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CN103555838A - 一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒 Download PDF

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CN103555838A CN201310533375.XA CN201310533375A CN103555838A CN 103555838 A CN103555838 A CN 103555838A CN 201310533375 A CN201310533375 A CN 201310533375A CN 103555838 A CN103555838 A CN 103555838A
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Abstract

本发明提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒。本发明提供的探针包括发卡探针和环形探针，发卡探针依次包括5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3），5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3）均为单链核苷酸，其中，5’端侧链（1）和环区（2）具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，5’端侧链（1）和3’端侧链（3）的部分核苷酸序列互补，3’端侧链（3）具有与环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列；本发明提供的miRNA检测方法，能区分待测miRNA、与靶标序列相似的miRNA、及目标miRNA前体；且检测血液样品时不需要miRNA抽提和纯化。

Description

一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及核酸分子检测领域，具体涉及一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒。
背景技术
miRNA是真核生物细胞中一类非编码小分子RNA，主要在转录后水平发挥调控靶基因的作用。miRNA参与调节众多生理病理过程，特别在肿瘤的发生和发展中发挥着重要的调节作用。伴随着癌症的发生发展，miRNA水平在外周体液（特别是血清）中的异常波动成为癌症早期诊断的重要生理指标。然而，miRNA通常尺寸小，在体液中的丰度低，且同一家族内不同miRNA的核酸序列高度相似，因而实现miRNA的高灵敏分析具有很大的挑战性。
目前，qRT-PCR（定量逆转录聚合酶链式反应）、miRNA微阵列和第二代测序技术是主要的miRNA检测手段。其中，miRNA微阵列和第二代测序技术在高通量检测和挖掘新的miRNA上较有优势，但是检测的特异性和灵敏度有待提高；此外，目前微阵列和第二代测序技术需要专业且昂贵的设备进行数据采集和数据解析，从而限制了它们的广泛应用；qRT-PCR是目前最为认可的miRNA定量检测手段，具有较高的检测特异性和灵敏度，但是该方法需要额外的反转录反应，并且引物设计的难度较高，操作过程较为繁琐。
滚环扩增是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法，以单链环状DNA为模板，以寡聚核苷酸为引物（与部分环状模板互补），在有顶替作用的DNA聚合酶作用下，引物延伸一个循环至起始延伸处再顶替剥离下旧的DNA链而进行下一轮扩增，如此循环，生成包含若干重复序列的DNA长链。基于滚环扩增的miRNA检测通常需要高温孵育（55℃～65℃）促进锁式探针和miRNA间的退火，然而处理的温度接近或高于发卡结构的miRNA前体的熔解温度，miRNA前体本身包含miRNA序列，因此会形成miRNA前体与锁式探针之间的错配，从而影响检测的特异性。
针对上述问题，有必要提供一种不仅能特异性的区分待测miRNA、与待测miRNA相似的序列、及目标miRNA的前体，而且简单易行，能快速、高灵敏对检测样品中miRNA浓度的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针。本发明第二方面提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测方法。本发明第三方面提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测试剂盒。本发明提供的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒在生物医学研究和疾病早期诊断方面具有广阔的应用价值，不仅能特异性的区分待测miRNA、与待测miRNA相似的序列、及目标miRNA的前体，而且简单易行，能快速、高灵敏检测样品中miRNA的浓度。
本发明所述“miRNA”是指微小核糖核酸。
第一方面，本发明提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，包括发卡探针和环形探针，所述发卡探针依次包括5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3），所述5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3）均为单链核苷酸，其中，所述5’端侧链（1）和环区（2）具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，所述5’端侧链（1）和3’端侧链（3）的部分核苷酸序列互补，所述3’端侧链（3）具有与所述环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
优选地，所述发卡探针的3’端侧链（3）依次包括与5’端侧链（1）互补的核苷酸序列（31）以及与5’端侧链（1）不互补的核苷酸序列（32），所述核苷酸序列（32）与所述环形探针的部分核苷酸序列互补时形成双链核苷酸（4），所述双链核苷酸（4）的解链温度为5～15℃。
进一步优选地，所述发卡探针具有茎-环二级结构的初始状态，由茎部和环部构成，茎部由双链核苷酸（5）和核苷酸序列（32）组成，环部为环区（2），其中，所述双链核苷酸（5）为所述5’端侧链（1）与核苷酸序列（31）互补形成，当待测miRNA不存在时，所述发卡探针以初始状态存在；
当待测miRNA存在时，所述待测miRNA与发卡探针的5’端侧链（1）及环区（2）互补形成双链核苷酸（6），所述双链核苷酸（5）解体，随后所述环形探针结合发卡探针的3’端侧链（3），得到miRNA-发卡探针-环形探针复合物，其中，所述发卡探针的3’端侧链（3）与环形探针结合的互补区为双链核苷酸（7）。
本发明所述核苷酸链之间互补形成双链核苷酸为两条具有互补核苷酸序列的单链核苷酸通过其互补碱基之间的氢键作用形成双链。
在滚环扩增反应体系中，所述环形探针很难竞争性结合初始状态发卡探针的3’端侧链（3），只有当目标miRNA与发卡探针互补配对后，探针的发卡结构被完全打开，暴露出与环形探针互补的区域，即发卡探针由初始状态转为成为解链状态时，环形探针极易结合到发卡探针的3’端侧链（3）；形成miRNA-发卡探针-环形探针复合物后，发卡探针作为引物、环形探针作为模板，在Phi29DNA聚合酶的参与下实现滚环扩增。
进一步优选地，所述初始状态发卡探针的双链核苷酸（5）的解链温度为45～65℃；所述miRNA-发卡探针-环形探针复合中，所述双链核苷酸（7）的GC含量为40～60%，解链温度为45～65℃。
发卡探针的设计是本发明提供的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法的关键所在，设计所述发卡探针时有两个原则如下：
1、发卡探针茎干的5’端侧链（1）和环区（2）同目标miRNA的碱基完全互补；
2、发卡探针茎干的发卡结构（与5’端侧链（1）互补形成）区域（31）和3’端侧链的突出区域（32）同环形探针的部分碱基完全互补；
本发明提供的发卡探针和环形探针的具体设计原则如下：
1）、整个发卡探针的熔解温度范围为45～65℃，以确保其在扩增反应条件下能稳定存在；
2）、传统的发卡探针的5’端侧链和3’端侧链完全互补，而本发明提供的发卡探针在其3’端添加一小段序列（32），该小段序列（32）可以调节发卡探针与环形探针配对区域的GC含量在40%～60%，并确保发卡探针与环形探针配对时退火温度范围为45～65℃，以确保其在扩增反应条件下能稳定存在；此外，所添加的小段序列（32）单独与环形探针配对时退火温度范围为5～15℃，以确保其在滚环扩增反应条件下不能单独与环形探针结合；
当目标miRNA与发卡探针互补配对后，探针茎干的发卡结构被完全打开，暴露出与环形探针互补的区域，且在扩增反应条件下，因为环形探针和发卡探针配对的退火温度范围为45～65℃，所以该配对能稳定存在，从而发卡探针可以作为引物在Phi29DNA聚合酶的参与下实现滚环扩增。
优选地，所述发卡探针为脱氧核糖核苷酸链。
优选地，所述环形探针为脱氧核糖核苷酸链。
优选地，所述发卡探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
所述SEQ ID NO:1所示核苷酸序列为发明人根据本发明设计发卡探针的原则、以及已知miR-486-5p的序列进行设计。
优选地，所述环形探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
该发卡探针的设计十分简单，探针的5’端侧链（1）、环区（2）的序列由目标miRNA的序列决定，只需要额外的调节3’端突出序列以增强发卡探针与环形探针互补时的稳定性，当目标miRNA与发卡探针的互补配时改变了发卡探针的二级结构，使得发卡探针的3’端可以作为引物在Phi29等DNA聚合酶的参与下进行滚环扩增，经过一轮又一轮的引物延伸和链置换得到大量的单链的扩增产物，最终通过对产物的定量来衡量目标miRNA的水平。
第二方面，本发明提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，包括如下步骤：
提供或配置滚环扩增反应体系，及
在25～40℃下恒温反应2～16小时，及
灭活，得到扩增产物，及
在扩增产物中加入荧光染料，进行荧光光谱检测；
其中，所述滚环扩增反应体系含有DNA聚合酶、待测miRNA样品、环形探针和发卡探针，所述发卡探针依次包括5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3），所述5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3）均为单链核苷酸，其中，所述5’端侧链（1）和环区（2）具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，所述5’端侧链（1）和3’端侧链（3）的部分核苷酸序列互补，所述3’端侧链（3）具有与所述环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明提供的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法中采用的发卡探针为脱氧核糖核苷酸。
优选地，所述发卡探针的3’端侧链（3）依次包括与5’端侧链（1）互补的核苷酸序列（31）以及与5’端侧链（1）不互补的核苷酸序列（32），所述核苷酸序列（32）与所述环形探针的部分核苷酸序列互补时形成双链核苷酸（4），所述双链核苷酸（4）的退火温度范围为5～15℃。
进一步优选地，所述发卡探针具有茎-环二级结构的初始状态，由茎部和环部构成，茎部由双链核苷酸（5）和核苷酸序列（32）组成，环部为环区（2），其中，所述双链核苷酸（5）为所述5’端侧链（1）与核苷酸序列（31）互补形成，当待测miRNA不存在时，所述发卡探针以初始状态存在；
当待测miRNA存在时，所述待测miRNA与5’端侧链（1）及环区（2）互补形成双链核苷酸（6），所述双链核苷酸（5）解体，随后所述环形探针结合3’端侧链（3），得到miRNA-发卡探针-环形探针复合物，其中，所述3’端侧链（3）与环形探针结合的互补区为双链核苷酸（7）。
进一步优选地，所述初始状态发卡探针的双链核苷酸（5）的解链温度为45～65℃；所述miRNA-发卡探针-环形探针复合中，所述双链核苷酸（7）的GC含量为40～60%，解链温度为45～65℃。
优选地，所述发卡探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述环形探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述步骤（2）中，所述恒温反应的温度为35℃。
优选地，所述步骤（2）中，所述恒温反应的时间为4小时。
所述步骤（2）中，所述恒温反应的时间2～16个小时为优选条件，此外，也可根据需要过夜恒温反应。
在25～40℃的反应温度下，与发卡探针完全互补的目标miRNA能打开发卡结构进行高效的滚环扩增，而序列相似的非目标miRNA较难与发卡探针稳定结合；同样条件下，反应体系的温度低于miRNA前体的溶解温度，所以miRNA前体仍然维持二级结构，也较难与发卡探针互补结合，很能启动扩增反应。所以，本发明提供的方法能够特异性区分miRNA、与miRNA序列相似的miRNA、及miRNA前体。
优选地，所述步骤（3）中，所述灭活的条件为在65℃下灭活10分钟。
优选地，所述DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶大片段或VentR exo–DNA聚合酶。
所述Phi29DNA聚合酶为从Bacillus subtilis噬菌体phi29中克隆出的嗜温DNA聚合酶，除了具有3'→5'核酸外切酶校读功能，还具有特殊的链置换和连续合成特性；所述Bst DNA聚合酶（大片段）是Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的一部分，具有5'→3'DNA聚合酶活性，但不具有5'→3'核酸外切酶活性；所述VentR(exo–)DNA聚合酶是一种高保真的耐热DNA聚合酶，是VentR DNA聚合酶经基因工程改造而得，去除了3'→5'核酸外切酶校读活性。
优选地，所述待测miRNA样品为合成的miRNA样品、从细胞或组织中纯化的含miRNA的待测样品、或含有miRNA的待测血清裂解液。
优选地，所述含有miRNA的待测血清裂解液的制备方法为：取血清样品用磷酸盐缓冲液稀释，95～100℃孵育后，放冰上冷却；然后离心分离取上清液，得到所述含有miRNA的待测血清裂解液。
进一步优选地，所述血清样品的孵育条件为在98℃下孵育5分钟，冰上冷却的时间为3分钟。
进一步优选地，所述离心分离取上清液的条件为17000g转速下4℃离心15分钟。
现有的miNRA检测手段绝大多数都需要提前对样品中的miRNA进行抽提和纯化，这不但增大了样品检测的起始需求量也增加了检测的繁琐程度。传统从血清等体液样品中检测miRNA时，通常需要提纯RNA以排除血清中蛋白对检测的干扰。本发明将血清稀释液进行简单的热处理，从而破坏血清中蛋白与miRNA的相互作用，使蛋白变性沉淀；然后通过高速离心将变性蛋白与miRNA分离，得到血清裂解上清液；该血清裂解上清可以直接采用本发明提供的方法检测miRNA，不需要miRNA抽提和纯化而能直接检测血清裂解液中miRNA的含量，并能特异性的区分待测miRNA、与靶标序列相似的miRNA、及目标miRNA的前体。
本发明直接使用血清裂解液进行检测，每次检测仅需10ul的血清进行样品制备，远远的低于要满足RNA抽提所需的血清起始量（100微升左右）。
优选地，所述发卡探针为初始状态的发卡探针，所述初始状态的发卡探针的制备方法为：取合成后的发卡探针，用发卡探针退火缓冲液稀释，90～100℃孵育5～10分钟，然后冷却至室温使所述核苷酸单链折叠形成所述初始状态的发卡探针，其中，所述发卡探针退火缓冲液为氯化镁和三羟甲基氨基甲烷-盐酸的混合液。
进一步优选地，所述合成后的发卡探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述滚环扩增反应体系，所述发卡探针和所述环形探针的摩尔比为1:1～1:10。
进一步优选地，所述发卡探针和所述环形探针的摩尔比为1:5。
进一步优选地，所述发卡探针退火缓冲液的pH为8.0。
进一步优选地，所述核苷酸单链采用发卡探针退火缓冲液稀释至50nmol/L。
进一步优选地，所述稀释后的核苷酸单链的孵育条件为在95℃下孵育5分钟。
进一步优选地，所述冷却至室温的条件为缓慢冷却3～4小时。
