CN108642164B - miRNA捕获探针、分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种miRNA捕获探针、miRNA分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒。所述miRNA捕获探针包括磁珠和固定在磁珠上的环形探针；所述磁珠上固定有单链DNA探针；所述环形探针包括miRNAs的互补序列和单链DNA探针的杂交序列。所述检测方法包括以下步骤：(1)制备miRNA捕获探针；(2)使用miRNA捕获探针对miRNA进行识别和捕获；(3)捕获的miRNA作为引物触发滚环扩增；(4)荧光信号检测。本发明提供的miRNA捕获探针、miRNA分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒无需提取总RNA，是一种简单，高效，低成本的miRNAs检测方法，对肿瘤的早期筛查及生命科学的基础研究等有一定的实际意义。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤检测技术领域，具体涉及一种miRNA捕获探针、分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
miRNAs是一类短链，内源的非编码RNA，在基因表达中起着重要的调控作用，参与了细胞增殖，分化，凋亡等生理过程。包括癌症在内的许多疾病与miRNAs异常表达有关，因此，miRNAs是一种很有潜力的肿瘤早期筛查和治疗的生物标记物。高效灵敏的miRNAs分析方法在临床诊断中有十分重要的意义。
目前，用于miRNAs检测的传统方法有Northern印迹法，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，微阵列法等。Northern印迹法操作步骤繁琐，耗时较长，检测灵敏度低；反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和微阵列法检测灵敏度较好，但是需要昂贵的仪器，检测成本较高。针对这些问题，出现了许多新的检测方法，如电化学和光学传感器，实现了miRNAs的快速灵敏，低成本检测。但是，为了获得高的灵敏度，这些体系通常结合了多种信号放大技术，导致体系的稳定性和可靠性不能满足实际样本检测的要求。
实际样本的组成通常比较复杂，包含了多种蛋白，核酸，及其它类型的组分，对miRNAs的检测有很大的干扰。因此，目前发展的miRNAs检测技术通常需要首先提取总RNA。这不仅浪费时间和人力，而且miRNAs在提纯的过程中会有降解和损失。因此，发展简便可靠，能够实现miRNAs高效分离和信号放大的一体化检测技术，对于以miRNAs为生物标记物的疾病诊断有重要意义。
磁分离是一种简便高效的分子分离技术，广泛应用于商品化试剂盒和基础研究中；经过捕获分子功能化的磁珠能够识别并特异性地结合靶标分子，从而实现复杂基质中特定靶标的快速高效分离；滚环扩增是一种设计简单，应用广泛的等温扩增技术，能够在恒定温度下实现核酸快速扩增和信号放大，尤其适用于短链DNA或RNA，例如miRNAs。
公开号为CN103555838A的专利文献提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒。本发明提供的探针包括发卡探针和环形探针，发卡探针依次包括5’端侧链(1)、环区(2)以及3’端侧链(3)，5’端侧链(1)、环区(2)以及3’端侧链(3)均为单链核苷酸，其中，5’端侧链(1)和环区(2)具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，5’端侧链(1)和3’端侧链(3)的部分核苷酸序列互补，3’端侧链(3)具有与环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列；本发明提供的miRNA检测方法，能区分待测miRNA、与靶标序列相似的miRNA、及目标miRNA前体；且检测血液样品时不需要miRNA抽提和纯化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种miRNA捕获探针、分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒。本发明提供的miRNA捕获探针、检测方法及检测试剂盒可以实现miRNAs高效分离和扩增一体化检测，所述检测方法无需提取总RNA，是一种简单，高效，低成本的miRNAs检测方法，对肿瘤的早期筛查及生命科学的基础研究等有一定的实际意义。
本发明提供如下技术方案：
一种miRNA捕获探针，所述miRNA捕获探针包括磁珠和固定在磁珠上的环形探针；所述磁珠上固定有单链DNA探针；所述环形探针包括miRNAs的互补序列和单链DNA探针的杂交序列。
在miRNA捕获探针中，所述的单链DNA探针通过与环形序列中单链DNA探针的杂交序列杂交，从而将环形探针固定在磁珠上。
所述miRNAs的互补序列用于miRNA的识别和捕获。
所述单链DNA探针的一端用生物素标记，所述磁珠用链霉亲和素包被；所述单链DNA探针通过生物素和链霉亲和素之间特异性的亲和力固定在磁珠上。
所述单链DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
所述环形探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供一种使用上述miRNA捕获探针对miRNA分离扩增一体化的检测方法，包括以下步骤：
(1)配置环形探针和生物素标记的单链DNA探针的杂交溶液，加入链霉亲和素包被的磁珠，得到miRNA捕获探针；
(2)使用miRNA捕获探针对miRNA进行识别和捕获；
(3)捕获的miRNA作为引物触发滚环扩增，通过链置换扩增反应转移到滚环扩增反应液进行扩增；
(4)磁分离去除磁珠后，在扩增后的反应液中加入荧光染料，蓝光激发发出荧光信号，拍照成像，读取图像的灰度值实现定量检测。
滚环扩增反应液中的酶反应速率显著高于固相表面，因此可以获得较高的扩增效率。
通过磁分离可以尽可能去除干扰物质的影响。
本发明还提供一种使用上述miRNA捕获探针及miRNA分离扩增一体化的检测方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：
(1)miRNA捕获探针；
(2)包含有30％甲酰胺的PBS清洗液；
(3)滚环扩增反应液；
(4)包含200mM EDTA(乙二胺四乙酸)和10×Evagreen的终止液。
所述的滚环扩增反应液包括20-30μL双蒸水ddH2O、3μL聚合酶缓冲液、0.3-0.5μL脱氧核糖核苷三磷酸和0.3-0.5μLDNA聚合酶。
脱氧核糖核苷三磷酸和DNA聚合酶的含量将会影响扩增效率和特异性。
本发明提供的miRNA捕获探针、分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒，通过将环形探针固定在磁珠上，通过滚环扩增实现信号放大，通过磁分离可以尽可能去除干扰物质的影响，提高精度，能够实现miRNAs高效分离和扩增一体化检测，荧光信号的检测体系操作简单，所需仪器设备简单，无需提取总RNA，是一种便捷，低成本的miRNAs检测方法。
附图说明
图1为本发明提供的miRNA捕获探针的结构示意图；
图2为本发明提供的miRNA分离扩增一体化的检测方法的原理示意图；
图3为本发明提供的miRNA分离扩增一体化的检测方法的流程示意图；
图4为检测不同浓度miR-21的荧光强度；
图5为分别检测miR-let-7a,miR-141,miR-155,miR-21存在时的荧光强度信号；
图6为单碱基，三个碱基，五个碱基错配链，miR-21存在时的荧光强度信号；
图7为直接检测MCF-7和L02细胞裂解液中的miR-21；
图8为检测不同细胞数目的MCF-7细胞裂解液中的miR-21。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施例进行详细说明。
如图1所示，本发明提供的miRNA捕获探针包括磁珠1和固定在磁珠1上的环形探针2；所述磁珠上固定有单链DNA探针11；所述环形探针包括miRNAs的互补序列21和单链DNA探针的杂交序列22。
在miRNA捕获探针中，所述的单链DNA探针11通过与环形序列中的单链DNA探针的杂交序列22杂交，从而将环形探针2固定在磁珠1上。
所述miRNAs的互补序列21用于miRNA的识别和捕获。
所述单链DNA探针11的3＇端用生物素标记，所述磁珠1用链霉亲和素包被；所述单链DNA探针11通过生物素和链霉亲和素之间特异性的亲和力固定在磁珠1上。
单链DNA探针11的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
图2为本发明提供的miRNA分离扩增一体化的检测方法的原理示意图；其中1为磁珠，2为生物素标记单链DNA，3为环形探针，4为待测miRNA，5为干扰核酸，6为Phi 29DNA聚合酶，7为滚环扩增产物，8为Evagreen染料。
如图3所示，本发明提供的miRNA分离扩增一体化的检测方法，包括以下步骤：
(1)配置环形探针和生物素标记的单链DNA探针的杂交溶液，加入链霉亲和素包被的磁珠，得到miRNA捕获探针；
(2)使用miRNA捕获探针对miRNA进行识别和捕获；
(3)捕获的miRNA作为引物触发滚环扩增，通过链置换扩增反应转移到滚环扩增反应液进行扩增；
(4)磁分离去除磁珠后，在扩增后的反应液中加入荧光染料，蓝光激发发出荧光信号，拍照成像，读取图像灰度值实现定量检测。
本实施例以miR-21为待测miRNA。
miR-21的核苷酸序列为：
5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
1、miRNA捕获探针
用1×PBS配制环形探针(50nM)和生物素标记的单链探针(100nM)的杂交溶液90μL，90℃温育30s；然后冷却至室温，放置30min；取22.5μL链霉亲和素包被的磁珠，用1×PBS清洗3次，然后加入准备的杂交溶液中，震荡混匀，25℃温育30min；用1×PBS清洗3次，加入90μL1×PBS重悬，得到miRNA捕获探针。
生物素标记的单链DNA探针：
5’-CAACCACACTGGCAAGAGGC AAAAAAAAAAAAAAA-biotin
其中，单链DNA探针中与环形探针杂交的序列用下划线标示。
环形探针
5’-p-
TCTTCTTCAACATCAGTCTGATAAGCTAATAACATTATACGCCATCCTCAGCCA
其中，miRNAs的互补序列用单下划线标示；与单链DNA探针的杂交序列用双下划线标示。
2、待测miRNA的检测
取5μL上述重悬液加入到50μL包含待测miRNA的样品溶液中，混匀，25℃温育30min；1×PBS清洗3次，然后加入30μL滚环扩增反应液，滚环扩增反应液的配方如表1所示，31℃温育2h；磁分离去除磁珠后，在滚环扩增反应液中加入1×Evagreen染料，采用可见光凝胶透射仪激发荧光，智能手机拍照记录荧光信号，以扣除背景后的灰度值进行定量分析。
表1 滚环扩增反应液的配方
注：dNTP为脱氧核糖核苷三磷酸。
3、灵敏度检测
根据上述待测miRNA的检测方法分别检测不同浓度的miR-21，浓度分别为0.1pM、2.5pM、5.0pM、7.5pM、10pM、100pM和1000pM。
分别检测不同浓度的miR-21的结果如图4所示，随着miR-21的浓度增加，荧光强度不断增强，说明本发明提供的miRNA捕获探针对miR-21的检测灵敏度高。
4、特异性检测
根据上述待测miRNA的检测方法分别检测miR-let-7a、miR-141、miR-155、miR-21存在时的荧光强度信号，其中miR-let-7a、miR-141、miR-155的核苷酸序列如表2所示。
表2 特异性检测miRNA序列
检测结果如图5所示，结果表明只有在待测miR-21存在时，有很强的荧光信号，其他干扰miRNAs存在时，与背景相比，无明显荧光信号增强，说明本发明提供的检测方法检测miRNAs的特异性良好。
再用miRNA捕获探针分别检测单碱基M1，三个碱基M3，五个碱基M5错配链的miR-21，在杂交捕获后用30％的甲酰胺溶液清洗；其中单碱基M1，三个碱基M3，五个碱基M5错配链的待测miRNA的核苷酸序列如表2所示，序列中的下划线区域为错配的碱基。
图6是用30％甲酰胺溶液清洗后检测的结果，表明即使对于单碱基错配链，也能和完全互补链明显区分，说明本发明提供的检测方法检测miRNAs的特异性良好。
5、直接检测细胞裂解液中miRNAs
为了评价本发明提供的miRNA捕获探针及检测方法检测复杂样本的性能，选取MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)为模型，直接检测细胞裂解液中的miR-21；其中MCF-7细胞中miR-21表达量是上调的，选取miR-21低表达的L02细胞(正常肝细胞)作为对照。
用细胞计数板对MCF-7和L02细胞进行计数，然后加入500μL(每一百万细胞)TRIzon试剂裂解细胞；室温放置5min，加入100μL氯仿震荡混匀，静置分层，取上层水相，按照上述目标miRNA的检测的方案，检测样本中的miR-21。
检测结果如图7所示，添加MCF-7细胞裂解液的荧光强度远远高于添加L02细胞裂解液，说明MCF-7细胞中miR-21的表达量明显高于L02细胞，表明本发明提供的检测方法能够实现miRNAs高效分离与扩增一体化检测，大大简化了miRNAs分析检测过程，降低了检测成本，在基层的肿瘤早期筛查具有重要的潜在应用价值。
图8为检测不同细胞数目的MCF-7细胞裂解液中的miR-21，细胞数目分别为500、1000、2000和10000，随着细胞数目的增长，荧光强度逐渐增强，说明了裂解液中的miR-21含量随着细胞数目的增多而升高。
本发明建立了一种miRNA捕获探针，通过将环形探针固定在磁珠上，可以实现miRNAs高效分离和扩增一体化检测；本发明提供的检测方法及检测试剂盒操作简单，所需仪器设备简单，无需提取总RNA，是一种便捷，低成本的miRNAs检测方法，对肿瘤的早期筛查及生命科学的基础研究等有一定的实际意义。
序列表
<110> 浙江大学
<120> miRNA捕获探针、分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caaccacact ggcaagaggc aaaaaaaaaa aaaaa 35
<210> 2
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtggttgtct tcttcaacat cagtctgata agctaataac attatacgcc atcctcagcc 60
agcctcttgc cagt 74
Claims (6)
1.一种miRNA捕获探针，其特征在于，所述miRNA捕获探针包括磁珠和固定在磁珠上的环形探针；所述磁珠上固定有单链DNA探针；所述环形探针包括miRNAs的互补序列和单链DNA探针的杂交序列；所述单链DNA探针的一端用生物素标记，所述磁珠用链霉亲和素包被；所述单链DNA探针通过生物素和链霉亲和素之间特异性的亲和力固定在磁珠上；
所述的miRNA捕获探针对miRNA分离扩增一体化的检测方法，包括以下步骤：
(1)配制环形探针和生物素标记的单链DNA探针的杂交溶液，加入链霉亲和素包被的磁珠，得到miRNA捕获探针；
(2)使用miRNA捕获探针对miRNA进行识别和捕获；
(3)捕获的miRNA作为引物触发滚环扩增，通过链置换扩增反应转移到滚环扩增反应液进行扩增；
(4)磁分离去除磁珠后，在扩增后的反应液中加入荧光染料，蓝光激发发出荧光信号，拍照成像，读取图像的灰度值实现定量检测。
2.根据权利要求1所述的miRNA捕获探针，其特征在于，所述单链DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的miRNA捕获探针，其特征在于，所述环形探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求1所述的miRNA捕获探针，其特征在于，所述的步骤(3)中的滚环扩增反应液包括双蒸水ddH2O、聚合酶缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和DNA聚合酶。
5.一种使用权利要求1所述的miRNA捕获探针对miRNA分离扩增一体化的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：
(1)miRNA捕获探针；
(2)包含有30％甲酰胺的PBS清洗液；
(3)滚环扩增反应液；
(4)包含200mM EDTA和10×Evagreen的终止液。
6.根据权利要求5所述的miRNA分离扩增一体化的检测试剂盒，其特征在于，所述滚环扩增反应液包括20-30μL双蒸水ddH2O、3μL聚合酶缓冲液、0.3-0.5μL脱氧核糖核苷三磷酸和0.3-0.5μLDNA聚合酶。
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