Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

KR102246288B1 - 퓨트레신 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법 - Google Patents

퓨트레신 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102246288B1
KR102246288B1 KR1020200101894A KR20200101894A KR102246288B1 KR 102246288 B1 KR102246288 B1 KR 102246288B1 KR 1020200101894 A KR1020200101894 A KR 1020200101894A KR 20200101894 A KR20200101894 A KR 20200101894A KR 102246288 B1 KR102246288 B1 KR 102246288B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
putrescine
ala
strain
gly
val
Prior art date
Application number
KR1020200101894A
Other languages
English (en)
Inventor
이재헌
이경민
배현정
Original Assignee
씨제이제일제당 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to KR1020200101894A priority Critical patent/KR102246288B1/ko
Application filed by 씨제이제일제당 주식회사 filed Critical 씨제이제일제당 주식회사
Priority to JP2023510305A priority patent/JP7544962B2/ja
Priority to MX2023001849A priority patent/MX2023001849A/es
Priority to BR112023002636A priority patent/BR112023002636A2/pt
Priority to AU2021325749A priority patent/AU2021325749A1/en
Priority to US18/021,059 priority patent/US20230392174A1/en
Priority to CN202180068172.0A priority patent/CN116648504A/zh
Priority to PCT/KR2021/003408 priority patent/WO2022035011A1/ko
Priority to EP21856020.9A priority patent/EP4198131A4/en
Priority to CA3189239A priority patent/CA3189239A1/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102246288B1 publication Critical patent/KR102246288B1/ko
Priority to ZA2023/03479A priority patent/ZA202303479B/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/002—Nitriles (-CN)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01001—Amino-acid N-acetyltransferase (2.3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01005—Arylamine N-acetyltransferase (2.3.1.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01035—Glutamate N-acetyltransferase (2.3.1.35)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01016—Acetylornithine deacetylase (3.5.1.16)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 출원은 퓨트레신 생산 미생물 및 당해 미생물을 이용한 퓨트레신 생산방법에 관한 것이다.

Description

퓨트레신 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법{MICROORGANISMS FOR PRODUCING PUTRESCINE AND PROCESS FOR PRODUCING PUTRESCINE USING THEM}
본 출원은 퓨트레신 생산 미생물 및 당해 미생물을 이용한 퓨트레신 생산방법에 관한 것이다.
나일론 등의 원료인 퓨트레신(putrescine)은 주로 석유화합물을 원료물질로 하는 화학적 방법으로 생산되며, 구체적으로 아크릴로니트릴 (acrylonitrile)에 시안화 수소를 첨가하여 숙시노니트릴(succinonitrile)을 만든 후 수소화를 과정을 거쳐서 퓨트레신이 생산된다. 이러한 화학적 공정은 효율성 및 경제성을 지녔으나 친환경적이지 않은 단점이 있는 바, 최근 강화되고 있는 환경규제와 더불어 생물 기반 경로를 통한 대체물질 생산의 필요성이 대두되고 있다.
이와 관련하여, 대장균과 코리테박테리움속 미생물을 형질전환하여 퓨트레신을 고농도로 생산하는 방법이 공개되어 있다(Morris et al., J Biol. Chem. 241: 13, 3129-3135, 1996, 국제특허공개 WO06/005603; 국제특허공개 WO09/125924; Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104: 4, 651-662, 2009; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88: 4, 859-868, 2010; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 91: 17-30, 2011). 이외에도, 미생물을 이용하여 퓨트레신을 생산하기 위한 다양한 방법이 알려져 있다(US13/992242, US14/372000, US14/373265, EP 2236613 B1, US 8497098 B2).
퓨트레신 생합성 경로와 관련된 단백질 중 이중기능성 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루타메이트 신타제(bifunctional ornithine acetyltransferase/N-acetylglutamate synthase)인 argJ는 아세틸-CoA(acetyl-CoA)와 N-아세틸오르니틴(N-acetylornithine)의 2 가지 물질에 대해서 전환 반응을 수행할 수 있는 효소로, 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제(L-글루타메이트 N-아세틸트랜스퍼라제, glutamate N-acetyltransferase)와 N-아세틸글루타메이트 신타제의 기능을 모두 가진다. argJ는 하나의 효소가 2개의 효소 반응을 매개함으로써 부산물을 저감하고 퓨트레신 생성에 대한 부담을 덜 수 있다. 그러나, argJ는 오르니틴과 같은 중간 대사 물질에 의해서 그 활성이 저해될 수 있고(Sakanyan V, Petrosyan P, Lecocq M, Boyen A, Legrain C, Demarez M, Hallet J, Glansdorff N: Genes and enzymes of the acetyl cycle of arginine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum: enzyme evolution in the early steps of the arginine pathway. Microbiology 1996, 142:99-108.), 이에 따라 퓨트레신 생합성 효율이 낮아질 수 있다.
한편, 코리네박테리움 글리타미쿰에 존재하는 N-아세틸트랜스퍼라제(N-acetyltransferase)는 아세틸-CoA와 글루타메이트의 존재 하에 N-아세틸-L-글루타메이트 생성능을 가진다. 그러나, 상기 N-아세틸트랜스퍼라제는 argJ 대비 9.43배 높은 비활성을 가지는 것으로 보고된 바 있다(A novel type of N-acetylglutamate synthase is involved in the first step of arginine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum."BMC genomics 2013(14) p713).
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 미생물에서 퓨트레신의 생산을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, 코리네박테리움 속 미생물에 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제(N-acetyltransferase) 및 대장균 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제(Acetylornithine deacetylase)의 활성을 도입하였을 때 퓨트레신 생산이 증가됨을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원은 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제(N-acetyltransferase) 및 대장균 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제(Acetylornithine deacetylase, argE)의 활성이 도입된, 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원은 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제(N-acetyltransferase) 및 대장균 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제(Acetylornithine deacetylase, argE)의 활성이 도입된, 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 퓨트레신 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원은 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제(N-acetyltransferase) 및 대장균 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제(Acetylornithine deacetylase, argE)의 활성이 도입된, 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 포함하는, 퓨트레신 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 하나의 양태는 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제(N-acetyltransferase) 및 대장균 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제(Acetylornithine deacetylase, argE)의 활성이 도입된, 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 출원에서 용어, "퓨트레신(putrescine)"은 NH2(CH2)4NH2의 분자식을 가지는 4개의 탄소로 구성된 다이아민(diamine) 유기화합물이며, 1,4-디아미노부탄(1,4-diaminobutane) 또는 부탄디아민(butanediamine)으로도 명명된다.
본 출원에서 용어, "N-아세틸트랜스퍼라제(N-acetyltransferase)"는 아세틸-CoA(acetyl-CoA)로부터 아릴아민(arylamine), 아릴히드록시라민(arylhydroxylamine) 및 아릴히드라진(arylhydrazine)으로 아세틸기의 전달을 촉매하는 효소(EC2.3.1.5)이다. 상기 효소는 CoA 없이 아릴아민 간의 아세틸 전이를 촉매할 수 있고, 아세틸-CoA와 글루타메이트 존재하에 N-아세틸-L-글루타메이트 생성능을 가질 수 있다. 상기 효소는 방향족 아민에 대해 넓은 특이성을 갖는 것으로 알려져 있다.
본 출원에 있어서, 상기 N-아세틸트랜스퍼라제는 GNAT(GCN5-related N-acetyltransferases) 패밀리에 속하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 N-아세틸트랜스퍼라제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지거나, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 서열번호 1으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 1의 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI 진뱅크(Genbank)에서 그 서열을 확인할 수 있다.
구체적으로, 상기 N-아세틸트랜스퍼라제는 서열번호 1 및/또는 상기 서열번호 1과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 N-아세틸트랜스퍼라제에 상응하는 기능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 N-아세틸트랜스퍼라제도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 당해 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, '서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드'는, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 포함하는 폴리펩티드'에 속할 수 있음은 자명하다.
본 출원에서 상기 N-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 코리네박테리움 속 균주로부터 유래하는 것일 수 있고, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)로부터 유래하는 것일 수 있으나, N-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 코리네박테리움 속 균주이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 염기 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 2의 염기 서열은 공지의 데이터 베이스인 진뱅크에서 얻을 수 있고, Ncgl2644로 명명될 수 있다. 상기 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 유전자는 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기 서열을 가지는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기 서열로 이루어지는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드와 혼용하여 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 기능을 할 수 있는 폴리뉴클레오티드 집합체인 경우 유전자로 기재될 수 있다. 본 출원에서 폴리뉴클레오티드와 유전자는 혼용될 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 N-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 N-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 당해기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60 ℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60 ℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68 ℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 당해기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참고).
본 출원에서 용어, "상동성(homology) 및 동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)], 또는 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 당해 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)으로 결정될 수 있다.
본 출원에서 용어, "아세틸오르니틴 디아세틸라제(Acetylornithine deacetylase)"는 아세틸오르니틴의 가수분해를 매개하여 아세트산과 오르니틴이 생성되는 반응을 매개하는 효소(EC3.5.1.16)이다.
본 출원에 있어서, 상기 아세틸오르니틴 디아세틸라제는 argE일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 argE는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지거나, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 3의 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI 진뱅크에서 그 서열을 확인할 수 있다.
본 출원에서 상기 argE를 코딩하는 유전자는 박테리아로부터 유래하는 것일 수 있고, 구체적으로 대장균으로부터 유래하는 것일 수 있으나, argE를 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 균주이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 4의 염기 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 4의 염기 서열은 공지의 데이터 베이스인 진뱅크에서 얻을 수 있다.
본 출원에 있어서, 상기 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 속 균주 유래 이중기능성 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루타메이트 신타제(bifunctional ornithine acetyltransferase/N-acetylglutamate synthase, argJ)의 활성이 불활성화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "이중기능성 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루타메이트 신타제(bifunctional ornithine acetyltransferase/N-acetylglutamate synthase)"는 아세틸-CoA(acetyl-CoA)와 N-아세틸오르니틴(N-acetylornithine)의 2 가지 물질에 대해서 전환 반응을 수행할 수 있는 효소로, 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제[L-글루타메이트 N-아세틸트랜스퍼라제, glutamate N-acetyltransferase(EC2.3.1.35)]와 N-아세틸글루타메이트 신타제(EC2.3.1.1)의 기능을 모두 가진다. 상기 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제는 N2-아세틸-L-오르니틴(N2-acetyl-L-ornithine) 및 L-글루타메이트(L-glutamate)를 L-오르니틴(L-ornithine) 및 N-아세틸-L-글루타메이트(N-acetyl-L-glutamate)로 전환하고, 상기 N-아세틸글루타메이트 신타제는 글루타메이트(glutamate) 및 아세틸-CoA로부터 N-아세틸글루타메이트(N-acetylglutamate)의 생성을 촉매한다.
본 출원에 있어서, 상기 이중기능성 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루타메이트 신타제는 argJ일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 argJ는 하나의 효소가 2개의 효소 반응을 매개함으로써 부산물을 저감하고 퓨트레신 생성에 대한 부담을 덜 수 있다. 그러나, argJ는 오르니틴과 같은 중간 대사 물질에 의해서 그 활성이 저해될 수 있고, 이에 따라 퓨트레신 생합성 효율이 낮아질 수 있다.
상기 argJ는 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지거나, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지거나, 혹은또는 서열번호 5 또는 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 5 또는 서열번호 7의 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI 진뱅크에서 그 서열을 확인할 수 있다.
본 출원에서 상기 argJ를 코딩하는 유전자는 코리네박테리움 속 균주로부터 유래하는 것일 수 있고, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)로부터 유래하는 것일 수 있으나, argJ를 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 코리네박테리움 속 균주이라면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자는 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 6의 염기 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 6의 염기 서열은 공지의 데이터 베이스인 진뱅크에서 얻을 수 있다.
또한, 상기 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자는 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 8의 염기 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 8의 염기 서열은 공지의 데이터 베이스인 진뱅크에서 얻을 수 있다.
본 출원에서 용어, "퓨트레신 생산능을 가지는 미생물"이란, 자연적으로 퓨트레신의 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 퓨트레신의 생산능이 없는 모균주에 퓨트레신의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 구체적으로 상기 미생물은 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제 및 대장균 유래 argE의 활성이 도입된, 퓨트레신을 생산하는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 "퓨트레신을 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함한다. 더욱 구체적으로, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 퓨트레신 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 퓨트레신 생산 활성을 강화시킨 미생물일 수 있다.
본 출원에서 용어, 활성의 "도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 유전자가 그 미생물내에서 발현됨에 따라 특정 단백질의 활성을 나타나게 되는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 증가 또는 향상된 활성을 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, 단백질의 "활성 강화"는, 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 의미한다. 이는 "변형전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 "활성 증가"는 외래의 단백질을 도입하거나, 내재적인 단백질의 활성 강화를 통해 달성할 수 있다. 상기 단백질의 활성 강화 여부는 당해 단백질의 활성 정도, 발현량 또는 당해 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
본 출원에 있어서, 상기 활성 강화의 대상이 되는 단백질, 즉, 목적 단백질은 Ncgl2644 유전자로부터 발현되는 단백질 및 argE일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질의 활성 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 단백질의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 상기 방법은 유전자 공학 또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자 공학을 이용하여 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면,
1) 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가,
2) 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법,
3) 상기 단백질 활성이 증가되도록 상기 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법,
4) 상기 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법,
5) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는
6) 상기 방법들의 조합 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질 공학을 이용하여 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면, 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가는, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 당해 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터를 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있다. 또는, 상기 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 유전자를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 목적 단백질을 발현시키기에 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 형태로 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 코리네박테리움 속 미생물의 트렌스포존 유전자 부위를 이용하여 염색체 내 유전자 도입을 가능하게 하는 형질전환용 벡터로 pDZTn(국제공개특허 WO 2009/125992, 도 1)일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것이 아니며, 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.
본 출원에서 용어, "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열 또는 발현조절영역과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 2) 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 상기 방법은 구체적으로 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터를 연결시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 변이형 lysC 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0930203호), CJ7 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호), CJ1 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호), lac 프로모터, Trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터 및 tet 프로모터가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 출원에서 사용 가능한 프로모터는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 lysC-asd 오페론 유전자의 프로모터를 개량한 lysCP1 프로모터(국제공개특허 WO 2009/096689, 서열번호 9)일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것이 아니며, 공지된 프로모터를 사용할 수 있다.
상기 3) 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질의 내재적 개시코돈을 상기 내재적 개시코돈에 비해 단백질 발현율이 더 높은 다른 개시코돈으로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 상기 유전자를 염색체내로 삽입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 도입하고자 하는 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
상기 5) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
마지막으로, 6) 상기 방법들의 조합은 상기 1) 내지 5) 중 어느 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
이와 같은 단백질의 활성 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 변형전 미생물 균주에서 발현된 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원에서 용어, "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미한다. 본 출원에 있어서, 상기 형질 변화는 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제 및 대장균 유래 argE 활성의 도입일 수 있다. 상기 "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물", "비변형 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 출원에 있어서, 상기 기준 미생물은 퓨트레신을 생산하는 미생물이라면 특별히 제한되지 않으며, 야생형에 비해 퓨트레신 생산능이 강화된 변이 균주 역시 제한 없이 포함된다. 그 예로, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC13032 균주, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주 또는 퓨트레신 생합성 경로를 강화하기 위하여 상기 균주에 하나 이상의 유전적 변형이 추가된 균주가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 하나 이상의 유전적 변형은 예를 들면, 퓨트레신 생합성 경로의 유전자를 강화시키거나; 퓨트레신 오페론(operon)의 활성을 과발현시키거나; 퓨트레신의 전구체의 공급 및 효율을 개선하거나; 퓨트레신의 배출을 향상시키거나; 경쟁경로의 유전자, 퓨트레신 오페론의 방향성 경로의 조절자, 퓨트레신 유입 유전자, 퓨트레신 유입 및 분해 유전자의 활성을 약화 또는 불활성화시키는; 것 중 선택되는 어느 하나 이상의 유전적 변형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 퓨트레신 생합성 경로의 유전자를 강화시키는 유전적 변형은 예를 들면, 야생형 대장균 W3110 균주 유래의 오르니틴 디카복실레이즈(ODC)를 코딩하는 유전자(speC)를 염색체 내에 도입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 퓨트레신 오페론의 활성을 과발현시키는 유전적 변형은 예를 들면, 글루타메이트에서 오르니틴 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 argCJBD 유전자군의 프로모터를 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 퓨트레신의 배출을 향상시키거나; 경쟁경로의 유전자, 퓨트레신 오페론의 방향성 경로의 조절자, 퓨트레신 유입 유전자, 퓨트레신 유입 및 분해 유전자의 활성을 약화 또는 불활성화시키는 유전적 변형은 예를 들면, 염색체 내 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼레이즈를 암호화하는 유전자(argF) 및 글루타메이트 배출에 관여하는 글루타메이트 엑스포터(NCgl1221)를 암호화하는 유전자를 결손시키거나; 히스톤 아세틸 트렌스퍼레이즈 HPA2 및 관련 아세틸 트렌스퍼레이즈(histone acetyltransferase HPA2 and related acetyltransferase)로 정의되는 NCgl1469 단백질의 활성을 결실시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 하나 이상의 유전적 변형이 추가된 균주는 예를 들면, ATCC13032에서 염색체 내 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼레이즈를 암호화하는 유전자(argF) 및 글루타메이트 배출에 관여하는 글루타메이트 엑스포터(NCgl1221)를 암호화하는 유전자가 결손되고, 야생형 대장균 W3110 균주 유래의 오르니틴 디카복실레이즈(ODC)를 암호화하는 유전자(speC)가 염색체 내에 도입되며, 글루타메이트에서 오르니틴 합성에 관여하는 효소를 코딩하고 있는 argCJBD 유전자군의 프로모터가 치환되어 퓨트레신 생산능을 갖는 CC01-0064 균주(대한민국 공개특허 제2012-0064046호, KCCM11138P), CC01-0064 균주에 히스톤 아세틸 트렌스퍼레이즈 HPA2 및 관련 아세틸 트렌스퍼레이즈(histone acetyltransferase HPA2 and related acetyltransferase)로 정의되는 NCgl1469 단백질의 활성이 결실된 CC01-0163 균주(대한민국 공개특허 제10-2013-0082478호, KCCM11240P)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은 코리네박테리움 속 균주 유래 argJ의 활성이 불활성화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, 단백질의 "불활성화"는 본래 미생물이 가진 효소 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여, 그 활성이 약화되는 경우, 전혀 발현이 되지 않는 경우 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미한다. 상기 불활성화는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 약화하거나 제거된 경우와, 이를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 미생물에 비하여 낮거나 제거된 경우, 상기 유전자가 일부 또는 전체 결실된 경우, 및 이들의 조합 역시 포함하는 개념으로, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에 있어서, 상기 불활성화의 대상이 되는 단백질, 즉, 목적 단백질은 argJ일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이러한 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법은 예를 들면,
1) 상기 단백질의 활성이 제거된 경우를 포함하여 단백질의 활성이 약화되도록 돌연변이된 유전자로 염색체상의 단백질을 코딩하는 유전자를 대체하는 방법,
2) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열을 변형하는 방법,
3) 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법,
4) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법,
5) 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 상기 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법,
6) 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 방법,
7) 당해 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법, 또는
8) 상기 방법들의 조합 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 2) 내지 3) 발현 조절 서열을 변형 또는 교체하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 세균내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 "폴리뉴클레오티드의 일부"란, 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 그 길이(개수)가 상이할 수 있다.
상기 5) 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하는 방법, 상기 6) 단백질을 코딩하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하는 방법 및 상기 7) RTE 방법 또한 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
마지막으로, 6) 상기 방법들의 조합은 상기 1) 내지 5) 중 어느 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
이와 같은 단백질의 불활성화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 변형전 미생물 균주에서 발현된 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 감소되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은 전술한 방법으로 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제 및 대장균 유래 argE의 활성이 도입되어, 퓨트레신을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다. 본 출원의 목적상, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은 전술한 방법으로 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제 및 대장균 유래 argE의 활성이 도입되고, 코리네박테리움 속 균주 유래 argJ의 활성이 불활성화되어, 목적하는 퓨트레신 생산능이 증가된 것을 특징으로 하며, 유전적으로 변형된 미생물 또는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원에서 상기 "퓨트레신을 생산하는 미생물"은 "퓨트레신 생산 미생물", "퓨트레신 생산능을 갖는 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 미생물은 예를 들면, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있고, 구체적으로, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물일 수 있다.
보다 구체적으로, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스Cxorynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens) 등일 수 있고, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으며, 코리네박테리움 속에 속하는 미생물은 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제(N-acetyltransferase) 및 대장균 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제(Acetylornithine deacetylase, argE)의 활성이 도입된, 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 퓨트레신 생산 방법을 제공한다.
상기 N-아세틸트랜스퍼라제, 아세틸오르니틴 디아세틸라제, 퓨트레신 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 속 균주 유래 이중기능성 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루타메이트 신타제(bifunctional ornithine acetyltransferase/N-acetylglutamate synthase, argJ)의 활성이 불활성화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법은 당업계에 공지된 최적화된 배양 조건 및 효소 활성 조건에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 퓨트레신은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 배양 단계 이후 배양된 배지 또는 미생물에서 퓨트레신을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 배양 단계에서 생산된 퓨트레신을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 퓨트레신을 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 퓨트레신을 회수 할 수 있다.
상기 퓨트레신을 회수하는 방법은, 정제 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 정제 단계는 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 퓨트레신은 정제된 형태 또는 퓨트레신을 함유한 미생물 발효액일 수 있다.
본 출원의 또 하나의 양태는 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제(N-acetyltransferase) 및 대장균 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제(Acetylornithine deacetylase, argE)의 활성이 도입된, 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 포함하는, 퓨트레신 생산용 조성물을 제공한다.
상기 N-아세틸트랜스퍼라제, 아세틸오르니틴 디아세틸라제, 퓨트레신 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 속 균주 유래 이중기능성 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루타메이트 신타제(bifunctional ornithine acetyltransferase/N-acetylglutamate synthase, argJ)의 활성이 불활성화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 퓨트레신 생산용 조성물은 상기 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제(N-acetyltransferase) 및 대장균 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제(Acetylornithine deacetylase, argE)의 활성을 도입시킬 수 있는 구성을 제한없이 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 구성은 도입된 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있도록 벡터 내에 포함된 형태일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 퓨트레신 생산을 위한, 조성물의 용도를 제공한다.
본 출원의 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제(N-acetyltransferase) 및 대장균 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제(Acetylornithine deacetylase, argE)의 활성이 도입된, 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 경우, 기존 비변형 미생물에 비해 고수율의 퓨트레신 생산이 가능하다.
도 1은 A. 코리네박테리움 속 미생물의 퓨트레신 및 오르니틴 생합성 경로 B. 대장균의 퓨트레신 및 오르니틴 생합성 경로를 나타낸 모식도이다.
도 2는 코리네 Ncgl2644 강화 및 대장균 argE 도입을 통한 퓨트레신 및 오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물의 퓨트레신 및 오르니틴 생합성 경로를 나타낸 모식도이다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예 1: 코리네 유래 argJ 유전자 강화 균주의 퓨트레신 생산능 확인
1-1. ATCC13032 기반 퓨트레신 생산 균주의 트랜스포존 유전자 내로의 ATCC13869 유래 argJ 강화 균주의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 기반의 퓨트레신 생산 균주에서 코리네박테리움 속 균주 유래 이중기능성 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루타메이트 신타제(bifunctional ornithine acetyltransferase/N-acetylglutamate synthase)를 코딩하는 argJ유전자를 강화하기 위해, argJ유전자를 상기 균주의 트랜스포존 유전자 내로 도입하였다.
코리네박테리움 속 미생물의 트렌스포존 유전자 부위를 이용하여 염색체 내 유전자 도입을 가능하게 하는 형질전환용 벡터로 pDZTn(국제공개특허 WO 2009/125992)를 사용하였으며, 프로모터로 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 lysC-asd 오페론 유전자의 프로모터를 개량한 lysCP1 프로모터(국제공개특허 WO 2009/096689, 서열번호 9)를 이용하였다.
구체적으로, 상기 pDZTn 벡터의 제작 과정은 다음과 같다. 트랜스포존 유전자를 확보하기 위하여 NIH 유전자 은행(NIH GenBank)으로부터 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 전체 염기서열 중 트랜스포존 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 NC_003450, NCgl1021)를 확보하고, 이에 근거하여 두 쌍의 프라이머(표 1, 서열번호 10 내지 13)를 합성하였다.
코리넥박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 하기 서열번호 10 내지 13의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃ 30초; 어닐링 58℃ 30초; 및 중합반응 72℃ 1분을 30회 반복하였다.
서열번호 명칭 서열
10 Tn-A-F atcctctagagtcgaccatcgctgacaccatctgcc
11 Tn-A-R gggcccactagtctcgagttcaccgcgggagccaagcc
12 Tn-B-F ctcgagactagtgggccctggattccaaggctacgcc
13 Tn-B-R atgcctgcaggtcgaccctgaatggataaggcaccg
그 결과, PCR 결과물로 약 500bp의 프로모터 부위를 포함한 트랜스포존 유전자 두 쌍 (Tn-A, Tn-B)을 수득하였다. Tn-A(서열번호 14)은 서열번호 10과 11을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, Tn-B(서열번호 15)는 서열번호 12와 13을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 BD 인퓨전 키트(In-Fusion kit, BD)를 이용하여 미리 SalI 제한효소로 처리한 pDZ 벡터에 클로닝하여 pDZTn 벡터를 얻었다. 두 개의 증폭된 산물 사이에는 프라이머 제작시 인위적으로 삽입한 다수의 제한효소 인식 부위를 포함하고 있다.
lysCP1 프로모터의 제작 과정은 다음과 같다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881을 lysCP1 프로모터를 포함하는 벡터로 형질전환시킨 CA01-0135 균주(국제공개특허 WO 2009-096689, KCCM10919P)의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 하기 서열번호 16 및 17의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초 과정을 30회 반복하였다.
여기에서 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 2와 같다.
서열번호 명칭 서열
16 lysCP1 promotor_F GAATGAGTTCCTCGAGCCGATGCTAGGGCGAAAA
17 lysCP1 promotor_R CTTTGTGCACCTTTCGATCTACGTGCTGACAGTTAC
그 결과, PCR 결과물로 lysCP1 프로모터 부위(서열번호 9)를 수득하였다.
argJ 유전자를 수득하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래 argJ 유전자의 염기서열(서열번호 6)에 근거하여 argJ ORF(open-reading frame) 상동재조합 단편을 얻기 위한 서열번호 18 및 19의 프라이머 쌍을 제작하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 하기 서열번호 18 및 19의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다.
여기에서 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 3과 같다.
서열번호 명칭 서열
18 argJ _F GTTCCACATGGCCAAAAAAGGCATTAC
19 argJ _R TTCTTTTTAAGAGCTGTACGCGGAGTTGATCTCC
그 결과, PCR 결과물로 약 1.2kb의 argJ 유전자 단편이 증폭되었으며, 이를 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다.
앞서 제작한 pDZTn 벡터에 제한효소인 XhoI을 처리하고 상기에서 수득한 각 PCR 산물(lysCP1프로모터 부위 및 argJ 유전자 단편)을 인퓨전 HD 클로닝 키트(In-Fusion® HD Cloning Kit, Clontech)를 이용하여 퓨전 클로닝한 후, 이의 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn-lysCP1-argJ라 명명하였다.
다음으로, 제작한 상기 플라스미드 pDZTn-lysCP1-argJ를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC13032에서 염색체 내 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼레이즈를 암호화하는 유전자(argF) 및 글루타메이트 배출에 관여하는 글루타메이트 엑스포터(NCgl1221)를 암호화하는 유전자가 결손되고, 야생형 대장균 W3110 균주 유래의 오르니틴 디카복실레이즈(ODC)를 암호화하는 유전자(speC)가 염색체 내에 도입되며, 글루타메이트에서 오르니틴 합성에 관여하는 효소를 코딩하고 있는 argCJBD 유전자군의 프로모터가 치환되어 퓨트레신 생산능을 갖는 CC01-0064 균주(대한민국 공개특허 제2012-0064046호, KCCM11138P)에서 히스톤 아세틸 트렌스퍼레이즈 HPA2 및 관련 아세틸 트렌스퍼레이즈(histone acetyltransferase HPA2 and related acetyltransferase)로 정의되는 NCgl1469 단백질의 활성이 결실된 CC01-0163 균주(대한민국 공개특허 제10-2013-0082478호, KCCM11240P)에 전기천공법(electroporation)으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 카나마이신 25 ㎍/㎖과 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolin-D-galactoside)이 함유된 BHIS 평판 배지(Braine heart infusion 37 g/l, 소르비톨 91 g/l, 한천 2%)에 도말하고 배양하여 콜로니를 형성시켰다. 형성된 콜로니 중에서 백색의 콜로니를 선택함으로써 상기 플라스미드 pDZTn-lysCP1-argJ가 도입된 형질전환 균주를 선별하였다.
상기 선별된 균주를 CM 배지(글루코오스(glucose) 10 g/l, 폴리펩톤(polypeptone) 10 g/l, 효모 추출물(yeast extract) 5 g/l, 소고기 추출물(beef extract) 5 g/l, NaCl 2.5 g/l, 요소(urea) 2 g/l, pH 6.8)에서 30℃에서 8시간 동안 진탕 배양하고, 각각 10-4부터 10-10까지 순차적으로 희석한 후 X-gal 함유 고체배지에 도말하고 배양하여 콜로니를 형성시켰다. 형성된 콜로니 중에서 상대적으로 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선택함으로써 2차 교차(crossover)에 의해 argJ를 코딩하는 유전자가 도입된 균주를 최종 선별하였다.
최종 선별된 균주를 대상으로 서열번호 18 및 19의 프라이머 쌍을 이용해 PCR을 수행하여 argJ를 코딩하는 유전자가 도입되었음을 확인하고, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 CC01-0163 Tn:lysCP1-argJ 로 명명하였다.
1-2. 코리네 유래 argJ 유전자가 강화된 코리네 기반 균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에 코리네박테리움 유래 argJ 유전자를 강화시켰을 때 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-1에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-1에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주(CC01-0163 Tn:lysCP1-argJ)를 각각 1 mM 아르기닌 함유 CM 평판 배지(글루코오스 1%, 폴리펩톤 1%, 효모 추출물 0.5%, 소고기 추출물 0.5%, NaCl 0.25%, 요소 0.2%, 50% NaOH 100 ㎕, 한천 2%, pH 6.8, 1 L 기준)에 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였다.
이로부터 배양된 각 균주를 25 ml의 역가 배지(글루코오스 8%, 대두단백질 0.25%, 옥수수고형 0.50%, (NH4)2SO4 4%, KH2PO4 0.1%, MgSO4·7H2O 0.05%, 요소 0.15%, 바이오틴 100 μg, 티아민 염산염 3 mg, 칼슘-판토텐산 3 mg, 니코틴아미드 3 mg, CaCO3 5%, 1 L 기준)에 한 백금이 정도로 접종한 후 30℃에서 200 rpm으로 98시간 동안 진탕 배양하였다. 모든 균주의 배양 시 배지에 1 mM 아르기닌을 첨가하였다. 각 배양물로부터 생산된 퓨트레신 농도를 측정하고 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
균주명 퓨트레신 (g/L)
CC01-0163 11.7
CC01-0163 Tn:lysCP1-argJ 12.4
그 결과, 상기 표 4에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 유래 argJ가 강화된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주에서 퓨트레신 생산이 6% 증가하였음을 확인하였다.
실시예 2: 대장균 유래 argA 및 argE의 퓨트레신 생산 균주 내 도입 및 이의 퓨트레신 생산능 확인
2-1. ATCC13032 기반 퓨트레신 생산 균주의 트랜스포존 유전자 내로의 대장균 유래 argA 및 argE 동시 도입한 균주의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 기반의 퓨트레신 생산 균주(CC01-0163)에 대장균 유래 N-아세틸글루타메이트 신타아제(N-acetylglutamate synthase)를 코딩하는 argA와 아세틸오르니틴 디아세틸라제(Acetylornithine deacetylase)를 코딩하는 argE 유전자를 삽입하였을 때 퓨트레신 생산능이 향상하는지를 확인하기 위해, argA와 argE를 상기 균주의 트랜스포존 유전자 내로 도입하였다.
이를 위해, 상기 대장균 유래 argA유전자의 염기서열(서열번호 20)로부터 argA ORF 부위의 상동재조합 단편을 얻기 위한 서열번호 21 및 22의 프라이머 쌍을 제작하고, argE 유전자의 염기서열(서열번호 4)로부터 argE ORF 부위의 상동재조합 단편을 얻기 위한 서열번호 23 및 24의 프라이머 쌍을 제작하였다.
상기 프라이머의 서열은 하기 표 5와 같다.
서열번호 명칭 서열
21 argA ORF_F GAAAGGTGCACAAAGATGGTAAAGGAACGTAAAACCG
22 argA ORF_R GCCCACTAGTCTCGAGCATGCGGCGTTGATTTTG
23 argE ORF_F GAAAGGTGCACAAAGATGAAAAACAAATTACCGCC
24 argE ORF_R GCCCACTAGTCTCGAGGTTTGAGTCACTGTCGGTCG
lysCP1 프로모터 부위는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 KCCM10919P 균주 염색체를 주형으로 하고 서열번호 16 및 17의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통해 수득하였다.
argA 유전자를 수득하기 위하여, 대장균 W3110 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 21 및 22의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다.
그 결과, PCR 결과물로 약 1.6kb의 argA 유전자 단편이 증폭되었으며, 이를 실시예 1-1에서 제작한 pDZTn 벡터에 실시예 1-1과 동일한 방법으로 lysCP1 프로모터 부위와 퓨전 클로닝하였다. 그 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn-lysCP1-argA라 명명하였다.
실시예 1-1에서 제작한 pDZTn 벡터에 제한효소인 XhoI을 처리하고 상기에서 수득한 각 PCR 산물(lysCP1프로모터 부위 및 argA 유전자 단편)을 실시예 1-1과 동일한 방법으로 퓨전 클로닝한 후, 이의 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn-lysCP1-argA라 명명하였다.
argE 유전자를 수득하기 위하여, 상기와 동일한 방법으로 대장균 W3110 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 23 및 24의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다.
그 결과, PCR 결과물로 약 1.4kb의 argE 유전자 단편이 증폭되었으며, 이를 실시예 1-1에서 제작한 pDZTn 벡터에 실시예 1-1과 동일한 방법으로 기 수득한 lysCP1 프로모터 부위와 퓨전 클로닝하였다. 그 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn-lysCP1-argE라 명명하였다.
다음으로, 상기 플라스미드 pDZTn-lysCP1-argA를 CC01-0163에 전기천공법으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 상기 플라스미드 pDZTn-lysCP1-argA가 도입된 형질전환 균주를 선별하였다.
상기 선별된 균주를 2차 교차에 의해 argA를 코딩하는 유전자가 도입된 균주를 최종 선별하였다. 최종 선별된 균주를 대상으로 서열번호 21 및 22의 프라이머 쌍을 이용해 PCR을 수행하여 argA를 코딩하는 유전자가 도입되었음을 확인하고, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 CC01-0163 Tn:lysCP1-argA로 명명하였다.
상기 제작된 argA가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주에 argE를 도입하기 위해, 앞서 제작한 pDZTn-lysCP1-argE를 상기와 동일한 방법으로 CC01-0163 Tn:lysCP1-argA에 형질전환하였으며, 최종 선별된 균주를 대상으로 서열번호 23 및 24의 프라이머 쌍을 이용해 PCR을 수행하여 트랜스포존 내 argE가 도입되었음을 확인하였다.
이로부터 선별된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 CC01-0163 Tn:lysCP1-argA Tn:lysCP1-argE라 명명하였다.
2-2. 대장균 유래 argA 및 argE 유전자가 도입된 퓨트레신 생산 코리네박테리움 속 균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에 대장균 유래 argA와 argE 도입이 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-1에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-1에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주(CC01-0163 Tn:lysCP1-argA Tn:lysCP1-argE)와 모균주(CC01-0163)를 각각 실시예 1-2와 동일한 방법으로 배양하고 각 배양물로부터 생산된 퓨트레신 농도를 측정하고 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
균주명 퓨트레신 (g/L)
CC01-0163 12.2
CC01-0163 Tn:lysCP1-argA Tn:lysCP1-argE 13.4
그 결과, 상기 표 6에 나타난 바와 같이, 대장균 유래 argA와 argE 유전자가 동시에 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주에서 퓨트레신 생산량이 9.8% 증가하였음을 확인하였다.
실시예 3: 코리네 유래 Ncgl2644 유전자 강화 균주의 퓨트레신 생산능 확인
3-1. ATCC13032 기반 퓨트레신 생산 균주의 트랜스포존 유전자 내로의 ATCC13869 유래 Ncgl2644 도입 균주의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 기반의 퓨트레신 생산 균주(CC01-0163)에서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래 GNAT(GCN5-related N-acetyltransferases) 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라제(GNAT family N-acetyltransferase)를 코딩하는 Ncgl2644 유전자를 강화하였을 때 퓨트레신 생산능이 향상하는지를 확인하기 위해, Ncgl2644를 상기 균주의 트랜스포존 유전자 내로 도입 및 강화하였다.
이를 위해, 상기 코리네박테리움 유래 유전자 Ncgl2644의 염기서열(서열번호 2)로부터 Ncgl2644 ORF 부위의 상동재조합 단편을 얻기 위한 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍을 제작하였다.
상기 프라이머의 서열은 하기 표 7과 같다.
서열번호 명칭 서열
25 Ncgl2644 ORF_F GAGGAGATCAAAACACATATGACGCCTAGTCTTCCCCG
26 Ncgl2644 ORF_R TTAGAATTTCCGTTCGGCGTACC
Ncgl2644 유전자를 수득하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분의 신장 과정을 30회 반복하였다.
그 결과, PCR 결과물로 약 1kb의 Ncgl2644유전자 단편이 증폭되었으며, 이를 실시예 1-1에서 제작한 pDZTn 벡터에 실시예 1-1과 동일한 방법으로 실시예 2-1에서 수득한 lysCP1 프로모터 부위와 퓨전 클로닝하였다. 그 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn-lysCP1-Ncgl2644라 명명하였다.
다음으로, 상기 플라스미드 pDZTn-lysCP1-Ncgl2644를 CC01-0163에 전기천공법으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 상기 플라스미드 pDZTn-lysCP1-Ncgl2644가 도입된 형질전환 균주를 선별하였다.
상기 선별된 균주를 2차 교차에 의해 Ncgl2644를 코딩하는 유전자가 도입된 균주를 최종 선별하였다. 최종 선별된 균주를 대상으로 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍을 이용해 PCR을 수행하여 Ncgl2644를 코딩하는 유전자가 도입되었음을 확인하고, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 CC01-0163 Tn:lysCP1-Ncgl2644로 명명하였다.
3-2. 코리네 유래 Ncgl2644 유전자가 강화된 퓨트레신 생산 코리네박테리움 속 균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 코리네박테리움 유래 Ncgl2644 유전자를 강화시켰을 때 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 3-1에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3-1에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주(CC01-0163 Tn:lysCP1- Ncgl2644)와 모균주(CC01-0163)를 각각 실시예 1-2와 동일한 방법으로 배양하고 각 배양물로부터 생산된 퓨트레신 농도를 측정하고 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
균주명 퓨트레신 (g/L)
CC01-0163 12.0
CC01-0163 Tn:lysCP1-Ncgl2644 10.1
그 결과, 상기 표 8에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 유래 Ncgl2644가 강화된 경우에는 퓨트레신 생산능이 감소하는 것을 확인하였다. 이는 퓨트레신 생산 경로의 중간 대사 물질인 아세틸 글루타메이트의 농도가 증가되면서 생합성 경로의 병목현상이 일어남에 따라 나타나는 현상일 수 있다. 이에, 하기의 추가적인 실시예를 통하여 퓨트레신 생산에 대한 Ncgl2644의 영향성을 평가하였다.
실시예 4: argJ 유전자 결손, Ncgl2644 강화 균주의 퓨트레신 생산능 확인
4-1. ATCC13032 기반 퓨트레신 생산 균주의 argJ 결손 균주 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 기반의 퓨트레신 생산 균주(CC01-0163)에서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래 argJ 유전자를 결손한 균주를 제작하였다.
이를 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래 argJ 유전자의 염기서열(서열번호 8)로부터 argJ의 N-말단 부위의 상동재조합 단편을 얻기 위한 서열번호 27 및 28의 프라이머 쌍과, argJ의 C-말단 부위의 상동재조합 단편을 얻기 위한 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍을 제작하였다.
상기 프라이머의 서열은 하기 표 9와 같다.
서열번호 명칭 서열
27 argJ_N_F CGGGATCCCACGCCTGTCTGGTCGC
28 argJ_N_R ACGCGTCGACGGATCTAAAGCGGCGCTTC
29 argJ_C_F ACGCGTCGACTCCGGCGCTGACATTGATGTCC
30 argJ_C_R CTAGTCTAGAGAGCTGCACCAGGTAGACG
argJ의 N-말단 부위와 C-말단 부위의 상동재조합 단편을 각각 수득하기 위해, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 27 및 28, 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 각각 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다.
그 결과, PCR 결과물로 N-말단 부위와 C-말단 부위의 PCR 단편이 각각 증폭되었으며, 이를 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다.
수득된 N-말단 부위의 단편을 제한효소인 BamHI 및 SalI으로, C-말단 부위의 단편을 제한효소인 SalI 및 XbaI으로 처리하였으며, 처리된 단편을 제한효소인 BamHI과 XbaI으로 처리된 pDZ 벡터에 클로닝하여 플라스미드 pDZ-1'argJ(K/O)를 제작하였다.
제작한 플라스미드 pDZ-1'argJ(K/O)를 전기천공법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 CC01-0163에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 pDZ-1'NCglargJ(K/O)가 도입된 균주를 선발하였다.
상기 선발된 균주로부터 argJ를 코딩하는 유전자가 결실되어 퓨트레신 생산성이 약화된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 최종 선별하였으며, 상기와 같이 제작된 퓨트레신 배출능이 약화된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 CC01-0163 △argJ로 명명하였다.
제작된 CC01-0163 △argJ 균주에 실시예 3-1과 동일한 방법으로 Ncgl2644 유전자를 형질전환시켜 CC01-0163 △argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644 균주를 제작하였다.
4-2. 코리네 유래 argJ 결손, Ncgl2644 유전자가 강화된 퓨트레신 생산 코리네박테리움 속 균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 코리네박테리움 유래 argJ 유전자를 결손 및 Ncgl2644를 강화시켰을 때 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 4-1에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주(CC01-0163 △argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644)와 모균주(CC01-0163 △argJ)를 각각 각각 실시예 1-2와 동일한 방법으로 배양하고 각 배양물로부터 생산된 퓨트레신 농도를 측정하고 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
균주명 퓨트레신 (g/L)
CC01-0163 △argJ 0.1
CC01-0163 △argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644 0.3
그 결과, 상기 표 10에 나타난 바와 같이, argJ가 결손된 균주는 퓨트레신 생산능을 가지기 어려운 것으로 확인되었으며, 아세틸글루타메이트(acetyl glutamate)를 생성할 수 있는 Ncgl2644가 도입되더라도 이후 생성되는 중간 대사 물질인 아세틸 오르니틴(acetyl ornithine)을 탈아세틸화시킬 수 있는 효소의 부재로 인해 퓨트레신 생산이 낮은 것으로 사료되었다. 이에, 하기의 추가적인 실시예를 통하여 Ncgl2644 및 argE가 동시 강화된 균주에서 퓨트레신 생산능을 평가하였다.
실시예 5: 코리네 유래 Ncgl2644 유전자 강화와 대장균 유래 argE 유전자 도입 균주의 퓨트레신 생산능 확인
5-1. ATCC13032 기반 퓨트레신 생산 균주들에 대한 Ncgl2644 유전자 강화 균주 제작
상기 실시예 3-1에서 제작된 CC01-0163 Tn:lysCP1-Ncgl2644 균주와 실시예 4-1에서 제작된 CC01-0163 △argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644 균주에 아세틸 오르니틴(acetyl ornithine)을 탈아세틸화시킬 수 있는 대장균 W3110 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제(Acetylornithine deacetylase)를 코딩하는 argE 유전자를 도입하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-1에서 제작된 pDZTn-lysCP1-argE 플라스미드를 실시예 2-1과 동일한 방법으로 CC01-0163 Tn:lysCP1-Ncgl2644 균주와 CC01-0163 △argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644 균주에 형질전환하여 형질전환체를 수득하고, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 상기 플라스미드 pDZTn-lysCP1-argE가 도입된 형질전환 균주를 선별하였다.
상기 선발된 균주로부터 argE가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 최종 선별하였으며, 상기와 같이 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 CC01-0163 Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE와 CC01-0163 △argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE를 제작하였으며, CC01-0163 △argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE의 경우 Corynebacterium glutamicum CC01-1425로 명명하였다. 또한, 상기 Corynebacterium glutamicum CC01-1425(CC01-0163 △argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE)는 2020년 7월 24일자로 기탁(KCCM12774P)하였다.
5-2. Ncgl2644 유전자 및 argE가 강화된 퓨트레신 생산 코리네박테리움 속 균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 코리네박테리움 유래 Ncgl2644를 강화 및 argE를 도입했을 때 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 5-1에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주(CC01-0163 Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE, CC01-0163 △argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE)와 모균주(CC01-0163)를 각각 각각 실시예 1-2와 동일한 방법으로 배양하고 각 배양물로부터 생산된 퓨트레신 농도를 측정하고 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
균주명 퓨트레신 (g/L)
CC01-0163 12.0
CC01-0163 Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE 15.7
CC01-0163 △argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE 16.4
상기 표 11에 나타난 바와 같이, Ncgl2644와 argE가 동시에 도입되면서 CC01-0163 균주보다 현저히 향상된 퓨트레신 생산량을 확인할 수 있었다. 특히, argJ의 활성이 제거된 CC01-0163 △argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE 균주의 경우 CC01-0163 균주보다 36.6% 향상된 퓨트레신 생산능을 보이며, argJ의 활성이 남아있는 CC01-0163 Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE 균주의 경우 argJ의 활성이 제거된 균주 대비 낮은 퓨트레신 생산능을 보이지만 CC01-0163 균주 대비 30.8%만 향상된 퓨트레신 생산능을 가지는 것으로 확인되었다.
또한, argJ의 활성이 남아있는 CC01-0163 Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE 균주는 Ncgl2644와 유사한 기능을 나타내는 대장균 유래 argA와 argE 유전자가 동시에 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주보다 현저히 높은 퓨트레신 생산량을 나타내었다(표 6).
본 실시예의 결과를 통하여, argJ를 결손시키고 Ncgl2644와 argE를 동시 발현할 경우, argJ을 결손시키지 않거나, argJ를 결손시키고 Ncgl2644와 유사한 기능을 나타내는 대장균 유래 argA 및 argE를 도입했을 때보다 현저한 퓨트레신 생산능을 가지는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12774P 20200724
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> MICROORGANISMS FOR PRODUCING PUTRESCINE AND PROCESS FOR PRODUCING PUTRESCINE USING THEM <130> KPA200318-KR <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 335 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> C. glutamicum GNAT family N-acetyltransferase <400> 1 Met Thr Pro Ser Leu Pro Arg Phe Arg Ser Gln Lys Pro Ala Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Val Ala Arg Arg Arg Ile Pro Gly Ala Asn Val His Trp 20 25 30 Thr Asp Ala Ile Gly His Val Ile Gly Val Asp Pro Leu Val Val Arg 35 40 45 Pro Gln Ser Val Gly Gly Met Pro Ser Asp Ala Glu Glu Ile Val Ile 50 55 60 Pro Asp Asp Gln Leu Glu Val Ile Lys Ile Leu Ser Pro Arg Thr Ile 65 70 75 80 Arg Asn Ser Asp Ile Arg Ala Val Glu Val Ala Thr Ala Lys Ala Phe 85 90 95 Pro Gly Leu Val Asn Glu Trp His Asp Gly Trp Leu Leu Arg Ala Gly 100 105 110 Asp Gly Ile Ala Glu Arg Ser Asn Ser Ala Ser Pro Leu Gly Pro Ser 115 120 125 Val Gly Phe Glu Pro Val Pro Met Glu Asp Ile Ser Arg Phe Tyr Ala 130 135 140 Arg His Asp Leu Pro Val Lys Leu His Ile Pro Glu Arg Ile Gly Arg 145 150 155 160 Pro Ala Gln Lys Val Ile Asp Ala Asp Pro Gln Lys Trp Val Met Gly 165 170 175 Pro Glu Ile Leu Val Met Thr Lys Ser Leu Asp His Val Glu Ser His 180 185 190 Glu Leu Pro Gly Gly Leu Glu Phe Ser Val Asp Lys Gln Pro Asp Gln 195 200 205 Glu Trp Leu Gly Met Tyr His Phe Arg Gly Gln Ala Leu Pro Ala His 210 215 220 Ala Leu Glu Leu Leu Arg Thr Gln Ile Glu Gly Arg Met Gly Phe Gly 225 230 235 240 Arg Leu Thr Thr Pro Ala Gly Gln Thr Val Ala Ile Thr Arg Ala Thr 245 250 255 Ile Thr Ala Ala Glu Glu Arg Ile Phe Leu Gly Tyr Ser Ala Val Glu 260 265 270 Val Asp Pro Ala Phe Arg Arg Gln Gly Leu Gly Thr Ala Leu Gly Ser 275 280 285 Arg Ile Gln Glu Trp Gly Ala Glu Gln His Ala Gln Glu Ala Tyr Leu 290 295 300 Gln Val Val Ala His Asn Glu Ala Gly Ile Gly Leu Tyr Gln Lys Leu 305 310 315 320 Gly Phe Ser Glu His His Arg His Arg Tyr Ala Glu Arg Lys Phe 325 330 335 <210> 2 <211> 1008 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> C. glutamicum GNAT family N-acetyltransferase(Ncgl2644) <400> 2 atgacgccta gtcttccccg tttccgcagc cagaaacctg ccgtcggcga tcgtgttgtt 60 gcacgtcgcc ggattcctgg tgccaatgtg cattggacag atgccattgg ccatgtgatt 120 ggggtggatc cgttggtggt tcgcccgcag tcggttggtg ggatgccgtc ggatgcggaa 180 gaaattgtca ttcctgatga tcagcttgag gtgattaaga ttttgtcgcc gcgcaccatt 240 aggaattcgg atattcgtgc ggtggaggtt gccacggcga aggcctttcc ggggctggtc 300 aatgagtggc atgatggttg gctgctgcgt gccggtgatg gcattgcgga gcgttctaat 360 tctgcgtcgc cactcggccc aagtgttggt tttgagccgg taccgatgga ggatatttcg 420 cggttttacg caaggcacga tctccccgtg aagctgcaca ttccggagcg gattggtcgg 480 cctgcgcaga aagtcattga cgccgatccc cagaaatggg tgatgggccc ggagattttg 540 gtgatgacga aatctttgga ccatgtggag tcgcacgagt tgcccggtgg cctagaattt 600 agcgtcgata agcagcctga ccaggagtgg ctgggcatgt accatttccg cggacaggcg 660 ttgcccgctc acgcccttga gcttttgcgc acgcaaatcg agggccgcat ggggttcggg 720 cgcctgacca cgccggcggg gcaaaccgtc gcgatcacgc gcgccaccat cacggctgcg 780 gaggagcgca tatttttggg ctattcagcg gtcgaggtgg atcctgcttt tcgacgtcag 840 gggctgggca ccgcgctcgg ctcgcgcatc caggagtggg gcgccgagca acacgcacaa 900 gaggcatatc tccaggttgt cgcccataat gaagcaggta tcggcctgta tcaaaagctc 960 gggttcagtg aacaccaccg acaccggtac gccgaacgga aattctaa 1008 <210> 3 <211> 408 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> E.coli argE <400> 3 Met Asp Lys Leu Leu Glu Arg Phe Leu Asn Tyr Val Ser Leu Asp Thr 1 5 10 15 Gln Ser Lys Ala Gly Val Arg Gln Val Pro Ser Thr Glu Gly Gln Trp 20 25 30 Lys Leu Leu His Leu Leu Lys Glu Gln Leu Glu Glu Met Gly Leu Ile 35 40 45 Asn Val Thr Leu Ser Glu Lys Gly Thr Leu Met Ala Thr Leu Pro Ala 50 55 60 Asn Val Pro Gly Asp Ile Pro Ala Ile Gly Phe Ile Ser His Val Asp 65 70 75 80 Thr Ser Pro Asp Cys Ser Gly Lys Asn Val Asn Pro Gln Ile Val Glu 85 90 95 Asn Tyr Arg Gly Gly Asp Ile Ala Leu Gly Ile Gly Asp Glu Val Leu 100 105 110 Ser Pro Val Met Phe Pro Val Leu His Gln Leu Leu Gly Gln Thr Leu 115 120 125 Ile Thr Thr Asp Gly Lys Thr Leu Leu Gly Ala Asp Asp Lys Ala Gly 130 135 140 Ile Ala Glu Ile Met Thr Ala Leu Ala Val Leu Gln Gln Lys Lys Ile 145 150 155 160 Pro His Gly Asp Ile Arg Val Ala Phe Thr Pro Asp Glu Glu Val Gly 165 170 175 Lys Gly Ala Lys His Phe Asp Val Asp Ala Phe Asp Ala Arg Trp Ala 180 185 190 Tyr Thr Val Asp Gly Gly Gly Val Gly Glu Leu Glu Phe Glu Asn Phe 195 200 205 Asn Ala Ala Ser Val Asn Ile Lys Ile Val Gly Asn Asn Val His Pro 210 215 220 Gly Thr Ala Lys Gly Val Met Val Asn Ala Leu Ser Leu Ala Ala Arg 225 230 235 240 Ile His Ala Glu Val Pro Ala Asp Glu Ser Pro Glu Met Thr Glu Gly 245 250 255 Tyr Glu Gly Phe Tyr His Leu Ala Ser Met Lys Gly Thr Val Glu Arg 260 265 270 Ala Asp Met His Tyr Ile Ile Arg Asp Phe Asp Arg Lys Gln Phe Glu 275 280 285 Ala Arg Lys Arg Lys Met Met Glu Ile Ala Lys Lys Val Gly Lys Gly 290 295 300 Leu His Pro Asp Cys Tyr Ile Glu Leu Val Ile Glu Asp Ser Tyr Tyr 305 310 315 320 Asn Met Arg Glu Lys Val Val Glu His Pro His Ile Leu Asp Ile Ala 325 330 335 Gln Gln Ala Met Arg Asp Cys Asp Ile Glu Pro Glu Leu Lys Pro Ile 340 345 350 Arg Gly Gly Thr Asp Gly Ala Gln Leu Ser Phe Met Gly Leu Pro Cys 355 360 365 Pro Asn Leu Phe Thr Gly Gly Tyr Asn Tyr His Gly Lys His Glu Phe 370 375 380 Val Thr Leu Glu Gly Met Glu Lys Ala Val Gln Val Ile Val Arg Ile 385 390 395 400 Ala Glu Leu Thr Ala Gln Arg Lys 405 <210> 4 <211> 1227 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> E.coli argE <400> 4 atggataaac tacttgagcg atttttgaac tacgtgtctc tggataccca atcaaaagca 60 ggggtgagac aggttcccag cacggaaggc caatggaagt tattgcatct gctgaaagag 120 cagctcgaag agatggggct tatcaatgtg accttaagtg agaagggcac tttgatggcg 180 acgttaccgg ctaacgtccc tggcgatatc ccggcgattg gctttatttc tcatgtggat 240 acctcaccgg attgcagcgg caaaaatgtg aatccgcaaa ttgttgaaaa ctatcgcggt 300 ggcgatattg cgctgggtat cggcgatgaa gttttatcac cggttatgtt cccggtgctg 360 catcagctac tgggtcagac gctgattacc accgatggta aaaccttgtt aggtgccgat 420 gacaaagcag gtattgcaga aatcatgacc gcgctggcgg tattgcaaca gaaaaaaatt 480 ccgcatggtg atattcgcgt cgcctttacc ccggatgaag aagtgggcaa aggggcgaaa 540 cattttgatg ttgacgcctt cgatgcccgc tgggcttaca ctgttgatgg tggtggcgta 600 ggcgaactgg agtttgaaaa cttcaacgcc gcgtcggtca atatcaaaat tgtcggtaac 660 aatgttcatc cgggcacggc gaaaggagtg atggtaaatg cgctgtcgct ggcggcacgt 720 attcatgcgg aagttccggc ggatgaaagc ccggaaatga cagaaggcta tgaaggtttc 780 tatcatctgg cgagcatgaa aggcaccgtt gaacgggccg atatgcacta catcatccgt 840 gatttcgacc gtaaacagtt tgaagcgcgt aaacgtaaaa tgatggagat cgccaaaaaa 900 gtgggcaaag ggttacatcc tgattgctac attgaactgg tgattgaaga cagttactac 960 aatatgcgcg agaaagtggt tgagcatccg catattctcg atatcgccca gcaggcgatg 1020 cgcgattgcg atattgaacc ggaactgaaa ccgatccgcg gtggtaccga cggcgcgcag 1080 ttgtcgttta tgggattacc gtgcccgaac ctgttcactg gcggttacaa ctatcatggt 1140 aagcatgagt ttgtgactct ggaaggtatg gaaaaagcgg tgcaggtgat cgtccgtatt 1200 gccgagttaa cggcgcaacg gaagtaa 1227 <210> 5 <211> 388 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> C. glutamicum 13869 argJ <400> 5 Met Ala Lys Lys Gly Ile Thr Ala Pro Lys Gly Phe Val Ala Ser Ala 1 5 10 15 Thr Thr Ala Gly Ile Lys Ala Ser Gly Asn Pro Asp Met Ala Leu Val 20 25 30 Val Asn Gln Gly Pro Glu Phe Ser Ala Ala Ala Val Phe Thr Arg Asn 35 40 45 Arg Val Phe Ala Ala Pro Val Lys Val Ser Arg Glu Asn Val Ala Asp 50 55 60 Gly Gln Ile Arg Ala Val Leu Tyr Asn Ala Gly Asn Ala Asn Ala Cys 65 70 75 80 Asn Gly Leu Gln Gly Glu Lys Asp Ala Arg Glu Ser Val Ser His Leu 85 90 95 Ala Gln Asn Leu Gly Leu Glu Asp Ser Asp Ile Gly Val Cys Ser Thr 100 105 110 Gly Leu Ile Gly Glu Leu Leu Pro Met Asp Lys Leu Asn Thr Gly Ile 115 120 125 Asp Gln Leu Thr Ala Glu Gly Ala Leu Gly Asp Asn Gly Ala Ala Ala 130 135 140 Ala Lys Ala Ile Met Thr Thr Asp Thr Val Asp Lys Glu Thr Val Val 145 150 155 160 Phe Ala Asp Gly Trp Thr Val Gly Gly Met Gly Lys Gly Val Gly Met 165 170 175 Met Ala Pro Ser Leu Ala Thr Met Leu Val Cys Leu Thr Thr Asp Ala 180 185 190 Ser Val Thr Gln Glu Met Ala Gln Ile Ala Leu Ala Asn Ala Thr Ala 195 200 205 Val Thr Phe Asp Thr Leu Asp Ile Asp Gly Ser Thr Ser Thr Asn Asp 210 215 220 Thr Val Phe Leu Leu Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Thr Pro Thr Gln 225 230 235 240 Asp Glu Leu Asn Asp Ala Val Tyr Ala Ala Cys Ser Asp Ile Ala Ala 245 250 255 Lys Leu Gln Ala Asp Ala Glu Gly Val Thr Lys Arg Val Ala Val Thr 260 265 270 Val Val Gly Thr Thr Asn Asn Glu Gln Ala Ile Asn Ala Ala Arg Thr 275 280 285 Val Ala Arg Asp Asn Leu Phe Lys Cys Ala Met Phe Gly Ser Asp Pro 290 295 300 Asn Trp Gly Arg Val Leu Ala Ala Val Gly Met Ala Asp Ala Asp Met 305 310 315 320 Glu Pro Glu Lys Ile Ser Val Phe Phe Asn Asp Gln Ala Val Cys Leu 325 330 335 Asp Ser Thr Gly Ala Pro Gly Ala Arg Glu Val Asp Leu Ser Gly Ala 340 345 350 Asp Ile Asp Val Arg Ile Asp Leu Gly Thr Ser Gly Glu Gly Gln Ala 355 360 365 Thr Val Arg Thr Thr Asp Leu Ser Phe Ser Tyr Val Glu Ile Asn Ser 370 375 380 Ala Tyr Ser Ser 385 <210> 6 <211> 1167 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> C. glutamicum 13869 argJ <400> 6 atggccaaaa aaggcattac cgcgccgaaa ggcttcgttg cttctgcaac gaccgcgggt 60 attaaagctt ctggcaatcc tgacatggcg ttggtggtta accagggtcc agagttttcc 120 gcagcggccg tgtttacacg caaccgagtt ttcgcagcgc ctgtgaaggt gagccgggag 180 aacgttgctg atggccagat cagggctgtt ttgtacaacg ctggtaatgc taatgcgtgt 240 aatggtctgc agggtgagaa ggatgctcgt gagtctgttt ctcatctagc tcaaaatttg 300 ggcttggagg attccgatat tggtgtgtgt tccactggtc ttattggtga gttgcttccg 360 atggataagc tcaatacagg tattgatcag ctgaccgctg agggcgcttt gggtgacaat 420 ggtgcagctg ctgccaaggc gatcatgacc actgacacgg tggataagga aaccgtcgtg 480 tttgctgatg gttggactgt cggcggaatg ggcaagggcg tgggcatgat ggcgccgtct 540 cttgccacca tgctggtctg cttgaccact gatgcatccg ttactcagga aatggctcag 600 attgcgctgg ctaatgctac ggccgttacg tttgacaccc tggatattga tggatcaacc 660 tccaccaatg acaccgtgtt cctgctggca tctggcgcta gcggaatcac cccaactcag 720 gatgaactca acgatgcggt gtacgcagct tgttctgata tcgcagcgaa gcttcaggct 780 gatgcagagg gggtgaccaa gcgcgttgct gtgacagtgg tgggaaccac caacaacgag 840 caggcgatca atgcggctcg cacggttgct cgtgacaatt tgttcaagtg cgcaatgttt 900 ggatctgatc caaactgggg tcgcgtgttg gctgcagtcg gcatggctga tgctgatatg 960 gaaccagaga agatttctgt gttcttcaat gatcaagcag tatgccttga ttccactggc 1020 gctcctggtg ctcgtgaggt ggatctttcc ggcgctgaca ttgatgtccg aattgatttg 1080 ggcaccagtg gggaaggcca ggcaacagtt cgaaccactg acctgagctt ctcctacgtg 1140 gagatcaact ccgcgtacag ctcttaa 1167 <210> 7 <211> 388 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> C. glutamicum 13032 argJ <400> 7 Met Ala Glu Lys Gly Ile Thr Ala Pro Lys Gly Phe Val Ala Ser Ala 1 5 10 15 Thr Thr Ala Gly Ile Lys Ala Ser Gly Asn Pro Asp Met Ala Leu Val 20 25 30 Val Asn Gln Gly Pro Glu Phe Ser Ala Ala Ala Val Phe Thr Arg Asn 35 40 45 Arg Val Phe Ala Ala Pro Val Lys Val Ser Arg Glu Asn Val Ala Asp 50 55 60 Gly Gln Ile Arg Ala Val Leu Tyr Asn Ala Gly Asn Ala Asn Ala Cys 65 70 75 80 Asn Gly Leu Gln Gly Glu Lys Asp Ala Arg Glu Ser Val Ser His Leu 85 90 95 Ala Gln Asn Leu Gly Leu Glu Asp Ser Asp Ile Gly Val Cys Ser Thr 100 105 110 Gly Leu Ile Gly Glu Leu Leu Pro Met Asp Lys Leu Asn Ala Gly Ile 115 120 125 Asp Gln Leu Thr Ala Glu Gly Ala Leu Gly Asp Asn Gly Ala Ala Ala 130 135 140 Ala Lys Ala Ile Met Thr Thr Asp Thr Val Asp Lys Glu Thr Val Val 145 150 155 160 Phe Ala Asp Gly Trp Thr Val Gly Gly Met Gly Lys Gly Val Gly Met 165 170 175 Met Ala Pro Ser Leu Ala Thr Met Leu Val Cys Leu Thr Thr Asp Ala 180 185 190 Ser Val Thr Gln Glu Met Ala Gln Ile Ala Leu Ala Asn Ala Thr Ala 195 200 205 Val Thr Phe Asp Thr Leu Asp Ile Asp Gly Ser Thr Ser Thr Asn Asp 210 215 220 Thr Val Phe Leu Leu Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Thr Pro Thr Gln 225 230 235 240 Asp Glu Leu Asn Asp Ala Val Tyr Ala Ala Cys Ser Asp Ile Ala Ala 245 250 255 Lys Leu Gln Ala Asp Ala Glu Gly Val Thr Lys Arg Val Ala Val Thr 260 265 270 Val Val Gly Thr Thr Asn Asn Glu Gln Ala Ile Asn Ala Ala Arg Thr 275 280 285 Val Ala Arg Asp Asn Leu Phe Lys Cys Ala Met Phe Gly Ser Asp Pro 290 295 300 Asn Trp Gly Arg Val Leu Ala Ala Val Gly Met Ala Asp Ala Asp Met 305 310 315 320 Glu Pro Glu Lys Ile Ser Val Phe Phe Asn Gly Gln Ala Val Cys Leu 325 330 335 Asp Ser Thr Gly Ala Pro Gly Ala Arg Glu Val Asp Leu Ser Gly Ala 340 345 350 Asp Ile Asp Val Arg Ile Asp Leu Gly Thr Ser Gly Glu Gly Gln Ala 355 360 365 Thr Val Arg Thr Thr Asp Leu Ser Phe Ser Tyr Val Glu Ile Asn Ser 370 375 380 Ala Tyr Ser Ser 385 <210> 8 <211> 1167 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> C. glutamicum 13032 argJ <400> 8 atggcagaaa aaggcattac cgcgccgaaa ggcttcgttg cttctgcaac gaccgcgggt 60 attaaagctt ctggcaatcc tgacatggcg ttggtggtta accagggtcc agagttttcc 120 gcagcggccg tgtttacacg taaccgagtt ttcgcagcgc ctgtgaaggt gagccgagag 180 aacgttgctg atggccagat cagggctgtt ttgtacaacg ctggtaatgc taatgcgtgt 240 aatggtctgc agggtgagaa ggatgctcgt gagtctgttt ctcatctagc tcaaaatttg 300 ggcttggagg attccgatat tggtgtgtgt tccactggtc ttattggtga gttgcttccg 360 atggataagc tcaatgcagg tattgatcag ctgaccgctg agggcgcttt gggtgacaat 420 ggtgcagctg ctgccaaggc gatcatgacc actgacacgg tggataagga aaccgtcgtg 480 tttgctgatg gttggactgt cggcggaatg ggcaagggcg tgggcatgat ggcgccgtct 540 cttgccacca tgctggtctg cttgaccact gatgcatccg ttactcagga aatggctcag 600 atcgcgctgg ctaatgctac ggccgttacg tttgacaccc tggatattga tggatcaacc 660 tccaccaatg acaccgtgtt cctgctggca tctggcgcta gcggaatcac cccaactcag 720 gatgaactca acgatgcggt gtacgcagct tgttctgata tcgcagcgaa gcttcaggct 780 gatgcagagg gtgtgaccaa gcgcgttgct gtgacagtgg tgggaaccac caacaacgag 840 caggcgatta atgcggctcg cactgttgct cgtgacaatt tgttcaagtg cgcaatgttt 900 ggatctgatc caaactgggg tcgcgtgttg gctgcagtcg gcatggctga tgctgatatg 960 gaaccagaga agatttctgt gttcttcaat ggtcaagcag tatgccttga ttccactggc 1020 gctcctggtg ctcgtgaggt ggatctttcc ggcgctgaca ttgatgtccg aattgatttg 1080 ggcaccagtg gggaaggcca ggcaacagtt cgaaccactg acctgagctt ctcctacgtg 1140 gagatcaact ccgcgtacag ctcttaa 1167 <210> 9 <211> 289 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> lysCP1 <400> 9 ccgatgctag ggcgaaaagc acggcgagca gattgctttg cacttgattc agggtagttg 60 actaaagagt tgctcgcgaa gtagcacctg tcacttttgt ctcaaatatt aaatcgaata 120 tcaatatatg gtctgtttat tggaacgcgt cccagtggct gagacgcatc cgctaaagcc 180 ccaggaaccc tgtgcagaaa gaaaacactc ctctggctag gtagacacag tttattgtgg 240 tagagttgag cgggtaactg tcagcacgta gatcgaaagg tgcacaaag 289 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tn-A-F <400> 10 atcctctaga gtcgaccatc gctgacacca tctgcc 36 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tn-A-R <400> 11 gggcccacta gtctcgagtt caccgcggga gccaagcc 38 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tn-B-F <400> 12 ctcgagacta gtgggccctg gattccaagg ctacgcc 37 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tn-B-R <400> 13 atgcctgcag gtcgaccctg aatggataag gcaccg 36 <210> 14 <211> 510 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Tn-A <400> 14 gcagacgcac tcgactacac ctccacctgc ccagaatgct cccaacctgg ggtgtttcgt 60 catcacaccc accggatgct cattgattta cccatcgtcg ggtttcccac caaactgttt 120 atccgtctac ctcgctaccg ctgcaccaac cccacatgta agcaaaagta tttccaagca 180 gaactaagct gcgctgacca cggtaaaaag gtcacccacc gggtcacccg ctggatttta 240 caacgccttg ctattgaccg gatgagtgtt cacgcaaccg cgaaagcact tgggctaggg 300 tgggatttaa cctgccaact agccctcgat atgtgccgtg agctggtcta taacgatcct 360 caccatcttg atggagtgta tgtcattggg gtggatgagc ataagtggtc acataatagg 420 gctaagcatg gtgatgggtt tgtcaccgtg attgtcgata tgaccgggca tcggtatgac 480 tcacggtgtc ctgcccggtt attagatgtc 510 <210> 15 <211> 479 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Tn-B <400> 15 aactcattcc ttctgctcgt cgcgtgatgg atccattcca tgttgtgcgg cttgctggtg 60 acaagctcac cgcctgccgg caacgcctcc agcgggagaa ataccagcgt cgtggtttaa 120 gccaggatcc gttgtataaa aaccggaaga ccttgttgac cacgcacaag tggttgagtc 180 ctcgtcagca agaaagcttg gagcagttgt gggcgtatga caaagactac ggggcgttaa 240 agcttgcgtg gcttgcgtat caggcgatta ttgattgtta tcagatgggt aataagcgtg 300 aagcgaagaa gaaaatgcgg accattattg atcagcttcg ggtgttgaag gggccgaata 360 aggaactcgc gcagttgggt cgtagtttgt ttaaacgact tggtgatgtg ttggcgtatt 420 tcgatgttgg tgtctccaac ggtccggtcg aagcgatcaa cggacggttg gagcatttg 479 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lysCP1 promotor_F <400> 16 gaatgagttc ctcgagccga tgctagggcg aaaa 34 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lysCP1 promotor_R <400> 17 ctttgtgcac ctttcgatct acgtgctgac agttac 36 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> argJ _F <400> 18 gttccacatg gccaaaaaag gcattac 27 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> argJ _R <400> 19 ttctttttaa gagctgtacg cggagttgat ctcc 34 <210> 20 <211> 1332 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> E.coli arg A <400> 20 gtggtaaagg aacgtaaaac cgagttggtc gagggattcc gccattcggt tccctatatc 60 aatacccacc ggggaaaaac gtttgtcatc atgctcggcg gtgaagccat tgagcatgag 120 aatttctcca gtatcgttaa tgatatcggg ttgttgcaca gcctcggcat ccgtctggtg 180 gtggtctatg gcgcacgtcc gcagatcgac gcaaatctgg ctgcgcatca ccacgaaccg 240 ctgtatcaca agaatatacg tgtgaccgac gccaaaacac tggaactggt gaagcaggct 300 gcgggaacat tgcaactgga tattactgct cgcctgtcga tgagtctcaa taacacgccg 360 ctgcagggcg cgcatatcaa cgtcgtcagt ggcaatttta ttattgccca gccgctgggc 420 gtcgatgacg gcgtggatta ctgccatagc gggcgtatcc ggcggattga tgaagacgcg 480 atccatcgtc aactggacag cggtgcaata gtgctaatgg ggccggtcgc tgtttcagtc 540 actggcgaga gctttaacct gacctcggaa gagattgcca ctcaactggc catcaaactg 600 aaagctgaaa agatgattgg tttttgctct tcccagggcg tcactaatga cgacggtgat 660 attgtctccg aacttttccc taacgaagcg caagcgcggg tagaagccca ggaagagaaa 720 ggcgattaca actccggtac ggtgcgcttt ttgcgtggcg cagtgaaagc ctgccgcagc 780 ggcgtgcgtc gctgtcattt aatcagttat caggaagatg gcgcgctgtt gcaagagttg 840 ttctcacgcg acggtatcgg tacgcagatt gtgatggaaa gcgccgagca gattcgtcgc 900 gcaacaatca acgatattgg cggtattctg gagttgattc gcccactgga gcagcaaggt 960 attctggtac gccgttctcg cgagcagctg gagatggaaa tcgacaaatt caccattatt 1020 cagcgcgata acacgactat tgcctgcgcc gcgctctatc cgttcccgga agagaagatt 1080 ggggaaatgg cctgtgtggc agttcacccg gattaccgca gttcatcaag gggtgaagtt 1140 ctgctggaac gcattgccgc tcaggcgaag cagagcggct taagcaaatt gtttgtgctg 1200 accacgcgca gtattcactg gttccaggaa cgtggattta ccccagtgga tattgattta 1260 ctgcccgaga gcaaaaagca gttgtacaac taccagcgta aatccaaagt gttgatggcg 1320 gatttagggt aa 1332 <210> 21 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> argA ORF_F <400> 21 gaaaggtgca caaagatggt aaaggaacgt aaaaccg 37 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> argA ORF_R <400> 22 gcccactagt ctcgagcatg cggcgttgat tttg 34 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> argE ORF_F <400> 23 gaaaggtgca caaagatgaa aaacaaatta ccgcc 35 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> argE ORF_R <400> 24 gcccactagt ctcgaggttt gagtcactgt cggtcg 36 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ncgl2644 ORF_F <400> 25 gaggagatca aaacacatat gacgcctagt cttccccg 38 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ncgl2644 ORF_R <400> 26 ttagaatttc cgttcggcgt acc 23 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> argJ_N_F <400> 27 cgggatccca cgcctgtctg gtcgc 25 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> argJ_N_R <400> 28 acgcgtcgac ggatctaaag cggcgcttc 29 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> argJ_C_F <400> 29 acgcgtcgac tccggcgctg acattgatgt cc 32 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> argJ_C_R <400> 30 ctagtctaga gagctgcacc aggtagacg 29

Claims (12)

  1. 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제(N-acetyltransferase) 및 대장균 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제(Acetylornithine deacetylase, argE)의 활성이 도입된, 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 대장균 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 속 균주 유래 이중기능성 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루타메이트 신타제(bifunctional ornithine acetyltransferase/N-acetylglutamate synthase, argJ)의 활성이 불활성화된 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
  6. 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제(N-acetyltransferase) 및 대장균 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제(Acetylornithine deacetylase, argE)의 활성이 도입된, 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 퓨트레신 생산 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 방법은 배양된 배지 또는 미생물에서 퓨트레신을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 퓨트레신 생산 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인, 퓨트레신 생산 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 대장균 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것인, 퓨트레신 생산 방법.
  10. 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제(N-acetyltransferase) 및 대장균 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제(Acetylornithine deacetylase, argE)의 활성이 도입된, 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 포함하는, 퓨트레신 생산용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 균주 유래 N-아세틸트랜스퍼라제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인, 퓨트레신 생산용 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 대장균 유래 아세틸오르니틴 디아세틸라제는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것인, 퓨트레신 생산용 조성물.
KR1020200101894A 2020-08-13 2020-08-13 퓨트레신 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법 KR102246288B1 (ko)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200101894A KR102246288B1 (ko) 2020-08-13 2020-08-13 퓨트레신 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
MX2023001849A MX2023001849A (es) 2020-08-13 2021-03-19 Microorganismo para producir putrescina y proceso para producir putrescina utilizando el mismo.
BR112023002636A BR112023002636A2 (pt) 2020-08-13 2021-03-19 Microrganismo para produzir putrescina e processo para produzir putrescina usando o mesmo
AU2021325749A AU2021325749A1 (en) 2020-08-13 2021-03-19 Microorganism for producing putrescine and process for producing putrescine by using same
JP2023510305A JP7544962B2 (ja) 2020-08-13 2021-03-19 プトレシン生産微生物及びそれを用いたプトレシン生産方法
US18/021,059 US20230392174A1 (en) 2020-08-13 2021-03-19 Microorganism for producing putrescine and process for producing putrescine by using same
CN202180068172.0A CN116648504A (zh) 2020-08-13 2021-03-19 生产腐胺的微生物和利用其生产腐胺的方法
PCT/KR2021/003408 WO2022035011A1 (ko) 2020-08-13 2021-03-19 퓨트레신 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
EP21856020.9A EP4198131A4 (en) 2020-08-13 2021-03-19 MICROORGANISM FOR PRODUCING PUTRESCIN AND METHOD FOR PRODUCING PUTRESCIN THEREFROM
CA3189239A CA3189239A1 (en) 2020-08-13 2021-03-19 Microorganism for producing putrescine and process for producing putrescine by using same
ZA2023/03479A ZA202303479B (en) 2020-08-13 2023-03-10 Microorganism for producing putrescine and process for producing putrescine by using same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200101894A KR102246288B1 (ko) 2020-08-13 2020-08-13 퓨트레신 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102246288B1 true KR102246288B1 (ko) 2021-04-29

Family

ID=75728438

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200101894A KR102246288B1 (ko) 2020-08-13 2020-08-13 퓨트레신 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230392174A1 (ko)
EP (1) EP4198131A4 (ko)
JP (1) JP7544962B2 (ko)
KR (1) KR102246288B1 (ko)
CN (1) CN116648504A (ko)
AU (1) AU2021325749A1 (ko)
BR (1) BR112023002636A2 (ko)
CA (1) CA3189239A1 (ko)
MX (1) MX2023001849A (ko)
WO (1) WO2022035011A1 (ko)
ZA (1) ZA202303479B (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108893438A (zh) * 2018-06-25 2018-11-27 江南大学 一种提高钝齿棒杆菌合成l-鸟氨酸产量的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090107920A (ko) * 2008-04-10 2009-10-14 한국과학기술원 퓨트레신 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신의 제조방법
KR20150124398A (ko) * 2014-04-25 2015-11-05 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 생산 변이주 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
KR20170010960A (ko) * 2015-07-20 2017-02-02 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 또는 오르니틴 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 또는 오르니틴 생산방법

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005261861B2 (en) 2004-07-15 2010-08-26 Dsm Ip Assets B.V. Biochemical synthesis of 1,4-butanediamine
AU2005261862B2 (en) 2004-07-15 2010-08-26 Dsm Ip Assets B.V. Biochemical synthesis of 1,4-butanediamine
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
KR100930203B1 (ko) 2008-01-28 2009-12-07 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
EP2281880B1 (en) * 2008-04-10 2016-07-06 Korea Advanced Institute of Science and Technology Mutant microorganism with high ability of producing putrescine and preparation of putrescine using same
KR101126041B1 (ko) 2008-04-10 2012-03-19 씨제이제일제당 (주) 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
KR101348461B1 (ko) 2010-12-08 2014-01-08 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법
WO2013105827A2 (ko) 2012-01-11 2013-07-18 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법
KR101632642B1 (ko) 2015-01-29 2016-06-22 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 그의 용도
WO2017097828A1 (en) * 2015-12-07 2017-06-15 Danmarks Tekniske Universitet Bacterial cells with improved tolerance to polyamines
ES2907694T3 (es) 2016-08-31 2022-04-26 Cj Cheiljedang Corp Nuevo promotor y uso del mismo

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090107920A (ko) * 2008-04-10 2009-10-14 한국과학기술원 퓨트레신 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신의 제조방법
KR20150124398A (ko) * 2014-04-25 2015-11-05 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 생산 변이주 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
KR20170010960A (ko) * 2015-07-20 2017-02-02 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 또는 오르니틴 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 또는 오르니틴 생산방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Biotechnol Vol.201 pp.75-85 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108893438A (zh) * 2018-06-25 2018-11-27 江南大学 一种提高钝齿棒杆菌合成l-鸟氨酸产量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
BR112023002636A2 (pt) 2023-04-04
MX2023001849A (es) 2023-05-08
JP7544962B2 (ja) 2024-09-03
CA3189239A1 (en) 2022-02-17
ZA202303479B (en) 2024-07-31
JP2023538009A (ja) 2023-09-06
AU2021325749A9 (en) 2023-04-27
EP4198131A1 (en) 2023-06-21
CN116648504A (zh) 2023-08-25
US20230392174A1 (en) 2023-12-07
EP4198131A4 (en) 2024-02-21
WO2022035011A1 (ko) 2022-02-17
AU2021325749A1 (en) 2023-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102075160B1 (ko) L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 제조 방법
KR101996769B1 (ko) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법
KR101607741B1 (ko) 퓨트레신 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
KR102207867B1 (ko) Nadp 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 포함하는 미생물을 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
KR102126951B1 (ko) 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산방법
US20220411832A1 (en) Novel branched-chain amino acid aminotransferase variant and method for producing leucine using the same
KR101937569B1 (ko) 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 오르니틴계 산물 생산방법
KR102277407B1 (ko) 신규한 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
CN115135759B (zh) 新型葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶变体及使用其生产l-谷氨酸的方法
CN111655859B (zh) 生产腐胺的微生物及利用其生产腐胺的方法
KR102246288B1 (ko) 퓨트레신 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
KR101941775B1 (ko) 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 오르니틴계 산물 생산방법
KR20220110992A (ko) 프리페네이트 탈수 효소 (Prephenate dehydratase) 변이체 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산 생산 방법
KR101732788B1 (ko) 다이아민 생산 미생물 및 이를 이용한 다이아민 생산방법
KR101735178B1 (ko) 다이아민 생산 미생물 및 이를 이용한 다이아민 생산방법
EP4105324B1 (en) Novel bifunctional pyr operon transcriptional regulator/uracil phosphoribosyltransferase variant, and method for producing imp using same
KR102277409B1 (ko) 신규한 2중기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포밀트랜스퍼라아제/imp 사이클로하이드롤라아제 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법
KR102273638B1 (ko) 신규한 포스포글리세린산 디하이드로게나제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
KR102527895B1 (ko) GlxR 단백질 변이체 또는 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법
KR102134375B1 (ko) 사이토크롬 c 활성이 강화된 l-라이신 생산 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법
KR20220139085A (ko) L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산방법
RU2817284C1 (ru) Микроорганизм для продуцирования путресцина и способ получения путресцина с его применением
EP4067484B1 (en) Novel galactoside o-acetyltransferase variant, and method for producing l-glutamic acid using same
KR102527102B1 (ko) 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
EP4098658B1 (en) Novel protein variant and method for producing l-lysine using same

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant