CN103320540B - 鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重rt-pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重RT‑PCR试剂盒，该试剂盒含有三对特异性引物。实验证明，应用本发明仅需一次RT‑PCR反应就能同时检测和鉴别鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒三种病原体，具有特异性强、灵敏度高、低成本、高效率等优点；而且本发明在引物设计上利用扩增片段长度的不同可直接判定扩增结果，更简便、直观和实用。本发明的待测样品可来自健康动物或死亡动物，可为DNA和/或RNA，最低能同时检出100pg鸭坦布苏病毒RNA、10pg减蛋综合症病毒DNA和1ng新城疫病毒RNA，这为三种病毒的发病早期提供了准确的诊断结果，对切断其传播途径有重要意义，具有广阔的应用前景，对鸭养殖业可持续发展有着重要的现实意义。

Description

鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR 试剂盒

技术领域

本发明属于PCR试剂盒技术领域，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR试剂盒，以及鉴定或辅助鉴定这三种病毒的引物对组。

背景技术

鸭坦布苏病毒（Duck Tanbusu Virus，DTBSV）是引起产蛋鸭产蛋急剧下降、死亡和小鸭神经症状、死亡的一种病毒性传染病的病原。该病主要侵害处于产蛋期的成鸭，可以使处于产蛋高峰期的母鸭的产蛋率在几天之内降到20%以内甚至为0，也可以引起雏鸭的神经症状和死亡，是危害养鸭业最为严重的传染病之一。减蛋综合症病毒（Egg Drop SyndromeVirus，EDSV）是主要引起鸭产蛋下降的一种腺病毒。产蛋鸭感染坦布苏病毒或减蛋综合症病毒之后，同样都会引起产蛋下降，且剖检也会见到卵巢出血充血等病变。新城疫（Newcastle disease Virus，NDV）是引起鸡等走禽和飞禽呼吸道、消化道和神经系统严重病变的病毒，之前一直被认为对鸭等水禽的致病性不强，但今年来陆续有鸭等水禽感染新城疫病毒后发病的报道，说明病毒已经逐渐适应了水禽的机体，对水禽产生了致病性。产蛋鸭感染新城疫强毒之后，同样会引起产蛋下降，且剖检也会见到卵巢出血充血等病变。目前，鸭坦布苏病毒的检测方法包括间接ELISA和PCR，减蛋综合症病毒的检测方法有HI、PCR等，新城疫病毒的检测方法有HI、PCR等。

PCR技术由于具有敏感性高、特异性好、快速简便等特点，已经走进临床诊断实验室并广泛应用于各种禽病病原体的检测，包括用于DTBSV、EDSV和NDV的检测。三重RT-PCR是一种特殊的PCR形式，其突出特点是一次RT-PCR反应能同时检测并鉴别出三种病原体，在临床上具有很高的应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、快速方、低成本、高效率便的鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR试剂盒，以及鉴定或辅助鉴定这三种病毒的引物对组。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR引物组，包括三对特异性引物，分别是引物1和2（鉴定新城疫病毒）、引物3和4（鉴定减蛋综合症病毒）、引物5和6（鉴定鸭坦布苏病毒），它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。

引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩尔比为5∶5∶5∶5∶3∶3。

上述鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR引物组在PCR扩增方面的应用，RT-PCR扩增的退火温度为50℃-60℃。

PCR扩增的退火温度为52℃。

鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：A液：引物组和One-Step RT-PCR试剂盒；引物组包括三对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4、引物5和6，引物组中引物1至4的浓度为25μM，引物5至6的浓度为15μM，各1μL，One Step RT-PCR试剂盒包括2×one-step reaction mix（含4种dNTP、RT反应缓冲液组成和PCR反应缓冲液组成）、TransScript one-step emzyme mix（含反转录酶和PCRTaq酶）和去离子水；B液：鸭坦布苏病毒cDNA、减蛋综合症病毒DNA和新城疫病毒cDNA，作为阳性对照；C液：去离子水，作为阴性对照。

上述鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR试剂盒在RT-PCR扩增方面的应用，RT-PCR扩增的退火温度为50℃-60℃。

PCR扩增的退火温度为52℃。

针对目前缺乏对鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒同时进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究设计了三对特异性引物，据此建立了鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，应用本发明仅需一次RT-PCR反应就能同时检测和鉴别鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒三种病原体，具有特异性强、灵敏度高、低成本、高效率等优点；而且本发明在引物设计上利用扩增片段长度的不同可直接判定扩增结果，更简便、直观和实用。本发明的待测样品可来自健康动物或死亡动物，可为DNA和/或RNA，最低能同时检出100pg鸭坦布苏病毒RNA、10pg减蛋综合症病毒DNA和1ng新城疫病毒RNA，这为三种病毒的发病早期提供了准确的诊断结果，对切断其传播途径有重要意义，具有广阔的应用前景，对鸭养殖业可持续发展有着重要的现实意义。

附图说明

图1是三重RT-PCR的敏感性试验结果电泳图，图中：M为分子量标准100bp DNAladder；1为10ng NDV、10ng EDSV和10ng DTBSV；2为1ng NDV、1ng EDSV和1ng DTBSV；3为100pg NDV、100pg EDSV和100pg DTBSV；4为10pg NDV、10pg EDSV和10pg DTBSV；5为1pgNDV、1pg EDSV和1pg DTBSV；6为100fg NDV、100fg EDSV和100fg DTBSV；7为阴性对照（水）。

图2是三重RT-PCR的特异性试验结果电泳图，图中：M为分子量标准100bp DNAladder；1为DTBSV RNA；2为EDSV DNA；3为NDV RNA；4为DTBSV RNA和EDSV RNA的混合样品（浓度比1:1）；5为NDV RNA和DTBSV RNA的混合样品（浓度比1:1）；6为EDSV RNA和NDV RNA的混合样品（浓度比1:1）；7为NDV RNA、EDSV RNA和DTBSV RNA的混合样品（浓度比1:1:1）；8为H5亚型禽流感RNA；9为番鸭细小病毒RNA；10为鸭瘟病毒DNA；11为H9亚型禽流感RNA；12为阴性对照（水）。

具体实施方式

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：

新城疫病毒（NDV）记载在“广西新城疫病毒的分离和鉴定”，广西畜牧兽医,2002,18(6):5-7，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

减蛋综合症病毒记载在“广西部分地区减蛋综合症病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医,2010，37（11):156-158,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

新城疫病毒记载在“新城疫植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报,2000,(04):23-27,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

鸭瘟病毒AV1221株购自中国兽医药品监察所；

H9亚型禽流感记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报,2006,(09):858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

H5亚型禽流感记载在“多重反转录聚合酶链反应检测H5亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病杂志,2005,21(9):762-764，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

鸭坦布苏病毒记载在“4株广西鸭源坦布苏病毒分离及初步鉴定”，中国动物检疫，已收录，待发表。

病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒和One-Step RT-PCR试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司，PMD-18T购自大连宝生物工程有限公司；DNA片断胶回收试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司。PCR仪为美国Perkin Elmer Cetus公司生产的PE9600仪。

实施例1、引物的设计与合成

根据现有公开的鸭坦布苏病毒（DTBSV），减蛋综合症病毒（EDSV）和新城疫病毒（NDV）的基因保守序列，通过Blast验证，设计并合成了3对特异性引物（表1）。

表1 鉴定NDV、EDSV和DTBSV的引物序列

实施例2、三重RT-PCR鉴定鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒

一、三重RT-PCR体系的建立

1、待测样品的制备

根据病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒说明书，提取鸭坦布苏病毒RNA、新城疫病毒的RNA和减蛋综合症病毒的DNA。参照Sambrook方法测定核酸的浓度和纯度，保存于-70℃备用。

2、三重RT-PCR反应条件的优化

使用One Step RT-PCR试剂盒采用一步法进行RT-PCR。对RT-PCR各循环参数和各引物浓度等进行优化，以确定最佳的RT-PCR模式。

通过对RT-PCR的引物浓度、各反应温度、时间及循环次数等进行优化，最后确定RT-PCR中NDV283-1和NDV283-2引物的最佳工作终浓度均为05μM，DTBSV422-1和DTBSV422-2引物的最佳工作终浓度均为0.5μM，EDSV741-1和EDSV741-2引物的最佳工作终浓度均为0.3μM。

反应体系（50μl）：PrimeScript1Step Enzyme Mix2μl，2×1Step Buffer25μl，终浓度均为0.5μM的NDV283-1和NDV283-2引物，终浓度均为0.5μM的EDSV741-1和EDSV741-2引物，以及终浓度均为0.3μM的DTBSV422-1和DTBSV422-2引物，NDV DNA、DTBSV RNA和EDSVDNA共3μL（体积比是1:1:1）作为混合模板，以无RNase的dH₂O补足50μl。

RT-PCR的最佳反应模式为50℃反转录30分钟，94℃变性2分钟，然后进入94℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸1分钟的循环，共进行35个循环，最后再经72℃延伸10分钟后，于4℃结束反应。

二、三重RT-PCR的敏感性试验

将步骤一、1、中制备得到的样品作为鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒模板的RNA，加适量到同一试管中并用水调整使其终浓度一致，然后进行10倍比梯度稀释，按照步骤一、2、中优化后的PCR反应条件进行扩增，检测其敏感性；同时设置以水代替等量模板的阴性对照。

反应结束后，取50μl RT-PCR产物与5μl溴酚兰混合，在10g/L琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后，在紫外光下观察拍照，与DNA标准分子量作比较，分析并记录结果。在紫外灯下用刀片切割所需的片段，然后用DNA片断胶回收试剂盒纯化回收。取适量纯化回收的PCR产物，与PMD-18T（来自PME-18T试剂盒）于16℃连接4小时，转化DH5α大肠埃希氏菌。挑取在含氨苄青霉素的选择培养基上长出的白色菌落37℃培养，用PCR方法进行快速鉴定，阳性克隆菌送大连宝生生物技术有限公司进行测序，测序结果进行Blast比对分析。

琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，该三重RT-PCR最低能检出100pg鸭坦布苏病毒RNA、10pg减蛋综合症病毒RNA和1ng新城疫病毒RNA。最低检测线以上各浓度的模板中新城疫病毒均扩增得到大小约为300bp的条带，减蛋综合症病毒均扩增得到大小约为750bp的条带，鸭坦布苏病毒均扩增得到大小约为400bp的条带，且测序结果进一步证实了鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒RT-PCR扩增产物，大小分别为283bp、741bp和422bp，与实验设计大小相符，且PCR产物的核酸序列与引物设计模板的基因对应片段的同源性一致。以上结果表明利用该三重RT-PCR同时检测鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒具有较高的灵敏度。

三、三重RT-PCR的特异性试验

1、待测样品的制备

根据病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒说明书，提取EDSV RNA、DTBSV RNA、AIV H5RNA、AIV H9RNA、AIV H9RNA、鸭瘟病毒DNA、番鸭细小病毒RNA和NDV RNA。参照Sambrook方法测定核酸的浓度和纯度，保存于-70℃备用。

2、三重RT-PCR扩增

按照步骤一、2、中优化后的PCR反应条件进行扩增，不同的是模板分别如下：DTBSVRNA；EDSV DNA；NDV RNA；DTBSV RNA和EDSV RNA的混合样品（浓度比1:1）；NDV RNA和DTBSVRNA的混合样品（浓度比1:1）；EDSV RNA和NDV RNA的混合样品（浓度比1:1）；NDV RNA、EDSVRNA和DTBSV RNA的混合样品（浓度比1:1:1）；H5亚型禽流感RNA；番鸭细小病毒RNA；鸭瘟病毒DNA；H9亚型禽流感RNA；阴性对照水。

反应结束后，取50μl RT-PCR产物与5μl溴酚兰混合，在10g/L琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后，在紫外光下观察拍照，与DNA标准分子量作比较，分析并记录结果。在紫外灯下用刀片切割所需的片段，然后用DNA片断胶回收试剂盒纯化回收。取适量纯化回收的PCR产物，与PMD-18T（来自PME-18T试剂盒）于16℃连接4小时，转化DH5α大肠埃希氏菌。挑取在含氨苄青霉素的选择培养基上长出的白色菌落37℃培养，用PCR方法进行快速鉴定，阳性克隆菌送大连宝生生物技术有限公司进行测序，测序结果进行Blast比对分析。

琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，所有含有鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒核酸模板的样品均能扩增出与试验设计大小相符的扩增条带，即新城疫病毒扩增得到大小约为300bp的目的条带，减蛋综合症病毒扩增得到大小约为750bp的目的条带，鸭坦布苏病毒扩增得到大小约为400bp的目的条带；而其它对照病原体在相同位置却无任何扩增条带。测序结果进一步证实了鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒RT-PCR扩增产物，大小分别为283bp、741bp和422bp，与实验设计大小相符，且PCR产物的核酸序列与引物设计模板的基因对应片段的同源性一致。这一结果表明利用该三重RT-PCR检测鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒具有较强的特异性。

实施例3、检测试剂盒的组装

根据实施例1和2的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。

A液：引物组和One-Step RT-PCR试剂盒；引物组包括三对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4、引物5和6，引物1至4的浓度为25μM，引物5至6的浓度为15μM，各1μL，OneStep RT-PCR试剂盒包括2×one-step reaction mix（含4种dNTP、RT反应缓冲液组成和PCR反应缓冲液组成）、TransScript one-step emzyme mix（含反转录酶和PCR Taq酶）和去离子水；

B液：鸭坦布苏病毒cDNA、减蛋综合症病毒cDNA和新城疫病毒cDNA，作为阳性对照；

C液：去离子水，作为阴性对照。

因此，本发明的引物组、试剂盒及由此建立的检测方法可用于鉴定待测样本是否感染鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒：若得到283bp的片段，则待测样本中含有新城疫病毒，反之则没有；若得到741bp的片段，则待测样本中含有减蛋综合症病毒，反之则没有；若得到422bp的片段，则待测样本中含有鸭坦布苏病毒，反之则没有。

Claims (6)

1.一种鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：

A液：引物组和One-Step RT-PCR试剂盒；引物组包括三对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4、引物5和6，所述引物组中引物1至4的浓度为25μM，引物5至6的浓度为15μM，各1μL，One Step RT-PCR试剂盒包括2×one-step reaction mix、TransScript one-stepemzyme mix和去离子水；

B液：鸭坦布苏病毒cDNA、减蛋综合症病毒DNA和新城疫病毒cDNA，作为阳性对照；

C液：去离子水，作为阴性对照；

所述引物1和2、引物3和4、引物5和6，它们分别是序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。

2.权利要求1所述鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR试剂盒在PCR扩增方面的非诊断应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为50℃-60℃。

3.根据权利要求2所述的非诊断应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为52℃。

4.鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR引物组，其特征在于包括三对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4、引物5和6，它们分别是序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列，所述引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩尔比为5∶5∶5∶5∶3∶3。

5.权利要求4所述鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR引物组在PCR扩增方面的非诊断应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为50℃-60℃。

6.根据权利要求5所述的非诊断应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为52℃。