ES2258108T3 - Vacunas con respuesta inmune mejorada y procedimientos de preparacion de las mismas. - Google Patents
Vacunas con respuesta inmune mejorada y procedimientos de preparacion de las mismas.Info
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Abstract
Una composición para usar como vacuna, que comprende: (a) un transportador que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba farmacéutica y/o inmunológicamente aceptable; (b) liposomas; (c) un antígeno; y (d) un adyuvante adecuado
Description
Vacunas con respuesta inmune mejorada y
procedimientos de preparación de las mismas.
La presente invención se refiere al campo de la
inmunología, en particular a vacunas y su preparación.
En general, las vacunas usan dosis bajas de una
antígeno específico para generar resistencia en un huésped a los
efectos de dosis más altas del antígeno o a compuestos antigénicos
similares. Normalmente, los antígenos usados en las vacunas son
partes de microorganismos enteros o toxinas desnaturalizadas
(toxoides) que inducen la producción de anticuerpos. Por desgracia,
sólo algunos de los anticuerpos producidos se unen al microorganismo
o a la toxina diana porque, en la mayoría de los casos, el antígeno
usado en la vacuna difiere estructuralmente de la diana. La
disponibilidad limitada de antígenos útiles ha planteado
limitaciones al desarrollo de vacunas en el pasado. Los avances en
la ingeniería genética han hecho que la producción de antígenos por
medios recombinantes sea posible. Sin embargo, el uso de antígenos
producidos por medios recombinantes a menudo tiene como resultado
una producción baja de anticuerpos con mala afinidad por el antígeno
nativo diana por las razones indicadas anteriormente. El efecto de
la inmunización se puede potenciar cuando se producen más
anticuerpos con afinidad elevada. En la técnica existe una necesidad
de desarrollar vacunas que produzcan una respuesta inmunitaria mayor
sin incrementar la cantidad de antígeno usado en la vacuna. En
particular, existe una necesidad de vacunas de administración única
que eliminen o reduzcan la necesidad de inmunizaciones de
repuesto.
Muchas estrategias de inmunización se
beneficiarían de tal desarrollo. Las vacunas que usan antígenos
derivados de fuentes mamíferos, víricas, bacterianas, fúngicas o
levaduras tienen muchos usos. Por ejemplo, los antígenos de fuentes
víricas, bacterianas, fúngicas o levaduras son útiles en la
prevención de enfermedades. Los antígenos de mamíferos pueden usarse
en el tratamiento del cáncer o en la inmunoanticoncepción. Las
vacunas inmunoanticonceptivas usan antígenos derivados de mamíferos
que tienen como resultado una infertilidad o esterilidad transitoria
de un huésped, en particular un huésped mamífero, al favorecer la
producción de anticuerpos con afinidad por la superficie del oocito.
Las vacunas inmunoanticonceptivas encuentran usos en el control de
poblaciones de animales salvajes, incluidas las poblaciones de
animales domésticos asilvestrados tales como gatos.
En particular, las poblaciones de gatos
asilvestrados han sido difíciles de controlar y son una amenaza para
muchas aves y animales pequeños. Los gatos asilvestrados perdidos
también actúan como vectores de enfermedades humanas y animales. En
un esfuerzo por controlar las poblaciones de gatos perdidos se han
usado varios métodos, incluidos la caza, la colocación de trampas y
el envenenamiento, pero estos métodos han tenido un éxito limitado y
se han encontrado con la oposición pública. Durante las últimas dos
décadas se ha utilizado de forma creciente la esterilización
quirúrgica de gatos asilvestrados como herramienta humana para
disminuir las poblaciones de gatos asilvestrados. La aceptación de
este procedimiento está extendida; sin embargo, las desventajas
incluyen el coste, los cambios de conducta y el riesgo de infección
y mortalidad. A pesar del éxito de la esterilización quirúrgica a
gran escala, tales programas no son ni económica ni logísticamente
viables en muchos lugares, ya que la captura de animales requiere
tiempo, es difícil y estresante para el animal. La
inmunoanticoncepción ofrece un procedimiento alternativo con menores
costes y de fácil administración. No obstante, la
inmunoanticoncepción a largo plazo en general requiere vacunaciones
de refuerzo, lo que la convierte en poco práctica para el control de
especies salvajes y vagabundos.
Por lo general, las vacunas comprenden un
antígeno, que provoca la respuesta inmunitaria en el huésped, y una
variedad de transportadores, excipientes y adyuvantes útiles para
administrar el antígeno al huésped.
Los liposomas, que encapsulan el antígeno, se han
usad de forma creciente en la liberación de vacunas. Se ha mostrado
que la liberación en liposoma de antígenos desnaturalizados favorece
la producción de anticuerpos que reconocen epítopos nativos
(Muttllainen, S., I.Idanpaan-Heikkila, E. Wahlstrom,
M. Nominen, P-H. Makela y M. Sarvas, 1995. "The
Neisseria meningitidis outer membrane protein P1 produced in
Bacillus subtilis and reconstituted into phospholipid
vesicles elicits antibodies to native P1 epitopes". Microbial
Pathogen. 18; 423-436). Aunque los liposomas
son vehículos de liberación de vacunas útiles, su uso solo no ha
proporcionado una vacuna de dosis única eficaz, en particular en lo
que se refiere a las vacunas inmunoanticonceptivas.
La mayoría de las vacunas inmunoanticonceptivas
usan adyuvante completo de Freund (ACF), seguido por adyuvante
incompleto de Freund (AIF) en múltiples inyecciones para ayudar a la
producción de suficientes anticuerpos como para ejercer un efecto
inmunoanticonceptivo (véase Ivanova, y col., 1989. "Contraceptive
potencial of porcine zona pellucida in cats." Theriogenology. 43:
969-981 y Sacco y col., 1989. "Effect of varying
dosage and adjuvants on antibody response in squirrel monkeys
(Saimiri sciureus) immunized with the porcine zona pellucida
Mr= 55,000 glycoprotein (ZP3)". Am. J. Reprod. Immunol.
21: 1-8). Algunos investigadores han usado otros
adyuvantes, tales como Ribi^{TM} y TiterMax^{TM}. El alumbre
(fosfato y/o hidróxido de aluminio) posee una larga historia de uso
como adyuvante. El alumbre es el único adyuvante reconocido como
seguro por la Food and Drug Administration. Muchas vacunas
inmunoanticonceptivas que usan alumbre requieren una inyección
principal y varias inyecciones de refuerzo para producir suficientes
anticuerpos para un efecto inmunoanticonceptivo (véase Bagavant y
col., 1994. "Antifertility effects of porcine zona pellucida 3
immunization usinf permissible adjuvants in female bonnet monkeys
(Macaca radiata): reversibility, effect on follicular
development and hormonal profiles". J. Reprod. Fertil.
102: 17-25). Algunos estudios han mostrado que el
alumbre no es un adyuvante adecuado para vacunas de
inmunoanticoncepción contra la zona pelúcida (véase Sacco y col.,
1989, Am. J. Reprod. Immunol. 21: 1-8 y
Bagavant y col., 1994. J. Reprod. Fertil 102:
17-25).
Por lo general, la técnica anterior se ha basado
en el uso de un medio acuoso o emulsiones de aceite en agua como
transportadores. Por ejemplo, Muttilainen y col. (Microbial
Pathogen. 18: 423-436 (1995) usan un medio
acuoso en combinación con liberación liposómica para provocar una
respuesta inmunitaria. Popescu (patentes de EE.UU. 5.897.873
expedida el 27 de abril de 1999 y 6.090.406 expedida el 18 de julio
de 2000), Alving (patentes de EE.UU. 6.093.406 expedida el 25 de
julio de 2000 y 6.110.492 expedida el 29 de agosto de 2000) y
Muderhwa y col. ("Oil-in-water
liposomal emulsions: Characterization and potential use in vaccine
delivery", (diciembre, 1999) J Pharm Sci. 88 (12):
1332-9) también usan sistemas liposómicos junto con
un transportador de aceite en agua como sistema de liberación en una
vacuna. Popescu usa alumbre con liposomas consistentes en colesterol
esterificado con succinato u otros ácidos orgánicos. La patente de
EE.UU. 6.093-406 enseña el uso de alumbre y
liposomas compuestos por Lípido A o Lípido A no pirogénico en una
emulsión de aceite en agua para liberar una vacuna basada en
antígenos palúdicos. La patente de EE.UU. 6.110.492 y Muderhwa
enseñan el uso de liposomas compuestos por Lípido A o Lípido A no
pirogénico en una emulsión de aceite en agua para liberar antígenos
específicos de la próstata. Hilbert y col. 1999 "Biodegradable
microspheres containing influenza A vaccine: immune response to
mice" Vaccine 17 (9-10):
1065-1073 atañe a los intentos para superar el
problema de la ausencia de asociación física entre el antígeno y el
adyuvante en las vacunas de la gripe. Como han analizado Hilbert y
col, se ha propuesto como una solución la microencapsulación de las
microesferas de poliéster de antígeno y adyuvante. Sin embargo, se
ha observado desnaturalización y agregación de las proteínas cuando
se usan microesferas de PLGA. Se han registrado resultados mejores
cuando se usan microesferas copoliméricas tribloque ABA. Hilbert
y col. compararon la respuesta inmunitaria contra
microesferas cargadas con antígeno de la gripe formadas por PLGA o
ABA (dos materiales de poliéster) en comparación con una vacuna
líquida convencional. Las microesferas de poliéster se suspendieron
en un vehículo de inyección acuosa (es decir, transportador) para la
inmunización de ratones.
La patente 5.376.141 de EE.UU. del solicitante,
expedida el 7 de abril de 1998, enseña una vacuna
inmunoanticonceptiva de dosis única para focas derivada de antígenos
de la zona pelúcida. Aunque los resultados conseguidos con esta
vacuna son buenos, todavía existe una necesidad para una vacuna de
inmunoanticoncepción duradera y de dosis única eficaz en una
variedad de especies usando adyuvantes aprobados por la Agencia
Norteamericana del Medicamento.
También sigue habiendo una necesidad de
inmunovacunas duraderas en general, que sean eficaces usando una
variedad de antígenos en una variedad de especies usando adyuvantes
aprobados por la Agencia Norteamericana del Medicamento.
De acuerdo con la invención se proporciona una
composición para usar como vacuna, que comprende:
- (a)
- un transportador que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba farmacéutica y/o inmunológicamente aceptable;
- (b)
- liposomas;
- (c)
- un antígeno; y
- (d)
- un adyuvante adecuado.
Además se proporciona el uso de:
- (a)
- un transportador que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba farmacéutica y/o inmunológicamente aceptable;
- (b)
- liposomas;
- (c)
- un antígeno; y
- (d)
- un adyuvante adecuado
En la fabricación de un medicamento para
potenciar una respuesta inmunitaria en un animal.
Todavía más, se proporciona un procedimiento para
preparar una composición de vacuna que comprende las etapas de:
- (a)
- encapsular un antígeno o un complejo antígeno/adyuvante en liposomas para formar un antígeno encapsulado en liposoma;
- (b)
- mezclar el antígeno encapsulado en liposoma con un transportador que comprenda una fase continua de una sustancia hidrófoba farmacéutica y/o inmunológicamente aceptable; y
- (c)
- añadir un adyuvante adecuado si en la parte (a) no se usa un complejo antígeno/adyuvante.
Inesperadamente y de forma única, en la
actualidad se ha encontrado que usar una fase continua de una
sustancia hidrófoba como el transportador en una composición de
vacuna de la presente invención potencia la respuesta inmunitaria.
La respuesta potenciada se caracteriza por títulos elevados de
anticuerpos de larga duración tras la administración de una única
vacuna, que tiene como resultado una mayor duración de la respuesta
inmunitaria. Esto es particularmente cierto para las vacunas que
también comprenden antígeno encapsulado en liposoma y un adyuvante
(o mezcla de antígeno/adyuvante). Las composiciones de vacuna de la
presente invención generalmente son eficaces como dosis única y
proporcionan una respuesta inmunitaria a largo plazo en una variedad
de especies, normalmente sin requerir refuerzos.
Aunque no se avala ninguna teoría concreta de
acción, se piensa que, cuando se usa una composición de vacuna de la
presente invención, la producción de anticuerpos IgG se produce en
dos fases y los anticuerpos producidos en cada fase difieren en su
reconocimiento del epítopo. Los anticuerpos producidos en la segunda
fase de producción de IgG poseen más afinidad por antígenos de la
proteína nativa, lo que convierte a la vacuna en más eficaz. El uso
de vacunas convencionales con una inyección principal y refuerzos
producen anticuerpos que poseen distinta especificidad de unión por
un antígeno que el uso de una composición de vacuna de la presente
invención.
El transportador comprende una fase continua de
una sustancia hidrófoba, preferentemente una sustancia hidrófoba
líquida. La fase continua puede ser una sustancia hidrófoba
esencialmente pura, una mezcla de sustancias hidrófobas, una
emulsión de agua en una sustancia hidrófoba o una emulsión de agua
en una mezcla de sustancias hidrófobas.
Las sustancias hidrófobas que son útiles en la
presente invención son aquéllos que son farmacéutica y/o
inmunológicamente aceptables. Idealmente, la sustancia hidrófoba es
una que ha sido aprobada para usar por agencias reguladoras
sanitarias tales como la Agencia Norteamericana del medicamento de
EE.UU. Preferentemente, el transportador es un líquido, pero ciertas
sustancias hidrófobas que no son líquidas a temperatura atmosférica
se pueden licuar, por ejemplo mediante calentamiento, y también son
útiles en esta invención.
Las emulsiones de aceite o agua en aceite son
transportadores particularmente adecuados para usar en la presente
invención. Los aceites son farmacéutica y/o inmunológicamente
aceptables. Ejemplos preferidos de aceites son aceite mineral
(especialmente aceite mineral de viscosidad alta o baja), aceite
vegetal (por ejemplo, aceite de maíz o de colza), aceite de nuez
(por ejemplo, aceite de cacahuete) y escualeno. Se prefiere más un
aceite mineral de viscosidad baja. También se pueden usar grasas
animales y materiales poliméricos hidrófobos artificiales, en
particular aquéllos que son líquidos a temperatura atmosférica o que
se pueden licuar con relativa facilidad.
La cantidad de sustancia hidrófoba usada no es
crucial pero normalmente es de aproximadamente 0,1 ml por dosis a
aproximadamente 1,5 ml por dosis, en función del tamaño del animal y
la cantidad de antígeno que se está usando. Para los animales
pequeños, la cantidad de sustancia hidrófoba es, preferentemente, de
aproximadamente 0,20 ml a aproximadamente 1,0 ml por dosis, mientras
que para animales grandes, la cantidad es, preferentemente, de
aproximadamente 0,45 ml a aproximadamente 1,5 ml por dosis.
Normalmente, para animales pequeños se usan 0,25 ml por dosis,
mientras que para animales grandes se usan 0,5 ml por dosis.
Los antígenos adecuados son todos los productos
químicos que sean capaces de producir una respuesta inmunitaria en
un microorganismo huésped. Preferentemente, el antígeno es una
proteína o péptido adecuada nativa o no nativa, recombinante o
desnaturalizada, o un fragmento de la misma capaz de producir la
respuesta inmunitaria deseada en un microorganismo huésped. Los
microorganismos huésped son, preferentemente, animales (incluidos
mamíferos), más preferentemente gatos, conejos, caballos y/o
ciervos. El antígeno puede ser de origen vírico, bacteriano,
protozoico o mamífero. Por lo general se sabe que los antígenos son
cualquier producto químico (normalmente proteínas u otros péptidos)
que sean capaces de provocar una respuesta inmunitaria en un
microorganismo huésped. Más particularmente, cuando un antígeno se
introduce en un microorganismo huésped, se une a un anticuerpo sobre
las células B y hacen que el huésped produzca más cantidad del
anticuerpo. Para un análisis general de antígenos y la respuesta
inmunitaria, véase Kuby, J., Immunology, 3ª Ed. W. H. Freeman
& C. NY (1997).
Los antígenos que provocan una respuesta
inmunitaria relacionada con el cáncer, la anticoncepción y otros
trastornos biológicos o efectos se pueden usar en la preparación de
inmunovacunas. Algunos ejemplos típicos no limitantes que pueden
usarse son alcohol deshidrogenasa (ADH), estreptoquinasa, antígeno
de superficie de la hepatitis B y glicoproteínas de la zona
pelúcida (ZP).
Cuando la respuesta inmunitaria deseada es la
anticoncepción en mamíferos, los epítopos diana se encuentran en
oocitos de mamífero. En este caso se pueden usar glicoproteínas de
la zona pelúcida (ZP) o proteínas recombinantes o fragmentos
peptídicos derivados de las mismas. En particular, en una vacuna de
inmunoanticoncepción se pueden usar como antígeno glicoproteínas de
la zona pelúcida aisladas solubilizadas y extraídas con calor
(SIZP). Más particularmente, se puede usar la zona pelúcida porcina
intacta soluble.
La cantidad de antígeno usada en una dosis de la
composición de vacuna puede variar en función del tipo de antígeno y
del tamaño del huésped. Un experto en la técnica será capaz de
determinar, sin experimentación indebida, la cantidad eficaz de
antígeno a usar en una aplicación concreta.
En el caso de las SIZP, la cantidad usada
normalmente entra dentro del intervalo de aproximadamente 20 \mug
a aproximadamente 2 mg por dosis, más preferentemente de
aproximadamente 20 \mug a aproximadamente 200 \mug, e incluso
más preferentemente de aproximadamente 40 \mug a aproximadamente
120 \mug. Normalmente, la cantidad para un animal pequeño es de
aproximadamente 50 \mug por dosis, mientras que para un animal
grande es de aproximadamente 100 \mug por dosis.
En las composiciones de la presente invención,
los antígenos producen niveles mayores de anticuerpos del huésped
que se unen a epítopos nativos de la proteína diana. Este es el caso
aunque el antígeno puede ser una proteína o péptido no nativa,
recombinante o desnaturalizada, o un fragmento de la misma. Aunque
no se desea avalar ninguna teoría concreta, esto puede deberse al
antígeno que se mantiene en una conformación de tipo nativa de tres
dimensiones en los liposomas.
Los liposomas son membranas bicapas lipídicas
completamente cerradas que contienen un volumen acuoso atrapado. Los
liposomas pueden ser vesículas unilamelares (que poseen una única
membrana bicapa) o vesículas multilamelares (estructuras de tipo
cebolla que se caracterizan porque poseen bicapas multimembrana,
cada una de ellas separadas de la siguiente por una capa acuosa. Una
discusión general de los liposomas se puede encontrar en Gregoriadis
G. (1990) Immunological adjuvants: A role for liposomes, Immunol.
Today 11: 89-97 y Frezard, F. (1999) Liposomes: From
biophysics to the design of peptide vaccines. Brraz. J. Med. Bio.
Res 32: 181-189.
Aunque en esta invención se puede usar cualquier
liposoma, incluidos los liposomas formados a partir de lípidos
arqueobacterianos, los liposomas particularmente útiles usan
fosfolípidos y colesterol sin esterificar en la formulación del
liposoma. El colesterol se usa para estabilizar los liposomas y
cualquier otro compuesto que estabilice los liposomas pueden
reemplazar al colesterol. Los expertos en la técnica conocen otros
compuestos estabilizantes de liposomas. El uso de los liposomas
particularmente preferidos puede tener como resultado la limitación
de la asociación electrostática entre el antígeno y los liposomas.
En consecuencia, la mayoría de los antígenos pueden quedar
secuestrados en el interior de los liposomas.
Los fosfolípidos que preferentemente se usan en
la preparación de liposomas son aquéllos con al menos un grupo
principal seleccionado del grupo compuesto por fosfoglicerol
fosfoetanolamina, fosfoserina, fosfocolina y fosfoinositol. Más
preferidos son los liposomas que comprenden lípidos en fosfolipon
90G^{TM}.
La cantidad de lípido usado para formar liposomas
depende del antígeno que se esté usando, pero normalmente se
encuentra en un intervalo de aproximadamente 0,05 gramos a
aproximadamente 0,5 gramos por dosis de vacuna. Preferentemente, la
cantidad es de aproximadamente 0,1 gramos por dosis. Cuando en la
formulación de liposoma también se usa colesterol sin esterificar,
el colesterol se usa en una cantidad equivalente a aproximadamente
el 10% de la cantidad de lípido. La cantidad preferida de colesterol
es de aproximadamente 0,01 gramos por dosis de vacuna. Si para
estabilizar los liposomas se usa un compuesto distinto al
colesterol, un experto en la técnica puede determinar fácilmente la
cantidad necesaria en la formulación.
En un aspecto más preferido, las composiciones de
vacuna de la presente invención están, esencialmente, exentas de
Lípido A, incluido el Lípido A no pirogénico. Para los fines de esta
especificación, cuando se usa el término Lípido A, se entiende que
abarca también el Lípido A no pirogénico. El lípido A a menudo se
encuentra en formulaciones liposomales de la técnica anterior. El
Lípido A poseen muchos efectos secundarios indeseables, que se
pueden superar usando Lípido A no pirogénico, pero incluso así, el
Lípido A posee muchas reacciones farmacéuticas distintas a la
pirogénica y todavía pueden causar muchas reacciones adversas. Por
tanto, es deseable excluir al Lípido A de las composiciones de esta
invención.
Adyuvantes adecuados son alumbre, otros
compuestos de aluminio, bacilo de Calmette Guerin (BCG),
TiterMax^{TM}, Ribi^{TM}, adyuvante completo de Freund (ACF) y
un adyuvante nuevo descrito por el Centro de Investigación Nacional
de vida salvaje del Departamento de Agricultura de EE.UU. (USDA) en
su sitio web en http://:www.aphis.usda.gov./
ws/mwrc/pzp.htm sobre la base del antígeno de Johne. Se
prefieren alumbre, otros compuestos de aluminio, TiterMax^{TM} y
el Nuevo adyuvante de USDA. Incluso cuando el adyuvante es alumbre
se encuentra una mayor respuesta inmunitaria, lo que es sorprendente
a la luz de la técnica anterior (Sacco y col., 1989. Am. J.
Reprod. Immunol., 21: 1-8). Como adyuvante el
alumbre es particularmente preferido.
En general, se considera que el alumbre es
cualquier sal de aluminio, en particular las sales de ácidos
inorgánicos. Las sales de hidróxido y de fosfato son particularmente
útiles como adyuvantes. Un adyuvante de alumbre adecuado se
comercializa con la marca ImjectAlum^{TM} (Pierce Chemical
Company), que consiste en una solución acuosa de hidróxido de
aluminio (45 mg/ml) e hidróxido de magnesio (40 mg/ml) más
estabilizantes inactivos. El alumbre es un adyuvante particularmente
ventajoso, dado que ya posee la aprobación reguladora y está
ampliamente aceptada en la técnica.
La cantidad de adyuvante usada depende de la
cantidad de antígeno y del tipo de adyuvante. Un experto en la
técnica puede determinar con facilidad la cantidad de adyuvante
necesaria en una aplicación particular. Para inmunoanticoncepción,
una cantidad adecuada de ImjectAlum^{TM} para un conejo es 0,1
ml/dosis de vacuna, mientras que una cantidad adecuada de
ImjectAlum^{TM} para un caballo es 0,5 ml/dosis.
En general, la composición de vacuna se formula
mediante: encapsulación de un antígeno o un complejo
antígeno/adyuvante en liposomas para formar antígeno encapsulado en
liposoma y mezclar el antígeno encapsulado en liposoma con un
transportador que comprende una fase continua de una sustancia
hidrófoba. Si en la primera etapa no se usa un complejo
antígeno/adyuvante, se puede añadir un adyuvante adecuado al
antígeno encapsulado en liposoma, a la mezcla de antígeno
encapsulado en liposoma y transportador o al transportador antes de
que el transportador se mezcle con el antígeno encapsulado en
liposoma. El orden del procedimiento puede depender del tipo de
adyuvante usado. Normalmente, cuando se usa un adyuvante como el
alumbre, el adyuvante y el antígeno se mezclan primero para formar
un complejo antígeno/adyuvante, seguido por la encapsulación del
complejo antígeno/adyuvante con liposomas. A continuación, el
resultante antígeno encapsulado en liposoma se mezcla con el
transportador. (Debe observarse que el término "antígeno
encapsulado en liposoma" se puede referir a la encapsulación del
antígeno solo o a la encapsulación del complejo antígeno/adyuvante,
depende del contexto). Esto estimula el contacto estrecho entre el
adyuvante y el antígeno y puede, al menos en parte, ser la causa de
la sorprendentemente buena respuesta inmunitaria cuando se usa
alumbre como adyuvante. Cuando se usa otro, el antígeno se puede
encapsular primero en liposomas y a continuación el antígeno
encapsulado en liposoma se mezcla en el adyuvante en una sustancia
hidrófoba.
Al formular una composición de vacuna que carezca
sustancialmente de agua, antígeno o complejo antígeno/adyu-
vante se encapsula con liposomas y se mezcla con una sustancia hidrófoba. Al formula una vacuna en una emulsión de agua en una sustancia hidrófoba, el antígeno o complejo adyuvante/antígeno se encapsula con liposomas en un medio acuoso, seguido por la mezcla del medio acuoso con una sustancia hidrófoba. En el caso de la emulsión, para mantener la sustancia hidrófoba en la fase continua, el medio acuoso que contienen los liposomas se puede añadir en alícuotas mezclando con la sustancia hidrófoba.
vante se encapsula con liposomas y se mezcla con una sustancia hidrófoba. Al formula una vacuna en una emulsión de agua en una sustancia hidrófoba, el antígeno o complejo adyuvante/antígeno se encapsula con liposomas en un medio acuoso, seguido por la mezcla del medio acuoso con una sustancia hidrófoba. En el caso de la emulsión, para mantener la sustancia hidrófoba en la fase continua, el medio acuoso que contienen los liposomas se puede añadir en alícuotas mezclando con la sustancia hidrófoba.
En todos los procedimientos de formulación, el
antígeno encapsulado en liposoma puede liofilizarse antes de
mezclarse con la sustancia hidrófoba o con el medio acuoso, como
puede ser el caso. En algunos casos, un complejo adyuvante/antígeno
puede encapsularse mediante liposomas, seguido por liofilización. En
otros casos, el antígeno puede encapsularse mediante liposomas,
seguido por la adición de adyuvante y después liofilizar para formar
un antígeno encapsulado en liposoma liofilizado con adyuvante
externo. En otro caso más, el antígeno puede encapsularse mediante
liposomas, seguido por la liofilización antes de la adición del
adyuvante. La liofilización puede estimular una mejor interacción
entre el adyuvante y el antígeno, lo que tiene como resultado una
vacuna más eficaz.
La formulación del antígeno encapsulado en
liposoma en una sustancia hidrófoba también puede implicar el uso de
un emulsionante para estimular una distribución más uniforme de los
liposomas en la sustancia hidrófoba. Los emulsionantes típicos son
bien conocidos en la técnica e incluyen oleato de manida
(Arlacel^{TM} A), lecitina, Tween^{TM}80, Spans^{TM} 20, 80,
83 y 85. El oleato de manida es un emulsionante preferido. El
emulsionante se usa en una cantidad eficaz para estimular la
distribución uniforme de los liposomas. Normalmente, la proporción
volumétrica (v/v) entre la sustancia hidrófoba y el emulsionante se
encuentra en el intervalo de aproximadamente 5:1 a aproximadamente
15:1, prefiriéndose una proporción de 10:1.
La administración de la composición de vacuna se
puede realizar por cualquier procedimiento conveniente y dependerá
del antígeno que se esté usando. Las composiciones de vacuna se
pueden administrar por vía parenteral (incluidas las vías
intramuscular, subcutánea) o por vía rectal. Se prefiere la
administración parenteral.
Para la aplicación parenteral, formas
farmacéuticas particularmente convenientes son las ampollas. Las
técnicas que liberan la vacuna mediante inyección y a través de la
liberación remota usando dardos, jeringas de resorte cargadas con
agujas para inyección, rifles con polvo de dióxido de carbono /aire,
arma Wester y/o balas biológicas Ballistivet^{TM} y retienen la
actividad biológica son particularmente preferidos.
La cantidad de composición de vacuna administrada
a un huésped puede depender de la cantidad de antígeno usado en una
dosis y de la cantidad eficaz de antígeno requerida para una
aplicación concreta. En el caso de las SIZP, el tamaño de cada dosis
administrada a un animal suele ser de aproximadamente 0,25 ml a
aproximadamente 2,0 ml dependiente del tamaño del animal. Para
animales más pequeños (por ejemplo, gatos, conejos, etc.), el tamaño
de la dosis suele ser de aproximadamente 0, 5 ml, mientras que para
animales más grandes (por ejemplo, caballos,
gamos-ciervos, ciervo de cola blanca, etc.) el
tamaño de la dosis suele ser de aproximadamente 1,0 ml. Normalmente,
incluso cuando la cantidad de SIZP es variada, el tamaño de dosis se
mantiene más o menos constante.
Ahora se describirá la invención mediante
ejemplos no limitantes, en referencia a las figuras adjuntas en las
que:
La Figura 1 es un diagrama que muestra la
posición de ZPB1 y ZPB2 recombinantes; ZP1 y ZP2 de las proteínas
ZPB y ZPC de la zona pelúcida procina que se generaron en los
vectores pRSET.
La composición de vacuna se puede formular para
que carezca de agua o que contenga varias cantidades de agua (usando
un medio acuoso, por ejemplo, solución salina, solución salina
tamponada con fosfato (PBS) o agua apirógena) mientras mantiene una
fase oleosa continua. El procedimiento 1 que se describe a
continuación se aplica a la formulación sin agua de la composición
de vacuna. El procedimiento 2 que se describe a continuación se
aplica a la formulación de la composición de vacuna que contiene
agua, es decir, la emulsión de agua en aceite. Los dos
procedimientos también pueden variar en función del adyuvante que se
esté usando. Como ejemplos, el procedimiento A se aplica a
formulaciones de la composición de la vacuna que contienen alumbre y
el procedimiento B se aplica a formulaciones que contienen Adyuvante
Completo de Freund (ACF). Otros adyuvantes se pueden acomodar
mediante la adaptación del procedimiento A o el procedimiento B. Los
procedimientos que se describen a continuación incorporan como
antígeno zona pelúcida intacta soluble procina (SIZP), otros
antígenos pueden sustituir a la SIZP en la formulación. Por
ejemplo, también se pueden usar como antígeno la alcohol
deshidrogenasa (ADH), la estreptoquinasa o el antígeno de superficie
de la hepatitis B.
Procedimiento
1
Procedimiento
A
La SIZP se prepara como se ha descrito
anteriormente (Brown, R. G., W. D. Bowen, J. D. Eddington, W. C.
Kimmins, M. Mezei, J. L. Parsons, B. Pohajdak. (1997) Temporal
trends in antibody production in captive grey seals, harp and hooded
seals to a single administration immunocontraceptive vaccine. J.
Reproductive Immunology 35: 53-64). Se pesa la
cantidad de SIZP necesaria para el número de dosis de la vacuna que
se estén preparando (la cantidad habitual de SIZP usada para la
inmunización es 50 \mug para animales pequeños y 100 \mug para
animales grandes). La SIZP se disuelve en agua destilada apirógena
para dar una concentración final de 2 mg/ml. Se añade un volumen
igual de ImjectAlum^{TM} (un producto de alumbre de Pierce
Chemical Co., número de catálogo 77161) y la suspensión se mezcla,
después se liofiliza.
Para formar liposomas, se pesa fosfolipón 90 G (u
otros lípidos seleccionados de fosfoglicerol, fosfoetanolamina,
fosfoserina, fosfocolina, fosfoinositol, lípidos arquebacterianos,
sin limitaciones, que forman una bicapa lipídica cerrada que
contiene un antígeno atrapado) (0,1 g/dosis de la composición de
vacuna). El fosfolipón 90 G se mezcla con colesterol (0,01 g/dosis
de la composición de vacuna) y la mezcla se disuelve en
cloroformo:metanol (1/1; v/v; 1,5 ml/dosis de composición de
vacuna). El colesterol se puede reemplazar con otros compuestos que
estabilizan los liposomas a concentraciones determinadas por los
expertos en la técnica. Se añaden perlas de vidrio lavadas (de
aproximadamente 3 mm de diámetro; 15 ml para 10 dosis de la vacuna)
y la mezcla se evapora a presión reducida usando un evaporador
rotatorio hasta que carezca de cloroformo:metanol. Para garantizar
la eliminación de todo el cloroformo:metanol, la mezcla se coloca en
un desecador a presión reducida durante la noche a
temperatura
ambiente.
ambiente.
El complejo SIZP/alumbre liofilizado se suspende
en agua destilada apirógena (5 ml/mg de SIZP) y la suspensión se
añade al matraz que contiene la mezcla de fosfolipón 90 G/colesterol
que recubre el matraz y las perlas de vidrio. El contenido del
matraz se deja reposar sin agitación durante 30 minutos. Tras 30
minutos, el matraz se coloca en un baño de agua a
35-40ºC y se agita suavemente con una espátula para
formar los liposomas. Se usa un microscopio para evaluar la
formación de liposomas y se continua agitando con cada vez más
agitación hasta que la mezcla contenga, predominantemente,
liposomas multilamelares reconocidos por los expertos en la técnica.
Los liposomas se liofilizan y los liposomas liofilizados resultantes
se suspenden en aceite mineral de baja viscosidad (0,25 ml de
aceite/dosis para animales pequeños y 0,5 ml de aceite/dosis para
animales grandes) que contiene oleato de manida como emulsionante
(10:1: aceite:emulsionante:v/v). Dado que los liposomas se suspenden
en aceite y no se encuentran en solución, es necesario determinar si
los procedimientos usados tienen como resultado una distribución
uniforme del SIZP en cada dosis. Para determinar si los liposomas
liofilizados que contienen SIZP están igualmente distribuidos en
aceite, SIZP se marca con ^{14}C mediante metilación reductora
(Jentoft, N. y D. G. Dearborn. 1979. Labeling of proteins by
reductive methylation using sodium cyanoborohydride. J. Biol. Chem.
254: 4359-4365) y la SIZP radiactiva se usó para
preparar dos preparaciones de la vacuna. Se preparan dosis
individuales de la vacuna y se determina la radiactividad de cada
dosis, y por tanto se determina el contenido de SIZP en cada dosis
de la vacuna (Tabla 1). La distribución de SIZP en cada dosis de la
vacuna es altamente reproducible (la desviación estándar, DE, fue
inferior
a +/- 10%).
a +/- 10%).
| Muestra nº | Preparación 1 \mug | Preparación 2 \mug |
| SIZP/dosis | SIZP/dosis | |
| 1 | 68 | 55 |
| 2 | 66 | 53 |
| 3 | 57 | 53 |
| 4 | 65 | 62 |
| 5 | 56 | 59 |
| 6 | 51 | 57 |
| 7 | 62 | 58 |
| 8 | 55 | 60 |
| 9 | 69 | 51 |
| 10 | 54 | 59 |
| 11 | 52 | 57 |
| 12 | 61 | 61 |
| 13 | 64 | 61 |
| 14 | 61 | 60 |
| 15 | - | 56 |
| Media | 60 | 57 |
| Desviación estándar | 5,9 | 3,2 |
Procedimiento
B
La preparación de la composición de vacuna de
modo que contenga ACF como adyuvante en vez de alumbre es similar al
procedimiento A, a excepción de que la propia SIZP, en vez de en
forma de complejo SIZP/alumbre, se encapsula en liposomas como se
ha descrito anteriormente. Los liposomas que contienen SIZP se
liofilizan y los liposomas liofilizados se añaden al ACF en
alícuotas mezclando para estimular una distribución igual de los
liposomas en el aceite. La suspensión resultante de liposomas
liofilizados que contienen SIZP en ACF se administra a los animales
que se están vacunando.
Procedimiento
2
Procedimiento
A
La SIZP se prepara como se ha descrito
anteriormente (Brown, R. G., W. D. Bowen, J. D. Eddington, W. C.
Kimmins, M. Mezei, J. L. Parsons, B. Pohajdak (1997) Temporal trends
in antibody production in captive grey seals, harp and hooded seals
to a single administration immunocontraceptive vaccine. J.
Reproductive Immunology 35: 53-64). Se pesa la
cantidad de SIZP necesaria para el número de dosis de la vacuna que
se estén preparando (la cantidad habitual de SIZP usada para la
inmunización es 50 \mug para animales pequeños y 100 \mug para
animales grandes). La SIZP se disuelve en agua destilada apirógena
para dar una concentración final de 2 mg/ml. Se añade un volumen
igual de ImjectAlum^{TM} (un producto de alumbre de Pierce
Chemical Co., número de catálogo 77161) y la suspensión se mezcla,
después se liofiliza.
Para formar liposomas, se pesa fosfolipón 90 G (u
otros lípidos seleccionados de fosfoglicerol, fosfoetanolamina,
fosfoserina, fosfocolina, fosfoinositol etc., que forman una bicapa
lipídica cerrada que contiene un volumen acuoso atrapado) (0,1
g/dosis de la composición de vacuna). El fosfolipón 90 G se mezcla
con colesterol (0,01 g/dosis de la composición de vacuna) y la
mezcla se disuelve en cloroformo:metanol (1/1; v/v; 1,5 ml/dosis de
composición de vacuna). El colesterol se puede reemplazar con otros
compuestos que estabilizan los liposomas a concentraciones
determinadas por los expertos en la técnica. Se añaden perlas de
vidrio lavadas (de aproximadamente 3 mm de diámetro; 15 ml para 10
dosis de la vacuna) y la mezcla se evapora a presión reducida usando
un evaporador rotatorio hasta que carezca de cloroformo:metanol.
Para garantizar la eliminación de todo el cloroformo:metanol, la
mezcla se coloca en un desecador a presión reducida durante la noche
a temperatura ambiente.
El complejo SIZP/alumbre liofilizado se suspende
en solución salina (5 ml/mg de SIZP) y la suspensión se añade al
matraz que contiene la mezcla de fosfolipón 90 G/colesterol que
recubre el matraz y las perlas de vidrio. El contenido del matraz se
deja reposar sin agitación durante 30 minutos. Tras 30 minutos, el
matraz se coloca en un baño de agua a 35-40ºC y se
agita suavemente con una espátula para formar los liposomas. Se usa
un microscopio para evaluar la formación de liposomas reconocidos
por los expertos en la técnica. La suspensión acuosa de liposomas
(0,25 ml/dosis para animales pequeños y 0,5 ml/dosis para animales
grandes) se añade a aceite mineral de baja viscosidad (0,25 ml de
aceite/dosis para animales pequeños y 0,5 ml de aceite/dosis para
animales grandes) que contiene oleato de manida como emulsionante
(10:1: aceite:emulsionante:v/v). La suspensión acuosa de liposomas
se añade a la fase de aceite mineral bajo en alícuotas mezclando
entre alícuotas para mantener la fase oleosa continua.
Procedimiento
B
La preparación de la composición de vacuna de
modo que contenga ACF como adyuvante en vez de alumbre es similar al
procedimiento A, a excepción de que la propia SIZP, en vez de en
forma de complejo SIZP/alumbre, se encapsula en liposomas como se ha
descrito anteriormente. La suspensión acuosa de liposomas se añade
al ACF en alícuotas mezclando entre alícuotas para mantener la fase
oleosa continua. La suspensión acuosa de liposomas resultante que
contiene SIZP en ACF se administra a los animales que se están
vacunando.
Nota: En algunos ensayos, la cantidad de SIZP se
varía para estudiar la respuesta de animales inmunizados a
cantidades diferentes de antígeno. En tales experimentos, el volumen
de la vacuna administrada a los animales pequeños (gatos, conejos,
etc.) fue 0,5 ml y el volumen administrado a los animales grandes
(caballos, gamos-ciervos, ciervos de cola blanca,
etc.) fue 1,0 ml. En tales casos, la cantidad de liposomas en cada
dosis de la vacuna se mantiene constante mientras que la cantidad de
antígeno encapsulado en los liposomas se varía.
La composición de vacuna es única a la hora de
producir títulos elevados de anticuerpos anti-SIZP
que son duraderos después de una administración única. Para
determinar si la composición de vacuna produciría títulos elevados
de anticuerpos con otros antígenos, particularmente proteínas que no
están unidas a membranas celulares, los conejos se inmunizan con
alcohol deshidrogenasa (ADH) de levaduras. Se usan dos formas de ADH
como antígeno, e concreto ADH nativa y ADH que se había tratado para
desnaturalizar la proteína. Para desnaturalizar la ADH, la ADH se
trata con mercaptoetanol (10% v/v en tampón Tris, 0,1 M, pH 7,5, 30
min, 100ºC). LA solución se dializa contra agua destilada y se
liofiliza. Cuatro conejos (2 para cada tratamiento) se inmunizan con
ADH nativa o desnaturalizada (40 \mug) usando una inyección
principal con adyuvante completo de Freund (ACF), seguida por una
inyección de refuerzo con adyuvante incompleto de Freund (AIF)
administrada un mes más tarde. Se considera que el periodo posterior
a la inmunización ha comenzado tras la inyección de refuerzo. Al
mismo tiempo que se administra la inyección de refuerzo, cuatro
conejos (2 para cada tratamiento) se inmunizan mediante
administración única con ADH nativa o desnaturalizada (40 \mug)
usando la composición de vacuna, es decir la ADH se encapsula en
liposomas que se suspenden en solución salina (0,5 ml) y se
emulsionan en ACF (0,5 ml). Los títulos anti-ADH se
miden mediante ELISA usando ADH nativa y desnaturalizada (Tabla
2).
Cuando los conejos se inmunizan con ADH nativa,
el suero resultante contenía cantidades similares de anticuerpos
anti-ADH cuando la ADH nativa se libera con la
composición de la vacuna o al usar una inyección principal con un
refuerzo. En contraste con ello, el suero procedente de conejos
inmunizados con ADH desnaturalizada liberada con la composición de
vacuna contiene 2,7 veces más anticuerpos que se unen a la ADH
nativa que el suero de conejos que se inmunizan con ADH
desnaturalizada con una inyección principal y un refuerzo (P<
0,01; T= 4,14; df= 6). En todos los casos, los títulos son más
elevados en conejos inmunizados con ADH nativa que cuando los
conejos se inmunizan con ADH desnaturalizada. Esto indica que la ADH
nativa es un antígeno mejor que la ADH desnaturalizada. Dado que
muchos antígenos proteicos se desnaturalizan hasta cierto grado
durante la extracción y asilamiento o cuando se producen por medios
recombinantes, la producción incrementada de anticuerpos que se unen
mejor a las proteínas nativas puede mejorar de forma significativa
el desenlace de la vacunación, como se demuestra mediante la
inmunoanticoncepción de una variedad de mamíferos con
\hbox{SIZP usando la composición de vacuna de la presente
invención.}
Además, los sueros anti-ADH de
los conejos 237 y 238 reconocen ADH desnaturalizada en
transferencias de tipo Western con aproximadamente
4-5 veces la intensidad de los sueros
anti-ADH de los conejos 235 y 236. Esto confirma los
resultados de las mediciones de título, lo que indica que la
inmunización de conejos con la composición de vacuna favorece la
producción de anticuerpos anti-ADH que se unen mejor
a la ADH nativa, ya que se sabe que muchas proteínas se repliegan
durante el protocolo Western hasta un estado más nativo. Esta
conclusión está avalada por Multtilainen y col. (1995) en un estudio
de la proteína P1 de la membrana externa de Neisseria
meningitidis, que encontró que se producción anticuerpos frente
a P1 nativa en ratones vacunados con P1 desnaturalizada constituida
en vesículas de fosfolípidos (liposomas). Sin embargo, Multtilainen
y col. (1995) no usaron aceite en su formulación de vacuna, por
tanto su protocolo de inmunización era diferente del de la presente
invención.
| Inmunización | Título anti-ADH (% de suero de referencia)^{1} | |||||
| Nº ID de conejo | Antígeno | Liberación^{2} | ADH nativa^{3} | ADH desnaturalizada^{4} | ||
| 4^{4} | 5^{4} | 4^{4} | 5^{4} | |||
| 231 | ADH nativa | -Liposomas | 187 | 148 | 19 | 23 |
| 232 | ADH nativa | -Liposomas | 200 | 161 | 17 | 15 |
| 233 | ADH nativa | +Liposomas | 239 | 156 | 21 | 14 |
| 234 | ADH nativa | +Liposomas | 100 | 100 | 19 | 11 |
| 235 | ADH desnaturalizada | -Liposomas | 41 | 37 | 7 | 3 |
| 236 | ADH desnaturalizada | -Liposomas | 30 | 18 | 7 | 4 |
| 237 | ADH desnaturalizada | +Liposomas | 101 | 71 | 8 | 3 |
| 238 | ADH desnaturalizada | +Liposomas | 101 | 83 | 12 | 7 |
| ^{1} El suero anti-ADH del conejo 234 se usa como suero de referencia. | ||||||
| ^{2} \begin{minipage}[t]{158mm} La ADH nativa y desnaturalizada se administran con la composición de la vacuna, encapsulada en liposomas con ACF como inyección im única (+liposomas) o suspendidos en ACF seguida un mes después como inyección de refuerzo. \end{minipage} | ||||||
| ^{3} \begin{minipage}[t]{158mm} La ADH se adquiere de Sigma Chemical Co. La ADH desnaturalizada se produce mediante el tratamiento de la ADH nativa con mercaptoetanol y calentando hasta 100^{o}C durante 30 minutos. La ADH desnaturalizada resultante contiene tres proteínas principales que poseen pesos moleculares de 26, 33 y 40 kDa. Los títulos se miden mediante ELISA usando ADH nativa y desnaturalizada como antígeno para recubrir las placas de ELISA en determinaciones distintas. \end{minipage} | ||||||
| ^{4} Postinmunización en meses. | ||||||
| \begin{minipage}[t]{158mm} Nota: El suero de referencia indicado en la Tabla 2 corresponde al suero de conejo con número de identificación 234. \end{minipage} |
Los sueros de conejos inmunizados con una vacuna
de placebo que contenía todos los ingredientes de la composición de
vacuna a excepción del antígeno (SIZP) no contienen anticuerpos SIZP
anti-porcinos (véase la Tabla 3A). La inmunización
de conejos con SIZP porcina (40 \mug) encapsulada en liposomas que
contenían fosfolipón 90G (0,1 g), colesterol (0,01 g) en solución
salina (0,5 ml) emulsionado en adyuvante ACF (0, 5 ml) producen
títulos elevados de anticuerpos anti-SIZP durante el
periodo de monitorización de 12 meses después de la inmunización
tras una administración única de la vacuna. La inmunización de
conejos con SIZP porcina (40 \mug) encapsulada en liposomas con
adyuvante MF59 (0,5 ml) produce títulos anti-SIZP
bajos. En contraste con ello, la inmunización de conejos con SIZP
porcina encapsulada en liposomas con adyuvante de alumbre (100
\mul), Pierce ImjectAlum^{TM}) produce títulos de
anti-SIZP porcina que son inferiores a los títulos
producidos usando ACF al principio después de la inmunización, pero
los títulos son menos diferentes que los observados entre los ciclos
de alumbre y ACF hacia el mes 12 después de la inmunización. La cría
de conejos estableció que una única administración de la vacuna
usando ACF o alumbre reduce la fertilidad de conejos en un 79% y 74%
respectivamente (Tabla 3B). La inmunización de conejos mediante una
única inyección de SIZP (40 \mug) que no está encapsulada en
liposomas con adyuvante Gerbu produce títulos
anti-SIZP porcina bajos (Tabla 3A). Como cabe
esperar según los títulos anti-SIZP, los conejos
inmunizados con SIZP que no está encapsulada en liposomas con
adyuvante Gerbu tienen la misma fertilidad que los conejos que
reciben la vacuna placebo (Tabla 3B). Estos resultados indican que
las vacunas que comprenden antígeno encapsulado en liposoma producen
buenos resultados y que el ACF y el alumbre,
\hbox{en
particular el alumbre, son adyuvantes especialmente
buenos.}
| Título de anti-SIZP porcina tras la inmunización (% de referencia) | ||||||||||
| Nº de ID. | Tiempo (meses) | |||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 11 | 12 | |
| Placebo | ||||||||||
| 2 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 13 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 14 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| ACF | ||||||||||
| 3 | 0 | 145 | 112 | 94 | 94 | 82 | 23 | 24 | 20 | 20 |
| 15 | 0 | 100 | 71 | 68 | 68 | 83 | 19 | 26 | 18 | 25 |
| 16 | 0 | 125 | 111 | 122 | 128 | 128 | 111 | 92 | 75 | 63 |
| MF 59 | ||||||||||
| 1 | 0 | 3 | 1 | 1 | 1 | 2 | 0 | ND | ND | ND |
| 7 | 0 | 10 | 9 | 3 | 3 | 5 | 2 | ND | ND | ND |
| 19 | 0 | 12 | 6 | 3 | 3 | 3 | 3 | ND | ND | ND |
| 20 | 0 | 37 | 21 | 13 | 15 | 13 | 10 | ND | ND | ND |
| Alumbre | ||||||||||
| 11 | 0 | 19 | 12 | 12 | 11 | 14 | 18 | 7 | 8 | 10 |
| 12 | 0 | 20 | 10 | 10 | 8 | 6 | 11 | 5 | 2 | 4 |
| 23 | 0 | 31 | 16 | 40 | 22 | 20 | 33 | 28 | 37 | 28 |
| 24 | 0 | 36 | 21 | 40 | 27 | 24 | 40 | 36 | 34 | 34 |
| Gerbu sin encapsulación el liposomas de la SIZP | ||||||||||
| 9 | 0 | 5 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ND | ND |
| 10 | 0 | 11 | 3 | 3 | 2 | 2 | 3 | 1 | ND | ND |
| 21 | 0 | 17 | 4 | 6 | 19 | 5 | 6 | 2 | ND | ND |
| 22 | 0 | 24 | 3 | 6 | 3 | 4 | 4 | 7 | ND | ND |
| ^{1} \begin{minipage}[t]{158mm} Los conejos reciben una única administración de la vacuna placebo, vacuna que contenía SIZP (40 \mu g) encapsulada en liposomas (0,25 ml) con adyuvantes ACF, MF 59 o alumbre (0,25 ml) o vacuna que contenía SIZP porcina (40 \mu g) disuelta en solución salina (0,25 ml) con adyuvante gerbu (0,25 ml). ND= no determinado. \end{minipage} |
El suero de referencia usado procede de un conejo
inmunizado con zona pelúcida porcina usando una inyección principal
con adyuvante completo de Freund y 2 inyecciones de refuerzo con
adyuvante incompleto de Freund.
| Nº Id. | Nacimientos | Media de nacimientos | % reducción de la | ||
| vivos/apareamiento^{1} | vivos/apareamiento | fertilidad | |||
| 1 | 2 | 3 | |||
| Placebo | |||||
| 2 | 6 | 0 | 4 | 5,1 | 0 |
| 13 | 7 | 1 | 10 | ||
| 14 | 6 | 7 | 5 | ||
| ACF | |||||
| 3 | 0 | 0 | 0 | 1,1 | 79 |
| 15 | 0 | 8 | 5 | ||
| 16 | 0 | NM | 0 | ||
| MF 59 | |||||
| 1 | 11 | NM | 10 | 6,1 | 0 |
| 7 | 0 | 0 | NM | ||
| 19 | 5 | 11 | 11 | ||
| 20 | 6 | 0 | 7 | ||
| Alumbre | |||||
| 11 | 0 | 0 | 6 | 1,3 | 74 |
| 12 | 0 | 0 | 0 | ||
| 23 | 0 | 0 | 0 | ||
| 24 | 3 | 5 | 2 | ||
| Gerbu sin encapsulación en liposoma | |||||
| 9 | 0 | 0 | 11 | 5,3 | 0 |
| 10 | 0 | 0 | 0 | ||
| 21 | 8 | 9 | 11 | ||
| 22 | 10 | 7 | 11 | ||
| NM= apareamiento repetido con machos sin éxito del apareamiento | |||||
| ^{1} \begin{minipage}[t]{158mm} Nacimientos vivos tras un apareamiento con éxito. Los intervalos entre apareamientos fueron 65 \pm 10, 141 \pm 14 y 216 \pm 14 días tras la inmunización para los apareamientos 1, 2 y 3 respectivamente. \end{minipage} |
Veintinueve gatos de pelo corto domésticos
exentos de patógenos específicos se estabulan en la instalación
exenta de patógenos específicos en la Universidad de Florida bajo la
supervisión del Dr. Julie Levy y el Sr. Shawn Gorman. El ciclo
estral se monitoriza mediante observación diaria y citología
vaginal. Las composiciones de vacuna de la presente invención, las
vacunas placebo y las muestras de suero se codifican como parte de
un estudio doble ciego. Los gatos se dividen al azar en 3 grupos de
nueve o diez gatos cada una. Un grupo recibe una vacuna placebo que
contiene todos los componentes de la composición de vacuna a
excepción del antígeno (SIZP porcina) mediante inyección
intramuscular. Cada gato de este grupo recibe liposomas que no
contienen antígeno en solución salina (0,25 ml) suspendidos en ACF
(0,25 ml). Cada gato del segundo grupo de nueve gatos se inmuniza
mediante inyección intramuscular con la composición de vacuna que
contiene SIZP (135 \mug) encapsulada en liposomas en solución
salina (0,25 ml) y suspendidos en ACF (0,25 ml). Cada gato de un
tercer grupo de nueve gatos se inmuniza mediante inyección
intramuscular con la composición de vacuna que contiene SIZP porcina
(200 \mug) con alumbre (0,12 ml, Pierce Chemical Co., número de
catálogo 77161) encapsulada en liposomas en solución salina (0,12
ml) y suspendidos en un transportador farmacológico adecuado. La
producción de anticuerpos anti-SIZP en gatos se mide
mediante ELISA usando proteína A/fosfatasa alcalina (Brown, R. G.,
W. D.Bowen, J. D. Eddington, W. C. Kimmins, M. Mezel, J. L. Parsons,
B. Pohajdak. (1997) Temporal trends in antibody production in
captive grey seals, harp and hooded seals to a single administration
immunocontraceptive vaccine. J. Reproductive Immunology 35:
53-64).
Una única administración de la composición de
vacuna usando ACF produce títulos de anticuerpos
anti-SIZP que alcanzaron títulos máximos en 2 meses
(Tabla 4). El título medio dos meses después de la inmunización es
58 \pm 2% del suero de referencia, que disminuyó a 41 \pm 4% del
suero de referencia a los cuatro meses de la inmunización cuando un
gato macho probado se introduce en la colonia. Los gatos que reciben
una única administración de la composición de vacuna usando alumbre
como adyuvante producen anticuerpos anti-SIZP con un
título medio de 67 \pm 2% del suero de referencia dos meses
después de la inmunización.
Las muestras de suero mensuales procedentes de
gatos que están inmunizados con la vacuna placebo que contiene todos
los componentes de la composición de vacuna a excepción del antígeno
tienen un título anti-SIZP medio de 0,6 \pm 0,2%
del suero de referencia durante el periodo de monitorización
posterior a la inmunización. Por tanto, es evidente que los gatos
que recibieron la vacuna placebo producirán cachorros de gatos
durante el periodo posterior a la inmunización.
| Nº Id. cat. | Título anti-SIZP (% del suero de referencia) | |||||||||||
| Después de la inmunización (meses) | ||||||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 6 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| Placebo | ||||||||||||
| 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7 | 4 | 2 |
| 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 3 | 1 | 2 | 2 | 0 |
| 8 | 0 | 3 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 2 | 2 | 0 |
| 15 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 1 | ND | ND | ND |
| A | 0 | 0 | 3 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 0 |
| B | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 0 | ND | 2 | 2 | 0 | 0 |
| E | 0 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 2 | 5 | ND | ND | ND |
| F | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 0 | ND | ND | ND |
| I | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | ND | ND | ND |
| N | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | ND | ND | ND |
| Nº Id. cat. | Título anti-SIZP (% del suero de referencia) | |||||||||||
| Después de la inmunización (meses) | ||||||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 6 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| Vacuna con ACF | ||||||||||||
| 1 | 0 | 60 | 57 | 68 | 46 | 56 | 23 | 46 | 15 | 40 | 23 | 23 |
| 2 | 0 | 60 | 53 | 58 | 44 | 25 | 23 | 69 | 46 | 68 | 70 | 62 |
| 9 | 0 | 47 | 56 | 41 | 56 | 20 | 58 | 78 | 103 | 74 | 86 | ND |
| 13 | 0 | 42 | 64 | 53 | 66 | 55 | 47 | 29 | 33 | 12 | 16 | ND |
| 14 | 0 | 48 | 51 | 30 | 45 | 40 | 10 | 20 | 9 | 10 | 12 | 7 |
| C | 0 | 56 | 54 | 49 | 34 | 21 | 16 | 12 | 14 | 24 | 14 | 16 |
| D | 0 | 58 | 60 | 67 | 59 | 52 | 32 | 19 | 48 | ND | ND | ND |
| L | 0 | 47 | 61 | 40 | 28 | 16 | 46 | 37 | 59 | 70 | 59 | 72 |
| G | 0 | 59 | 65 | 79 | 85 | 81 | 92 | 94 | 96 | 115 | 152 | 79 |
| O | 0 | 48 | 42 | 53 | 42 | 24 | 26 | 28 | 25 | 31 | 16 | 10 |
| Vacuna con alumbre | ||||||||||||
| 1P | 1 | 60 | 60 | 70 | 46 | 47 | 25 | 18 | 41 | 26 | 6 | ND |
| 1S | 0 | 73 | 56 | 43 | 24 | 42 | 19 | 18 | 18 | 14 | 4 | ND |
| 1T | 0 | 62 | 62 | 58 | 30 | 34 | 14 | 12 | 8 | 11 | 4 | ND |
| 1V | 2 | 70 | 68 | 60 | 40 | 36 | 12 | 12 | ND | ND | ND | ND |
| 1Y | 1 | 84 | 82 | 84 | 81 | 80 | 67 | 34 | 44 | 28 | ND | ND |
| 1Z | 0 | 77 | 75 | 71 | 54 | 72 | 54 | 26 | 35 | 21 | 9 | ND |
| Z1 | 0 | 61 | 74 | 95 | 83 | 100 | 98 | 92 | 70 | 42 | ND | ND |
| Z2 | 0 | 77 | 79 | 63 | 34 | 50 | 41 | 28 | 18 | 11 | ND | ND |
| Z3 | 0 | 65 | 72 | 61 | 55 | 30 | 35 | 18 | 20 | 6 | ND | ND |
| Z4 | 0 | 73 | ND | 68 | 53 | 29 | 32 | 17 | 18 | 13 | ND | ND |
| ND= no determinado |
Cuarenta y un ciervos hembra (Dama dama)
en James Island, una isla de 360 hectáreas que yace en la costa del
sur de la Columbia británica, se inmunizan con la composición de
vacuna usando ACF como adyuvante. Otro grupo de cuarenta ciervos
hembra se inmunizan con la composición de la vacuna usando alumbre
como adyuvante. Para su captura, las ciervas se introdujeron en un
corral grande (200 x 200 metros) que está conectada a una serie de
cercados vallados y un canal que termina en un pequeño edificio.
Antes de la inmunización, a cada cierva se le restringe físicamente
y se le coloca una etiqueta numerada en la oreja, un collar de
plástico coloreado o un collar de radio con un sensor de mortalidad,
y una etiqueta TIP (transpondedor de identificación permanente) que
lleva un código único. Por tanto, si un ciervo tratado pierde todas
las marcas externas, todavía se podría reconocer como animal tratado
por la lesión resultante de la pérdida de la etiqueta de la oreja y
como ciervo particular por la etiqueta TIP. A cada cierva cautiva se
le inyecta por vía intramuscular en las ancas SIZP (100 \muG)
encapsulada en liposomas con ACF o alumbre como adyuvantes. Las
ciervas sin tratar sirven como controles.
Los títulos anti-SIZP se miden
como se ha descrito anteriormente (Brown, R. G., W. D. Bowen, J. D.
Eddington, W. C. Kimmins, M. Mezei, J. L. Parsons, B. Pohjajdak.
(1997) Temporal trends in antibody production in captive grey seals,
harp and hooded seals to a single administration immunocontraceptive
vaccine. J. Reproductive Immunology 35:
53-64), a excepción de que la proteína G/fosfatasa
alcalina sustituyó a la proteína A/fosfatasa alcalina dado que la
proteína G posee una afinidad mayor por la inmunoglobulina de
gamo-ciervo que la proteína A. En cuanto a las
afinidades de la proteína A y la proteína G por inmunoglobulina de
conejo (el suero de referencia), las afinidades de la proteína A y
la proteína G por inmunoglobulina de gamo-ciervo son
8 y 89% respectivamente. Los títulos anti-SIZP de
los gamos-ciervos están sin corregir para la
afinidad relativa de la proteína G (Tabla 5A). Ninguna de las
ciervas analizadas 2 meses o más después del celo y
8-9 meses después de ser inmunizados con la vacuna
que contenía ACF estaba preñada, mientras que el 96% (192/200) de
las ciervas sin tratar está preñada. El embarazo se determina
mediante exploración del tracto reproductor en busca de signos de
embarazo o analizando la sangre de las DOES capturadas vivas para
detectar la proteína B específica de embarazo (PSPB) por Bio
Tracking, Inc. de Moscow, Idaho (Willard y col., "Pregnancy
detection and the effects of age, body weight, and previous
reproductive on pregnancy status and weaning rates of farmed fallow
deer (Dama dama)". J. Animal Science. 77:
32-38 (1999)). El contraste entre los índices de
embarazo entre ciervas inmunizadas y no inmunizadas muestra
claramente que la composición de vacuna que contiene ACF es eficaz a
la hora de evitar la concepción. Dado que este es un estudio de
varios años, se capturan vivas tantas ciervas como sea posible.
| Nº ID. del gamo-ciervo | Título anti-SIZP tras la inmunización (% del suero de referencia) | ||
| Tiempo (meses) | |||
| 0 | 1-2 | 7-10 | |
| Controles | |||
| 99023 | 0 | 0 | 0 |
| 99024 | 0 | 0 | 0 |
| 99025 | 0 | 0 | 0 |
| 99027 | 0 | 0 | 0 |
| 99028 | 0 | 0 | 0 |
| 99029 | 0 | 0 | 0 |
| Vacuna con ACF | |||
| 99026 | 0 | 117 | ND |
| 99025 | 0 | 72 | ND |
| 2000-06 | 0 | 96 | ND |
| 2000-08 | 0 | 94 | ND |
| 99007 | 0 | ND | 36 |
| 99008 | 0 | ND | 60 |
| 99009 | 0 | ND | 94 |
| 99016 | 0 | ND | 60 |
| Nº ID. del gamo-ciervo | Título anti-SIZP tras la inmunización (% del suero de referencia) | ||
| Tiempo (meses) | |||
| 0 | 1-2 | 7-10 | |
| 99017 | 0 | ND | 66 |
| 99019 | 0 | ND | 133 |
| 99020 | 0 | ND | 56 |
| ND= no determinado |
Otros experimentos se realizaron en ciervas de
cola blanca. Ninguna de las ciervas de cola blanca inmunizadas con
la composición de vacuna que comprende ACF estaba preñada un año
después de la inmunización. Sólo una de las ciervas de cola blanca
inmunizadas con la composición de vacuna que comprende alumbre no
estaba preñada un año después de la inmunización. Los resultados
para los niveles de título anti-SIZP se muestran en
la Tabla 5B.
| Nº ID. ciervas de cola blanca | Anti-SIZP (% del suero de referencia) | |||||
| Después de la inmunización (meses) | ||||||
| 0 | 2 | 4 | 5 | 8 | 12 | |
| Adyuvante completo de Freund (ACF) | ||||||
| 19 | 0 | ND | ND | 85 | ND | |
| 21 | 0 | ND | ND | 139 | ND | |
| 33 | 0 | ND | ND | 125 | ND | |
| Alumbre | ||||||
| 949 | 1 | 12 | 11 | ND | 48 | 27 |
| 916 | 1 | 6 | 4 | ND | 5 | 2 |
| 744 | 3 | 105 | 111 | ND | 123 | 75 |
| 694 | 0 | 7 | 7 | ND | 5 | 4 |
| 956 | 0 | 5 | 4 | ND | 2 | 2 |
| 9 | 0 | ND | ND | 3 | ND | ND |
| 14 | 0 | ND | ND | 8 | ND | ND |
| 17 | 0 | ND | ND | 4 | ND | ND |
| 27 | 0 | ND | ND | 4 | ND | ND |
| ND= no determinado |
La composición de vacuna proporciona buenos
títulos de anticuerpos tras una única administración de un antígeno,
por tanto, a menos que se indique otra cosa, todos los títulos
comunicados en el ejemplo siguiente son el resultado de una única
administración del antígeno en la formulación de la vacuna y en
otros protocolos de inmunización.
Para determinar si una fase acuosa es un
componente necesario de la composición de vacuna para obtener una
buena respuesta inmunitaria, tres grupos de conejos (2 ó 3
conejos/grupos) se inmunizan con tres preparaciones diferentes de la
vacuna que contiene SIZP (50 \mug SIZP/conejo) encapsulada en
liposomas que están suspendidos en solución salina (0,5 ml) y
emulsionados en adyuvante completo de Freund (0,5 ml). La proporción
de fase oleosa y fase acuosa es igual en estas preparaciones (Tabla
6A).
| Contenido en aceite (%, v/v) | Título anti-SIZP (% del suero de referencia)^{1} | ||||
| Después de la inmunización (meses) | |||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 50^{2} | 0 | 120 | 131 | 103 | 24 |
| 0 | 38 | 38 | 24 | 17 | |
| 50^{2} | 0 | 91 | 91 | 54 | 67 |
| 0 | 46 | 112 | 143 | 112 | |
| 50^{2} | 0 | 54 | 65 | 51 | ND |
| 0 | 95 | 94 | 81 | ND | |
| 0 | 47 | 49 | 32 | ND | |
| 100^{3} | 0 | 61 | 75 | 136 | 34 |
| 0 | 14 | 24 | 100 | 95 | |
| 100^{4} | 0 | 159 | 149 | 215 | 27 |
| 0 | 50 | 196 | 244 | 128 | |
| 100^{4} | 0 | 11 | 30 | 48 | 29 |
| 0 | 15 | 28 | 40 | 41 | |
| 100^{4} | 0 | 54 | 54 | 90 | 91 |
| 0 | 14 | 2 | 19 | 19 | |
| 0 | 47 | 49 | 67 | 76 | |
| ^{1} Cada línea representa títulos de las muestras de sangre obtenidas del mismo conejo. | |||||
| ^{2} \begin{minipage}[t]{158mm} Los liposomas que contienen SIZP (50 \mu g/conejo) se resuspendieron en solución salina (0,5 ml) y esta fase acuosa se emulsionó en adyuvante completo de Freund (0,5 ml). \end{minipage} | |||||
| ^{3} \begin{minipage}[t]{158mm} Los liposomas que contienen SIZP (50 \mu g/conejo) se liofilizaron y los liposomas liofilizados resultantes se suspendieron en el adyuvante completo de Freund (0,5 ml). \end{minipage} | |||||
| ^{4} \begin{minipage}[t]{158mm} Los liposomas que contienen SIZP (50 \mu g/conejo) se liofilizaron y los liposomas liofilizados resultantes se suspendieron en el adyuvante completo de Freund (0,2 ml). \end{minipage} | |||||
| ND= no determinado |
La vacuna formulada para que no contenga agua se
usa para inmunizar cuatro grupos de conejos (2 ó 3 conejos/grupo)
con cuatro preparaciones diferentes de la vacuna que contiene SIZP
(50 \mug SIZP/conejo) encapsulada en liposomas liofilizados
suspendidos en adyuvante completo de Freund (0,2 ml ó 0,5 ml). Dado
que el adyuvante completo de Freund no contiene agua, estas
preparaciones carecen de agua y sólo contenían una fase acuosa. Los
títulos medios anti-SIZP 4 meses después de la
inmunización son 55 \pm 44% (coeficiente de variación, cv 805)
para conejos que están inmunizados con la composición que contiene
un 50% de aceite y 59 \pm 41% (cv 69%) para conejos que están
inmunizados con la vacuna que contiene 100% de aceite. No existen
diferencias en la respuesta de conejos hembra que recibieron la
vacuna con 100% de aceite y de conejos hembra que se inmunizaron con
la vacuna que contiene un 50% de aceite (P= 0,87; F (1, 45)= 0,03);
los títulos medios fueron 71 \pm 7% para el 50% de aceite y 72
\pm 12% para el 100% de aceite). Estos resultados indican que la
presencia de una fase acuosa no es necesaria para una buena
respuesta inmunitaria a la vacuna.
Con el fin de determinar si existe una diferencia
en la duración de los títulos anti-SIZP en conejos
que están inmunizados con la composición de vacuna con 50% y 100% de
aceite, los títulos anti-SIZP se miden durante 12
meses (Tabla 6B). Los títulos anti-SIZP durante el
periodo de 12 meses posterior a la inmunización son similares en
conejos inmunizados con la formulación de 50% de aceite y el conejo
inmunizado con la formulación de 100% de aceite. Para verificar el
efecto biológico de la inmunización con SIZP, conejos hembra
probadas inmunizadas con ambas formulaciones de la vacuna se aparean
con machos probados 3 veces durante el periodo de 12 meses posterior
a la inmunización. La reducción de la fertilidad fue del 80% para
los conejos que están inmunizados con la vacuna que contiene un 50%
de aceite y el conejo hembra que está inmunizada con la vacuna que
contiene un 100% de aceite no produce descendencia, lo que indica
que el efecto biológico de la fertilidad reducida es similar con
ambas formulaciones de la vacuna.
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 11 | 12 | |
| Contenido en aceite 50% | ||||||||||
| 3 | 0 | 145 | 112 | 94 | 82 | 45 | 23 | 24 | 20 | 20 |
| 15 | 0 | 100 | 71 | 68 | 83 | 19 | 29 | 26 | 18 | 25 |
| 16 | 0 | 125 | 111 | 122 | 128 | 111 | 74 | 92 | 75 | 63 |
| Contenido en aceite 100% | ||||||||||
| 1 | 1 | 127 | 138 | ND | ND | ND | 33 | 51 | 17 | 27 |
| ND= no determinado |
Dado que los liposomas están compuestos por
material que es lipófilo, la conservación de los liposomas en aceite
puede conducir a su destrucción por la disolución de los
constituyentes de los liposomas en el aceite. Para investigar esta
cuestión, se inmunizan conejos (2 conejos en cada grupo) con la
vacuna (formulación con 100% de aceite) que se conserva durante
hasta 5 meses a 5ºC y -20ºC. La conservación de la vacuna a 5ºC
durante 5 meses redujo los títulos anti-SIZP de los
conejos en sólo un 28% (Tabla 6C; P= 0,002; F(5,33)= 4,9). La
conservación de la vacuna a -20ºC durante 5 meses redujo los
títulos anti-SIZP en sólo un 14% (Tabla 6D; P= <
0,001; F(5,35)= 23,7). Estos resultados indican que la
mayoría de los liposomas permanece intacta en aceite, ya que la
inmunización de conejos con una única inyección de SIZP suspendida
en adyuvante completo de Freund son encapsulación en liposomas
tiene como resultado títulos bajos (Tabla 6E).
| Conservación^{2} | Título anti-SIZP^{1} (% del suero de referencia) | ||||||||
| (meses) | |||||||||
| Después de la inmunización (meses) | |||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | Media | DE | |
| 0 | 0 | 60 | 123 | 112 | 163 | 109 | 119 | 114 | 11,2 |
| 0 | 26 | 108 | 112 | 163 | 131 | 141 | |||
| 1 | 0 | 26 | 112 | 183 | 121 | 122 | 100 | 113 | 11,9 |
| 0 | 77 | 133 | 142 | 117 | 70 | 153 | |||
| 2 | 0 | 63 | 176 | 128 | 70 | 127 | 57 | 98 | 13,9 |
| 0 | 50 | 110 | 100 | ND | ND | ND | |||
| 3 | 0 | 23 | 138 | 168 | 104 | 117 | 143 | 94 | 13,3 |
| 0 | 35 | 100 | 113 | 76 | 63 | 42 | |||
| 4 | 0 | 17 | 39 | 104 | 63 | 73 | 100 | 68 | 10,1 |
| 0 | 47 | 136 | 73 | 26 | 45 | 85 | |||
| 5 | 0 | 22 | 127 | 69 | 66 | 140 | 99 | 82 | 11,8 |
| 0 | 27 | 111 | 57 | 54 | 140 | 74 | |||
| ^{1} \begin{minipage}[t]{158mm} La composición de vacuna (formulación de 100% de aceite) se coloca en balas biológicas adquiridas de Ballistivet^{TM} y se implantaron quirúrgicamente intramuscularmente en los conejos. \end{minipage} | |||||||||
| ^{2} Las balas biológicas se conservan a 5ºC. |
| Conservación^{2} | Título anti-SIZP^{1} (% del suero de referencia) | ||||||||
| (meses) | |||||||||
| Después de la inmunización (meses) | |||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | Media | DE | |
| 0 | 0 | 60 | 123 | 112 | 163 | 109 | 119 | 114 | 11,2 |
| 1 | 26 | 108 | 112 | 163 | 131 | 141 | |||
| 1 | 0 | 9 | 13 | 13 | 41 | 19 | 60 | 27 | 6,7 |
| 0 | 6 | 16 | 14 | 73 | 33 | ND | |||
| 2 | 0 | 9 | 14 | 23 | 70 | 136 | 116 | 51 | 12,7 |
| 0 | 6 | 30 | 19 | 41 | 95 | 57 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Conservación^{2} | Título anti-SIZP^{1} (% del suero de referencia) | ||||||||
| (meses) | |||||||||
| Después de la inmunización (meses) | |||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | Media | DE | |
| 3 | 0 | 13 | 23 | 127 | 100 | 73 | 88 | 57 | 11,1 |
| 0 | 13 | 18 | 90 | 61 | 58 | 30 | |||
| 4 | 0 | 13 | 68 | 50 | 71 | 80 | 122 | 85 | 14,0 |
| 0 | 13 | 114 | 134 | 81 | 100 | 179 | |||
| 5 | 0 | 9 | 114 | 75 | 87 | 146 | 92 | 98 | 13,7 |
| 1 | 22 | 108 | 116 | 109 | 179 | 125 | |||
| ^{1} \begin{minipage}[t]{158mm} La composición de vacuna (formulación de 100% de aceite) se coloca en balas biológicas adquiridas de Ballistivet^{TM} y se implantaron quirúrgicamente intramuscularmente en los conejos. \end{minipage} | |||||||||
| ^{2} Las balas biológicas se conservan a -20ºC. |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Nº ID. del conejo | Título anti-SIZP (% del suero de referencia)^{1} | ||||
| Después de la inmunización (meses) | |||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 1 | 0 | 43 | 19 | 9 | 2 |
| 2 | 0 | 27 | 7 | 4 | 1 |
| ^{1} \begin{minipage}[t]{158mm} Los conejos se inmunizan con una única administración de SIZP (50 \mu g/conejo) suspendida en adyuvante completo de Freund. \end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar si la vacuna formulada de modo
que no contenga fase acuosa tendría como resultado una buena
respuesta en otras especies de mamíferos, se inmunizan focas grises
(Halichoerus grypus) con la vacuna que contiene por igual
fases oleosa y acuosa, sólo una fase acuosa o sólo una fase oleosa
(Tabla 6F). No se observaron diferencias en los títulos
anti-SIZP en la vacuna que contenía por igual fases
oleosa y acuosa o sólo la oleosa, pero la administración de la
vacuna que contenía todos los ingredientes a excepción de aceite
tuvo como resultado títulos significativamente menores.
| Contenido en aceite (%) | Título anti-SIZP (% del suero de referencia)^{1} | ||||
| Después de la inmunización (meses) | |||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 0^{2} | 0 | 5 | 4 | 1 | 1 |
| 0 | 1 | 2 | 1 | 1 | |
| 50^{3} | 0 | 7 | 9 | 145 | 107 |
| 0 | 41 | 52 | 82 | 38 | |
| 100^{4} | 0 | 20 | 28 | 79 | 60 |
| 0 | 3 | 30 | 90 | 50 | |
| ^{1} Cada línea presenta títulos de muestras de sangre tomadas de la misma foca gris. | |||||
| ^{2} \begin{minipage}[t]{158mm} Los liposomas que contienen SIZP (100 \mu g/foca\ gris) y Mycobacteriun tuberculosis muertos por calor (2 mg/foca gris), el ingrediente activo en el adyuvante completo de Freund como suministra Sigma Chemical Co. y se usa en todos los estudios comunicados en la presente memoria descriptiva se suspenden en solución salina (0,5 ml). \end{minipage} | |||||
| ^{3} \begin{minipage}[t]{158mm} Los liposomas que contienen SIZP (100 \mu g/foca\ gris) se suspenden en solución salina (0,5 ml) y esta fase acuosa se emulsiona en adyuvante completo de Freund (0,5 ml). \end{minipage} | |||||
| ^{4} \begin{minipage}[t]{158mm} Los liposomas que contienen SIZP (100 \mu g/foca\ gris) se liofilizan y los liposomas liofilizados resultantes se suspenden en adyuvante completo de Freund (0,5 ml). \end{minipage} |
Los liposomas son membranas lipídicas
completamente cerradas que se pueden preparar a partir de una
variedad de materiales lipídicos. En este ejemplo se comparan los
liposomas formados usando lípidos arqueabacterianos con los
liposomas formados usando lecitina de soja por su capacidad para
estimular la producción de anticuerpos en conejos (Tabla 7). Los
liposomas formados por lecitina de soja tienen como resultado una
mejor producción de anticuerpos anti-SIZP que los
liposomas formados con lípidos arqueabacterianos.
| Título anti-SIZP (% del suero de referencia) | |||||||
| Nº de Id. | Tipo de lípido | Después de la inmunización (meses) | |||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||
| 112 | Lecitina de soja | 0 | 143 | 195 | 137 | 197 | 98 |
| 115 | Lecitina de soja | 0 | 200 | 198 | 157 | 179 | 106 |
| 117 | Lípidos | 0 | 46 | 30 | 37 | 13 | ND |
| arqueabacterianos | |||||||
| 118 | Lípidos | 0 | 7 | 4 | 8 | 2 | ND |
| arqueabacterianos | |||||||
| ND= no determinado |
La composición de vacuna es única a la hora de
producción títulos elevados de anticuerpos anti-SIZP
que son duraderos después de una única administración. Para
determinar si la composición de vacuna produciría títulos elevados
de anticuerpos con otros antígenos, los conejos se inmunizan con
estreptoquinasa.
La estreptoquinasa es una exoproteína producida
por cepas patógenas de la familia de bacterias estreptococos. Como
activador de la fibrinólisis vascular, su utilidad terapéutica se ha
apreciado durante muchos años en el tratamiento del infarto de
miocardio. La estreptoquinasa se despliega de forma no cooperativa.
Por tanto, la proteína puede asumir un número de estados de
plegamiento parcial que contienen algunas regiones que parecen ser
nativas y otras que están desplegadas. Existen tres dominios de
estabilidad diferente que son independientes de otras regiones de la
proteína (Teuten y col., 1993, Biochem. J. 290:
313-319). La estreptoquinasa nativa contiene
epítopos inmunodominantes en la región del C terminal (Torrens y
col., 1999, Immunology Letters 70: 213-218). La
región del C terminal está relativamente sin estructurar (Parrado
y col., 1996, Protein Sci 5: 693-704), por
tanto el tratamiento con calor no puede alterar la estructura, ya
que estaba sin estructurar antes del tratamiento con calor. La
estabilidad térmica del dominio C aumenta significativamente
mediante su aislamiento del resto de la cadena
(Connejero-Lara y col., 1996, Protein Sci
5:2583-2591). La pérdida de la región del C terminal
tiene como resultado una proteína menos inmunógena, pero sí expone
los epítopos inmunogénicos escondidos en la molécula nativa. En
nuestros estudios, la región del C terminal estaba presente en la
estreptoquinasa nativa y tratada con calor, por tanto, como la
región inmunodominante de la proteína, determinaría la respuesta de
los conejos. Si la región del C terminal retenía los mismos epítopos
tras el tratamiento con calor que se encuentran en el estado nativo,
no cabría esperar encontrar una diferencia en la unión de
anticuerpos antiestreptoquinasa a la estreptoquinasa nativa y
tratada con calor. Estas son exactamente las observaciones
encontradas (Tabla 8). Los autores han propuesto que la liberación
de proteínas desnaturalizadas usando una composición de vacuna de la
presente invención favorece la producción de anticuerpos dirigidos
contra epítopos nativos. Esto está avalado por los estudios de la
alcohol deshidrogenasa en el Ejemplo 2. Los resultados con
estreptoquinasa son consistentes con esta propuesta ya que el
tratamiento con calor no alteraría la estructura de la región
inmunodominante y de ahí se deduce la predicción de que no habría
diferencias en la respuesta inmunitaria de los conejos que se
estaban inmunizando con estreptoquinasa nativa y tratada con calor
al margen del sistema de liberación empleado. Estas son exactamente
las observaciones de los autores (Tabla 8).
| Inmunización | Título (% del suero de referencia)^{3} | |||||||
| ID. Del conejo | Antígeno | Liberación | Estreptoquinasa nativa | Estreptoquinasa tratada con calor | ||||
| Después de la inmunización (meses) | ||||||||
| 0 | 1 | 2 | 0 | 1 | 2 | |||
| 21 | Nativa | Invención | 0 | 100 | 122 | 0 | 98 | 122 |
| 24 | Nativa | Invención | 0 | 82 | 98 | 0 | 53 | 108 |
| 25 | Nativa | Convencional | 0 | 10 | 89 | 0 | 8 | 100 |
| 20 | Nativa | Convencional | 0 | 9 | 94 | 0 | 3 | 92 |
| 23 | Tratada con calor | Invención | 0 | 10 | 34 | 0 | 15 | 31 |
| 28 | Tratada con calor | Invención | 0 | 25 | 99 | 0 | 24 | 94 |
| 27 | Tratada con calor | Convencional | 0 | 9 | 107 | 0 | 7 | 94 |
| 30 | Tratada con calor | Convencional | 0 | 10 | 100 | 0 | 8 | 94 |
| ^{1} \begin{minipage}[t]{158mm} Los conejos se inmunizaron con 75 \mu g de estreptoquinasa en adyuvante completo de Freund, seguido por una inyección de refuerzo un mes después con 75 \mu g de estreptoquinasa en adyuvante incompleto de Freund. \end{minipage} | ||||||||
| ^{2} \begin{minipage}[t]{158mm} Los conejos se inmunizaron con una única inyección de 75 \mu g de estreptoquinasa en una vacuna de la presente invención. \end{minipage} | ||||||||
| ^{3} Los títulos se midieron con estreptoquinasa nativa y tratada con calor. |
De los resultados se hace evidente que una única
inyección de estreptoquinasa usando una vacuna de la presente
invención producía títulos anti-estreptoquinasa
similares a los títulos obtenidos mediante los protocolos
convencionales de inyecciones principal y de refuerzo. Asimismo, al
margen del protocolo de inmunización usado, es decir el de la
presente invención o el convencional, los anticuerpos producidos se
unían a la estreptoquinasa nativa y tratada con calor igualmente
bien.
Se formuló una composición de vacuna de acuerdo
con esta invención usando aceite de colza en lugar de aceite
mineral. Los resultados se muestran en la Tabla 9. Los resultados
indican que las vacunas formuladas con aceite de colza producen
anticuerpos anti-SIZP en conejos, por tanto, el
aceite de colza es útil. No obstante, los niveles de titulación no
son tan elevados como los que se producen con aceite mineral.
\vskip1.000000\baselineskip
| ID. Del conejo | Formulación de la vacuna | Título anti-SIZP (% del suero de referencia) | |||||||
| Después de la inmunización (meses) | |||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | ||
| 4 | Alumbre/aceite mineral | 0 | 111 | 123 | 105 | 124 | 95 | 125 | 157 |
| 14 | 0 | 231 | 132 | 205 | 178 | 279 | 258 | 251 | |
| 9 | ACF/aceite mineral^{1} | 0 | 162 | 264 | 310 | ND | ND | ND | ND |
| 26 | 0 | 351 | 166 | 112 | ND | ND | ND | ND | |
| 34 | ACF/aceite de colza^{2} | 0 | 27 | 24 | 37 | ND | ND | ND | ND |
| 36 | 0 | 18 | 24 | 36 | ND | ND | ND | ND | |
| ^{1} \begin{minipage}[t]{158mm} El adyuvante completo de Freund (ACF) se obtuvo de una fuente comercial (Sigma) y se formuló con aceite mineral. \end{minipage} | |||||||||
| ^{2} \begin{minipage}[t]{158mm} ACF/aceite de colza contenía la misma cantidad de células de Mycobacterium muertas por calor que las presentes en el ACF, pero el componente de aceite mineral del ACF se sustituyó por aceite de colza comestible. \end{minipage} | |||||||||
| ND= no determinado |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se formuló una vacuna de acuerdo con la presente
invención usando 5 microgramos de antígeno de superficie de la
hepatitis B (Recombivax HB^{TM}, un antígeno recombinante de la
hepatitis B) que contiene adyuvante alumbre encapsulada en liposomas
que contienen lecitina de soja (0,05 g) y colesterol (0,005 g)
suspendidos en solución salina (0,25 ml), después se emulsionaron en
aceite mineral de viscosidad baja (0,225 ml) y oleato de MANNIDE
(0,025 ml). También se administró una vacuna convencional contra la
hepatitis B usando 5 microgramos de antígeno de superficie de la
hepatitis B (Recombivax HB^{TM}, un antígeno recombinante de la
hepatitis B) que contiene adyuvante alumbre en un volumen de 0,5 ml
de medio acuoso según recomienda el fabricante. Se inmunizaron ocho
conejos con la vacuna preparada de acuerdo con la presente invención
y ocho conejos se inmunizaron con la vacuna convencional. Los
resultados se muestran en la Tabla 10.
De la Tabla 10 se hace evidente que la vacuna
preparada de acuerdo con la presente invención da como resultado 6
veces más anticuerpos 1 mes después de la inmunización que la
liberación convencional del antígeno de superficie de la hepatitis
B.
| Id. Del conejo | Tïtulo anti-HepB (mUI/ml)^{1} | |
| Después de la inmunización (meses) | ||
| 0 | 1 | |
| Vacuna comercial | ||
| 96 | 0 | 736 |
| 101 | 0 | 1237 |
| 97 | 0 | 488 |
| 100 | 0 | 1877 |
| 99 | 0 | 6251 |
| 103 | 0 | 8384 |
| 98 | 0 | 688 |
| 102 | 0 | 1568 |
| Media | 0 | 2654 |
| Vacuna de la invención | ||
| 93 | 0 | 32.341 |
| 95 | 0 | 3371 |
| 88 | 0 | 5717 |
| 81 | 0 | 23.808 |
| 83 | 0 | 9344 |
| 84 | 0 | 17.856 |
| 79 | 0 | 9344 |
| 85 | 0 | 21.675 |
| Media | 0 | 15.432 |
| ^{1} \begin{minipage}[t]{158mm} Los títulos de anticuerpos se midieron usando el inmunoensayo enzimático para la detección de anticuerpos contra el antígeno de superficie de la hepatitis B (anti-HBs) distribuido por DiaSorin Inc., Stillwater, MN, EE.UU. \end{minipage} |
Las vacunas se prepararon del siguiente modo:
| Grupo | Antígeno SIZP | Alumbre | Medio |
| 1 | Dentro del liposoma | Dentro del liposoma | Solución salina |
| 2 | Dentro del liposoma | Fuera del liposoma | Solución salina |
| 3 | Dentro del liposoma | Dentro del liposoma | Aceite |
| 4 | Dentro del liposoma | Fuera del liposoma | Aceite |
| 5 | Control-no liposomas | Aceite | |
| 6 | Control-no liposomas | Solución salina |
Los grupos 1-4 se prepararon con
100 \mug de SIZP encapsulada en liposomas formados con 0,1 g de
lecitina de soja y 0,01 g de colesterol. Los liposomas de los grupos
1 y 3 también contenían 100 \mul de ImjectAlum^{TM}. En los
Grupos 2 y 4, 100 \mul de ImjectAlum^{TM} se colocaron en la
parte externa de los liposomas. En los Grupos 1 y 2, los liposomas
se suspendieron en 0,25 ml de solución salina y esta suspensión se
emulsionó en 0,225 ml de aceite mineral de baja viscosidad y 0,225
ml de oleato de manida. En los Grupos 3 y 4, los liposomas se
liofilizaron, después se suspendieron en 0,225 ml de de aceite
mineral de baja viscosidad y 0,225 ml de oleato de manida y esta
suspensión se emulsionó en 0,25 ml de solución salina. En el Grupo
5, se liofilizaron 100 \mug de SIZP y 100 \mul de
ImjectAlum^{TM}, después se suspendieron en 0,225 ml de de aceite
mineral de baja viscosidad y 0,025 ml de oleato de manida y se
emulsionaron en 0,25 ml de solución salina. En el Grupo 6, se
liofilizaron 100 \mug de SIZP y 100 \mul de ImjectAlum^{TM},
después se suspendieron en 0,25 ml de solución salina y se
emulsionaron en 0,225 ml de aceite mineral de baja viscosidad y
0,025 ml de oleato de manida. Los conejos se inmunizaron con los
seis grupos de vacunas y los resultados se muestran en la Tabla
11.
| Grupo | Id. del | Título anti-SIZP | Título medio | Error estándar del | ||||||||
| conejo | (% del suero de referencia) | Después de la inmunización | título medio | |||||||||
| Después de la inmunización | (meses) | |||||||||||
| (meses) | ||||||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 0 | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | ||
| 1 | 49 | 2 | 107 | 176 | 183 | 0 | 135 | 203 | 236 | 22 | 28 | 37 |
| 1 | 76 | 0 | 134 | 105 | 124 | |||||||
| 1 | 71 | 0 | 70 | 249 | 331 | |||||||
| 1 | 82 | 0 | 182 | 236 | 268 | |||||||
| 1 | 78 | 0 | 182 | 249 | 274 | |||||||
| 2 | 73 | 0 | 373 | 273 | 304 | 0 | 287 | 207 | 258 | 32 | 24 | 15 |
| 2 | 42 | 0 | 328 | 199 | 281 | |||||||
| 2 | 62 | 0 | 259 | 194 | 244 | |||||||
| 2 | 77 | 0 | 182 | 131 | 235 | |||||||
| 2 | 74 | 0 | 295 | 238 | 225 | |||||||
| 3 | 83 | 0 | 363 | 135 | 113 | 0 | 300 | 171 | 160 | 32 | 26 | 34 |
| 3 | 67 | 0 | 286 | 175 | 140 |
| Grupo | Id. del | Título anti-SIZP | Título medio | Error estándar del | ||||||||
| conejo | (% del suero de referencia) | Después de la inmunización | título medio | |||||||||
| Después de la inmunización | (meses) | |||||||||||
| (meses) | ||||||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 0 | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | ||
| 3 | 70 | 0 | 332 | 241 | 261 | |||||||
| 3 | 80 | 0 | 218 | 131 | 125 | |||||||
| 4 | 48 | 0 | 383 | 210 | 113 | 0 | 200 | 138 | 108 | 49 | 20 | 12 |
| 4 | 64 | 0 | 129 | 109 | 121 | |||||||
| 4 | 61 | 0 | 125 | 98 | 63 | |||||||
| 4 | 60 | 0 | 148 | 140 | 115 | |||||||
| 4 | 66 | 0 | 215 | 134 | 130 | |||||||
| 5 | 45 | 0 | 21 | 133 | 120 | 0 | 26 | 96 | 123 | 8 | 29 | 33 |
| 5 | 65 | 0 | 6 | 26 | 42 | |||||||
| 5 | 69 | 0 | 49 | 110 | 121 | |||||||
| 5 | 72 | 0 | 12 | 36 | 89 | |||||||
| 5 | 50 | 0 | 40 | 176 | 242 | |||||||
| 6 | 68 | 0 | 28 | 31 | 22 | 0 | 16 | 22 | 18 | 4 | 3 | 1 |
| 6 | 75 | 0 | 9 | 16 | 16 | |||||||
| 6 | 46 | 0 | 18 | 23 | 17 | |||||||
| 6 | 43 | 0 | 10 | 19 | 16 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Las vacunas se prepararon del siguiente modo:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Grupo | Antígeno SIZP | M. tuberculosis | Medio |
| muertos por calor | |||
| 1 | Dentro del liposoma | Dentro del liposoma | Solución salina |
| 2 | Dentro del liposoma | Fuera del liposoma | Solución salina |
| 3 | Dentro del liposoma | Dentro del liposoma | Aceite |
| 4 | Dentro del liposoma | Fuera del liposoma | Aceite |
\newpage
Los Grupos 1-4 se prepararon con
100 \mug de SIZP encapsulada en liposomas formados con 0,1 g de
lecitina de soja y 0,01 g de colesterol. Los liposomas de los Grupos
1 y 3 también contenían 200 \mul de M. tuberculosis muertos
por calor. En los Grupos 2 y 4, 200 \mul de M. tuberculosis
muertos por calor se colocaron en la parte externa de los liposomas.
En los Grupos 1 y 2, los liposomas se suspendieron en 0,2 ml de
solución salina y esta suspensión se emulsionó en 0,18 ml de aceite
mineral de baja viscosidad y 0,02 ml de oleato de manida. En los
Grupos 3 y 4, los liposomas se liofilizaron, después se suspendieron
en 0,18 ml de de aceite mineral de baja viscosidad y 0,02 ml de
oleato de manida y esta suspensión se emulsionó en 0,2 ml de
solución salina. Los conejos se inmunizaron con los cuatro grupos de
vacunas y los resultados se muestran en la Tabla 12.
\vskip1.000000\baselineskip
| Grupo | Id. del | Título anti-SIZP | Título medio | Error estándar del | ||||||||
| conejo | (% del suero de referencia) | Después de la inmunización | título medio | |||||||||
| Después de la inmunización | (meses) | |||||||||||
| (meses) | ||||||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 0 | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | ||
| 1 | 33 | 0 | 245 | 236 | 259 | 0 | 318 | 262 | 437 | 51 | 18 | 126 |
| 1 | 29 | 0 | 390 | 288 | 614 | |||||||
| 2 | 32 | 0 | 544 | 515 | 633 | 0 | 578 | 532 | 638 | 22 | 12 | 3 |
| 2 | 22 | 0 | 608 | 549 | 642 | |||||||
| 3 | 9 | 0 | 162 | 264 | 310 | 0 | 293 | 599 | 508 | 93 | 237 | 140 |
| 3 | 13 | 0 | 424 | 933 | 707 | |||||||
| 4 | 16 | 0 | 454 | 276 | 532 | 0 | 403 | 221 | 322 | 36 | 39 | 149 |
| 4 | 26 | 0 | 351 | 166 | 112 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Se formularon vacunas de la presente invención
que contenían 100 \mug de ADH nativa o desnaturalizada junto con
100 \mul de ImjectAlum^{TM} encapsulada en liposomas formados
con 0,1 g de lecitina de soja y 0,01 g de colesterol. Los liposomas
se suspendieron en 0,25 ml de solución salina y la suspensión se
emulsionó en 0,225 ml de aceite mineral de baja viscosidad y 0,225
ml de oleato de manida.
Se formularon vacunas convencionales que
contenían 100 mg de ADH nativa o desnaturalizada junto con 100
\mul de ImjectAlum^{TM} y se suspendieron en 0,5 ml de solución
salina.
La ADH desnaturalizada se preparó mediante
calentamiento de ADH hasta 100ºC durante 30 minutos y el tratamiento
con mercaptoetanol al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente
para romper los puentes disulfuro. El mercaptoetanol se eliminó
mediante diálisis durante 12 horas y la ADH desnaturalizada se
recuperó mediante liofilización.
Los resultados de la comparación de vacunas de la
presente invención y las vacunas convencionales se muestran en la
Tabla 13.
| Id. del conejo | Sistema de liberación | Título anti-ADH (% del suero de referencia) | |||||||
| Después de la inmunización (meses) | |||||||||
| ADH nativa | ADH desnaturalizada | ||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 0 | 1 | 2 | 3 | ||
| ADH nativa | |||||||||
| 54 | Invención | 0 | 24 | 42 | 66 | 0 | 8 | 4 | 4 |
| 57 | 0 | 100 | 143 | 146 | 0 | 29 | 3 | 6 | |
| 55 | 0 | 91 | 85 | 111 | 0 | 26 | 3 | 5 | |
| 40 | Convencional | 0 | 1 | 1 | 2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 44 | 0 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 | |
| 47 | 0 | 5 | 4 | 8 | 0 | 3 | 1 | 1 | |
| ADH desnaturalizada | |||||||||
| 53 | Invención | 0 | 1 | 2 | 5 | 0 | 1 | 1 | 2 |
| 58 | 0 | 1 | 1 | 2 | 0 | 1 | 0,5 | 1 | |
| 52 | 0 | 1 | 4 | 15 | 0 | 1 | 0,5 | 1 | |
| 51 | Convencional | 0 | 2 | 4 | 4 | 0 | 1 | 0,5 | 2 |
| 59 | 0 | 1 | 1 | 4 | 0 | 1 | 0,5 | 0 | |
| 56 | 0 | 2 | 2 | 2 | 0 | 1 | 0,5 | 0 |
Los resultados muestran que la liberación de ADH
nativa o desnaturalizada usando una formulación de la presente
invención tiene como resultado una mayor producción de anticuerpos
anti-ADH en comparación con la producción de
anticuerpos anti-ADH por conejos inmunizados contra
la ADH nativa o desnaturalizada usando procedimientos
convencionales. Además, los conejos inmunizados con la ADH
desnaturalizada produjeron más anticuerpos dirigidos contra la ADH
nativa cuando se usó una formulación de la presente invención en
lugar de cuando se libera ADH desnaturalizada por medios
convencionales sin inyecciones de refuerzo.
Experimentos de cartografía de los epítopos para
demostrar que las vacunas de la presente invención producen
anticuerpos que poseen diferente especificidad de unión para un
antígeno que la alcanzada mediante protocolos de inmunización
convencionales de inyecciones principal y secundarias de refuerzo.
Los fragmentos del antígeno ZP se usaron de forma específica, pero
cabe esperar que otros antígenos se comporten de un modo
similar.
La inmunización convencional de focas grises y
arpa con una inyección principal y dos inyecciones de refuerzo tiene
como resultado títulos bajos de anticuerpos
anti-SIZP que tienen un máximo dos meses después de
la inmunización en las focas tanto grises como arpa. En contraste
con ello, la inmunización con una vacuna formulada de acuerdo con la
presente invención produce títulos de anticuerpos
anti-SIZP que persisten durante al menos 24 horas en
las focas grises y 5-6 meses en las focas arpa, con
una excepción. Los títulos en las focas arpa alcanzan un nivel
meseta que persiste durante 6-10 meses después de la
inmunización. Por tanto, una vacuna formulada de acuerdo con la
presente invención induce títulos elevados de anticuerpos
anti-SIZP de larga duración en comparación con los
protocolos de inmunización convencionales usando inyecciones
principal y de refuerzo.
Los fragmentos polipeptídicos de ZPB Y ZPC que se
usaron en la cartografía del epítopo para demostrar que los
anticuerpos anti-SIZP producidos siguiendo los
protocolos de inmunización convencionales poseen diferente
especificidad de unión de la que poseen los anticuerpos
anti-SIZP producidos tras la inmunización con una
vacuna de la presente invención se muestran en la Figura 1. Los
fragmentos ZPB1, ZPB2, ZPC1 y ZPC2 son polipéptidos de longitud
corta y no tienen estructuras tridimensionales de longitud completa
ZPB y ZPC. En la Figura 1, los polipéptidos sin procesar de
longitud total se muestran encima de los dos fragmentos ZPB y ZPC.
Los péptidos señalizadores secretores que se escinden en las
proteínas nativas se sombrean en negro.
Los anticuerpos anti-SIZP de las
focas grises producidos siguiendo inmunización convencional (una
inyección principal y dos de refuerzo usando adyuvante ACF) poseen
una afinidad elevada por los fragmentos ZPB1, ZPB2, ZPC1 y ZPC2
(Tabla 14A, foca con nº de id. 1). En contraste con ello, las focas
grises inmunizadas con una vacuna formulada de acuerdo con la
presente invención (Tabla 14A, focas con nº de id. 76 y 96) producen
anticuerpos que poseen una afinidad baja por los fragmentos ZPB2,
ZPC1 y ZPV2 un año después de la inmunización y afinidad baja por
los cuatro fragmentos tres años después de la inmunización. Los
cuatro fragmentos juntos representan el 80% de la proteína
encontrada en la SIZP.
| ID. de la foca | Después de la inmunización | Unión relativa a la SIZP (%) | ||||
| (meses) | ||||||
| ZPB1 | ZPB2 | ZPC1 | ZPC2 | Total | ||
| 1 | 3 | 30 | 44 | 59 | 41 | 174 |
| 1 | 4 | 71 | 70 | 83 | 63 | 287 |
| 76 | 12 | 54 | 25 | 8 | 12 | 99 |
| 76 | 36 | 18 | 9 | 13 | 11 | 51 |
| 96 | 12 | 47 | 18 | 15 | 10 | 90 |
| 96 | 36 | 10 | 8 | 15 | 10 | 43 |
Un estudio temporal de la especificidad de unión
de los anticuerpos producidos por focas grises inmunizadas con una
vacuna formulada de acuerdo con la presente invención indicó que los
anticuerpos productos pronto después de la inmunización (< 7
meses) se unen a epítopos que se localizan principalmente en el
fragmento ZPB1. Los anticuerpos producidos más tarde después de la
inmunización (> 7 meses) poseen una afinidad menor por ZPB1 Y los
otros tres fragmentos. Los fragmentos ZPB1, ZPB2, ZPC1 y ZPC2 son de
peso molecular bajo y no están glicosilados. Estos fragmentos poseen
una estructura menos tridimensional que los ZPB y ZPC de longitud
completa a causa de su bajo peso molecular. Por tanto, los
anticuerpos que se unen a la SIZP pero no a ZPB1, ZPB2, ZPC1 O ZPC2
deben reconocer estructuras tridimensionales reconocibles que sólo
se encuentran en los fragmentos ZPB y ZPC o los hidratos de carbono
unidos de forma covalente a estas proteínas. Dado que la cantidad
total de anticuerpo unido a los fragmentos pronto tras la
inmunización supera o es equivalente a la cantidad de anticuerpo que
se une a los fragmentos ZPB y ZPB, el anticuerpo que reconoce
carbohidratos debe desempeñar un papel pequeño. Esto implica que las
estructuras 3-D determinan la diferencia en la unión
a los fragmentos en oposición a la SIZP. Un estudio con otras nueve
focas grises inmunizadas con SIZP en una vacuna de la presente
invención indica una reducción similar de los anticuerpos producidos
5 meses o más después de la inmunización.
En otro experimento, tres de cuatro conejos
inmunizados con una vacuna de la presente invención produjeron
anticuerpos con una afinidad más elevada por epítopos en ZPB1 que en
los otros tres fragmentos. Sólo el 20-30% de los
anticuerpos producidos por los cuatro conejos se unió a los epítopos
que se encuentran en los cuatro fragmentos ZP. Por tanto, el
60-80% de los anticuerpos anti-SIZP
producidos por conejos inmunizados con una vacuna de la presente
invención se unió únicamente a los epítopos que se encuentran en ZPB
y ZPC de longitud completa. Por tanto, el 60-80% de
los anticuerpos producidos en conejos inmunizados con una vacuna de
la presente invención reconocen epítopos relacionados con las
estructuras -D nativas.
En otro experimento, la inmunización de focas
arpa (156 y 162) mediante protocolos convencionales de una inyección
principal usando adyuvante ACF, seguido por inyecciones de refuerzo
con adyuvante AIF produjo anticuerpos pronto después de la
inmunización que se unieron a epítopos encontrados en ZPB1, ZPB2 y
ZPC2 (foca arpa 156) o los cuatro fragmentos (foca arpa 162) así
como en SIZP (Tabla 14B). En contraste con ello, la inmunización de
una foca arpa 151 con una vacuna formulada de acuerdo con la
presente invención produjo anticuerpos pronto tras la inmunización
(< 5 meses) que se unieron a los epítopos que se encuentran en
los cuatro fragmentos ZP, pero los anticuerpos producidos más tarde
después de la inmunización (> 7 meses) se unieron a los epítopos
que únicamente se encuentran en ZPB y ZPC de longitud completa
(Tabla 14B). Sólo el 30-40% de los anticuerpos
producidos por inmunización de la foca arpa 153 con una vacuna de la
presente invención se unieron bien a los epítopos de los cuatro
fragmentos de ZP, lo que implica que el 6-70% de los
anticuerpos producidos por la foca arpa 153 durante el periodo de 7
meses tras la inmunización se unieron sólo a los epítopos
encontrados en ZPB Y ZPC de longitud completa. Estos epítopos deben
estar relacionados con las estructuras que sólo se encuentran en ZPB
Y ZPC de longitud completa, lo que implica estructuras
3-D. La inmunización de la foca encapuchada 1 con
una vacuna de la presente invención produjo anticuerpos con una
secuencia temporal similar de especificidad a la de la foca arpa
151.
| ID. de la foca | Después de la inmunización | Unión relativa a la SIZP (%) | ||||
| (meses) | ||||||
| ZPB1 | ZPB2 | ZPC1 | ZPC2 | Total | ||
| Arpa 156 | 2 | 9 | 8 | 7 | 7 | 31 |
| 3 | 30 | 19 | 10 | 24 | 83 | |
| 4 | 36 | 38 | 2 | 34 | 110 | |
| Arpa 162 | 2 | 8 | 10 | 11 | 11 | 40 |
| 3 | 33 | 26 | 19 | 24 | 102 | |
| Arpa 151 | 1 | 40 | 33 | 36 | 33 | 142 |
| 3 | 41 | 28 | 32 | 21 | 122 | |
| 5 | 21 | 27 | 35 | 34 | 117 | |
| 6 | 50 | 26 | 30 | 44 | 150 | |
| 7 | 8 | 6 | 9 | 8 | 31 | |
| 9 | 4 | 17 | 32 | 10 | 63 | |
| Arpa 153 | 2 | 12 | 6 | 11 | 9 | 38 |
| 3 | 16 | 12 | 9 | 12 | 49 | |
| 4 | 6 | 5 | 7 | 3 | 21 | |
| 5 | 13 | 8 | 12 | 11 | 44 | |
| 6 | 12 | 9 | 11 | 12 | 44 | |
| 7 | 9 | 8 | 0 | 7 | 22 | |
| Encapuchada 1 | 2 | 30 | 22 | 26 | 27 | 105 |
| 3 | 33 | 25 | 28 | 30 | 116 | |
| 4 | 37 | 32 | 38 | 34 | 141 | |
| 5 | 31 | 24 | 29 | 31 | 115 | |
| 7 | 15 | 12 | 12 | 11 | 50 | |
| 8 | 12 | 13 | 11 | 8 | 44 |
Claims (45)
1. Una composición para usar como vacuna, que
comprende:
- (a)
- un transportador que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba farmacéutica y/o inmunológicamente aceptable;
- (b)
- liposomas;
- (c)
- un antígeno; y
- (d)
- un adyuvante adecuado
2. La composición de la reivindicación 1, en la
que la sustancia hidrófoba es un líquido.
3. La composición de la reivindicación 2, en la
que el transportador es un aceite o una emulsión de agua en
aceite.
4. La composición de la reivindicación 3, en la
que el aceite es aceite mineral, un aceite vegetal, escualeno o un
aceite de nuez.
5. La composición de la reivindicación 3, en la
que el adyuvante es alumbre u otro compuesto de aluminio.
6. La composición de la reivindicación 5, en la
que el adyuvante es alumbre.
7. La composición de la reivindicación 3, en la
que el antígeno es un péptido o proteína nativa, no nativa,
recombinantes o desnaturalizante, o un fragmento de los mismos.
8. La composición de la reivindicación 7, en la
que el antígeno es un antígeno vírico, bacteriano, protozooico o de
mamíferos.
9. La composición de la reivindicación 8, en la
que el antígeno es capaz de provocar un anticuerpo que reconoce un
epítopo nativo.
10. La composición de la reivindicación 9, en la
que el epítopo nativo es un epítopo de mamífero.
11. La composición de la reivindicación 10, en la
que el mamífero es un caballo, un conejo, un ciervo o un gato.
12. La composición de la reivindicación 7, en la
que el antígeno es una glicoproteína de la zona pelúcida o fragmento
de la misma, alcohol deshidrogenasa, un antígeno de la hepatitis B o
estreptoquinasa.
13. La composición de la reivindicación 3, en la
que los liposomas comprenden colesterol sin esterificar y un
fosfolípido con al menos un grupo principal seleccionado del grupo
consistente en fosfoglicerol, fosfoetanolamina, fosfoserina,
fosfocolina y fosfoinositol.
14. La composición de la reivindicación 3, que
está esencialmente exenta de lípido A.
15. La composición de la reivindicación 4, en la
que el antígeno es una glicoproteína de la zona pelúcida o fragmento
de la misma, el adyuvante es alumbre, y la vacuna proporciona
inmunoanticoncepción a largo plazo eficaz en un mamífero.
16. La composición de la reivindicación 15, en la
que el aceite es aceite mineral y la composición está esencialmente
exenta de lípido A.
17. El uso de:
- (a)
- un transportador que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba farmacéutica y/o inmunológicamente aceptable;
- (b)
- liposomas;
- (c)
- un antígeno; y
- (d)
- un adyuvante adecuado;
en la fabricación de un medicamento
para potenciar una respuesta inmunitaria en un
animal.
18. El uso según la reivindicación 17, en el que
la sustancia hidrófoba es un líquida.
19. El uso según la reivindicación 17, en el que
el transportador es un aceite o una emulsión de agua en aceite.
20. El uso según la reivindicación 19, en el que
el aceite es un aceite mineral, un aceite vegetal, escualeno o un
aceite de nuez.
21. El uso según la reivindicación 20, en el que
el adyuvante es alumbre.
22. El uso según la reivindicación 20, en el que
el antígeno es una glicoproteína de la zona pelúcida o fragmento de
la misma, alcohol deshidrogenasa, un antígeno de la hepatitis B o
estreptoquinasa.
23. El uso según la reivindicación 21, en el que
el antígeno es capaz de producir una anticuerpo que reconoce el
epítopo nativo.
24. El uso según la reivindicación 23, en el que
el epítopo nativo es un epítopo de mamífero.
25. El uso según la reivindicación 24, en el que
el mamífero es un caballo, un conejo, un ciervo o un gato.
26. El uso según la reivindicación 19, en el que
la composición está sustancialmente exenta de lípido A.
27. Un procedimiento de preparar una composición
de vacuna que comprende las etapas de:
- (a)
- encapsular un complejo antígeno/adyuvante en liposomas para formar un antígeno encapsulado en liposoma;
- (b)
- mezclar el antígeno encapsulado en liposoma con un transportador que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba farmacéutica y/o inmunológicamente aceptable; y
- (c)
- añadir un adyuvante adecuado si en la parte (a) no se usa un complejo antígeno/adyuvante.
28. El procedimiento de la reivindicación 27, en
el que el antígeno encapsulado en liposoma está liofilizado.
29. El procedimiento de la reivindicación 28, en
el que un antígeno sin adyuvante se encapsula en los liposomas antes
de añadir el adyuvante y el antígeno encapsulado en liposoma se
liofiliza después de añadir el adyuvante para formar un antígeno
encapsulado en liposoma liofilizado con adyuvante externo.
30. El procedimiento de la reivindicación 29, en
el que el adyuvante se añade a agua apirógena antes de que el
adyuvante se añada al antígeno encapsulado en liposoma.
31. El procedimiento de la reivindicación 30, en
el que el antígeno encapsulado en liposoma liofilizado con adyuvante
externo se mezcla con el transportador y en el que un medio acuoso
se mezcla con el transportador para formar una emulsión de agua en
la sustancia hidrófoba.
32. El procedimiento de la reivindicación 31, en
el que el antígeno encapsulado en liposoma liofilizado con adyuvante
externo se mezcla después con el transportador.
33. El procedimiento de la reivindicación 28, en
el que el antígeno encapsulado en liposoma comprende un complejo
antígeno/adyuvante y en el que el antígeno encapsulado en liposoma
liofilizado se mezcla con el transportador y en el que un medio
acuoso se mezcla con el transportador para formar una emulsión de
agua en la sustancia
hidrófoba.
hidrófoba.
34. El procedimiento de la reivindicación 27, en
el que:
- (i)
- el antígeno encapsulado en liposoma se mezcla con un medio acuoso antes de mezclarlo con el transportador;
- (ii)
- el adyuvante se añade al transportador antes de que el transportador se mezcle con el antígeno encapsulado en liposoma; y
- (iii)
- el transportador se mezcla con el antígeno encapsulado en liposoma para formar una emulsión de agua en la sustancia hidrófoba.
35. El procedimiento de la reivindicación 27, en
el que:
- (i)
- el antígeno encapsulado en liposoma comprende un complejo antígeno-adyuvante;
- (ii)
- el antígeno encapsulado en liposoma se mezcla con un medio acuoso antes de mezclarlo con el transportador; y
- (iii)
- el antígeno encapsulado en liposoma se mezcla con el transportador para formar una emulsión de agua en la sustancia hidrófoba.
36. El procedimiento de la reivindicación 27, en
el que la sustancia hidrófoba es un líquido.
37. El procedimiento de la reivindicación 36, en
el que el líquido es un aceite.
38. El procedimiento de la reivindicación 37, en
el que el aceite es aceite mineral.
39. El procedimiento de la reivindicación 27, en
el que el adyuvante es alumbre.
40. El procedimiento de la reivindicación 27, en
el que el antígeno es una glicoproteína de la zona pelúcida o
fragmento de la misma, alcohol deshidrogenasa, un antígeno de la
hepatitis B o estreptoquinasa.
41. El procedimiento de la reivindicación 27, en
el que el adyuvante es alumbre y el transportador es un aceite o una
emulsión de agua en aceite.
42. El procedimiento de la reivindicación 32, en
el que el aceite es aceite mineral.
43. La composición de la reivindicación 1, en la
que el antígeno es un antígeno que provoca una respuesta
inmunitaria relacionada con el cáncer.
44. El uso de la reivindicación 17, en el que el
antígeno es un antígeno que provoca una respuesta inmunitaria
relacionada con el cáncer.
45. El procedimiento de la reivindicación 27, en
el que el antígeno es un antígeno que provoca una respuesta
inmunitaria relacionada con el cáncer.
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