Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN103585623A - 含有肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗 - Google Patents

含有肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN103585623A
CN103585623A CN201310103804.XA CN201310103804A CN103585623A CN 103585623 A CN103585623 A CN 103585623A CN 201310103804 A CN201310103804 A CN 201310103804A CN 103585623 A CN103585623 A CN 103585623A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vaccine
sugar
conjugate
albumen
phtd
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310103804.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN103585623B (zh
Inventor
R.L.比曼斯
N.M.-J.加孔
P.V.赫尔曼德
J.普尔曼
M.P.范梅歇伦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39133667&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN103585623(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GB0526232A external-priority patent/GB0526232D0/en
Priority claimed from GBGB0607088.2A external-priority patent/GB0607088D0/en
Priority claimed from GB0607087A external-priority patent/GB0607087D0/en
Priority claimed from GB0609902A external-priority patent/GB0609902D0/en
Priority claimed from GBGB0620336.8A external-priority patent/GB0620336D0/en
Priority claimed from GB0620337A external-priority patent/GB0620337D0/en
Priority claimed from GB0620815A external-priority patent/GB0620815D0/en
Priority claimed from GB0620816A external-priority patent/GB0620816D0/en
Priority claimed from PCT/GB2006/004634 external-priority patent/WO2007068907A2/en
Application filed by GlaxoSmithKline Biologicals SA filed Critical GlaxoSmithKline Biologicals SA
Publication of CN103585623A publication Critical patent/CN103585623A/zh
Publication of CN103585623B publication Critical patent/CN103585623B/zh
Application granted granted Critical
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/14—Decongestants or antiallergics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明公开了含有血清型19A和19F肺炎链球菌(S.pneumoniae)荚膜糖缀合物的免疫原性组合物，其中19A与第一种细菌类毒素缀合，19F与第二种细菌类毒素缀合。还描述了制备疫苗的方法和疫苗的用途。

Description

含有肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗
本申请是申请日为2006年12月20日，申请号为200680052954.0的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。 
发明领域
本发明涉及改进的肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)疫苗。 
发明背景 
不到2岁的儿童对大多数多糖疫苗不产生免疫应答，所以一直以来必须通过与蛋白载体进行化学缀合使多糖成为免疫原性的。将为非T细胞依赖性抗原的多糖与为T细胞依赖性抗原的蛋白偶联赋予多糖T细胞依赖性特性，包括同种型转换、亲和力成熟和记忆诱导。 
然而，重复给予多糖-蛋白缀合物或将多糖-蛋白缀合物联合成多价疫苗可能有问题．例如，已有报道指出在一定剂量范围内测试了使用破伤风类毒素(TT)作为蛋白载体的乙型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)多糖(PRP)疫苗，该疫苗与(游离的)TT和肺炎链球菌多糖-TT缀合疫苗按照标准婴儿免疫程序同时免疫。当肺炎链球菌疫苗的剂量增加时，对Hib缀合疫苗的PRP多糖部分的免疫应答降低，这表明很可能是通过使用相同载体蛋白引起的多糖免疫干扰(Dagan等,InfectImmun.(1998);66:2093-2098)。 
已证实载体-蛋白剂量对针对蛋白自身的体液免疫应答的影响是多方面的。据报道在人类婴儿中增加四价破伤风类毒素缀合物的剂量导致对破伤风载体的应答下降(Dagan等，出处同上)。对于联合疫苗的这些效应的经典分析一直被描述为载体诱导的表位抑制，这一点还没有完全弄清楚，但一般认为是由过量的载体蛋白引起的(Fattom,vaccine17:126(1999))。这似乎导致针对载体蛋白的B细胞和针对多糖的B细胞竞争Th细胞。如果针对载体蛋白的B细胞占优势，则没 有足够的Th细胞可用于为多糖特异性B细胞提供必需的辅助。然而，观察到的免疫效果一直不一致，载体蛋白的总量在某些情况下增加免疫应答，而在另一些情况下降低免疫应答。 
因此，将多种多糖缀合物组合成单一的、有效的疫苗制剂仍有技术难度。 
肺炎链球菌为革兰氏阳性细菌，可导致相当高的发病率和死亡率(尤其是对年纪小的人和上年纪的人)，引起诸如肺炎、菌血症和脑膜炎等侵袭性疾病以及与定植相关的疾病，如急性中耳炎。在美国，60岁以上的人患有肺炎链球菌性肺炎的比例估计为十万分之3-8。其中20%的病例中会引发菌血症，其它则表现为例如脑膜炎，即便采用抗生素治疗死亡率也接近30%。 
肺炎链球菌被赋予血清型特异性的化学连接的多糖包裹。有90种公知的肺炎链球菌血清型，荚膜是肺炎链球菌毒力的主要决定因素，因为荚膜不但保护细菌内表面不受补体影响，而且其本身是弱免疫原性的。多糖是非T细胞依赖性抗原，不能被加工或呈递到MHC分子上，从而不能与T细胞相互作用。但它们能通过一种涉及B细胞表面受体交联的替代机制来刺激免疫系统。 
一些实验表明，对侵袭性肺炎链球菌疾病的防护作用与荚膜特异性抗体最为相关，且该防护作用具有血清型特异性。 
肺炎链球菌是婴儿和儿童侵袭性细菌疾病和中耳炎的最常见致病因素。同样，老年人对肺炎链球菌疫苗的应答较弱[Roghmann等,(1987),J.Gerontol.42:265-270]，因此，在该人群中细菌性肺炎的发病率升高[Verghese和Berk,(1983)Medicine(Baltimore)62:271-285]。 
因此，本发明的目的是开发一种改进的多种血清型肺炎链球菌多糖缀合疫苗的制剂。 
附图简述 
图1在老年猕猴中的缀合物免疫原性(在第Ⅱ剂Ⅱ剂后的抗PSIgG水平)。显示老年猕猴(Rhesusmonkeys)中的11价缀合物免疫原性的条形图。浅色条代表用在磷酸铝佐剂中的11价缀合物2次接种后的GMC。深色条代表用在佐剂C中的11价缀合物2次接种后的GMC。 
图2在老年猕猴中的缀合物免疫原性(在第Ⅱ剂后的抗PS3记忆B细胞频率)。显示用在佐剂C或磷酸铝佐剂中的11价缀合物接种后针对PS3的记忆B细胞的条形图。 
图3在Balb/c小鼠中的PS19F免疫原性(在第Ⅲ剂后的IgG水平)。显示Balb/C小鼠中4价普通多糖和4价dPly缀合物的抗多糖19F免疫原性的条形图。 
图4在Balb/c小鼠中的PS22F免疫原性(在第Ⅲ剂后的IgG水平)。显示Balb/C小鼠中4价普通多糖和4价PhtD缀合物的抗多糖22F免疫原性的条形图。 
图5血清抗PSIgG抗体水平。显示Balb/C小鼠中的抗22FIgG应答的条形图。 
图6调理吞噬效价。显示Balb/C小鼠中的抗22F调理吞噬效价的条形图。 
图7用新佐剂诱导的IgG应答与用AlPO4激发的应答的比较。比较在C57B1幼龄小鼠中用以不同佐剂配制的13价缀合疫苗免疫后诱导的IgG应答的条形图。 
图8在猕猴中PhtD+dPly蛋白组合物抗19F型肺定居的保护效力。显示不同疫苗组合在猴肺炎模型中的保护效力的条形图。 
图9血清抗PhtDIgG应答。显示Balb/c小鼠中用22F-PhtD或22F-AH-PhtD缀合物免疫后的抗PhtDIgG应答的条形图。 
图10在小鼠中抗4型肺炎链球菌挑战的保护作用。在小鼠中用22F-PhtD或22F-AH-PhtD免疫后的抗4型肺炎链球菌挑战的保护作用。 
发明详述 
本发明提供含有血清型19A和19F肺炎链球菌(Streptococcus.pneumoniae)荚膜糖缀合物的免疫原性组合物，其中19A与为第一种细菌类毒素的载体蛋白缀合，19F与为第二种细菌类毒素的载体蛋白缀合。 
术语荚膜糖包括荚膜多糖和可来源于荚膜多糖的寡糖。寡糖包含至少4个糖残基。术语缀合物和缀合的涉及与载体蛋白共价键合的荚膜糖。 
就本发明而言，“免疫人类宿主以抵御COPD恶化”或“治疗或预防COPD恶化”或“减轻COPD恶化严重性”是指COPD恶化的发生率或速率下降(例如速率下降0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、20%或以上)，例如在用本发明的组合物或疫苗免疫的患者组中。 
术语细菌类毒素包括通过遗传突变、化学处理或缀合失活的细菌毒素。适宜的细菌类毒素包括破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素、细菌溶细胞素或肺炎链球菌溶血素。业已描述了降低肺炎链球菌溶血素毒性的肺炎链球菌溶血素(Ply)突变(WO90/06951、WO99/03884)。同样，知晓降低其毒性的白喉毒素遗传突变(参见下文)。白喉毒素的遗传学上的解毒类似物包括CRM197和其它突变体,参见US4,709,017、US5,843,711、US5,601,827和US5,917,017。CRM197是无毒形式的白喉毒素，但在免疫学上与白喉毒素没有区别。CRM197由不产毒噬菌体β197tox感染的白喉棒杆菌(C.diphtheriae)产生，而β197tox是通过对产毒棒状噬菌体b进行亚硝基胍诱变产生的(Uchida等,NatureNewBiology(1971)233;8-11)。CRM197蛋白与白喉毒素具有相同分子量，但由于1个碱基变化而在结构基因方面不同。这导致52位的氨基酸从甘氨酸变为谷氨酰胺，使A片段不能结合NAD，因此无毒(Pappenheimer1977,AnnRev,Biochem.46；69-94,Rappuoli AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1983年9月,560-564页)。 
第一种和第二种细菌类毒素可相同或不同。当第一种和第二种细菌类毒素不同时，意味着它们具有不同的氨基酸序列。 
例如，19A和19F可分别与破伤风类毒素和破伤风类毒素、白喉类毒素和白喉类毒素、Crm197和CRM197、肺炎链球菌溶血素和肺炎链球菌溶血素、破伤风类毒素和白喉类毒素、破伤风类毒素和CRM197、破伤风类毒素和肺炎链球菌溶血素、白喉类毒素和破伤风类毒素、白喉类毒素和CRM197、白喉类毒素和肺炎链球菌溶血素、CRM197和破伤风类毒素、CRM197和白喉类毒素、CRM197和肺炎链球菌溶血素、肺炎链球菌溶血素和破伤风类毒素、肺炎链球菌溶血 素和白喉类毒素或者肺炎链球菌溶血素和CRM197缀合。 
在一个实施方案中，除了19A和19F的肺炎链球菌糖缀合物以外，免疫原性组合物还包含肺炎链球菌荚膜糖4、6B、9V、14、18C和23F的缀合物。 
在一个实施方案中，除了19A和19F的肺炎链球菌糖缀合物以外，免疫原性组合物还包含肺炎链球菌荚膜糖1、4、5、6B、7F、9V、14、18C和23F的缀合物。 
在一个实施方案中，除了19A和19F的肺炎链球菌糖缀合物以外，免疫原性组合物还包含肺炎链球菌荚膜糖1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的缀合物。 
在一个实施方案中，除了19A和19F的肺炎链球菌糖缀合物以外，免疫原性组合物还包含肺炎链球菌荚膜糖1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的缀合物。 
在一个实施方案中，除了19A和19F的肺炎链球菌糖缀合物以外，免疫原性组合物还包含肺炎链球菌荚膜糖1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的缀合物。 
通常，本发明的肺炎链球菌疫苗含有荚膜糖抗原(任选缀合的)，其中所述糖来源于至少10种肺炎链球菌血清型。肺炎链球菌荚膜糖的数量可在10种不同血清型(或“V”，价)至23种不同血清型(23V)的范围内。在一个实施方案中，有10、11、12、13、14或15种不同血清型。在本发明的另一个实施方案中，疫苗可含有缀合的肺炎链球菌糖和未缀合的肺炎链球菌糖。任选地，糖血清型的总数少于或等于23。例如，本发明可包含10种缀合的血清型和13种未缀合的糖。以类似的方式，疫苗可分别含有11、12、13、14或16种缀合的糖以及12、11、10、9或7种未缀合的糖。 
在一个实施方案中，本发明的多价肺炎链球菌疫苗选自以下血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，但要认识到 的是，根据接受疫苗的接受者的年龄和将给予疫苗的地理位置，可以1种或2种其它血清型替代。例如，10价疫苗可含有血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的多糖。11价疫苗还可以包含血清型3的糖。12价或13价儿科(婴儿)疫苗还可以包括补加血清型6A和19A、或6A和22F、或19A和22F、或6A和15B、或19A和15B、或22F和15B的11价制剂，而13价老年疫苗可以包括补加血清型19A和22F、8和12F、或8和15B、或8和19A、或8和22F、或12F和15B、或12F和19A、或12F和22F、或15B和19A、或15B和22F的10或11价制剂。14价儿科疫苗可包括补加血清型3、6A、19A和22F；血清型6A、8、19A和22F；血清型6A、12F、19A和22F；血清型6A、15B、19A和22F；血清型3、8、19A和22F；血清型3、12F、19A和22F；血清型3、15B、19A和22F；血清型3、6A、8和22F；血清型3、6A、12F和22F；或血清型3、6A、15B和22F的上述10价制剂。 
在一个实施方案中，组合物包含来源于血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F(任选缀合的)的荚膜糖。在本发明的又一个实施方案中，包含至少11种糖抗原(任选缀合的)，例如来源于血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜糖。在本发明的又一个实施方案中，包含至少12种或13种糖抗原，例如疫苗可含有来源于血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的荚膜糖，或者来源于血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的荚膜糖，但本发明还包括其它糖抗原，例如23价(例如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。 
本发明的疫苗可含有流感嗜血菌的D蛋白(PD)(参见例如EP0594610)。流感嗜血菌是中耳炎的关键致病生物，本发明人已表明，将该蛋白纳入肺炎链球菌疫苗中将提供针对流感嗜血菌相关性中耳 炎的保护水平(参考POET出版物)。在一个实施方案中，疫苗组合物含有D蛋白。一方面，PD作为一种或多种糖的载体蛋白存在。另一方面，D蛋白可作为游离蛋白存在于疫苗组合物中。又一方面，D蛋白作为载体蛋白和游离蛋白这二者存在。D蛋白可用作全长蛋白或片段(WO0056360)。又一方面，D蛋白作为大部分糖的载体蛋白存在，例如6、7、8、9种或更多种的糖可与D蛋白缀合。在该方面，D蛋白也可作为游离蛋白存在。 
本发明的疫苗含有1种、2种或更多种不同类型的载体蛋白。每类载体蛋白均可用作1种以上的糖的载体，所述糖可为相同的或不同的。例如，血清型3和4可缀合相同载体蛋白，或者缀合同一载体蛋白分子，或者缀合相同载体蛋白的不同分子。在一个实施方案中，2种以上的不同的糖可与相同载体蛋白缀合，或者缀合同一载体蛋白分子，或者缀合相同载体蛋白的不同分子。 
除19A和19F以外存在于本发明的免疫原性组合物中的任何肺炎链球菌荚膜糖都可与独立地选自以下的载体蛋白缀合：TT、DT、CRM197、TT的片段C、PhtD、PhtBE或PhtDE融合蛋白(尤其是在WO01/98334和WO03/54007中描述的那些)、解毒的肺炎链球菌溶血素和D蛋白。以下提供了可用于本发明缀合物的蛋白载体的更完整清单。 
与本发明的免疫原性组合物中存在的缀合物中的一种或多种肺炎链球菌荚膜糖缀合的载体蛋白任选地为聚组氨酸三联体家族(Pht)蛋白成员、其片段或融合蛋白。PhtA、PhtB、PhtD或PhtE蛋白可具有与WO00/37105或WO00/39299中公开的序列(例如与WO00/37105中关于PhtD的SEQIDNO:4的氨基酸序列1-838或21-838)共有80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。例如，融合蛋白由PhtA、PhtB、PhtD、PhtE中的2、3或4种的全长或片段组成。融合蛋白的实例为PhtA/B、PhtA/D、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/D、PhtB/E、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E、PhtE/A、PhtE/B和PhtE/D， 其中所述蛋白在N末端与首先提到的连接(参见例如WO01/98334)。 
在使用Pht蛋白片段(独立的或作为融合蛋白的一部分)时，每个片段任选地含有一个或多个组氨酸三联体基序和/或这些多肽的卷曲螺旋区。组氨酸三联体基序是多肽的一部分，具有序列HxxHxH，其中H为组氨酸，x为非组氨酸的氨基酸。卷曲螺旋区是Lupus,A等,(1991)Science252；1162-1164通过“Coils”算法预测的区域。在一个实施方案中，该片段或每个片段含有一个或多个组氨酸三联体基序以及至少一个卷曲螺旋区。在一个实施方案中，该片段或每个片段含有恰好或至少2、3、4或5个组氨酸三联体基序(任选地，在2个或多个三联体之间具有天然Pht序列，或者具有三联体内序列，该三联体内序列与天然肺炎链球菌三联体内Pht序列—例如示于WO00/37105的SEQIDNO:4的三联体内PhtD序列超过50%、60%、70%、80%、90%或100%相同)。在一个实施方案中，该片段或每个片段含有恰好或至少2、3或4个卷曲螺旋区。在一个实施方案中，本文公开的Pht蛋白包括具有连接的信号序列的全长蛋白、信号肽(例如在N-末端的20个氨基酸)已被去除的成熟全长蛋白、Pht蛋白的天然变体和Pht蛋白的免疫原性片段(例如上述片段，或含有WO00/37105或WO00/39299中的氨基酸序列的至少15个或20个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够激发对WO00/37105或WO00/39299中所述氨基酸序列特异性的免疫应答)。 
具体地说，本文使用的术语“PhtD”包括具有连接的信号序列的全长蛋白、信号肽(例如在N-末端的20个氨基酸)已被去除的成熟全长蛋白、PhtD的天然变体和PhtD的免疫原性片段(例如上述片段，或含有WO00/37105或WO00/39299中的PhtD氨基酸序列的至少15个或20个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够激发对WO00/37105或WO00/39299中所述PhtD氨基酸序列(例如WO00/37105中针对PhtD的SEQIDNO:4)特异性的免疫应答)。 
如果蛋白载体与组合物中的2种以上的糖相同，则糖可与同一蛋 白载体分子缀合(载体分子具有2个以上与其缀合的不同糖)[参见例如WO04/083251]。或者，所述糖可各自独立缀合不同的蛋白载体分子(每个蛋白载体分子均仅具有1类与其缀合的糖)。 
可用于本发明的载体蛋白的实例为DT(白喉类毒素)；TT(破伤风类毒素)或TT的C片段；DTCRM197(DT突变体)，其它DT点突变，例如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等,J.Biol.Chem.218;3838-3844,1973)；CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107以及由Nicholls和Youle在GeneticallyEngineeredToxins,Frankel编辑,MaecelDekkerInc,1992中描述的其它突变；Glu-148缺失或突变为Asp、Gln或Ser，和/或Ala158缺失或突变为Gly，以及在US4709017或US4950740中公开的其它突变；Lys516、Lys526、Phe530和/或Lys534中至少一个或多个残基的突变，以及在US5917017或US6455673中公开的其它突变；或者在US5843711中公开的片段；肺炎链球菌性肺炎链球菌溶血素(Kuo等,(1995)InfectImmun63;2706-13)，包括以某些方式解毒的ply，例如dPLY-GMBS(WO04081515、PCT/EP2005/010258)或dPLY-甲醛、PhtX，包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE以及Pht蛋白的融合体，例如PhtDE融合体、PhtBE融合体(WO01/98334和WO03/54007)、(PhtA-E详述于下文)；OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白–通常由脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)血清群B提取–EP0372501)；PorB(得自脑膜炎奈瑟氏球菌)；PD(流感嗜血菌D蛋白–参见例如EP0594610B)或其免疫学功能等同物；合成肽(EP0378881、EP0427347)；热激蛋白(WO93/17712、WO94/03208)；百日咳蛋白(WO98/58668、EP0471177)；细胞因子；淋巴因子；生长因子或激素(WO91/01146)；含有来自多种病原体衍生抗原的多个人CD4+T细胞表位的人工蛋白(Falugi等,(2001)EurJImmunol31;3816-3824)，例如N19蛋白(Baraldoi等,(2004)InfectImmun72;4884-7)；肺炎链球菌表面蛋白PspA(WO02/091998)；铁吸收蛋白(WO01/72337)；艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B(WO00/61761)。 
Nurkka等,PediatricInfectiousDiseaseJournal.23(11):1008-14,2004年11月描述了所有血清型均缀合PD的11价肺炎链球菌疫苗。然而，本发明人已表明，相比于缀合PD的19F，用具有缀合DT的19F的缀合物诱导的抗体的调理吞噬活性被改善。另外，本发明人已表明，用缀合DT的19F观察到对19A的更大交叉反应性。因此，本发明组合物的特征在于血清型19F与细菌类毒素如TT、肺炎链球菌溶血素、DT或CRM197缀合。一方面，血清型19F与DT缀合。血清型19A与细菌类毒素如TT、肺炎链球菌溶血素、DT或CRM197缀合也是本发明的特征。免疫原性组合物余下的糖血清型可全部与一种或多种不是DT的载体蛋白缀合(即仅有19F缀合DT)，或者可以在不是DT和为DT自身的一种或多种载体蛋白之间分摊。在一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，所有余下的血清型缀合PD。在又一个实施方案中，19F缀合DT或CRM197，余下的血清型在PD和TT或者DT或CRM197之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，仅1种糖缀合TT。在该实施方案的一方面，所述1种糖为18C或12F。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，仅2种糖与TT缀合。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，余下的血清型在PD、TT和DT或CRM197之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，余下的血清型在PD、TT和肺炎链球菌溶血素之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，余下的血清型在PD、TT和CRM197之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，余下的血清型在PD、TT、肺炎链球菌溶血素和任选的PhtD或PhtD/E融合蛋白之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，19A与肺炎链球菌溶血素或TT缀合，余下的血清型在PD、TT、肺炎链球菌溶血素和任选的PhtD或PhtD/E融合蛋白之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，19A与肺炎链球菌溶血素或TT缀合，还有1种糖缀合TT，还有1种糖缀合PhtD或PhtD/E， 所有其余的糖缀合PD。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，19A与肺炎链球菌溶血素缀合，还有1种糖缀合TT，还有1种糖缀合肺炎链球菌溶血素，还有2种糖缀合PhtD或PhtD/E，所有其余的糖缀合PD。 
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有来自流感嗜血菌的D蛋白。在该实施方案中，如果PD不是其中一种用于缀合非19F的任何糖的载体蛋白，例如19F与DT缀合，而其它血清型与一种或多种不是PD的不同载体蛋白缀合，那么PD将在疫苗组合物中作为游离蛋白存在。如果PD是其中一种用于缀合非19F的糖的载体蛋白，则PD可任选地作为游离蛋白存在于疫苗组合物中。 
术语“糖”在整个本说明书中可指示多糖或寡糖，并包括这二者。多糖分离自细菌，并可以在某种程度上通过已知方法(参见例如EP497524和EP497525)并任选地通过微流化调整大小。可对多糖调整大小，以便降低多糖样品的粘度和/或改善缀合产物的过滤性。寡糖具有少量重复单元(通常5-30个重复单元)，并通常为水解的多糖。 
肺炎链球菌的荚膜多糖包含可含有达8个糖残基的重复寡糖单元。关于关键肺炎链球菌血清型的寡糖单元的综述，参见JONES,Christopher.Vaccinebasedonthecellsurfacecarbohydratesof pathogenicbacteria.An.Acad.Bras.Ciênc.,2005年6月,第77卷,第2册,293-324页,ISSN0001-3765。在一个实施方案中，荚膜糖抗原可为全长多糖，但是在其它实施方案中其可为一个寡糖单元，或者比重复寡糖单元的天然长度的糖链短。在一个实施方案中，疫苗中存在的所有糖都是多糖。全长多糖可被“调整大小”，即它们的大小可通过多种方法降低，例如酸解处理；过氧化氢处理；通过
Figure BDA00002978220800111
调整大小，然后经过氧化氢处理，以产生寡糖片段；或者微流化。 
本发明人还注意到，本技术的核心是使用易于生产缀合物的寡糖。本发明人已发现，通过使用天然的或稍微调整大小的多糖缀合物，可实现一个或多个以下优势：1)具有高免疫原性的可过滤的缀合物， 2)可改变缀合物中多糖对蛋白的比率，使得缀合物中多糖对蛋白的比率(重量/重量)可被增加(其可对载体抑制作用有影响)，3)倾向于水解的免疫原性缀合物可通过使用较大的糖进行缀合来稳定。使用较大的多糖可导致与缀合物载体更加交联，并可以减少由缀合物释放游离的糖。在先有技术中描述的缀合疫苗倾向于在缀合前解聚多糖，以便改善缀合。本发明人已发现，保留较大尺寸糖的糖缀合疫苗可提供抵御肺炎链球菌疾病的良好免疫应答。 
本发明的免疫原性组合物因此可以包含一种或多种糖缀合物，其中在缀合前每种糖的平均尺寸(重均分子量；Mw)在80kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa或1000kDa以上。在一个实施方案中，缀合后的缀合物应可容易地通过0.2μm滤器过滤，使得与过滤前样品相比在过滤后获得50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的产量。 
就本发明而言，“天然的多糖”是指未经处理的多糖，处理的目的是减小糖的尺寸。在常规纯化工艺中多糖的尺寸可被轻微减少。这样的糖仍是天然的。只要多糖经过调整大小的工艺，该多糖就不被认为是天然多糖。 
就本发明而言，“以达到x2的因数调整大小”是指糖经过处理，目的是降低糖大小，但仍保留超过天然多糖大小的一半的大小。x3、x4等等以相同的方式解释，即对糖进行处理，以减少多糖的大小，但仍保留天然多糖大小的1/3、1/4等等以上的大小。 
在本发明的一方面，免疫原性组合物包含至少10种血清型的缀合载体蛋白的肺炎链球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或每种肺炎链球菌糖为天然多糖。 
在本发明的一方面，免疫原性组合物包含来自至少10种血清型的缀合载体蛋白的肺炎链球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或每种肺炎链球菌糖被达到x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因数调整大小。在该方面的一个实施方案中，大部分糖，例如 6、7、8种或更多种的糖被达到x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因数调整大小。 
糖的分子量或平均分子量在本文是指在缀合前检测的糖的重均分子量(Mw)，通过MALLS来检测。 
MALLS技术在本领域众所周知，通常如实施例2所述进行。就肺炎链球菌糖的MALLS分析而言，可组合使用两种柱子(TSKG6000和5000PWxl)，并用水洗脱糖。用光散射检测器(例如配有10mW488nm氩激光器的WyattDawnDSP)和干涉仪折射计(例如装备P100光电元件和498nm红光过滤的WyattOtilabDSP)检测糖。 
在一个实施方案中，肺炎链球菌糖为天然多糖，或者为在常规提取步骤中己经减小了尺寸的天然多糖。 
在一个实施方案中，通过机械裂解，例如通过微流化或超声，调整肺炎链球菌糖的大小。微流化和超声具有充分减小较大天然多糖大小从而提供可过滤缀合物的优点。调整大小以不超过x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3或x2的因数进行。 
在一个实施方案中，免疫原性组合物包含肺炎链球菌缀合物，该缀合物由天然多糖和以不超过x20的因数调整大小的糖的混合物制备。在该实施方案的一个方面，大部分糖，例如6、7、8种或更多种糖以达到x2、x3、x4、x5或x6的因数调整大小。 
在一个实施方案中，肺炎链球菌糖通过接头如双功能接头与载体蛋白缀合。任选地，接头为异双功能或同双功能接头，具有例如1个反应性氨基和1个反应性羧基、2个反应性氨基或者2个反应性羧基。例如，接头具有4-20、4-12、5-10个碳原子。可能的接头是ADH。其它接头包括B-丙酰胺基(WO00/10599)、硝基苯-乙胺(Gever等,(1979)Med.Microbiol.Immunol.165；171-288)、卤代烷基卤(US4057685)、糖苷键(US4673574、US4808700)、己烷二胺和6-氨基己酸(US4459286)。在一个实施方案中，ADH用作缀合血清型18C的糖的接头。 
在本发明的免疫原性组合物中存在的糖缀合物可用任何己知的偶联技术制备。缀合方法可依赖于用四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶
Figure BDA00002978220800141
(CDAP)活化糖而形成氰酸酯。由此，活化的糖可直接或经由间隔臂(接头)基团偶联至载体蛋白上的氨基。例如，间隔臂可以是胱胺或半胱胺，以得到硫醇化多糖，硫醇化多糖可经由与马来酰亚胺活化的载体蛋白(例如使用GMBS)或卤乙酰载体蛋白(例如使用碘乙酰亚胺[例如乙基碘乙酰亚胺HCl]或N-琥珀酰亚胺基溴乙酸盐或SIAB、或SIA、或SBAP)反应后所获得的硫醚键与载体偶联。任选地，氰酸酯(任选地以CDAP化学法制备)可与己二胺或ADH偶联，并采用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学法经蛋白载体上的羧基使氨基衍生化的糖与载体蛋白缀合。这样的缀合物描述于PCT公开申请WO93/15760(UniformedServicesUniversity)以及WO95/08348和WO96/29094。 
其它的合适技术使用碳二亚胺、碳亚胺、酰肼、活化酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。许多都描述于WO98/42721。缀合可涉及羰基接头，其可如下形成：糖的游离羟基先与CDI反应(Bethell等,J.Biol.Chem.1979,254；2572-4,Hearn等,J.Chromatogr.1981.218；509-18)，再与蛋白反应，形成氨基甲酸酯键。该过程可涉及异头末端还原成伯羟基，任选地，涉及伯羟基与CDI反应的伯羟基的保护/去保护，以形成CDI氨基甲酸酯中间体，并将CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白的氨基偶联。 
缀合物也可通过如US4365170(Jennings)和US4673574(Anderson)所述的直接还原胺化法制备。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508。 
进一步的方法涉及通过碳二亚胺缩合(ChuC.等,Infect.Immunity,1983245256)，例如使用EDAC，将溴化氰(或CDAP)活化的、被己二酰肼(ADH)衍生化的糖与蛋白载体偶联。 
在一个实施方案中，糖上的羟基(任选活化的羟基，例如被活化以制备氰酸酯的羟基(例如使用CDAP))直接或间接(通过接头)与蛋白 的氨基或羧基连接。当存在接头时，糖上的羟基任选地与接头上的氨基连接，例如通过使用CDAP缀合。接头如ADH中的其余氨基可缀合蛋白上的羧酸基团，例如通过使用碳二亚胺化学，例如通过使用EDAC。在一个实施方案中，肺炎链球菌荚膜糖在接头与载体蛋白缀合之前先与接头缀合。或者，接头可在与糖缀合之前与载体缀合。 
还可以使用技术组合，一些糖-蛋白缀合物通过CDAP制备，一些通过还原胺化法制备。 
通常，蛋白载体上可用于偶联/缀合的化学基团的类型如下： 
A)羧基(例如经天冬氨酸或谷氨酸)。在一个实施方案中，该基团直接与糖上的氨基连接，或者用碳二亚胺化学(例如用EDAC)与接头上的氨基连接。 
B)氨基(例如经由赖氨酸)。在一个实施方案中，该基团直接与糖上的羧基连接，或者用碳二亚胺化学(例如用EDAC)与接头上的羧基连接。在另一个实施方案中，该基团直接与糖上用CDAP或CNBr活化的羟基连接，或者与接头上的这些基团连接；与具有醛基的糖或接头连接；与具有琥珀酰亚胺酯基团的糖或接头连接。 
C)巯基(例如经由半胱氨酸)。在一个实施方案中，该基团与溴乙酰糖或氯乙酰糖连接，或者用马来酰亚胺化学与接头连接。在一个实施方案中，该基团用双二重氮联苯胺活化/改性。 
D)羟基(例如经由酪氨酸)。在一个实施方案中，该基团用双二重氮联苯胺活化/改性。 
E)咪唑基(例如经由组氨酸)。在一个实施方案中，该基团用双二重氮联苯胺活化/改性。 
F)胍基(例如经由精氨酸)。 
G)吲哚基(例如经由色氨酸)。 
在糖上，能够用于偶联的通常是以下基团：OH、COOH或NH2。醛基能够在本领域已知的不同处理后产生，所述处理例如：高碘酸盐、酸解、过氧化氢等。 
直接偶联法： 
糖-OH＋CNBr或CDAP----->氰酸酯＋NH2-Prot---->缀合物 
糖-醛＋NH2-Prot---->席夫碱＋NaCNBH3---->缀合物 
糖-COOH＋NH2-Prot＋EDAC---->缀合物 
糖-NH2＋COOH-Prot＋EDAC---->缀合物 
通过间隔臂(接头)间接偶联的方法： 
糖-OH＋CNBr或CDAP--->氰酸酯＋NH2----NH2---->糖----NH2＋COOH-Prot＋EDAC----->缀合物 
糖-OH＋CNBr或CDAP---->氰酸酯＋NH2-----SH----->糖----SH＋SH-Prot(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或是通过例如SPDP将蛋白的氨基改性后获得的)----->糖-S-S-Prot 
糖-OH＋CNBr或CDAP--->氰酸酯＋NH2----SH------->糖----SH＋马来酰亚胺-Prot(氨基的改性物)---->缀合物 
糖-OH＋CNBr或CDAP--->氰酸酯＋NH2-----SH--->糖-SH＋卤代乙酰胺-Prot---->缀合物 
糖-COOH＋EDAC＋NH2-----NH2--->糖------NH2＋EDAC＋COOH-Prot---->缀合物 
糖-COOH＋EDAC＋NH2----SH----->糖----SH＋SH-Prot(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或是通过例如SPDP将蛋白的氨基改性后获得的)----->糖-S-S-Prot 
糖-COOH＋EDAC＋NH2----SH----->糖----SH＋马来酰亚胺-Prot(氨基的改性物)---->缀合物 
糖-COOH＋EDAC＋NH2----SH--->糖-SH＋卤代乙酰胺-Prot---->缀合物 
糖-醛＋NH2-----NH2--->糖------NH2＋EDAC＋COOH-Prot---->缀合物 
注意：除了以上的EDAC，还可以使用任何合适的碳二亚胺。 
总之，通常可以用于与糖偶合的蛋白载体化学基团的类型是氨基(例如赖氨酸残基上的)、COOH基团(例如天冬氨酸和谷氨酸残基上的)和SH基团(如果能够获得的话)(例如半胱氨酸残基上的)。 
任选地，载体蛋白对肺炎链球菌糖的比率在1:5至5:1(重量/重量)之间；1:2至2.5:1(重量/重量)之间；1:1至2:1(重量/重量)之间。在一个实施方案中，大部分缀合物，例如6、7、8、9种或更多种缀合物，具有大于1:1的载体蛋白对糖的比率，例如1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1或1.6:1。 
在一个实施方案中，使用CDAP和EDAC使至少一种肺炎链球菌糖经接头与载体蛋白缀合。例如，可使用如上所述的CDAP和EDAC使18C经接头(例如在其末端具有两个酰肼基团的那些接头，例如ADH)与蛋白缀合。在使用接头时，CDAP可用于使糖与接头缀合，然后可使用EDAC使接头与蛋白缀合，或者可首先使用EDAC使接头与蛋白缀合，此后可使用CDAP使接头与糖缀合。 
通常，本发明的免疫原性组合物可含有在0.1-20μg、1-10μg或1-3μg糖之间的每种糖缀合物的剂量。 
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有为0.1-20μg、0.5-10μg、0.5-5μg或1-3μg糖剂量的每种肺炎链球菌荚膜糖。在一个实施方案中，荚膜糖可以不同剂量存在，例如某些荚膜糖可以恰好1μg的剂量存在，或者某些荚膜糖可以恰好3μg的剂量存在。在一个实施方案中，血清型3、18C和19F(或者4、18C和19F)的糖以高于其它糖的剂量存在。在该实施方案的一个方面，血清型3、18C和19F(或4、18C和19F)以近似或恰好3μg的剂量存在，而免疫原性组合物中的其它糖以近似或恰好1μg的剂量存在。 
“约”或“近似”就本发明而言被定义为在给定值的10%左右。 
在一个实施方案中，至少一种肺炎链球菌荚膜糖与载体蛋白直接缀合。任选地，至少一种肺炎链球菌荚膜糖通过CDAP直接缀合。在 一个实施方案中，大部分荚膜糖，例如5、6、7、8、9种或更多种，通过CDAP与载体蛋白连接(参见WO95/08348和WO96/29094)。 
免疫原性组合物可包含肺炎链球菌蛋白，本文称为本发明的肺炎链球菌蛋白。这些蛋白可用作载体蛋白，或者可作为游离蛋白存在，或者可作为载体蛋白和游离蛋白这二者存在。本发明的肺炎链球菌蛋白或者为表面暴露的，至少在肺炎链球菌部分生命周期当中，或者为由肺炎链球菌分泌或释放的蛋白。任选地，本发明的蛋白选自以下类别，例如具有LXXC的Ⅱ型信号序列基序的蛋白(其中X为任何氨基酸，例如聚组氨酸三联体家族(PhtX))、胆碱结合蛋白(CbpX)、具有Ⅰ型信号序列基序的蛋白(例如Sp101)、具有LPXTG基序的蛋白(其中X为任何氨基酸，例如Sp128、Sp130)和毒素(例如Ply)。这些类别(或基序)中的实例为以下蛋白或其免疫学功能等效物。 
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有至少一种蛋白，所述蛋白选自：聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合体)。肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133。在又一个实施方案中，免疫原性组合物含有2种或多种蛋白，所述蛋白选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合体)、肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和Sp128。在又一个实施方案中，免疫原性组合物含有2种或多种蛋白，所述蛋白选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合体)、肺炎链球菌溶血素(Ply)和Sp128。 
Pht(聚组氨酸三联体)家族包括蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。该家族具有以下特征：脂质化序列；由脯氨酸富集区和几个组氨酸三联体分隔开的两个结构域，可能涉及金属或核苷的结合或酶活性；(3-5) 卷曲螺旋区；保守的N-末端和异源的C末端。它存在于已检验的所有肺炎链球菌菌株中。同源蛋白已在其它链球菌和奈瑟氏球菌属中发现。在本发明的一个实施方案中，本发明的Pht蛋白为PhtD。然而，要理解的是，术语PhtA、B、D和E是指具有在以下引用文献中公开的序列的蛋白，以及其天然(和人工制备的)变体，所述变体与参比蛋白具有至少90%的序列同源性。任选地为至少95%相同或至少97%相同。 
对于PhtX蛋白而言，PhtA在WO98/18930中公开，也称作Sp36。如上所述，其是聚组氨酸三联体家族蛋白，并具有Ⅱ型信号基序LXXC。PhtD在WO00/37105中公开，也称为Sp036D。如上所述，它也是聚组氨酸三联体家族蛋白，并具有Ⅱ型LXXC信号基序。PhtB在WO00/37105中公开，也称为Sp036B。PhtB家族的另一成员是C3-降解多肽，在WO00/17370中公开。该蛋白也来自聚组氨酸三联体家族(triadfamily)，并具有Ⅱ型LXXC信号基序。例如，免疫功能等效物为在WO98/18930中公开的蛋白Sp42。PhtB截短物(约79kD)在WO99/15675中公开，它也被认为是PhtX家族成员。PhtE在WO00/30299中公开，称作BVH-3。当本文提到任何Pht蛋白时，意味着可使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。例如，提到的PhtX包括来自任何Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。提到PhtD或PhtB也就提到了可见于例如WO0198334的PhtDE或PhtBE。 
肺炎链球菌溶血素是一种具有独特的溶细胞(溶血)作用和补体活化活性的多功能毒素(Rubins等,Am.Respi.CitCareMed,153:1339-1346(1996))。该毒素不由肺炎链球菌分泌，而是在肺炎链球菌于自溶素影响下裂解时释放。其作用包括例如：刺激人体单核细胞产生炎性细胞因子，抑制人体呼吸上皮纤毛颤动，降低嗜中性粒细胞的杀菌活性和迁移性。肺炎链球菌溶血素最明显的作用在于红细胞裂解方面，该作用涉及与胆固醇结合。因为肺炎链球菌溶血素是一种毒素，因此在其可以体内给药前必须脱毒(即以适于保护的剂量提供时对人 无毒)。在本领域已知野生型或天然肺炎链球菌溶血素的表达和克隆。参见例如Walker等(InfectImmun,55:1184-1189(1987))，Mitchell等(BiochimBiophysActa,1007:67-72(1989)和Mitchell等(NAR,18:4010(1990))。Ply的脱毒可以用化学方法进行，例如进行福尔马林或戊二醛处理或二者的组合(WO04081515，PCT/EP2005/010258)。这些方法在本领域众所周知用于多种毒素。或者，ply可以用基因方法脱毒。因此，本发明包括肺炎链球菌蛋白衍生物，该衍生物可为例如突变蛋白。术语“突变的”在本文用于指已使用公知的定点诱变技术或任何其它常规方法缺失、增加或取代一个或多个氨基酸的分子。例如：如上所述，突变型ply蛋白可以被改变，以使其生物失活，但仍保持其致免疫表位，参见例如WO90/06951，Berry等,(InfectImmun,67:981-985(1999))和WO99/03884。 
要理解的是，此处所用的术语“Ply”是指适于医用的突变或脱毒的(即无毒的)肺炎链球菌溶血素。 
关于胆碱结合蛋白家族(CbpX)，该家族的成员最初被鉴定为能用胆碱亲和层析纯化的肺炎链球菌蛋白。所有胆碱结合蛋白都非共价结合于细胞壁磷壁酸和膜结合脂磷壁酸的磷酸胆碱部分。虽然该蛋白质的确切性质(氨基酸序列、长度等)可以不同，但整个家族具有数个在结构上相同的区域。一般来说，胆碱结合蛋白包含N末端区(N)、保守重复区(R1和/或R2)、脯氨酸富集区(P)和保守的胆碱结合区(C)，该胆碱结合区由多个重复序列组成，约占该蛋白的一半。本申请中所用的术语“胆碱结合蛋白家族(CbpX)”选自WO97/41151中所鉴定的胆碱结合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA公开于WO97/41151，CbpD和CbpG公开于WO00/29434，PspC公开于WO97/09994，PbcA公开于WO98/21337。SpsA为WO98/39450中公开的胆碱结合蛋白。该胆碱结合蛋白任选地选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。 
本发明的一个实施方案包括CbpX截短物，其中“CbpX”在上文 定义，“截短物”指缺少50%或更多的胆碱结合区(C)的CbpX蛋白。任选地，这样的蛋白质没有整个胆碱结合区。任选地，这样的蛋白截短物没有(i)胆碱结合区和(ii)该蛋白质的N末端一半的一部分，但至少保留一个重复区(R1或R2)。任选地，该截短物具有两个重复区(R1和R2)。这些实施方案的实例是在WO99/51266或WO99/51188中举例说明的NR1xR2和R1xR2，但是，其它没有相似的胆碱结合区的胆碱结合蛋白也包含在本发明的范围内。 
LytX家族是与细胞裂解有关的膜结合蛋白。N末端结构域包含胆碱结合域，但是，LytX家族并不具有在上述CbpA家族中发现的所有特征，因此，对于本发明来说，LytX家族被认为不同于CbpX家族。与CbpX家族相比，LytX的C末端结构域包含LytX蛋白家族的催化域。该家族包含LytA、B和C。对于LytX家族而言，LytA公开于Ronda等,EurJBiochem,164:621-624(1987)。LytB公开于WO98/18930，也被称为Sp46。LytC也公开于WO98/18930，也被称为Sp91。本发明的实施方案包含LytC。 
另一个实施方案包含LytX截短物，其中“LytX”在上文定义，“截短物”指没有50%或更多胆碱结合区的LytX蛋白。任选地，这样的蛋白质没有整个胆碱结合区。本发明的又一个实施方案包含CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合体)。任选地，该蛋白包含CbpX的NR1xR2(或R1xR2)和LytX的C末端部分(Cterm,即没有胆碱结合域)(例如LytCCterm或Sp91Cterm)。任选地，CbpX选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。任选地其为CbpA。任选地Lytx为LytC(也被称为Sp91)。本发明的另一个实施方案为PspA或PsaA截短物，其没有胆碱结合域(C)，并与LytX一起表达为融合蛋白。任选地，LytX为LytC。 
PsaA和PspA这二者在本领域都是已知的。例如，Berry和Paton,InfectImmun1996年12月；64(12):5255-62已描述了PsaA和其跨膜缺失变体。例如US5804193、WO92/14488和WO99/53940公开了 PspA和其跨膜缺失变体。 
Sp128和Sp130公开于WO00/76540。Sp125是带有细胞壁锚定基序LPXTG(其中X为任何氨基酸)的肺炎链球菌表面蛋白的实例。具有此基序的这类肺炎链球菌表面蛋白中的任何蛋白在本发明范围内都已被发现是有用的，因此将其视为本发明的另一种蛋白。Sp125本身公开于WO98/18930，也称为ZmpB-锌金属蛋白酶。Sp101公开于WO98/06734(其中它的索引为#y85993)。其特征为Ⅰ型信号序列。Sp133公开于WO98/06734(其中它的索引为#y85992)。其也以Ⅰ型信号序列为特征。 
可包含在联合疫苗(尤其是用于预防中耳炎的联合疫苗)中的卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)蛋白抗原的实例为：OMP106[WO97/41731(Antex)和WO96/34960(PMC)]；OMP21或其片段(WO0018910)；LbpA和/或LbpB[WO98/55606(PMC)]；TbpA和/或TbpB[WO97/13785和WO97/32980(PMC)]；CopB[HelminenME等,(1993)Infect.Immun.61:2003-2010]；UspA1和/或UspA2[WO93/03761(德克萨斯大学)]；OmpCD；HasR(PCT/EP99/03824)；PilQ(PCT/EP99/03823)；OMP85(PCT/EP00/01468)；lipo06(GB9917977.2)；lipo10(GB9918208.1)；lipo11(GB9918302.2)；lipo18(GB9918038.2)；P6(PCT/EP99/03038)；D15(PCT/EP99/03822)；OmplA1(PCT/EP99/06781)；Hly3(PCT/EP99/03257)；和OmpE。可包含在联合疫苗(尤其是用于预防中耳炎的联合疫苗)中的不可分型流感嗜血菌抗原或其片段的实例包括：丝束蛋白[(US5766608-俄亥俄州研究基金会)]和含有来自其的肽的融合体[例如LB1(f)肽融合体；US5843464(OSU)或WO99/64067]；OMP26[WO97/01638(Cortecs)]；P6[EP281673(纽约州立大学)]；TbpA和/或TbpB；Hia；Hsf；Hin47；Hif；Hmw1；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15(WO94/12641)；P2；和P5(WO94/26304)。 
本发明的蛋白也可以进行有益的组合。所述组合的是指免疫原性 组合物包含来自以下组合中的所有蛋白，其或者为载体蛋白，或者为游离蛋白，或者为二者的混合物。例如，在后文陈述的两种蛋白的组合中，两种蛋白都可以用作载体蛋白，或者两种蛋白都可以作为游离蛋白存在，或者两种蛋白都可以作为载体蛋白和游离蛋白存在，或者一个可作为载体蛋白和游离蛋白存在，而另一个仅作为载体蛋白或仅作为游离蛋白存在。当给出3种蛋白的组合时，存在类似的可能性。组合包括但不限于：PhtD＋NR1xR2、PhtD＋NR1xR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白、PhtD＋Ply、PhtD＋Sp128、PhtD＋PsaA、PhtD＋PspA、PhtA＋NR1xR2、PhtA＋NR1xR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白、PhtA＋Ply、PhtA＋Sp128、PhtA＋PsaA、PhtA＋PspA、NR1xR2＋LytC、NR1xR2＋PspA、NR1xR2＋PsaA、NR1xR2＋Sp128、R1xR2＋LytC、R1xR2＋PspA、R1xR2＋PsaA、R1xR2＋Sp128、R1xR2＋PhtD、R1xR2＋PhtA。任选地，NR1xR2(或R1xR2)来自CbpA或PspC。任选地，其来自CbpA。其它组合包括3种蛋白组合，例如PhtD＋NR1xR2＋Ply以及PhtA＋NR1xR2＋PhtD。在一个实施方案中，疫苗组合物包含解毒的肺炎链球菌溶血素以及PhtD或PhtDE作为载体蛋白。在又一个实施方案中，疫苗组合物包含解毒的肺炎链球菌溶血素以及PhtD或PhtDE作为游离蛋白。 
在一个独立方面，本发明提供包含至少4种肺炎链球菌荚膜糖缀合物的免疫原性组合物，所述缀合物含有不同肺炎链球菌血清型的糖，其中至少一种糖与PhtD或其融合蛋白缀合，免疫原性组合物能够激发抗PhtD的有效免疫应答。 
例如通过保护测定，如在实施例15中描述的测定，检测抗PhtD或其融合蛋白的有效免疫应答。有效的免疫应答在用异源菌株挑战后7天提供至少40%、50%、60%、70%、80%或90%的存活。假定挑战菌株是异源的，则提供的保护归因于抗PhtD或其融合蛋白的免疫应答。 
或者，抗PhtD的有效免疫应答通过如在实施例14中描述的 ELISA检测。有效的免疫应答产生的抗PhtDIgG应答至少为250、300、350、400、500、550或600μg/mlGMC。 
例如，免疫原性组合物包含来自不同血清型的缀合PhtD或其融合蛋白的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种肺炎链球菌荚膜糖。例如，血清型22F和另外选自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、23F和33F的1、2、3、4、5、6或7种缀合PhtD。在一个实施方案中，血清型3、6A和22F中的2种或3种与PhtD或其融合蛋白缀合。 
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种经接头(例如ADH)与PhtD或其融合蛋白缀合的肺炎链球菌荚膜糖。在一个实施方案中，使用以下列出的其中一种缀合化学物质。 
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种缀合PhtD或其融合蛋白的肺炎链球菌荚膜糖，其中缀合物中PhtD对糖的比率在6:1至1:5、6:1至2:1、6:1至2.5:1、6:1至3:1、6:1至3.5:1(重量/重量)之间，或者大于2.0:1、2.5:1、3.0:1、3.5:1或4.0:1(重量/重量)(即包含较大比例的PhtD)。 
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含肺炎链球菌溶血素。 
本发明还提供含有本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂的疫苗。 
本发明的疫苗可被佐剂化，尤其是在计划用于老年人群而且用于婴儿人群时。适宜的佐剂包括铝盐，例如氢氧化铝凝胶或磷酸铝或明矾，而且可以为其它金属盐，例如钙盐、镁盐、铁盐或锌盐，或者可为酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生化糖或聚磷腈的不溶性混悬液。 
任选地选择为TH1型应答的优先诱导物的佐剂。这些高水平的Th1型细胞因子倾向于支持诱导针对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的Th2型细胞因子倾向于支持诱导针对抗原的体液免疫 应答。 
Th1和Th2型免疫应答的区别不是绝对的。实际上，个体将支持被描述为以Th1为主或以Th2为主的免疫应答。然而，经常便利地根据Mosmann和Coffman在鼠CD4+veT细胞克隆中所描述的(Mosmann,T.R.和Coffman,R.L.(1989)TH1andTH2cells:different patternsoflymphokinesecretionleadtodifferentfunctionalproperties.(AnnualReviewofImmunology,7,145-173页)考虑细胞因子家族。传统上，Th1型应答与T淋巴细胞生产INF-γ和IL-2细胞因子有关。经常与Th1型免疫应答的诱导直接相关的其它细胞因子不由T细胞产生，例如IL-12。相比之下，Th2型应答与Il-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有关。主要促进Th1应答的适宜佐剂系统包括：单磷酰脂质A或其衍生物(或通常为解毒的脂质A–参见例如WO2005107798)，尤其是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)(关于其制备参见GB2220211A)；以及单磷酰脂质A、任选的3-脱-O-酰化单磷酰脂质A连同铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)或水包油乳剂的组合。在这些组合中，抗原和3D-MPL包含在相同的颗粒结构中，允许更有效地传递抗原性和免疫刺激性信号。研究表明，3D-MPL能够进一步增强明矾吸附抗原的免疫原性[Thoelen等,Vaccine(1998)16:708-14；EP689454-B1]。 
增强的系统包括单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，尤其是如在WO94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或者如在WO96/33739中公开的较少反应原性的组合物，其中QS21用胆固醇猝灭。在WO95/17210中描述了一种特别有效的佐剂制剂，其包含在水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚。在一个实施方案中，免疫原性组合物另外含有皂苷，其可为QS21。制剂还可以包含水包油乳剂和生育酚(WO95/17210)。含有寡核苷酸的未甲基化CpG(WO96/02555)和其它免疫调节性寡核苷酸(WO0226757和WO03507822)也是TH1应答的优先诱导物，适用于本发明。 
具体的佐剂选自：金属盐、水包油乳剂、Toll样受体激动剂(尤其 是Toll样受体2激动剂、Toll样受体3激动剂、Toll样受体4激动剂、Toll样受体7激动剂、Toll样受体8激动剂和Toll样受体9激动剂)、皂苷或其组合。 
可用于本发明的疫苗组合物的佐剂为革兰氏阴性细菌菌株的小泡或外膜囊泡制备物，例如由WO02/09746教导的那些—尤其是脑膜炎奈瑟氏球菌小泡。小泡的佐剂特性可通过在其表面上保留LOS(脂多糖)(例如通过用低浓度去污剂[例如0-0.1%脱氧胆酸盐]提取)而改善。LOS可通过WO02/09746所论述的msbB(-)或htrB(-)突变解毒。佐剂特性还可以通过保留脑膜炎球菌小泡的PorB(和任选地去除PorA)而改善。佐剂特性还可以通过截短脑膜炎球菌小泡上的LOS的外核糖结构而改善–例如经由WO2004/014417所论述的lgtB(-)突变。或者，前述LOS(例如分离自msbB(-)和/或lgtB(-)菌株)可被纯化并用作本发明组合物中的佐剂。 
可用于本发明组合物的其它佐剂可选自：皂苷、脂质A或其衍生物、免疫刺激性寡核苷酸、烷基氨基葡糖苷磷酸酯、水包油乳剂或其组合。可用于本发明组合物的其它佐剂为与另一种佐剂组合的金属盐。在一个实施方案中，佐剂为Toll样受体激动剂，尤其是Toll样受体2、3、4、7、8或9的激动剂，或皂苷，尤其是Qs21。在一个实施方案中，佐剂系统包括前面所列的两种或多种佐剂。具体而言，组合任选地包含皂苷(尤其是Qs21)佐剂和/或Toll样受体9激动剂，例如含有CpG的免疫刺激性寡核苷酸。其它组合包含皂苷(尤其是QS21)和Toll样受体4激动剂，例如单磷酰脂质A或其3脱酰衍生物3D-MPL，或皂苷(尤其是QS21)和Toll样受体4配体，例如烷基氨基葡糖苷磷酸酯。 
在一个实施方案中，佐剂为3D-MPL和QS21的组合(EP0671948B1)、含有3D-MPL和QS21的水包油乳剂(WO95/17210、WO98/56414)或者与其它载体一起配制的3D-MPL(EP0689454B1)。在一个实施方案中，佐剂系统包含如在US6558670、US6544518中描述的3DMPL、 QS21和CpG寡核苷酸的组合。 
在一个实施方案中，佐剂为Toll样受体(TLR)4配体，任选地为激动剂，例如脂质A衍生物，尤其是单磷酰脂质A，或者更具体地说为3脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。 
3D-MPL可得自北美葛兰素史克生物制品公司(GlaxoSmithKline BiologicalsNorthAmerica)，主要促进具有IFN-g(Th1)表型的CD4+T细胞反应。其可依据GB2220211A中公开的方法生产。在化学上，3D-MPL是具有3、4、5或6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。在一个实施方案中，本发明的组合物使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL的粒径使得其可通过0.22μm滤器除菌过滤。在国际专利申请号WO94/21292中描述了这些制备物。脂质A的合成衍生物是已知的，并被认为是TLR4激动剂，其包括但不限于： 
OM174(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二酰氧十四酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基二氢磷酸酯)，(WO95/14026) 
OM294DP(3S,9R)-3-[(R)-十二酰氧十四酰基氨基]-4-氧-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]癸-1,10-二醇,1,10-双(二氢磷酸酯)，(WO99/64301和WO00/0462) 
OM197MP-AcDP(3S-,9R)-3-[(R)-十二酰氧十四酰基氨基]-4-氧-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]癸-1,10-二醇,1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(WO01/46127) 
其它可用的TLR4配体是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)，如在WO9850399或US6303347中公开的那些(还公开了用于制备AGP的方法)，或如在US6764840中所公开的AGP的药学上可接受的盐。有些AGP是TLR4激动剂，而有些是TLR4拮抗剂。两者都被认为可用作佐剂。 
另一个用于本发明的免疫刺激剂是QuilA及其衍生物。QuilA是从南美奎拉雅属皂树(QuilajaSaponariaMolina)中分离出来的皂苷制 剂，并且由Dalsgaard等在1974年首次描述为具有佐剂活性(“Saponin adjuvants”,Archiv.fürdiegesamteVirusforschung,44卷,Springer Verlag,Berlin,243-254页)。通过HPLC已经分离了QuilA的纯化片段，其保留了佐剂活性，没有与QuilA相关的毒性(EP0362278)，例如QS7和QS21(也称为QA7和QA21)。QS-21是来源于奎拉雅属皂树树皮的天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)、Th1细胞和主要的IgG2a抗体反应，在本发明背景下为优选皂苷。 
已经描述了为本发明实施方案的具体QS21制剂，这些制剂还包括固醇(WO96/33739)。本发明的皂苷形成部分可以是独立的胶束形式、混合的胶束(任选地具有胆汁盐)形式，或者当用胆固醇和脂质制备时可以是ISCOM基质(EP0109942B1)、脂质体或相关胶体结构的形式，如似螺旋形或环形多聚体复合物或者油脂/分层的结构和薄片，或者是水包油乳剂形式(例如WO95/17210)。皂苷可与金属盐结合，诸如氢氧化铝或磷酸铝(WO98/15287)。 
任选地，皂苷以脂质体、ISCOM或水包油乳剂的形式存在。 
增强的系统包括单磷酰脂质A(或解毒的脂质A)和皂苷衍生物的的组合，尤其是如在WO94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或如在WO96/33739中公开的其中QS21用胆固醇猝灭的较少反应原性的组合物。在WO95/17210中描述了一种特别有效的佐剂制剂，其在水包油乳剂中包含生育酚，有或没有QS21和/或3D-MPL。在一个实施方案中，免疫原性组合物另外含有皂苷，其可为QS21。 
还可以使用免疫刺激性寡核苷酸或任何其它的Toll样受体(TLR)9激动剂．用于本发明佐剂或疫苗的寡核苷酸任选地为包含CpG的寡核苷酸，任选地包含两个或更多个二核苷酸CpG基序，这些基序由至少三个、任选地至少六个或更多个核苷酸分隔。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后接鸟嘌呤核苷酸。本发明的CpG寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在一个实施方案中，寡核苷酸内核苷酸间是二硫代磷酸酯键或硫代磷酸酯键，但磷酸二酯键和其它核苷酸间键也在本发明范围内。还包括 在本发明范围内的是具有混合的核苷酸间键的寡核苷酸。用于生产硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204。 
寡核苷酸的实例具有以下序列。这些序列任选地包含硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键。 
OLIGO1(SEQIDNO:1)：TCCATGACGTTCCTGACGTT(CpG1826) 
OLIGO2(SEQIDNO:2)：TCTCCCAGCGTGCGCCAT(CpG1758) 
OLIGO3(SEQIDNO:3)：ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACG 
OLIGO4(SEQIDNO:4)：TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(CpG2006) 
OLIGO5(SEQIDNO:5)：TCCATGACGTTCCTGATGCT(CpG1668) 
OLIGO6(SEQIDNO:6)：TCGACGTTTTCGGCGCGCGCCG(CpG5456) 
备选的CpG寡核苷酸可包含以上序列，因为它们具有序列内无关紧要的缺失或添加。 
本发明所用的CpG寡核苷酸可通过本领城已知的任一方法合成(例如参见EP468520)。为方便起见，这些寡核苷酸可利用自动合成仪合成。 
佐剂可为水包油乳剂，或者可以包含与其它佐剂组合的水包油乳剂。乳剂系统的油相任选地含有可代谢油。术语可代谢油的含义在本领域众所周知。可代谢油可被定义为“能够通过代谢转化的”(道兰氏图解医学词典,W.B.SandersCompany,第25版,(1974))。所述油可为任何植物油、鱼油、动物油或合成油，其对接受者无毒，能够通过代谢转化。坚果、种子和谷物是常见的植物油来源。合成油也是本发明的一部分，可包括市售油，例如等。鲨烯(2,6,10,15,19,23- 六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯)是不饱和油，大量存在于鲨鱼肝油中，少量存在于橄榄油、麦胚芽油、米糠油和酵母中，是用于本发明的油。鲨烯是可代谢油依据以下事实：其是胆固醇生物合成的中间体(默克索引,第10版,编目流水号8619)。 
母育酚(例如维生素E)也经常用于油性乳化佐剂(EP0382271B1；US5667784；WO95/17210)。用于本发明的油性乳剂(任选地为水包油乳剂)的母育酚可以如EP0382271B1所述配制，即母育酚可为母育酚液滴分散液，任选地含有乳化剂，任选地低于1μm直径。或者，母育酚可与另一种油联合使用，以形成油性乳剂的油相。本文描述了可与母育酚联合使用的油性乳剂的实例，例如上述可代谢油。 
业已表明，水包油乳剂佐剂自身可用作佐剂组合物(EP0399843B)，水包油乳剂和其它活性物质的组合也已被描述为疫苗佐剂(WO95/17210；WO98/56414；WO99/12565；WO99/11241)。已表述了其它油性乳化佐剂，例如油包水乳剂(US5,422,109；EP0480982B2)和水包油包水乳剂(US5,424,067；EP0480981B)。所有这些都构成了油性乳剂系统(尤其是在掺入母育酚时)，以形成本发明的佐剂和组合物。 
在一个实施方案中，油性乳剂(例如水包油乳剂)还包含乳化剂，例如吐温80和/或固醇，例如胆固醇。 
在一个实施方案中，油性乳剂(任选地水包油乳剂)含有可代谢油；无毒性油，例如角鲨烷、鲨烯或生育酚，例如α生育酚(和任选地鲨烯和α生育酚这二者)，以及任选的乳化剂(或表面活性剂)，例如吐温80。还可以包括固醇(例如胆固醇)。 
生产水包油乳剂的方法是本领域技术人员熟知的。一般来说，该方法包括：将含母育酚的油相与表面活性剂如PBS/吐温80TM溶液混合，然后用匀浆器进行匀浆，对本领域技术人员应显而易见的是，包括将混合物两次通过注射器针头的方法应适于匀化小体积液体。同样地，本领域技术人员可修改在微射流仪(M110S微流体机器，最多为 50个通道，在6巴的最大压力输入下2分钟的时间段(输出压力为约850巴))中的乳化方法，以产生更小体积或更大体积的乳剂。该修改可通过常规实验完成，包括测量所得乳剂，直到得到具有所需直径的油滴的制剂。 
在水包油乳剂中，油和乳剂应处于水性载体中。水性载体可为例如磷酸缓冲盐水。 
在稳定的水包油乳剂中存在的油滴大小任选地可小于1微米，可基本上在30-600纳米的范围内，任选地基本约30-500纳米直径，任选地基本150-500纳米直径，尤其是约150纳米直径，如按光子相关光谱学所测量的。在这点上，以数目计80%的油滴应在该范围内，任选地以数目计超过90%的油滴和任选地以数目计超过95%的油滴在限定的尺寸范围内。按照常规，本发明的油性乳剂中存在的组分量为0.5-20%或2-10%的油(总剂量体积)，例如鲨烯；且如果有α生育酚则为2-10%；以及0.3-3%的表面活性剂，如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。任选地，油(例如鲨烯):母育酚(例如α-生育酚)的比率等于或小于1，因为这样提供了更稳定的乳剂。诸如吐温80或司盘85的乳剂也可以以约1%的水平存在。在某些情况下，本发明的疫苗还包含有稳定剂可能是有利的。 
乳化系统的实例描述于WO95/17210、WO99/11241和WO99/12565，其公开了基于鲨烯、α生育酚和吐温80的乳化佐剂，其任选地与免疫刺激剂QS21和/或3D-MPL一起配制。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的佐剂可另外含有其它的免疫刺激剂，例如LPS或其衍生物，和/或皂苷。其它免疫刺激剂的实例描述于本文和“VaccineDesign-TheSubunitandAdjuvantApproach”1995,PharmaceuticalBiotechnology,第6卷,Powell,M.F.和Newman,M.J.编辑,PlenumPress,NewYorkandLondon,ISBN0-306-44867-X。 
在一个实施方案中，本发明的佐剂和免疫原性组合物包含在上述油性乳剂中的皂苷(例如QS21)和/或LPS衍生物(例如3D-MPL)，任选 地具有固醇(例如胆固醇)。另外，油性乳剂(任选地水包油乳剂)可含有司盘85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。含有水包油乳剂、固醇和皂苷的佐剂描述于WO99/12565。 
通常，对于人类给药而言，皂苷(例如QS21)和/或LPS衍生物(例如3D-MPL)在人类免疫原性组合物剂量中以1μg-200μg/剂存在，例如10-100μg或10μg-50μg/剂。通常，油性乳剂(任选地为水包油乳剂)包含2-10%可代谢油。任选地，其包含2-10%鲨烯、2-10%α生育酚和0.3-3%(任选地0.4-2%)乳剂(任选地吐温80[聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯])。在鲨烯和α生育酚这二者均存在时，任选地鲨烯与α生育酚的比率等于或小于1，因为这提供了更稳定的乳剂。司盘85(山梨糖醇酐三油酸酯)也可以在用于本发明的乳剂中以0.5-1%的水平存在。在某些情况下，本发明的免疫原性组合物和疫苗还包含稳定剂可能是有利的，所述稳定剂例如为其它乳化剂/表面活性剂，包括辛酸(默克索引第10版，编目流水号1739)，例如三辛酸甘油酯。 
在含有鲨烯和皂苷(任选地为QS21)时，制剂还包含固醇(任选地为胆固醇)是有益的，因为这允许降低乳剂中的总油量。这导致生产成本降低，接种的总体舒适性改善，还定量和定性地改善了所获免疫应答，例如改善了IFN-γ生产。因此，本发明的佐剂系统通常包含在200:1-300:1范围内的可代谢油:皂苷(重量/重量)比率，还可以以“低油”形式使用本发明，其任选的范围为1:1-200:1，任选地为20:1-100:1，或者基本上为48:1，该疫苗保留了所有组分的有益佐剂特性和显著减少的反应原性谱。因此，某些实施方案具有的鲨烯:QS21(重量/重量)比率在1:1-250:1或20:1-200:1或20:1-100:1范围内，或者基本上为48:1。任选地，还包括以如本文所述的皂苷:固醇比率存在的固醇(例如胆固醇)。 
本发明的乳化系统任选地具有在亚微米范围内的小油滴尺寸。任选地，油滴尺寸为直径120-750nm，或直径120-600nm。 
特别有效的佐剂制剂(用于在本发明的免疫原性组合物中与 AlPO4最终组合)包括皂苷(例如QS21)、LPS衍生物(例如3D-MPL)和油性乳剂(例如在水包油乳剂中的鲨烯和α生育酚)，其描述于WO95/17210或WO99/12565(尤其是在实施例2表1中的佐剂制剂11)。 
TLR2激动剂的实例包括肽聚糖或或脂蛋白。咪唑并喹啉，例如咪喹莫特和雷西莫特，是已知的TLR7激动剂。单链RNA也是已知的TLR激动剂(在人中的TLR8和在小鼠中的TLR7)，而双链RNA和聚合IC(聚肌苷酸-聚胞嘧啶核苷酸，其为市售的病毒RNA的合成模拟物)是TLR3激动剂的示例。3D-MPL是TLR4激动剂的实例，而CPG是TLR9激动剂的实例。 
免疫原性组合物可以包含吸附在金属盐上的抗原和免疫刺激物。其中抗原和免疫刺激物3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)吸附到相同颗粒上的基于铝的疫苗制剂描述于EP0576478B1、EP0689454B1和EP0633784B1。那么，在这些情况下，抗原首先吸附到铝盐上，之后将免疫刺激剂3D-MPL吸附到相同铝盐颗粒上。这些方法首先包括在水浴中通过超声悬浮3D-MPL，直至颗粒达到80-500nm的尺寸。抗原典型地在搅拌下于室温在铝盐上吸附1小时。然后将3D-MPL悬浮液加入至吸附的抗原，制剂于室温温育1小时，然后保持于4℃，直至使用。 
在另一种方法中，免疫刺激物和抗原在单独的金属颗粒上，如在EP1126876中所述。改善的方法包括将免疫刺激物吸附到金属盐颗粒上，接着将抗原吸附到另一种金属盐颗粒上，之后混合单独的金属颗粒，以形成疫苗。用于本发明的佐剂可为包含免疫刺激物的佐剂组合物，其吸附到金属盐颗粒上，特征在于金属盐颗粒基本没有其它抗原。此外，疫苗由本发明提供，特征在于免疫刺激物吸附到基本没有其它抗原的金属盐颗粒上，以及特征在于吸附抗原的金属盐颗粒基本没有其它免疫刺激物。 
因此，本发明提供含有免疫刺激物的佐剂制剂，其已吸附到金属盐颗粒上，特征在于组合物基本没有其它抗原。此外，该佐剂制剂可 为中间体，如果使用这样的佐剂，则其是生产疫苗所必需的。因此，提供一种生产疫苗的方法，包括将为一种或多种吸附到金属颗粒上的免疫刺激物的佐剂组合物与抗原混合。任选地，抗原可预先吸附到金属盐上。所述金属盐可与吸附到免疫刺激物上的金属盐相同或相似。任选地，金属盐为铝盐，例如磷酸铝或氢氧化铝。 
本发明还提供一种疫苗组合物，其含有吸附到第一种金属盐颗粒上的免疫刺激物和吸附到金属盐上的抗原，其特征在于第一种和第二种金属盐颗粒为单独的颗粒。 
本文描述的LPS或LOS衍生物或突变或脂质A衍生物设计得比天然脂多糖毒性低(例如3D-MPL)，就本文描述的这些部分的任何用途而言是可互换的等效物。 
在一个实施方案中，用于本发明的组合物的佐剂包含脂质体载体(通过已知技术由磷脂(例如二油酰磷脂酰胆碱[DOPC])和任选的固醇[例如胆固醇]制备)。这些脂质体载体可携带脂质A衍生物[例如3D-MPL,参见上文]和/或皂苷(例如QS21,参见上文)。在一个实施方案中，佐剂含有(每0.5mL剂量)0.1-10mg、0.2-7mg、0.3-5mg、0.4-2mg或0.5-1mg(例如0.4-0.6mg、0.9-1.1mg、0.5mg或1mg)磷脂(例如DOPC)；0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、0.1-0.3mg或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3mg、0.1-0.15mg、0.25mg或0.125mg)固醇(例如胆固醇)；5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)；以及5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)皂苷(例如QS21)。 
该佐剂尤其适合于老年疫苗制剂。在一个实施方案中，含有此佐剂的疫苗组合物包含来源于至少以下所有血清型的糖缀合物：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并还可以包含来自血清型3、6A、19A和22F的一种或多种糖缀合物)，其中在人类接种者中针对一种或多种(或全部)疫苗组分4、6B、9V、14、18C、19F和23F诱导的GMC 抗体效价不明显劣于疫苗诱导的抗体效价。 
在一个实施方案中，用于本发明组合物的佐剂包含由可代谢油(例如鲨烯)、乳剂(例如吐温80)和任选的母育酚(例如α生育酚)制备的水包油乳剂。在一个实施方案中，佐剂含有(每0.5mL剂量)0.5-15mg、1-13mg、2-11mg、4-8mg或5-6mg(例如2-3mg、5-6mg或10-11mg)可代谢油(例如鲨烯)；0.1-10mg、0.3-8mg、0.6-6mg、0.9-5mg、1-4mg或2-3mg(例如0.9-1.1mg、2-3mg或4-5mg)乳剂(例如吐温80)；和任选的0.5-20mg、1-15mg、2-12mg、4-10mg、5-7mg(例如11-13mg、5-6mg或2-3mg)母育酚(例如α生育酚)。 
该佐剂任选地还可以包含5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。 
这些佐剂尤其适合于婴儿或老年疫苗制剂。在一个实施方案中，含有此佐剂的疫苗组合物包含来源于至少以下所有血清型的糖缀合物：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并还可以包含来自血清型3、6A、19A和22F的一种或多种糖缀合物)，其中在人类接种者中针对一种或多种(或全部)疫苗组分4、6B、9V、14、18C、19F和23F诱导的GMC抗体效价不明显劣于
Figure BDA00002978220800352
疫苗诱导的抗体效价。 
该佐剂任选地可含有0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、0.1-0.3mg或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3mg、0.1-0.15mg、0.25mg或0.125mg)固醇(例如胆固醇)；5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)；和5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)皂苷(例如QS21)。 
该佐剂尤其适合于老年疫苗制剂。在一个实施方案中，含有此佐剂的疫苗组合物包含来源于至少以下所有血清型的糖缀合物：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并还可以包含来自血清型3、6A、19A和22F的一种或多种糖缀合物)，其中在人类接种者中针对一种或 多种(或全部)疫苗组分4、6B、9V、14、18C、19F和23F诱导的GMC抗体效价不明显劣于
Figure BDA00002978220800361
疫苗诱导的抗体效价。 
在一个实施方案中，用于本发明组合物的佐剂包含磷酸铝和脂质A衍生物(例如3D-MPL)。该佐剂可包含(每0.5mL剂量)100-750μg、200-500μg或300-400μg为磷酸铝的Al，和5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。 
该佐剂尤其适合于老年或婴儿疫苗制剂。在一个实施方案中，含有此佐剂的疫苗组合物包含来源于至少以下所有血清型的糖缀合物：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并还可以包含来自血清型3、6A、19A和22F的一种或多种糖缀合物)，其中在人类接种者中针对一种或多种(或全部)疫苗组分4、6B、9V、14、18C、19F和23F诱导的GMC抗体效价不明显劣于
Figure BDA00002978220800362
疫苗诱导的抗体效价。 
通过将含有本发明的免疫原性组合物的疫苗制备物经系统或粘膜途径给药，所述疫苗可用于保护或治疗对感染易感的哺乳动物。这些给药可包括经肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或经粘膜给予至口/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。鼻内给予疫苗有可能用于治疗肺炎或中耳炎(由于能更有效地阻止肺炎链球菌的鼻咽携带，因此能在其最早期减弱感染)。尽管本发明的疫苗可作为单剂给予，但其组分也可以同时或在不同时间一起共给予(例如肺炎链球菌糖缀合物可单独给予、同时给予或在给予疫苗的任何细菌蛋白组分之后1-2周给予，用于彼此之间免疫应答的最佳协调)。对于共给予，任选的Th1佐剂可存在于任意的或全部的不同给药中。除了单一给药途径之外，还可使用2种不同的给药途径。例如，糖或糖缀合物可IM(或ID)给予，细菌蛋白可IN(或ID)给予。另外，本发明的疫苗可IM给予初次剂量，IN给予加强剂量。 
疫苗中的蛋白抗原的含量通常在1-100μg的范围内，任选地为5-50μg，最通常在5-25μg的范围内。在初始接种后，受试者可接受 1次或数次足够间隔的加强免疫。 
疫苗制剂一般描述于VaccineDesign(“Thesubunitandadjuvant approach”(PowellM.F.和NewmanM.J.编辑)(1995)PlenumPressNew York)。在脂质体中的囊化描述于Fullerton,美国专利4,235,877。 
本发明的疫苗或免疫原性组合物可储存在溶液中或冻干储存。在一个实施方案中，溶液在用作无定形冻干保护剂的糖存在下冻干，所述糖例如为蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖或乳糖。在一个实施方案中，溶液在用作无定形冻干保护剂的糖和提供改善的块状结构的填充剂(例如甘氨酸或甘露醇)存在下冻干。晶体填充剂的存在允许在高盐浓度存在下缩短冻干周期。用于冻干本发明的免疫原性组合物或疫苗的这些混合物的实例包括蔗糖/甘氨酸、海藻糖/甘氨酸、葡萄糖/甘氨酸、甘露糖/甘氨酸、麦芽糖/甘氨酸、蔗糖/甘露醇/海藻糖/甘露醇、葡萄糖/甘露醇、甘露糖/甘露醇以及麦芽糖/甘露醇。典型地，两种成分的摩尔比率任选地为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5或1:6。本发明的免疫原性组合物任选地含有上述冻干试剂。 
上述稳定剂和稳定剂的混合物还可以包括能够增加制剂的玻璃化温度(Tg’)的聚合物，例如聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、羟乙基淀粉或葡聚糖，或者用作晶体填充剂的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，例如具有1500-6000分子量的聚乙二醇，和葡聚糖。 
本发明的免疫原性组合物任选地被冻干，并在使用前临时重配。冻干可产生更稳定的组合物(疫苗)，并在存在3D-MPL和没有基于铝的佐剂的情况下可能产生更高的抗体效价。 
在本发明的一个方面，提供一种疫苗药盒，其包括含有本发明的免疫原性组合物(任选地为冻干形式)的小瓶，并还包括含有本文所述佐剂的小瓶。可预见的是，在本发明的该方面，佐剂将用于重配冻干的免疫原性组合物。 
尽管本发明的疫苗可通过任何途径给予，但将所述疫苗给予到皮肤中(ID)构成了本发明的一个实施方案。人皮肤含有外“角状”表皮， 叫做角质层，其覆盖表皮。在此表皮下面是叫做真皮的层，其又覆盖皮下组织。研究者已表明，将疫苗注射到皮肤中，尤其是真皮中，刺激免疫应答，其还可能与许多其它优势有关。用本文所述疫苗皮内接种构成了本发明的可选特征。 
皮内注射的常规技术“芒图操作(mantouxprocedure)”包括下述步骤：清洁皮肤，然后伸出一只手，使小号针(26-31号)的斜面朝上，以10-15°的角度将针插入。一旦针斜面被插入，就降低针管并前推，同时轻压使其在皮肤下抬高。然后将液体非常缓慢地注入，这样便在皮肤表面上形成一个大包或肿块，接着缓慢抽出针。 
近来，已描述了特别设计用于皮内或通过皮肤给予液体制剂的装置，例如在WO99/34850和EP1092444中描述的装置，以及例如在WO01/13977、US5,480,381、US5,599,302、US5,334,144、US5,993,412、US5,649,912、US5,569,189、US5,704,911、US5,383,851、US5,893,397、US5,466,220、US5,339,163、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520,639、US4,596,556、US4,790,824、US4,941,880、US4,940,460、WO97/37705和WO97/13537中描述的喷射注射装置。疫苗制剂的真皮内给药替代方法可包括常规注射器和针，或设计用于固体疫苗的弹道式给药的装置(WO99/27961)，或透皮贴剂(WO97/48440；WO98/28037)；或皮肤表面给药(经真皮或经皮传送，WO98/20734；WO98/28037)。 
当本发明的疫苗给予皮肤时，或更具体地说给予到真皮中时，疫苗为小液体体积，具体地说为约0.05ml至0.2ml的体积。 
本发明皮肤或皮内疫苗中的抗原含量可类似于肌内疫苗中存在的常规剂量(参见上文)。然而，皮肤或皮内疫苗的一个特点是制剂可以为“低剂量”。因此，“低剂量”疫苗中的蛋白抗原任选地以低至每剂0.1-10μg或0.1-5μg存在；糖(任选缀合的)抗原可以每剂0.01-1μg或0.01-0.5μg糖存在。 
此处所用的术语“皮内传送”是指将疫苗给至皮肤的真皮区域。 然而，疫苗不一定仅定位于真皮内。真皮层是距离人体皮肤表面约1.0mm至约2.0mm的皮层，但个体之间和机体的不同部位之间存在一定量的差异。一般地，预计疫苗可以通过进入皮肤表面下1.5mm达到真皮层。真皮位于在表面的角质层和表皮与下面的皮下层之间。根据给药模式，可以使疫苗最终仅存在于或主要存在于真皮内，或最终可分布于表皮和真皮内。 
本发明还通过加入为游离或缀合形式的流感嗜血菌蛋白如D蛋白提供预防或减轻流感嗜血菌所致中耳炎的改良疫苗。另外，本发明还通过依靠向本发明的肺炎链球菌缀合组合物加入为游离或缀合蛋白的一种或两种肺炎链球菌蛋白提供在婴儿中预防或减轻肺炎链球菌感染(例如中耳炎)的改良疫苗。所述肺炎链球菌游离蛋白可与用作载体蛋白的任何肺炎链球菌蛋白相同或不同。一种或多种卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)蛋白抗原也可以游离或缀合形式包含在联合疫苗中。因此，本发明为在婴儿中激发抵御中耳炎的(保护性)免疫应答的改良方法。 
在另一个实施方案中，本发明为通过给予安全有效量的本发明疫苗[儿科疫苗]在婴儿(在本发明背景下定义为0-2岁)中激发(保护性)免疫应答的改良方法。此外，本发明的实施方案包括提供用于药物的本发明的抗原性肺炎链球菌缀合组合物以及本发明的肺炎链球菌缀合物在制造用于预防(或治疗)肺炎链球菌疾病的药物中的用途。 
在又一个实施方案中，本发明为通过给予安全有效量的本发明疫苗，任选地连同一种或两种作为游离或缀合蛋白存在的肺炎链球菌蛋白，在老年人群(在本发明背景下患者如果为50岁或以上、通常超过55岁以及更通常超过60岁，则被视为老年人)中激发(保护性)免疫应答的改良方法，所述游离的肺炎链球菌蛋白可与用作载体蛋白的任何肺炎链球菌蛋白相同或不同。 
本发明的又一方面是免疫人类宿主抵御肺炎链球菌和任选地流感嗜血菌感染所致疾病的方法，该方法包括给予宿主免疫保护剂量的 本发明的免疫原性组合物或疫苗或药盒。 
本发明的又一方面为用于治疗或预防肺炎链球菌和任选地流感嗜血菌感染所致疾病的免疫原性组合物。 
本发明的又一方面为本发明的免疫原性组合物或疫苗或药盒在制造用于治疗或预防肺炎链球菌和任选的流感嗜血菌感染所致疾病的药物中的用途。 
在所有情况下，本发明人都意欲用术语“由……组成”分别任选地取代本文的术语“包含”、“含有”和“包括”。 
涉及本发明的“疫苗组合物”的本文的实施方案也适用于与本发明的“免疫原性组合物”相关的实施方案，反之亦然。 
在本专利说明书中提及的所有参考文献或专利申请都通过引用结合到本文中。 
为了可更好地理解本发明，提供以下实施例。这些实施例仅是为了阐述目的，无意以任何方式限制本发明的范围。 
实施例
实施例1：D蛋白的表达 
流感嗜血菌D蛋白 
用于D蛋白表达的遗传构建 
起始物质 
编码D蛋白的DNA 
D蛋白在所有血清型以及非分型的流感嗜血菌菌株中都高度保守。含有整个D蛋白基因编码DNA序列的载体pHIC348由A.Forsgren博士,DepartmentofMedicalMicrobiology,UniversityofLund,
Figure BDA00002978220800401
 GeneralHospital,
Figure BDA00002978220800402
Sweden处获得。D蛋白的DNA序列由Janson等,(1991)Infect.Immun.59:119-125发表。 
表达载体pMG1 
表达载体pMG1为pBR322衍生物(Gross等,1985)，其中导入了来源于噬菌体λ的控制元件，该控制元件用于外源插入基因的转录和翻译(Shatzman等,1983)。此外，氨苄青霉素抗性基因被替换成卡那霉素抗性基因。 
大肠杆菌菌株AR58 
用预先在SA500衍生物(galE::TN10,λKil-cI857ΔH1)中生长的P1噬菌体原液转导N99产生大肠杆菌菌株AR58。N99和SA500为大肠杆菌K12菌株，得自国立卫生研究所(NIH)的MartinRosenberg博士实验室。 
表达载体pMG1 
为生产D蛋白，将编码该蛋白的DNA克隆到表达载体pMG1中。该质粒使用λ噬菌体DNA的信号来驱动插入的外源基因的转录和翻译。该载体含有启动子PL、操纵子OL和2个可用位点(NutL和NutR)，从而在提供N蛋白时缓解转录极性效应(Gross等,1985)。将含有PL启动子的载体引入一种大肠杆菌溶原性宿主，以稳定质粒DNA。溶原性宿主菌株含有整合到基因组中的复制缺陷型λ噬菌体DNA(Shatzman等,1983)。染色体中的λ噬菌体DNA可引导cI阻抑蛋白的合成，cI蛋白结合载体的OL阻抑物，阻止RNA聚合酶与PL启动子结合，从而防止插入基因转录。表达菌株AR58的cI基因含有温度敏感性突变，使得可通过温度变化来调控PL引导的转录，即提高培养温度可使阻抑物失活，并开始合成外源蛋白。该表达系统可使外源蛋白(尤其是可能对细胞有毒性的那些外源蛋白)受控合成(Shimataka和Rosenberg,1981)。 
大肠杆菌菌株AR58 
用于产生D蛋白载体的AR58溶原性大肠杆菌菌株为标准NIH大肠杆菌K12菌株N99(F-su-galK2,lacZ-thr-)的衍生物。它含有缺陷 型溶原性λ噬菌体(galE::TN10,λKil-cI857ΔH1)。Kil-表型防止宿主停止合成大分子。cI857突变赋予cI阻抑物温度敏感性损伤。ΔH1缺失去除λ噬菌体的右侧操纵子以及宿主的bio、uvr3和chlA基因座。用预先在SA500衍生物(galE::TN10,lambdaKil-cI857ΔH1)中生长的P1噬菌体原液转导N99产生AR58菌株。由于galE基因附近存在编码四环素抗性的TN10转座子，因而可利用四环素对N99中缺陷型溶菌原的导入情况进行选择。 
载体pMGMDPPrD的构建 
使用含有流感病毒非结构S1蛋白编码基因的pMG1载体(pMGNSI)构建pMGMDPPrD。利用在5'和3'端分别含有NcoI与XbaI限制位点的PCR引物经PCR由pHIC348载体(Janson等,1991,Infect.Immun.59:119-125)扩增D蛋白基因。然后将NcoI/XbaI片段引入到pMGNS1的NcoI与XbaI之间，由此产生含有NS1蛋白的N端81个氨基酸并后接PD蛋白的融合蛋白。该载体称为pMGNS1PrD。 
基于上述构建体产生用于D蛋白表达的最终构建体。从pMGNS1PrD中去除BamHI/BamHI片段。该DNA水解反应去除除前3个N端残基之外的NS1编码区。在该载体重新连接时，产生编码具有以下N端氨基酸序列的融合蛋白的基因： 
-----MDPSSHSSNMANT----- 
NS1   D蛋白 
D蛋白不含有前导肽或通常连接有脂链的N端半胱氨酸。因此，该蛋白不会被分泌到周质中，也不会被脂化，而是以可溶形式保留在细胞质中。 
通过于37℃热激将最终构建体pMG-MDPPrD导入到AR58宿主菌株中。在卡那霉素存在下选择含有质粒的细菌。用选定的内切核酸酶消化分离的质粒DNA来证实编码DNA插入序列的D蛋白的存在。重组的大肠杆菌菌株称为ECD4。 
D蛋白的表达处于λPL启动子/OL操纵子控制之下。宿主菌株AR58的基因组中含有温度敏感性cI基因，该基因在低温下可通过与OL结合来阻断由λPL启动的表达。一旦温度提高，cI就由OL释放，D蛋白得以表达。 
小规模制备 
在发酵结束时，可将细胞浓缩并冷冻。 
如下进行收集细胞的提取和D蛋白纯化。将冷冻的细胞培养物解冻，并重悬于细胞裂解液(柠檬酸盐缓冲液,pH6.0)中，使最终OD650 ＝60。使该悬浮液两次流经P＝1000bar的高压匀浆器。通过离心澄清细胞培养物匀浆，并过滤去除细胞碎片。在第一个纯化步骤中，将过滤的裂解物上样于阳离子交换层析柱(SPSepharoseFastFlow)。PD可通过离子作用与凝胶基质结合，并可通过增加洗脱缓冲液的离子强度的步骤洗脱PD。 
在第二个纯化步骤中，杂质保留在阴离子交换基质(QSepharose FastFlow)上。PD未结合到凝胶上，并可收集在流出物中。 
两个柱层析步骤均利用OD监测分部收集物。通过超滤浓缩含有纯化的D蛋白的阴离子交换柱层析的流出物。 
最后，使含有D蛋白的超滤保留物通过0.2μm膜。 
大规模制备 
如下进行收集细胞的提取和D蛋白的纯化。冷却收集的培养液，并直接通过约800bar压力的高压匀浆器2次。 
在第一个纯化步骤中，稀释细胞培养物匀浆物，并上阳离子交换层析柱(SPSepharoseBigbeads)。PD通过离子作用结合凝胶基质，通过增加洗脱缓冲液的离子强度的步骤洗脱PD，并过滤。 
在第二个纯化步骤中，杂质保留在阴离子交换基质(QSepharose FastFlow)上。PD未结合到凝胶上，并可收集在流出物中。 
两个柱层析步骤均利用OD监测分部收集物。通过超滤浓缩并渗滤含有纯化的D蛋白的阴离子交换柱层析的流出物。 
最后，使含有D蛋白的超滤保留物通过0.2μm膜。 
实施例1b：PhtD的表达 
PhtD蛋白是肺炎链球菌组氨酸三联体(Pht)蛋白家族的成员，其特征在于存在组氨酸三联体(HXXHXH基序)。PhtD是838个氨基酸的分子，具有5个组氨酸三联体(参见MedImmuneWO00/37105SEQIDNO:4的氨基酸序列和SEQIDNO:5的DNA序列)。PhtD还在中部(氨基酸位置348-380)含有富集脯氨酸的区域。PhtD具有20个氨基酸的N末端信号序列和LXXC基序。 
遗传构建体 
使用携带pλ启动子的自制pTCMP14载体将成熟的MedImmune PhtD蛋白(由氨基酸21至氨基酸838)的基因序列重组转移到大肠杆菌中。大肠杆菌宿主菌株为AR58，其携带cI857热敏感性阻抑物，允许热诱导启动子。 
实施聚合酶链式反应，以由MedImmune质粒扩增phtD基因(携带肺炎链球菌菌株Norway4(血清型4)的phtD基因-如在WO00/37105中所述的SEQIDNO:5)。仅对phtD基因特异性的引物用于扩增两个片段中的phtD基因。引物携带NdeI和KpnI限制位点或KpnI和XbaI限制位点。这些引物不与该载体的任何核苷酸杂交，而是仅与phtD特异性基因序列杂交。使用携带NdeI限制位点的第一个引物插入人工ATG起始密码子。然后将产生的PCR产物插入到pGEM-T克隆载体(Promega)中，并检验DNA序列。然后使用标准技术在TCMP14表达载体中实现片段亚克隆，并将载体转化入AR58大肠杆菌中。 
PhtD纯化 
如下实现PhtD纯化： 
□在卡那霉素存在下大肠杆菌细胞的生长：于30℃生长30小时，然后于39.5℃温育18小时。 
□在作为蛋白酶抑制剂的5mMEDTA和2mMPMSF存在下以OD±115由完整培养物破碎大肠杆菌细胞：Rannie,2次通过,1000bar。 
□于室温(20°C)用膨胀床模式StreamlineQXL层析去除抗原捕获物和细胞碎片；柱子用NaCl150mM＋Empigen0.25%pH6.5洗涤，并用NaCl400mM＋Empigen0.25%的25mM磷酸钾缓冲液pH7.4溶液洗脱。 
□用Sartobran150滤器(0.45＋0.2μm)过滤。 
□在5mM咪唑存在下于4℃抗原结合在螯合Zn++的SepharoseFFIMAC层析柱pH7.4上；该柱用5mM咪唑和1%Empigen洗涤，并用50mM咪唑洗脱，二者均在25mM磷酸钾缓冲液pH8.0中。 
□以阳离子模式在FractogelEMDDEAEpH8.0(25mM磷酸钾)上于4℃进行弱阴离子交换层析；该柱用140mMNaCl洗涤，并用200mMNaCl洗脱，同时杂质(蛋白和DNA)仍吸附在交换剂上。 
□用50kDa膜以2mM磷酸钠/钾pH7.15浓缩和超滤。 
□纯化的半成品经0.2μmMillipak-20滤器除菌过滤。 
实施例1c：肺炎链球菌溶血素的表达 
如在WO2004/081515和WO2006/032499中所述制备和解毒肺炎链球菌性肺炎链球菌溶血素。 
实施例2: 
缀合物的制备 
在本领域众所周知如何制备纯化的肺炎链球菌多糖。就这些实施 例而言，多糖基本如EP072513所述制备，或者通过紧密相关的方法制备。在缀合前，多糖可通过如下所述的微流化调整大小。 
活化和偶联条件对每一种多糖都是特异性的。这些条件在表1中给出。将调整过大小的多糖(PS5、6B和23F除外)溶解在2MNaCl、0.2MNaCl或注射用水(WFI)中。评估所有血清型的最佳多糖浓度。除血清型18C之外的所有血清型都如下详述与载体蛋白直接缀合。产生2种替代血清型22F缀合物，1种直接缀合，1种通过ADH接头缀合。 
将100mg/mlCDAP在乙腈或乙腈/水50%/50%溶液中的母液(CDAP/PS比率为0.5-1.5mg/mgPS)加入多糖溶液。1.5分钟后，加入0.2M-0.3MNaOH，以获得特定活化pH。在此pH于25°C在3分钟内进行多糖的活化。将纯化的蛋白(D蛋白、PhtD、肺炎链球菌溶血素或DT)(其量取决于初始PS/载体蛋白的比值)加入活化的多糖中，在该特定pH于pH调节下进行偶联反应达2小时(取决于血清型)。为了猝灭未反应的氰酸酯基团，然后将2M甘氨酸溶液加入混合物。调节pH至猝灭pH(pH9.0)。于25℃搅拌溶液30分钟，然后在持续的缓慢搅拌下于2-8°C过夜。 
18C的制备：
18C经接头己二酸二酰肼(ADH)与载体蛋白连接。多糖血清型18C在缀合前被微流化。 
用EDAC衍生化破伤风类毒素 
为衍生化破伤风类毒素，用0.2MNaCl将纯化的TT稀释至25mg/ml，加入ADH间隔臂，以便达到0.2M终浓度。当间隔臂完全溶解时，将pH调节至6.2。然后加入EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺)，以达到0.02M终浓度，在pH调节下搅拌混合物1小时。通过于25°C增加pH至9.0达至少30分钟终止缩合反应。 
然后渗滤衍生化的TT(10kDaCO膜)，以便去除残余的ADH和EDAC试剂。 
最后除菌过滤TTAH半成品，直至偶联步骤，并储存于-70°C。 
TTAH与PS18C的化学偶联 
详细的缀合参数可见于表1。 
以限定的浓度用水稀释2g微流化PS，并通过加入NaCl粉末调节至2MNaCl。 
加入CDAP溶液(100mg/ml，在50/50体积/体积乙腈/WFI中新鲜制备)，以达到适宜的CDAP/PS比率。 
通过加入0.3MNaOH将pH升高至活化pH9.0，并在此pH稳定，直至加入TTAH。 
3分钟后，加入衍生化的TTAH(20mg/ml的0.2MNaCl溶液)，以使TTAH/PS比率达到2；将pH调节至偶联pH9.0。在pH调节下静置溶液1小时。 
对于猝灭，向混合物PS/TTAH/CDAP加入2M甘氨酸溶液。 
调节pH至猝灭pH(pH9.0)。 
溶液于25℃搅拌30分钟，然后在连续缓慢搅拌下于2-8°C静置过夜。 
PS22F AH -PhtD缀合物
在用于该糖的第二种缀合方法(第一种为表1中显示的直接PS22-PhtD缀合方法)中，22F与载体蛋白经接头己二酸二酰肼(ADH)连接。多糖血清型22F在缀合前被微流化。 
PS22F衍生化 
活化和偶联在连续搅拌下于25℃在控温水浴中进行。 
稀释微流化的PS22F，以获得在0.2MNaCl中6mg/ml的最终PS浓度，用0.1NHCl将该溶液调节至pH6.05±0.2。 
加入CDAP溶液(100mg/ml，在50/50的乙腈/WFI中新鲜制备)，以达到适宜的CDAP/PS比率(1.5/1重量/重量)。 
通过加入0.5MNaOH将pH升高至活化pH9.00±0.05，并稳定在此pH，直至加入ADH。 
3分钟后，加入ADH，以达到适宜的ADH/PS比率(8.9/1重量/重量)；将pH调节至偶联pH9.0。在pH调节下静置溶液1小时。 
浓缩并渗滤PSAH衍生物。 
偶联 
向PS22FAH衍生物加入10mg/ml在0.2MNaCl中的PhtD，以便达到4/1(重量/重量)的PhtD/PS22FAH比率。用HCl将pH调节至5.0±0.05。在10分钟内(250μl/分钟)手动加入EDAC溶液(20mg/ml的0.1MTris-HCl溶液，pH7.5)，以达到1mgEDAC/mgPS22FAH。所获溶液在搅拌和pH调节下于25℃温育150分钟(尽管也可以使用60分钟)。通过加入1MTris-HClpH7.5(1/10终体积)中和溶液，并于25°C静置30分钟。 
在SephacrylS400HR上洗脱前，使用5μmMinisart滤器澄清缀合物。 
获得的缀合物具有4/1(重量/重量)的最终PhtD/PS比率，游离PS含量在1%以下，抗原性(α-PS/α-PS)为36.3%，抗PhtD抗原性为7.4%。 
缀合物的纯化：
使用用0.15MNaCl(对于18C为S500HR)平衡的Sephacryl S400HR凝胶过滤柱通过凝胶过滤柱纯化缀合物，以去除小分子(包括DMAP)和未缀合的PS和蛋白。基于反应组分的不同分子量大小，首先洗脱出PS-PD、PS-TT、PS-PhtD、PS-肺炎链球菌溶血素或PS-DT缀合物，之后洗脱出游离PS，然后洗脱出游离PD或游离DT，最后洗脱出DMAP和其它盐(NaCl、甘氨酸)。 
含有缀合物的级分通过UV280nm检测。按照其Kd合并级分，除菌过滤(0.22μm)，并储存于+2-8°C。测定缀合制备物中的PS/蛋白比率。 
PS肺炎链球菌-D蛋白/TT/DT/PhtD/Ply缀合物的特异性活化/偶联/猝灭条件
其中出现在行标题中的“μfluid”表示糖在缀合前通过微流化调整大小。微流化后的糖的尺寸在表2中给出。 
表1PS肺炎链球菌-D蛋白/TT/DT/PhtD/Ply缀合物的特异性活化/偶联/猝灭条件
Figure BDA00002978220800491
Figure BDA00002978220800501
备注：pHa、c、q分别对应于活化pH、偶联pH和猝灭pH。 
鉴定： 
对每一缀合物进行鉴定，它们都符合表2中描述的标准。用Resorcinol检测法检测多糖含量(μg/ml)，用Lowry检测法检测蛋白含量(μg/ml)。用浓度比值确定最终的PS/PD比值(重量/重量)。 
游离多糖含量(%)： 
将缀合物与α-载体蛋白抗体和饱和硫酸铵温育，之后离心，得到上清液，确定该上清液保持于4°C或在37℃储存7天时缀合物的游离多糖含量。 
用α-PS/α-PSELISA定量上清液中的游离多糖。没有缀合物也通过α-载体蛋白/α-PSELISA控制。 
抗原性： 
用夹心型ELISA分析同一缀合物的抗原性，其中捕获抗体和检测抗体分别为α-PS和α-蛋白。 
游离蛋白含量(%)： 
未缀合的载体蛋白可在纯化步骤中由缀合物分离。游离的残余蛋白的含量使用大小排阻层析(TSK5000-PWXL)继之以UV检测(214nm)来测定。洗脱条件允许分离游离载体蛋白和缀合物。然后相对于校准曲线(由0至50μg/ml载体蛋白)测定缀合物原液中的游离蛋白含量。游离载体蛋白%如下获得：%游离载体＝(游离载体(μg/ml)/(通过Lowry法检测的对应载体蛋白的总浓度(μg/ml)*100%)。 
稳定性： 
对于保持于4°C和于37°C储存7天的缀合物，用HPLC-SEC凝胶过滤(TSK5000-PWXL)检测分子量分布(Kav)和稳定性。 
10/11/13/14价特征在表2中给出(参见其下的注释)。 
蛋白缀合物可吸附到磷酸铝上，并合并，以形成最终疫苗。 
结论： 
已生产出免疫原性缀合物，以后表明其为有前景的疫苗的组分。 
表2-缀合物的表征 
Figure BDA00002978220800511
Figure BDA00002978220800521
*天然PS微流化后的PS大小 
通过混合血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F缀合物(例如以每份人剂量分别1、3、1、1、1、1、1、3、3、1μg糖的剂量)制备10价疫苗。通过又加入表5的血清型3缀合物(例如以每份人剂量1μg糖)制备11价疫苗。通过又加入以上的血清型19A和22F缀合物(22F直接连接至PhtD，或者通过ADH接头连接)[例如以每份人剂量各3μg糖的剂量]制备13价疫苗。可以通过又加入以上的血清型6A缀合物[例如以每份人剂量1μg糖的剂量]制备14价疫苗。实施例3：在本发明的免疫原性组合物中包含流感嗜血菌D蛋白的证据可提供抵御急性中耳炎(AOM)的改善的保护作用 
研究设计 
研究使用11Pn-PD疫苗，其含有血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F，每种血清型均缀合流感嗜血菌的D蛋白(参阅实施例4中的表5)。将受试者随机分为2组，以在约3、4、5和12-15月龄时接受4剂11Pn-PD疫苗或Havrix。所有受试者都在3、4和5月龄时伴随接受GSK生物制品公司的Infanrix-hexa(DTPa-HBV-IPV/Hib)疫苗。Infanrix-hexa是在给药前混合的Pediarix和Hib的组合。在给予第3剂疫苗后2周开始“依照方案”的随访效力分析，并持续至24-27月龄。在选定的受试者亚组中评价肺炎链球菌和流感嗜血菌的鼻咽携带情况。 
如果孩子生病、耳痛、鼓膜自发穿孔或自发耳溢液，则建议孩子的双亲咨询研究者。如果研究者怀疑AOM事件，则立即将孩子转移至耳鼻喉(ENT)专业医师处证实诊断结果。 
AOM的临床诊断基于目测鼓膜外观(即发红、膨胀、失去光反射) 或存在中耳液体渗漏(通过简易耳镜或气式耳镜或通过显微镜证实)。另外，必须存在以下几项体征或症状中的至少两种：耳痛、耳溢液、听力丧失、发烧、嗜睡、过敏、食欲不振、呕吐或腹泻。如果ENT专业医师证实临床诊断结果，则通过鼓膜穿刺术收集中耳液的标本进行细菌学检验。 
对于因复发疾病就诊的受试者，如果自先前的事件开始以后已过去了30天以上，则认为新的AOM事件已开始。另外，如果分离的细菌/血清型不同于先前的分离株，则AOM事件被认为是新细菌事件，无论两个联系事件之间的间隔是多少。 
试验结果 
招募了总共4968名婴儿，11Pn-PD组中2489名，对照组中2479名。两组之间的个人背景特征或风险因素没有显著差异。 
临床事件和AOM病例定义
在依照方案的随访期当中，在11Pn-PD组中记录到总共333件临床AOM事件，在对照组中记录到499件。 
表3提供了11Pn-PD疫苗和先前在芬兰测试的两种7价疫苗(Eskola等,NEnglJMed2001；344:403-409和Kilpi等,ClinInfectDis200337:1155-64)抗任何AOM事件和由不同肺炎链球菌血清型、流感嗜血菌、NTHi和卡他莫拉菌(M.catarrhalis)所致的AOM的保护效力。采用11Pn-PD，统计学显著性和临床相关性降低至整体AOM疾病负荷的33.6%，与病因无关(表3)。 
归于11Pn-PD疫苗中包含的11种肺炎链球菌血清型中的任一种的抗AOM事件的整体效力为57.6%(表3)。 
该研究的另一个重要发现是由11Pn-PD疫苗提供的抗流感嗜血菌所致AOM的35.6%的保护作用(具体地说由NTHi提供35.3%的保护作用)。该发现具有重要的临床意义，给出了在肺炎链球菌缀合物接 种世代作为AOM主因的流感嗜血菌的重要性增加。与抗AOM提供的保护作用相一致，11Pn-PD疫苗也降低了在生命的第2年在加强剂量后的流感嗜血菌的鼻咽携带情况。这些发现与先前在芬兰的观察结果相反，在芬兰，对于两种7价肺炎链球菌缀合疫苗，观察到归因于流感嗜血菌的AOM事件增加，(Eskola等和Kilpi等)，以病因取代为证。 
在归于Hi的抗AOM事件的保护作用与抗载体蛋白D的抗体水平之间不能建立清晰关联，因为在仍无HiAOM事件的11Pn-PD接种者中的初免后抗PDIgG抗体浓度与在效力随访期当中发展出至少一种HiAOM事件的11Pn-PD接种者中的初免后抗PDIgG抗体水平基本相同。然而，尽管在疫苗的生物学影响和初免后IgG抗PD免疫原性之间不能建立关联，但可以合理地假定在流感嗜血菌之间高度保守的PD载体蛋白较大程度地有助于诱导抗Hi的保护作用。 
对AOM疾病的作用伴随着对鼻咽携带的作用，后一作用对于疫苗血清型肺炎链球菌和流感嗜血菌具有相似的程度(图1)。在PD缀合物接种者中流感嗜血菌的鼻咽携带情况的这种下降支持以下假设：PD缀合疫苗具有抗流感嗜血菌的直接保护作用，即便这种保护作用与通过ELISA检测的抗PDIgG免疫应答没有关联。 
在以下的试验中，使用栗鼠中耳炎模型和用该实施例的11价制剂或实施例2的10价疫苗(另参见表1和2以及其下的备注)免疫的婴儿的血清合并液。两种合并液诱导的患有中耳炎的动物百分率显著低于免疫前血清合并液。在10价和11价免疫合并液之间没有显著差异。这表明两种疫苗在该模型中诱导抗非分型流感嗜血菌所致中耳炎的保护作用的潜力相似。 
Figure BDA00002978220800551
实施例4： 
用于血清型19F的载体蛋白的选择 
使用的ELISA测定 
22F抑制ELISA方法基本上基于Concepcion和Frasch在2001年所提出的测定，并由Henckaerts等,2006,ClinicalandVaccine Immunology13:356-360报道。简而言之，纯化的肺炎链球菌多糖与甲基化人血清白蛋白混合，并于4°C过夜吸附到NuncMaxisorpTM (Roskilde,DK)高结合免疫滴定板。该板用10%胎牛血清(FBS)的PBS溶液在搅拌下于室温封闭1小时。血清样品用含10%FBS、10μg/mL细胞壁多糖(SSI)和2μg/mL肺炎链球菌多糖血清型22F(ATCC)的PBS稀释，并在微量滴定板上用相同缓冲液进一步稀释。以相同方式处理内标并纳入每块板，内标在89-SF中使用血清型特异性IgG浓度对标准血清89-SF校准。在洗涤后，使用缀合过氧化物酶的抗人IgG单克隆抗体(StratechScientificLtd.,Soham,UK)检测结合抗体，所述单克隆抗体用10%FBS(在PBS中)稀释，并在搅拌下于室温温育1小时。使用现成的单组分四甲基联苯胺过氧化物酶免疫测定底物试剂盒(BioRad,Hercules,CA,US)在暗室中于室温显色。用H2SO40.18M终止反应，于450nm读取光密度。通过参比内标血清曲线的限定限度内的光密度点计算样品中血清型特异性IgG浓度(μg/mL)，该内标血清曲线通过用SoftMaxProTM(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)软件计算的4参数逻辑斯蒂对数方程建立。在考虑检测限度和定量限度的情况下，对所有血清型的ELSIA截取值都为0.05μg/mLIgG。 
调理吞噬测定 
在2003年6月的WHO磋商会上，推荐使用如Romero-Steiner等,ClinDiagnLabImmunol200310(6):1019-1024页陈述的OPA测定。该方案用于在以下测试中检验血清型的OPA活性。 
缀合物的制备 
在研究11Pn-PD&Di-001和11Pn-PD&Di-007中，包括3种11价疫苗制剂(表4)，其中3μg的19F多糖缀合白喉类毒素(19F-DT)，而不是1μg多糖缀合D蛋白(19F-PD)。用于研究11Pn-PD、11Pn-PD&Di-001和11Pn-PD&Di-007的缀合参数分别公开于表5、6和7。 
在用这些19F-DT制剂初免后1个月的抗肺炎链球菌抗体应答和抗血清型19F的OPA活性分别示于表8和9。表10显示了在23价普通多糖加强接种之前和之后达到0.2μg/mL的受试者的22F-ELISA抗体浓度和百分率。 
已表明用这些19F-DT制剂诱导的抗体的调理吞噬活性被明显改善，这由初免接种后1个月较高的血清阳性率(调理吞噬效价≥1:8)和OPAGMT得以证实(表9)。在23价普通多糖加强接种之后1个月，19F抗体的调理吞噬活性仍显著好于用19F-DT制剂初免的儿童(表11)。 
表12提供了与连续第4剂
Figure BDA00002978220800571
相比较在预先用19F-DT或19F-PD缀合物初免的学步儿童中在11Pn-PD加强剂量之后的免疫原性数据。已知在美国引入
Figure BDA00002978220800572
后报告的成就，在血清型19F缀合DT载体蛋白时抗血清型19F的改善的调理吞噬活性可能对候选疫苗有利。 
表13提供了19F-DT缀合物相对于交叉反应性血清型19A的ELISA和OPA数据。发现19F-DT相对于19A诱导低但显著的OPA活性。 
表4在临床研究中使用的肺炎链球菌缀合疫苗制剂 
表5PS肺炎链球菌D蛋白/TT/DT缀合物的特异性活化/偶联/猝灭条件
Figure BDA00002978220800583
Figure BDA00002978220800591
表6用于11Pn-PD&Di-001研究的PS肺炎链球菌D蛋白/DT缀合物的特异性活化/偶联/猝灭条件
Figure BDA00002978220800592
Figure BDA00002978220800593
表7用于11Pn-PD&Di-007研究的PS肺炎链球菌D蛋白/DT缀合物的特异性活化/偶联/猝灭条件
Figure BDA00002978220800601
Figure BDA00002978220800602
表8在1μg19F-PD、3μg19F-DT或Prevnar(2μg19F-CRM)初免接种后1个月19F抗体浓度≥0.20μg/mL的受试者百分率和19F抗体几何平均抗体浓度(GMC和95%CI；μg/mL)(总队列) 
Figure BDA00002978220800611
Γ在表4中提供不同制剂的组成。 
表9在用1μg19F-PD、3μg19F-DT或Prevnar(2μg19F-CRM)初免接种后1个月19FOPA效价≥1:8的受试者百分率和19FOPAGMT(总队列) 
Figure BDA00002978220800612
Figure BDA00002978220800621
Γ在表4中提供不同制剂的组成。 
表10在用1μg19F-PD、3μg19F-DT或Prevnar(2μg19F-CRM)初免接种的儿童中于23价普通多糖加强接种之前和之后1个月19F抗体浓度≥0.20μg/ml的受试者百分率和19F抗体GMC(μg/ml)(总队列) 
Figure BDA00002978220800622
Γ在表4中提供不同制剂的组成。 
表11在用1μg19F-PD、3μg19F-DT或Prevnar(2μg19F-CRM)初免接种的儿童中于23价普通多糖加强接种之前和之后1个月19FOPA效价≥1:8的受试者百分率和19FOPAGMT(总队列) 
Figure BDA00002978220800623
Figure BDA00002978220800631
Γ在表4中提供不同制剂的组成。 
表12在用1μg19F-PD、3μg19F-DT或Prevnar(2μg19F-CRM)初免接种的儿童中于11Pn-PD或Prevnar加强接种后1个月抗体浓度≥0.2μg/mL、OPA≥1:8的受试者百分率和抗19F肺炎链球菌的GMC/GMT(总队列) 
Figure BDA00002978220800632
Γ在表4中提供不同制剂的组成。 
表13在用1μg19F-PD、3μg19F-DT或Prevnar(2μg19F-CRM)初免接种后1个月抗体浓度≥0.2μg/mL、OPA≥1:8的受试者百分率和抗19A肺炎链球菌的GMC/GMT(总队列) 
Figure BDA00002978220800641
Γ在表4中提供不同制剂的组成。 
实施例5：在预临床模型中的佐剂试验：对老年猕猴中的肺炎链球菌11价多糖缀合物的免疫原性的影响 
为优化在老年群体中针对缀合的肺炎链球菌疫苗激发的应答，GSK配制了一种具有新型佐剂—佐剂C的11价多糖(PS)缀合疫苗制剂，参见下文。 
在0-28天用500μl吸附到315μgAlPO4上的11价PS缀合物或与佐剂C混合的11价PS缀合物肌内(IM)免疫5只老年猕猴(14-28岁)的组别。 
在两种疫苗制剂中，11价PS缀合物各自由以下缀合物组成：PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-PD、PS19F-PD、PS23F-DT和PS6B-DT。所用疫苗为按照表6条件(实施例4)缀合的人用疫苗剂量的1/5剂量(每人用剂量每种糖5μg，6B除外[10μg])，只有19F按照以下CDAP方法条件制备：调整大小的糖为9mg/ml、PD为5mg/ml、初始PD/PS比率为1.2/1、CDAP 浓度为0.75mg/mgPS，pHa＝pHc＝pHq9.0/9.0/9.0，偶联时间为60分钟。 
定量在第42天收集的血清中的抗PSELISAIgG水平和调理吞噬效价。通过Elispot由在第42天收集的外周血细胞检测抗PS3记忆B细胞频率。 
按照下文所示结果，佐剂C在老年猴子中显著改善11价PS缀合物相对于采用AlPO4的缀合物的免疫原性。新佐剂增强针对PS的IgG应答(图1)和调理吞噬抗体效价(表14)。还有支持性证据表明使用佐剂C增强了PS3特异性记忆B细胞的频率(图2)。 
表14,在老年猕猴中的缀合物免疫原性(第Ⅱ剂后的调理吞噬效价) 
Figure BDA00002978220800651
B细胞Elispot 
测定的原则依赖于以下事实：在与CpG培养5天后记忆B细胞在体外成熟为浆细胞。体外产生的抗原特异性浆细胞可易于检测，并因此使用B细胞elispot测定计数。特异性浆细胞数反映出在培养开始 时的记忆B细胞频率。 
简而言之，体外产生的浆细胞在用抗原包被的培养板中温育。抗原特异性浆细胞形成抗体/抗原斑点，其通过常规免疫-酶促方法检测，并作为记忆B细胞计数。在本研究中，多糖已用于包被培养板，以便计数对应的记忆B细胞。结果表示为1百万记忆B细胞中PS特异性记忆B细胞的频率。 
研究表明，佐剂C能够减轻已知的PS3加强能力问题(参见关于肺炎链球菌和肺炎链球菌疾病的第5届国际讨论会，2006年4月2-6日，AliceSprings,CentralAustralia，抗血清型3肺炎链球菌缀合物的免疫应答的特异性。SchuermanL,PrymulaR,PoolmanJ.Abstractbook245页,PO10.06)。 
实施例6,解毒的肺炎链球菌溶血素(dPly)作为蛋白载体在幼龄Balb/c小鼠中增强PS19F的免疫原性的有效性 
于0、14和28天用50μl的4价普通PS或4价dPly缀合PS(二者均与佐剂C混合)IM免疫40只雌性Balb/c小鼠(4周龄)的组别。 
两种疫苗制剂均由0.1μg(糖的量)的以下PS中的每一种组成：PS8、PS12F、PS19F和PS22F。 
定量在第42天收集的血清的抗PSELISAIgG水平。 
与用普通PS免疫的小鼠相比，在给予4价dPly缀合物的小鼠中的抗PS19F应答(作为图3的实例显示)被强烈增强。对于抗PS8、12F和22FIgG应答观察到相同的改善(未显示数据)。 
实施例7，肺炎链球菌组氨酸三联体D蛋白(PhtD)作为蛋白载体在幼龄Balb/c小鼠中增强PS22F的免疫原性的有效性 
于0、14和28天用50μl的4价普通PS或4价PhtD缀合PS(二者均与佐剂C混合)IM免疫40只雌性Balb/c小鼠(4周龄)的组别。 
两种疫苗制剂均由0.1μg(糖的量)的以下PS中的每一种组成： PS8、PS12F、PS19F和PS22F。 
定量在第42天收集的血清的抗PSELISAIgG水平。 
与用普通PS免疫的小鼠相比，在给予4价PhtD缀合物的小鼠中的抗PS22F应答(作为图4的实例显示)被强烈增强。对于抗PS8、12F和19FIgG应答观察到相同的改善(未显示数据)。 
实施例8,含有19A-dPly和22F-PhtD的13-价PS缀合物在老年C57Bl小鼠中的免疫原性 
于0、14和28天用50μl的11价PS缀合物或13价PS缀合物(二者均与佐剂C混合)IM免疫30只老年C57Bl小鼠(＞69周龄)的组别(参见下文)。 
11价疫苗制剂由以下缀合物中的每一种的0.1μg糖组成：PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(参见表1和表2下讨论的关于11价疫苗的备注)。13价疫苗制剂另外包含0.1μgPS19A-dPly和PS22F-PhtD缀合物(参见表1和表2下讨论的关于13价疫苗的备注[使用直接缀合的22F])。在第2组和第4组中，肺炎链球菌溶血素载体用GMBS处理解毒，在第3组和第5组中其用甲醛进行。在第2组和第3组中，PhtD用于缀合PS22F，在第4组和第5组中，使用PhtD_E融合体(WO03/054007的构建体VP147)。在第6组中，19A与白喉类毒素缀合，22F与D蛋白缀合。 
定量在第42天收集的单独血清的抗PS19A和22FELISAIgG水平。检测合并血清针对其它PS产生的ELISAIgG应答。 
在13价缀合疫苗制剂中给予的19A-dPly和22F-PhtD在老年C57Bl小鼠中显示出免疫原性(表15)。与用11价制剂免疫的小鼠相比，在给予13价制剂的小鼠中针对其它PS诱导的免疫应答没有受到负面影响。 
表15,在老年C57Bl小鼠中的PS免疫原性(第Ⅲ剂后的IgG水平) 
Figure BDA00002978220800681
Figure BDA00002978220800691
实施例9,含19A-dPly和22F-PhtD的13价PS缀合物在幼龄Balb/c小鼠中的免疫原性 
于0、14和28天用50μl的11价PS缀合物或13价PS缀合物(二者均与佐剂C混合)IM免疫30只幼龄Balb/c小鼠(4周龄)的组别(参见下文)。 
11价疫苗制剂由以下缀合物中的每一种的0.1μg糖组成：PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(参见表1和表2下讨论的关于11价疫苗的备注)。13价疫苗制剂另外包含0.1μgPS19A-dPly和PS22F-PhtD缀合物(参见表1和表2下讨论的关于13价疫苗的备注[使用直接缀合的22F])。在第2组和第4组中，肺炎链球菌溶血素载体用GMBS处理解毒，在第3组和第5组中其用甲醛进行。在第2组和第3组中，PhtD用于缀合PS22F，在第4组和第5组中，使用PhtD_E融合体(WO03/054007的构建体VP147)。在第6组中，19A与白喉类毒素缀合，22F与D蛋白缀合。 
定量在第42天收集的单独血清的抗PS19A和22FELISAIgG水平。检测合并血清针对其它PS产生的ELISAIgG应答。 
在13价缀合疫苗制剂中给予的19A-dPly和22F-PhtD在幼龄Balb/c小鼠中显示出免疫原性(表16)。与用11价制剂免疫的小鼠相比，在给予13价制剂的小鼠中针对其它PS诱导的免疫应答没有受到负面影响。 
表16,在幼龄Balb/c小鼠中的PS免疫原性(在第Ⅲ剂后的IgG水平) 
Figure BDA00002978220800701
Figure BDA00002978220800711
实施例10,含19A-dPly和22F-PhtD的13价PS缀合物在豚鼠中的免疫原性 
于0、14和28天用125μl的11价PS缀合物或13价PS缀合物(二者均与佐剂C混合)IM免疫20只幼龄豚鼠(HartleyStrain；5周龄)的组别(参见下文)。 
11价疫苗制剂由以下缀合物中的每一种的0.25μg糖组成：PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(参见表1和表2下讨论的关于11价疫苗的备注)。13价疫苗制剂另外包含0.1μgPS19A-dPly和PS22F-PhtD缀合物(参见表1和表2下讨论的关于13价疫苗的备注[使用直接缀合的22F])。在第2组和第4组中，肺炎链球菌溶血素载体用GMBS处理解毒，在第3组和第5组中其用甲醛进行。在第2组和第3组中，PhtD用于缀合PS22F，在第4组和第5组中，使用PhtD_E融合体(WO03/054007的构建体VP147)。在第6组中，19A与白喉类毒素缀合，22F与D蛋白缀合。 
定量在第42天收集的单独血清的抗PS19A和22FELISAIgG水平。检测合并血清针对其它PS产生的ELISAIgG应答。 
表17,在幼龄Balb/c小鼠中的PS免疫原性(在第Ⅲ剂后的IgG水平) 
Figure BDA00002978220800712
Figure BDA00002978220800721
Figure BDA00002978220800731
实施例11：要制备和检验的制剂 
a)制备以下制剂(使用表1的13价疫苗和表5的血清型3-参见在表2下论述的关于14价疫苗的备注[使用直接缀合的22F或通过ADH接头])。如下文所示将糖与磷酸铝和3D-MPL一起配制。 
Figure BDA00002978220800732
Figure BDA00002978220800741
Figure BDA00002978220800742
b)用以下的每一种佐剂进行佐剂化的相同糖制剂： 
-在下表中显示了每500μl剂量的乳剂组分的浓度。 
Figure BDA00002978220800751
Figure BDA00002978220800752
c)糖还与两种基于脂质体的佐剂一起配制： 
佐剂B1的组成 
定性定量(每0.5mL剂量) 
脂质体： 
-DOPC1mg 
-胆固醇0.25mg 
3DMPL50μg 
QS2150μg 
KH2PO413.124mg缓冲液 
Na2HPO410.290mg缓冲液 
NaCl2.922mg 
(100mM) 
足够量的WFI调到0.5ml溶剂 
pH6.1 
1.总PO4浓度＝50mM 
佐剂B2的组成 
定性定量(每0.5mL剂量) 
脂质体： 
-DOPC0.5mg 
-胆固醇0.125mg 
3DMPL25μg 
QS2125μg 
KH2PO413.124mg缓冲液 
Na2HPO410.290mg缓冲液 
NaCl2.922mg 
(100mM) 
足够量的WFI调到0.5ml溶剂 
pH6.1 
d)糖还用佐剂C配制(参见上文其中已使用该佐剂的其它组合物)： 
定性定量(每0.5mL剂量) 
水包油乳剂：50μl 
-鲨烯2.136mg 
-α生育酚2.372mg 
-吐温800.97mg 
-胆固醇0.1mg 
3DMPL50μg 
QS2150μg 
KH2PO410.470mg缓冲液 
Na2HPO410.219mg缓冲液 
NaCl4.003mg 
(137mM) 
KCl0.101mg 
(2.7mM) 
足够量的WFI调到0.5ml溶剂 
pH6.8 
实施例12,缀合化学对Balb/c小鼠中22F-PhtD缀合物免疫原性的影响 
于0、14和28天用含有PS1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F(剂量：对于PS4、18C、19A、19F和22F为0.3μg糖/缀合物，对于其它PS为0.1μg糖/缀合物)的13价PS制剂通过肌内(IM)途径免疫30只雌性小鼠的组别。 
PS18C与破伤风类毒素缀合，19F与白喉类毒素缀合，19A与甲醛解毒的Ply缀合，22F与PhtD缀合，其它PS与PD缀合。 
比较由通过直接CDAP化学制备的22F-PhtD或22F-AH-PhtD(ADH衍生化的PS)构成的两种制剂。参见实施例2、表1和表2下关于用22F直接缀合或经由ADH间隔臂制备的13价疫苗特征的备注。疫苗制剂补加佐剂C。 
检测在第42天收集的血清的抗PS22FELISAIgG水平和调理吞噬效价。 
就IgG水平(图5)和调理吞噬效价(图6)这二者而言，22F-AH-PhtD显示出远强于22F-PhtD的免疫原性。 
实施例13,新佐剂对肺炎链球菌荚膜PS缀合物的免疫原性的影响
于0、14和28天用含有PS1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F(剂量：对于PS4、18C、19A、19F和22F为0.3μg糖/缀合物，对于其它PS为0.1μg糖/缀合物)的13价PS制剂 通过肌内(IM)途径免疫40只雌性Balb/c小鼠的组别。 
PS18C与破伤风类毒素缀合，19F与白喉类毒素缀合，19A与甲醛解毒的Ply缀合，22F与PhtD缀合，其它PS与PD缀合。参见实施例2、表1和表2下关于用直接缀合的22F制备的13价疫苗特征的备注。 
比较补加AlPO4、佐剂A1、佐剂A4或佐剂A5的4种制剂。 
检测在第42天收集的和每组合并的血清的抗PS、Ply、PhtD和PDELISAIgG水平。计算每种抗原的以下比率：用测试的新佐剂诱导的IgG水平/用AlPO4诱导的IgG水平。 
与经典的AlPO4制剂相比，测试的所有新佐剂将针对13价缀合物的免疫应答提升至少2倍(图7)。 
实施例14,在猴子肺炎链球菌性肺炎模型中PhtD/解毒的Ply组合的保护效力
选择6只猕猴(3-8岁)的组别作为具有预先存在的最低抗19F抗体水平的组别，于0和28天用11价PS缀合物(即1μgPS1、3、5、6B、7F、9V、14和23F，3μgPS4、18C和19F[糖])或PhtD(10μg)＋甲醛解毒的Ply(10μg)或单独的佐剂肌内免疫该组别。 
PS18C与破伤风类毒素缀合，19F与白喉类毒素缀合，其它PS与PD缀合。参见实施例2、表1和表2下关于11价疫苗特征的备注。所有疫苗制剂均补加佐剂C。 
在第42天将19F型肺炎链球菌(5.108cfu)接种在右肺中。计数在挑战后第1、3和7天收集的支气管肺泡灌洗液的菌落。结果表示为在挑战后第7天每组的死亡动物数、肺定居动物数或清除的动物数。 
如在图8中所示，与单独的佐剂组相比，用11价缀合物和PhtD＋dPly组合物(p＜0.12,Fisher确切检验)获得了接近于统计学显著性的良好保护作用(尽管使用的动物数少)。 
实施例15,缀合化学对抗PhtD抗体应答和针对22F-PhtD缀合物诱导的4型挑战的保护效力的影响
在第0和14天用3μg22F-PhtD(通过直接CDAP化学制备)或22F-AH-PhtD(ADH衍生化的PS)或单独的佐剂肌内免疫20只雌性OF1小鼠的组别。两种单价22F缀合物均通过实施例2的方法制备(另参见表1和表2)。每种制剂均补加佐剂C。 
检测在第27天收集的血清的抗PhtDELISAIgG水平。 
在第28天用5.106cfu的4型肺炎链球菌(即测试的疫苗制剂中存在的PS潜在地没有涵盖的肺炎链球菌血清型)鼻内挑战小鼠。监测诱导的死亡率，直至挑战后的第8天。 
与22F-PhtD相比22F-AH-PhtD诱导显著较高的抗PhtDIgG应答和更好的抗4型挑战的保护作用。 

Claims (10)

1. 一种含有血清型19A和19F肺炎链球菌(Streptococcus. pneumoniae)荚膜糖缀合物的免疫原性组合物，其中19A与第一种细菌类毒素缀合，19F与第二种细菌类毒素缀合。
2. 权利要求1的免疫原性组合物，其中所述第一种细菌类毒素为不同于第二种细菌毒素的蛋白质。
3. 权利要求1或2的免疫原性组合物，其中第一种细菌类毒素选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、百日咳类毒素、细菌溶细胞素和肺炎链球菌溶血素。
4. 权利要求1-3中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二种细菌类毒素选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、百日咳类毒素、细菌溶细胞素和肺炎链球菌溶血素。
5. 权利要求1-4中任一项的免疫原性组合物，其中第一种细菌类毒素为肺炎链球菌溶血素。
6. 权利要求1-5中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二种细菌类毒素为白喉类毒素。
7. 权利要求1-6中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含肺炎链球菌荚膜糖4、6B、9V、14、18C和23F的缀合物。
8. 权利要求1-7中的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含肺炎链球菌荚膜糖1、5和7F的缀合物。
9. 权利要求1-8中的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含肺炎链球菌荚膜糖22F的缀合物。
10. 权利要求1-9中的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含肺炎链球菌荚膜糖3缀合物。
CN201310103804.XA 2005-12-22 2006-12-20 含有肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗 Active CN103585623B (zh)

Applications Claiming Priority (19)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0526232A GB0526232D0 (en) 2005-12-22 2005-12-22 Vaccine
GB0526232.4 2005-12-22
GBGB0607088.2A GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-04-07 Vaccine
GB0607088.2 2006-04-07
GB0607087A GB0607087D0 (en) 2006-04-07 2006-04-07 Vaccine
GB0607087.4 2006-04-07
GB0609902A GB0609902D0 (en) 2006-05-18 2006-05-18 Novel composition
GB0609902.2 2006-05-18
GBGB0620336.8A GB0620336D0 (en) 2006-10-12 2006-10-12 Vaccine
GB0620337.6 2006-10-12
GB0620337A GB0620337D0 (en) 2006-10-12 2006-10-12 Vaccine
GB0620336.8 2006-10-12
GB0620815A GB0620815D0 (en) 2006-10-19 2006-10-19 Vaccine
GB0620816.9 2006-10-19
GB0620815.1 2006-10-19
GB0620816A GB0620816D0 (en) 2006-10-19 2006-10-19 vaccine
GBPCT/GB2006/004634 2006-12-12
PCT/GB2006/004634 WO2007068907A2 (en) 2005-12-13 2006-12-12 Vaccine compositions comprising a saponin adjuvant
CN2006800529540A CN101374548B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 含有肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006800529540A Division CN101374548B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 含有肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103585623A true CN103585623A (zh) 2014-02-19
CN103585623B CN103585623B (zh) 2016-09-28

Family

ID=39133667

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2013100364450A Pending CN103251940A (zh) 2005-12-22 2006-12-20 疫苗
CN201910504933.7A Active CN110179974B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 疫苗
CN200680053139.6A Active CN101378779B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 疫苗
CN2006800529540A Active CN101374548B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 含有肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗
CN2006800531112A Active CN101378778B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 肺炎球菌多糖缀合物疫苗
CN201310103804.XA Active CN103585623B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 含有肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗

Family Applications Before (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2013100364450A Pending CN103251940A (zh) 2005-12-22 2006-12-20 疫苗
CN201910504933.7A Active CN110179974B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 疫苗
CN200680053139.6A Active CN101378779B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 疫苗
CN2006800529540A Active CN101374548B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 含有肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗
CN2006800531112A Active CN101378778B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 肺炎球菌多糖缀合物疫苗

Country Status (37)

Country Link
US (10) US20090010959A1 (zh)
EP (10) EP3017827B1 (zh)
JP (7) JP5461838B2 (zh)
KR (5) KR101515078B1 (zh)
CN (6) CN103251940A (zh)
AR (3) AR058707A1 (zh)
AT (1) ATE520415T1 (zh)
AU (4) AU2006327041B2 (zh)
BR (3) BRPI0620460B8 (zh)
CA (5) CA2634885C (zh)
CL (1) CL2013002106A1 (zh)
CR (2) CR10119A (zh)
CY (5) CY1112677T1 (zh)
DK (5) DK2384765T3 (zh)
EA (3) EA014165B1 (zh)
ES (4) ES2630759T3 (zh)
HK (1) HK1120230A1 (zh)
HR (4) HRP20110685T1 (zh)
HU (3) HUE033081T2 (zh)
IL (5) IL191913A (zh)
JO (1) JO2813B1 (zh)
LT (3) LT2384765T (zh)
MA (3) MA30065B1 (zh)
MX (2) MX354843B (zh)
MY (4) MY160199A (zh)
NO (4) NO345368B1 (zh)
NZ (4) NZ569076A (zh)
PE (2) PE20071058A1 (zh)
PH (1) PH12014502544A1 (zh)
PL (5) PL2384765T3 (zh)
PT (5) PT3017827T (zh)
SG (1) SG168517A1 (zh)
SI (5) SI3017827T1 (zh)
TR (1) TR201900418T4 (zh)
TW (4) TWI487534B (zh)
UA (2) UA96583C2 (zh)
WO (3) WO2007071710A2 (zh)

Families Citing this family (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2385100T3 (es) * 2000-06-29 2012-07-18 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Composición de vacuna multivalente con dosis reducida de Haemophilus influenzae de tipo B
ES2258108T3 (es) * 2000-11-07 2006-08-16 Immunovaccine Technologies Inc. Vacunas con respuesta inmune mejorada y procedimientos de preparacion de las mismas.
EP2425856A1 (en) 2005-04-08 2012-03-07 Wyeth LLC Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
ATE536884T1 (de) 2005-06-27 2011-12-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogene zusammensetzung
LT2384765T (lt) 2005-12-22 2017-01-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae vakcina
JP2010501012A (ja) * 2006-08-17 2010-01-14 ザ ユーエービー リサーチ ファウンデーション 免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドおよびその使用
US8398985B2 (en) * 2007-04-23 2013-03-19 Serum Institute Of India Ltd. Antigenic polysaccharides and process for their preparation
AR066376A1 (es) * 2007-05-02 2009-08-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna
EA020817B1 (ru) 2007-06-26 2015-02-27 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
JP5731198B2 (ja) 2007-09-27 2015-06-10 イムノバクシーン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｖａｃｃｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． インビボでのポリヌクレオチドの送達のための連続疎水相を含む担体におけるリポソームの使用
ATE553774T1 (de) 2007-10-19 2012-05-15 Novartis Ag Meningokokkenimpfstoffformulierungen
WO2009094730A1 (en) * 2008-02-01 2009-08-06 Newcastle Innovation Limited Vaccine compositions
KR20110009158A (ko) * 2008-04-16 2011-01-27 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
ES2553113T3 (es) * 2008-04-16 2015-12-04 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacuna
WO2009143413A1 (en) * 2008-05-22 2009-11-26 Children'smedical Center Corporation Synergistic immunogenic fusion protein-polysaccharide conjugate
WO2009146523A1 (en) 2008-06-05 2009-12-10 Immunovaccine Technologies Inc. Compositions comprising liposomes, an antigen, a polynucleotide and a carrier comprising a continuous phase of a hydrophobic substance
GB0822633D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Formulation
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
AU2009329193A1 (en) 2008-12-17 2011-07-14 Novartis Ag Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor
CN102438649A (zh) * 2009-03-24 2012-05-02 诺华有限公司 脑膜炎球菌h因子结合蛋白和肺炎球菌结合糖的组合物
CA2756522C (en) 2009-03-24 2018-06-26 Novartis Ag Adjuvanting meningococcal factor h binding protein
RU2549438C2 (ru) * 2009-03-24 2015-04-27 Новартис Аг Комбинации, включающие сахарид пневмококка серотипа 14
EP2424562B1 (en) * 2009-04-30 2015-10-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pneumococcal vaccine and uses thereof
WO2010141312A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Wake Forest University Health Sciences Flagellin fusion proteins and conjugates comprising pneumococcus antigens and methods of using the same
CA2773637A1 (en) 2009-09-10 2011-03-17 Novartis Ag Combination vaccines against respiratory tract diseases
KR20110068831A (ko) * 2009-12-16 2011-06-22 재단법인 전라남도생물산업진흥재단 리포좀 조성물, 그 제조방법, 및 폐렴 백신으로서의 그 용도
TW201136603A (en) * 2010-02-09 2011-11-01 Merck Sharp & Amp Dohme Corp 15-valent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine composition
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
GB201003924D0 (en) * 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
CA2803239A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding proteins
EP2613805B1 (en) 2010-09-10 2019-10-23 GlaxoSmithKline Biologicals SA Meningococcus overexpressing nada and/or nhba and outer membrane vesicles derived therefrom
WO2012072769A1 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Novartis Ag Pneumococcal rrgb epitopes and clade combinations
CN103533954B (zh) * 2011-03-02 2015-09-09 诺华股份有限公司 含较低剂量的抗原和/或佐剂的联合疫苗
GB201103836D0 (en) 2011-03-07 2011-04-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
BR112013029514A2 (pt) * 2011-05-17 2019-09-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa composição imunogênica, vacina, e, método de tratar ou impedir uma doença
ES2855474T3 (es) 2011-10-06 2021-09-23 Immunovaccine Technologies Inc Composiciones de liposomas que comprenden un adyuvante que activa o incrementa la actividad de TLR2 y usos del mismo
BR112014016223A8 (pt) 2011-12-29 2017-07-04 Novartis Ag combinações adjuvantes de proteínas de ligação de fator h meningocócico
CA2863178C (en) * 2012-01-30 2021-04-06 Serum Institute Of India Ltd. Immunogenic composition
EP2809785B1 (en) 2012-02-02 2017-11-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Promoters for increased protein expression in meningococcus
EP2811981B1 (en) * 2012-02-07 2019-05-08 Infectious Disease Research Institute Improved adjuvant formulations comprising tlr4 agonists and methods of using the same
US20150132339A1 (en) * 2012-03-07 2015-05-14 Novartis Ag Adjuvanted formulations of streptococcus pneumoniae antigens
CN104159603A (zh) 2012-03-08 2014-11-19 诺华股份有限公司 带有tlr4激动剂的联合疫苗
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
RU2510281C2 (ru) * 2012-06-22 2014-03-27 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитоп" (ООО "Эпитоп") ВАКЦИНА ПРОТИВ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ Streptococcus pneumoniae, НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА
WO2014009971A2 (en) * 2012-07-07 2014-01-16 Bharat Biotech International Limited Non-alcoholic vaccine compositions free from animal- origin and process for preparation thereof
SI2885007T1 (sl) 2012-08-16 2018-12-31 Pfizer Inc. Postopki in kompozicije glikokonjugacij
RU2015106930A (ru) 2012-09-06 2016-10-20 Новартис Аг Комбинированные вакцины с менингококком серогруппы в и к/д/с
CN109289045A (zh) * 2012-09-19 2019-02-01 国立大学法人大阪大学 含有肺炎球菌表面蛋白a的肺炎球菌疫苗
GB201218660D0 (en) 2012-10-17 2012-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
KR20140075196A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075201A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
CN105007935A (zh) 2012-12-18 2015-10-28 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 用于保护免于白喉和/或破伤风的缀合物
PT3363806T (pt) * 2012-12-20 2022-12-16 Pfizer Processo de glicoconjugação
RU2544168C1 (ru) * 2014-01-17 2015-03-10 Андрей Дмитриевич Протасов Способ формирования иммунологической памяти к антигенам streptococcus pneumoniae у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких
CA2937184A1 (en) * 2014-01-21 2015-07-30 Pfizer Inc. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof
ES2820824T3 (es) * 2014-01-21 2021-04-22 Pfizer Composiciones inmunogénicas que comprenden antígenos sacáridos capsulares conjugados y usos de las mismas
JP6585624B2 (ja) * 2014-01-21 2019-10-02 ファイザー・インク 肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖体およびそれらのコンジュゲート
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
ES2701169T3 (es) 2014-02-14 2019-02-21 Pfizer Conjugados glucoproteicos inmunogénicos
CN103893751B (zh) * 2014-03-26 2016-04-20 天津康希诺生物技术有限公司 一种肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗及其制备方法
CN103936842B (zh) * 2014-04-30 2016-03-23 重庆医科大学 肺炎链球菌溶血素突变体及其作为粘膜免疫佐剂的应用
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
WO2016079755A1 (en) * 2014-11-20 2016-05-26 Biological E Limited Codon optimized polynucleotide for high level expression of crm197
WO2016149771A1 (en) * 2015-03-26 2016-09-29 Gamma Vaccines Pty Limited Streptococcal vaccine
IL255106B2 (en) 2015-05-04 2023-04-01 Pfizer Protein-polysaccharide conjugates of group b streptococcus, methods for preparing conjugates, immunogenic preparations containing conjugates and their uses
MX2017015985A (es) * 2015-06-08 2018-08-15 Serum Inst Of India Private Ltd Metodos para mejorar la adsorcion de conjugados de polisacarido-proteina y formulacion de vacuna multivalente obtenida con los mismos.
RU2600838C1 (ru) * 2015-06-08 2016-10-27 Андрей Дмитриевич Протасов Способ усиления активности факторов неспецифической защиты у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких
KR20160146240A (ko) 2015-06-12 2016-12-21 전관구 염기성 계면활성제를 이용한 산화은나노 및 은나노 제조 방법
RS61440B1 (sr) * 2015-06-23 2021-03-31 Biological E Ltd Multivalentna pneumokokna konjugatna vakcina
SG10202005253TA (en) * 2015-07-21 2020-07-29 Pfizer Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
GB201518684D0 (en) * 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB201522068D0 (en) * 2015-12-15 2016-01-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Dried composition
SG11201900789VA (en) * 2016-08-05 2019-02-27 Sanofi Pasteur Inc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
TWI789357B (zh) 2016-08-05 2023-01-11 南韓商Ｓｋ生物科技股份有限公司 多價肺炎球菌多醣-蛋白質共軛物組成物(二)
CN118236477A (zh) 2016-09-02 2024-06-25 赛诺菲巴斯德股份有限公司 脑膜炎奈瑟氏菌疫苗
JP7125197B2 (ja) 2016-09-27 2022-08-24 イミューノヴァクシーン テクノロジーズ インコーポレイテッド ヒト対象において抗体免疫応答を誘導するために低投与体積ｂ細胞エピトープ組成物を使用する方法
WO2018064444A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Biological E Limited Multivalent pneumococcal vaccine compositions comprising polysaccharide-protein conjugates
CN109922828A (zh) * 2016-10-20 2019-06-21 Km生物医药股份公司 使用具有降低了的分子量的PRP的Hib结合疫苗的制造方法
KR102083973B1 (ko) * 2016-10-28 2020-04-23 주식회사 엘지화학 향상된 IgG 역가를 갖는 다가면역원성 조성물 및 이의 용도
CN108144052A (zh) * 2016-12-02 2018-06-12 武汉博沃生物科技有限公司 肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物及其制取方法和用途
WO2018124959A2 (en) 2016-12-28 2018-07-05 Henriques Normark Birgitta Microparticles from streptococcus pneumoniae as vaccine antigens
MX2019007910A (es) * 2016-12-30 2019-12-05 Sutrovax Inc Conjugados de polipeptido-antigeno con aminoacidos no naturales.
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
HUE059252T2 (hu) * 2017-01-20 2022-11-28 Pfizer Immunogén készítmények pneumokokkusz vakcinákban történõ alkalmazásra
EP3576759A4 (en) 2017-01-31 2020-11-11 Merck Sharp & Dohme Corp. PROCESS FOR THE PREPARATION OF CAPSULE POLYSACCHARIDE PROTEIN CONJUGATES FROM STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE SEROTYPE 19F
CA3052621A1 (en) 2017-02-03 2018-08-09 Schadeck, Eva Barbara Haemophilus influenzae saccharide-carrier conjugate compositions and uses thereof
US11400162B2 (en) 2017-02-24 2022-08-02 Merck Sharp & Dohme Llc Processes for the formulation of pneumococcal polysaccharides for conjugation to a carrier protein
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
CN107929728A (zh) * 2017-04-19 2018-04-20 武汉博沃生物科技有限公司 一种肺炎球菌蛋白疫苗及其制备方法
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
KR20240018697A (ko) 2017-06-10 2024-02-13 인벤트프라이즈 인크. 면역원성과 항원항체 결합성이 개선된 2가 또는 다가 접합체 다당류를 가진 다가 접합체 백신
WO2019043245A1 (en) * 2017-09-04 2019-03-07 London School Of Hygiene And Tropical Medicine MICROBIAL CELLS EXPRESSING STREPTOCOCCAL SERROTYPES
CN111050794A (zh) * 2017-09-07 2020-04-21 默沙东公司 将肺炎球菌多糖与载体蛋白缀合的配制方法
EP3678652A4 (en) 2017-09-07 2021-05-19 Merck Sharp & Dohme Corp. ANTIPNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDES AND THEIR USE IN POLYSACCHARIDE-CARRIER PROTEIN IMMUNOGENIC CONJUGATES
CN116898959A (zh) 2017-09-07 2023-10-20 默沙东有限责任公司 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途
AU2018400751B2 (en) 2017-12-06 2022-07-21 Merck Sharp & Dohme Llc Compositions comprising Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
KR102486891B1 (ko) 2018-02-05 2023-01-10 사노피 파스퇴르 인코포레이티드 다가 폐렴구균성 다당류-단백질 접합체 조성물
IL276229B2 (en) 2018-02-05 2024-01-01 Sanofi Pasteur Inc A multivalent pneumococcal protein-polysaccharide conjugate preparation
KR20190121713A (ko) 2018-04-18 2019-10-28 에스케이바이오사이언스(주) 스트렙토코커스 뉴모니애 협막 다당류 및 그의 면역원성 접합체
EP3787673A4 (en) 2018-04-30 2022-04-27 Merck Sharp & Dohme Corp. METHODS FOR PRODUCING CAPSULAR CARRIER PROTEIN-POLYSACCHARIDE CONJUGATES OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
US11896656B2 (en) 2018-04-30 2024-02-13 Merck Sharp & Dohme Llc Methods for providing a homogenous solution of lyophilized mutant diptheria toxin in dimethylsulfoxide
KR20210005161A (ko) * 2018-04-30 2021-01-13 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 리오스피어로부터 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조하는 방법
CN108524926B (zh) * 2018-06-29 2021-06-29 康希诺生物股份公司 一种多价肺炎球菌结合疫苗的制剂组合及其应用
EP3817775B1 (en) * 2018-07-04 2024-09-04 Vaxcyte, Inc. Improvements in immunogenic conjugates
BR112021004193A2 (pt) * 2018-09-12 2021-05-25 Affinivax, Inc. vacinas pneumocócicas multivalentes
EP3863667A4 (en) 2018-10-12 2022-08-17 Biological E Limited POLYVALENT PNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDE PROTEIN CONJUGATE VACCINE
AU2019401535B2 (en) 2018-12-19 2023-12-14 Merck Sharp & Dohme Llc Compositions comprising Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
TW202116352A (zh) * 2019-07-18 2021-05-01 南韓商賽特瑞恩股份有限公司 包含多價肺炎球菌多醣-蛋白共軛物的免疫組成物、醫藥組成物及其用途
US20210070890A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Serum Institute Of India Private Limited Method for obtaining purified bacterial polysaccharides
WO2021053586A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Alcon Inc. Wet-packed soft hydrogel ocular inserts
US20210220461A1 (en) * 2020-01-17 2021-07-22 Inventprise, Llc Multivalent Streptococcus Vaccines
KR20210117663A (ko) 2020-03-20 2021-09-29 주식회사 보고 수직형 침지식 dpf 세척장치
US12053515B2 (en) 2020-08-10 2024-08-06 Inventprise, Inc. Multivalent pneumococcal glycoconjugate vaccines containing emerging serotype 24F
CN116121106A (zh) * 2021-07-08 2023-05-16 成都生物制品研究所有限责任公司 肺炎链球菌无动物源冻干保护剂
KR20240055283A (ko) 2022-10-20 2024-04-29 우남철 Ｄｐｆ용 순환펌프 연결구
WO2024180472A1 (en) 2023-02-28 2024-09-06 Alcon Inc. Ocular inserts

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1351501A (zh) * 1999-03-19 2002-05-29 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 疫苗
CN1449293A (zh) * 2000-06-29 2003-10-15 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 多价疫苗组合物
CN1635904A (zh) * 2001-12-18 2005-07-06 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 肺炎链球菌疫苗

Family Cites Families (177)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4057685A (en) 1972-02-02 1977-11-08 Abbott Laboratories Chemically modified endotoxin immunizing agent
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
EP0027888B1 (en) 1979-09-21 1986-04-16 Hitachi, Ltd. Semiconductor switch
BE889979A (fr) 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4619828A (en) 1982-07-06 1986-10-28 Connaught Laboratories, Inc. Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US4459286A (en) 1983-01-31 1984-07-10 Merck & Co., Inc. Coupled H. influenzae type B vaccine
US4695624A (en) 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4808700A (en) 1984-07-09 1989-02-28 Praxis Biologics, Inc. Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
JP2851288B2 (ja) 1987-06-05 1999-01-27 アメリカ合衆国 癌診断および管理における自己分泌運動性因子
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5785973A (en) * 1988-02-01 1998-07-28 Praxis Biologics, Inc. Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DE3841091A1 (de) 1988-12-07 1990-06-13 Behringwerke Ag Synthetische antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
RU2121481C1 (ru) 1988-12-16 1998-11-10 Де Стат Дер Недерланден Вертегенвордигд Дор де Министр Ван Велзейн, Волксгезондхейд эн Кюлтюр Модифицированный пневмолизин, рекомбинантная плазмида, способ получения модифицированного пневмолизина, вакцина
ES2055785T3 (es) 1989-01-17 1994-09-01 Eniricerche Spa Peptidos sinteticos y su uso como vehiculos universales para la preparacion de conjugados inmunogenos aptos para el desarrollo de vacunas sinteticas.
EP0382271B1 (en) 1989-02-04 1994-12-21 Akzo Nobel N.V. Tocols as adjuvant in vaccine
CA2017507C (en) 1989-05-25 1996-11-12 Gary Van Nest Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
FR2649012B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Emulsions multiphasiques injectables
FR2649013B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
US5334379A (en) 1989-07-14 1994-08-02 American Cyanamid Company Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
DE69113564T2 (de) 1990-08-13 1996-05-30 American Cyanamid Co Faser-Hemagglutinin von Bordetella pertussis als Träger für konjugierten Impfstoff.
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
CA2059692C (en) * 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
CA2059693C (en) 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
ATE168132T1 (de) 1991-02-15 1998-07-15 Uab Research Foundation Strukturgen von pneumokokken-protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
GB9105992D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
NZ249704A (en) 1992-02-11 1996-11-26 Jackson H M Found Military Med A two carrier immunogenic construct comprising a 70+ kd molecule conjugated to at least 1 t-dependent antigen, preparation, compositions containing the construct
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
MY111880A (en) 1992-03-27 2001-02-28 Smithkline Beecham Biologicals S A Hepatitis vaccines containing 3-0 deacylated monophosphoryl lipid a
CA2135052A1 (en) 1992-05-06 1993-11-11 R. John Collier Diphtheria toxin receptor-binding region
DE69327534T2 (de) 1992-06-18 2000-06-08 The President And Fellows Of Harvard College, Cambridge Impfstoffe gegen diphtherietoxin
ATE188613T1 (de) 1992-06-25 2000-01-15 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantien enthaltende impfstoffzusammensetzung
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
GB9224584D0 (en) 1992-11-23 1993-01-13 Connaught Lab Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases
US5776468A (en) 1993-03-23 1998-07-07 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccine compositions containing 3-0 deacylated monophosphoryl lipid A
JP3429313B2 (ja) 1993-05-18 2003-07-22 オハイオ・ステイト・リサーチ・ファウンデーション 中耳炎ワクチン
ATE254475T1 (de) 1993-09-22 2003-12-15 Jackson H M Found Military Med Verfahren zur aktivierung von löslichem kohlenhydraten durch verwendung von neuen cyanylierungsreagenzien, zur herstellung von immunogenischen konstrukten
US6005099A (en) 1993-11-17 1999-12-21 Laboratoires Om S.A. Glucosamine disaccharides, method for their preparation, pharmaceutical composition comprising same, and their use
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
ATE328890T1 (de) 1994-07-15 2006-06-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
NZ304715A (en) 1995-03-22 1999-07-29 Jackson H M Found Military Med Production of immunogenic constructs using organic cyanylating reagents to activate carbohydrates and then coupling the carbohydrate to a protein, peptide or hapten
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
GB9620795D0 (en) 1996-10-05 1996-11-20 Smithkline Beecham Plc Vaccines
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5695768A (en) * 1995-06-07 1997-12-09 Alberta Research Council Immunostimulating activity of Streptococcus pneumoniae serotype 8 oligosaccharides
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
ATE323721T1 (de) 1996-05-01 2006-05-15 Univ Rockefeller Cholin-bindendes protein, welches als gegen pneumokokken gerichtetes vakzin verwendet wird
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
JP4012252B2 (ja) 1996-06-18 2007-11-21 アルザ コーポレイション 薬剤の経皮放出又はサンプリングを高めるための装置
EP0956289A4 (en) 1996-08-16 2004-10-13 Smithkline Beecham Corp NOVEL PROKARYOTA POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
DK0942983T4 (en) 1996-10-31 2014-12-01 Human Genome Sciences Inc Streptococcus pneumoniae antigens and vaccines
AU5355398A (en) 1996-11-12 1998-06-03 Regents Of The University Of Minnesota C3 binding protein of (streptococcus pneumoniae)
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
CN1133472C (zh) 1996-12-20 2004-01-07 阿尔萨公司 增加经皮样剂流量的装置
DE19708537A1 (de) 1997-03-03 1998-09-10 Biotechnolog Forschung Gmbh Neues Oberflächenprotein (SpsA-Protein) von Streptococcus pneumoniae etc.
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US6764840B2 (en) 1997-05-08 2004-07-20 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6303347B1 (en) 1997-05-08 2001-10-16 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
FR2763244B1 (fr) * 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
ATE380867T1 (de) 1997-06-03 2007-12-15 Sanofi Pasteur Ltd Lactoferrinrezeptorgen von moraxella
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
WO1999003884A2 (en) 1997-07-21 1999-01-28 North American Vaccine, Inc. Modified immunogenic pneumolysin, compositions and their use as vaccines
DE69815692T2 (de) 1997-09-05 2004-04-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Öl in wasser emulsionen mit saponinen
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
JP2001517449A (ja) 1997-09-24 2001-10-09 リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミネソタ ストレプトコッカス・ニューモニア由来のヒト補体ｃ３分解プロテイナーゼ
US6224880B1 (en) * 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
US5965714A (en) * 1997-10-02 1999-10-12 Connaught Laboratories, Inc. Method for the covalent attachment of polysaccharides to protein molecules
JP2001524533A (ja) 1997-12-02 2001-12-04 パウダージェクト ヴァクシンズ，インコーポレイテッド 粒子状ワクチン組成物の経皮的送達
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
US7018637B2 (en) 1998-02-23 2006-03-28 Aventis Pasteur, Inc Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccines
ATE461709T1 (de) 1998-04-07 2010-04-15 Medimmune Llc Choline-bindende proteine derivate aus pneumokoken als impfstoff
CN1191851C (zh) 1998-04-07 2005-03-09 圣朱德儿童研究医院 包含胆碱结合蛋白an－末端截取物的氨基酸的多肽、由该多肽衍生的疫苗及其应用
EP1073450A4 (en) 1998-04-23 2003-04-23 Uab Research Foundation PNEUMOCOCCAL SURFACE PROTEIN C (PSPC), EPITOPIC REGIONS, SELECTION OF CORRESPONDING STRES AND USES
WO1999064301A1 (fr) 1998-06-08 1999-12-16 Sca Emballage France Emballage a remise a plat rapide
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1091928B1 (fr) 1998-06-30 2007-02-28 OM Pharma Nouveaux pseudodipeptides acyles, leur mode de preparation et les compositions pharmaceutiques en renfermant
KR100704826B1 (ko) 1998-08-19 2007-04-09 박스터 헬쓰케어 에스.에이. Ｎ-아크릴로일화된 폴리사카라이드를 사용하여 제조된백신으로서 사용하기에 적합한 면역원성β-프로피온아미도-결합 폴리사카라이드 단백질 컨쥬게이트
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
JP2002526082A (ja) 1998-09-24 2002-08-20 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ストレプトコッカス・ニューモニア由来のヒト補体ｃ３分解ポリペプチド
US6541616B1 (en) 1998-10-01 2003-04-01 Antex Biologics Inc. Moraxella catarrhalis protein, gene sequence and uses thereof
CN100558401C (zh) 1998-10-16 2009-11-11 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 佐剂系统及疫苗
GB2359228A (en) 1998-11-17 2001-08-15 Schlumberger Technology Corp Transmitting information over a communication link
AU2027400A (en) 1998-11-19 2000-06-05 St. Jude Children's Research Hospital Identification and characterization of novel pneumococcal choline binding proteins, cbpg and cbpd, and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU776828B2 (en) * 1998-12-21 2004-09-23 Medimmune, Llc Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
DK1141306T3 (da) 1998-12-23 2008-08-18 Id Biomedical Corp Streptococcus-antigener
EP1034792A1 (en) 1999-03-11 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Intranasal delivery of pneumococcal polysaccharide vaccines
WO2000061761A2 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Techlab, Inc. Recombinant clostridium toxin a protein carrier for polysaccharide conjugate vaccines
US6558670B1 (en) 1999-04-19 2003-05-06 Smithkline Beechman Biologicals S.A. Vaccine adjuvants
IL145982A0 (en) 1999-04-19 2002-07-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO2000076540A2 (en) 1999-06-10 2000-12-21 Med Immune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and vaccines
US6319224B1 (en) 1999-08-20 2001-11-20 Bioject Medical Technologies Inc. Intradermal injection system for injecting DNA-based injectables into humans
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
US20040191834A1 (en) * 1999-10-28 2004-09-30 Laferriere Craig Antony Joseph Novel method
WO2001046127A1 (fr) 1999-12-22 2001-06-28 Om Pharma Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise
FR2806304B1 (fr) * 2000-03-17 2002-05-10 Aventis Pasteur Conjugues polysaccharidiques du pneumocoque a usage vaccinal contre le tetanos et la diphterie
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
JP5051959B2 (ja) 2000-06-20 2012-10-17 アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック ストレプトコッカス抗原
GB0108364D0 (en) * 2001-04-03 2001-05-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
GB0103170D0 (en) 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
AU8100101A (en) 2000-08-04 2002-02-18 Corixa Corp New immunoeffector compounds
GB0022742D0 (en) * 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
KR100894767B1 (ko) 2000-09-26 2009-04-24 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 화학적인 위치 변화에 의해 면역자극 올리고누클레오티드유사체의 면역자극 활성을 조절하는 방법
WO2002078673A1 (fr) 2001-03-29 2002-10-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de production d'un medicament sous forme de granules fins
US20030031684A1 (en) 2001-03-30 2003-02-13 Corixa Corporation Methods for the production of 3-O-deactivated-4'-monophosphoryl lipid a (3D-MLA)
AU2002309706A1 (en) 2001-05-11 2002-11-25 Aventis Pasteur, Inc. Novel meningitis conjugate vaccine
FR2827199B1 (fr) 2001-07-10 2004-07-09 Centre Nat Rech Scient Procede et machine de fabrication ex situ de reseaux de biopuces basse et moyennes integration
GB0123580D0 (en) 2001-10-01 2001-11-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
WO2003054007A2 (en) 2001-12-20 2003-07-03 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
BR0215588A (pt) 2002-02-04 2005-03-22 Corixa Corp Compostos imunoefetores
GB0213622D0 (en) * 2002-06-13 2002-07-24 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine Corporation
US20040096461A1 (en) 2002-07-30 2004-05-20 Baxter Healthcare Corporation Chimeric multivalent polysaccharide conjugate vaccines
AU2003250204B8 (en) 2002-08-02 2008-07-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Neisserial vaccine compositions comprising a combination of antigens
GB0220198D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Modified saccharides,conjugates thereof and their manufacture
JP3754420B2 (ja) 2003-02-04 2006-03-15 三洋電機株式会社 二次電池用電極板及びその製造方法並びにこの電極板を用いた二次電池
WO2004081515A2 (en) 2003-03-13 2004-09-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Purification process for bacterial cytolysin
CA2519511A1 (en) 2003-03-17 2004-09-30 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
AU2004251734B2 (en) 2003-06-23 2010-11-04 Baxalta GmbH Vaccines against group Y neisseria meningitidis and meningococcal combinations thereof
US8048432B2 (en) * 2003-08-06 2011-11-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Polysaccharide-protein conjugate vaccines
GB0323103D0 (en) * 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
GB0408977D0 (en) * 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
PL1740217T3 (pl) 2004-04-30 2012-03-30 Novartis Ag Szczepienie koniugatem meningokokowym
PL1748791T3 (pl) 2004-05-11 2010-08-31 De Staat Der Nederlanden Vert Door De Mini Van Vws LOS IgtB Neisseria Meningitidis jako adjuvant
GB0421083D0 (en) 2004-09-22 2004-10-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Purification process
GB0502096D0 (en) 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Purification of streptococcal capsular polysaccharide
EP2425856A1 (en) * 2005-04-08 2012-03-07 Wyeth LLC Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7955605B2 (en) * 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
ATE536884T1 (de) 2005-06-27 2011-12-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogene zusammensetzung
WO2007026249A2 (en) 2005-09-01 2007-03-08 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co Kg Multiple vaccination including serogroup c meningococcus
US20090035326A1 (en) 2005-11-01 2009-02-05 Novartis Ag Compositions with antigens adsorbed to calcium phosphate
TWI457133B (zh) * 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
LT2384765T (lt) 2005-12-22 2017-01-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae vakcina
GB0607088D0 (en) * 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
CA2650590C (en) 2006-04-26 2018-04-03 Micell Technologies, Inc. Coatings containing multiple drugs
EA020817B1 (ru) 2007-06-26 2015-02-27 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae
EP2385981B1 (en) 2008-12-18 2019-09-04 Wyeth LLC Method for controlling streptococcus pneumoniae polysaccharide molecular weight using carbon

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1351501A (zh) * 1999-03-19 2002-05-29 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 疫苗
CN1449293A (zh) * 2000-06-29 2003-10-15 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 多价疫苗组合物
CN1635904A (zh) * 2001-12-18 2005-07-06 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 肺炎链球菌疫苗

Also Published As

Publication number Publication date
ES2539795T3 (es) 2015-07-06
CR10122A (zh) 2008-08-21
IL191911A0 (en) 2008-12-29
BRPI0620460B8 (pt) 2021-05-25
BRPI0620193B1 (pt) 2019-12-31
CA2634887A1 (en) 2007-06-28
LT2384765T (lt) 2017-01-10
CN110179974B (zh) 2024-01-09
MY148141A (en) 2013-03-15
LT1973564T (lt) 2016-12-27
UA96934C2 (uk) 2011-12-26
JP5579387B2 (ja) 2014-08-27
US20190262447A1 (en) 2019-08-29
EP2382986A3 (en) 2012-08-22
PE20071305A1 (es) 2007-12-14
ES2630759T3 (es) 2017-08-23
BRPI0620163A2 (pt) 2011-11-01
PT1973564T (pt) 2017-01-24
DK1968631T3 (da) 2015-06-15
JP5849125B2 (ja) 2016-01-27
NZ569168A (en) 2012-02-24
AU2006327041A1 (en) 2007-06-28
CY1118535T1 (el) 2017-07-12
EP1968631A2 (en) 2008-09-17
SI1973564T1 (sl) 2017-02-28
HUE033081T2 (hu) 2017-11-28
EP1962899B1 (en) 2011-08-17
MA30066B1 (fr) 2008-12-01
KR101515078B1 (ko) 2015-04-24
EP1973564A2 (en) 2008-10-01
AR058592A1 (es) 2008-02-13
TR201900418T4 (tr) 2019-02-21
JP5792920B2 (ja) 2015-10-14
ES2614938T3 (es) 2017-06-02
HUE041979T2 (hu) 2019-06-28
AR058706A1 (es) 2008-02-20
EA014107B1 (ru) 2010-10-29
TW200738257A (en) 2007-10-16
CN101374548A (zh) 2009-02-25
CN101378778A (zh) 2009-03-04
AU2006327040A1 (en) 2007-06-28
IL191913A0 (en) 2009-02-11
AU2010241281A1 (en) 2010-11-25
BRPI0620193A2 (pt) 2011-11-01
CA2633772A1 (en) 2007-06-28
EP1962899A2 (en) 2008-09-03
CN101378779B (zh) 2015-09-02
US20100074922A1 (en) 2010-03-25
HRP20190037T1 (hr) 2019-02-22
CN101378778B (zh) 2013-02-06
ES2707499T3 (es) 2019-04-03
PT3017827T (pt) 2019-01-28
EP2384765A2 (en) 2011-11-09
US20180250389A9 (en) 2018-09-06
KR20080081063A (ko) 2008-09-05
EP2384765A3 (en) 2012-06-20
CA2808919C (en) 2016-04-19
JP2009520759A (ja) 2009-05-28
TW201350129A (zh) 2013-12-16
WO2007071711A3 (en) 2007-11-08
MA30065B1 (fr) 2008-12-01
NO20190104A1 (no) 2008-09-18
SI1968631T1 (sl) 2015-07-31
NO20082718L (no) 2008-09-16
JP5600337B2 (ja) 2014-10-01
PL1968631T3 (pl) 2015-08-31
CY1112677T1 (el) 2016-02-10
CY1118345T1 (el) 2017-06-28
US20220354941A1 (en) 2022-11-10
NO343981B1 (no) 2019-08-05
EP3020411A1 (en) 2016-05-18
CN110179974A (zh) 2019-08-30
JP5461838B2 (ja) 2014-04-02
EA014649B1 (ru) 2010-12-30
CA2634885A1 (en) 2007-06-28
MA30062B1 (fr) 2008-12-01
WO2007071711A2 (en) 2007-06-28
IL219641A (en) 2017-10-31
IL192084A (en) 2013-11-28
MX354843B (es) 2018-03-22
JP2012232985A (ja) 2012-11-29
KR101365001B1 (ko) 2014-02-21
EA200801367A1 (ru) 2008-12-30
CY1121376T1 (el) 2020-05-29
NO345368B1 (no) 2021-01-04
CR10119A (zh) 2008-07-29
NZ596500A (en) 2013-05-31
HRP20161682T1 (hr) 2017-01-27
US20090017059A1 (en) 2009-01-15
PL1962899T3 (pl) 2011-12-30
KR20080081060A (ko) 2008-09-05
WO2007071707A2 (en) 2007-06-28
WO2007071710A3 (en) 2007-11-29
EP2382986A2 (en) 2011-11-02
US20180207262A1 (en) 2018-07-26
TWI465248B (zh) 2014-12-21
IL211664A0 (en) 2011-05-31
EP1968631B1 (en) 2015-04-08
EP3017827A1 (en) 2016-05-11
CN103585623B (zh) 2016-09-28
CL2013002106A1 (es) 2014-03-07
KR101367237B1 (ko) 2014-03-14
KR101441368B1 (ko) 2014-09-24
MY147495A (en) 2012-12-14
HUE032903T2 (hu) 2017-11-28
PT2384765T (pt) 2017-02-06
CA2816182C (en) 2018-02-20
CA2634887C (en) 2016-01-19
US20150265702A1 (en) 2015-09-24
MY150719A (en) 2014-02-28
SG168517A1 (en) 2011-02-28
JP2009520760A (ja) 2009-05-28
NO20082646L (no) 2008-09-16
US9107872B2 (en) 2015-08-18
PT1962899E (pt) 2011-10-19
CA2633772C (en) 2015-09-15
WO2007071710A2 (en) 2007-06-28
DK1962899T3 (da) 2011-10-31
PH12014502544A1 (en) 2015-12-14
AU2006327040B2 (en) 2010-08-19
AU2006327036A1 (en) 2007-06-28
AU2006327036B2 (en) 2012-11-15
EP2402025A2 (en) 2012-01-04
AU2006327041B2 (en) 2010-08-26
JO2813B1 (en) 2014-09-15
HRP20110685T1 (hr) 2011-10-31
CN101374548B (zh) 2013-05-01
EP3470080A1 (en) 2019-04-17
BRPI0620460B1 (pt) 2019-08-13
BRPI0620163B1 (pt) 2019-08-13
DK1973564T3 (da) 2017-01-16
DK3017827T3 (en) 2019-02-18
TWI487534B (zh) 2015-06-11
EP3130348A1 (en) 2017-02-15
NZ569077A (en) 2011-08-26
US10279033B2 (en) 2019-05-07
PT1968631E (pt) 2015-07-20
CN103251940A (zh) 2013-08-21
EA200801374A1 (ru) 2008-12-30
BRPI0620460A2 (pt) 2011-11-16
JP5615323B2 (ja) 2014-10-29
BRPI0620163B8 (pt) 2021-05-25
CY1116407T1 (el) 2017-02-08
PL2384765T3 (pl) 2017-05-31
MY160199A (en) 2017-02-28
CA2808919A1 (en) 2007-06-28
HK1120230A1 (en) 2009-03-27
WO2007071707A3 (en) 2007-09-13
KR20140036327A (ko) 2014-03-25
EA200801344A1 (ru) 2008-12-30
JP2012229228A (ja) 2012-11-22
KR101418240B1 (ko) 2014-07-16
PE20071058A1 (es) 2007-11-27
NO20082647L (no) 2008-09-18
NO346529B1 (no) 2022-09-26
JP2009520761A (ja) 2009-05-28
AU2010241281B2 (en) 2012-12-06
US20150190521A1 (en) 2015-07-09
TW200738258A (en) 2007-10-16
IL191911A (en) 2015-09-24
IL192084A0 (en) 2008-12-29
WO2007071710A8 (en) 2008-09-04
NO344187B1 (no) 2019-09-30
IL191913A (en) 2012-07-31
US20160243219A1 (en) 2016-08-25
US9884113B2 (en) 2018-02-06
SI1962899T1 (sl) 2011-11-30
DK2384765T3 (en) 2017-01-09
US20090017072A1 (en) 2009-01-15
US11400147B2 (en) 2022-08-02
PL3017827T3 (pl) 2019-04-30
KR20130103831A (ko) 2013-09-24
BRPI0620193B8 (pt) 2021-05-25
ATE520415T1 (de) 2011-09-15
AR058707A1 (es) 2008-02-20
SI3017827T1 (sl) 2019-01-31
EP2402025A3 (en) 2012-03-07
SI2384765T1 (sl) 2017-03-31
EP3017827B1 (en) 2018-11-07
US20090010959A1 (en) 2009-01-08
US10646564B2 (en) 2020-05-12
KR20080081061A (ko) 2008-09-05
CA2634885C (en) 2016-04-19
JP5749689B2 (ja) 2015-07-15
EP1973564B1 (en) 2016-11-09
MX2008008140A (es) 2008-09-24
CA2816182A1 (en) 2007-06-28
NZ569076A (en) 2011-08-26
EP2384765B1 (en) 2016-11-23
TWI415622B (zh) 2013-11-21
IL219641A0 (en) 2012-06-28
JP2012211165A (ja) 2012-11-01
PL1973564T3 (pl) 2017-04-28
HRP20161681T1 (hr) 2017-01-13
LT3017827T (lt) 2019-01-10
UA96583C2 (uk) 2011-11-25
CN101378779A (zh) 2009-03-04
JP2014205673A (ja) 2014-10-30
EA014165B1 (ru) 2010-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101374548B (zh) 含有肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗
CN101883583B (zh) 含有肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗
CN103127499A (zh) 缀合疫苗
AU2013200552B9 (en) Conjugate vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant