可任选地，LY6G6F ECD还指包括融合至人类免疫球蛋白Fc的人类LY6G6F ECD的氨基酸序列的融合蛋白。可任选地，所述融合蛋白包括融合至任一SEQ ID NO：70、156中所阐明的人类IgG1 Fc的SEQ ID NO：2中所阐明的人类LY6G6F ECD的氨基酸序列。可任选地，所述融合蛋白的氨基酸序列给出于SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：172中。
在一个另外的实施例中，该融合蛋白包括融合至Ig Fc区的VSIG10、或其片段的细胞外结构域。重组体IgVSIG10多肽、其片段或融合蛋白，融合蛋白可以通过如前所述地将VSIG10或其片段的细胞外结构域的编码区融合至人类IgG1或小鼠IgG2a的Fc区来制备(Chapoval等人，Methods Mol.Med(《分子药学方法》)，45：247-255(2000))。
可任选地，VSIG10 ECD还指包括融合至人类免疫球蛋白Fc的人类VSIG10 ECD的氨基酸序列的融合蛋白。可任选地，所述融合蛋白包括融合至任一SEQ ID NO：70、156中所阐明的人类IgG1 Fc的选自任一SEQ ID NO：4和6中所阐明的氨基酸序列的人类VSIG10 ECD的氨基酸序列。可任选地，所述融合蛋白的氨基酸序列给出于任一SEQ ID NO：72、73、173以及174中。
在一个另外的实施例中，该融合蛋白包括融合至Ig Fc区的TMEM25、或其片段的细胞外结构域。重组体IgTMEM25多肽、其片段或融合蛋白，融合蛋白可以通过如前所述地将TMEM25或其片段的细胞外结构域的编码区融合至人类IgG1或小鼠IgG2a的Fc区来制备(Chapoval等人，Methods Mol.Med(《分子药学方法》)，45：247-255(2000))。
可任选地，TMEM25 ECD还指包括融合至人类免疫球蛋白Fc的人类TMEM25 ECD的氨基酸序列的融合蛋白。可任选地，所述融合蛋白包括融合至任一SEQ ID NO：70、156中所阐明的人类IgG1 Fc的SEQ ID NO：8中所阐明的人类TMEM25 ECD的氨基酸序列。可任选地，所述融合蛋白的氨基酸序列给出于任一SEQ ID NO：74、175中。
在一个另外的实施例中，该融合蛋白包括融合至Ig Fc区的LSR、或其片段的细胞外结构域。重组体Ig LSR多肽、其片段或融合蛋白，融合蛋白可以通过如前所述地将LSR或其片段的细胞外结构域的编码区融合至人类IgG1或小鼠IgG2a的Fc区来制备(Chapoval等人，Methods Mol.Med(《分子药学方法》)，45：247-255(2000))。
可任选地，LSR ECD还指包括融合至人类免疫球蛋白Fc的人类LSR ECD的氨基酸序列的融合蛋白。可任选地，所述融合蛋白包括融合至任一SEQ ID NO：70、156中所阐明的人类IgG1 Fc的选自任一SEQ ID NO：12、14、15、16、17、18、47、48、49以及50中所阐明的氨基酸序列的人类LSR ECD的氨基酸序列。可任选地，所述融合蛋白的氨基酸序列给出于任一SEQID NO：75、76、77、78、79、80、176、177、178、179、180、以及181中。
前述示例性融合蛋白可合并有在此描述的变体的任何组合。在另一个实施例中，前述示例性融合蛋白的末端赖氨酸被删除。
所披露的融合蛋白可使用标准分子生物学技术来分离。例如，将包含编码LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽、其片段或融合蛋白的DNA序列的表达载体通过磷酸钙沉淀而转染至293细胞中并且在无血清DMEM中培养。在72h收集上清液并且通过蛋白G、或优选地蛋白A管柱(法玛西亚公司(Pharmacia)，乌普萨拉(Uppsala)，瑞典)来纯化该融合蛋白。可任选地，将编码LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽、其片段或融合蛋白的DNA序列转染至逆转录病毒载体中并且在四轮逆转录病毒载体转导之后，在CHO-S细胞中表达。该蛋白通过使用蛋白A色谱法从上清液中净化。
在另一个实施例中，该第二多肽可以具有通过它额外的分子可以结合至LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR融合蛋白的偶联结构域。在一个这样的实施例中，被偶联的分子能够将融合蛋白靶向输送至特定器官或组织；这类靶向结构域和/或分子的进一步的具体、说明性、非限制性实例在下文阐明。
在另一个这样的实施例中，偶联分子是可以增强或增加LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR融合蛋白的作用的另一种免疫调节剂。在另一个实施例中，偶联分子是聚乙二醇(PEG)。
肽或多肽连接物结构域
所披露的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR融合蛋白可任选地包含将LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽与第二多肽分离的肽或多肽连接物结构域。在一个实施例中，该连接物结构域包含一种免疫球蛋白的铰链区。在一个另外的实施例中，该铰链区来源于人类免疫球蛋白。该铰链可来源于的适合的人类免疫球蛋白包括IgG、IgD以及IgA。在一个另外的实施例中，铰链区来源于人类IgG。免疫球蛋白铰链区以及其他结构域的氨基酸序列在本领域是熟知的。在一个实施例中，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR融合多肽包含与SEQID NO：70中所阐明的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、99％或100％序列同源性的人类免疫球蛋白Cγ1链的绞链区、CH2区以及CH3区，可任选地其中位置220处的Cys(根据全长人类IgG1，在SEQ ID NO：70中的位置5)被Ser(SEQ ID NO：156)替代：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
铰链可以被进一步缩短以便去除任一SEQ ID NO：70或156的氨基酸1、2、3、4、5、或其组合。在一个实施例中，任一SEQ ID NO：70或156的氨基酸1-5被缺失。包含位置220处的Cys被Ser替代的人类免疫球蛋白Cγ1链的绞链区、CH2区以及CH3区的示例性LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR融合多肽给出于SEQ ID NO：71、72、73、74、75、76、77、78、79、80中。
在另一个实施例中，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR融合多肽包含与SEQ ID NO：157中所阐明的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、99％或100％序列同源性的人类免疫球蛋白Cγ1链的CH2区以及CH3区：APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在另一个实施例中，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR融合多肽包含与SEQ ID NO：158中所阐明的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、99％或100％序列同源性的鼠科动物免疫球蛋白Cγ2a链的CH2区以及CH3区：EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK。在另一个实施例中，该连接物结构域包含如上所述的一种免疫球蛋白的铰链区，并且进一步包含一个或多个另外的免疫球蛋白结构域。
其他适合的肽/多肽连接物结构域包含天然发生或非天然发生的肽或多肽。肽连接物序列具有至少2个氨基酸的长度。任选地，肽或多肽结构域是柔性肽或多肽。“柔性连接物”在此是指包含由一个或多个肽键连接的两个或更多个氨基酸残基的肽或多肽，这为由此连接的两个多肽提供了比在该柔性连接物不存在下这两个被连接的多肽将具有的转动自由度增加的转动自由度。这种转动自由度允许由该柔性连接物连接的两个或更多个抗原结合位点各自更有效地接近一个或多个靶抗原。示例性柔性肽/多肽包括但不局限于以下氨基酸序列：Gly-Ser(SEQ ID NO：159)，Gly-Ser-Gly-Ser(SEQ ID NO：160)，Ala-Ser(SEQID NO：161)，Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：162)，Gly4-Ser(SEQ ID NO：163)，(Gly4-Ser)2(SEQ ID NO：164)，(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO：165)以及(Gly4-Ser)4(SEQ ID NO：166)。额外的柔性肽/多肽序列在本领域是熟知的。其他适合的连接物结构域包括螺旋形成连接物，例如Ala-(Glu-Ala-Ala-Ala-Lys)n-Ala(n＝1-5)。额外的螺旋形成肽/多肽序列在本领域是熟知的。此类连接物的非限制性实例描绘于SEQ ID NO：167-171中。
二聚化、多聚化以及靶向结构域
在此披露的融合蛋白任选地包含起作用以便使两个或更多个融合蛋白二聚化或多聚化的一个二聚化或多聚化结构域。发挥作用以便使融合蛋白二聚化或多聚化的这个结构域可以是一种单独的结构域，亦或可替代地，可以被包含于该融合蛋白的其他结构域之一(LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽、第二多肽或肽/多肽连接物结构域)内。
二聚化或多聚化可以经由二聚化或多聚化结构域在两个或更多个融合蛋白之间发生。可替代地，融合蛋白的二聚化或多聚化可通过化学交联发生。形成的二聚体或多聚体可以是同型二聚体/同型多聚体或异源二聚体/异源多聚体。LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽多肽中的第二多肽“配偶体”可以由一种或多种如在此所描述的其他蛋白、蛋白片段或肽组成，包括但不局限于任何免疫球蛋白(Ig)蛋白或其部分(优选是Fc区)，或生物活性蛋白或化学活性蛋白的部分，例如乳头状瘤病毒E7基因产物、黑色素瘤相关抗原p97、以及HIV env蛋白(gp120)。可任选地选择“配偶体”以提供可溶性二聚体/多聚体和/或一种或多种在此所描述的其他生物活性。
“二聚化结构域”由至少两种氨基酸残基或由至少两种肽或多肽(可以具有相同、或不同的氨基酸序列)形成。肽或多肽可经由共价和/或非共价缔合来彼此相互作用。任选的二聚化结构域包含能够与配偶体融合蛋白上的半胱氨酸形成分子间二硫键的至少一个半胱氨酸。二聚化结构域可包含一个或多个半胱氨酸残基以使得可在配偶体融合蛋白之间形成一个或多个二硫键。在一个实施例中，二聚化结构域包含一个、两个或三个至约十个半胱氨酸残基。在一个另外的实施例中，二聚化结构域是一种免疫球蛋白的铰链区。
额外的示例性二聚化结构域可以是任何本领域中已知的结构域，并且包括但不局限于：卷曲螺旋，酸片(acid patch)，锌指，钙手(calcium hand)，CHI-CL对，如美国专利号5,821,333中所描述的具有工程化“结节”(knob)和/或“突起”(protruberance)的“界面”(interface)，亮氨酸拉链(例如，来自jun和/或fos)(美国专利号5,932,448)，和/或酵母菌转录活化剂GCN4、SH2(src同源2)、SH3(src同源3)(维达尔(Vidal)等人，《生物化学》(Biochemistry)，43，7336-44(2004))，磷酸酪氨酸结合(PTB)(周(Zhou)等人.，《自然》(Nature)，378：584-592(1995))，WW(萨多尔(Sudol)，《生物物理学与分子生物学》(Prog，Biochys.MoL Bio.)，65：113-132(1996))，PDZ(金姆(Kim)等人.，《自然》(Nature)，378：85-88(1995))；科曼(Komau)等人，《科学》(Science)，269.1737-1740(1995))14-3-3，WD40(胡(Hu5)等人.，《生物化学杂志》(J Biol Chem.)，273，33489-33494(1998))EH，Lim，异亮氨酸拉链，受体二聚体对(例如，白细胞介素-8受体(IL-8R)；以及整合素异源二聚体，例如LFA-I和GPIIIb/IIIa)，或其一个或多个二聚化区，二聚体配体多肽(例如神经生长因子(NGF)、神经营养素-3(NT-3)、白细胞介素(IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、PDGF成员、以及脑衍生的神经营养因子(BDNF)(荒川(Arakawa)等人.，《生物化学杂志》(JBiol.Chem.)，269(45)：27833-27839(1994)和拉切耶夫斯基(Radziejewski)等人.，《生物化学》(Biochem.)，32(48)：1350(1993))并且还可以是其中亲和性被改变的这些结构域的变体。这些多肽对可通过本领域中已知的方法，包括酵母双杂交筛选来鉴定。酵母双杂交筛选描述于美国专利号5,283,173以及6,562,576中。一对相互作用结构域之间的亲和性可以使用本领域中已知的方法，包括如片平(Katahira)等人，《生物化学杂志》(J.Biol Chem)，277，9242-9246(2002年)中所描述的来确定。可替代地，可以针对异源二聚化，例如使用在WO 01/00814中描述的方法来筛选肽序列文库。蛋白-蛋白相互作用的有用方法还描述于美国专利号6,790,624中。
“多聚化结构域”是导致三种或更多种肽或多肽通过一种或多种共价缔合和/或非共价缔合相互作用的结构域。适合的多聚化结构域包括但不局限于卷曲螺旋结构域。卷曲螺旋是具有间隔开3个和4个残基的主要疏水性残基的连续型式的肽序列，通常呈七个氨基酸(七价重复)或十一个氨基酸(十一价重复)的序列形式的，这些氨基酸组装(折叠)以形成多聚体螺旋束。还涵盖具有包含3个和4个残基间隔的某种不规则分布的序列的卷曲螺旋。疏水性残基具体来说是疏水性氨基酸Val、He、Leu、Met、Tyr、Phe以及Trp。“主要疏水性”意指至少50％的残基必须选自提及的疏水性氨基酸。
卷曲螺旋结构域可来源于层粘连蛋白。在细胞外空间中，异源三聚体卷曲螺旋蛋白层粘连蛋白在基底膜的形成中发挥重要作用。显然地，多功能低聚结构是层粘连蛋白功能所要求的。卷曲螺旋结构域还可以来源于血小板反应素，其中三个(TSP-I和TSP-2)或五个(TSP-3、TSP-4和TSP-5)链被连接；或来源于COMP(COMPcc)(郭(Guo)等人，《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J)，1998，17：5265-5272)，它折叠为平行的五股卷曲螺旋(马拉舍科维奇(Malashkevich)等人，《科学》(Science)，274：761-765(1996))。来源于其他蛋白的卷曲螺旋结构域、以及其他介导多肽多聚化的结构域的额外的非限制性实例在本领域中是已知的，例如适合在所披露的融合蛋白中使用的血管扩张刺激磷蛋白(VASP)结构域、母系蛋白-1(CMP)、病毒融合肽、可溶性NSF(N-乙基马来酰亚胺-敏感因子)、吸附蛋白受体(SNARE)复合体、富亮氨酸重复序列、某些tRNA合成酶。
在另一个实施例中，可以通过结合至例如抗体的第二多价多肽来诱导LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽、其融合蛋白或片段以便形成多聚体。适合于用于使LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽、其融合蛋白或片段多聚化的抗体包括但不局限于IgM抗体以及交联的多价IgG、IgA、IgD、或IgE复合体。
二聚化或多聚化可经由二聚化或多聚化结构域在两个或更多个融合蛋白之间发生，这些二聚化或多聚化结构域包括如上所述的那些结构域。可替代地，融合蛋白的二聚化或多聚化可通过化学交联发生。融合蛋白二聚体可为同源二聚体或异源二聚体。融合蛋白多聚体可为同源多聚体或异源多聚体。如在此披露的融合蛋白二聚体具有式II：N-R1-R2-R3-C N-R4-R5-R6-C或替代地具有式III：N-R1-R2-R3-C C-R4-R5-R6-N，其中式II提供的二聚体的融合蛋白被定义为处于平行取向并且式III提供的二聚体的融合蛋白被定义为处于反平行取向。平行和反平行二聚体又分别称为顺式和反式二聚体。“N”和“C”分别表示该融合蛋白的N-末端和C-末端。该融合蛋白的组分“R1”、“R2”和“R3”是如上相对于式I来定义的。关于式II和式III两者，“R4”是LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽或第二多肽，“R5”是可任选的肽/多肽连接物结构域，并且“R6”是LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽或第二多肽，其中当“R4”是第二多肽时，“R6”是LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽，并且当“R4”是LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽时，“R6”是第二多肽。在一个实施例中，“R1”是LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽，“R4”也是LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽，并且“R3”和“R6”两者都是第二多肽。
当“R1”＝“R4”、“R2”＝“R5”并且“R3”＝“R6”时，具有式II的融合蛋白二聚体定义为同型二聚体。类似地，当“R1”＝“R6”、“R2”＝“R5”并且“R3”＝“R4”时，具有式III的融合蛋白二聚体定义为同型二聚体。当出于任何原因不满足这些条件时，融合蛋白二聚体被定义为异源二聚体。例如，异源二聚体可以包含满足这些条件(即，对于根据式II的二聚体而言，“R1”和“R4”两者都是LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽，“R2”和“R5”两者都是肽/多肽连接物结构域并且“R3”和“R6”两者都是第二多肽)的结构域取向，然而这些结构域的一种或多种的种类是不同的。例如，尽管“R3”和“R6”两者可以都是LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽，但是一种多肽可以包含野生型LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR氨基酸序列而另一种多肽可以是变体LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽。示例性变体LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽是已经被修饰而具有增加或减少的与靶细胞的结合、对于免疫细胞的增加的活性、增加或减少的半衰期或稳定性的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽。包含一种免疫球蛋白的CHI或CL区作为多肽连接物结构域的一部分的融合蛋白二聚体优选地形成这样的异源二聚体，其中二聚体的一个融合蛋白包含CHI区并且二聚体的另一个融合蛋白包含CL区。
融合蛋白也可用于形成多聚体。与二聚体一样，多聚体可为平行多聚体，其中多聚体的所有融合蛋白以相对于其N-和C-末端的相同取向来对齐。多聚体可为反平行多聚体，其中多聚体的融合蛋白可替代地以相对于其N-和C-末端的相反取向来对齐。多聚体(平行或反平行)可为同源多聚体或异源多聚体。融合蛋白任选地以二聚体形式产生；更优选地，融合如下所述在基因水平来进行，方法为连接与两个(或更多个)蛋白、蛋白部分和/或肽对应的多核苷酸序列，以使得由细胞根据连接的多核苷酸序列来产生连接或融合的蛋白。制备这种融合蛋白的描述参照Linsley(林斯雷)等的美国专利号5,851,795来描述，该专利只作为非限制性实例通过引用结合在此，其引用程度如同完全在此阐明一样。
靶向结构域
LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽以及融合蛋白可以包含将该分子靶向身体内的特异性位点的靶向结构域。任选的靶向结构域将分子靶向输送至炎症区域。示例性靶向结构域是对于发炎组织或促炎症细胞因子具有特异性的抗体或其抗原结合片段，所述细胞因子包括但不局限于IL17、IL-4、IL-6、IL-12、IL-21、IL-22、以及IL-23。在神经失调，例如多发性硬化症的情况下，靶向结构域可将该分子靶向至CNS或可以结合至血管上皮上的VCAM-I。另外的靶向结构域可以是对于促炎症分子具有特异性的肽适体。在其他实施例中，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR融合蛋白可以包括对于展示于例如T细胞的免疫细胞的表面上的多肽具有特异性的结合配偶体。仍然在其他实施例中，靶向结构域特异性地靶向活化的免疫细胞。被靶向的可任选的免疫细胞包括Th0、Th1、Th17、Th2以及Th22 T细胞、分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞，这些炎症分子包括但不局限于：IL-lβ、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21、和MMP、以及Treg。例如，Treg的靶向结构域可以特异性地结合至CD25。以上变化只用来说明任选的变化并且不欲以任何方式具有限制性。此外，以上解释只出于描述目的而提供，而不希望受单一假设限制。
基团的添加
如果根据本发明的蛋白是一种线型分子，那么将对化学修饰敏感或适于化学修饰的不同官能团放置在该线型分子上的不同点是可能的。可以将官能团添加至根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白的线型形式的末端。在一些实施例中，这些官能团关于一种或多种特征改善该蛋白的活性，这些特征包括但不局限于：稳定性、渗透性(穿过细胞膜和/或组织屏障)、组织定位、疗效的改善，减少的清除，减少的毒性，改善的选择性，对细胞泵(cellular pump)驱除的改善的抗性等。为了方便起见并且不希望被限制，包含在根据本发明的至少一些实施例所述的组合物中的序列之一的游离N-末端将叫做该组合物的N-末端，并且该序列的游离C-末端被认为是该组合物的C-末端。序列的C-末端亦或N-末端、或两者可以被分别连接至羧酸官能团或氨基官能团。
适合的官能团的非限制性实例描述于格林(Green)和伍兹(Wuts)，“ProtectingGroups in Organic Synthesis”(“有机合成中的保护基团”)，John Wiley and Sons(约翰威利父子公司)，第5章和第7章，1991中，其传授内容通过引用结合在此。优选的保护基团是协助附接至该保护基团的活性成分转运进细胞的的那些，例如通过减少该活性成分的亲水性以及增加其亲油性，这些是“跨细胞膜转运部分”的实例。
这些部分能可任选地并且优选地通过细胞内的水解或酶促地在体内剪切。(迪特(Ditter)等人，《药学杂志》(J.Pharm.Sci.)57：783(1968)；迪特(Ditter)等人，《药学杂志》(J.Pharm.Sci.)57：828(1968)；迪特(Ditter)等人，《药学杂志》(J.Pharm.Sci.)58：557(1969)；金(King)等人，《生物化学》(Biochemistry)26：2294(1987)；林德伯格(Lindberg)等人，《药物代谢与配置》(Drug Metabolism and Disposition)17：311(1989)；以及图尼克(Tunek)等人，《生化药学》(Biochem.Pharm.)37：3867(1988)，安德森(Anderson)等人，《生物化学与生物物理学档案》(Arch.Biochem.Biophys.)239：538(1985)以及辛格尔(Singhal)等人，《FASEB杂志》(FASEB J.)1：220(1987))。羟基保护基团包括酯、碳酸酯以及氨基甲酸酯保护基团。氨基保护基团包括如上对于N-末端保护基团所描述的烷氧基羰基和芳氧基羰基。羧酸保护基团包括如上对于C-末端保护基团所描述的脂肪族酯、苄型酯以及芳基酯。在一个实施例中，优选地用甲酯、乙酯、苄酯或取代的苄酯，更优选如苄酯来保护本发明的组合物中的一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的侧链中的羧酸基团。
N-末端保护基团的非限制性、示意性实例包括酰基(-CO-R1)以及烷氧基羰基或芳氧基羰基(-CO-O-R1)，其中R1是脂肪族基团、取代的脂肪族基团、苄基、取代的苄基、芳香族基团或取代的芳香族基团。酰基的特定实例包括但不局限于：乙酰基、(乙基)-CO-、正丙基-CO-、异丙基-CO-、正丁基-CO-、仲丁基-CO-、叔丁基-CO-、己基、月桂酰基、棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基、油酰基苯基-CO-、取代的苯基-CO-、苄基-CO-以及(取代的苄基)-CO-。烷氧基羰基和芳氧基羰基的实例包括CH3-O-CO-、(乙基)-O-CO-、正丙基-O-CO-、异丙基-O-CO-、正丁基-O-CO-、仲丁基-O-CO、叔丁基-O-CO-、苯基-O-CO-、取代的苯基-O-CO-以及苄基-O-CO-、(取代的苄基)-O-CO-、金刚烷、萘基(naphtalen)、肉豆蔻油烯基(myristoleyl)、甲苯、联苯基、肉桂酰基(cinnamoyl)、硝基苯甲酰基、甲苯酰基、呋喃甲酰、苯甲酰基、环己烷、降莰烷、或Z-己醛。为了协助N-酰化，一至四个甘氨酸残基可以存在于该分子的N-末端。
该化合物C-末端处的羧基可以例如通过包括但不局限于以下的基团进行保护：酰胺(即，位于C-末端的羟基被-NH2、-NHR2和-NR2R3替代)或酯(即，位于C-末端的羟基被-OR2替代)。可任选地，R2和R3独立地是脂肪族基团、取代的脂肪族基团、苄基、取代的苄基、芳基或取代的芳基基团。此外，与氮原子一起，R2和R3能可任选地形成一个具有从约0-2个额外的杂原子(例如氮、氧或硫)的C4至C8杂环。适合的杂环的非限制性适合的实例包括哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基(thiomorpholino)或哌嗪基。C-末端保护基团的实例包括但不局限于：-NH2，-NHCH3，-N(CH3)2-NH(乙基)，-N(乙基)2，-N(甲基)(乙基)，-NH(苄基)，-N(C1-C4烷基)(苄基)，-NH(苯基)，-N(C1-C4烷基)(苯基)，-OCH3，-O-(乙基)，-O-(正丙基)，-O-(正丁基)，-O-(异丙基)，-O-(叔丁基)，-O-(正丁基)，-O-苄基乙基-O-苯基。
被肽模拟部分取代
“肽模拟有机部分”能可任选地作为保守取代和非保守取代两者来取代本发明的组合物中的氨基酸残基。这些部分也被叫做“非天然氨基酸”并且能可任选地替代氨基酸残基、氨基酸，或充当代替(in lieu of)已删除的氨基酸的肽内的间隔基团。这些肽模拟有机部分可任选地并且优选地具有与被替代的氨基酸类似的立体特性、电子特性或构型特性，并且此类肽模拟物用来替代必要位置中的氨基酸，并且被认为是保存取代。然而，这样的相似性不是必需的。根据本发明的优选实施例，选择一种或多种肽模拟物，这样使得该组合物与根据本发明的天然蛋白相比至少大体上保留其生理活性。
肽模拟物能可任选地被用来抑制肽被酶促或其他降解过程的降解。这些肽模拟物能可任选地并且优选地通过有机合成技术来生产。适合的肽模拟物的非限制性实例包括相对应的L氨基酸的D氨基酸，四氮唑(扎布罗基(Zabrocki)等人，《美国化学学会杂志》(J.Am.Chem.Soc.)110：5875-5880(1988))；酰胺键的电子等排物(琼斯(Jones)等人，《四面体通讯》(Tetrahedron Lett.)29：3853-3856(1988))；LL-3-氨基-2-propenidone-6-羧酸(LL-Acp)(肯普(Kemp)等人，《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)50：5834-5838(1985))。类似的类似物示于肯普(Kemp)等人，《四面体通讯》(Tetrahedron Lett.)29：5081-5082(1988)以及肯普(Kemp)等人，《四面体通讯》(Tetrahedron Lett.)29：5057-5060(1988)，肯普(Kemp)等人，《四面体通讯》(Tetrahedron Lett.)29：4935-4938(1988)以及肯普(Kemp)等人，《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)54：109-115(1987)中。其他适合的但示例性的肽模拟物示于长井(Nagai)和佐藤(Sato)，《四面体通讯》(Tetrahedron Lett.)26：647-650(1985)；迪 梅约(Di Maio)等人，《英国化学会志，普尔金会刊》(J.Chem.Soc.Perkin Trans.)，1687(1985)；卡恩(Kahn)等人，《四面体通讯》(Tetrahedron Lett.)30：2317(1989)；奥尔森(Olson)等人，《美国化学学会杂志》(J.Am.Chem.Soc.)112：323-333(1990)；嘉伟(Garvey)等人，《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)56：436(1990)中。另外适合的示例性肽模拟物包括羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸酯(三宅(Miyake)等人，《武田研究实验室杂志》(J.TakedaRes.Labs)43：53-76(1989))；1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸酯(凯兹米尔斯基(Kazmierski)等人，《美国化学学会杂志》(J.Am.Chem.Soc.)133：2275-2283(1991))；组氨酸异喹啉酮羧酸(HIC)(泽赫尔(Zechel)等人，《肽蛋白研究国际杂志》(Int.J.Pep.ProteinRes.)43(1991))；(2S，3S)-甲基-苯丙氨酸，(2S，3R)-甲基-苯丙氨酸，(2R，3S)-甲基-苯丙氨酸以及(2R，3R)-甲基-苯丙氨酸(凯兹米尔斯基(Kazmierski)和赫鲁比(Hruby)，《四面体通讯》(Tetrahedron Lett.)(1991))。
示例性、示意性但非限制性非天然氨基酸包括β-氨基酸(β3和β2)、homo-氨基酸、环氨基酸、芳香族氨基酸、Pro和Pyr衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环-取代的Phe和Tyr衍生物、线性核心氨基酸(linear core amino acid)或二氨基酸。它们可以从多个供应商获得，例如像Sigma-Aldrich公司(美国)。
蛋白化学修饰
在本发明中，根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白的任何部分能可任选地被化学修饰，即通过添加官能团来改变。例如，出现在原生序列中的侧氨基酸残基可任选地修饰，但是替代地如下所述，除了侧氨基酸残基以外或代替侧氨基酸残基，蛋白的其他部分可任选地修饰。如果遵循一个化学合成过程，可任选地在分子合成期间进行修饰，例如通过添加化学修饰的氨基酸。然而，已经存在于分子中的氨基酸的化学修饰(“原位”修饰)也是可能的。
该分子的任何序列区的氨基酸能可任选地根据以下示例性类型的修饰中的任何一种(在肽概念上被视为“化学修饰的”)进行修饰。非限制性示例性类型的修饰包括羧甲基化、酰化、磷酸化、糖基化或脂肪酰化。醚键能可任选地用于将丝氨酸或苏氨酸羟基连接至糖的羟基。酰胺键可任选地用于将谷氨酸或天冬氨酸羧基连接至糖上的氨基(盖尔格(Garg)和扬洛兹(Jeanloz)，《碳水化合物化学与生物化学进展》(Advances inCarbohydrate Chemistry and Biochemistry)，第43卷，学术出版社(Academic Press)(1985)；孔兹(Kunz)，《应用化学》(Ang.Chem.)国际版英语26：294-308(1987年))。缩醛和缩酮键也可任选地形成于氨基酸与碳水化合物之间。例如通过游离氨基(例如，赖氨酸)的酰化能可任选地制备脂肪酸酰基衍生物(托斯(Toth)等人，《肽：化学，结构学与生物学》(Peptides：Chemistry，Structure and Biology)，利维尔(Rivier)和玛莎(Marshal)，编辑，ESCOM Publ.出版社，莱顿(Leiden)，1078-1079(1990))。
如在此使用，当提及根据本发明的蛋白或肽时，术语“化学修饰”是指蛋白或肽中的氨基酸残基中至少之一通过天然过程(例如处理或其他翻译后修饰)亦或通过本领域中熟知的化学修饰技术进行修饰的蛋白或肽。许多已知修饰的实例典型地包括但不局限于：乙酰化，酰化，酰胺化，ADP-核糖基化，糖基化，GPI锚的形成(GPI anchor formation)，脂质或脂质衍生物的共价附接，甲基化，十四烷基化，聚乙二醇化，异戊二烯化，磷酸化，泛素化，或任何类似过程。
其他类型的修饰任选地包括添加环烷烃部分至生物分子，例如像在PCT申请号WO2006/050262中描述的蛋白，该申请通过引用结合在此，如同完全在此阐明一样。这些部分被设计成与生物分子一起使用并且可任选地用于向蛋白赋予不同特性。
此外，任选地在蛋白上的任何点可被修饰。例如，蛋白上的糖基化部分的聚乙二醇化可任选地进行，如PCT申请号WO 2006/050247中所描述，该申请通过引用结合在此，如同完全在此阐明一样。一个或多个聚乙二醇(PEG)基团可任选地添加至O-连接和/或N-连接的糖基化。PEG基团可任选地为分支的或直链的。任选地，任何类型的水溶性聚合物可经由糖基连接物连接至蛋白上的糖基化位点。
改变的糖基化
根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白可以被修饰以便具有改变的糖基化型式(即，从原始或天然糖基化型式改变)。如在此使用，“改变”意味着一个或多个碳水化合物部分被从原始蛋白删除，和/或至少一个糖基化位点被添加至该原始蛋白。
蛋白的糖基化通常是N-连接亦或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分附接至天冬酰胺残基的侧链。其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸的三肽序列，天冬酰胺-X-丝氨酸以及天冬酰胺-X-苏氨酸，是将碳水化合物部分酶促附接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中的这些三肽序列中的任何一个的存在产生潜在糖基化位点。O-连接糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一个附接至羟基氨基酸，最通常为丝氨酸或苏氨酸，但是也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
向根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白添加糖基化位点便利地通过改变蛋白的氨基酸序列，这样使得它包含一个或多个上述三肽序列来完成(对于N-连接糖基化位点)。改变也可通过原始蛋白的序列中的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的添加或取代来造成(对于O-连接糖基化位点)。蛋白的氨基酸序列也可通过引入DNA水平上的变化来改变。
增加蛋白上的碳水化合物部分的数量的另一种手段是通过将糖苷以化学或酶法偶联至蛋白的氨基酸残基。取决于所使用的偶联模式，糖可连接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，例如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些，(e)芳香族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于WO 87/05330以及Aplin(艾波林)和Wriston(里斯顿)，CRCCrit.Rev.Biochem.(CRC生物化学关键评论)，22：259-306(1981年)中。
可以化学地或酶促地完成根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白上存在的任何碳水化合物部分的去除。化学去糖基化要求将蛋白暴露于三氟甲磺酸，或等效化合物。这种治疗导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以外的大多数或所有糖剪切，留下氨基酸序列为完整的。
化学去糖基化由哈克木丁(Hakimuddin)等人，《生物化学与生物物理学档案》(Arch.Biochem.Biophys.)，259：52(1987)；和艾格(Edge)等人，《分析生物化学》(Anal.Biochem.)，118：131(1981)进行描述。蛋白上的碳水化合物部分的酶促剪切可以使用各种内切和外切糖苷酶如索塔库拉(Thotakura)等人，《酶学方法》(Meth.Enzymol.)，138：350(1987年)中描述来实现。
使用方法
如在此使用，“治疗剂”是任一根据本发明的至少一些实施例所述的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白和多肽、或其直向同源物、或片段，尤其是LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的胞外域或其分泌形式，和/或融合蛋白，和/或包含它们的多聚体蛋白，或LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的核酸序列或其片段，以及与LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白特异性结合的药物，和/或激动或拮抗其他部分与LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的结合的药物，和/或调节(激动或拮抗)至少一种LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR相关生物活性的药物。此类药物包括单克隆抗体和/或多克隆抗体，和/或抗原结合片段，和/或包含它们的偶联物，和/或包括一个与任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽或其表位特异性结合的抗原结合位点的其替代支架。通过举例，此类药物还包括小分子、肽、核酶、适体、反义分子、siRNA等。
在以下情形中LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的活性的刺激是令人希望的：其中LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR被异常下调，和/或其中增加活性的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR可能具有有益的作用。同样地，在以下情形中LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的活性的抑制是令人希望的：其中LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR被异常上调，和/或其中减少活性的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR可能具有有益的作用。
如在上文所提及，这些治疗剂可以用来治疗如在此所列举的免疫相关失调，和/或如在此所列举的自体免疫失调，和/或如在此所列举的感染性失调，和/或如在此所列举的癌瘤，和/或阻断和/或促进由任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽介导的免疫共刺激。
根据本发明的一个额外的方面，这些治疗剂可以用来阻止T细胞活性的病理学抑制，例如直接针对癌细胞或慢性感染的T细胞；和/或阻止T细胞活性的病理学刺激，例如直接针对自体免疫性疾病中的自体抗原的T细胞。例如，可以将这些分子向培养物中的、体外的或离体的细胞给予，或向人类受试者(例如，体内)给予来治疗、预防并且诊断多种失调。优选的受试者包括人类患者，这些人类患者具有由表达LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的细胞、以及拥有LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR活性的细胞介导的失调。
根据本发明的一个额外的方面，这些治疗剂可以用来抑制T细胞活化，如可以例如由T细胞增殖和细胞因子分泌所证明的。
根据本发明的一个额外的方面，这些治疗药可以用来体内或体外引起一种或多种以下生物活性：抑制表达LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的细胞的生长和/或将其杀死；在人类效应细胞存在的情况下，介导表达LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的细胞的吞噬作用或ADCC；或阻断LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR配体分别与LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的结合。
因此，根据本发明的一个额外的方面，提供了通过以下来在一个受试者中治疗如在此所列举的免疫相关失调，和/或如在此所列举的自体免疫失调，和/或如在此所列举的感染性失调，和/或如在此所列举的癌瘤，和/或阻断或促进由LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽介导的免疫共刺激的方法：向一位对其有需要的受试者给予一个有效量的任一治疗剂和/或包括任一治疗剂并且进一步包括一种药学上可接受的稀释剂或运载体的药物组合物。
根据本发明的受试者是哺乳动物，优选是被诊断为患有在上文所描述的疾病、失调或病症之一，或可替代地易患至少一种类型的癌症和/或感染性失调、和/或免疫相关失调的人。
如在此使用，术语“治疗”是指上述疾病、失调或病症的预防，发作的延迟，治愈，回复(reversing)，弱化，缓解，最小化，抑制或停止(halting)其有害作用。它还包括控制(manage)如上所述的疾病。“控制”意指减轻该疾病的严重性，降低该疾病发作的频率，减少此类发作的持续时间，减轻此类发作的严重性等。
根据本发明，治疗可以通过特异性地上调本发明的至少一种多肽在受试者体内的表达来实现。
将理解的是，根据本发明的上述疾病的治疗可以与在本领域中已知的其他治疗方法组合(即，组合疗法)。因此，在此所列举的根据本发明的至少一些实施例所述的治疗剂和/或包含它们的药物组合物可以与以下一种或多种试剂组合使用以调节免疫应答：可溶性gp39(也被称为CD40配体(CD40L)、CD154、T-BAM、TRAP)，可溶性CD29，可溶性CD40，可溶性CD80(例如ATCC 68627)，可溶性CD86，可溶性CD28(例如68628)，可溶性CD56，可溶性Thy-1，可溶性CD3，可溶性TCR，可溶性VLA-4，可溶性VCAM-1，可溶性LECAM-1，可溶性ELAM-1，可溶性CD44，与gp39反应的抗体(例如ATCC HB-10916、ATCC HB-12055以及ATCC HB-12056)，与CD40反应的抗体(例如ATCC HB-9110)，与B7反应的抗体(例如ATCC HB-253、ATCC CRL-2223、ATCC CRL-2226、ATCC HB-301、ATCC HB-11341等)，与CD28反应的抗体(例如ATCC HB-11944或mAb 9.3)，与LFA-1反应的抗体(例如ATCC HB-9579以及ATCC TIB-213)，与反应的抗体LFA-2，与反应的抗体IL-2，与反应的抗体IL-12，与反应的抗体IFN-γ，与CD2反应的抗体，与CD48反应的抗体，与任何ICAM反应的抗体(例如，ICAM-1(ATCC CRL-2252)、ICAM-2以及ICAM-3)，与CTLA4反应的抗体(例如ATCC HB-304)，与Thy-1反应的抗体，与CD56反应的抗体，与CD3反应的抗体，与CD29反应的抗体，与TCR反应的抗体，与VLA-4反应的抗体，与反应的抗体VCAM-1，与反应的抗体LECAM-1，与反应的抗体ELAM-1，与CD44反应的抗体；L104EA29YIg，CD80单克隆抗体(mAb)，CD86 mAb，gp39 mAb，CD40 mAb，CD28 mAb；抗-LFAlmAb，靶向免疫系统的机制的抗体或其他试剂，例如CD52(阿仑单抗)、CD25(达利珠单抗)、VLA-4(那他珠单抗)、CD20(利妥昔单抗)、IL2R(达利珠单抗)以及MS4A1(ocrelizumab)；已经显示阻止淋巴细胞从淋巴器官再循环的新颖的口服免疫调节剂，例如fingolimod(FTY720)或导致淋巴细胞耗尽的新颖的口服免疫调节剂，例如mylinax(口服克拉屈滨)或特立氟胺；以及预防免疫活化的试剂，例如panaclar(富马酸二甲酯BG-12)或拉喹莫德(ABR216062)。其他组合可以容易地被本领域的普通技术人员所理解。在一些实施例中，这些治疗剂可以被用来减弱或逆转前炎性药物(pro-inflammatory drug)的活性，和/或限制此类药物的副作用。
如本领域的普通技术人员容易理解的，该组合可以包括根据本发明的至少一些实施例所述的治疗剂和/或包含它们的药物组合物以及一种其他免疫抑制剂；如在此所列举的治疗剂和/或包含它们的药物组合物以及两种其他免疫抑制剂；如在此所列举的治疗剂和/或包含它们的药物组合物以及三种其他免疫抑制剂、等。最佳组合和剂量的确定可以使用本领域熟知的方法来确定并且优化。
根据本发明的治疗剂以及一种或多种其他治疗剂可以顺序地亦或同时地给予。其他治疗剂是例如细胞毒素剂、放射性毒性剂或免疫抑制剂。该组合物可以被连接至该试剂(作为免疫复合体)或可以与该试剂分别给予。在后一种情况(分别给予)下，该组合物可以在该试剂之前、之后或同时给予，或可以与其他已知治疗，例如抗癌治疗(例如辐射)，共给予。此类治疗剂除了其他之外还包括抗肿瘤剂，例如阿霉素(doxorubicin，adriamycin)、顺铂硫酸博莱霉素、卡莫司汀、瘤可宁、以及环磷酰胺羟基脲，它们本身只有处于对患者有毒性或亚毒性水平才有效。顺铂依照100mg/剂量每四周静脉给药一次，并且阿霉素依照60-75mg/ml剂量每21天静脉给药一次。
根据本发明的至少一些实施例所述的人类抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体、及其抗原结合片段与化学治疗剂的共给予提供两种抗癌剂，这两种抗癌剂经由不同机制起作用，这对人类肿瘤细胞产生细胞毒性效应。这样的共给予可以解决归因于使得肿瘤细胞对抗体物无反应性的肿瘤细胞对药物的抗性的发展或其抗原性的变化的问题。靶标特异性效应细胞，例如被连接至根据本发明的至少一些实施例所述的组合物的效应细胞(例如，人类抗体、多特异性分子以及双特异性分子)也可以被用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人类白细胞，例如巨噬细胞、中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞以及其他带IgG-受体或IgA-受体的细胞。如果希望的话，效应细胞可以从有待治疗的受试者获得。靶标特异性效应细胞可以作为生理学上可接受的溶液中的细胞悬浮液来给予。细胞的数目可以是约10-8至10-9，但是将取决于治疗目的而变化。通常，这个量足以获得在靶细胞(例如表达LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的肿瘤细胞)处的定位，并且通过例如吞噬作用足够实现杀死细胞。给予途径也可以变化。
使用靶标特异性效应细胞的治疗可以与用于去除靶细胞的其他技术联合进行。例如，使用根据本发明的至少一些实施例所述的组合物(例如，人类抗体、多特异性分子以及双特异性分子)和/或配备有这些组合物的效应细胞的抗肿瘤疗法可以与化学疗法联合使用。额外地，可以使用联合免疫疗法来使两种不同的细胞毒性效应群体指向肿瘤细胞排斥。例如，被连接至抗-Fc-γRI或抗-CD3的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25或抗-LSR抗体可以与IgG-或IgA-受体特异性结合剂联合使用。
根据本发明的至少一些实施例所述的双特异性分子和多特异性分子也可以被用来调节效应细胞上的FcγR或FcγR水平，例如通过帽化并且消除细胞表面上的受体。抗-Fc受体的混合物也可以用于这个目的。
本发明还涵盖与其他药物试剂联合的根据本发明的至少一些实施例所述的组合物用来治疗免疫系统疾病的用途。例如，自体免疫性疾病可以用与以下但不局限于以下物质结合的根据本发明的至少一些实施例所述的分子来治疗：免疫抑制剂，例如皮质类固醇、环孢霉素、环磷酰胺、泼尼松、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、西罗莫司、他克莫司，生物剂，例如TNF-α阻断剂或拮抗剂，或靶向任何炎性细胞因子的任何其他生物剂，非甾体抗炎药物/Cox-2抑制剂，羟基氯喹，柳氮磺胺吡啶(sulphasalazopryine)，氯金酸钠，依那西普，英利昔单抗，吗替麦考酚酯，巴利昔单抗，阿塞西普，利妥昔单抗，环磷酰胺，干扰素β-la，干扰素β-lb，醋酸格拉默，盐酸米托蒽醌，阿那白滞素和/或其他其他生物制剂和/或静脉注射免疫球蛋白(IVIG)。这类已知治疗剂的非限制实例包括干扰素，例如IFN-β-la(和)以及IFN-β-lb醋酸格拉默一种多肽；那他珠单抗以及米托蒽醌一种细胞毒素剂。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例所述的药剂来治疗多发性硬化症可与例如治疗多发性硬化症的任何已知治疗剂或方法组合。这类已知用于治疗多发性硬化症的治疗剂或方法的非限制实例包括干扰素类，IFN-β-la(和)以及IFN-β-lb醋酸格拉默一种多肽；那他珠单抗以及米托蒽醌一种细胞毒素剂，氨吡啶其他药物包括皮质类固醇、甲氨喋呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤，以及静脉内免疫球蛋白(IVIG)、肌苷、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab；R1594)、米留斯(Mylinax；Caldribine)、阿来组单抗(alemtuzumab；Campath)、达利珠单抗(daclizumab；Zenapax)、Panaclar/延胡索酸二甲酯(BG-12)、特立氟胺(Teriflunomide；HMR1726)、芬戈莫德(fingolimod；FTY720)、拉喹莫德(laquinimod；ABR216062)，以及造血干细胞移植、Neurovax、利妥昔单抗(Rituximab；Rituxan)、BCG疫苗、低剂量纳曲酮(naltrexone)、驱虫疗法、血管成形术、静脉支架，以及替代疗法，例如维生素D、多不饱和脂肪、医用大麻。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例所述的药剂来治疗类风湿性关节炎可与例如治疗类风湿性关节炎的任何已知治疗剂或方法组合。这类已知用于治疗类风湿关节炎的治疗剂或方法的非限制实例包括糖皮质激素，非甾体抗炎药(NSAID)(例如水杨酸盐(酯)、或环氧酶-2抑制剂、布洛芬以及萘普生、双氯芬酸、吲哚美辛、依托度酸)，疾病修饰抗风湿药物(Disease-modifying antirheumatic drug)(DMARD)-口服DMARD：金诺芬(Auranofin，Ridaura)，硫唑嘌呤(Azathioprine、Imuran)，环孢霉素(Cyclosporine，Sandimmune，Gengraf，Neoral，非商标的)，D-青霉胺(Penicillamine，Cuprimine)，羟基氯喹(Hydroxychloroquine，Plaquenil)，硫代苹果酸金钠(IM gold Gold sodiumthiomalate，Myochrysine)，金硫葡糖(Aurothioglucose，Solganal)，来氟米特(Leflunomide，Arava)，甲氨蝶呤(Methotrexate，Rheumatrex)，米诺环素(Minocycline，Minocin)，葡萄球菌蛋白A免疫吸附剂(Prosorba column)，柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine，Azulfidine)。生物DMARD：TNF-α阻断剂，包括阿达木单抗(Adalimumab，Humira)、依那西普(Etanercept，Enbrel)、英利昔单抗(Infliximab，Remicade)、戈利木单抗(golimumab，Simponi)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol，Cimzia)，以及其他生物DMARD，例如阿那白滞素(Anakinra，Kineret)、利妥昔单抗(Rituximab，Rituxan)、托珠单抗(Tocilizumab，Actemra)，CD28抑制剂，包括阿巴西普(Abatacept，Orencia)以及贝拉西普。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例所述的药剂来治疗IBD可以与例如治疗IBD的任何已知治疗剂或方法组合。这类已知治疗IBD的治疗剂或方法的非限制实例包括控制症状的免疫抑制，例如泼尼松(prednisone)、美沙拉嗪(Mesalazine；包括安萨科(Asacol)、颇得斯安(Pentasa)、Lialda、Aspiro)、硫唑嘌呤(Azathioprine，Imuran)、甲氨喋呤或6-巯基嘌呤、类固醇、昂丹司琼(Ondansetron)、TNF-α阻断剂(包括英利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗(certolizumab pegol))、阿巴西普(Orencia，abatacept)、优特克单抗(ustekinumab)Briakinumab(ABT-874)、赛妥珠单抗ITF2357(givinostat)、那他珠单抗(Natalizumab，Tysabri)、非拉司特(SB-683699)、英利昔单抗(Remicade，infliximab)、vedolizumab(MLN0002)，其他药物包括GSK1605786 CCX282-B(Traficet-EN)、AJM300、优特克单抗(Stelara，ustekinumab)、塞马莫德(CNI-1493)、tasocitinib(CP-690550)、LMW肝素MMX(LMW Heparin MMX)、布地奈德MMX、戈利木单抗(Simponi，golimumab)、加德西HPV疫苗(Gardasil HPVvaccine)、爱巴苏(Epaxal Berna)(病毒体的A型肝炎疫苗)，手术，例如肠切除术、肠狭窄成形术(strictureplasty)或暂时性或永久性结肠造口术或回肠造口术抗真菌药，例如制霉菌素(广谱肠抗真菌素)以及伊曲康唑(itraconazole，Sporanox)亦或氟康唑(fluconazole，Diflucan)；替代药物，益生元和益生菌，大麻，鞭虫属猪丹毒杆菌寄生虫(Trichuris suis helminth)的驱虫治疗或其卵细胞的治疗。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例所述的药剂来治疗银屑病可以与例如治疗银屑病的任何已知治疗剂或方法组合。治疗银屑病的这类已知治疗剂的非限制实例包括通常用于轻微疾病的外用剂、用于中度疾病的光线疗法，以及用于严重疾病的全身剂。外用剂的非限制性实例：沐浴溶液和保湿剂、矿物油以及凡士林油；包含以下物质的药膏和乳膏：煤焦油、蒽三酚(蒽啉)、皮质类固醇如去羟米松(desoximetasone，Topicort)、倍他米松(Betamethasone)、氟轻松乙酸酯(fluocinonide)、维生素D3类似物(例如卡泊三醇(calcipotriol))，以及类视黄醇。光疗的非限制性实例：阳光；波长为311-313nm的补骨脂素和长波紫外线光疗(PUVA)。全身剂的非限制性实例：生物制剂，例如白细胞介素拮抗剂、TNF-α阻断剂，包括抗体，例如英利昔单抗(infliximab，Remicade)、阿达木单抗(adalimumab，Humira)、戈利木单抗、赛妥珠单抗、以及重组TNF-α诱饵受体，依那西普(etanercept，Enbrel)；靶向T细胞的药物，例如依法珠单抗(efalizumab，Xannelim/Raptiva)、阿法赛特(alefacept，Ameviv)、树突细胞样依法珠单抗(dendritic cells suchEfalizumab)；靶向细胞因子的单克隆抗体(MAb)，包括抗-IL-12/IL-23(优特克单抗(品牌名称Stelara))以及抗-白细胞介素-17；Briakinumab(ABT-874)；小分子，包括但不局限于ISA247；免疫抑制剂，例如甲氨蝶呤、环孢霉素；维生素A和类视黄醇(维生素A的合成形式)；以及替代疗法，例如饮食和生活方式的变化、空腹期间(fasting period)、低能量饮食和素食饮食、补充有富含维生素A和维生素D的鱼肝油的饮食(例如鳕鱼肝油)、富含两种Ω-3脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)并且包含维生素E的鱼肝油的饮食；Ichthyotherapy，催眠疗法，大麻。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例所述的药剂来治疗1型糖尿病可以与例如治疗1型糖尿病的任何已知治疗剂或方法组合。治疗1型糖尿病的这类已知治疗剂的非限制性实例包括胰岛素，胰岛素类似物，胰岛移植，干细胞疗法(包括)，非胰岛素疗法，例如il-lβ抑制剂，包括阿那白滞素阿巴西普Diamyd、阿法赛特(alefacept)Otelixizumab、DiaPep277(Hsp60衍生肽)，阿尔法1-抗胰蛋白酶、泼尼松、硫唑嘌呤、环孢霉素，El-INT(一种可注射的胰岛新生疗法，包括表皮生长因子类似物和胃泌激素类似物)，他汀，包括西他列汀(二肽基肽酶(DPP-4)抑制剂)，抗-CD3 mAb(例如，Teplizumab)；CTLA4-Ig(阿巴西普)，抗IL-Iβ(康纳单抗)，抗-CD20mAb(例如，利妥昔单抗)。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例所述的药剂来治疗葡萄膜炎可以与例如治疗葡萄膜炎的任何已知治疗剂或方法组合。治疗葡萄膜炎的这类已知治疗剂的非限制实例包括皮质类固醇、外用睫状肌麻痹剂，例如阿托品(atropine)或后马托品(homatropine)，或PSTTA注射剂(后眼筋膜囊下乙酸去炎松(posterior subtenontriamcinolone acetate))、抗代谢物药物，例如甲氨喋呤、TNF-α阻断剂(包括英利昔单抗、阿达木单抗、依那西普、戈利木单抗、赛妥珠单抗)。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例所述的药剂来治疗修格兰氏综合征可以与例如治疗修格兰氏综合征的任何已知治疗剂或方法组合。治疗修格兰氏综合征的这类已知治疗剂的非限制实例包括环孢霉素、匹鲁卡品(pilocarpine；Salagen)以及西维美林(cevimeline；Evoxac)、羟基氯喹(Plaquenil)、可的松(cortisone；泼尼松以及其他)和/或硫唑嘌呤(Imuran)或环磷酰胺(Cytoxan)、地塞米松、沙立度胺、去氢表雄酮、NGX267、瑞巴派特(Rebamipide)、FID114657、依那西普(Etanercept)、Raptiva、贝利木单抗、MabThera(利妥昔单抗)；阿那白滞素、静脉内免疫球蛋白(IVIG)、异体骨髓间充质干细胞(AlloMSC)、“aliwell Crown”的自动神经电刺激。
因此，使用根据本发明的至少一些实施例所述的药剂来治疗全身性红斑狼疮可以与例如治疗全身性红斑狼疮的任何已知治疗剂或方法组合。治疗全身性红斑狼疮的这类已知治疗剂的非限制实例包括皮质类固醇以及疾病改进抗风湿药物(DMARD)、通常抗患疟疾药物例如普拉奎尼(plaquenil)以及免疫抑制剂(例如甲氨喋呤和硫唑嘌呤)、羟基氯喹、细胞毒性药物(例如环磷酰胺和吗替麦考酚酯)、羟基氯喹(HCQ)、Benlysta(贝利木单抗)、非甾体抗炎症药物、泼尼松、骁悉(Cellcept)、普乐可复(Prograf)、阿塞西普(Atacicept)、Lupuzor、静脉内免疫球蛋白(IVIG)、CellCept(吗替麦考酚酯)、奥瑞希纳(Orencia)、CTLA4-IgG4m(RG2077)、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、依帕珠单抗、CNTO136、西法木单抗(Sifalimumab；MEDI-545)、A-623(以前AMG623)、AMG557、罗利珠单抗、帕喹莫德(paquinimod；ABR-215757)、LY2127399、CEP-33457、去氢表雄酮、左旋甲状腺素、阿贝莫司钠(abetimus sodium；LJP394)、美金刚、阿片类药物、西罗莫司、肾移植、干细胞移植。
如在此所列举的根据本发明的至少一些实施例所述的治疗药和/或包含它们的药物组合物可以作为单独活性成分或连同免疫调节方案中的其他药物或其他抗炎症剂一起给予，例如用于治疗或预防同种异体或异种移植急性或慢性排斥反应或炎性或自体免疫病症，或用于诱导耐受性。
例如，它可以与以下物质联合使用：钙调磷酸酶抑制剂，例如环孢霉素A或FK506；免疫抑制大环内酯类，例如西罗莫司或其衍生物；例如40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素、淋巴细胞归巢剂，例如FTY720或其类似物、皮质类固醇；环磷酰胺；咪唑硫嘌呤；甲氨喋呤；来氟米特或其类似物；咪唑立宾；麦考酚酸；吗替麦考酚酯；15-脱氧精胍菌素或其类似物；免疫抑制单克隆抗体，例如白细胞受体的单克隆抗体，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD11a/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BB或其配体；或其他免疫调节化合物，例如CTLA4/-Ig(阿巴西普，或贝拉西普)、CD28-Ig、B7-H4-Ig，或其他共刺激剂，或粘附分子抑制剂，例如mAb或低分子量抑制剂，包括LFA-1拮抗剂、选择蛋白拮抗剂以及VLA-4拮抗剂。
当如在此所列举的根据本发明的至少一些实施例所述的治疗剂和/或包括它们的药物组合物与例如在上文中指定的其他免疫抑制/免疫调节或抗炎疗法来组合给予时，共给予的免疫抑制剂、免疫调节或抗炎化合物的剂量当然取决于所使用的共用药物的类型(例如它无论是类固醇还是环孢菌素)、所使用的具体药物、所治疗的病状等而变化。
使用本发明的这些试剂对恶性肿瘤的治疗可以与本领域中熟知的其他治疗方法进行组合，例如以下中的一种或多种：放射疗法，抗体疗法，化学疗法，光动力学疗法，手术或与常规药物(例如免疫抑制剂或细胞毒素药物)的组合疗法，
根据本发明的至少一些实施例所述的治疗剂或药物组合物还可以与其他化合物或免疫疗法联合给予。例如，联合治疗可以包括与至少一种其他治疗剂或免疫调节剂、或免疫刺激策略联合的本发明的化合物，包括但不局限于：肿瘤疫苗，过继性T细胞疗法，Treg耗尽，抗体(例如，贝伐单抗、爱必妥)，肽，百普素体(pepti-bodies)，小分子，化学治疗剂，例如细胞毒素剂和细胞抑制剂(例如，紫杉醇、顺铂、长春瑞宾、多西他赛、吉西他滨、替莫唑胺、伊立替康、5FU、卡铂)，免疫学修饰剂，例如干扰素和白细胞介素，免疫刺激性抗体，生长激素或其他细胞因子，叶酸，维生素，矿物质，芳香酶抑制药，RNAi，组蛋白脱酰酶抑制剂，蛋白酶体抑制剂等。
根据本发明的至少一些实施例，提供了如在此所列举的治疗剂和/或包括它们的药物组合物与有效治疗感染的一种已知治疗剂的组合的用途。
如在此所列举的治疗剂和/或包括它们的药物组合物可以与一种或多种用于治疗细菌感染的额外的治疗剂联合给予，这些额外的治疗剂包括但不局限于：抗生素，包括氨基糖甙类、碳青霉烯类、头孢菌素类、大环内酯类、林可酰胺类、硝基呋喃类、青霉素类、聚缩氨酸、喹诺酮类、磺胺类、四环素；针对分枝杆菌的药物，包括但不局限于氯法齐明、环丝氨酸、环丝氨酸、利福布汀、利福喷汀、链霉素；以及其他抗细菌药物，例如氯霉素、磷霉素、甲硝唑、莫匹罗星、以及替硝唑。
如在此所列举的治疗剂和/或包括它们的药物组合物可以与一种或多种用于治疗病毒感染的额外的治疗剂联合给予，这些额外的治疗剂包括但不局限于：抗病毒药物，例如奥司他韦(品牌名称达菲(Tamiflu))和扎那米韦(品牌名称瑞乐沙(Relenza))阿比朵-金刚烷衍生物(金刚胺、金刚乙胺)-神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦、拉尼娜米韦、帕拉米韦、扎那米韦)核苷类似物逆转录酶抑制剂，包括嘌呤类似物鸟嘌呤(阿昔洛韦(Aciclovir)#/伐昔洛韦(Valacyclovir)、更昔洛韦(Ganciclovir)/缬更昔洛韦(Valganciclovir)、喷昔洛韦(Penciclovir)/泛昔洛韦(Famciclovir))和腺嘌呤(阿糖腺苷)，嘧啶类似物，尿甙(碘苷、曲氟尿苷、依度尿苷)，胸腺嘧啶(溴夫定)，胞嘧啶(阿糖胞苷)；膦甲酸；核苷类似物/NARTI：恩替卡韦(Entecavir)、拉米夫定、替比夫定、克拉夫定；核苷类似物/NtRTIs：阿德福韦(Adefovir)、泰诺福韦(Tenofovir)；核酸抑制剂，例如西多福韦(Cidofovir)；干扰素α-2b，聚乙二醇干扰素α-2a；利巴韦林(Ribavirin)#/Taribavirin；抗逆转录病毒药物，包括齐多夫定、拉米夫定、阿巴卡韦(abacavir)、洛匹那韦(lopinavir)、利托那韦(ritonavir)、泰诺福韦(tenofovir)/恩曲他滨(emtricitabine)、依法韦仑(efavirenz)，其单独的或不同组合，gp41(恩夫韦地(Enfuvirtide))，拉替拉韦(Raltegravir)；蛋白酶抑制剂，例如福沙那韦(Fosamprenavir)、洛匹那韦(Lopinavir)和阿扎那韦(Atazanavir)，甲吲噻腙，二十二醇，福米韦生(Fomivirsen)，曲金刚胺。
如在此所列举的治疗剂和/或包括它们的药物组合物可以与一种或多种用于治疗真菌感染的额外的治疗剂联合给予，这些额外的治疗剂包括但不局限于：聚烯类抗真菌剂的抗真菌药物，咪唑、三唑、以及噻唑抗真菌剂，烯丙基胺，棘球白素或其他抗真菌药物。
可替代地或额外地，上调方法能可任选地通过在该受试者中特异性上调至少一种本发明的多肽或其活性部分的量(可任选地表达)来实现。
如在上文以及在随后的实例部分所提及的，本发明的这个方面的生物分子序列可以被用作治疗以下疾病、失调或病症中的有价值的治疗工具，其中已知野生型基因产物(已知蛋白)的改变的活性或表达促成疾病、失调或病症的发作或进展。例如，在一种疾病是由膜结合受体的过表达导致的情况中，其可溶性变体可以被用作与该受体竞争与该配体的结合，以由此终止该受体的信号转导的拮抗剂。
根据至少一些实施例，免疫细胞(优选是T细胞)可以在体内或离体与治疗剂进行接触以调节免疫应答。与治疗剂进行接触的T细胞可以是表达T细胞受体(包括α/β和γ/δT细胞受体)的任何细胞。T-细胞包括表达CD3的所有细胞，包括还表达CD4和CDS的T-细胞子集。T-细胞包括原始和记忆细胞以及效应细胞，例如CTL。T-细胞还包括例如Th1、Tc1、Th2、Tc2、Th3、Th17、Th22、Treg以及Tr1细胞的细胞。T-细胞还包括NKT-细胞以及T-细胞谱系的相似独特类别。
抑制表位扩展
表位扩展是指B和T细胞免疫应答在从自体抗原上的单一决定予到许多位点的特异性水平上，并且在V基因使用水平上发生多样化的能力(曼努斯(Monneaux，F.)等人，《关节炎和风湿病》(Arthritis&amp；Rheumatism)，46(6)：1430-1438(2002))。表位扩展不局限于全身性自体免疫疾病。它已经在人类，以及具有各种髓磷脂蛋白的EAE诱导实验动物中的T细胞依赖性器官特异性疾病，例如1型糖尿病和多发性硬化症中得到描述。
表位扩展涉及相同自体分子中的新的表位连同存在于相同大分子复合体中有关的蛋白中的表位的获得性识别。表位扩展可通过测量延迟型过敏(DTH)应答来评估，其方法是本领域中已知的。
一个实施例提供了一种通过向受试者给予一个有效量的治疗剂来抑制或减少该受试者的表位扩展的方法。在一个另外的实施例中，这些治疗剂中任何之一抑制患有多发性硬化症的个体的表位扩展。优选地，这些治疗剂抑制或阻断炎症通路的多个点。
又另一个实施例提供了一种通过向受试者给予一个有效量的治疗剂以便抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或导致其他细胞分泌炎性分子的其他细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌来抑制或减少患有多发性硬化症的受试者的表位扩展的方法，这些炎症分子包括但不局限于IL-lβ、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21、以及MMP。
根据本发明的至少一些实施例所述的治疗剂作为癌症疫苗接种中的佐剂的用途：
针对肿瘤相关抗原(TAA)的免疫法是用于癌症治疗和预防的一种有前途的途径，但是它面对若干挑战和局限，例如与由肿瘤细胞表达的自体抗原相关的耐受性机制。共刺激分子(例如B7.1(CD80)和B7.2(CD86))在动物模型中已经改善了基于基因的疫苗和基于细胞的疫苗的疗效，并且作为佐剂在临床试验中处于研究之下。这种佐剂活性可以通过增强共刺激信号亦或阻断抑制信号来实现，抑制信号是由肿瘤细胞表达的负向共刺激分子传递的(内博尔(Neighbors)等人，2008《免疫疗法杂志》(J Immunother.)；31(7)：644-55)。根据本发明的至少一些实施例，任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的分泌形式或可溶性形式或其ECD和/或变体、和/或直向同源物、和/或偶联物、和/或对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白特异的多克隆抗体或单克隆抗体和/或抗原结合片段和/或包含它们的偶联物、和/或替代支架可以被用作癌症疫苗接种的佐剂。根据至少一些实施例，提供了用于改善针对TAA的免疫作用的方法，包括向患者给予一个有效量的任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的分泌形式或可溶性形式或其ECD和/或变体、和/或直向同源物、和/或偶联物、和/或对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白特异的多克隆抗体或单克隆抗体和/或抗原结合片段和/或包含它们的偶联物、和/或替代支架。
根据本发明的至少一些实施例所述的治疗剂用于过继性免疫治疗的用途：
一些耐受性模型的基本特征之一是一旦这种耐受性状态已经建立，它可以由供体特异性的调节细胞的过继性转移永久延续至天然接受者。此类过继性转移研究也已经解决了T-细胞亚群和非T-细胞转移耐受性的能力。可以通过阻断共刺激或使共抑制性与其反受体衔接来诱导这样的耐受性。这种已经成功地应用于动物中并且在人类中处于临床试验评估的途径(斯卡拉皮诺(Scalapino KJ)和达赫(Daikh DI.)PLoS One.2009；4(6)：e6031；莱利(Riley)等人，《免疫性》(Immunity)，2009；30(5)：656-665)为自体免疫失调和移植提供了一个有前途的治疗选择。根据本发明的至少一些实施例，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的分泌形式或可溶性形式或其ECD和/或变体、和/或直向同源物、和/或偶联物、和/或对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白特异的多克隆抗体或单克隆抗体和/或抗原结合片段和/或包含它们的偶联物、和/或替代支架可以用于过继性免疫治疗。因此，根据至少一些实施例，为了诱导耐受原性调节细胞的分化，本发明提供了用于体内或离体的耐受性诱导的方法，这些方法包括向一个患者或向从该患者分离的白细胞给予有效量的以下各项：LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的分泌形式或可溶性形式或其ECD和/或变体、和/或直向同源物、和/或偶联物、和/或对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白特异的多克隆抗体或单克隆抗体、或和/或抗原结合片段和/或包含它们的偶联物、和/或替代支架；随后是所述细胞的离体富集和增殖以及向所述患者再输注这些耐受原性调节细胞。
可替代地，可以通过以下来增强患者的免疫应答：将免疫细胞从该患者去除，使免疫细胞与抑制LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR活性的试剂、和/或与抑制LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR与其天然结合配偶体的相互作用的试剂进行接触，并且将这些体外刺激的免疫细胞再引入进该患者。在另一个实施例中，调节免疫应答的方法涉及将免疫细胞从患者分离，用编码一种形式的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的核酸分子对其进行转染，这样使得这些细胞在其表面表达全部或一部分的根据本发明的不同实施例的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽，并且将这些转染细胞再引入进该患者。这些转染细胞具有在患者中调节免疫应答的能力。
根据本发明的至少一些实施例所述的治疗剂用于免疫增强的用途
1.癌症的治疗
在此所提供的这些治疗剂在体内和离体中作为免疫应答刺激治疗剂通常是有用的。通常，所披露的治疗剂组合物对于治疗患有或易患受试者的免疫系统对其发动免疫应答的任何疾病或失调的受试者是有用的。治疗剂调节LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR免疫信号的能力使得一种更强劲的免疫应答成为可能。根据本发明的至少一些实施例所述的治疗剂对于刺激或增强涉及免疫细胞(例如T细胞)的免疫应答是有用的。
根据本发明的至少一些实施例所述的治疗剂对于在宿主中刺激或增强免疫应答来治疗癌症是有用的，这是通过向受试者给予一个在受试者中有效刺激T细胞的量的治疗剂来实现的。
2.治疗剂在疫苗中的用途
根据本发明的至少一些实施例所述的治疗剂被单独给予或与任何其他适合的治疗联合给予。在一个实施例中，这些治疗剂可以与如上所述的疫苗组合物联合给予、或作为其组分来给予。根据本发明的至少一些实施例所述的治疗剂可以在疫苗给予之前、同时、或之后给予。在一个实施例中，治疗剂与疫苗的给予同时给予。
药物组合物
在另一个方面中，本发明提供了一种包含一种根据本发明的至少一些实施例所述的治疗剂或其组合的组合物，例如药物组合物。
因此，本发明突出了一种包括一个治疗有效量的根据本发明的至少一些实施例所述的治疗剂的药物组合物。
根据本发明的至少一些实施例所述的药物组合物进一步优选地用于治疗癌症，治疗免疫相关失调和/或感染性失调，其中这种癌症可以是是非转移性的、浸润性的或转移性的。
“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。需要治疗的那些包括已经患有这种失调的那些连同在其中要预防这种疾病的那些。因此，有待治疗的哺乳动物在此可以已经被诊断为患有这种失调或可以易患或对这种失调敏感。用于治疗目标的“哺乳动物”是指任何被分类为哺乳动物的动物，包括人类、家养动物和农场动物，以及动物园动物、体育动物、或宠物动物，例如狗、马、猫、牛、等。优选地，这种哺乳动物是人。
术语“治疗有效量”是指根据本发明的试剂有效地治疗哺乳动物的疾病或失调的量。
本发明的治疗剂可以单独，或作为它们与药学上可接受的载体混合于其中的药物组合物的一部分来提供给受试者。
根据本发明的至少一些实施例所述的药物组合物还可以在联合治疗中被给予，即，与其他试剂合并。例如，联合治疗可以包括与至少一种其他治疗剂或免疫调节剂合并的以下物质：根据本发明的至少一些实施例所述的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体或LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR调节剂，例如包含LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原的胞外域或一种小分子(例如肽、核酶、适体、siRNA)的可溶性多肽偶联物，或其他与LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR结合的药物。
受这种组合物被称为“药学上可接受的载体”，如果其给予可以被一位接受者患者所忍受的话。如在此使用，“药学上可接受的载体”包括任何以及全部的生理学上相容的溶剂、分散体介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮给予(例如通过注射或输注)。此类组合物包括无菌水，pH和离子强度的缓冲盐水(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)，以及可任选的添加剂，例如洗涤剂和加溶剂(例如，聚山梨酯20，聚山梨酯80)，抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)，防腐剂(例如，硫柳汞(Thimersol)，苯甲醇)以及膨胀物质(例如，乳醇、甘露醇)。非水性溶剂或媒介物也可以如下详细说明地来使用。
可以用于根据本发明的至少一些实施例所述的药物组合物中的适合的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、以及其适合的混合物，植物油(例如橄榄油)，以及可注射有机酯(例如油酸乙酯)。适当流动性可例如通过使用涂层材料，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所要求粒径，以及通过使用表面活性剂来维持。取决于给予途径，活性化合物(即包含LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原的胞外域的可溶性多肽偶联物，特异性结合任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体以及抗原结合片段以及包含它们的偶联物、和/或替代支架，或双特异性分子)可以被包衣于一种用来使该化合物免于酸的作用以及可以使该化合物失活的其他自然条件的破坏的材料中。根据本发明的至少一些实施例所述的药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所希望的生物活性并且不赋予任何所不希望的毒物学效应的盐(参见例如，Berge，S.M.，(博尔格S.M.)等人(1977)《药学杂志》(J.Pharm.Sci.)66：1-19)。这类盐的实例包括酸加成盐以及碱加成盐。酸加成盐包括来源于无毒无机酸的那些盐，这些无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等，以及来源于无毒有机酸的盐，这些有机酸例如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸类、脂族以及芳族磺酸等。碱加成盐包括来源于碱土金属的那些盐，这些碱土金属例如钠、钾、镁、钙等，以及来源于无毒有机胺的盐，这些有机胺例如N，N′--二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)等。
根据本发明的至少一些实施例所述的药物组合物还可以包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
这些组合物还可包含佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂以及分散剂。预防存在微生物可通过上述灭菌程序，以及通过包含不同抗细菌和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯(paraben)、氯代丁醇、苯酚山梨酸、以及类似物来确保。可能还希望将等渗剂，例如糖、氯化钠、以及类似物包括于组合物中。另外，可通过包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝以及明胶来实现可注射药物形式的延长的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和试剂用作药物活性物质的用途在本领域中是已知的。除了在任何常规介质或试剂与该活性化合物不相容的范围内之外，涵盖了它们在根据本发明的至少一些实施例所述的药物组合物中的用途。辅助活性化合物也可以并入组合物中。
治疗组合物典型地必须在制造以及储存条件下是无菌并且稳定的。组合物可配制为溶液、微乳液、脂质体，或适合于高药物浓度的其他有序结构。载体可以为包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇，以及液体聚乙二醇等)以及其合适混合物的溶剂或分散介质。适当流动性可例如通过使用涂层，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所希望粒径，以及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，可取的是将等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠包括在组合物中。可通过在组合物中包括例如单硬脂酸盐以及明胶的延迟吸收的试剂来实现可注射组合物的延长的吸收。无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一个或其组合一起并入适当溶剂中，随后灭菌微滤来制备。总体上，分散液通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物包含一种基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥以及冷冻干燥(冻干)，这从先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一个或其组合一起并入适当溶剂中，随后灭菌微滤来制备。总体上，分散液通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物包含一种基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥以及冷冻干燥(冻干)，这从先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量取决于所治疗的受试者以及具体给予模式而变化。可与载体材料组合以便产生单一剂型的活性成分的量总体上是产生治疗效果的组合物的量。通常，在百分之百中，与药学上可接受的载体组合地，这个量在从约百分之0.01至约九十九％的活性成分，优选地从约百分之0.1至约百分之70，最优选地从约百分之1至约百分之30的活性成分的范围内变化。
剂量方案经过调整以便提供最佳所希望应答(例如治疗应答)。例如，可给予单次丸剂，可随着时间的推移来给予若干分次剂量或剂量可按治疗情况的紧急状态指示来按比例减少或增加。尤其有利的是将肠胃外组合物配制成剂量单位形式，以实现方便给予以及剂量均匀性。如在此使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散单位；每个单位包含预定数量的经过计算结合所需药用载体以产生所希望治疗效果的活性化合物。根据本发明的至少一些实施例所述的剂量单位形式的规格由以下因素指示并且直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特征以及待达到的特定治疗效果，以及(b)调配这样的一种活性化合物以便治疗个体的感受性的领域中固有的限制。
为了给予该抗体，该剂量的范围是从约0.0001至100mg/kg，并且更通常是0.01至5mg/kg的宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。一个示例性的治疗方案需要以下给予：每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每三个月至每6个月一次。针对根据本发明的至少一些实施例所述的抗体的优选剂量方案包括经由静脉给药的1mg/kg体重或3mg/kg体重，该抗体使用以下给药方案之一来给予：(i)每四周六个剂量，然后是每三周；(ii)每三周；(iii)一次3mg/kg体重，随后是每三周1mg/kg体重。
针对如在此所描述的融合蛋白，可任选地遵循一种类似的剂量方案；可替代地，根据任何适合的定时方案，这些融合蛋白能可任选地以0.0001至100mg/kg患者的体重/天之间的量来给予，优选是0.001至10.0mg/kg/天之间。根据本发明的至少一些实施例所述的治疗组合物可以例如每天三次、每天两次、每天一次、每周三次、每周两次或每周一次、每两周或3、4、5、6、7或8周一次来给予。此外，组合物可给予短或长时期(例如1周、1月、1年、5年)。
在一些方法中，具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体可以被同时给予，在这种情况下给予的每种抗体的剂量落入表明的范围。抗体通常在多种场合被给予。单一剂量之间的间隔可以是例如，每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是无规律的，如由在患者中测量至靶标抗原的抗体的血液水平所表明的。在一些方法中，调节剂量以实现约1-1000mug/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中约25-300.mu.g/ml。
可替代地，治疗剂可以持续释放配制品形式给予，在此情况下所要求的给予频率更小。剂量和频率取决于治疗剂在患者体内的半衰期而变化。总体上，人类抗体展示最长半衰期，随后为人源化抗体、嵌合抗体以及非人类抗体。融合蛋白的半衰期可广泛地变化。给予剂量和频率可取决于治疗是预防性或是治疗性而变化。在预防性应用中，相对较低剂量以相对稀少的间隔在长时期内给予。一些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时要求相对较短间隔下的相对较高剂量直到疾病进展减少或终止为止，并且优选地直到患者展示疾病症状的部分或完全改进为止。此后，可向患者给予预防方案。
本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可改变以便获得对于具体患者、组合物以及给予模式可有效实现所希望治疗应答，而对患者无毒的活性成分的量。选择的剂量水平取决于各种药代动力学因素，包括所使用的本发明的具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给予途径、给予时间、所使用的具体化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所使用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况以及以前病史，以及医学领域熟知的类似因素。
根据本发明的至少一些实施例所述的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR可溶性蛋白或LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR胞外域或包含它们的融合蛋白、或抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重性的降低，无疾病症状期的频率和持续时间的增加，寿命的增加，疾病的缓解，或归因于疾病折磨的损伤或残疾的预防或减少。例如，对于LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR阳性肿瘤(例如，黑色素瘤、肝症、肾症、脑症、乳腺症、结肠症、肺症、卵巢症、胰腺症、前列腺症、胃症、多发性骨髓瘤以及造血性癌症，包括但不局限于淋巴瘤(何杰金氏和非何杰金氏)、急性和慢性淋巴性白血病以及急性和慢性骨髓性白血病)的治疗，相对于未治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％，更优选地至少约40％，甚至更优选地至少约60％，并且仍然更优选地至少约80％。化合物抑制肿瘤生长的能力可以在一种预测在人类肿瘤中的疗效的动物模型中进行评估。可替代地，组合物的这种特性可以通过检查该化合物抑制的能力来进行评估，这样的体外抑制是通过熟练的从业者已知的测定进行的。治疗化合物的治疗有效量可以降低肿瘤尺寸，或以另外的方式改善受试者的症状。
本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者体型、受试者症状的严重度以及所选择的具体组合物或给予途径的因素来确定治疗有效量。
本发明的组合物可以使用本领域中已知的多种方法中的一种或多种经由一种或多种给予途径来给予。如被技术人员所理解的，给予途径和/或给予模式将取决于所希望的结果而变化。根据本发明的至少一些实施例所述的治疗剂的优选给予途径包括血管内递送(例如注射或输注)、静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱、口服、肠内、直肠、肺部(例如吸入)、鼻腔、外用(包括经皮肤、口腔以及舌下)、膀胱内、玻璃体内、腹膜内、阴道、大脑递送(例如脑室内、大脑内以及对流增强扩散)、CNS递送(例如鞘内、髓周以及脊柱内)或肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内以及真皮内)、经粘膜(例如舌下给予)给予或经由植入物给予，或其他肠胃外给予途径，例如通过注射或输注，或在本领域中已知的其他递送途径和/或给予形式。如在此使用，短语“肠胃外给予”意味着除了肠给予和局部给予之外的、通常通过注射的给予模式，并且包括但不局限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。在一个具体实施例中，根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白、治疗剂或药物组合物可腹膜内或静脉内给予。
可替代地，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR特异性抗体或其他调节LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白活性的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR药物或分子以及包含它们的偶联物及其组合可以经由非肠道途径来给予，例如局部的、表皮的或粘膜的给予途径，例如鼻内地、口腔地、阴道地、直肠地、舌下地或局部地。
活性化合物可用保护化合物以便避免快速释放的载体来制备，例如受控释放制剂，包括植入物、经皮贴片以及微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。许多用于制备此类配制品的方法是获专利的或通常是本领域的普通技术人员已知的。参见，例如，Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems(缓控释药物递送系统)，罗宾逊(J.R.Robinson)，e编辑，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔·德克尔公司)，New York(纽约)，1978。
治疗组合物可以使用本领域已知的医疗装置来给予。例如，在一个优选实施例中，根据本发明的至少一些实施例所述的治疗组合物可以使用针状皮下注射装置来给予，例如在美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中所披露的装置。适用于本发明的熟知植入物以及模块的实例包括：美国专利号4,487,603，它披露用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4,486,194，它披露经由皮肤给予药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，它披露以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，它披露用于连续药物递送的变速流可植入输注设备；美国专利号4,439,196它披露具有多腔室隔室的渗透药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，它披露渗透药物递送系统。这些专利通过引用结合在此。许多其他这类植入物、递送系统以及模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施例中，可以对抗体、LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR可溶性蛋白、胞外域、和/或融合蛋白进行配制以确保在体内适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性化合物。为了确保根据本发明的至少一些实施例所述的治疗化合物穿过BBB(如果希望)，它们可以例如配制在脂质体中。制造脂质体的方法参见例如美国专利号4,522,811；5,374,548；以及5,399,331。脂质体可以包括被选择性运输至特定细胞或器官中，由此增强靶向药物递送的一个或多个部分(参见例如兰纳德(V.V.Ranade)(1989)《临床药理学杂志》(J.Clin.Pharmacol.)29：685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如，劳(Low)等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(梅泽(Umezawa)等人，(1988)《生物化学和生物物理学研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun)，153：1038)；抗体(布劳艾曼(P.G.Bloeman)等人(1995)FEBS Lett.357：140；奥维斯(M.Owais)等人(1995)《抗微生物制剂与化学疗法》(Antimicrob.Agents Chemother.)39：180)；表面活性剂蛋白A受体(布里斯科(Briscoe)等人(1995)《美国生理学杂杂》(Am.J Physiol.)1233：134)；pl20(施赖埃尔(Schreier)等人(1994)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)269：9090)；还参见克莱南(K.Keinanen)；劳卡南(M.L.Laukkanen)(1994)FEBS Lett.346：123；基利昂(J.J.Killion)；菲德勒(I.J.Fidler)(1994)《免疫方法》(Immunomethods)4：273。
根据本发明的至少一些实施例所述的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25以及抗-LSR抗体可以用作中和抗体。中和抗体(Nab)是一种能够结合并且中和或抑制特异性抗原由此抑制其生物作用的抗体，例如通过阻断细胞或病毒上的受体，抑制该病毒与宿主细胞的结合。Nab将部分地或彻底地废除试剂的生物作用，通过阻断其活性需要的重要的表面分子亦或通过妨碍该试剂与靶细胞上的其受体的结合。
在仍另一个实施例中，可以使用本发明的免疫偶联物通过将化合物连接至抗体而将此类化合物(例如，治疗剂、标签、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向具有LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR细胞表面受体的细胞。因此，本发明还提供了用于离体或体内定位表达LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的细胞的方法(例如，用可检测的标签，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。可替代地，这些免疫偶联物可以通过将细胞毒素或放射性毒素靶向LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原而用来杀死具有LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR细胞表面受体的细胞。
LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR多肽以及相对应的多核苷酸的诊断用途
根据一些实施例，用于进行根据本发明的至少一些实施例所述的诊断测定、取自受试者(患者)的样品选自下组，该组由以下各项组成：体液或分泌物，包括但不局限于血液、血清、尿液、血浆、前列腺液、精液(seminal fluid，semen)，皮肤、呼吸道、肠道、以及泌尿生殖道的外分泌物，眼泪，脑脊髓液，滑液，痰液，唾液，乳，腹膜液，胸膜液，囊液，乳腺导管系统(the breast ductal system)(和/或其灌洗)、支气管肺泡灌洗、生殖系统的灌洗、以及身体的任何其他部分或身体中的系统的灌洗的分泌物；任何器官(包括分离的细胞或组织)的样品，其中该细胞或组织可以从一种选自以下但不局限于以下的器官获得：肺、结肠、卵巢和/或乳房组织；粪便或组织样品，或其任何组合。在一些实施例中，这个术语涵盖体内细胞培养组分的样品。在经受诊断测定之前，该样品能可任选地使用一种适合的洗脱液进行稀释。
在一些实施例中，在本发明背景下的短语“标记”是指与一种取自不患有上述疾病或病症之一的受试者的可比较的样品相比，差异地存在于取自患有在此所描述的疾病或病症之一的患者(受试者)的样品中的核酸片段、肽、或多肽。
在一些实施例中，短语“差异地存在”是指与一种取自不患有在此所描述的疾病或病症之一的患者的可比较的样品相比，存在于取自患有在此所描述的疾病或病症之一的患者的样品中的标记的量或质量上的差异。例如，如果一种样品中的核酸片段的量显著不同于另一种样品中的核酸片段的量，那么核酸片段能可任选地差异地存在于这两种样品之间，例如如通过杂交和/或基于NAT的测定所测量的。如果一种样品中的多肽的量显著不同于另一种样品中的多肽的量，那么多肽能可任选地差异地存在于这两种样品之间。应该指出的是，如果该标记在一种样品中是可检测的但在另一种样品中是不可检测的，那么可以认为这样的一种标记是差异地存在的。可任选地，如在此所描述，相对低量的上调可以充当该标记。本领域的普通技术人员可以容易地确定这样的相对水平的标记；进一步的指导提供于下面的每种单独的标记的说明之中。
在一些实施例中，短语“诊断(diagnostic)”意味着鉴定一种病理学病症的存在或性质。诊断方法在其敏感性和专一性方面存在不同。诊断测定的“敏感性”是测试呈阳性的患病个体的百分数(“真阳性”的百分数)。未由该测定检测的患病个体是“假阴性”。未患病并且在该测定中呈阴性的受试者被叫做“真阴性”。诊断测定的“专一性”是1减去假阳性率，其中“假阳性”率被定义为测试呈阳性但不患有该疾病的那些的比例。尽管一种具体的诊断方法可能不提供病症的决定性诊断，但是如果这种方法提供在诊断中协助的阳性指示，它就是合格的。
如在此使用，术语“诊断(diagnosis)”是指通过其征象、症状来鉴定医学症状或疾病的过程，并且特别是从不同诊断程序的结果来鉴定，包括例如，在获得自个体的生物样品(例如，如下所定义的，在细胞、组织或血清中)中检测根据本发明的至少一些实施例所述的核酸或多肽的表达。此外，如在此使用，术语“诊断(diagnosis)”涵盖以下：筛选疾病，检测疾病的存在或严重性，提供疾病的预后，监测疾病的进展或复发，连同对疾病、失调或病症的疗效和/或复发的评估，连同为疾病选择一种疗法和/或治疗，给定的疾病疗法的优化，监测疾病的治疗，和/或预测针对特定患者或亚群的疗法的适合性或确定治疗产品在患者或亚群中的适当配量。诊断程序可以在体内或体外进行。
在一些实施例中，当就如在此所描述的多核苷酸或多肽的表达水平上的差异而论时，短语“定性”是指表达的存在对不存在；或在一些实施例中，是指表达的时序调节；或在一些实施例中，是指表达的时机；或在一些实施例中，是指对表达的分子的翻译后修饰；以及其他被本领域普通技术人员所理解的。在一些实施例中，当就如在此所描述的多核苷酸或多肽的表达水平上的差异而论时，短语“定量”是指表达量上的绝对差异，如通过任何本领域中已知的手段所确定的；或在其他实施例中，是指统计学上可以是有意义的相对差异；或在一些实施例中，当被视为一个整体或在延长的一段时间内等，指示就表达的差异而言的趋势。
在一些实施例中，术语“诊断(diagnosing)”是指把疾病或症状分级，确定疾病的严重性，监测疾病的进展，预测疾病的后果和/或恢复的前景。术语“检测”也能可任选地涵盖以上任一项。
在一些实施例中，对根据本发明的疾病的诊断可以受到对获得自受试者的生物样品中的本发明的多核苷酸或多肽的水平的确定的影响，其中确定的水平可以与该疾病的易患病体质、或存在或不存在有关。应该指出的是，“获得自受试者的生物样品”还能可任选地包括未从该受试者身体上移除的样品，如下进行更加详细的描述。
在一些实施例中，术语“水平”是指RNA和/或蛋白的表达水平，或是指本发明的标记的DNA拷贝数。
典型地，获得自受试者的生物样品中的标记的水平与获得自一个健康个体的类似样品(生物样品的实例是在此所描述的)中的同一标记的水平是不同的(即，增加或减少)。
为了确定一个受试者中的感兴趣的标记的DNA、RNA和/或多肽的水平，可以利用许多熟知的组织或流体采集方法来从受试者采集生物样品。
实例包括但不局限于：细针穿刺活检，穿刺活检，芯针穿刺活检以及手术活检(例如，脑活检)，以及灌洗。不管所使用的程序，一旦获得活检/样品，就可以确定该标记的水平并且因此可以做出诊断。
确定同一来源的正常组织中的同一标记的水平优选地并行实现，以对照正常组织检测该标记的升高的表达和/或扩增和/或减少的表达。
在一些实施例中，术语标记的“测试量”是指与具体疾病或病症的诊断一致的受试者样品中的标记的量。测试量可以是绝对量(例如，微克/ml)亦或相对量(例如，信号的相对强度)。
在一些实施例中，术语标记的“对照量”可以是有待与标记的测试量进行比较的任何量或一系列的量。例如，标记的对照量可以是患有具体疾病或病症的患者或不患有这样的一种疾病或病症的人中的标记的量。对照量可以是绝对量(例如，微克/ml)亦或相对量(例如，信号的相对强度)。
在一些实施例中，术语“检测”是指鉴定有待检测的目标的存在、不存在或量。
在一些实施例中，术语“标签”包括被光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测的任何部分或事项。例如，有用的标签包括32P，35S，荧光染料，电子致密试剂，酶(例如，如在ELISA中常用的)，生物素-链霉亲和素，dioxigenin，针对其的抗血清或单克隆抗体可获得的半抗原和蛋白，或具有与靶标互补的序列的核酸分子。标签通常产生一种可以用来定量样品中结合的标签的量的可测量的信号，例如放射性信号、发色信号、或荧光信号。该标签可以共价地、亦或通过离子键、范德华力或氢键被合并进或附接至引物或探针，例如与被链霉亲和素识别的放射性核苷酸、或生物素化的核苷酸合并。该标签可以是直接或间接可检测的。间接检测可以涉及一个第二标签与该第一标签直接或间接地结合。例如，该标签可以是结合配偶体的配体，例如作为链霉亲和素的结合配偶体的生物素，或作为可以与其特异性杂交的互补序列的结合配偶体的核苷酸序列。结合配偶体本身可以是直接可检测的，例如，抗体本身可以被荧光分子所标记。结合配偶体还可以是间接可检测的，例如，具有互补核苷酸序列的核酸可以是分支DNA分子的一部分，这通过与其他标记的核酸分子的杂交反过来是可检测的(参见例如，法荷兰德(P.D.Fahrlander)和克劳斯纳(A.Klausner)，《生物/技术》(Bio/Technology)6：1165(1988))。信号的定量可以通过例如闪烁计数、光密度测定法、或流式细胞计数法来实现。
可任选地并且优选地用于与免疫测定一起使用的示例性可检测的标签包括但不局限于磁珠，荧光染料，放射性标签，酶(例如，辣根过氧化物、碱性磷酸酯酶以及ELISA中常用的其他物质)，以及量热标签(例如胶体金或有色玻璃或塑料珠)。可替代地，样品中的该标记可以使用间接测定来检测，其中例如使用一种第二标记抗体来检测标记结合特异性抗体；和/或竞争或抑制测定，其中例如将与该标记的不同表位结合的单克隆抗体与该混合物同时孵育。
“免疫测定”是一种使用与抗原特异性结合的抗体的测定。免疫测定的特征在于使用具体抗体的特异性结合特性来分离、靶向、和/或定量该抗原。
当提及蛋白或肽(或其他表位)时，在一些实施例中，术语与抗体“特异性(或选择性)结合”或具有“特异性(或选择性)免疫反应性”或“特异性相互反应或结合”，是指确定蛋白以及其他生物制剂的异质群体中的蛋白的存在的结合反应。因此，在特指的免疫测定的条件下，特异性抗体与具体蛋白的结合比背景(非特异性信号)大至少两倍，并且不以显著的量实质上地与该样品中存在的其他蛋白结合。在这样的条件下，与抗体的特异性结合可能需要针对其对具体蛋白的特异性对抗体进行选择。例如，可以选择为来自特定物种(例如大鼠、小鼠、或人类)的精液碱性蛋白而培养的多克隆抗体，以获得与精液碱性蛋白具有特异免疫反应性而与其他蛋白(除了精液碱性蛋白的多态变体和等位基因之外)不具有特异免疫反应性的仅那些多克隆抗体。这种选择可以通过减去与来自其他物种的精液碱性蛋白交叉反应的抗体来实现。可以使用多种免疫测定方式来选择与具体蛋白具有特异免疫反应性的抗体。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白具有特异免疫反应性的抗体(参见例如，哈洛(Harlow)和莱恩(Lane)，《抗体，实验室手册》(Antibodies，A LaboratoryManual)，(1988)，提供了可以用来确定特异免疫反应性的免疫测定方式和条件的说明)。典型地，特异性或选择性反应将是至少两倍背景信号或背景噪声，并且更典型地大于10倍至100倍背景。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于在生物样品中检测本发明的多肽的方法，包括：使生物样品与一种特异性识别根据本发明所述的多肽的抗体进行接触并且检测所述相互作用；其中相互作用的存在与该生物样品中多肽的存在相关。
在本发明的一些实施例中，在此所描述的这些多肽是用于诊断疾病和/或指示病症的标记的非限制性实例。本发明的每种标记可以单独地或组合地用于不同用途，包括但不局限于疾病和/或指示病状的预后、预测、筛选、早期诊断、确定进展、疗法选择以及治疗监测。
在一个相关目标中，这些检测的疾病包括癌症，例如非实体瘤和实体瘤、肉瘤以及血液恶性肿瘤。
在另一个相关目标中，这些检测的疾病包括自体免疫失调、任何器官移植物的排斥和/或移植物抗宿主疾病。
本发明的每种多肽/多核苷酸可以单独地或组合地用于不同用途，包括但不局限于疾病和/或指示病状的预后、预测、筛选、早期诊断、确定进展、疗法选择以及治疗监测，如上所详细说明的。
这样的一种组合能可任选地包括标记的任何亚组合，和/或特征是至少一种其他标记(例如一种已知的标记)的组合。此外，关于确定在此所描述的任何标记与在此所描述的任何其他标记、和/或任何其他已知标记、和/或任何其他标记之间的定量的或半定量的测量值的比例，这样的一种组合能可任选地并且优选地如上所描述的来使用。
在本发明的一些实施例中，提供了用于疾病或病症的诊断的方法、用途、装置以及测定。可任选地，可以与本发明一起使用多个标记。多个标记能可任选地包括在此所描述的标记，和/或一个或多个已知标记。优选地，然后使多个标记与该疾病或病症相关联。例如，这样的关联能可任选地包括对多个标记中的每个的浓度进行确定，以及单独地将每个标记浓度与临界水平进行比较。可任选地，如果该标记浓度高于或低于临界水平(取决于该标记和/或正在进行的诊断测试)，那么该标记浓度与该疾病或病症相关联。可任选地并且优选地，多个标记浓度与该疾病或病症相关联。
可替代地，这样的关联能可任选地包括对多个标记中的每个的浓度进行确定，基于多个标记中的每个的浓度计算单一指数值，以及将这个指数值与临界水平进行比较。
还可替代地，这样的关联能可任选地包括对至少一种标记中的暂时变化进行确定，并且其中将该暂时变化用于关联步骤中。
还可替代地，这样的关联能可任选地包括对至少“X”数目的多个标记是否具有预定范围外和/或高于或低于临界(如上所述)的浓度进行确定。“X”的值能可任选地是一个标记、多个标记或全部标记；可替代地或额外地，不是在“X”的计数中包括任何标记，多个标记中的一个或多个特异性标记能可任选地被要求与该疾病或病症相关联(根据一个范围和/或临界)。
还可替代地，这样的关联能可任选地包括对针对两个标记的标记浓度的比例是否在范围之外和/或高于或低于临界进行确定。可任选地，如果该比例高于或低于该临界水平和/或在范围之外，那么该比例与该疾病或病症相关联。
可任选地，这些相关性中的两个或更多个的组合可以被与一张单个的图一起来使用，和/或用于多个图之间的关联。
可任选地，当与正常受试者相比时，这种方法以至少70％的敏感性、至少85％的专一性辨别一种疾病或病症。如在此使用，敏感性涉及检测的阳性(患病)样品的数目/存在的阳性样品的总数；专一性涉及检测的真阴性(非患病)样品的数目/存在的阴性样品的总数。优选地，当与正常受试者相比时，这种方法以至少80％的敏感性、至少90％的专一性辨别一种疾病或病症。更优选地，当与正常受试者相比时，这种方法以至少90％的敏感性、至少90％的专一性辨别一种疾病或病症。还更优选地，当与展示出模拟疾病或病症症状的症状的受试者相比时，这种方法以至少70％的敏感性、至少85％的专一性辨别一种疾病或病症。
可以使用多种本领域的普通技术人员熟知的方式来对标记面板进行分析。例如，可以将面板的每个成员与“正常”值、或指示具体结果的值进行比较。具体的诊断/预后可以取决于每个标记与这个值的比较；可替代地，如果只有一个子集的标记在正常范围之外，那么这个子集可以指示具体的诊断/预后。技术人员还将理解，可以将诊断标记、差别诊断标记、预后标记、标记发作时间、疾病或病症差异标记等合并于一个单一测定或装置中。标记通常还可以用于多种目的，针对不同目的，例如通过将不同临界或不同加权因子应用于该标记。
在一个实施例中，这些面板包括用于以下目标的标记：疾病的诊断；如果疾病处于急性期和/或疾病的急性发作已经发生，疾病和适应症的诊断；如果疾病处于非急性期和/或疾病的非急性发作已经发生，疾病和适应症的诊断；指示急性期和非急性期或发作的组合是否已经发生；疾病的诊断以及随后的不良后果的预后；疾病的诊断以及随后的急性期或非急性期或发作的预后；疾病的进展(例如对于癌症，这样的进展可以包括例如转移的发生或复发)。
上面的诊断还能可任选地包括用来将其与其他疾病区分开的该疾病的差别诊断，包括特征可以在于一种或多种类似的或相同的症状的那些疾病。
在某些实施例中，一种或多种诊断的或预后的指示物仅通过这些指示物的存在或不存在而与一种病症或疾病相关联。在其他实施例中，可以制定诊断的或预后的指示物的临界水平，并且患者样品中的这些指示物的水平可以简单地与这些临界水平进行比较。诊断的和/或预后的测试的敏感性以及专一性不只是取决于该测试的分析“质量”--它们还取决于什么构成异常结果的定义。在实践中，接受者工作特征曲线、或“ROC”曲线典型地是通过在“正常”和“患病”群体中绘制对其相对频率的变量的值，和/或通过将治疗前、治疗中和/或治疗后从受试者得到的结果进行比较来计算的。
根据本发明的至少一些实施例，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白、多核苷酸或其片段能被特征化为用于检测疾病和/或指示病状的生物标记，如上所详细说明的。
根据仍其他实施例，本发明可任选地并且优选地涵盖由对应于如在此所描述的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的核酸序列编码的任何氨基酸序列或其片段。涉及这样的氨基酸序列或其片段的任何寡肽或肽也能可任选地(额外地或可替代地)被用作生物标记。
在仍其他实施例中，本发明提供了使用基于NAT的测定来在生物样品中检测本发明的多核苷酸的方法，包括：使分离的核酸分子或至少约一个最小长度的寡核苷酸片段与生物样品的核酸材料进行杂交并且检测杂交复合体；其中杂交复合体的存在与生物样品种多核苷酸的存在相关联。方法或测定的非限制性实例描述于以下。
本发明还涉及基于此类诊断方法或测定的试剂盒。还在本发明的范围内的是包括本发明的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白或LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR偶联物或抗体组合物(例如，人类抗体、双特异性分子或多特异性分子、或免疫偶联物)的试剂盒以及使用说明。该试剂盒可以进一步包含一种或多种额外的试剂，例如免疫抑制剂、细胞毒素剂或放射性毒素剂，或一种或多种根据本发明的至少一些实施例所述的人类抗体(例如，具有互补活性、与不同于第一人类抗体的抗原上的表位结合的人类抗体)。
基于核酸技术(NAT)的测定：
对生物样品中的感兴趣的核酸的检测还能可任选地通过基于NAT的测定来实现，基于NAT的测定涉及核酸扩增技术，例如PCR，例如(或其变化，例如像实时PCR)。如在此使用，“引物”定义了一种能够退火以与靶向序列杂交的寡核苷酸，由此产生在适合的条件下充当DNA合成的起始点的双链区。选择的、或靶向核酸序列的扩增可以通过多种本领域中已知的适合方法来进行。扩增技术的非限制性实例包括聚合酶链式反应(PCR)，连接酶链式反应(LCR)，链置换扩增反应(SDA)，基于转录的扩增，q3复制酶体系以及NASBA(果(Kwoh)等人，1989，《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86，1173-1177；李查蒂(Lizardi)等人，1988，《生物技术》(BioTechnology)6：1197-1202；马列克(Malek)等人，1994，《分子生物学方法》(Methods Mol.Biol.)，28：253-260；以及萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。基于核酸技术的测定的非限制性实例选自下组，该组由以下各项组成：PCR，实时PCR，LCR，自动维持合成反应，Q-β复制酶，循环探针反应，分支DNA，RFLP分析，DGGE/TGGE，单链构象多态性，双脱氧指纹法，微阵列，荧光原位杂交以及比较基因组杂交。术语“扩增对”(或“引物对”)在此是指本发明的一对寡核苷酸(oligo)，对这对寡核苷酸进行选择，以在通过多种类型的扩增工艺之一，优选是聚合酶链式反应来扩增选择的核酸序列中一起使用。如本领域普遍已知的，对这些oligo进行设计以在选择的条件下与互补序列结合。在一个具体的实施例中，对来自患者的核酸样品的扩增是在有利于差异表达最丰富的核酸的扩增的条件下进行扩增的。在一个优选实施例中，RT-PCR是在有利于最丰富的mRNA的扩增的条件下、在来自患者的mRNA样品上进行的。在另一个优选实施例中，差异表达的核酸的扩增是同时进行的。本领域的普通技术人员将认识到，此类方法可以被修改用于差异表达的蛋白而非差异表达的核酸序列的检测。用于实践本发明的核酸(即，DNA或RNA)可以根据熟知的方法来获得。
取决于具体测定的方式和具体需要以及采用的靶向基因组，本发明的寡核苷酸引物可以具有任何适合的长度。可任选地，这些寡核苷酸引物的长度至少为12个核苷酸，优选是15个与24个分子之间，并且它们可以被修改以尤其适于选择的核酸扩增体系。如本领域普遍已知的，这些寡核苷酸引物可以通过考虑它与其靶向序列杂交的熔点来设计(Sambrook(萨姆布鲁克)等人，1989，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning-ALaboratory Manual)，第2版，CSH实验室；《分子生物学实验指南》(Current Protocols inMolecular Biology)中的Ausubel(奥苏贝尔)等人，1989，John Wiley and Sons Inc.(约翰威利父子公司)，纽约州)。
免疫测定
在本发明的另一个实施例中，可以使用免疫测定来定性地或定量地检测和分析样品中的标记。这种方法包括：提供一种与标记特异性结合的抗体；使样品与该抗体进行接触；以及在该样品中检测与该标记结合的该抗体的复合体的存在。
为了制备与标记特异性结合的抗体，可以使用纯化的蛋白标记。可以使用任何本领域已知的适合的方法来制备与蛋白标记特异性结合的抗体。
在提供了抗体之后，可以使用任何多种公认的免疫学结合测定来对标记进行检测和/或定量。有用的测定包括例如，酶免疫测定(EIA)(例如酶联免疫吸附测定(ELISA))、放射性免疫测定(IA)、蛋白印迹测定、或斑点印迹测定(slot blot assay)(参见，例如，美国专利号4,366,241；4,376,110；4,517,288；以及4,837,168)。通常，从受试者获得的样品可以与特异性结合该标记的抗体进行接触。
可任选地，在将该抗体与样品进行接触之前，可以将该抗体固定至固相支持体以协助该复合体的洗涤以及随后的分离。固相支持体的实例包括但不局限于，例如处于以下形式的玻璃或塑料：微量滴定板、棒、珠、或微珠。抗体也可以被附接至固相支持体。
在将该样品与抗体孵育之后，将该混合物进行洗涤，并且可以检测出形成的抗体-标记复合体。这可以通过将洗涤的混合物与检测试剂一起孵育来实现。可替代地，样品中的该标记可以使用间接测定来检测，其中例如使用一种第二、标记抗体来检测标记结合特异性抗体；和/或竞争或抑制测定，其中例如将与该标记的不同表位结合的单克隆抗体与该混合物同时孵育。
贯穿这些测定，在试剂的每种组合之后需要孵育和/或洗涤步骤。孵育步骤可以从约5秒钟至数小时变化，优选是从约5分钟至约24小时。然而，孵育时间取决于测定方式、标记、溶液的体积、浓度等。通常，尽管这些测定可以在一个温度范围内(例如10℃至40℃)进行，但是它们将在周围温度下进行。
可以使用免疫测定来确定来自受试者的样品中的标记的测试量。首先，可以使用上述的免疫测定方法来检测样品中的标记的测试量。如果该样品中存在标记，那么在上述适合的孵育条件下，它将与特异性结合该标记的抗体形成抗体-标记复合体。抗体-标记复合体的量能可任选地通过与标准品进行比较来确定。如上所指出，只要测量值的单位可以与对照量和/或信号进行比较，那么标记的测试量不需要以绝对单位进行测量。
放射-免疫测定(RIA)：在一个版本中，这种方法涉及所希望的底物的沉淀并且涉及在此以下详细说明的方法，其中在一个可沉淀的载体(例如琼脂糖珠粒)固定有特异性抗体以及放射性标记的抗体结合蛋白(例如，被I125标记的蛋白A)。沉淀的小粒的计数的数目正比于底物的量。
在RIA的一个交替版本中，采用标记的底物和未标记的抗体结合蛋白。以变化的量的形式添加包含未知量的底物的样品。来自标记的底物的沉淀计数的减少正比于添加的样品中的底物的量。
酶联免疫吸附测定(ELISA)：这种方法涉及将包含蛋白底物的样品(例如，固定的细胞或蛋白溶液)向一个表面(例如微量滴定板的孔)的固定。应用与一种酶偶联的底物特异性抗体并且允许它与该底物结合。然后采用与该抗体偶联的酶通过比色反应来检测并且定量该抗体的存在。在这种方法中常用的酶包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。如果很好校准并且在反应的线性范围内，那么该样品中存在的底物的量正比于产生的颜色的量。为了改善定量准确度，通常采用底物标准品。
蛋白印迹：这种方法涉及借助丙烯酰胺凝胶将底物与其他蛋白的分离，随后是将该底物向膜(例如，尼龙或PVDF)的转移。然后通过与该底物特异性结合的抗体对该底物的存在进行检测，这反过来通过抗体结合试剂来进行检测。抗体结合试剂可以是例如蛋白A、或其他抗体。抗体结合试剂可以如在上文所述的进行放射性标记或酶联。检测可以通过放射自显影、比色反应或化学发光。这种方法允许通过该膜上的相对位置来定量底物的量和确定其一致性两者，膜上的相对位置是电泳过程中丙烯酰胺凝胶中的迁移距离的指示。
免疫组织化学分析：这种方法涉及通过底物特异性抗体对固定的细胞中的底物的原位检测。底物特异性抗体可以被酶联或被连接至荧光团。通过显微镜和主观评价进行检测。如果采用酶联抗体，那么需要比色反应。
荧光激活细胞分选(FACS)：这种方法涉及通过底物特异性抗体对细胞中的底物的原位检测。这些底物特异性抗体被连接至荧光团。借助细胞分选设备进行检测，当每个细胞穿过一个光束时，该细胞分选设备读出由每个细胞射出的光的波长。这种方法可以同时采用两种或更多种抗体。
无线成像方法
这些方法包括但不局限于，正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。这两种技术都是非侵入性的，并且可以用来检测和/或测量多种多样组织事件和/或功能，例如像检测癌性细胞。与PECT不同，SPECT能可任选地同时与两种标签一起使用。例如关于可以使用的标签的成本和类型，SPECT也具有一些其他优势。例如，美国专利号6,696,686描述了SPECT用于检测乳腺癌的用途，并且通过引用将其结合在此，如同完全在此阐明一样。
治疗诊断学：
术语治疗诊断学描述了诊断测试的以下用途：用于根据诊断测试的结果诊断疾病、选择正确的治疗方案和/或根据诊断测试的结果监测患者对治疗的反应。可以使用治疗诊断学测试来为患者选择特别可能使其受益并且不太可能产生副作用的治疗。它们还可以提供个体患者的疗效的早期的并且客观的指示，这样使得(如果必需的话)这种治疗能以最小的延迟来改变。例如：DAKO和Genentech(基因泰克公司)一起产生了用于乳腺癌的治疗的HercepTest和Herceptin(赫赛汀)，这是与一种新的治疗药物一起被同时批准的第一种治疗诊断学测试。除了HercepTest(一种免疫组织化学测试)之外，其他的治疗诊断学测试正处于研发中，它们使用传统的临床化学、免疫测定、基于细胞的技术以及核酸测试。PPGx′s最近推出了TPMT(巯基嘌呤S-甲基转移酶)测试，它使得医生能够鉴定对6-巯基嘌呤(一种用于白血病的治疗的试剂)有潜在致命不良反应的风险的患者。而且，Nova Molecular公司开辟了载脂蛋白E基因的SNP基因分型以预测阿耳茨海默病患者对拟胆碱能药治疗的反应，并且现在它广泛地用于针对这种适应症的新药的临床试验中。因此，治疗诊断学领域代表诊断测试信息的交叉点，断测试信息能预测患者对治疗的反应连同为那位具体患者选择适当的治疗。
替代标记：
替代标记是一种这样的标记，它在实验室和/或根据患者的生理信号或症状可检测，并且在治疗试验中被用作针对临床上有意义的终点的替代物。替代标记是患者如何感觉、发挥功能、或生存的直接量度，预期的是它预测治疗的效果。就患者的治疗效果而言，当替代标记可以比感兴趣的终点(被称为临床终点)更早、更便利地、或更频繁地被测量时，对此类标记的需要大大地升高。理想地，替代标记应该是生物学上貌似合理的、预测疾病的进展的并且被归一化测定(包括但不局限于传统的临床化学、免疫测定、基于细胞的技术、核酸测定以及成像形态)可测量的。
在补体存在的情况下，还可以使用根据本发明的至少一些实施例所述的具有补体结合位点(例如，来自结合补体的IgG1、IgG2、或IgG3或IgM的部分)的治疗组合物(例如，人类抗体、多特异性分子和双特异性分子以及免疫偶联物)。在一个实施例中，包括具有根据本发明的至少一些实施例所述的结合剂的靶细胞以及适当的效应细胞的细胞群体的离体治疗可以通过添加补体或包含补体的血清进行补充。被根据本发明的至少一些实施例所述的结合剂包衣的靶细胞的吞噬作用可以通过补体蛋白的结合来改善。在另一个实施例中，被根据本发明的至少一些实施例所述的组合物(例如，人类抗体、多特异性分子以及双特异性分子)包衣的靶细胞也可以被补体裂解。在仍另一个实施例中，根据本发明的至少一些实施例所述的组合物不活化补体。
根据本发明的至少一些实施例所述的治疗组合物(例如，人类抗体、多特异性分子和双特异性分子以及免疫偶联物)也可以与补体一起给予。因此，根据本发明的至少一些实施例，存在包括人类抗体、多特异性分子或双特异性分子以及血清或补体的组合物。这些组合物是有利的，因为这种补体位于紧密接近这些人类抗体、多特异性分子或双特异性分子处。可替代地，根据本发明的至少一些实施例所述的人类抗体、多特异性分子或双特异性分子可以与补体或血清来分开给予。
通过以下实例来进一步说明本发明。此信息以及实例是说明性的并且不应被视为进一步限制。贯穿本申请引用的所有图以及所有参考文献、专利以及公开专利申请的内容明确地通过引用结合在此。
实例
实例1：
使用MED发现引擎的根据本发明的至少一些实施例所述的蛋白的表达模式：
MED是一种用于收集公共基因表达数据，归一化、注解并且执行不同查询的专利软件平台。来自使用最广泛地Affymetrix微阵列的表达数据可以从基因表达大棚车(GeneExpression Omnibus)(GEO-www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO)下载。数据通过将百分之95设置为常数值(归一化表达＝1200)用乘法进行归一准化，并且通过将下限设置为30％至0来过滤噪声。实验是带注解的，首先是自动化地，并且然后是手动地，以鉴定组织和病症，并且根据这个注解对芯片进行分组，并且这种分组的交叉验证是通过将每个芯片的基因的全部表达模式与在这个组中的基因的总平均表达模式进行比较的。为每个组中的每个探针集指定一个表达值，该表达值是包括在该组中的所有芯片中的该探针集的表达量的中值。在某一组内的全部探针集的表达的载体形成那个组的虚拟芯片，并且所有此类虚拟芯片的集合是虚拟面板。可以对面板(或子面板)进行查询以鉴定具有要求的行为的探针集(例如，在组织的子集中的特异性表达、或在患病与健康组织之间的差异表达)。这些探针集通过探针水平的作图(probe-level mapping)被连接至LEADS重叠群和RefSeq(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/)以用于进一步分析。
被下载的Affymetrix平台是HG-U95A和HG-U133家族(A，B，A2.0和PLUS 2.0)。产生了三种虚拟面板：基于相对应的Affymetrix平台的U95和U133Plus 2.0，以及使用针对HG-U133A、HG-U133A2.0和HG-U133 PLUS 2.0+的常见探针集的集合的U133。
MED发现引擎的结果以散点图呈现。散点图是给定的面板(组的集合)的简洁表示。y-轴是(归一化)表达并且x-轴描述了面板中的组。对于每组而言，中值表达量由实心标记表示，并且该组中的不同芯片的表达值由小破折号(“-”)表示。这些组如下进行安排和标记-“其他”组(例如良性的、非癌症疾病等)用三角形，被处理的细胞用正方形，正常用圆圈，匹配的用十字，并且癌症用菱形。每组中的芯片的数目也被临近其名字而书写。
MED发现引擎被用来评估VSIG10转录本的表达。表示VSIG10基因数据时，针对Affymetrix探针集220137的表达数据示于图3中(对于所有与MED发现引擎相关的图，将其分为“A”、“B”等仅是因为空间的缘故，这样能够示出所有探针结果)。如从呈现于图3中的散点图明显可见的，用上面的探针集可检测的VSIG10转录本的表达是在若干组来自免疫系统的细胞(主要是白细胞)中观察的。在不同癌症病症中观察到差异表达，例如在来自ALL(急性成淋巴细胞白血病)的CD10+白细胞与来自AML(急性髓细胞性白血病)细胞的BM-CD34+细胞上。
图3示出了一幅散点图，使用MED发现引擎展示了编码VSIG10蛋白的VSIG10转录本在所有组织和病症的虚拟面板上的表达。
MED发现引擎被用来评估LSR转录本的表达。在表示LSR基因数据时，针对Affymetrix探针集208190_s的表达数据示于图4中。如从呈现于图4中的散点图明显可见的，用上面的探针集可检测的LSR转录本的表达是在若干组来自免疫系统的细胞(主要是骨髓细胞)中观察的。在不同癌性病症的组织中也观察到了LSR转录本的高表达，例如在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌以及皮肤癌中。
图4示出了一幅散点图，使用MED发现引擎演示了编码LSR蛋白的LSR转录本在所有组织和病症的虚拟面板上的表达。
实例2
用于分析编码LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的RNA的表达的方法
关于其在不同癌性以及非癌性组织样品中的表达，对根据本发明的至少一些实施例所述的靶标进行测试。在卵巢癌测试面板中使用的样品的说明提供于下表1中。在乳腺癌测试面板中使用的样品的说明提供于下表2中。在肺癌测试面板中使用的样品的说明提供于表3中。在健康测试面板中使用的样品的说明提供于表4中。在肾癌测试面板中使用的样品的说明提供于表5中。在肝癌测试面板中使用的样品的说明提供于表6中。然后如在以下材料和方法部分所描述的进行测试。
材料和方法
RNA制备-RNA从以下获得：ABS(威尔明顿，DE 19801，美国，http://www.absbioreagents.com)，BioChain Inst.Inc.(生物链研究所公司)(海沃，CA 94545美国，www.biochain.com)，用于卵巢样品的GOG-Pediatic Cooperative Human TissueNetwork(儿科合作性人体组织网络)，Gynecologic Oncology Group Tissue Bank(妇科肿瘤学组组织库)，哥伦布的儿童医院(哥伦布，OH 43205 USA)，Ambion公司(Austin(奥斯汀)，TX 78744 USA，http://www.ambion.com)，Analytical Biological Services Inc.(分析生物学服务公司)(威尔明顿，DE 19801 USA，www.absbioreagents.com)，Asternad公司(底特律，MI 48202-3420，USA，www.asterand.com)，Genomics Collaborative Inc.(基因组协作公司)(Seracare的一个机构)(剑桥，MA 02139，USA，www.genomicsinc.com)，TheTel Aviv Sourasky Medical Center Ichilov Hospital(特拉维夫Sourasky医疗中心Ichilov医院)(特拉维夫，ISRAEL，www.tasmc.org.il/e/)以及The Chaim Sheba MedicalCenter(哈伊姆·巴医学中心)(Tel-Hashomer(特拉受麦尔)，ISRAEL，eng.sheba.co.il)。RNA样品从患者或从尸体解剖获得。使用DNasel(Ambion)对所有总RNA样品进行处理。
用于卵巢、肾脏以及健康面板的RT-PCR-将10ug的纯化RNA与随机六聚体引物(Applied Biosystems(应用生物系统公司)，根据制造说明)、4mM dNTPs、12.5μl的10XMultiScribeTM缓冲剂(Applied Biosystems(应用生物系统公司))、6μl(50U/μl)的RNasin(Promega(普洛麦格公司))以及6μl(50U/μl)的MultiScribe(Applied Biosystems(应用生物系统公司)))进行混合，总体积为125μl。将该反应在25℃下孵育10min，随后在37℃下进一步孵育2小时。然后，将该混合物在85℃下灭活5秒钟。将生成的cDNA在TE缓冲剂(10mMTris pH＝8，1mM EDTA pH＝8)中稀释为1∶10-1∶40(取决于面板校准)。
如下所述进行实时(RT)PCR分析-将如上所述制备的cDNA(5μl)用作实时PCR反应的模板(最终体积为20μl)，使用SYBR Green I测定(PE Applied Biosystem(PE应用生物系统公司))连同特异性引物和UNG酶(Eurogentech公司或ABI公司或Roche(罗氏公司))。扩增如下来实现：50℃持续2min，95℃持续10min，并且然后是95℃持续15sec，40个循环，随后是60℃持续30sec，随后是解离步骤。使用PE Applied Biosystem SDS 7000(PE应用生物系统公司SDS 7000)进行检测。对其中达到荧光性的临界水平的反应的循环(Ct＝临界循环，下面进行详细描述)进行记录，并且用来计算RT反应中的相对转录本数量。使用等式Q＝效率^-Ct来计算相对数量。PCR反应的效率是从标准曲线计算的，这条标准曲线是通过使用若干逆转录(RT)反应的不同稀释而产生的。为了最小化RT反应中的固有差异，使用以下方式计算的归一化因子对得到的相对数量进行归一化：
在每个面板中对若干管家(HSKP)基因的表达进行检查。将如上所述计算的每个样品中的每种管家基因的相对数量(Q)除以在所有面板样品中的这种基因的中值数量以获得“相对Q对MED(RelatiVe Q rel to MED)”。然后，针对每个样品，计算选择的管家基因的“相对Q对MED(Relative Q rel to MED)”的中值，并且充当用于进一步计算的这种样品的归一化因子。
针对每个RT样品，将特定扩增子的表达量相对于从不同管家基因的表达量计算出的归一化因子进行归一化。用于卵巢、肾脏、肺、肝、乳腺以及健康面板的管家基因(HSKG)列于表7中。
用于卵巢和健康面板校准的HSKG是：HPRT1、SDHA和G6PD；用于肾脏和肝面板校准的HSKP基因是：G6PD、PBGD和SDHA；用于肺面板校准的HSKP基因是：UBC、PBGD、HPRT以及SDHA；用于乳腺面板校准的HSKP基因是：G6PD、PBGD、RPL19以及SDHA。
表1：卵巢RNA细节：
表2：乳腺RNA细节：
表3：肺面板RNA细节
表4：健康面板RNA细节：
表5：肾脏面板RNA细节
表6：肝脏面板RNA细节
表7：管家基因
用于LSR转录本的表达分析的特异性引物和扩增子提供于表8中。
表8：LSR引物和扩增子
用于TMEM25转录本的表达分析的特异性引物和扩增子提供于表9中。
表9：TMEM25引物和扩增子
LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID：140)的表达数据描述于下面的实例3-9中。
实例3
由如在序列名称LSR_SEG24-36_200-309/310中描绘的扩增子可检测的LSR_转录本在正常和癌性卵巢组织中的表达
通过实时PCR测量通过或根据LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID：140)以及引物LSR_seg24F_200-309(SEQ ID：141)和LSR_seg36R_200-310(SEQ ID：142)可检测的LSR转录本的表达。将未检测到的样品(样品号28)的Ct值指定为41并且相应地进行计算。并行地，对若干管家基因的表达进行类似测量-SDHA(SEQ ID：103)(GenBank登录号NM_004168；扩增子-SDHA_扩增子(seq ID：106))，HPRTl(SEQ ID：107)(GenBank登录号NM_000194；HPRTl_扩增子(SEQ ID：110))，以及G6PD(SEQ ID：111)(GenBank登录号NM_000402；G6PD_扩增子(SEQ ID：1114))。对于每个RT样品，将上面扩增子的表达相对于如在“材料和方法”部分的归一化方法2中所描述的这些管家基因的表达中计算出的归一化因子进行归一化。然后将每个RT样品的归一化数量除以正常样品(样品编号41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63以及64，上表1)的数量的中值，以针对每个样品获得一个相对于正常样品的中值的上调倍值。
图12是一个直方图，示出了相对于正常样品的癌性卵巢样品中的上面表明的LSR转录本的过表达。
如从图12明显可见的，在浆液性癌、黏液性癌以及腺癌样品中，由上面的扩增子可检测的LSR转录本的表达显著地高于非癌性样品(样品编号41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63以及64，上表1)。值得注意地，至少5倍的过表达发现于21/27的浆液性癌样品中，7/9的黏液性癌样品中以及7/8的内膜样癌样品中。
如下所述，应用统计学分析来检验这些结果的显著性。
针对由上面的扩增子可检测的LSR转录本在卵巢癌样品对比正常组织样品中的表达水平的差异的P值由T检验确定为2.22e-002。针对由上面的扩增子可检测的LSR转录本在卵巢黏液性癌样品对比正常组织样品中的表达水平的差异的P值由T检验确定为6.84e-004。针对由上面的扩增子可检测的LSR转录本在卵巢内膜样癌样品对比正常组织样品中的表达水平的差异的P值由T检验确定为4.61e-003。针对由上面的扩增子可检测的LSR转录本在卵巢腺癌样品对比正常组织样品中的表达水平的差异的P值由T检验确定为5.68e-004。
发现5倍过表达的临界能以如通过精确Fisher检验所检查的2.59e-009的P值来区分浆液性癌与正常样品。发现5倍过表达的临界能以如通过精确Fisher检验所检查的8.43e-006的P值来区分浆黏液性癌与正常样品。发现5倍过表达的临界能以如通过精确Fisher检验所检查的2.38e-006的P值来区分浆内膜样癌与正常样品。发现5倍过表达的临界能以如通过精确Fisher检验所检查的7.28e-012的P值来区分浆腺癌样品与正常样品。
上面的值展示了这些结果的统计学显著性。
引物对也可任选地并且优选地被涵盖在本发明内；例如，对于上面的实验，将以下引物对仅用作一种适合的引物对的非限制性示意性实例：LSR_seg24F_200-309(SEQ ID：141)；和LSR_seg36R_200-310(SEQ ID：142)。
本发明还优选地涵盖通过使用任何适合的引物对而获得的任何扩增子；例如，对于上面的实验，以下扩增子仅作为适合的扩增子的一个非限制性示意性实例而获得：LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID：140)。
实例4
由如在序列名称LSR_SEG24-36_200-309/310中描绘的扩增子可检测的LSR_转录本在正常和癌性乳腺组织中的表达
通过实时PCR测量通过或根据seg24-36FR-LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID：140)以及引物LSR_seg24F_200-309(SEQ ID：141)和LSR_seg36R_200-310(SEQID：142)可检测的LSR转录本的表达。将来检测到的样品(样品号81)的Ct值指定为41并且相应地进行计算。并行地，对若干管家基因的表达进行类似测量-G6PD(SEQ ID：111)(GenBank登录号NM_000402；G6PD_扩增子)，PBGD(SEQ ID：115)(GenBank登录号BC019323；PB GD_扩增子)，RPL19(SEQ ID：119)(GenBank登录号NM_000981RPL19_扩增子)以及SDHA(SEQ ID：103)(GenBank登录号NM_004168SDHA_扩增子)。对于每个RT样品，将上面扩增子的表达相对于如在“材料和方法”部分的归一化方法2中所描述的这些管家基因的表达中计算出的归一化因子进行归一化。然后将每个RT样品的归一化数量除以正常样品(样品编号43、45、46、47、48、49、50、51、52、54、56、58、59、60、61、62、63、64、66、67、68以及69，上表2)的数量的中值，以针对每个样品获得一个相对于正常样品的中值的折中上调值。
图13是一个直方图，示出了相对于正常样品的癌性乳腺样品中的上面表明的LSR转录本的过表达。
如从图13明显可见的，在癌症样品中，由上面的扩增子可检测的LSR转录本的表达高于非癌性样品(样品编号43、45、46、47、48、49、50、51、52、54、56、58、59、60、61、62、63、64、66、67、68以及69，上表2)。值得注意地，至少5倍的过表达发现于9/53的腺癌样品中。
引物对也可任选地并且优选地被涵盖在本发明内；例如，对于上面的实验，将以下引物对仅用作一种适合的引物对的非限制性示意性实例：LSR_seg24F_200-309(SEQ ID：141)；和LSR_seg36R_200-310(SEQ ID：142)。
本发明还优选地涵盖通过使用任何适合的引物对而获得的任何扩增子；例如，对于上面的实验，以下扩增子仅作为适合的扩增子的一个非限制性示意性实例而获得：LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID：140)。
实例5
由如在序列名称LSR_SEG24-36_200-309/310中描绘的扩增子可检测的LSR_转录本在正常和癌性肺组织中的表达
通过实时PCR测量通过或根据seg24-36FR LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID：140)以及引物LSR_seg24F_200-309(SEQ ID：141)和LSR_seg36R_200-310(SEQID：142)可检测的LSR转录本的表达。并行地，对若干管家基因的表达进行类似测量-HPRT1(SEQ ID：107)(GenBank登录号NM_000194 HPRTl_扩增子(SEQ ID：110))，PBGD(SEQ ID：115)(GenBank登录号BC019323；PB GD_扩增子(SEQ ID：118))，SDHA(SEQ ID：103)(GenBank登录号NM_004168；SDHA_扩增子(SEQ ID：106))以及泛素(SEQ ID：133)(GenBank登录号BC000449；泛素_扩增子(SEQ ID：136))。对于每个RT样品，将上面扩增子的表达相对于如在“材料和方法”部分的归一化方法2中所描述的这些管家基因的表达中计算出的归一化因子进行归一化。然后将每个RT样品的归一化数量除以正常样品(样品编号51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、69以及70，上表3)的数量的中值，以针对每个样品获得一个相对于正常样品的中值的上调倍值。
图14是一个直方图，示出了相对于正常样品的癌性肺样品中的上面表明的LSR转录本的过表达。
如从图14明显可见的，由上面的扩增子可检测的LSR或转录本的表达在腺癌和非小细胞癌样品中显著地高于非癌性样品(样品编号51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、69以及70，上表3)，并且在一些鳞状细胞癌样品中高于非癌性样品。值得注意地，至少5倍的过表达发现于7/15的腺癌样品中，3/18的鳞状细胞癌样品中以及10/40的非小细胞癌样品中。
如下所述，应用统计学分析来检验这些结果的显著性。
针对由上面的扩增子可检测的智人脂解激活脂蛋白受体转录本在肺腺癌样品对比正常组织样品中的表达水平的差异的P值由T检验确定为2.98e-005。针对由上面的扩增子可检测的LSR转录本在肺鳞状细胞癌样品对比正常组织样品中的表达水平的差异的P值由T检验确定为7.42e-003。针对由上面的扩增子可检测的智人脂解激活脂蛋白受体转录本在肺大细胞癌样品对比正常组织样品中的表达水平的差异的P值由T检验确定为1.76e-002。针对由上面的扩增子可检测的智人脂解激活脂蛋白受体转录本在肺小细胞癌样品对比正常组织样品中的表达水平的差异的P值由T检验确定为4.35e-002。针对由上面的扩增子可检测的智人脂解激活脂蛋白受体转录本在肺非小细胞癌样品对比正常组织样品中的表达水平的差异的P值由T检验确定为4.31e-006。
发现5倍过表达的临界能以如通过精确Fisher检验所检查的3.16e-003的P值来区分浆腺癌与正常样品。发现5倍过表达的临界能以如通过精确Fisher检验所检查的2.90e-002的P值来区分非小细胞癌与正常样品。
上面的值展示了这些结果的统计学显著性。
引物对也可任选地并且优选地被涵盖在本发明内；例如，对于上面的实验，将以下引物对仅用作一种适合的引物对的非限制性示意性实例：LSR_seg24F_200-309(SEQ ID：141)；和LSR_seg36R_200-310(SEQ ID：142)。
本发明还优选地涵盖通过使用任何适合的引物对而获得的任何扩增子；例如，对于上面的实验，以下扩增子仅作为适合的扩增子的一个非限制性示意性实例而获得：LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID：140)。
实例6
由如在序列名称LSR_SEG24-36_200-309/310中描绘的扩增子可检测的LSR_转录本在不同正常组织中的表达
通过实时PCR测量通过或根据seg24-36FR LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID：140)以及引物LSR_seg24F_200-309(SEQ ID：141)和LSR_seg36R_200-310(SEQID：142)可检测的LSR转录本的表达。并行地，对若干管家基因的表达进行类似测量-SDHA(SEQ ID：103)(GenBank登录号NM_004168；SDHA_扩增子(SEQ ID：106))，HPRT1(SEQ ID：107)(GenBank登录号NM_000194；HPRTl_扩增子(SEQ ID：110))，以及G6PD(SEQ ID：111)(GenBank登录号NM_000402；G6PD_扩增子(SEQ ID：114))。对于每个RT样品，将上面扩增子的表达相对于如在“材料和方法”部分的归一化方法2中所描述的这些管家基因的表达中计算出的归一化因子进行归一化。然后将每个RT样品的归一化数量除以卵巢样品(样品编号20、21、22以及23，上表4)的数量的中值，以针对每个样品获得一个相对于卵巢样品的中值的相对表达值。
图15是一个直方图，示出了相对于卵巢样品的正常组织样品中的上面表明的LSR转录本的表达。
实例7
由如在序列名称LSR_SEG24-36_200-309/310中描绘的扩增子可检测的LSR_转录本在正常和癌性肾脏组织中的表达
通过实时PCR测量通过或根据seg24-36FR-LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID：140)以及引物LSR_seg24F_200-309(SEQ ID：141)和LSR_seg36R_200-310(SEQID：142)可检测的LSR转录本的表达。并行地，对若干管家基因的表达进行类似测量-SDHA(SEQ ID：103)(GenBank登录号NM_004168；SDHA_扩增子(SEQ ID：106))，G6PD(SEQ ID：111)(GenBank登录号NM_000402；G6PD_扩增子(SEQ ID：114))以及PBGD(SEQ ID：115)(GenBank登录号BC019323；PB GD_扩增子(SEQ ID：118))。对于每个RT样品，将上面扩增子的表达相对于如在“材料和方法”部分的归一化方法2中所描述的这些管家基因的表达中计算出的归一化因子进行归一化。然后将每个RT样品的归一化数量除以正常样品(样品编号1、2、3、4以及19，上表5)的数量的中值，以针对每个样品获得一个相对于正常样品的中值的上调倍值。
图16是一个直方图，示出了相对于正常样品的癌性肾脏样品中的上面表明的智人脂解激活脂蛋白受体转录本的下调。
如从图16明显可见的，由上面的扩增子可检测的LSR转录本的表达在癌性肾脏样品中显著地低于非癌性样品(样品编号1、2、3、4以及19，上表5)。
如下所述，应用统计学分析来检验这些结果的显著性。
针对由上面的扩增子可检测的LSR转录本在癌性肾脏样品对比正常组织样品中的表达水平的差异的P值由T检验确定为1.25e-01。
引物对也可任选地并且优选地被涵盖在本发明内；例如，对于上面的实验，将以下引物对仅用作一种适合的引物对的非限制性示意性实例：LSR_seg24F_200-309(SEQ ID：141)；和LSR_seg36R_200-310(SEQ ID：142)。
本发明还优选地涵盖通过使用任何适合的引物对而获得的任何扩增子；例如，对于上面的实验，以下扩增子仅作为适合的扩增子的一个非限制性示意性实例而获得：LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID：140)。
实例8
由如在序列名称LSR_SEG24-36_200-309/310中描绘的扩增子可检测的LSR_转录本在正常和癌性肝脏组织中的表达
通过实时PCR测量通过或根据seg24-36FR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQID：140)以及引物LSR_seg24F_200-309(SEQ ID：141)和LSR_seg36R_200-310(SEQ ID：142)可检测的LSR转录本的表达。并行地，对若干管家基因的表达进行类似测量-SDHA(SEQ ID：103)(GenBank登录号NM_004168；SDHA_扩增子(SEQ ID：106))，G6PD(SEQ ID：111)(GenBank登录号NM_000402；G6PD_扩增子(seq ID：114))以及PBGD(SEQ ID：115)(GenBank登录号BC019323；-PBGD_扩增子(SEQ ID：118))。对于每个RT样品，将上面扩增子的表达相对于如在“材料和方法”部分的归一化方法2中所描述的这些管家基因的表达中计算出的归一化因子进行归一化。然后将每个RT样品的归一化数量除以正常样品(样品编号41、42、43、44以及45，上表6)的数量的中值，以针对每个样品获得一个相对于正常样品的中值的上调倍值。
图17是一个直方图，示出了相对于正常样品的癌性肝脏样品中的上面表明的LSR转录本的表达。
引物对也可任选地并且优选地被涵盖在本发明内；例如，对于上面的实验，将以下引物对仅用作一种适合的引物对的非限制性示意性实例：LSR_seg24F_200-309(SEQ ID：141)；和LSR_seg36R_200-310(SEQ ID：142)反向引物。
本发明还优选地涵盖通过使用任何适合的引物对而获得的任何扩增子；例如，对于上面的实验，以下扩增子仅作为适合的扩增子的一个非限制性示意性实例而获得：LSR_seg24-36_200-309/310_扩增子(SEQ ID：140)。
实例9
融合至FLAG标签的LSR_Tl_P5a ORF的克隆
融合至FLAG(氨基酸序列：DYKDDDDK，SEQ ID NO：153)的LSR_Tl_P5a开放读码框(ORF)(SEQ ID NO：154)的克隆以产生融合至flag的LSR_P5a蛋白(SEQ ID NO：11)是通过PCR如下所述进行的。
在以下条件下使用PfuUltra II融合HS DNA聚合酶(安捷伦公司(Agilent)，目录号600670)进行3-步PCR反应：在第一步中，来自卵巢面板(表1)的1μl的未稀释卵巢样品(IDPZQXH)充当PCR反应的模板，其中每种引物200_369_LSR_Kozak_NheI(SEQ ID NO：147)和200_379_LSR_Rev(SEQ ID NO：148)为0.5μl，总反应体积为25μl。反应条件是：5分钟，98℃；35个循环：20秒钟、98℃，30秒钟、55℃以及1.5分钟、72℃；然后是5分钟，72℃。将PCR产物在DDW中以1∶20进行稀释并且使用1ul作为步骤2中的每个PCR反应的模板。
对于第二步，用0.5ul的每种引物200_369_LSR_Kozak_NheI(10μM)(SEQ ID NO：147)和200_371_LSR_seg36R(10μM)(SEQ ID NO：149)对LSR的5′部分进行扩增，总反应体积为25μl。使用0.5ul的每种引物200_370_LSR_seg36F(10μM)(SEQ ID NO：150)和200-373_LSR_Flag_BamHI_Rev(10μM)(SEQ ID NO：151)对LSR的3′部分进行扩增，总反应体积为25μl。对于两个反应的反应条件是：5分钟，98℃；35个循环：20秒钟、98℃，15秒钟、60℃以及1.5分钟、72℃；然后是5分钟，72℃。将每个反应的产物在1％的琼脂糖凝胶上进行分离并且使用QiaquickTM Gel Extraction Kit(QiaquickTM凝胶提取试剂盒)(Qiagene公司，目录号28706)将其从凝胶中纯化。将100ng的5′产物和100ng的3′产物用作第三步PCR反应的模板，其中对全LSR-Flag序列进行扩增。每种引物200_369_LSR_Kozak_NheI(SEQ ID NO：147)和200-373_LSR_Flag_BamHI_Rev(SEQ ID NO：151)为0.5μl，总反应体积为25μl。反应条件是：5分钟，98℃；35个循环：20秒钟、98℃，30秒钟、55℃以及1.5分钟、72℃；然后是5分钟，72℃。使用的所有引物包括基因特异性序列、限制性内切酶位点、Kozak序列以及FLAG标签序列。将步骤3的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行分离。在验证预期带的大小之后，使用QiaquickTM Gel Extraction Kit(QiaquickTM凝胶提取试剂盒)对PCR产物进行纯化。
将纯化的全长PCR产物用NheI和BamHI限制性内切酶(新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs)，贝弗利，马萨诸塞州，美国)进行消化。消化之后，将DNA在1％的琼脂糖凝胶上进行分离。将预期大小的带从如上所述的凝胶切除并且提取。然后将消化的DNA连接进被如上所述的NheI和BamHI消化的pIRESpuro3载体中，在37℃下使用南极磷酸酯酶(Antarctic Phosphatase)(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，贝弗利，MA，U.S.A.，目录号M0289L)处理30分钟，并且使用如上所述的QiaquickTM Gel Extraction Kit(QiaquickTM凝胶提取试剂盒)将其从1％的琼脂糖凝胶中纯化。使用T4 DNA连接酶(Promega(普洛麦格公司)，目录号M180A)进行连接反应。
实例10
LSR_Tl_P5a ORF的克隆
如下所述，通过PCR进行LSR_Tl_P5a开放读码框(ORF)(SEQ ID NO：154)的克隆以产生LSR_P5a蛋白(SEQ ID NO：11)。
在以下条件下使用PfuUltra II融合HS DNA聚合酶(安捷伦公司(Agilent)，目录号600670)进行PCR反应：50ng的上述pIRES_puro3_LSR_Tl_P5a_Flag构建体充当PCR反应的模板，每种引物200_369_LSR_Kozak_NheI(SEQ ID NO：147)和200-372_LSR_BamHI_Rev(SEQID NO：152)为0.5微升，总反应体积为25μl。反应条件是：5分钟，98℃；35个循环：20秒钟、98℃，30秒钟、55℃以及1.5分钟、72℃；然后是10分钟，72℃。使用的所有引物包括基因特异性序列、限制性内切酶位点以及Kozak序列。将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行分离在验证预期带的大小之后，使用如上所述的QiaquickTM Gel Extraction Kit(QiaquickTM凝胶提取试剂盒)对PCR产物进行纯化。
将纯化的PCR产物用NheI和BamHI限制性内切酶(新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs)，贝弗利，马萨诸塞州，美国)进行消化。消化之后，将DNA在1％的琼脂糖凝胶上进行分离。将预期大小的带从如上所述的凝胶切除并且提取。然后将消化的DNA连接进被如上所述的NheI和BamHI消化的pIRESpuro3载体中，在37℃下使用南极磷酸酯酶(Antarctic Phosphatase)(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，贝弗利，MA，U.S.A.，目录号M0289L)孵育30分钟，并且使用如上所述的QiaquickTM Gel Extraction Kit(QiaquickTM凝胶提取试剂盒)将其从1％的琼脂糖凝胶中纯化。使用T4 DNA连接酶(Promega(普洛麦格公司)，目录号M180A)进行连接反应。
对上述标记的构建体和未标记的构建体两者进行序列验证(Hylabs公司，雷霍沃特，以色列)。鉴定出两种核苷酸错配，如下：SEQ ID NO：154的核酸位置119处的G与A配对，以及来自SEQ ID NO：154的核酸位置626处的A与G配对，这产生针对未标记的构建体的SEQID NO：145中所阐明的核酸序列以及针对标记的构建体的SEQ ID NO：146中所阐明的核酸序列；这产生一种在SEQ ID NO：301中的氨基酸位置209处具有I与M的氨基酸错配的多肽，这产生具有针对未标记的构建体的SEQ ID NO：143中所阐明的氨基酸序列的蛋白以及具有针对标记的构建体的SEQ ID NO：144中所阐明的氨基酸序列的蛋白。
对上面的重组质粒进行处理以如下所述地产生稳定库。
实例11
表达LSR_P5a_FLAG_M蛋白的重组HEK293T细胞的稳定库的建立
使用LSR_Tl_P5a_Flag_m(SEQ ID NO：146)和pIRESpuro3空载体质粒如下对HEK-293T细胞进行稳定转染：
将HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞在适合组织培养的无菌6孔板上涂板，包含：2ml预加温的完全培养基，DMEM[Dulbecco′s modified Eagle′s Media(杜尔贝科改良的伊戈尔培养基)，生物工业公司(Biological Industries)(Beit Ha′Emek，以色列，目录号：01-055-1A)]+10％FBS[胎牛血清，生物工业公司(Biological Industries)(Beit Ha′Emek，以色列，目录号：04-001-1A)]+4mM L-谷氨酰胺(生物工业公司(BiologicalIndustries)(Beit Ha′Emek，以色列)，目录号：03-020-1A)。使用被稀释成94ul DMEM的6μl的FuGENE 6试剂(Roche(罗氏公司)，目录号：11-814-443-001)将每孔500,000个细胞用2μg的DNA构建体进行转染。将该混合物在室温下孵育15分钟。将该复杂混合物滴加至这些细胞中。将这些细胞放置于维持在37℃、具有5％的CO2含量的培养箱中。转染后48小时，将这些细胞转移至包含15ml的选择培养基(补充有5μg\ml嘌罗霉素(Sigma公司，目录号P8833)的完全培养基)的75cm2的组织培养烧瓶中。将细胞放置于培养箱中，并且每3-4天置换培养基，直到观察到克隆形成。
实例12
LSR_P5a_FLAG_M在稳定转染的HEK293T细胞中的异位表达分析
使用如在表9中表明的抗LSR抗体和抗flag抗体，通过细胞溶解产物的蛋白印迹分析来确定LSR_P5a_Flag_m(SEQ ID NO：144)在稳定转染的HEK293T细胞中的表达。
使用基于PBS的无酶细胞解离缓冲剂(Cell Dissociation Buffer Enzyme-FreePBS-Based)(Gibco公司；13151-014)将细胞从该平板上解离，在杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline)(PBS)(生物工业公司(BiologicalIndustries)，02*023-1A)中洗涤并且在1200g下离心5分钟。通过将这些细胞重悬浮于补充有25x的无蛋白酶抑制剂cocktail(Roche(罗氏公司)，11 873 580 001)的完全EDTA的50mMTris-HCl pH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、1％Triton X-100中并且涡旋20秒钟来进行全细胞提取。在4℃下、在20,000g下离心20分钟之后收集细胞提取物并且使用Bradford Biorad蛋白测定(Biorad cat#500-0006)来确定蛋白浓度。通过SDS-PAGE(英杰公司(Invitrogen)，NuPAGE 4-12％NuPAGEBis Tris，Cat#NP0335，NP0322)对相等蛋白量进行分析并且将其转移至硝酸纤维素膜(BA83，0.2μm，Schleicher(施莱歇尔)和Schuell(许尔)，Cat#401385)。将膜用TTBS(Biolab，Cat#：20892323)/10％脱脂乳(Difco，Cat#232100)封闭并且在4℃下、使用处于表明浓度(表9)的被稀释进TTBS/5％BSA(Sigma-Aldrich公司，A4503)的表明的第一抗体(图18)孵育16小时。在使用TTBS洗涤3次之后，该膜在室温下使用如所表明的、稀释于TTBS中的二级偶联抗体进一步孵育1小时。使用ECL蛋白印迹检测试剂(ECL Western Blotting Detection Reagent)(GE Healthcare(GE医疗集团)，Cat#RPN2209)进行化学发光反应并且将该膜暴露于超级RX富士X斜线胶片(Super RX Fuji X-Ray film)(目录号4741008389)。
图18展示了处于预期带大小～70k Da的重组HEK293T细胞中LSR_P5a_Flag_m蛋白(SEQ ID NO：144)的表达，使用如下Flag(Sigma公司cat#A8592)(图18A)和抗LSR抗体所检测的：Abnova公司，cat#H00051599-B01P(图18B)，Abeam公司，cat ab59646(图18C)以及Sigma公司cat#HPA007270(图18D)。
实例13
异位LSR_P5a_FLAG_M在HEK293T细胞中的亚细胞定位的确定
LSR_P5a_Flag_m蛋白(SEQ ID NO：144)在稳定转染的细胞中的亚细胞定位是通过共聚焦显微镜确定的。
将上述表达LSR_P5a_Flag_m(SEQ ID NO：144)的稳定转染的重组HEK293T细胞涂板在被聚-L-赖氨酸(Sigma公司，目录号P4832)预包衣的盖玻片上。24小时之后，对这些细胞进行处理用于免疫染色并且通过共聚焦显微镜进行分析。将盖玻片在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行洗涤，然后在PBS/3.7％多聚甲醛(PFA)(EMS，目录号：15710)/3％葡萄糖(Sigma公司，目录号：G5767)的溶液中固定15分钟。将PFA用PBS/3mM甘氨酸(Sigma，目录号：G7126)淬灭5分钟。在两个PBS中的5分钟的洗涤之后，将这些细胞使用PBS/0.1％Triton-X100在室温下透性化5分钟并且在PBS中洗涤两次。然后，使用PBS/牛血清白蛋白(BSA)(Sigma公司，目录号：A4503)进行非特异区的阻断，持续20分钟。然后将盖玻片与多种第一抗体在湿热试验箱(humid chamber)中孵育1小时，所用每种第一抗体如所表明的在PBS/5％BSA中进行稀释，随后是在PBS中的三个5分钟的洗涤。然后，将盖玻片用相对应的第二抗体孵育30分钟，该第二抗体在表明的稀释度被稀释于PBS/2.5％BSA中。使用的抗体和稀释度规定于表9中。在汉克平衡盐溶液(Hank′s Balanced Salt Solutions)w/o酚红(HBSS)(生物工业公司(Biological Industries)，目录号02-016-1)中的一个预洗涤之后，将盖玻片用以1∶200稀释于HBSS中的WGA-Alexa 488(英杰公司(Invitrogen)，目录号W11261)孵育10min，在HBSS中进行洗涤并且在以1∶1000稀释于HBSS中的双苯酰亚胺H 33258(BISBENZIMIDE H 33258)(Sigma，目录号：14530)进行孵育。然后将盖玻片安装在具有GelMount水性介质(Gel Mount Aqueous medium)(Sigma，目录号：G0918)的载玻片上并且使用共聚焦显微镜针对荧光产物的存在对细胞进行观察。
LSR_P5a_Flag_m的亚细胞定位展示于图19中，LSR_P5a_Flag_m(SEQ ID NO：144)主要定位至细胞的细胞质，但是也可以在细胞表面检测到，使用如下抗Flag(Sigma cat#A9594)(图19A)和抗LSR抗体所检测的：Abcam公司，cat ab59646(图19B)，Abnova公司，cat#H00051599-B01P(图19C)以及Sigma公司cat#HPA007270(图19D)。
实例14
内源LSR蛋白在不同细胞系中的表达的分析
内源LSR蛋白在不同细胞系中的表达通过蛋白印迹法如下所述进行分析。
如上所述制备SK-OV3(ATCC号HTB-77)、Caov3(ATCC号HTB-75)、OVCAR3(ATCC号HTB-161)、ES-2(ATCC号CRL-1978)、OV-90(ATCC号CRL-11732)、TOV112D(ATCC号CRL-11731)以及Hep G2(ATCC号HB-8065)的细胞提取物。
从圣克鲁斯生物技术公司(SantaCruz Biotechnology)购买HeLa(目录号sc-2200)、MCF-7(目录号sc-2206)、CaCo2(目录号sc-2262)以及SkBR3(目录号sc-2218)的细胞提取物。
如上所述，通过SDS-PAGE分析相等蛋白量并且将其转移至硝酸纤维素膜。将膜用TTBS(Biolab，Cat#：20892323)/10％脱脂乳(Difco，Cat#232100)封闭并且在4℃下、使用处于表明浓度(表9)的被稀释进TTBS/5％BSA(Sigma-Aldrich公司，A4503)的抗LSR抗体(Abcam，cat#ab59646)孵育16小时。在使用TTBS洗涤3次之后，该膜在室温下使用如所表明的、稀释于TTBS中的二级偶联抗体(表9)进一步孵育1小时。使用ECL蛋白印迹检测试剂(ECLWestern Blotting Detection Reagent)(GE Healthcare(GE医疗集团)，Cat#RPN2209)进行化学发光反应并且将该膜暴露于超级RX富士X斜线胶片(Super RX Fuji X-Ray film)(目录号4741008389)。
图20展示了在不同细胞系中的LSR的内源表达。用SK-OV3、Caov3、OVCAR3、OV-90、Hep G2、HeLa、CaCo2、以及SkBR3的提取物中的抗LSR抗体检测到了对应于LSR的处于72kDa的带(图20A)。抗GAPDH(Abeam cat#ab9484)充当一个上样对照(图20B)。
表9：第一抗体和第二抗体
实例15
由如在序列名称TMEM25_SEG21-27中描绘的扩增子可检测的TMEM25_转录本在正常和癌性乳腺组织中的表达
通过实时PCR测量通过或根据seg21-27-TMEM25_seg_21-27_200-344/346_扩增子(SEQ ID NO：123)以及引物TMEM25_seg21F_200-344(SEQ ID NO：124)和TMEM25_seg27R_200-346(SEQ ID NO：125)可检测的TMEM25转录本的表达。并行地，对若干管家基因的表达进行类似测量-G6PD(GenBank登录号NM_000402；(SEQ ID NO.111)G6PD_扩增子(SEQ IDNO.114))，RPL19(GenBank登录号NM 000981；(SEQ ID NO.119)-RPL19_扩增子(SEQ IDNO.122))，PBGD(GenBank登录号BC019323；(SEQ ID NO.115)PB GD_扩增子(SEQ IDNO.118))以及SDHA(GenBank登录号NM_004168；(SEQ ID NO.103)SDHA_扩增子(SEQ IDNO.106))。对于每个RT样品，将上面扩增子的表达相对于如在“材料和方法”部分中所描述的这些管家基因的表达中计算出的归一化因子进行归一化。然后将每个RT样品的归一化数量除以正常样品(样品编号43、45、46、47、48、49、50、51、52、54、56、58、59、60、61、62、63、64、66、67、68以及69，上表1)的数量的中值，以针对每个样品获得一个相对于正常样品的中值的差异表达的倍值。
在进行的两个实验中，没有观察到癌性样品相对于正常样品的差异表达(图21)。
引物对也可任选地并且优选地被涵盖在本发明内；例如，对于上面的实验，将以下引物对仅用作一种适合的引物对的非限制性示意性实例：TMEM25_seg21F_200-344(SEQ IDNO.124)正向引物；和TMEM25_seg27R_200-346(SEQ ID NO.125)反向引物。
本发明还优选地涵盖通过使用任何适合的引物对而获得的任何扩增子；例如，对于上面的实验，以下扩增子仅作为适合的扩增子的一个非限制性示意性实例而获得：TMEM25_seg_21-27_200-344/346_扩增子(SEQ ID NO：123)。
实例16
由如在序列名称TMEM25_SEG21-27中描绘的扩增子可检测的TMEM25_转录本在不同正常组织中的表达
通过实时PCR测量通过或根据seg21-27-TMEM25_seg_21-27_200-344/346_扩增子(SEQ ID NO：123)以及引物TMEM25_seg21F_200-344(SEQ ID NO：124)和TMEM25_seg27R_200-346(SEQ ID NO：125)可检测的TMEM25转录本的表达。并行地，对若干管家基因的表达进行类似测量-SDHA(GenBank登录号NM_004168；(SEQ ID NO.103)SDHA_扩增子(SEQ IDNO.106))，G6PD(GenBank登录号NM_000402；(SEQ ID NO.111)G6PD_扩增子(SEQ IDNO.114))以及HPRT1(GenBank登录号NM_000194；(SEQ ID NO.107)HPRTl_扩增子(SEQ IDNO.110))。对于每个RT样品，将上面扩增子的表达相对于如在“材料和方法”部分的归一化方法2中所描述的管家基因的表达中计算出的归一化因子进行归一化。然后将每个RT样品的归一化数量除以乳腺样品(样品编号30、31、32以及33，上表2)的数量的中值，以针对每个样品获得一个相对于乳腺样品的中值的相对表达值(图22)。
实例17
TMEM25蛋白的克隆
融合至FLAG标签的TMEM25_T0_P5 ORF的克隆
融合至FLAG(SEQ ID NO：153)的TMEM25_T0_P5开放读码框(ORF)(SEQ ID NO：130)的克隆是通过RT PCR如下所述进行的。
1μl的未稀释的结肠癌库DNA充当PCR反应的模板。在以下条件下，使用KAPA HifiDNA聚合酶(KAPABIOSYSTEM，目录号KK2101)进行PCR：1μl-上述cDNA；1μl(25μM)-每种引物200-374_TMEM25_NheI_Kozak_seg5F(SEQ ID NO：127)和200-375_TMEM25_Flag_STOP_EcoRI_seg43R(SEQ ID NO：128)，总反应体积为50μl；反应程序为：5分钟，95℃；40个循环：20秒钟、98℃，15秒钟、55℃，1分钟、72℃；然后是5分钟、72℃。使用的引物包括基因特异性序列；限制性内切酶位点；Kozak序列以及FLAG标签。
将25μl的PCR产物上样在经溴化乙锭染色的1.5％的琼脂糖凝胶上，在100V下、在1x TAE溶液中电泳，并且使用UV光进行可视化。在验证预期带的大小之后，1μl的上面模板上的PCR产物充当再扩增的模板。在上述相同的条件下，使用KAPA Hifi DNA聚合酶(KAPABIOSYSTEM，目录号KK2101)进行PCR。
使用QIAquickTM Gel Extraction Kit(QIAquickTM凝胶提取试剂盒)(Qiagene公司，目录号：28707)将PCR产物从该凝胶中纯化。
将纯化的PCR产物用NheI和BamHI限制性内切酶(新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs)，贝弗利，MA，U.S.A.)进行消化。然后将消化的DNA连接至预先被上面的限制性内切酶消化的pIRESpuro3(pRp)载体(Clontech公司，cat No：631619)中，使用T4DNA连接酶(Promega(普洛麦格公司)，目录号：M1801)。将生成的DNA根据制造商的说明转化进感受态E.Coli细菌DH5α(RBC Bioscience(RBC生物科学公司)，台北，台湾，目录号：RH816)中，然后在用于重组质粒的选择的琼脂平板上进行涂板，并且在37℃下孵育过夜。第二天，使用pIRESpuro3载体特异性引物和基因特异性引物通过PCR对阳性菌落进行筛选(数据未示出)。使用2％的琼脂糖凝胶如上所述对PCR产物进行分析。在验证预期带的大小之后，使阳性菌落生长于补充有10μg/ml氨比西林的5ml极品肉汤(Terrific Broth)中，在37℃下振荡过夜。使用QiaprepTM Spin小量制备试剂盒(QiaprepTM Spin Miniprep Kit)(Qiagene公司，目录号：27106)将质粒DNA从细菌培养物中分离。通过对插入片段进行测序检验精确克隆(Hylabs公司，雷霍沃特，以色列)。当检验出无错误的菌落(即，在ORF内没有突变)时，对重组质粒进行处理用于进一步分析。
未标记的TMEM25_T0_P5 ORF的克隆
未标记的TMEM25_T0_P5开放读码框(ORF)(SEQ ID NO：130)的克隆是通过RT PCR如下所述进行的。
1μl的未稀释的结肠癌库DNA充当PCR反应的模板。在以下条件下，使用KAPA HifiDNA聚合酶(KAPABIOSYSTEM，目录号KK2101)进行PCR：1μl-上述cDNA；1μl(25μM)-每种引物200-374_TMEM25_NheI_Kozak_seg5F(SEQ ID NO：127)和200-377_TMEM25_STOP_EcoRI_seg43R(SEQ ID NO：131)，总反应体积为50μl；反应程序为：5分钟，95℃；40个循环：20秒钟、98℃，15秒钟、55℃，1分钟、72℃；然后是5分钟、72℃。使用的引物包括基因特异性序列；限制性内切酶位点以及Kozak序列。
将25μl的PCR产物上样在经溴化乙锭染色的1.5％的琼脂糖凝胶上，在100V下、在1x TAE溶液中电泳，并且使用UV光进行可视化。在验证预期带的大小之后，5μl的上面模板上的PCR产物充当再扩增的模板。在上述相同的条件下，使用KAPA Hifi DNA聚合酶(KAPABIOSYSTEM，目录号KK2101)进行PCR。
使用QIAquickTM Gel Extraction Kit(QIAquickTM凝胶提取试剂盒)(Qiagene公司，目录号：28707)将PCR产物从该凝胶中纯化。
将纯化的PCR产物用NheI和BamHI限制性内切酶(新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs)，贝弗利，马萨诸塞州，美国)进行消化。然后将消化的DNA连接至预先被上面的限制性内切酶消化的pIRESpuro3(pRp)载体(Clontech公司，cat No：631619)中，使用T4 DNA连接酶(Promega(普洛麦格公司)，目录号：M1801)。将生成的DNA根据制造商的说明转化进感受态E.Coli细菌DH5α(RBC Bioscience(RBC生物科学公司)，台北，台湾，目录号：RH816)中，然后在用于重组质粒的选择的琼脂平板上进行涂板，并且在37℃下孵育过夜。第二天，使用pIRESpuro3载体特异性引物和基因特异性引物通过PCR对阳性菌落进行筛选(数据未显示)。使用2％的琼脂糖凝胶如上所述对PCR产物进行分析。在验证预期带的大小之后，使阳性菌落生长于补充有100μg/ml氨比西林的5ml极品肉汤(Terrific Broth)中，在37℃下振荡过夜。使用QiaprepTM Spin小量制备试剂盒(QiaprepTM Spin Miniprep Kit)(Qiagene公司，目录号：27106)将质粒DNA从细菌培养物中分离。通过对插入片段进行测序检验精确克隆(Hylabs，雷霍沃特，以色列)。当检验出无错误的菌落(即，在ORF内没有突变)时，对重组质粒进行处理用于进一步研究。
实例18
表达TMEM25_P5和TMEM25_P5_FLAG蛋白的稳定库的产生
将TMEM25_T0_P5(SEQ ID NO：130)和TMEM25_T0_P5_FLAG(SEQ ID NO：126)pIRESpuro3构建体或pIRESpuro3空载体如下稳定转染进HEK-293T细胞：
将HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞在适合组织培养的无菌6孔板上涂板，使用：2ml预加温的完全培养基，DMEM[Dulbecco′s modified Eagle′s Media(杜尔贝科改良的伊戈尔培养基)，生物工业公司(Biological Industries)(Beit Ha′Emek，以色列，目录号：01-055-1A)]+10％FBS[胎牛血清，生物工业公司(Biological Industries)(Beit Ha′Emek，以色列，目录号：04-001-1A)]+4mM L-谷氨酰胺(生物工业公司(BiologicalIndustries)(Beit Ha′Emek，以色列)，目录号：03-020-1A)。使用被稀释成94ul DMEM的6μl的FuGENE 6试剂(Roche(罗氏公司)，目录号：11-814-443-001)将每孔350,000个细胞用2μg的DNA构建体进行转染。将该混合物在室温下孵育15分钟。将该复杂混合物滴加至这些细胞中并且旋流。将细胞放置于维持在37℃、具有5％的CO2含量的培养箱中。转染之后48小时，将转染细胞转移至包含15ml的选择培养基(补充有5μg\ml嘌罗霉素(Sigma，目录号P8833)的完全培养基)的75cm2的组织培养烧瓶中。将细胞放置于培养箱中，并且每3-4天改变培养基，直到观察到克隆形成。
当足够数量的细胞通过选择时，收获了3-5百万细胞。将细胞在4℃下，在补充有蛋白酶抑制剂(Roche(罗氏公司)，目录号：11873580001)的300μl RIPA缓冲剂(50mM TrisHC1 pH 8，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)中进行裂解。在4℃下、在14,000x rpm下离心10分钟之后，将澄清的上清液转移至干净的试管中，并且用于WB步骤：将30μg的溶解产物与DTT 1，4-二硫苏糖醇(DTT；一种还原剂)混合至终浓度为100mM。
此外，将样品在100℃下孵育10分钟，随后在14,000x rpm下自旋1分钟。根据制造商的说明，当将30μl的样品上样进4-12％Bis-Tris凝胶(Bis-Trisgel)(英杰公司(Invitrogen)，目录号：NP0321)中的每条泳道时，进行SDS-PAGE(莱米理(Laemmli)，英国，《自然》(Nature)1970；227；680-685)，并且使凝胶在1x MES SDS电泳缓冲液(英杰公司(Invitrogen)，目录号：NP0060)中跑胶，使用XCell SureLockTM Mini-Cell(英杰公司(Invitrogen)，目录号：E10001)。根据制造商的说明，使用XCellTM II印迹装置(CellTM II blotting apparatus)(英杰公司(Invitrogen)，目录号E19051)将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜(Schleicher公司和Schuell公司，目录号：401385)。
对包含印迹蛋白的膜进行处理，用于如下的抗体检测：
将膜的非特异区通过在室温下、在补充有0.05％吐温-20(PBST)的稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5％脱脂乳中孵育1小时进行封闭(所有随后的孵育均在室温下发生，持续1小时)。然后将封闭液替换为以1∶500稀释于5％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，目录号：A4503)(稀释于PBS中)中的第一兔抗TMEM25抗体(Cat no.HPA012163，Sigma)。1小时孵育之后，三个5分钟的洗涤，应用第二抗体：以1∶20,000稀释于封闭液中的与过氧化物酶偶联的亲和纯化山羊抗兔IgG偶联的山羊抗兔(goat anti-rabbit conjugated to Peroxidaseconjugated Affipure Goat anti Rabbit IgG)(Jackson(杰克逊公司)，目录号：111-035-00)。还通过以1∶1000稀释于封闭液中的小鼠抗Flag M2-过氧化酶(Sigma，目录号：A8592)对蛋白进行检测。1小时孵育之后，3x5分钟洗涤，应用ECL底物(PIERCE，目录号：PIR-34080)1分钟，随后是向X-射线胶片(Fuji，目录号：100NIF)的暴露。结果呈现于图23中。
图23A证明上述兔抗TMEM25_P5特异性识别处于预期带大小约40.2kDa的TMEM25_P5蛋白(SEQ ID NO：7)和TMEM25_P5_Flag(SEQ ID NO：129)，而非HEK_293T_pRp3。
图23B证明处于预期带大小约40.2kDa的TMEM25_P5_Flag蛋白(SEQ ID NO：129)被抗-Flag特异性识别。
实例19
通过免疫荧光法对异位TMEM25_P5和TMEM25_P5_FLAG在HEK293T细胞中的亚细胞定位的确定
使用共聚焦显微镜，在如上所述的稳定转染中观察到TMEM25_P5(SEQ ID NO：7)和TMEM25_P5_FLAG(SEQ ID NO：129)的蛋白定位。
将表达TMEM25_P5(SEQ ID NO：7)和TMEM25_P5_FLAG(SEQ ID NO：129)的稳定转染的重组HEK293T细胞涂板在被聚-L-赖氨酸(Sigma，目录号P4832)预包衣的盖玻片上。24小时之后，对这些细胞进行处理用于免疫染色并且通过共聚焦显微镜进行分析。
将该盖玻片在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行洗涤，然后使用3.7％多聚甲醛(PFA)(Sigma公司，目录号：P-6148)/3％葡萄糖(Sigma公司，目录号：G5767)的溶液(稀释于PBS中)固定15分钟。通过在3mM甘氨酸(Sigma公司，目录号：G7126)(稀释于PBS中)中的5分钟孵育进行PFA的淬灭。在两个PBS中的5分钟的洗涤之后，使用5％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma公司，目录号：A4503)(稀释于PBS中)对非特异区进行封闭，持续20分钟。
然后将盖玻片与抗体在湿热试验箱(humid chamber)中孵育1小时，使用以1∶200稀释于PBS中的5％BSA中的小鼠抗FLAG-Cy3抗体(Sigma公司，目录号：A9594)，或者使用以1∶50稀释于PBS中的5％BSA中的兔抗TMEM25(Cat no.HPA012163，Sigma公司)，随后是在PBS中的三个5分钟的洗涤。仅对于抗TMEM25 Ab而言，需要第二Ab：以1∶200稀释于PBS中的5％BSA中的驴抗兔cy3(cat#711-165-152，Jackson(杰克逊公司))，在湿热试验箱(humidchamber)中孵育1小时，随后是在PBS中的三个5分钟的洗涤。在使用双苯酰亚胺H 33258(BISBENZIMIDE H 33258)(HBSS)(Sigma，目录号：14530)的预洗涤之后，将盖玻片用以1∶200稀释于HBSS中的WGA-Alexa 488(英杰公司(Invitrogen)，目录号W11261)孵育10min，随后是在HBSS中的两次洗涤以及在以1∶1000稀释于HBSS中的H 33258(BISBENZIMIDE H33258)(HBSS)(Sigma，目录号：14530)中的孵育。然后将盖玻片安装在具有Gel Mount水性介质(Gel Mount Aqueous medium)(Sigma公司，目录号：G0918)的载玻片上并且使用共聚焦显微镜针对荧光产物的存在对细胞进行观察。
使用抗TMEM25 Ab的TMEM25_P5(SEQ ID NO：132)和TMEM25_P5_Flag(SEQ ID NO：129)的亚细胞定位分别展示于图24A和24B中。图24C展示了使用抗-FLAG Ab(Sigma公司，目录号：A9594)的TMEM25_P5_Flag(SEQ ID NO：129)定位。TMEM25_P5蛋白被定位至细胞表面。
实例20
通过FACS来确定TMEM25_P5_Flag的细胞定位
在上述稳定转染中观察到TMEM25_P5_Flag蛋白(SEQ ID NO：129)的膜定位，通过使用抗TMEM25抗体(Abl628，Yomics)的流式血细胞计数分析并且通过正常小鼠血清作为阴性对照(015-000-120，Jackson(杰克逊公司))。将表达TMEM25_P5_Flag的重组HEK293T细胞使用抗TMEM25抗体(A)或通过正常小鼠血清(B)进行染色，随后是驴抗小鼠-DyLight 549偶联第二Ab(Donkey Anti Mouse-DyLight 549 conjugated secondary Ab)(Jackson(杰克逊公司)，715-506-150)，并且针对荧光信号的存在对其进行观察。
使用基于PBS的无酶细胞解离缓冲剂(Cell dissociation buffer Enzyme-FreePBS-Based)(Gibco公司；13151-014)将重组HEK293T-TMEM25_P5_Flag细胞从该平板上解离，在FACS缓冲剂[杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco′s Phosphate BufferedSaline)(PBS)(生物工业公司(Biological Industries)，02*023-1A)/1％牛白蛋白(Sigma，A7030)]中洗涤并且计数。将0.5×10^6细胞重悬浮于处于1∶2250ul稀释度的100μl的抗体溶液中，并且在冰上孵育1小时。将这些细胞用冰冷的FACS缓冲剂进行洗涤并且使用如所表明的第二抗体在冰上孵育1小时。将这些细胞用冰冷的FACS缓冲剂进行洗涤并且重悬浮于500μl的FACS缓冲剂中，然后在FACS设备(FACSCalibur，BD)上进行分析。使用Cellquest Pro VER.5.2获得数据并且对其进行分析。
呈现于图25中的结果证明与用作阴性对照的小鼠血清(B)相比较，抗TMEM25抗体(A)与表达TMEM25_P5_Flag蛋白的HEK293T重组细胞中的全长TMEM25蛋白结合，这指示了TMEM25蛋白的膜定位。
实例21
内源TMEM25蛋白在不同细胞系中的表达的分析
内源TMEM25蛋白在不同细胞系中的表达通过蛋白印迹法如下所述进行分析。
如上所述制备JURKAT(ATCC号TIB-152)、Daudi(ATCC号CCL-213)、RPMI8226(ATCC号CCL-155)、G-361(ATCC号CRL-1424)、KARPAS(ATCC号VR-702)的细胞提取物(图26中的泳道3-7-对于相对应的泳道/材料排布参见附图说明)。
全细胞溶解产物如上所述进行制备并且通过蛋白印迹进行分析。如上所述，通过SDS-PAGE分析相等蛋白量并且将其转移至硝酸纤维素膜。
将膜通过在室温下、在补充有0.05％吐温-20(PBST)的稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5％脱脂乳中孵育1小时进行封闭(所有随后的孵育均在室温下发生，持续1小时)。然后将封闭液替换为以1∶500稀释于5％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，目录号：A4503)(稀释于PBS中)中的第一兔抗TMEM25抗体(Cat no.HPA012163，Sigma公司)。1小时孵育之后，三个5分钟的洗涤，应用第二抗体：以1∶20,000稀释于封闭液中的与过氧化物酶偶联的亲和纯化山羊抗兔IgG偶联的山羊抗兔(goat anti-rabbit conjugated to Peroxidaseconjugated Affipure Goat anti Rabbit IgG)(Jackson(杰克逊公司)，目录号：111-035-00)还通过以1∶1000稀释于封闭液中的小鼠抗Flag M2-过氧化酶(Sigma，目录号：A8592)对蛋白进行检测。1小时孵育之后，3x5分钟洗涤，应用ECL底物(PIERCE，目录号：PIR-34080)1分钟，随后是向X-射线胶片(Fuji，目录号：100NIF)的暴露。
图26展示了在不同细胞系中的TMEM25的内源表达。用RPMI8226(泳道5)、Daudi(泳道6)以及JURKAT(泳道7)的提取物中的抗TMEM25抗体检测到了如对应于表达TMEM25_P5_Flag(泳道2；泳道1示出了没有Flag的对照)的HEK293T细胞中观察到的TMEM25的40.2kDa的蛋白。
实例22
具有siRNA的稳定HEK293T_TMEM25向TMEM25的转染
在前述使用TMEM25_P5-SiRNA转染中，在稳定表达TMEM25_P5_Flag(SEQ ID NO：129)的HEK293T细胞中观察到了TMEM25_P5_Flag蛋白(SEQ ID NO：129)的特异性敲减。
购自Dharmacon公司的siRNA如下：TMEM25(L-018183-00-0005，Dharmacon公司，在TARGET加SMART库上，人类TMEM25(84866)，5nmol)以及作为阴性对照的乱序SiRNA(scrambled SiRNA)(Dharmacon公司，D-001810-10-05)。
在转染之前24hr，将细胞以50％-70％的细胞汇合(confluence)进行涂板。将250pmol的siRNA复合体添加至250ul的还原血清Opti-MEM(cat 31985，GIBCO)中。并行地，将脂质体2000试剂(cat＃11668019，英杰公司(Invitrogen))进行混合；将5ul添加至250ul的还原血清Opti-MEM(cat 31985，GIBCO)中。将试管合并并且在RT下孵育15-30min用于足够的复合体形成；然后将该材料分布于细胞之上并且孵育48hr。收获细胞并且如上所述制备细胞溶解产物并且通过抗TMEM25(Cat no.HPA012163，Sigma)，随后是偶联至过氧化酶的第二驴抗兔进行检测。
图27示范了使用抗TMEM25抗体(Sigma，cat#HPA012163)，与稳定表达TMEM25_P5_FLAG、被Scrambled-SiRNA(条带1)(Dharmacon，D-001810-10-05)转染的HEK293T细胞相比，在稳定表达TMEM25_P5_Flag(SEQ ID NO：129)、被TMEM25_P5 siRNA(L-018183-00-0005，Dharmacon)(条带2)转染的HEK293T细胞中TMEM25_P5_Flag蛋白(SEQ ID NO：129)的特异性敲减。
实例23
使用抗LSR和抗TMEM25多克隆抗体的免疫组织化学法(IHC)
为了评估组织结合特征曲线，将抗-LSR(Abeam，目录号：ab59646)和抗-TMEM25(Cat no.HPA012163，Sigma公司)应用于肿瘤组织微阵列(TMA)的面板上，如表10中详细说明的。
将表达LSR_P5a_Flag_m(SEQ ID NO：144)或TMEM25_P5_Flag(SEQ ID NO：129)的HEK-293细胞用作用于染色的pAb的校准的阳性对照。将被空载体转染的HEK293T细胞连同兔血清IgG抗体用作阴性对照。
通过抗体抗-LSR和相应地抗TMEM25的LSR_P5a_Flag_m(SEQ ID NO：144)或TMEM25_P5_Flag(SEQ ID NO：129)的免疫组织化学检测是在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)切片中进行校准的。使用两种抗原检索方法：pH 6.1和pH 9.0，处于三个Ab浓度(3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml)。
抗原检索方法如下进行。将上述FFPE切片脱石蜡，进行抗原检索并且再水化，使用pH 6.1或pH 9.0 Flex+三合一(3-in-l)抗原检索缓冲剂以及PT Link自动化抗原检索系统，在95℃下伴随自动加热和冷却持续20min。
抗原检索之后，将切片在蒸馏水中洗涤2x5min，然后将其装载进DAKO自动染色机Plus(DAKO Autostainer Plus)中。然后将切片使用Flex+过氧化酶封闭剂孵育10min，在50mM Tris.HCl、300mM NaCl、0.1％吐温-20、pH 7.6(TBST)中漂洗两次，随后使用蛋白封闭剂(DAKO X0909)孵育10min。
将切片用稀释于DAKO Envision Flex抗体稀释剂(DAKO Cytomation，Cat#K8006)中的第一抗体孵育30min。使用第一抗体孵育之后，然后将切片在FLEX缓冲剂中漂洗两次，用抗-小鼠/兔Flex+HRP孵育20min，在FLEX缓冲剂中漂洗两次并且然后用二氨基联苯胺(DAB)底物孵育10min。显色反应通过使用蒸馏水漂洗载玻片来停止。
色素形成之后，将切片使用苏木精复染色，在递增系列的乙醇(90％-99％-100％)中脱水，在三次变化的二甲苯中清洗并且在DePeX下封片。使用具有Leica DFC290照相机的Olympus BX51显微镜对染色的切片进行分析。
图28展示了在pH 9，与阴性对照细胞系(面板B、D以及F)相比，在阳性对照细胞系的切片中分别处于剂量依赖性浓度3ug/ml、1ug/ml和0.3ug/ml的抗LSR抗体(Catno.ab59646，Abeam)(面板A、C以及E)示出了特异免疫反应性，根据前述抗原检索方法。
图29展示了在pH 9，与阴性对照细胞系(面板B、D以及F)相比，在阳性对照细胞系的切片中分别处于剂量依赖性浓度3ug/ml、1ug/ml和0.3ug/ml的抗TMEM25(Catno.HPA012163，Sigma)(面板A、C以及E)示出了特异免疫反应性，根据前述抗原检索方法。
表10：包括于组织微阵列(TMA)中的组织样品的总结。
实例24
编码LY6G6F转录本的全长确认
编码LY6G6F(SEQ ID NO：1)的全长转录本如下所述进行确认：
1.逆转录反应如下进行：将10μg的纯化RNA(肺正常)与150ng的随机六聚体引物(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，CA，USA，目录号：48190-011)和500μM的dNTPs混合，总体积为156μl。将该混合物在65℃下孵育5min，并且然后迅速在冰上进行冷冻。此后，添加50μl的5X SuperscriptII第一条链缓冲剂(SuperscriptII first strand buffer)(英杰公司(Invitrogen)，目录号：18064-014，料号：Y00146)、24μl 0.1M DTT以及400单位的RNA酶抑制剂(RNasin)(Promega(普洛麦格公司)，密尔沃基，WS，美国，目录号：N2511)，并且将该混合物在25℃下孵育10min，随后在42℃下进一步孵育2min。然后，添加10μl(2000单位)的SuperscriptII(英杰公司(Invitrogen)，目录号：18064-014)，并且将该反应(终体积为250μl)在42℃下进一步孵育50min，并且然后在70℃下灭活15min。将生成的cDNA以1∶20稀释于TE缓冲剂(10mM Tris，1mM EDTA pH 8)中
2.在以下条件下使用2x GoTaq ReadyMix(Promega(普洛麦格公司)，目录号：M7122.)进行PCR：12.5ul的GoTaq ready mix；来自上面的5ul cDNA；1ul的10uM正向引物100-690(SEQ ID NO：51)；：1ul的10uM反向引物100-691(SEQ ID NO：52)以及5.5ul的H20，总反应体积为25μl；反应程序为：5分钟，95℃；35个循环：30秒钟、94℃，30秒钟、53℃，50秒钟、72℃；然后是10分钟，72℃。关于引物的细节呈现于下面的表11中。
将上面的PCR产物上样在经溴化乙锭染色的1.2％的琼脂糖凝胶上，在100V下、在1x TAE溶液中电泳，并且使用UV光进行可视化。将预期大小的带使用QiaQuickTM GelExtraction kit(QiaQuickTM凝胶提取试剂盒)(Qiagene公司，目录号：28707)从该凝胶切除并且提取。然后使用上面的引物对纯化的DNA进行测序(特拉维夫大学(Tel-AvivUniversity)，以色列)并且针对全长LY6G6F编码转录本(SEQ ID NO：1)进行检验。
实例25
编码融合至EGFP的LY6G6F的全长转录本的克隆
编码融合至EGFP(增强型绿色荧光蛋白)的LY6G6F的全长转录本的克隆如下所述进行。
首先，构建一个EGFP表达载体，并且然后对编码SEQ ID NO：58中所阐明的氨基酸序列的LY6G6F开放读码框(SEQ ID NO：57)进行克隆。将EGFP如下亚克隆进pIRESpuro3(Clontech公司，目录号：631619)：EGFP-N1载体(Clontech公司，目录号：6085-1)用NheI和NotI进行消化以切除EGFP基因。为了获得EGFP-pIRESpuro3载体，然后将EGFP插入片段连接至预先使用相同酶消化的pIRESpuro3(Clontech公司，目录号：631619)中。
在以下条件下使用Platinum PFXTM(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，CA，USA，目录号：1178-021)进行PCR：5μl的Platinum PFX 10x缓冲剂；2μl-来自上面纯化的经确认的DNA；1μl-10mM dNTPs(每种核苷酸为2.5mM)；1μl-Platinum PFX酶；37μl-H2O；1μl的10uM正向引物100-729(SEQ ID NO：53)；1ul的10uM反向引物100-730(SEQ ID NO：54)(每个10uM)，总反应体积为50μl；反应程序为：5分钟，95℃；35个循环：30秒钟、94℃，30秒钟、55℃，60秒钟、68℃；然后是10分钟、68℃。使用的引物包括对应于该蛋白的所希望的坐标的基因特异性序列以及限制性内切酶位点和Kozak序列，如列举于下表11中和图6中。表11中的粗体字母表示基因特异性序列，而用于克隆目标的限制酶切位点扩展是斜体的，并且Kozak序列是加下划线的。
将上面的5ul PCR产物上样在经溴化乙锭染色的1.2％的琼脂糖凝胶上，在100V下、在1x TAE溶液中电泳，并且使用UV光进行可视化。在验证预期大小的带之后，使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR purification kit)(QiagenTM，巴伦西亚，CA，U.S.A.，目录号28106)对剩余的PCR产物进行处理，用于DNA纯化。将提取的PCR产物用NheI和BamHI限制性内切酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，贝弗利，MA，U.S.A.)进行消化，如表11中所列举。消化之后，将DNA上样在如上所述的1.2％的琼脂糖凝胶上。将预期大小的带使用QiaQuickTM Gel Extraction kit(QiaQuickTM凝胶提取试剂盒)(Qiagene公司，目录号：28707)从该凝胶切除并且提取。
使用LigaFastTM Rapid DNA连接体系(LigaFastTM Rapid DNA LigationSystem)(Promega(普洛麦格公司)，目录号：M8221)，将消化的DNA连接至预先使用NheI和EcoRI限制性内切酶消化的EGFP_PIRESpuro3载体。将产生的DNA根据制造商的说明转化进感受态E.Coli细菌DH5α(RBC Bioscience(RBC生物科学公司)，台北，台湾，目录号：RH816)中，然后在用于重组质粒的选择的琼脂平板上进行涂板，并且在37℃下孵育过夜。
使用GoTaq Ready Mix(Promega(普洛麦格公司)，目录号：M7122)，通过PCR进行阳极克隆的筛选。使阳极克隆生长于补充有100μg/ml的氨比西林的5ml的极品肉汤(TerrificBroth)中，在37℃下振荡过夜。使用QiaprepTM Spin小量制备试剂盒(QiaprepTM SpinMiniprep Kit)(Qiagene公司，目录号：27106)将质粒DNA从细菌培养物中分离。通过对插入片段进行测序检验精确克隆(特拉维夫大学，以色列)。当检验出无错误的菌落(即，在ORF内没有突变)时，对重组质粒进行处理用于进一步分析。
融合至EGFP的生成的LY6G6F的全长DNA序列(SEQ ID NO：55)示于图7中。在图7中，对应于LY6G6F全长序列的基因特异性序列以粗体字型标记，而EGFP序列以斜体和下划线标记。融合至EGFP的生成的LY6G6F的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：56)示于图8中；对应于LY6G6F的全长序列的基因特异性序列以粗体字型标记，而EGFP序列以斜体和下划线标记。
表11：引物细节
实例26
LY6G6F的细胞定位的确定
为了确定LY6G6F蛋白的细胞定位，使用LY6G6F-EGFP融合蛋白(SEQ ID NO：56)。使用共聚焦显微镜在瞬时转染中观察到LY6G6F蛋白定位(陈(Chen)等人，《分子视觉》(Molecular vision)2002；8；372-388)。转染之后48小时，针对荧光产物的存在对这些细胞进行观察。
将上述LY6G6F-EGFP pIRESpuro3构建体如下瞬时转染进HEK-293T细胞：
使用2ml的预加温DMEM[Dulbecco′s modified Eagle′s Media(杜尔贝科改良的伊戈尔培养基)，生物工业公司(Biological Industries)(Beit Ha′Emek，以色列)，目录号：01-055-1A]+10％FBS(胎牛血清)+4mM L-谷氨酰胺，将HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞涂板于13mm直径的无菌玻璃盖玻片(马林费尔德公司(Marienfeld)，目录号：01 115 30)上，将盖玻片放置于6孔板上。使用被稀释成94ul DMEM的6μl的FuGENE 6试剂(Roche(罗氏公司)，目录号：11-814-443-001)将每孔500,000个细胞用2μg的DNA构建体进行转染。将该混合物在室温下孵育15分钟。将该复杂混合物滴加至这些细胞中并且旋流。将细胞放置于维持在37℃、具有5％的CO2含量的培养箱中。
瞬时转染后48小时，对这些细胞进行进一步处理，用于在共聚焦显微镜中的分析。将盖玻片在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤3次，并且使用3.7％多聚甲醛(Sigma，目录号：P-6148)固定15分钟。在PBS中的2次洗涤之后，使用封固溶液(Sigma，目录号：G0918)将固定的盖玻片胶合至载玻片，并且使用共聚焦显微镜针对荧光产物的存在对这些细胞进行观察。结果呈现于图9A和9B中。
图9A和9B证明在HEK 293T细胞中表达时，LY6G6F_EGFP(SEQ ID NO：56)融合蛋白定位至细胞膜。这个图像是使用共聚焦显微镜的40x物镜获得的。
实例27
LY6G6F、VSIG10、TMEM25以及LSR ECD-小鼠IGg2A-FC融合蛋白的克隆和表达
使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件(使用默认参数)对人类LY6G6F、VSIG10、TMEM25、以及LSR蛋白的小鼠直向同源物进行鉴定，并且用于获得与LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR Ig融合蛋白在动物模型中的功能性相关的概念的实验证据。对应于人类LY6G6F、VSIG10、TMEM25以及LSR蛋白的小鼠直向同源物分别示出于SEQ ID NO：20、19、9以及21中。人类LY6G6F、VSIG10、LSR以及TMEM25蛋白与对应的小鼠直向同源物的氨基酸比对和比较分别示于图5A、5B、5C以及5D中。
将每个小鼠TMEM25(SEQ ID NO：9)、LY6G6F(SEQ ID NO：20)、VSIG10(SEQ ID NO：19)、以及LSR(SEQ ID NO：21)蛋白的cDNA序列融合至小鼠IgG2aFc(SEQ ID NO：27)的Fc结构域。在所有情况下，针对每个ECD，使用天然对应的信号肽。生成的LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD-mIgG2aFc Ig融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25、或26)分别示出于图10A-D中。
将LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD-mIgG2aFc融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25、或26)克隆进逆转录载体(retrovector)，随后是逆转录载体转导进Catalent′s“自体”(in-house)CHO-S细胞系。产生合并的(pooled)群体并且确认繁殖力。然后将该库进行扩大并且确定该库的相对繁殖力和相对拷贝数。通过Catalent′s Fc ELISA测定分析细胞培养物上清液以确认LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD-mIgG2aFc融合蛋白的生产。
针对生物负载(bioburden)和内毒素对蛋白溶液进行测试。由融合至人类IgG1的LY6G6F、VSIG10、TMEM25亦或LSR ECD的人类ECD组成的人类融合蛋白(如描绘于图11)也使用类似体系进行了表达。LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD-Ig融合蛋白对小鼠和人类T细 胞体外活化的作用的评估：
实例28：
LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD-IG融合蛋白对DO 11.10原始CD4+T细胞通过OVA肽的活化的作用
从五只DO11.10小鼠(Jackson(杰克逊公司))的脾脏经由automax分选分离出原始CD4+T细胞：CD4-阴性分选(Miltenyi公司，Cat#130-095-248)，包括在阴性分选cocktail中的抗-CD25(Miltenyi公司，Cat#130-091-072)，随后是CD62L-阳性分选(Miltenyi公司，Cat#130-049-701)。还从一只小鼠中收集Balb/c全脾细胞，并且使用3000rads进行辐射处理，来充当DO11.10 CD4+T细胞的抗原递呈细胞(APC)。将原始CD4+T细胞与经辐射处理的APC以1∶1(APC对T细胞)的比例、以每孔5x105个细胞培养于200ul的HL-1培养基中的平底96孔板中，并且在以表明的浓度的TMEM25-ECD-Ig(SEQ ID NO：25)、LSR-ECD-Ig(SEQ ID NO：26)、LY6G6F-ECD-Ig(SEQ ID NO：23)之一的存在下，用20ug/ml或2ug/ml的OVA323-339进行活化。作为阳性对照，使用B7-H4-Ig(R和D体系)或CTA4-Ig(融合至mIgG2a Fc的小鼠ECD)。将同种型对照Ig(mIgG2a，BioXCell，Cat.#BE0085)用作阴性对照。将这些细胞使用1uCi的氚化胸苷在24小时脉冲处理，并且在72小时收获。
如图30所示，TMEM25-ECD-Ig、LSR-ECD-Ig以及LY6G6F-ECD-Ig引起T细胞活化的剂量依赖性抑制。这被展示为由20ug/ml(图30A-C，E)或2ug/ml(图30D)的OVA323-339诱导的T细胞增殖的抑制。
VSIG10-ECD-Ig融合蛋白(SEQ ID NO：24)未在以类似测定进行的三个实验中示出活性。
实例29：
LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD-IG融合蛋白对原始CD4+T细胞通过抗-CD3/抗-CD28包衣的珠粒的活化的作用
从5只SJL(Harlan公司)小鼠中经由在先前部分中所述的automax分选分离出原始CD4+T细胞。遵循制造商的方案(Dynabeads M-450Epoxy Cat.140.11，英杰公司(Invitrogen))，用抗-CD3(0.5ug/ml；克隆2C11)和抗-CD28(2ug/ml；克隆37.51eBioscience)、以及增加浓度的LSR-ECD-Ig或mIgG2a同种型对照(mIgG2a，BioXCell Cat.#BE0085)(0.1-10ug/ml)对珠粒进行包衣。用于使用LSR-ECD-Ig对珠粒进行包衣的蛋白的总量补足至10ug/ml(具有对照Ig)。将原始CD4+T细胞(0.5x106/孔)以1∶2的比例(珠粒对T细胞)用包衣的珠粒进行活化。24小时后，将这些细胞使用1uCi的氚化胸苷脉冲处理，并且在72小时后收获。
LSR-ECD-Ig(SEQ ID NO：26)显著地抑制T细胞增殖的增殖并且以剂量依赖性方式引起其作用(图31)。
示于图10和11中的TMEM25、LY6G6F以及VSIG10 ECD Ig融合蛋白以类似测定进行测试，具有类似的结果。
实例30
LY6G6F、VSIG10、TMEM25以及LSR ECD Ig融合蛋白对结合抗CDS的平板活化的小鼠CD4+T细胞的剂量反应作用，如在活化标记CD69的细胞因子产生和表达中所证明的。
根据制造商的说明，使用CD4+CD62L+T细胞分离试剂盒(CD4+CD62L+T cellisolation Kit)(Miltenyi公司，Cat#130-093-227)通过阴性选择从BALB/C小鼠的脾脏和淋巴结细胞的库中分离出Untouched CD4+CD25-T细胞。获得的纯度＞百分之95。
在1ug/ml、5ug/ml和10ug/ml的LY6G6F、VSIG10、TMEM25以及LSR ECD-Ig融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25以及26)的存在下，将组织培养96孔板使用2ug/ml的抗-CD3mAb(克隆145-2C11)在4℃下包衣过夜。为了补足每孔12μg/ml的总蛋白浓度，向每个孔中添加对照mIgG2a(来自BioXCell的克隆C1.18.4；Cat#BE0085)。将孔以每孔1x105CD4+CD25-T细胞进行涂布。刺激之后48hr，收集培养物上清液并且使用小鼠IFNγELISA试剂盒进行分析，针对活化标记CD69的表达通过流式细胞计数法对这些细胞进行分析。
与对照mIgG2a和CTLA4-Ig相比，示于图32中的结果证明LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD-Ig融合蛋白对CD4 T细胞活化的抑制作用，通过TCR刺激中减少的IFNγ分泌(图32A)和减少的CD69表达(图32B)而证明。
实例31
LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD-IG融合蛋白对CD4+T细胞体外分化的作用。
为了测试LY6G6F、VSIG10、TMEM25以及LSR Ig融合蛋白抑制CD4+T细胞分化的能力，从DO11.10小鼠中分离出原始CD4+T细胞，这些DO11.10小鼠对于特异性针对OVA323-339肽的T细胞受体(TCR)而言是转基因的。使用DO11.10 T细胞，使能够研究对同一群体的CD4+T细胞的多克隆(抗-CD3/抗-CD28 mAb)和肽特异性响应两者。从DO11.10小鼠中分离出原始CD4+T细胞，并且在抗-CD3/抗-CD28包衣的珠粒或OVA323-339肽加上经辐射处理的BALB/c脾细胞的存在下，在LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD-Ig融合蛋白、对照Ig、或B7-H4 Ig的存在下，在培养中活化。将这些细胞在如下Th驱动条件的存在下进行活化：Th0细胞(IL-2)、Th1细胞(IL-2+IL-12)、Th2细胞(IL-2+IL-4)、或Th17细胞(TGF-β+IL-6+IL-23+抗-IL-2)。对T细胞分化以及Th-特异性响应的作用通过测量细胞增殖以及亚型特异性细胞因子的产生进行评估：IL-4、IL-5、IL-10、IL-17、IFN-γ。
实例32
LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD IG融合蛋白对人类T细胞活化的作用的评估。
LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD Ig融合蛋白对人类T细胞应答的作用是使用纯化的人类T细胞通过两个不同的体外测定来测试的。在第一个测定中，人类T细胞由抗-CD3以及抗-CD28包衣的珠粒来活化，并且在另一个测定中，活化使用抗-CD3以及抗-CD28抗体在存在自体、经辐射处理的PBMC下来进行。通过测量细胞增殖和细胞因子释放来评估LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD Ig融合蛋白对人类T细胞活化的调节活性。
研究I-人类T细胞通过抗-CD3以及抗-CD28-包衣的珠粒的活化被融合蛋白抑制
从4名健康人类供体分离出原始CD4+T细胞并且在对照mIgG2a、或任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD Ig融合蛋白的存在下，用抗-CD3 mAb/抗-CD28 mAb包衣的珠粒对其进行活化。建立两个并列培养物组；一种培养物用氚化胸苷在24小时脉冲处理并且在72小时时收获，同时第二板在96小时时收获，用于经由LiquiChip的细胞因子产生。
研究II-人类T细胞通过经辐射处理的自体PBMC的活化被融合蛋白抑制
总PBMC使用菲柯尔(ficoll)梯度从健康人类供体的新鲜血液中分离。将10x106总PBMC重悬浮于Ex-Vivo 20培养基中，并且在3000rad下辐射处理。这些细胞被用来通过呈递抗-CD3、抗-CD28或任一测试蛋白来在体外活化分离的T细胞。PBMC的余量经由使用来自Miltenyi的CD4+T细胞分离试剂盒II(CD4+T cell Isolation Kit II)而用于T细胞分离。
用于活化，在5x105的自体、经辐射处理的PBMC的存在下，将5x105分离的T细胞进行培养。将抗-CD3(0.5μg/ml)、抗-CD28(2μg/ml)以及LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD Ig融合蛋白亦或对照Ig(mIgG2a)以可溶态添加。培养物使用1uCi的氚化胸苷在24小时脉冲处理，并且在72小时处测量增殖。
实例33
在APC-样细胞中的异位表达中，LY6G6F、TMEM25以及LSR蛋白对人类T细胞应答的作用
LY6G6F、TMEM25以及LSR对人类T细胞应答的作用是按照其在‘T细胞刺激物’细胞中的异位表达而评估的：一种鼠科动物胸腺瘤细胞系，Bw5147，这些‘T细胞刺激物’细胞被工程化以表达可以触发人类T细胞上的TCR-复合体的膜结合抗人类CD3抗体片段(与或不与假定的共刺激配体或共抑制配体共表达)。
基因合成(gene-synthesize)编码LY6G6F(SEQ ID NO：1)、TMEM25(SEQ ID NO：7)以及LSR(SEQ ID NO：11)的密码子优化的cDNA，并且经由Sfi-I位点将其定向克隆进逆转录病毒载体pCJK2中。产生单顺反子表达构建体。通过琼脂糖凝胶电泳对构建体进行确认，并且被表达于展示出高水平的膜结合抗-CD3抗体(Bw-3/2)的Bw5147细胞中(莱特纳(Leitner)等人，2010)。被“空”载体(pCJK2)转导的Bw5147细胞用作阴性对照。另外，表达共刺激分子(ICOSL和CD70)的Bw-3/2细胞和表达共抑制分子(B7-H3和B7-H1/PD-L1)的Bw-3/2-细胞也被用作对照。使用DyLight-649抗-小鼠IgG(H+L)抗体通过FACS对刺激膜结合(stimulating membrane-bound)抗-CD3抗体的均匀高表达进行确认，DyLight-649抗-小鼠IgG(H+L)抗体与刺激细胞表达的鼠科动物单链抗体反应。通过qPCR对对应的刺激细胞中的单顺反子构建体的表达的存在和高水平转录进行确认。
从来源于健康志愿者供体的血沉棕黄层或肝素化血液中纯化T细胞，并且使用Ficoll-Paque(GE-Healthcare(GE-医疗集团))通过标准密度离心获得单核部分。通过CD11b、CD14、CD16、CD19、CD33以及带II类MHC的细胞(MHC-class II-bearing cell)的MACS-耗尽来获得Untouched bulk人类T细胞，上述细胞具有与顺磁性链霉亲和素珠粒结合的对应的生物素化的mAb(莱特纳(Leitner)等人，2009)。通过向该库中添加生物素化的CD4和CD8 mAb获得纯化的CD8 T细胞和CD4 T细胞。使用原始CD4+T细胞分离试剂盒II(NaiveCD4+T cell Isolation Kit II)来分离原始CD4+T细胞。分离之后，针对纯度通过FACS对细胞进行分析，并且具有足够纯度(＞90％)的样品用于实验。
收获刺激细胞，计数、辐射处理(2x3000rad)并且接种于平底96孔板中(20,000细胞/孔)。将液氮储存的MACS-纯化的T细胞解冻，计数并且以每孔100,000细胞添加至孔中；总体积为200μl/孔。为每种条件建立一式三个的孔。48小时的共培养之后，向这些孔中添加3H-胸苷(终浓度为0.025mCi；PerkinElmer/NewEngland Nuclear Corporation(珀金埃尔默/新英格兰核工业集团公司)，韦尔斯利，马萨诸塞州)。进一步培养18小时之后，将这些平板收获于滤板上并且如菲斯特沙摩尔(Pfistershammer)等人，2004中所述确定3H-胸苷的结合。此外，进行一系列MACS-纯化的T细胞亚群(CD8 T细胞、CD4 T细胞、以及原始CD45RA-p阳性CD4 T细胞)的实验。在所有实验中的额外的对照包括具有单独的刺激细胞的孔，用于微观地评估细胞并且还用于确定刺激细胞w/o T细胞的基础3H-胸苷的结合。辐射处理后迅速分解的刺激细胞的结果被从该分析中排除。
示于图33中的结果是若干实验的平均值，并且示出了表达LY6G6F、TMEM25或LSR的刺激细胞对人类bulk T细胞(图33A)、CD4+T细胞(图33B)、CD8+T细胞(图33C)、或原始CD4CD45RA+T细胞(图33D)的增殖的作用。对照共刺激分子(ICOSL和CD70)的表达导致所有细胞亚型的增殖的一贯的并且显著的刺激。类似于对照共抑制分子(B7-H3和B7-H1/PD-L1)的表达(导致不同T细胞亚型的增殖的温和抑制)，LY6G6F、TMEM25以及LSR的表达也导致T细胞增殖的温和抑制，在CD8+T细胞上展示出了最显著的抑制作用。
实例34
通过确定其与免疫细胞的结合特征曲线来对LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的靶细胞进行表征
在OVA323-339肽的存在下，活化来自DO11.10小鼠(其中所有的CD4+T细胞表达特异性针对OVA323-339肽的T细胞受体的转基因小鼠)的脾细胞，并且在最初活化后的t＝0、6、12、24、以及48小时时收集细胞，以确定随着时间哪种细胞类型正在表达LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的受体。然后针对CD3、CD4、CD8、B220、CD19、CD11b、以及CD11c对细胞进行共染色。
实例35
LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD IG融合蛋白对B细胞类别转换以及分泌抗体的能力的作用评估
从未接触抗原的C57BL/6小鼠中分离出休眠的B细胞，并且在抗-CD40加(i)无外源细胞因子、(ii)IL-4、或(iii)IFN-γ的存在下对其进行体外活化。在培养系建立的时候，细胞培养接受对照Ig(mIgG2a)，抗-CD86 mAb(作为增加的Ig产生的阳性对照)，或在此实例5中描述的任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25以及LSR ECD融合蛋白，并且培养5天。每个LY6G6F、VSIG10、TMEM25以及LSR ECD融合蛋白以三个浓度进行测试。在培养结束时，经由ELISA测试上清液中IgM、IgG1以及IgG2a的存在。如果B细胞对于一种同种型抗体相对于另一种抗体进行类别转换的能力似乎发生改变，则经由ELISPOT来确定发生类别转换的B细胞的数量。如果抗体产生细胞的数量发生改变，则还确定IgG1和IgG2a的γ1-以及γ2a-无菌转录物相对于成熟转录物的水平是否发生改变。
Ly6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD Ig融合蛋白对自体免疫性疾病的治疗的治疗效果的评估
实例36：
LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD IG融合蛋白在患有多发性硬化症的小鼠R-EAE模型中的疗效
TMEM25-ECD-Ig、LSR-ECD-Ig以及VSIG10-ECD-Ig融合蛋白(分别是SEQ ID NO：25、26以及24)用于治疗自体免疫性疾病的治疗效果是在患有多发性硬化症；复发缓解型实验性自体免疫性脑脊髓炎(R-EAE)的小鼠模型中测试的：
6周龄的雌性SJL小鼠购自Harlan并且在开始实验之前保持在CCM机构1周。小鼠随机地分配成每组10只动物的组并且在第0天用50μg PLP139-151/CFA致敏。接受100ug/剂量的TMEM25-ECD-Ig(SEQ ID NO：25)、LSR-ECD-Ig(SEQ ID NO：26)、mIgG2a同种型对照、或CTLA4-Ig(融合至小鼠IgG2a Fc的小鼠ECD)的6次i.p.(腹腔注射)的小鼠作为阳性对照。在疾病缓解开始的时候开始治疗，并且每周给予3次，持续2周。小鼠服从疾病症状。在第35天，(在疾病复发的高峰期间)，经由向一只耳朵中注射10μg的PLP139-151并且向另一只耳朵中注射PLP178-191，测定每组中的5只小鼠的DTH(延迟型超敏)反应，该DTH(延迟型超敏)反应针对诱导表位(PLP139-151)的疾病以及针对复发相关髓磷脂表位(PLP178-191)。激发后24小时测定耳朵肿胀水平。
本实例示出在一个每周3次、100ug/剂量的治疗模型中，当用TMEM25-ECD-Ig(SEQID NO：25)或(SEQ ID NO：26)治疗时，R-EAE-诱导的小鼠的疾病严重性的显著减少，如示图于34A中。抑制水平类似于CTLA4-Ig的抑制水平。
此外，在第35天，用TMEM25-ECD-Ig(SEQ ID NO：25)或(SEQ ID NO：26)治疗的R-EAE小鼠显著地抑制DTH反应，该DTH反应针对诱导表位(PLP139-151)的疾病以及针对复发相关髓磷脂表位(PLP178-191)(图34B)。
为了测试在PLP-诱导的R-EAE模型中TMEM25-ECD-Ig(SEQ ID NO：25)的疗效的剂量依赖性及其作用模式，如上所述诱导疾病并且以100、30或10ug/剂量从疾病缓解开始对小鼠进行治疗，每周3次，持续两周。TMEM25-ECD-Ig以一种如最低测试剂量(10ug/剂量)观察到的更温和作用的示出的剂量依赖方式降低了疾病的严重性水平，这显著地不同于高剂量(100ug/剂量)的作用(图35A)。在第45天和第76天，TMEM25-ECD-Ig还抑制了对扩展表位PLP178-191和MBP84-104的DTH应答(图35B)。此外，TMEM25-ECD-Ig抑制第45天和第76天脾细胞以及第45天宫颈淋巴结细胞对PLP139-151、PLP178-191以及MBP84-104的召回应答(recall response)(图35C和35D)。这主要在增殖的抑制连同在IFNγ和IL-17释放的减少中显示。TMEM25-ECD-Ig还抑制IL-4和IL-10从30ug/剂量TMEM25-ECD-Ig处理的小鼠的宫颈淋巴结细胞中释放。在这些条件下，对IL-4和IL-10从脾细胞中的释放没有一致作用。
在R-EAE模型中TMEM25-ECD-Ig(SEQ ID NO：25)的有益作用还伴随着免疫细胞向CNS的渗透的显著减少(图35E)。尽管在CNS中测试的谱系没有显著改变，但是存在CD4+T细胞和Dc(CD11C+)的减少以及在B细胞(CD19+)群体中的一些增加的清晰趋势，尽管这没有达到统计学显著性(图35E)。
在上述PLP-诱导的R-EAE模型中还测试了VSIG10-ECD-Ig(SEQ ID NO：24)。在缓解开始的当天开始治疗，并且以100ug/剂量、3x/周给予，持续2周。VSIG10-ECD-Ig显著地降低疾病的严重性，如在疾病分数的减少上所显示的(图36A)。在这个模型中VSIG10-ECD-Ig的有益作用还伴随着第45天和第76天对扩展表位PLP178-191和MBP84-104的DTH应答的抑制(图36B)。此外，摄取第45天，VSIG10-ECD-Ig(SEQ ID NO：24)抑制脾细胞和引流(宫颈)淋巴结细胞的召回应答(recall response)，响应于通过诱导表位PLP139-151、或扩展表位PLP178-191和MBP84-104的活化(图36C和36D)。这在细胞增殖连同IFNg、IL-17、IL-4以及IL-10的分泌的抑制中显示。
有趣地，在第76天，VSIG10-ECD-Ig(SEQ ID NO：24)仅抑制MBP84-104诱导的脾细胞增殖，而不抑制由更早的髓磷脂表位诱导的增殖(图36C)。在R-EAE模型中VSIG10-ECD-Ig的治疗还显著地减少免疫细胞向CNS的渗透，这伴随着淋巴结中的细胞数目的明显可见的而非显著的升高(图36E)。在CNS中减少的主要细胞亚型是CD4+T细胞，然而，CNS中也存在CD19+B细胞和CD11c+Dcs的减少的清晰趋势。所有这些免疫细胞亚型在淋巴结中都显著升高，这提示VSIG10-ECD-Ig可能抑制免疫细胞从淋巴结向CNS的运输。
LY6G6F-ECD-Ig融合蛋白在一种患有多发性硬化症的类似模型中进行研究。
实例37：
LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD IG融合蛋白在患有类风湿关节炎的小鼠CIA模型中的疗效
研究I：在作为患有类风湿关节炎的模型的患有胶原诱导的关节炎(CIA)的小鼠模型中测试LSR-ECD-Ig(SEQ ID NO：26)。将雄性DBA/1小鼠以8-10只的组圈养，并且维持在21℃加或减2℃、12h光/暗周期下，随意给予食物和水。通过用在完全弗氏佐剂中乳化的II型胶原进行免疫来诱导关节炎。以每天为基础监测小鼠的关节炎征象。在出现关节炎(第1天)时，开始用LSR-ECD-Ig(SEQ ID NO：26)、mIgG2a同种型对照或CTLA4-Ig(融合至小鼠IgG2aFc的小鼠ECD)作为阳性对照(每种100ug/剂量)，每周给予3次，持续10天。测量后足垫肿胀(使用千分卡尺)，连同所有四肢中的关节涉及的数量和程度。产生的两个测量值(临床分数和足垫厚度)可以用于统计学评估。
在治疗期间结束时，小鼠被放血并且处死。用于组织学分析，在尸体剖验之后除去爪，固定于缓冲福尔马林(10％v/v)中，然后在缓冲福尔马林(5.5％w/v)中的EDTA中脱钙。然后将组织包埋进石蜡中，切片并且使用苏木精和伊红染色。评分系统如下：
0＝正常；1＝滑膜炎，但软骨损失以及骨侵蚀不存在或局限于离散病灶；2＝滑膜炎并且呈现显著的侵蚀，但正常的关节架构完好；3＝滑膜炎，广泛侵蚀，关节架构被破坏。
本实例示出以100ug/剂量、3次/周、持续10天来用LSR-ECD-Ig治疗患有建立的CIA的小鼠导致临床分数(图37A)以及爪肿胀(图37B)和组织学损害(图37C)的有效减少。LSR-ECD-Ig(SEQ ID NO：26)的疗效类似于用CTLA4-Ig获得的疗效。
在这个CIA模型中评估TMEM25-ECD-Ig、VSIG10-ECD-Ig以及LY6G6F-ECD-Ig的疗效。
用TMEM25-ECD-Ig(SEQ ID NO：25)或用LSR-ECD-Ig(SEQ ID NO：26)的治疗在更严重的CIA模型中没有示出疗效，在这个更严重的CIA模型中，在第21天给予具有在完全弗氏佐剂中乳化的II型胶原的一个追加剂量。在这个严重的CIA Enbrel中，以相同方案和剂量给予的阳性对照具有非常微弱的疗效。使用TMEM25-ECD-Ig的治疗在CIA模型中也没有示出治疗效果，这个CIA模型在第21天给予不具有佐剂的II型胶原追加剂量。
研究II：使用如下修饰的CIA模型，在CIA模型中研究LY6G6F ECD Ig融合蛋白的疗效：将雌性DBA/1小鼠(塔科尼克农场(Taconic Farms)，9-11周龄)驯化7天。在第0天，用鸡胶原/CFA、0.05mL EK-0210乳剂/小鼠(虎克实验室公司(Hooke Laboratories，Inc.))对小鼠进行免疫，并且在第20天，注射具有鸡胶原/IFA、0.05mL EK-0211乳剂/小鼠(虎克实验室公司(Hooke Laboratories，Inc.))的追加剂量。每天为小鼠评分并且在关节炎发作的当天将分数登记进下列治疗组之一中：
组1：LY6G6F-ECD-Ig(SEQ ID NO：23)，i.p.(腹腔注射)，Q2D，30mg/kg，持续2周，10mL/kg。
组2：媒介物(PBS)Q2D，持续2周，10mL/kg(阴性对照)。
从登记的时间开始，每隔一天根据以下评分系统针对临床征象和关节强硬为小鼠评分：
临床分数：
关节强硬分数：
爪分数 临床观察结果
0 没有关节强硬
1 轻度的关节强硬
2 中等关节强硬
3 严重的关节强硬
本实例显示从关节炎的发作开始，用30mg/kg LY6G6F-PCD-Ig Q2D、持续2周来治疗患有建立的CIA的小鼠导致疾病分数的降低证明的疾病的减轻(图38)。
在类似模型中评估VSIG10-ECD-Ig(SEQ ID NO：24)和TMEM25-ECD-Ig(SEQ ID NO：25)的疗效。
研究III：LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD-Ig融合蛋白对患有CIA的转移模型中的耐受性诱导的作用
为了进一步理解LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD-Ig融合蛋白对免疫调节的作用，对这些蛋白在转移模型中诱导耐受性的能力进行分析。
简言之，将被LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25以及26)处理10天的关节炎DBA/1小鼠的脾脏和LN细胞除去，并且将其i.p(腹腔)注射T-细胞缺乏的C.B-17SCID接受者中。然后，小鼠接受注射100μg II型胶原(没有CFA)，这是关节炎成功转移所需要的。然后在SCID小鼠中监测关节炎。进行组织学并且测量抗胶原抗体水平，以确定LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白治疗赋予长期的疾病保护。
实例38
LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD-IG融合蛋白在具有TMEV的病毒感染模型中的作用的评估
泰勒鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)是小鼠的一种天然地方性病原体，它在小鼠的易感系(SJL/J，H-2KS)中导致诱导的脱髓鞘病(TMEV-IDD)，该病类似于MS的原发性进展型形式(姆兹(Munz)等人，《自然综述免疫学》(Nat Rev Immunol)2009；9：246-58)。TMEV感染导致CNS的终身持久性病毒感染，这导致慢性T细胞介导的自体免疫脱髓鞘病的发展，自体免疫脱髓鞘病是经由CD4 T细胞对发炎的CNS中的内源髓磷脂表位的应答的重新活化触发的(即，表位扩展)(米勒(Miller)等人，《自然医学》(Nat Med)1997；3：1133-6；卡茨-列维(Katz-Levy)等人，《临床研究杂志》(J Clin Invest)1999；104：599-610)。
感染之后21天内，SJL小鼠清除大多数病毒，然而潜伏的病毒感染被保持并且感染小胶质细胞、星形胶质细胞、以及神经元。感染之后约25-30天，显示出疾病症状。
通过评估病毒的清除和疾病的严重性，在TMEV-IDD模型中研究了使用Y6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR Ig融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25以及26)的治疗对病毒感染的急性和慢性阶段的作用。
方法：
通过在右侧大脑半球中颅内接种30ul无血清培养基中的3x107噬斑形成单位(PFU)的TMEV的BeAn菌株8386，用TMEV对雌性SJL/J小鼠(5-6周)进行感染。从感染之后的第2天，用对照Ig、Y6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD-Ig融合蛋白对小鼠进行处理，每种以100ug/剂量；3剂量/周，持续2周。
小鼠遵循临床评分。在感染之后的第7天和第14天(分别在3个和6个治疗之后)，从每个处理组的5只小鼠中收集大脑和脊髓，用于噬斑测定。对这些组织进行称重，这样使得在噬斑测定完成之后，可以计算CNS组织的PFU/mg的比例。
TMEV噬斑测定：
在感染之后的第7天和第14天，从未灌注的麻醉小鼠中收集用对照Ig(小鼠IgG2a)、或用每种Y6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD-Ig融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25以及26)处理的小鼠的大脑和脊髓。对大脑和脊髓进行称重并匀浆。将CNS匀浆连续地稀释于DMEM中并且添加至具有汇合BHK-21细胞的组织培养处理平板(tissue culture-treated plate)中，在室温下孵育1h，伴随周期性温和摇动。
将培养基/琼脂溶液以1∶1(体积∶体积)混合，添加至细胞中并且允许其在室温下凝固。然后将这些平板在34℃下培养5天。在培养结束时，添加1ml的福尔马林，并且在室温下孵育1h以固定单层细胞。将福尔马林倾倒进废物容器中，并且将琼脂从这些平板中除去。通过使用结晶紫染色5min来使噬斑可视化，并且将这些平板使用diH2O温和漂洗。为了确定PFU/ml匀浆，通过匀浆的稀化因子来使每块平板上的噬斑的数目倍增并且除以每块平板中添加的匀浆的量。将PFU/ml除以组织的重量来计算PFU/mg组织。
实例39
Y6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD-IG融合蛋白对患有流感的小鼠模型中的病毒感染的初次免疫应答和再次免疫应答的作用的评估
为了测试Y6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD-Ig融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25以及26)对病毒感染的初次免疫应答和再次免疫应答的作用，使用BALB/c原始小鼠(用于初次免疫应答)和‘HA-记忆小鼠’，连同‘多克隆流感记忆小鼠’(用于评估由记忆CD4T细胞介导的再次应答)，这些小鼠是如详细说明于台亚若(Teijaro)等人，《免疫学杂志》(JImmunol)，2009：182；5430-5438中而产生的并且描述于以下。
为了获得‘HA-记忆小鼠’，首先产生HA-特异性记忆CD4 T细胞，原始CD4 T细胞是从HA-TCR小鼠[表达特异性针对流感血凝素(HA)肽(110-119)的转基因T受体(TCR)的BALB/c-HA小鼠]的脾脏中纯化的，并且通过用5.0microg/ml HA肽以及丝裂霉素C-处理的、T-耗乏的BALB/c脾细胞作为APC、在37℃下培养3天而体外致敏。将生成的活化HA-特异性效应细胞转移至同类系BALB/c(Thyl.1)宿主(5x106细胞/小鼠)中，以产生具有稳定群体的HA-特异性记忆CD4 T细胞的“HA-记忆小鼠”。
为了获得‘多克隆-记忆小鼠’，首先通过使用亚致死剂量的PR8流感鼻内感染BALB/c小鼠来产生多克隆流感特异性记忆CD4 T细胞，感染之后2-4个月将CD4 T细胞分离，并且通过ELISPOT确定流感特异性记忆CD4 T细胞的频率。将来自先前致敏的小鼠的CD4 T细胞转移至BALB/c宿主中，以产生具有充足补体的内源T细胞的“多克隆流感-记忆”小鼠。
通过以亚致死剂量或致死剂量的PR8流感经由鼻内给予来感染原始BALB/c小鼠或BALB/c-HA记忆小鼠以及BALB/c‘多克隆流感-记忆小鼠’来测试对流感病毒的初次应答和再次应答。
在流感激发之前和之后，使用Y6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD-Ig融合蛋白或用mIgG2a对照对小鼠进行处理。每天监测体重减轻和死亡数。激发之后六天，通过收集灌洗液体和测试上清液对支气管肺泡灌洗(BAL)中的病毒含量进行分析，对于病毒含量是通过MDCK细胞中的组织培养感染剂量50％(TCID50)来确定的。另外，进行肺组织组织病理学。
为了测试Y6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD-Ig融合蛋白对T细胞增殖的作用，将BALB/c或BALB/c-HA记忆小鼠或BALB/c‘多克隆流感-记忆小鼠’如上进行感染并且在感染之后第3天、第4天以及第5天给予BrdU(1mg/剂量)。在第6天，收获脾脏和肺并且估计BrdU结合。在流感激发期间，在HA-特异性记忆CD4 T细胞中还研究了由肺记忆CD4 T的细胞因子产生，这些HA-特异性记忆CD4 T细胞在Y6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD-Ig融合蛋白的存在下用HA肽或使用IgG2a体外刺激18小时。
实例40
Y6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD-IG融合蛋白对患有流感的小鼠模型中的病毒感染的初次CD8 T细胞应答和再次CD8 T细胞应答的作用的评估
根据如文献(亨德里克斯(Hendriks)等人，《免疫学杂志》(J Immunol)2005；175；1665-1676；Bertram(伯特伦)等人，J Immunol.(《免疫学杂志》)2004；172：981-8)中描述的方法、使用经由鼻内或腹膜内给予而被流感A HKx31感染的C57BL/6小鼠来研究Y6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25以及26)对流感病毒的初次CD8 T细胞应答的作用。在致敏期间，给予Y6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD Ig融合蛋白或mIgG2a对照。每天监测动物体重减轻和死亡数。为了追踪病毒特异性CD8+T细胞，使用装载有主要CD8 T细胞表位的MHC H-2Db四聚物，NP366-374肽。预期肺、引流淋巴结、以及脾脏中的病毒特异性H-2Db/Np366-374+CD8+T细胞在感染之后的约8-10天达到峰值，并且此后下降至仅1.5％的病毒特异性CD8+T细胞(亨德里克斯(Hendriks)等人，《免疫学杂志》(JImmunol)2005；175；1665-1676；伯特伦(Bertram)等人，《免疫学杂志》(J Immunol.)2002；168：3777-85；伯特伦(Bertram)等人，《免疫学杂志》(J Immunol.)2004；172：981-8)。因此，在感染之后第8天和第21天处死小鼠，并且对肺、引流淋巴结、以及脾脏中的病毒特异性CD8+T细胞进行评估。评估病毒清除。在脾脏细胞悬液中评估CD8 T细胞应答，并且如先前所述包括细胞内IFN-γ染色和CTL活性(伯特伦(Bertram)等人，《免疫学杂志》(J Immunol.)2004；172：981-8)并且以下详细说明。
使用FITC-偶联抗-小鼠CD62L、PE-偶联抗-小鼠CD8对细胞进行表面染色以测量CD8+活化T细胞(或抗-小鼠CD4以追踪CD4+细胞)。除了这些Ab之外，还使用别藻蓝素标记的四聚物(由鼠科动物I类MHC分子H-2Db、β2-微球蛋白、以及流感NP肽NP366-374组成)来测量流感特异性CD8+T细胞。用于细胞内IFN-γ染色，使用1μl的NP366-374肽和GolgiStop(BDPharMingen公司，圣迭戈，加利福尼亚州)将细胞悬液在培养基中、在37℃下再刺激6h。然后收获细胞，重悬浮于PBS/2％FCS/叠氮化物中，并且如上所述用PE-抗-CD8和FITC-抗-CD62L进行表面染色。表面染色之后，将细胞在Cytofix/Cytoperm溶液(BD PharMingen公司)中固定，并且然后用稀释于1X perm洗涤液(BD PharMingen公司)中的别藻蓝素偶联抗小鼠IFN-γ进行染色。通过流式细胞计数法对样品进行分析。
用于细胞毒性测试(CTL应答)，将来自流感感染的小鼠的脾细胞在37℃下孵育2h以除去粘附细胞。针对51Cr-标记的EL4细胞的抗-流感NP366-374-特异性CTL活性，对连续3倍稀释的效应物进行测定，这些51Cr-标记的EL4细胞如由伯特伦(Bertram)等人2002和伯特伦(Bertram)等人2004所述的使用50uM的NP366-374肽脉冲处理6h。
在感染之后3周，用血清学上不同的流感A/PR8/34(PR8)对一些小鼠再激发，这种流感A/PR8/34与流感A HKx31共有NP基因，但是在血凝素和神经氨酸酶上不同，这样使得中和Ab不限制再次CTL应答。再激发之后第5天和第7天将小鼠处死，并且通过亨德里克斯(Hendriks)等人和伯特伦(Bertram)等人所述的对肺、引流淋巴结以及脾脏中的病毒特异性CD8 T细胞数目进行评估(亨德里克斯(Hendriks)等人，《免疫学杂志》(J Immunol)2005；175；1665-1676；伯特伦(Bertram)等人，《免疫学杂志》(J Immunol.)2004；172：981-8)以及以上详细说明。如上所述，在病毒再激发之后第5天和第7天，在小鼠的脾脏细胞悬液中对再次CD8 T细胞应答(包括细胞内IFN-γ染色和CTL活性)进行评估。
为了确定再次应答期间Y6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD-Ig融合蛋白对记忆CD8+T细胞的增殖和累积的作用，根据先前描述的方法进行过继性转移实验(亨德里克斯(Hendriks)等人，《免疫学杂志》(J Immunol)2005；175；1665-1676；伯特伦(Bertram)等人，J Immunol.(《免疫学杂志》)2004；172：981-8)：用流感流感A HKx31对小鼠进行免疫。二十一天后，将T细胞在T细胞富集免疫柱(T cell enrichment immunocolumn)(CEDARLANE实验室，霍恩斯比，安大略省，加拿大)上从脾脏中进行纯化并且用CFSE进行标记(可替代地，将Thy 1.1同类系小鼠用作受体)。将相等数目的四聚物-阳性T细胞通过受体小鼠的尾静脉进行注射。如上所述使用流感病毒对小鼠进行再激发，并且7天后，如上所述针对供体病毒特异性CD8 T细胞对脾细胞进行评估。
实例41
Y6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD-IG融合蛋白在耗尽T细胞中的蛋白表达、和与耗尽T细胞的结合及其对回复耗尽T细胞表型的作用的评估
急性病毒感染对慢性病毒感染之后，记忆CD 8 T细胞分化沿着不同的路径发生(克莱尼尔曼(Klenerman)和黑尔(Hill)，《自然免疫学》(Nat Immunol)6，873-879，2005)。在急性病毒感染后产生的记忆CD8 T细胞是高度功能性的并且构成保护性免疫的一种重要组分。相比之下，慢性感染通常是由病毒特异性T-细胞应答的不同程度功能性损伤进行表征的，并且这种缺陷是宿主对消除持久性病原体的无能的主要原因。尽管在感染的初期过程中最初产生了功能性效应T细胞，但是它们在慢性感染的过程中逐渐失去功能，这导致由受损的T细胞功能性表征的耗尽表型。
研究I.在急性病毒感染和慢性病毒感染过程中，Y6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECDIg融合蛋白对病毒感染的清除和对T细胞功能的作用。
根据由惠里(Wherry)等人《病毒学杂志》(J.Virol.)77：4911-4927，2003和巴伯(Barber)等人《自然》(Nature)，2006描述的方法论，在被LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)感染的小鼠模型中评估Y6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白(分别是SEQ IDNO：23、24、25以及26)对急性病毒感染和慢性病毒感染的作用，并且以下详细说明。
使用在成年小鼠中可以导致急性感染亦或慢性感染的两种LCMV品系；Armstrong(阿姆斯特朗)品系在一周内被清除，而建立持续感染的克隆13品系可以持续数月。因为保留了所有已知T细胞表位的这两种品系的区别仅在于两个氨基酸，所以在急性病毒感染或慢性病毒感染之后，追踪相同的CD8 T细胞应答是可能的。与急性Armstrong(阿姆斯特朗)感染之后产生高度强劲的记忆CD8 T细胞相反，在持久性克隆13感染过程中，LCMV-特异性CD 8 T细胞变得耗尽(惠里(Wherry)等人《病毒学杂志》(J.Virol.)77：4911-4927，2003；巴伯(Barber)等人《自然》(Nature)2006；439：682-7)。
用2x105PFU的LCMV的Armstrong(阿姆斯特朗)品系腹膜内感染小鼠来引发急性感染或使用2x106PFU的CI-13静脉内感染小鼠来引发慢性感染。用Y6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD Ig融合蛋白或用mIgG2a对照，并且使用特异性抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25、抗-LSR-抗体或同种型对照对小鼠进行i.p.(腹腔注射)处理。
使用病毒特异性MHC四聚物表位，例如在急性感染或慢性感染中不同的DbNP396-404和DbGP33-41，针对脾脏中的病毒特异性CD8 T细胞的数目对小鼠进行监测。根据惠里(Wherry)等人《病毒学杂志》(J.Virol.)77：4911-4927，2003所述的并且类似于实例40中所描述的那些进行CD8 T细胞功能测定，例如细胞内细胞因子水平以及CTL活性。额外的测定包括使用病毒特异性表位刺激之后脾细胞的产生；以及在血清和在脾脏、肝脏、肺以及肾脏中的病毒滴定度的评估(惠里(Wherry)等人《病毒学杂志》(J.Virol.)77：4911-4927，2003；巴伯(Barber)等人《自然》(Nature)2006；439：682-7)。
研究II.为了评估在T细胞的耗尽期间这些蛋白或其对应物受体的调节，对耗尽的T细胞中的Y6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR表达以及Y6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白与耗尽的T细胞的结合进行评估：
从患有由CI-13品系诱导的慢性LCMV感染的小鼠中分离T细胞。将这些细胞与荧光标记的抗-PD-1 Ab(作为阳性对照)(耗尽的T细胞高表达PD-1)和生物素化的Y6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白或生物素化的抗-Y6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和抗-LSR融合蛋白抗体、以及对应的同种型对照共染色。使用荧光标记的链霉亲和素通过FACS分析对结合进行检测。
实例42
LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白在滤泡辅助性T(TFH)细胞中的表达和IG融合蛋白与TFH细胞的结合的评估
滤泡辅助性T(Tfh)细胞是在B细胞辅助中特化的CD4+T细胞的一个亚群(由克罗蒂(Crotty)综述，Annu.Rev.Immunol.(《免疫学年报》)29：621-663，2011)。Tfh细胞迁移至淋巴结内的B细胞滤泡内，并且在T细胞-B细胞边界处与同源B细胞相互作用，并且随后在滤泡中诱导生发中心B细胞分化以及生发中心形成(由Crotty(克罗蒂)综述，Annu.Rev.Immunol.(《免疫学年报》)29：621663，2011)。B细胞辅助和T细胞依赖性抗体反应对Tfh细胞的需求表明这种细胞类型对于针对不同类型的传染剂的保护性免疫以及对于合理的疫苗设计是十分重要的。
作为CXCR5hiSLAMloBTLAhiPDlhiBcl6+病毒特异性CD4+T细胞的Tfh细胞在对急性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染的CD4+T细胞应答的最高点处是容易可辨认的(崔(Choi)等人2011，《免疫性》(Immunity)34：932-946)。从患有由腹膜内给予2x105PFU的LCMV的Armstrong(阿姆斯特朗)品系而诱导的急性LCMV感染的小鼠中分离T细胞。将这些细胞与针对Tfh细胞高表达的Tfh的标记(CXCR5、PD1、BTLA、Bcl6)的荧光标记抗体，和生物素化的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD-Ig融合蛋白或特异性针对LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR的生物素化抗体，以及对应的同种型对照共染色。使用荧光标记的链霉亲和素通过FACS分析对Fc融合蛋白或抗体的结合进行检测。
实例43
LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR IG融合蛋白对滤泡辅助性T(TFH)细胞的产生和活性的作用的评估
为了研究LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白对Tfh分化和体内B细胞免疫的发展的作用，贯穿LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)的Armstrong(阿姆斯特朗)品系的急性病毒感染的过程，用LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR Ig融合蛋白以及同种型对照对C57BL/6进行处理。通过如由爱图(Eto)等人2011(PLoS One 6：e17739)所述的FACS分析对Tfh分化和Bcl6蛋白表达进行评估。LCMV感染后8天，对脾细胞进行分析，通过FACS分析对Tfh产生(CD44hiCXCR5hiSLAMlo)和Bcl6表达进行评估。此外，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSRECD Ig融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25以及26)对抗原特异性B细胞应答的作用如由爱图(Eto)等人2011(PLoS One 6：e17739)所述的进行评估，包括LCMV感染后第8天血清中的抗-LCMV IgG的滴定度，以及在感染之后第8天，通过FACS分析对门控CD 19+脾细胞的浆细胞(CD138+IgD-)发展的定量。
实例44
LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD IG融合蛋白在NOD小鼠、CD28-KO NOD、以及B7-2-KO NOD中的1型糖尿病的作用
在患有1型糖尿病的广泛使用的小鼠模型中研究LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSRECD Ig融合蛋白的作用：非肥胖糖尿病(NOD)小鼠通过若干特征阶段的演变发展为自发性In NOD小鼠、自发性胰岛炎、明显的病理学损伤，若干特征阶段以临近胰岛炎开始并且以侵入性和破坏性胰岛炎以及明显的糖尿病结束。首先在3-4周龄观察到临近胰岛炎，在8-10周观察到侵入性胰岛炎，并且在临床糖尿病刚要发作之前出现破坏性胰岛炎，最早的案例是10-12周。在20周龄时，70％-80％的雌性NOD小鼠变为糖尿病(安萨利(Ansari)等人2003《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)198：63-69)。
还使用了两只KO小鼠：CD-28-KO NOD小鼠和B7-1/B7-2双重KO NOD小鼠-发展为加速的糖尿病(伦舍(Lenschow)等人1996《免疫性》(Immunity)5：285-293；萨洛蒙(Salomon)等人2000《免疫性》(Immunity)12：431-440)。
研究I：在糖尿病演变过程中，在疾病发作之前或之后，在早期和晚期用LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD-Ig融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25以及26)对NOD小鼠进行处理，用来检查这些化合物对疾病发病机制的作用并且用来证明这样的治疗减少疾病的发作并且改善发病机制。为了研究对胰岛炎的作用，对血糖水平进行测量，3次/周，持续长达25周(安萨利(Ansari)等人2003《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)198：63-69)。
通过单独的免疫细胞类型的实验评估研究疾病改变机理和作用方式：将收获胰腺、胰腺LN以及脾脏以获得Treg、Th亚型和CD8 T细胞、DC以及B细胞。对分离自胰腺、胰腺LN以及脾脏的细胞的细胞因子分泌的作用进行分析，聚焦于IFNg、IL-17、IL-4、IL-10以及TGFb。关于测试化合物的作用，通过检查单独免疫细胞类型(包括Treg、Th细胞和CD8T细胞、DC以及B细胞)；细胞因子(IFNg、IL-17、IL-4、IL-10和TGFb)以及组织学来研究疾病改变机制。进行胰腺的组织学分析以比较胰岛炎的发作和淋巴细胞渗透。
研究II-在过继性转移模型中，LY6G6F IG融合蛋白在1型糖尿病的调节中的作用
为了进一步研究Ig融合蛋白的作用方式，使用糖尿病的过继性转移模型。将来自糖尿病或前驱糖尿病NOD供体的T细胞转移至NOD SCID受者小鼠。针对糖尿病的发展，对这些小鼠进行监测。如在先前实例中所述，对尿糖和血糖、和胰腺的组织学评估、以及T细胞应答进行监测。
研究III：还通过将活化的CD4+CD62L+CD25-BDC2.5 T细胞(TCR识别通过与1040-p31一起孵育来活化的胰岛特异性肽1040-p31的转基因细胞)转移至NOD受者来诱导糖尿病。使用LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD Ig融合蛋白、对照mIgG2a或阳性对照对小鼠进行处理。在转移之后1天治疗开始。转移之后10-28天，针对葡萄糖水平对小鼠进行追踪(布尔-乔丹(Bour-Jordan)等人，《临床研究杂志》(J Clin Invest.)2004；114(7)：979-87)。
治疗后七天，提取并且检查不同免疫细胞群的胰腺、脾脏、胰腺LN以及周围淋巴结细胞。此外，通过测试响应p31肽的离体增殖以及细胞因子分泌来测量召回应答。
在上面的研究中，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白预防或减少疾病发作或其严重性。
实例45
LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD IG融合蛋白在狼疮小鼠模型中的作用
研究I：使用易发狼疮的小鼠模型，(NZB x NZW)F1(B/W)。环磷酰胺(CTX)是用于患有肾狼疮的患者的弥漫增生性肾小球肾炎的主要药物，戴克(Daikh)和沃夫席(Wofsy)报告在减少肾病以及延长患有晚期肾炎的NZB/NZW Fl狼疮小鼠的存活方面，CTX与CTLA4-Ig的组合治疗比单独任一种药剂更有效(戴克(Daikh)和沃夫席(Wofsy)，《免疫学杂志》(J.Immunol)，166(5)：2913-6(2001))。在概念证明(proof-of-concept)研究中，对单独使用LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD Ig融合蛋白和CTX亦或组合使用它们的治疗进行测试。
在蛋白治疗之前3天，收集血液样品，并且然后在治疗期间以及之后每隔一周通过ELISA进行血浆抗-dsDNA自体抗体分析。肾小球性肾炎通过肾脏的组织学分析进行评估。蛋白尿通过使用尿分析试纸测试新鲜的尿样来测量。
LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25以及26)至少在缓解狼疮性肾炎方面具有有益作用。
研究II：使用SLE的NZM2410-来源的B6.Slel.Sle2.Sle3小鼠模型。
NZM2410是由发展伴随更早疾病发作的高度渗透狼疮样疾病的NZB和NZW产生的重组近交品系。通过如上所述对蛋白尿和自体抗体的评估，在这个模型中研究LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白的作用。
研究III：使用诱导的狼疮模型。这个模型基于通过将来自一种正常小鼠品系(例如B6.C-H2(bml2)/KIEg(bml2))的Ia-不相容脾脏细胞转移至另一种小鼠品系(例如C57BL/6)而诱导的慢性移植物对抗宿主(cGVH)疾病，这导致类似系统性红斑狼疮(SLE)的自体免疫综合征，包括抗双链DNA(抗-dsDNA)自体抗体以及免疫复合体型增生性肾小球肾炎(阿普尔(Appleby)等人《临床和实验免疫学》(Clin.Exp.Immunol.)1989 78：449-453；艾森伯格(Eisenberg)和乔杜里(Choudhury)2004《分子医学方法》(Methods Mol.Med.)102：273-284)。
在将来自bml2小鼠的脾脏细胞注射进C57BL/6接受者之后，在这个模型中诱导狼疮。通过如上所述对蛋白尿和自体抗体的评估，在这个模型中研究LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白的作用。还将对T细胞应答和B细胞应答进行评估。
研究IV：使用MRL/lpr易发狼疮小鼠模型。通过如上所述对蛋白尿和自体抗体的评估，在这个模型中研究LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白的作用。
实例46
LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD IG融合蛋白在肠炎的控制中的作用。
使用小鼠中的患有结肠炎的过继性转移小鼠模型，由此来自BALB/c小鼠的CD45RB高-CD4+原始T细胞向同系SCID小鼠的转移在T细胞重构之后6-10周导致IBD-样综合征的发展，类似于人类克罗恩氏病。
SCID小鼠通过i.p.(腹腔)注射同系CD45RB高-CD4+T细胞来重构，这些T细胞是单独的或与同系CD45RB低-CD4+亦或CD25+CD4+细胞(每个细胞群为4x105/小鼠)共转移(刘(Liu)等人，《免疫学杂志》(J Immunol.)2001；167(3)：1830-8)。将用来自正常小鼠的脾脏的同系CD45RB高CD4+T细胞重构的结肠炎SCID小鼠在T细胞转移开始时开始每周两次使用LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD Ig融合蛋白或Ig同种型对照i.p.(腹腔注射)处理，长达8周。每周监测所有小鼠的重量、软便或腹泻，以及直肠脱垂。所有小鼠在T细胞转移之后8周或在其展现20％原始体重损失时被处死。收集结肠组织用于组织学和细胞学检查。LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白至少在缓解炎症性肠病方面具有有益作用。
实例47
LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD IG融合蛋白在患有银屑病的小鼠模型中的作用
研究I：建立银屑病SCID异种移植模型。
将人银屑病斑移植至SCID小鼠上。刮取活检(2.5_2.5cm)获自患有涉及5％-10％总皮肤的普通斑块状银屑病的患者，这些患者未接受银屑病的任何全身治疗或光线疗法历时6个月，并且未接受除润肤剂以外的任何局部用制剂历时6周。活检获自位于大腿或手臂上的活性斑块。将每一片活检划分成约1cm2大小的四个相等部分。每一片移植至单独小鼠。
在全身麻醉下，通过去除完全厚度的皮肤样品，保持覆盖下面的背部肌肉的筋膜上的血管丛完整，而在7至8周龄CB 17 SCID小鼠的背部的剃毛区域上产生约1cm2的移植物床。然后将通过刮取活检获得的部分厚度人类皮肤原位转移至移植物床上。将液体兽医绷带Nexaband(兽医产品实验室(Veterinary Products Laboratories)，亚利桑那州凤凰城(Phoenix，AZ))用于附接人类皮肤至小鼠皮肤并且施加抗生素药膏(枯草杆菌肽)。用LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD Ig融合蛋白、同种型对照或CTLA4-Ig(阳性对照)对小鼠进行腹膜内处理，每周三次，持续四周。
钻取活检(2mm)在研究期的第0天(治疗之前)以及第28天(治疗之后)获得。将活检快速冷冻并且冰冻切片用于组织病理学以及免疫组织化学研究。通过将治疗前和治疗后的数据进行比较来确定疗效：(i)表皮突长度，来确定对表皮厚度的作用，以及(ii)淋巴单核细胞渗透物的水平，来确定对炎性细胞渗透物的作用。(瑞查德夫里(Raychaudhuri)等人，2008，《研究性皮肤医学杂志》(J Invest Dermatol.)；128(8)：1969-76；伯恩克(Boehncke)等人，1999《皮肤病学研究档案》(Arch Dermatol Res)291：104-6)。
LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25以及26)至少在缓解银屑病方面具有有益作用。
研究II：通过SCID小鼠中的CD45RBHI CD4+T细胞的过继性转移，LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR在银屑病和结肠炎模型中的作用
向免疫功能低下小鼠静脉内(i.v.)注射0.3_106 CD4+CD45RBhi细胞。细胞过继转移后当天，向小鼠i.p.(腹腔)注射10微克葡萄球菌肠毒素B(戴文波特(Davenport)等人.，《国际免疫药理学》(Int Immunopharmacol.)2002年4月；2(5)：653-72)。使用LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD-Ig融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25以及26)，同种型对照或CTLA4-Ig(阳性对照)对受者小鼠进行处理。每周一次评估小鼠的重量损失以及皮肤病变的存在，历时8周。
获得的结果类似于如上所述的那些结果。
实例48
LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD IG融合蛋白在调节移植物排斥中的作用。
研究I：LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR在糖尿病小鼠中的异体胰岛移植中的作用。为了测试LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25以及26)对移植物排斥的作用，使用异体胰岛移植的模型。通过使用链唑霉素处理而在C57BL/6小鼠中诱导糖尿病。七天之后，将具有分离自供体BALB/c小鼠的胰岛移植于小鼠肾包膜下。使用LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECD Ig融合蛋白或使用作为阴性对照的mIgG2a对接受者小鼠进行处理。将对ECDI-固定具有耐受性的供体脾细胞用作阳性对照，用于成功的调节胰岛移植排斥。对受者小鼠的血糖水平进行监测，作为移植物接受/排斥的测量值(罗(Luo)等人，PNAS，2008年9月23日_vol.105_no.38_14527-14532)。
研究II：LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR在皮肤移植排斥的HYA-模型中的作用。
在人类和某些品系的实验室小鼠中，雄性组织被识别为异物并且经由组织相容性的识别而被雌性免疫系统所破坏-Y染色体编码的抗原(Hya)。雄性组织破坏被认为是以一种辅助依赖性(helper-dependent)方式通过细胞毒T淋巴细胞而完成。
为了测试LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25以及26)对移植的作用，使用Hya模型体系，其中雌性C57BL/6小鼠接受来自雄性C57BL/6供体的尾部皮肤移植片。
在这个研究中，用来自年龄相配的雄性C57BL/6小鼠的原位分裂厚度(split-thickness)尾部皮肤对雌性C57BL/6小鼠进行移植。使用LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECDIg融合蛋白，同种型对照mIgG2a对小鼠进行处理。将附接至雌性脾脏白细胞(Dby-SP)的免疫显性的Hya-编码的CD4表位(Dby)用作阳性对照，用于成功的调节移植排斥(马丁(Martin)等人.，《免疫学杂志》(J Immunol.)2010年9月15日；185(6)：3326-3336)。针对水肿、色素丢失以及毛发丧失，对皮肤移植片每天进行评分。排斥被定义为完全毛发丧失并且多于80％的色素丧失。此外，对在不同时间点分离自脾脏和引流淋巴结的细胞的T细胞召回应答进行研究，响应于特异性CD4表位(Dby)、CD8表位(Uty和Smcy)或无关肽(OVA 323-339)，同时抗CD3刺激被用作针对增殖和细胞因子分泌的阳性对照。
研究III：使用上述Hya模型体系，在同系骨髓细胞移植的鼠科动物模型中研究LY6G6F、VSIG10、TMEM25和LSR ECD Ig融合蛋白的作用。将表达CD45.1标记的雄性造血细胞移植至表达CD45.1同类系标记的雌性宿主小鼠中。使用LY6G6F、VSIG10、TMEM25或LSR ECDIg融合蛋白或使用同种型对照mIgG2a对雌性宿主进行处理。随着时间对雌性宿主进行追踪并且监测CD45.1+细胞的存在。
实例49
根据本发明的至少一些实施例所述的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白作为癌症免疫监视的调节剂的角色的建立：
1)体内概念证明
a)小鼠癌症同系模型：
(i)将过表达任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白或非相关对照蛋白的肿瘤细胞移植至遗传相配的小鼠中。然后对肿瘤体积(和处死动物之后，肿瘤重量)以及来自肿瘤引流淋巴结或脾脏的免疫细胞的离体分析进行检查，以证明有待延迟的肿瘤的排斥(即，过表达LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的肿瘤比过表达非相关对照蛋白的肿瘤生长更快)。预期来自肿瘤引流淋巴结的免疫细胞的离体分析揭示在调节T细胞的频率方面的增加和在效应T细胞对刺激的反应性方面的减少。(《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)2011 Vol.208No.3577-592)。
(ii)如下对使用任一融合至抗体Fc片段(小鼠ECD-Fc)的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白(分别是SEQ ID NO：23、24、25以及26)的小鼠直向同源物的额外的细胞结构域的体内同系模型进行测试。在肿瘤建立以后，以3-4天的间隔向C57BL/6小鼠IV(静脉内)注射小鼠ECD-FC，如描述于《免疫学杂志》(J Immunol)2010；185；2747-2753中。然后对肿瘤体积(和处死动物之后，肿瘤重量)以及来自肿瘤引流淋巴结或脾脏的免疫细胞的离体分析进行检查。作为使用LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的小鼠ECD-FC IV处理的结果，肿瘤的排斥被延迟(即，在使用LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的小鼠ECD-FC处理的小鼠中，肿瘤生长地比使用非相关对照蛋白处理的小鼠中的肿瘤更快)。来自肿瘤引流淋巴结的免疫细胞的离体分析揭示在调节T细胞的频率方面的增加和在效应T细胞对刺激的反应性方面的减少。
(iii)同系肿瘤的建立并且使用直接针对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白(1、3、5、7、11、143、13、15-17、18、28、29-32)的中和抗体进行处理。将肿瘤细胞移植至遗传一致的小鼠中。在肿瘤建立之后，向小鼠IV(静脉内)注射不同剂量的针对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的中和抗体。作为使用特异性针对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的中和抗体IV处理的结果，肿瘤的排斥被增加(即，在使用针对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的中和抗体进行处理的小鼠中，肿瘤生长地比使用非相关抗体处理的小鼠中的肿瘤更慢)。来自肿瘤引流淋巴结的免疫细胞的离体分析揭示在调节T细胞的频率方面的减少和在效应T细胞对刺激的反应性方面的增加。
b)人类癌症异种移植模型：
(i)在免疫受损的NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtmlWjl/SzJ小鼠(Jackson(杰克逊)实验室)，“NSG”小鼠的模型中重构肿瘤免疫应答。在NSG模型中建立人类肿瘤，并且使用肿瘤抗原、或/和T细胞对APC进行预装载(将用癌症靶细胞预活化的CD8 T细胞转移至带有肿瘤的NSG小鼠(所有被移植的细胞/被注射的细胞来自癌症患者)。这个模型由四方面组成：1.过表达任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的APC，2.APC上任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的沉默(siRNA亦或ShRNA)，3.过表达任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的癌细胞，以及4.癌细胞上任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的沉默(siRNA亦或ShRNA)。包括阳性对照(例如，B7-H1、PD-L1)和阴性对照(例如，单独的载体和细胞)。然后检查肿瘤体积或肿瘤转移以及小鼠存活(《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)；2006；Vol.203；p.871-881)。APC亦或肿瘤细胞上的任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的过表达导致肿瘤的延迟排斥(即，在使用过表达任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的APC或肿瘤细胞处理的小鼠中，肿瘤生长地比使用非相关对照蛋白处理的小鼠中的肿瘤更快)。APC亦或肿瘤细胞上的任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的沉默(用SiRNA或SHRNA)导致肿瘤的增强排斥。
(ii)如上所述NSG癌症异种移植的建立(无需APC和/或癌细胞的基因操作)并且用直接针对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的中和抗体进行处理。使用直接针对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的中和抗体对NSG异种移植的处理引起肿瘤的增强排斥。
2)自然杀伤(NK)细胞活性的体外确认
a)结合测定：
(i)如《免疫学杂志》(J Immunol)2005；174；6692-6701中所述的，在活化的原代培养NK细胞上进行人类LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR ECD-FC蛋白的结合测定。如果LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的反受体表达在NK细胞上，那么可以观察到LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR ECD-Fc的结合。
(ii)如PNAS，2009，vol.109；17858-17863中所述的，在活化的原代培养NK细胞上进行直接针对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的特异性抗体的结合测定。如果任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR表达在NK细胞上，那么可以分别观察到LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR特异性抗体的结合。
(ii)如《免疫学杂志》(J Immunol)2006；176；6762-6769中所述的，在可以充当NK杀伤的靶细胞的不同人类癌症细胞系上进行人类LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR ECD-FC蛋白的结合测定。如果任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的反受体表达在癌症靶细胞上，那么可以分别观察到LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR ECD-Fc的结合。
b)功能性杀伤测定：
(i)使用过表达系统进行杀伤测定(过表达任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的NK细胞亦或癌症靶细胞)。如PNAS，2009，vol.109；17858-17863中所述的，将细胞NK(效应物；e)与放射性(S35)标记的癌症靶细胞(靶标；t)以不同e∶t比例进行共孵育。然后通过放射性发射的测量值对靶细胞由NK杀伤活性的溶解进行评估。在癌症靶细胞和/或NK细胞系上的任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的过表达导致NK介导的杀伤活性的下调。
(ii)如PLoS ONE；2010；Vol.5；p.1-10中所述的，在人类LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR ECD-FC蛋白的存在下，进行杀伤测定。用任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的ECD-Fc的处理干扰LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR与其反受体的相互作用并且因此降低其抑制活性，这引起增强的杀伤活性。
(iii)如PNAS，2009，vol.109；17858-17863中所述的，在直接针对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的中和抗体的存在下，进行杀伤测定。用直接针对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的中和抗体的处理引起增强的NK杀伤活性。
(iv)“再定向杀伤测定”(Re-directed killing assay)进行如下：如PNAS，2009，vol.109；17858-17863中所述的，使用直接针对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的活化抗体对表达高密度的Fc受体的癌症靶细胞进行包衣并且向NK细胞(表达指定的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白)暴露。任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR与活性抗体的交联引起降低的NK介导的杀伤活性。
3)表达分析
a)LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白在分离自人类肿瘤活检的细胞上的表达
i)使用分别直接针对任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的特异性抗体，在来自肿瘤的分离的细胞群体上进行任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的表达确认。如《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)；2006；Vol.203；p.871-881和《癌症研究》(Cancer res.)2007；67；8900-8905中所述的，从肿瘤活检中新鲜分离不同细胞群体，(例如肿瘤细胞、内皮、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和DC、B细胞以及不同T细胞(CD4、CD8和Treg)，以证明任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR在肿瘤细胞中以及肿瘤间质和免疫渗透物上的表达。
ii)在来自肿瘤的分离的细胞群体上进行人类LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSRECD-FC蛋白的结合测定。如《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)；2006；Vol.203；p.871-881和《癌症研究》(Cancer res.)2007；67；8900-8905中所述的新鲜分离自肿瘤，从肿瘤活检中分离不同细胞群体，(例如肿瘤细胞、内皮、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和DC、B细胞以及不同T细胞(CD4、CD8和Treg)，以示出任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的反受体在肿瘤细胞中以及肿瘤间质和免疫细胞上的表达。
b)LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白在分离自荷瘤小鼠的引流淋巴结和脾脏 的细胞上的表达
(i)如《临床癌症研究》(Clinical Cancer Research)1996 Vol.2，811-820中所述的，使用分别直接针对LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的特异性抗体，在来自C57荷瘤小鼠的肿瘤引流淋巴结对脾脏的上皮癌细胞以及免疫细胞上进行LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的表达确认。正在测试三种不同的癌症类型：B16(黑色素瘤)、ID8(卵巢)以及MC38(结肠))，以示出任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR在肿瘤引流淋巴结中的肿瘤细胞和免疫细胞中的表达。
ii)在分离自C57荷瘤小鼠的肿瘤引流淋巴结对脾脏的上皮癌细胞以及免疫细胞的细胞上进行小鼠LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR ECD-FC蛋白的结合测定，以示出任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的反受体在肿瘤引流淋巴结中的肿瘤细胞和免疫细胞中的表达。
c)LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白在M2极化巨噬细胞上的表达
(i)如《自然免疫学》(Nat.Immunol.)2010；Vol.11；p.889-896中所述的，使用分别直接针对LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的特异性抗体，在分离自外周血、分化为巨噬细胞且向“M2驱动刺激”(例如，IL4、IL10、糖皮质激素、TGFβ)暴露的初级单核细胞上进行LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的表达确认，以示出任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR在M2分化的巨噬细胞中的表达。
ii)如上所述，在分离自外周血、分化为巨噬细胞且向“M2驱动刺激”(例如，IL4、IL10、糖皮质激素、TGFβ)暴露的初级单核细胞上进行LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR人类ECD-FC蛋白的结合测定，以示出任一LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的反受体在M2分化的巨噬细胞中的表达。
实例50
完全人类抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体的研发
针对LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原的人类单克隆抗体的产生
通过标准重组方法产生由连接至小鼠IgG2 Fc多肽的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的细胞外结构域组成的融合蛋白，并且将其用作免疫法的抗原。
转基因HuMab小鼠。
使用来自表达人类抗体基团的转基因HuMab小鼠RTM.的HCo7品系的小鼠制备针对LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的完全人类单克隆抗体。在这个小鼠品系中，内源小鼠的κ轻链基因已经如陈(Chen)等人(1993)《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)12：811-820中所述被纯合地破坏，并且内源小鼠重链基因已经如PCT公开WO 01/09187的实例1中所述被纯合地破坏。此外，这个小鼠品系携带人类κ轻链转基因KCo5，如费什瓦尔德(Fishwild)等人(1996)《自然生物技术》(Nature Biotechnology)14：845-851中所述；以及人类重链转基因，如美国专利号5,545,806，5,625,825，以及5,545,807中所述。
HuMab免疫法：
为了产生针对LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的完全人类单克隆抗体，可以用来源于哺乳动物细胞的纯化的重组LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR融合蛋白对HCo7 HuMab小鼠品系的小鼠进行免疫，用包含编码融合蛋白的基因的表达载体对这些哺乳动物细胞进行转染。针对HuMab小鼠的全身免疫方案描述于兰博尔格(Lonberg，N.)等人(1994)《自然》(Nature)368(6474)：856-859；费什瓦尔德(Fishwild，D.)等人(1996)《自然生物技术》(Nature Biotechnology)14：845-851以及PCT公开案WO 98/24884中。当第一次输注抗原时，这些小鼠是6-16周龄。使用纯化的重组LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原制剂(5-50.mu.g，从表达LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR融合蛋白的被转染哺乳动物细胞中纯化)来对HuMab小鼠腹膜内免疫。
用完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原对转基因小鼠IP免疫，随后是用完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原的3-21天IP免疫(高达总共11次免疫)。通过眶后放血对免疫应答进行监测。可以通过ELISA筛选血浆(如下所述)，并且使用具有足够滴定度的抗-LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR人类免疫球蛋白的小鼠用于融合。在处死并且除去脾脏之前的3天，使用抗原来静脉内地使小鼠增强免疫。
产生抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体的HuMab小鼠的选择：
为了选择产生结合LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的抗体的HuMab小鼠，如最初由费什瓦尔德(Fishwild，D.)等人(1996)描述的，通过修饰的ELISA对来自免疫小鼠的血清进行测试。简言之，使用1-2μg/ml的PBS中的纯化的重组LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR融合蛋白对微量滴定板进行包衣，在4℃下、以50μl/孔孵育过夜，然后用200μl/孔的PBS中的5％BSA进行封闭。向每个孔中添加来自LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR-免疫小鼠的血浆的稀释物，并且在周围温度下孵育1-2小时。使用PBS/吐温对平板进行洗涤，并且然后使用与碱性磷酸酯酶偶联的山羊-抗-人κ轻链多克隆抗体在室温下孵育1小时。洗涤之后，将这些平板用pNPP底物进行显影，并且在OD 415-650下通过分光光度计进行分析。将显示最高滴定度的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体的小鼠用于融合。如下所述进行融合，并且通过ELISA针对抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR活性对杂交瘤上清液进行测试。
生产针对LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的人类单克隆抗体的杂交瘤的产生。
基于标准方案，用PEG将分离自HuMab小鼠的小鼠脾细胞融合至小鼠骨髓瘤细胞系。然后针对抗原特异性抗体的产生对这些生成的杂交瘤进行筛选。将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液用50％的PEG(Sigma公司)融合至四分之一数目的P3X63 Ag8.6.53非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)中。将细胞以约1X 10-5/孔涂板于平底微量滴定板中，随后在补充有以下的包含10％的胎牛血清的选择培养基中孵育约两周：RPMI中的origen(IGEN0，L-谷氨酰胺，丙酮酸钠，HEPES，青霉素，链霉素，庆大霉素，1x HAT，以及β-巯基乙醇。在1-2周之后，将细胞在将HAT用HT替代的培养基中进行培养。然后针对人类抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR单克隆IgG抗体，对单独的孔通过ELISA(上述)进行筛选。一旦大量的杂交瘤生长出现，通常在10-14天之后可以对培养基进行监测。将抗体分泌杂交瘤再涂板，再次筛选，并且如果对于人类IgG仍呈阳性，就将抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR单克隆抗体通过有限稀释亚克隆至少两次。然后将稳定的亚克隆在体外培养，以在用于进一步表征的组织培养基中产生少量的抗体。
对杂交瘤克隆进行选择用于进一步分析。
所希望的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR人类单克隆抗体的结构表征
使用标准PCR技术，从生成的杂交瘤中分别获得对获得的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区进行编码的cDNA序列，并且使用标准DNA测序技术进行测序。
对重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列进行鉴定。可以将这些序列与已知的人类种系免疫球蛋白的轻链序列和重链序列以及鉴定的获得的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR序列的每个重链和轻链的CDR进行比较。
抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR人类单克隆抗体的结合特异性和结合动力学的表征
通过Biacore分析对抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体的结合亲和性、结合动力学、结合特异性以及交叉竞争进行检查。还通过流式细胞计数法对结合特异性进行检查。
结合亲和性和结合动力学
通过Biacore分析(Biacore AB，乌普萨拉，瑞典)针对亲和性和结合动力学对根据本发明产生的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体进行表征。使用标准胺偶联化学以及由提供Biacore的试剂盒，将纯化的重组人类LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR融合蛋白经由伯胺共价地连接至CM5芯片(羧甲基葡聚糖包衣的芯片)。在50μl/min的流速下，通过使抗体在处于267nM的浓度的HBS EP缓冲剂(由BIAcore AB提供)中流动对结合进行测量。对抗原相关抗体的缔合动力学追踪3分钟，而对解离动力学追踪7分钟。使用BlA评估(BlAevaluation)软件(Biacore AB)，将缔合曲线和解离曲线拟合进1∶1朗缪尔结合模型(Langmuir binding model)。为了最小化结合常数的估计中的亲和力的作用，仅使用对应于缔合阶段和解离阶段的起始区段的数据用于拟合。
获得的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体的表位作图
使用Biacore来确定抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSRHuMAb的表位分类。分别使用获得的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体来定位它们在LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原上的表位。将这些不同抗体包衣在的相同芯片的三个不同表面上，至每个8000RU。制备每种mAb的稀释物(起始于10μg/mL)，并且与Fc融合LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR(50nM)孵育一小时。将孵育复合体以20μL/min的流速同时注射至所有的三个表面(以及空白表面)，持续1.5分钟。在1.5分钟结束时，将减去适当的空白之后的来自每个表面的信号针对复合体中mAb的浓度进行标绘。在分析数据时，取决于表位作图结果，将抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体归类为不同表位组。还对其功能特性进行比较。
研发了在细胞表面表达LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR蛋白的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并且通过流式细胞计数法将其用来确定LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR HuMAb的特异性。用包含对跨膜型的LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原或其变体进行编码的全长cDNA的表达质粒对CHO细胞进行转染。将在N-末端包含表位标签的转染蛋白用于特异性针对该表位的抗体的检测。通过将每种LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR Ab以10μg/ml的浓度与转染细胞一起孵育来对抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR MAb的结合进行评估。对这些细胞进行洗涤，并且用FITC-标记的抗-人IgG Ab对结合进行检测。将鼠科动物抗-表位标签Ab、随后是标记的抗-鼠科动物IgG用作阳性对照。将非特异性人类和鼠科动物Ab用作阴性对照。使用获得的数据来评估HuMAb与LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原靶标的特异性。
可以将这些抗体和特异性针对LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR的其他抗体用于前述的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR相关治疗中，例如癌症的治疗，其中LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原被差异表达；和/或调节(增强或抑制)涉及LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原的B7免疫共刺激，例如在癌症和自体免疫性疾病的治疗中，其中此类抗体例如阻止针对所希望的靶标癌细胞的T细胞活性的负向刺激或阻止T细胞活性的正向刺激，由此引起所希望抗自体免疫作用。
本发明已经被描述并且提供了关于用作治疗学和诊断方法的所希望的抗-LY6G6F、抗-VSIG10、抗-TMEM25和/或抗-LSR抗体的制造和选择的不同实施例，其中疾病或病症与LY6G6F、VSIG10、TMEM25和/或LSR抗原相关联。超出在此所示的这些明确的组合和亚组合，不同的实施例能可任选地以任何适合的方式结合在此。现在通过下面的权利要求书对本发明进一步描述。

Claims (30)

1.一种分离的多肽，由SEQ ID NO:11或12组成。
2.一种融合蛋白，包括连接至异源序列的如权利要求1所述的多肽，其中该异源序列是人类IgG1 Fc。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：75-80、176-181中任一个所阐明。
4.如权利要求2所述的融合蛋白，该融合蛋白调节免疫细胞应答。
5.一种对如权利要求1所述的多肽或如权利要求2-4中任一项所述的融合蛋白进行编码的核酸序列。
6.根据权利要求5所述的核酸序列，选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：40-46、132、44、155、186-188、193-198。
7.一种表达载体或病毒，包含至少一种根据权利要求5所述的核酸序列。
8.一种重组细胞，包括根据权利要求7所述的表达载体或病毒，其中该细胞组成型表达或可诱导地表达由该核酸序列编码的多肽。
9.一种生产LSR可溶性胞外域多肽、或其片段或融合蛋白的方法，该方法包括将根据权利要求8所述的重组细胞在由此该细胞表达由该核酸序列编码的多肽的条件下培养，并且回收所述多肽。
10.一种药物组合物，包括：根据权利要求1所述的分离的多肽、或根据权利要求2所述的融合蛋白，并且还包括药学上可接受的稀释剂或运载体。
11.根据权利要求1所述的分离的多肽或根据权利要求2所述的融合蛋白中的任何一个在制备用于治疗免疫系统相关病症的药物中的用途，其中所述免疫系统相关病症包括自体免疫性疾病和移植排斥，其中所述自体免疫性疾病选自由以下组成的组：多发性硬化症；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；溃疡性结肠炎；克罗恩病；I型糖尿病，和银屑病。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述多发性硬化症包括复发型多发性硬化症，原发性进展型多发性硬化症，以及继发进展型多发性硬化症。
13.根据权利要求1所述的分离的多肽或根据权利要求2所述的融合蛋白中的任何一个在制备用于抑制或降低T细胞的活化的药物中的用途，其中所述药物施用至受试者。
14.根据权利要求1所述的分离的多肽或根据权利要求2所述的融合蛋白中的任何一个在制备用于治疗免疫系统相关病症的药物中的用途，其中所述免疫系统相关病症包括自体免疫性疾病和移植排斥，其中所述自体免疫性疾病选自由以下组成的组：多发性硬化症，类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；溃疡性结肠炎；克罗恩病；I型糖尿病，和银屑病。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述治疗与用于治疗免疫相关病症的另外的疗法进行组合。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述疗法选自由以下组成的组：免疫抑制剂，非甾体抗炎药物，羟基氯喹，柳氮磺胺吡啶(sulphasalazopryine)，氯金酸钠，依那西普，英利昔单抗，巴利昔单抗，阿塞西普，利妥昔单抗，癌得星(cytoxan)，盐酸米托蒽醌，阿那白滞素和/或其他生物制剂。
17.根据权利要求15所述的用途，其中所述疗法选自由以下组成的组：静脉注射免疫球蛋白(IVIG)，干扰素类；醋酸格拉默那他珠单抗米托蒽醌细胞毒性剂，钙调神经磷酸酶抑制剂；免疫抑制大环内酯，淋巴细胞归巢试剂，皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；来氟米特或其类似物；咪唑立宾；麦考酚酸；吗替麦考酚酯；15-deoxyspergualine或其类似物；免疫抑制单克隆抗体，或白细胞受体的配体；或其他免疫调节化合物或另一种免疫调节试剂。
18.根据权利要求15所述的用途，其中所述疗法为生物剂。
19.根据权利要求15所述的用途，其中所述疗法为Cox-2抑制剂。
20.根据权利要求15所述的用途，其中所述疗法是多肽。
21.根据权利要求16-19中任一项所述的用途，其中所述免疫抑制剂是皮质类固醇、环孢霉素、环磷酰胺、泼尼松、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、雷帕霉素或他克莫司；和/或所述生物剂是TNF-α阻断剂或拮抗剂、或靶向任何炎性细胞因子的任何其他生物剂；和/或所述干扰素类是IFN-β-la(和)或IFN-β-lb和/或钙调神经磷酸酶抑制剂是环孢霉素A或FK506；和/或所述免疫抑制大环内酯是雷帕霉素或其衍生物；和/或所述淋巴细胞归巢试剂是FTY720或其类似物；和/或所述免疫抑制单克隆抗体是白细胞受体的单克隆抗体；和/或其他免疫调节化合物是CTLA4-Ig(阿巴西普，)、CD28-Ig、B7-H4-Ig、或其他共刺激试剂，或粘附分子抑制剂。
22.根据权利要求21所述的用途，其中雷帕霉素的衍生物为40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素；和/或所述粘附分子抑制剂为mAb或低分子量抑制剂。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述低分子量抑制剂包括LFA-1拮抗剂、选择素拮抗剂以及VLA-4拮抗剂。
24.根据权利要求17所述的用途，其中所述白细胞受体为MHC、CD2、CD3、CD4、CD11a/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40或4-1BB。
25.根据权利要求21所述的用途，其中所述白细胞受体为MHC、CD2、CD3、CD4、CD11a/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40或4-1BB。
26.如权利要求16-20和22-25中任一项所述的用途，其中所述免疫病症选自自体免疫性疾病或移植排斥。
27.如权利要求21所述的用途，其中所述免疫病症选自自体免疫性疾病或移植排斥。
28.如权利要求26所述的用途，其中所述自体免疫性疾病选自由以下组成的组：多发性硬化症，类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；溃疡性结肠炎；克罗恩病；I型糖尿病和银屑病。
29.如权利要求27所述的用途，其中所述自体免疫性疾病选自由以下组成的组：多发性硬化症，类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；溃疡性结肠炎；克罗恩病；I型糖尿病和银屑病。
30.根据权利要求28或29所述的用途，其中所述自体免疫性疾病选自由以下任何疾病的任何类型和亚型组成的组：多发性硬化症、类风湿性关节炎、I型糖尿病、银屑病、和系统性红斑狼疮。
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