缓慢冷却有利于发卡结构的形成。
进一步优选地，所述混合液中，所述氯化镁的摩尔浓度为5mmol/L，三羟甲基氨基甲烷-盐酸的摩尔浓度为10mmol/L。
在预制备退火的发卡探针后，整个滚环扩增反应是在恒温的均相体系中完成的，只需将待测样品与探针、Phi29DNA聚合酶和反应所需原料混合即可；此外，作为扩增模板的环形探针可以预先统一制备，不需要在每次检测反应时都进行环化反应，从而简化检测步骤。
优选地，所述步骤（4）中，所述荧光光谱检测采用的荧光染料为SYBR GreenII染料。
滚环扩增的产物为大量长度不同的DNA单链，这些产物可以通过SYBRGreen II荧光染料定量检测。
在设定的反应温度下，没有与miRNA互补配对的发卡探针可以仍然保持其二级结构，不会与环形探针结合启动扩增反应，最后检测时只有极低的背景荧光信号，从而实现miRNA的特异性检测。
第三方面，本发明提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，用于检测待测样品中miR-486-5p的浓度C，所述miR-486-5p的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示，其特征在于，包括如下步骤：
提供或配置含miR-486-5p的待测样品、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的发卡探针Q1、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的环形探针Q2、用于滚环扩增的DNA聚合酶P；
配置滚环扩增反应体系1、2、3及4：所述滚环扩增反应体系1含有DNA聚合酶P、样品、发卡探针Q1、及环形探针Q2；所述滚环扩增反应体系2含有样品、发卡探针Q1、及环形探针Q2；所述滚环扩增反应体系3含有DNA聚合酶P、发卡探针Q1、及环形探针Q2；所述滚环扩增反应体系4含有DNA聚合酶P、及环形探针Q2；
随后在25～40℃下恒温反应2～16小时；
灭活，得到扩增产物；
在扩增产物中加入荧光染料，进行荧光光谱检测，得到滚环扩增反应体系1、2、3及4扩增后产物的荧光强度值，所述滚环扩增反应体系1、2、3及4的荧光强度值分别为F1、F2、F3及F4；
根据获得的上述参数，计算miR-486-5p浓度C如下式
log10Y=0.2884log10C+3.545
式中，
Figure BDA0000406120770000091
所述浓度C为每升待测样品中含miR-486-5p的摩尔数。
优选地，所述滚环扩增反应体系1、2、3及4，所述发卡探针和所述环形探针的摩尔比为1:1～1:10。
进一步优选地，所述发卡探针和所述环形探针的摩尔比为1:5。
优选地，所述发卡探针为初始状态的发卡探针，所述初始状态的发卡探针的制备方法为：取合成后的发卡探针，用发卡探针退火缓冲液稀释，90～100℃孵育5～10分钟，然后冷却至室温使所述核苷酸单链折叠形成所述初始状态的发卡探针，其中，所述发卡探针退火缓冲液为氯化镁和三羟甲基氨基甲烷-盐酸的混合液。
进一步优选地，所述发卡探针退火缓冲液的pH为8.0。
进一步优选地，所述核苷酸单链采用发卡探针退火缓冲液稀释至50nmol/L。
进一步优选地，所述稀释后的核苷酸单链的孵育条件为在95℃下孵育5分钟。
进一步优选地，所述冷却至室温的条件为缓慢冷却3～4小时。
进一步优选地，所述混合液中，所述氯化镁的摩尔浓度为5mmol/L，三羟甲基氨基甲烷-盐酸的摩尔浓度为10mmol/L。
优选地，所述恒温反应的时间为4小时。
优选地，所述灭活的条件为在65℃下灭活10分钟。
优选地，所述DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶大片段或VentRexo–DNA聚合酶、或含有miR-486-5p的血清裂解液。
优选地，所述含miR-486-5p的待测样品的制备方法为：取血清样品用磷酸盐缓冲液稀释，95～100℃孵育后，放冰上冷却；然后离心分离取上清液，得到所述含有miR-486-5p的待测血清裂解液。
进一步优选地，所述血清样品的孵育条件为在98℃下孵育5分钟，冰上冷却的时间为3分钟。
进一步优选地，所述离心分离取上清液的条件为17000g转速下4℃离心15分钟。
优选地，所述含miR-486-5p的待测样品为为合成的含miR-486-5p的样品、从细胞或组织中纯化的含miR-486-5p的待测样品。
优选地，所述荧光光谱检测采用的荧光染料为SYBR Green II染料。
采用本发明提供的滚环扩增方法和上述方程式检测miR-486-5p在正常人血清中的浓度显著高于其在非小细胞肺癌患者血清中的浓度，而康复者血清中miR-486-5p的浓度在两者之间；这与早前研究发现非小细胞肺癌患者的癌症组织和血液中miR-486-5p含量显著降低相一致（具体操作参见本发明实施例部分，所述早前研究见下述两篇文章：
(1)Shen J,Todd NW,Zhang H,et al.Plasma microRNAs as potentialbiomarkers for non-small-cell lung cancer[J].Lab Invest,2010,91(4):579-587；
(2)Wang,J.;Tian,X.;Han,R.et al.Downregulation of miR-486-5pcontributes to tumor progression and metastasis by targeting protumorigenicARHGAP5in lung cancer.Oncogene2013.）
本发明实施例的检测数据充分说明本发明提供的检测方法灵敏度高、特异性强，且本发明提供的所述计算miR-486-5p浓度C的方程式可用于计算待测样品中的miR-486-5p的摩尔数。
第四方面，本发明提供了如第一方面所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针在制备检测miRNA的基因芯片或试剂盒中的应用。
本发明提供了基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒具有如下有益效果：
（1）本发明利用发卡探针二级结构的变化启动滚环扩增反应，发卡探针的设计十分简单，其5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链的核苷酸序列（31）由目标miRNA的序列决定，只需要额外的调节3’端侧链的核苷酸序列（32）以增强发卡探针与环形探针互补时的稳定性；
（2）本发明提供的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，检测步骤简单，灵敏度高，且能特异性的区分待测miRNA、与靶标序列相似的miRNA、及目标miRNA的前体；
（3）本发明提供的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法直接使用血清裂解液进行检测，不需要miRNA抽提和纯化，降低了样品的起始需求量。
附图说明
图1为本发明实施例提供的发卡探针与miR-486-5p互补结合的示意图；
图2为本发明实施例提供的发卡探针的初始状态结构示意图；
图3为本发明实施例提供的miRNA-发卡探针-环形探针复合物的结构示意图；
图4为本发明实施例提供的环形探针特异性结合解链状态发卡探针的结构示意图；
图5为本发明实施例提供的采用滚环扩增反应检测miR-486-5p的流程图；
图6为本发明实施例2实施例提供的样品的琼脂糖凝胶电泳图；
图7为本发明实施例提供的miR-486-5p、miR-4529-3p以及miR-486-5p前体序列的比对图；
图8为本发明实施例2提供的样品的荧光光谱图；
图9为本发明实施例2提供的样品的荧光强度值标准化结果；
图10为本发明实施例3提供的样品的荧光强度值标准化结果；
图11为本发明实施例4提供的样品的荧光强度值标准化结果；
图12为本发明实施例5提供的样品的荧光光谱图；
图13为本发明实施例5提供的不同浓度的miR-486-5p与相应荧光信号强度经换算后的线性关系图；
图14为本发明实施例提供的热处理制备血清裂解液的流程图；
图15为本发明实施例6提供的样品的荧光强度值标准化结果。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本发明人实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品；本发明涉及的英文说明：U/ul：单位每微升；mmol/L：毫摩尔每升；nmol/L（nM）：纳摩尔每升；umol/L：微摩尔每升；pmol/L（pM）皮摩尔每升；fmol/L（fM）fmol/L；ug/mL：微克每毫升；dNTPs：四种脱氧核糖核苷酸。
实施例1
提供基于滚环扩增反应检测miR-486-5p的发卡探针、滚环探针、待测miR-486-5p序列相似的miR-4529-3p、以及miR-486-5p前体，包括如下步骤：
（1）体外合成待测miR-486-5p、与待测miR-486-5p序列相似的miR-4529-3p、以及miR-486-5p前体；所述miR-486-5p、miR-4529-3p和miR-486-5p前体的核苷酸序列（5’端到3’）分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；
（2）根据待测miR-486-5p的序列设计，并在体外合成发卡探针和环形探针；所述发卡探针和环形探针的核苷酸序列（5’端到3’）分别如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示，所述miR-486-5p、miR-4529-3p和miR-486-5p前体的核苷酸序列（5’端到3’）分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；
具体地，所述发卡探针、环形探针、miR-486-5p、miR-4529-3p和miR-486-5p前体的核苷酸序列如下表1所示:
Figure BDA0000406120770000131
表1.发卡探针、环形探针、miR-486-5p、miR-4529-3p和miR-486-5p前体的核苷酸序列
如表1所示的发卡探针中，其与miR-486-5p杂交的区域用黑体显示；发卡探针与环形探针杂交的区域用下划线标示，图1为本发明实施例提供的发卡探针与miR-486-5p互补结合的示意图，其中，A链为miR-486-5p，B链为发卡探针，C区核苷酸为发卡探针与滚环探针的识别区域。
图2为本发明实施例提供的发卡探针的初始状态结构示意图，如图2所示，所述发卡探针依次包括5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3），所述发卡探针的3’端侧链（3）包括与5’端侧链（1）互补的核苷酸序列（31）以及与5’端侧链（1）不互补的核苷酸序列（32）；所述初始状态中，所述发卡探针为茎-环二级结构，所述5’端侧链（1）和核苷酸序列（31）互补形成双链核苷酸（5）。
图3为本发明实施例提供的miRNA-发卡探针-环形探针复合物的结构示意图，如图3所示，A链为miR-486-5p，B链为发卡探针，D环为环形探针，待测miRNA特异性地与所述初始状态发卡探针的5’端侧链（1）及环区（2）互补形成双链核苷酸（6）时，所述初始状态发卡探针的双链核苷酸（5）解体，得到解链状态的发卡探针；所述核苷酸序列（32）与所述环形探针部分核苷酸序列互补时形成双链核苷酸（4）。
图4为本发明实施例提供的环形探针特异性结合解链状态发卡探针的结构示意图，如图4所示，所述解链状态发卡探针的3’端侧链（3）与环形探针结合的互补区为双链核苷酸（7）。
图2～图4中，所述双链核苷酸（4）的解链温度为10.7℃，所述初始状态发卡探针的双链核苷酸（5）的解链温度为57.6℃；所述miRNA-发卡探针-环形探针复合中，所述双链核苷酸（7）的GC含量为50%，解链温度为60.6℃；需要说明的是，图2～图4中各链的解链温度以及GC含量为本发明的优选方式，当所述双链核苷酸（4）的解链温度设计为5～15℃，双链核苷酸（5）的解链温度设计为45～65℃，双链核苷酸（7）的GC含量设计为40～60%，解链温度设计为45～65℃时，同样可以实现本发明的有益效果。
实施例2
图5为本发明实施例提供的采用滚环扩增反应检测miR-486-5p的流程图，结合图5，本实施例提供了一种采用滚环扩增反应检测miR-486-5p方法，包括如下步骤：
（1）样品制备
取实施例1合成的miR-486-5p作为待测样品；
（2）滚环扩增反应
（2a）提供或制备实验试剂：
10U/ul Phi29DNA聚合酶、40U/ul核糖核酸酶（RNA酶）抑制剂、10mmol/ul dNTPs、50×SYBR Green II染料、10×Phi29DNA聚合酶反应缓冲液（500mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸pH7.5、100mmol/L氯化镁、100mmol/L硫酸铵和40mmol/L二硫苏糖醇）、磷酸盐缓冲液（137mmol/L氯化钠、2.7mmol/L氯化钾、4.3mmol/L磷酸氢二钠和1.4mmol/L磷酸二氢钾）；
1×发卡探针退火缓冲液（5mmol/L氯化镁和10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸；pH8.0）；
（2b）初始状态发卡探针的形成
取实施例1体外合成的发卡探针，用1×发卡探针退火缓冲液稀释至50nmol/L，在95℃孵育5分钟，然后慢慢冷却至室温（冷却3.5小时），使其充分折叠形成发卡结构，该经退火处理的发卡探针即为初始状态的发卡探针，具有发卡结构。
（2c）进行滚环扩增反应
在冰上配置50ul的滚环扩增反应体系如表2所示：
Figure BDA0000406120770000151
表2  50ul滚环扩增反应体系
在该体系中，各物质的浓度为其在体系中的终浓度，Phi29DNA聚合酶为5U，所述初始状态的发卡探针为步骤（2b）退火后的发卡探针，环形探针为实施例1所合成，所述待测样品为步骤（1）所述miR-486-5p，所述miR-486-5p在反应体系中的浓度为1nmol/L（待测样品在体系中的终浓度应该小于发卡探针的浓度以保证探针足量，本发明取其最大值，即1:1进行实验，除特别说明外，实施例2～7所述待测样品在反应体系中的终浓度和发卡探针的浓度一样，均为1nmol/L）；
该体系中其他物质为步骤（2a）所制备或提供；
所述反应体系在35℃反应4小时，最后65℃灭活10分钟；
为充分说明本发明的有益效果，本步骤（2c）还提供了阴性对照实验，阴性对照实验与步骤（2c）的区别在于：配置滚环扩增反应体系时不加入miR-486-5p，而是加入等体积的去离子水（本发明实施例2～7所述反应体系皆以50ul为准，除特别说明外，反应体系中各物质的用量均如表2所示，且配置反应体系时因添加或减少某种物质引起的体积差由去离子水平衡）；
取步骤（2c）反应后的产物以及其阴性对照所得产物进行琼脂糖凝胶电泳，图6为本发明实施例2提供的样品的琼脂糖凝胶电泳图，由图6可知，泳道1为没有miR-486-5p存在时用SYBR Green II荧光染料染色后的结果，泳道2为有miR-486-5p存在时用SYBR Green II荧光染料染色后的结果；泳道1未能检测到滚环扩增条带，而泳道2可以清晰的分辨出滚环扩增所产生的大量长度不同的DNA片段；因为，当环形探针、发卡探针和待测miR-486-5p共存时，滚环反应才能启动，即发卡探针和环形探针结合进行滚环复制反应需要待测miR-486-5p结合发卡探针为前提，miR-486-5p结合发卡探针破环了其发卡结构，使得发卡探针暴露出于环形探针结合的互补序列；
（3）荧光光谱检测
取步骤（2c）反应后的50ul滚环扩增产物中加入5ul50×SYBR Green II染料，然后用去离子水稀释至400ul，制备成荧光光谱检测样品;
采用荧光光度计进行荧光光谱检测，激发光波长为475nm，光谱采集范围为500～700nm，在光谱峰值（512nm）处计量样品的发射波强度，如图4曲线1所示。
为充分说明本发明的对待测miRNA、与待测miRNA相似序列、及待测miRNA前提的检测灵敏度以及特异性，本步骤（3）还提供了阴性对照和阳性对照实验组，其中：阴性对照实验组设置2组，分别记为环形探针组、环形探针与发卡探针组；阳性对照实验组设置2组，分别记为探针+miR-4529-3p组和探针+miR-486-5p前体组，本步骤（3）记为探针+miR-486-5p组；
图7为本发明实施例提供的miR-486-5p、miR-4529-3p以及miR-486-5p前体序列的比对图，图中相同位点挑出了3种序列一致的核苷酸，如图中相同位点所示。
所述5组实验的滚环扩增反应体系参照步骤（2c）进行配置并进行滚环扩增反应，滚环扩增反应体系的区别如表3所示：（表中“+”表示反应体系中有该物质，“-”表示无）
Figure BDA0000406120770000171
表3阳性对照组和阴性对照组滚环扩增体系的设置
然后采用步骤（3）所述方法进行荧光光谱检测，计量各实验组样品的发射波强度，结果如图8所示。
图8为本发明实施例2提供的样品的荧光光谱图，在图8中，曲线1～5分别为环形探针组、滚环与发卡探针组、探针+miR-486-5p组、探针+miR-4529-3p组、探针+miR-486-5p前体的不同反应体系相应的荧光强度，结果显示，曲线3明显区别于其他曲线，即探针+miR-486-5p组的荧光强度最高，即本发明提供的方法只特异性的针对目标miR-486-5p进行信号放大，能够区别miR-486-5p以及miR-4529-3p、miR-486-5p前体。
（4）荧光光谱检测结果的标准化
以步骤（3）环形探针组的荧光强度值为对照组背景信号，滚环与发卡探针组的荧光强度值扣除所述对照组背景信号后为F0，探针+miR-486-5p组的荧光强度值扣除所述对照组背景信号后为F1，探针+miR-4529-3p组的荧光强度值扣除所述对照组背景信号后为F2，探针+miR-486-5p前体的荧光强度值扣除所述对照组背景信号后为F3，用标准化后的(F-F0)/F0比值衡量miRNA的浓度，其中，F分别为F1、F2和F3，标准化后的结果如图9所示（图9中的误差线表示的是3次检测的标准误差），图9为本发明实施例2提供的样品的荧光强度值标准化结果，(F1-F0)/F0明显高于(F2-F0)/F0与(F3-F0)/F0，该图显示，由miR-486-5p产生的(F1-F0)/F0比值约为相应miR-4529-3p的50倍，以及约为相应miR-486-5p的36倍，进一步说明本发明提供的检测miR-486-5p方法可将miR-486-5p与miR-4529-3p以及miR-486-5p前体进行区别，即本发明提供的方法不仅能特异性区分与目标分序列相似的miRNA也能区分miRNA前体。
实施例3
不同温度下进行滚环扩增反应对miR-486-5p、miR-4529-3p以及miR-486-5p前体检测灵敏度的影响，包括如下步骤：
（1）样品制备
取实施例1合成的miR-486-5p、miR-4529-3p以及miR-486-5p前体作为待测样品；
（2）滚环扩增反应
（2a）提供或制备实验试剂：参照实施例2步骤（2a）
（2b）初始状态发卡探针的形成
取实施例1体外合成的发卡探针，用1×发卡探针退火缓冲液稀释至50nmol/L，在100℃孵育8分钟，然后慢慢冷却至室温（冷却4小时），使其充分折叠形成发卡结构，该经退火处理的发卡探针即为初始状态的发卡探针，具有发卡结构；
（2c）进行滚环扩增反应
参照实施例2的表2配置好滚环扩增反应体系，体系中的待测样品分别为miR-486-5p、miR-4529-3p以及miR-486-5p前体，
所述反应体系分别在25℃反应12小时、30℃反应4小时以及40℃反应2小时，最后65℃灭活10分钟；
体系设置总结如表4所示
扩增反应温度 miR-486-5p miR-4529-3p miR-486-5p前体
25℃ + + +
30℃ + + +
40℃ + + +
表4各反应体系的反应温度
（3）荧光光谱检测
参照实施例2步骤（3）分别进行荧光光谱检测反应后产物的荧光强度值；
（4）荧光光谱检测结果的标准化
参照实施例2步骤（4）进行检测结果的标准化，用标准化后的(F-F0)/F0比值衡量miRNA的浓度，结果显示在25～40℃之间，本发明提供的扩增方法能区别miR-486-5p、miR-4529-3p以及miR-486-5p前体；
为充分说明本实施例的有益效果，本实施例提供了miR-486-5p、miR-4529-3p以及miR-486-5p前体的反应体系在30℃反应4小时后产物的荧光强度值的(F-F0)/F0与实施例2提供的miR-486-5p、miR-4529-3p以及miR-486-5p前体的反应体系在35℃反应4小时后产物的荧光强度值的(F-F0)/F0进行比较，结果如图10所示（图7中的误差线表示的是3次检测的标准误差）；
图10为本发明实施例3提供的样品的荧光强度值标准化结果，由图10可知，在Phi29DNA聚合酶最佳工作温度下（30℃），50ul反应体系中由1nmol/L的miR-4529-3p产生的荧光信号是1nmol/L的miR-486-5p所产生的荧光信号的16.2±1.4%；反应温度升高5℃后，即35℃，1nmol/L的miR-4529-3p产生的荧光信号与1nmol/L的miR-486-5p所产生的荧光信号的比值降低到2.1±1.1%，因此，虽然30℃为Phi29DNA聚合酶最佳工作温度，但35℃能降低miR-4529-3p与发卡探针之间非特异性结合的稳定性，因此35℃的扩增温度使得发卡探针对miR-4529-3p的区分度得到很大改善。此外，无论是在30℃还是35℃，由1nmol/L的miR-486-5p前体产生的荧光信号约为1nmol/L的miR-486-5p所产生的荧光信号的2.7%，因此在30～35℃之间，温度对前体的影响不是很明显；所以，在30～35℃之间，反应温度相对高一点更佳；
该结果也说明本发明提供的扩增方法区别miR-486-5p、miR-4529-3p以及miR-486-5p前体的效果非常显著，其滚环扩增的灵敏性和特异性明显。
实施例4
采用不同环形探针和发卡探针的摩尔比进行滚环扩增反应对miR-486-5p检测灵敏度的影响，包括如下步骤：
（1）样品制备
取实施例1合成的1nmol/L miR-486-5p作为待测样品；
（2）滚环扩增反应
（2a）提供或制备实验试剂：参照实施例2步骤（2a）
（2b）初始状态发卡探针的形成
取实施例1体外合成的发卡探针，用1×发卡探针退火缓冲液稀释至50nmol/L，在90℃孵育10分钟，然后慢慢冷却至室温（冷却3小时），使其充分折叠形成发卡结构，该经退火处理的发卡探针即为初始状态的发卡探针，具有发卡结构；
（2c）进行滚环扩增反应
再参照实施例2的表2配置好滚环扩增反应体系，其中，环形探针和发卡探针的摩尔比设置如表5所示，其中所述发卡探针的终浓度为1nmol/L，
Figure BDA0000406120770000201
表5各反应体系环形探针和发卡探针的摩尔比
所述各反应体系分别在35℃反应4小时，最后65℃灭活10分钟；
（3）荧光光谱检测
参照实施例2步骤（3）分别进行荧光光谱检测反应后产物的荧光强度值；
（4）荧光光谱检测结果的标准化
参照实施例2步骤（4）进行检测结果的标准化，用标准化后的(F-F0)/F0比值衡量miRNA的浓度，结果如图11所示（图11中的误差线表示的是3次检测的标准误差）；
图11为本发明实施例4提供的样品的荧光强度值标准化结果；由图11可知，滚环扩增反应体系中，环形探针和发卡探针的摩尔比在1:1、2.5:1、5:1、10:1之间变化时，采用本发明提供的扩增方法能特异性的检测miR-486-5p，且当环形探针和发卡探针的摩尔比在5:1时，反应体系对应的(F-F0)/F0值最高即滚环扩增的灵敏性和特异性最为明显。
实施例5
采用不同浓度的miR-486-5p进行滚环扩增反应并分析miR-486-5p的浓度与相应荧光信号强度的线性关系，包括如下步骤：
（1）样品制备
取实施例1合成的miR-486-5p作为待测样品；
（2）滚环扩增反应
参照实施例2步骤（2a）～（2b）；
参照实施例2的表2配置好滚环扩增反应体系，其中，反应体系中的待测样品分别为如表6所示浓度的miR-486-5p；
1nM 200pM 20pM 2pM 200fM 20fM 2fM 0 环形探针
表6miR-486-5p的浓度
表6中，所示环形探针组与实施例2步骤（3）的环形探针组设置一样，其反应体系中没有miR-486-5p和发卡探针，只有环形探针，作为阴性对照。
所述各反应体系分别在35℃反应4小时，最后65℃灭活10分钟；
（3）荧光光谱检测
参照实施例2步骤（3）分别进行荧光光谱检测反应后产物的荧光强度值，结果如图12所示，图12为本发明实施例5提供的样品的荧光光谱图，图12中，图中曲线1～8依次对应表6中各反应体系的荧光强度，即依次对应miR-486-5p浓度为1nM、200pM、20pM、2pM、200fM、20fM、2fM、0、以及只有环形探针的反应体系的荧光强度，由各曲线可知，随着miR-486-5p浓度的由0增加到1nmol/L，对应产物的荧光光谱的峰值也逐渐增大，且本发明提供的检测方法至少可以分辨浓度为2fM～1nM的miR-486-5p；
（4）miR-486-5p的浓度与相应荧光信号强度的线性关系
参照实施例2步骤（4）进行检测结果的标准化，用标准化后的(F-F0)/F0比值衡量miRNA的浓度，将(F-F0)/F0和miR-486-5p的浓度进行对数化后，miR-486-5p的浓度与相应荧光信号强度呈现了良好的线性关系，图13为本发明实施例5提供的不同浓度的miR-486-5p与相应荧光信号强度经换算后的线性关系图，其中，线性关系式为：log10Y=0.2884log10C+3.545（线性系数为0.9927），其中Y为(F-F0)/F0比值，C为miR-486-5p的浓度（mol/L），用此方程分析空白值加上3倍偏差值得到检测下限为10fmol/L。因此，本检测方案的线性关系覆盖6个数量级，由10fmol/L到1nmol/L，检测灵敏度高；
此外，本检测方案还具有很好的重复性，五次重复性检100fmol/LmiR-486-5p的标准偏差为5.0%。
本发明提供的线性关系式：log10Y=0.2884log10C+3.545（C的范围为：10fmol/L～1nmol/L）可以用来直接计算待测样品中miRNA的浓度C，只需检测出(F-F0)/F0值，根据方程式就能方便计算出C值。
实施例6
线性方程log10Y=0.2884log10C+3.545在基于滚环扩增反应检测血清中miR-486-5p浓度中的应用，包括如下步骤：
（1）样品制备
取正常和肺癌病人的血清样品，采用热处理制备血清裂解液的方法处理待测血清样品，其中，所述正常和肺癌病人的血清样品由北京大学第三附属医院提供，图14为本发明实施例提供的热处理制备血清裂解液的流程图，具体热处理的方法如下：
取10微升血清样品用磷酸盐缓冲液稀释至50微升，98℃孵育5分钟后，立即放置冰上冷却3分钟；随后在17000g的转速下4℃离心15分钟，取上清液，得到血清裂解液。
共处理如表7所示10组待测血清，其中包括2组肺癌病人的血清样品，2组肺癌康复者的血清样品，以及6组正常人的的血清样品：
Figure BDA0000406120770000231
表7各热处理血清样品
（2）滚环扩增反应
参照实施例2步骤（2a）～（2c）；
参照实施例2表2配置好10组待测组的滚环扩增反应体系，各体系中的待测样品分别为步骤（1）所述的2组肺癌病人的血清样品、2组肺癌康复者的血清样品、以及6组正常人的的血清样品；
同时参照表7所述待测样品，分别配置10组待测样品背景信号组，所述待测样品背景信号组与各待测组的区别在于：待测样品背景信号组无Phi29DNA聚合酶；
所述各反应体系分别在35℃反应4小时，最后65℃灭活10分钟；
（3）荧光光谱检测
参照实施例2步骤（3）分别对反应后产物的进行荧光光谱检测荧光强度值；
（4）miR-486-5p的浓度与相应荧光信号强度的线性关系
参照实施例2步骤（4）进行检测结果的标准化，计算(F-F0)/F0比值，其中，F0为实施例1步骤（4）所述滚环与发卡探针组的荧光强度值扣除所述对照组背景信号的荧光强度值，所述对照组背景信号即实施例1步骤（4）所述环形探针组的荧光强度值；F为10组待测组的荧光强度值分别扣除相应的待测样品背景信号的荧光强度值；
将所得(F-F0)/F0值分别代入线性关系式：
log10Y=0.2884log10C+3.545（C的范围为：10fmol/L～1nmol/L），其中Y为(F-F0)/F0比值，C为miR-486-5p的浓度（mol/L）
换算得出各待测血清样品中miR-486-5p的浓度C值，结果如图15所示（图15中的误差线表示的是3次检测的标准误差），图15为本发明实施例6提供的样品的荧光强度值标准化结果，其中，2组肺癌病人的血清样品的结果分别如病人1、病人2所示，2组肺癌康复者的血清样品的结果分别如康复者1、康复者2所示，6组正常人的血清样品的结果分别如正常人1、正常人2、正常人3、正常人4、正常人5、正常人6所示；
由图15可知，miR-486-5p在正常人血清中的浓度（中值为17pmol/L）显著高于其在非小细胞肺癌患者血清中的浓度（中值为0.7pmol/L）(ANOVAP<0.0001)，而康复者血清中miR-486-5p的浓度（中值为6pmol/L）在两者之间；这与早前研究发现非小细胞肺癌患者的癌症组织和血液中miR-486-5p含量显著降低相一致；
其次，本发明方案检测得到的正常人血清中miR-486-5p的浓度范围（3.0×106拷贝每微升到2.4×107拷贝每微升）与已报道的基于qRT-PCR方法检测得到的正常人血浆中miR-486-5p的浓度范围（106拷贝每微升到107拷贝每微升）相匹配，由此表明，本发明提供的检测方法能对血清样品进行特异、灵敏地检测分析；
此外，由于血清中miRNA与许多蛋白结合或者被外泌体包裹使得miRNA能抵抗降解而稳定存在，但是这些miRNA的保护机制却会阻碍miRNA与探针的相互作用；我们采用如本实施例步骤（1）所述的热处理破坏miRNA的保护机制，然后直接采用血清裂解后的上清液进行检测，方法简单方便，不需要对miRNA进行提纯，进一步提高了本发明在临床、检测等领域的应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0000406120860000011
Figure IDA0000406120860000021

Claims (16)

1.一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，其特征在于，包括发卡探针和环形探针，所述发卡探针依次包括5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3），所述5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3）均为单链核苷酸，其中，所述5’端侧链（1）和环区（2）具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，所述5’端侧链（1）和3’端侧链（3）的部分核苷酸序列互补，所述3’端侧链（3）具有与所述环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，其特征在于，所述发卡探针的3’端侧链（3）依次包括与5’端侧链（1）互补的核苷酸序列（31）以及与5’端侧链（1）不互补的核苷酸序列（32），所述核苷酸序列（32）与所述环形探针的部分核苷酸序列互补时形成双链核苷酸（4），所述双链核苷酸（4）的解链温度为5～15℃。
3.如权利要求2所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，其特征在于，所述发卡探针具有茎-环二级结构的初始状态，由茎部和环部构成，茎部由双链核苷酸（5）和核苷酸序列（32）组成，环部为环区（2），其中，所述双链核苷酸（5）为所述5’端侧链（1）与核苷酸序列（31）互补形成，当待测miRNA不存在时，所述发卡探针以初始状态存在；
当待测miRNA存在时，所述待测miRNA与发卡探针的5’端侧链（1）及环区（2）互补形成双链核苷酸（6），所述双链核苷酸（5）解体，随后所述环形探针结合发卡探针的3’端侧链（3），得到miRNA-发卡探针-环形探针复合物，其中，所述发卡探针的3’端侧链（3）与环形探针结合的互补区为双链核苷酸（7）。
4.如权利要求3所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，其特征在于，所述初始状态发卡探针的双链核苷酸（5）的解链温度为45～65℃；所述miRNA-发卡探针-环形探针复合中，所述双链核苷酸（7）的GC含量为40～60%，解链温度为45～65℃。
5.如权利要求1所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，其特征在于，所述发卡探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
6.权利要求1所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，其特征在于，所述环形探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
7.一种基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供或配置滚环扩增反应体系，及
在25～40℃下恒温反应2～16小时，及
灭活，得到扩增产物，及
在扩增产物中加入荧光染料，进行荧光光谱检测；
其中，所述滚环扩增反应体系含有DNA聚合酶、待测miRNA样品、环形探针和发卡探针，其中，所述发卡探针依次包括5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3），所述5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3）均为单链核苷酸，其中，所述5’端侧链（1）和环区（2）具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，所述5’端侧链（1）和3’端侧链（3）的部分核苷酸序列互补，所述3’端侧链（3）具有与所述环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
8.如权利要求7所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶大片段或VentR exo–DNA聚合酶。
9.如权利要求7所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，所述待测miRNA样品为合成的miRNA样品、从细胞或组织中纯化的含miRNA的待测样品、或含有miRNA的待测血清裂解液。
10.如权利要求9所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，所述含有miRNA的待测血清裂解液的制备方法为：取血清样品用磷酸盐缓冲液稀释，95～100℃孵育5～10分钟，冰上冷却2～5分钟；然后离心分离取上清液，得到所述含有miRNA的待测血清裂解液。
11.如权利要求7所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，所述发卡探针为初始状态的发卡探针，所述初始状态的发卡探针的制备方法为：取合成后的发卡探针，用发卡探针退火缓冲液稀释，90～100℃孵育5～10分钟，然后冷却至室温使所述核苷酸单链折叠形成所述初始状态的发卡探针，其中，所述发卡探针退火缓冲液为氯化镁和三羟甲基氨基甲烷-盐酸的混合液。
12.如权利要求7所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，所述滚环扩增反应体系，所述发卡探针和所述环形探针的摩尔比为1:1～1:10。
13.如权利要求7所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，所述荧光光谱检测采用的荧光染料为SYBR Green II染料。
14.一种基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，用于检测待测样品中miR-486-5p的浓度C，所述miR-486-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其特征在于，包括如下步骤：
提供或配置含miR-486-5p的待测样品、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的初始状态的发卡探针Q1、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的环形探针Q2、用于滚环扩增的DNA聚合酶P；
配置滚环扩增反应体系1、2、3及4：所述滚环扩增反应体系1含有DNA聚合酶P、样品、发卡探针Q1、及环形探针Q2；所述滚环扩增反应体系2含有样品、发卡探针Q1、及环形探针Q2；所述滚环扩增反应体系3含有DNA聚合酶P、发卡探针Q1、及环形探针Q2；所述滚环扩增反应体系4含有DNA聚合酶P、及环形探针Q2；
随后在25～40℃下恒温反应2～16小时；
灭活，得到扩增产物；
在扩增产物中加入荧光染料，进行荧光光谱检测，得到滚环扩增反应体系1、2、3及4扩增后产物的荧光强度值，所述滚环扩增反应体系1、2、3及4的荧光强度值分别为F1、F2、F3及F4；
根据获得的上述参数，计算miR-486-5p浓度C如下式
log10Y=0.2884log10C+3.545
式中，
Figure FDA0000406120760000041
所述浓度C为每升待测样品中含miR-486-5p的摩尔数。
15.如权利要求14所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，所述含miR-486-5p的待测样品的制备方法为：取血清样品用磷酸盐缓冲液稀释，95～100℃孵育后，放冰上冷却；然后离心分离取上清液，得到所述含有miR-486-5p的待测血清裂解液。
16.如权利要求1所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针在制备检测miRNA的基因芯片或试剂盒中的应用。
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Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450909A (zh) * 2014-12-09 2015-03-25 临沂大学 一种用于检测微小核糖核酸的检测方法及相应的试剂盒
CN104894260A (zh) * 2015-06-01 2015-09-09 清华大学 一种用于测定miRNA的DNA纳米机器及其建立和测定方法
CN105462972A (zh) * 2016-01-13 2016-04-06 深圳市坤健创新药物研究院 一种dna探针组合和试剂盒
CN105506136A (zh) * 2016-01-21 2016-04-20 武汉顺可达生物科技有限公司 一种基于滚环扩增和上转换材料检测microRNA的方法
CN106884047A (zh) * 2017-02-15 2017-06-23 济南大学 基于核酸适配体检测miRNA‑155的方法
CN107385014A (zh) * 2017-06-13 2017-11-24 深圳大学 一种直接定量检测循环miRNA的RT‑qPCR方法
CN107760763A (zh) * 2017-11-20 2018-03-06 东南大学 一种用于茎环引物‑滚环扩增反应的茎环引物以及茎环引物‑滚环扩增的应用
CN108315421A (zh) * 2018-04-04 2018-07-24 山东师范大学 恒温扩增与量子点荧光共振能量转移联用用于同时检测多种MicroRNAs的方法
CN108642164A (zh) * 2018-05-17 2018-10-12 浙江大学 miRNA捕获探针、分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒
CN108949910A (zh) * 2018-06-08 2018-12-07 武汉博杰生物医学科技有限公司 一种高通量miRNAs表达谱的检测方法及生物传感器
CN109251964A (zh) * 2018-04-25 2019-01-22 深圳市乾康医药科技有限公司 循环microRNAs检测试剂盒和特异性检测循环microRNAs的方法及应用
CN106967794B (zh) * 2017-03-14 2020-04-14 清华大学深圳研究生院 双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法
CN111378741A (zh) * 2020-03-23 2020-07-07 上海市第一人民医院 血液中环状rna的检测方法及其应用
CN112662738A (zh) * 2020-12-31 2021-04-16 华中科技大学 一种用于核酸原位杂交信号放大的单链dna制备方法及二级放大的单链dna制备方法
CN113201533A (zh) * 2021-05-28 2021-08-03 南方医科大学 基于催化发夹自组装恒温扩增技术检测核酸的通用探针及其应用
CN115873927A (zh) * 2022-08-04 2023-03-31 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 一种不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108845003B (zh) * 2018-06-06 2020-10-02 中国农业大学 一种通用型纳米孔检测传感器及检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103014168A (zh) * 2012-12-28 2013-04-03 北京大学 基于DNA hairpin和RCA的核酸检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103014168A (zh) * 2012-12-28 2013-04-03 北京大学 基于DNA hairpin和RCA的核酸检测方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVID ZHANG ET.AL: "Amplification of circularizable probes for the detection of target nucleic acids and proteins", 《CLINICA CHIMICA ACTA》 *
JUAN HU ET.AL: "Sensitive Detection of Nucleic Acids with Rolling Circle Amplification and Surface-Enhanced Raman Scattering Spectroscopy", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
YA-PING ZENG ET.AL: "Sensitive Detection of DNA Methyltransferase Using Hairpin Probe-Based Primer Generation Rolling Circle Amplification-Induced Chemiluminescence", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
YONGQIANG CHENG ET.AL: "Highly Sensitive Determination of microRNA Using Target‐Primed and Branched Rolling‐Circle Amplification", 《ANGEWANDTE CHEMIE》 *
YUNTAO ZHOU ET.AL: "A dumbbell probe-mediated rolling circle amplification strategy for highly sensitive microRNA detection", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
曾秀琼，吴起编著: "《化学生物学实验》", 31 January 2013 *

Cited By (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450909A (zh) * 2014-12-09 2015-03-25 临沂大学 一种用于检测微小核糖核酸的检测方法及相应的试剂盒
CN104894260A (zh) * 2015-06-01 2015-09-09 清华大学 一种用于测定miRNA的DNA纳米机器及其建立和测定方法
CN105462972A (zh) * 2016-01-13 2016-04-06 深圳市坤健创新药物研究院 一种dna探针组合和试剂盒
CN105506136B (zh) * 2016-01-21 2019-01-29 武汉顺可达生物科技有限公司 一种基于滚环扩增和上转换材料检测microRNA的方法
CN105506136A (zh) * 2016-01-21 2016-04-20 武汉顺可达生物科技有限公司 一种基于滚环扩增和上转换材料检测microRNA的方法
CN106884047A (zh) * 2017-02-15 2017-06-23 济南大学 基于核酸适配体检测miRNA‑155的方法
CN106884047B (zh) * 2017-02-15 2021-03-23 济南大学 基于核酸适配体检测miRNA-155的方法
CN106967794B (zh) * 2017-03-14 2020-04-14 清华大学深圳研究生院 双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法
CN107385014A (zh) * 2017-06-13 2017-11-24 深圳大学 一种直接定量检测循环miRNA的RT‑qPCR方法
CN107385014B (zh) * 2017-06-13 2020-12-22 深圳大学 一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法
WO2018227918A1 (zh) * 2017-06-13 2018-12-20 深圳大学 一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法
CN107760763A (zh) * 2017-11-20 2018-03-06 东南大学 一种用于茎环引物‑滚环扩增反应的茎环引物以及茎环引物‑滚环扩增的应用
CN107760763B (zh) * 2017-11-20 2021-05-11 东南大学 一种用于茎环引物-滚环扩增反应的茎环引物以及茎环引物-滚环扩增的应用
CN108315421A (zh) * 2018-04-04 2018-07-24 山东师范大学 恒温扩增与量子点荧光共振能量转移联用用于同时检测多种MicroRNAs的方法
CN108315421B (zh) * 2018-04-04 2021-06-25 山东师范大学 恒温扩增与量子点荧光共振能量转移联用用于同时检测多种MicroRNAs的方法
CN109251964A (zh) * 2018-04-25 2019-01-22 深圳市乾康医药科技有限公司 循环microRNAs检测试剂盒和特异性检测循环microRNAs的方法及应用
CN108642164A (zh) * 2018-05-17 2018-10-12 浙江大学 miRNA捕获探针、分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒
CN108642164B (zh) * 2018-05-17 2021-01-08 浙江大学 miRNA捕获探针、分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒
CN108949910A (zh) * 2018-06-08 2018-12-07 武汉博杰生物医学科技有限公司 一种高通量miRNAs表达谱的检测方法及生物传感器
CN111378741B (zh) * 2020-03-23 2024-04-02 上海市第一人民医院 血液中环状rna的检测方法及其应用
CN111378741A (zh) * 2020-03-23 2020-07-07 上海市第一人民医院 血液中环状rna的检测方法及其应用
CN112662738A (zh) * 2020-12-31 2021-04-16 华中科技大学 一种用于核酸原位杂交信号放大的单链dna制备方法及二级放大的单链dna制备方法
CN113201533A (zh) * 2021-05-28 2021-08-03 南方医科大学 基于催化发夹自组装恒温扩增技术检测核酸的通用探针及其应用
CN115873927A (zh) * 2022-08-04 2023-03-31 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 一种不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法及其应用
CN115873927B (zh) * 2022-08-04 2023-12-26 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 一种不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法及其应用

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