CN104673934A - 锦鲤疱疹病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种锦鲤疱疹病毒RT-LAMP的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。检测的引物组包括一对外引物、一对环引物、一对内引物；检测试剂盒包括引物组、RT-LAMP反应液、BstDNA聚合酶和阴阳性对照。其检测方法是通过提取待检病毒DNA，采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在63～65℃对样品DNA模板进行扩增，通过便捷仪器恒温荧光检测仪器观察是否有无S型扩增曲线，确定待检样品中是否含有锦鲤疱疹病毒（KHV）DNA。本发明具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点，适于在各级检测单位和水产养殖用户中进行推广应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及水产养殖业的检测方法，具体涉及一种锦鲤疱疹病毒（KHV）的RT-LAMP（Real -Time Loop-mediated Isothermal Amplification，恒温实时荧光扩增反应）检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
背景技术
锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus,KHV）引起的锦鲤（Cyprinus carpio koi）和鲤鱼（Cyprinus carpio carpio）的一种高致病性疾病。该病多发生在水温为18～28℃的春秋季节，具有高度传染性，发病率和死亡率均可高达80％～100％。由于缺乏相关的检疫制度，所以锦鲤和鲤鱼的国际贸易促进了该病在世界范围内的暴发性流行，给锦鲤和鲤鱼养殖业造成了破坏性影响。该病最初在德国报道，后主要在欧洲的锦鲤养殖中广泛传播，是国际动物卫生组织（OIE）规定需要向OIE申报的疾病之一。在我国也被列为《中华人民共和国动物防疫法》第十条规定中的二类动物疫病。
KHV属于疱疹病毒科，为直径100~110nm的二十面体，有囊膜，KHV是线形双股DNA病毒，是鱼类疱疹病毒，属中基因组最大的病毒。基因组大小为295kb，全部核苷酸的GC含量为59.2％。目前，已分离到４株病毒，即欧洲株、美国株（KHV-U）、亚洲株（KHV-J）和以色列株（KHV-I）。。KHV在22℃左右的池塘水中至少存活4ｈ，并且在鱼的分泌物或池塘底泥中可能存活更长时间。病毒对温度和酸碱度都比较敏感，在35℃ 2天或60℃ 30min以及pH低于3或高于11的条件下，病毒失去感染力。氯仿、250mL/Ｌ的乙醚或1g/L的TritonX-100可迅速灭活病毒。感染KHV的鱼典型临床症状是反应迟钝、食欲不振、呼吸困难、共济失调；鳃出血坏死，眼睛凹陷，皮肤有灰白色斑点，黏液分泌增多；感染后第7~10天开始出现死亡，2~3周后死亡率可达100%。
目前，采取细胞培养锦鲤疱疹病毒一般需要15天以上才能得出结果，检测周期太长，采取PCR检测方法需要昂贵的设备和专业的操作水平，因此建立一种快速、准确、高通量且对仪器要求不高的的检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测引物组。
本发明的另一个目的在于提供一种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物：
KHV-F3：AGTCACCAAAGCTCAACTG（SEQ ID NO:1）；
KHV-B3：GATTCCGATGCCGATGAA（SEQ ID NO:2）；
内引物：
KHV-FIP：TTGAATCGCTCAGCGTCTACGCCTGATGAACAAGGTGCC（SEQ ID NO:3）；
KHV-BIP：CCGCTGACGATGGGCATTTGAGATCAAAGTTGGGATCG（SEQ ID NO:4）；
环引物：
KHV-LF：CTTGACGAGGAGCTTGCT（SEQ ID NO:5）；
KHV-LB：GCACGCCATGTACTCCAA（SEQ ID NO:6）。
一种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒，该检测试剂盒包括上述所述的检测引物组。
进一步的，上述检测试剂盒包含上述所述的引物组、DNA聚合酶、RT-LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。
进一步的，上述外引物、内引物、环引物的摩尔比为1：8：4。
进一步的，上述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
进一步的，上述RT-LAMP反应液含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液和10×SYTO-9溶液。
进一步的，上述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为DEPC水。
一种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测方法，包括如下步骤：
1）待检样品DNA的提取；
2）恒温实时荧光扩增反应： 配制25μl反应体系，含有KHV-F3 0.2μM，KHV-B3 0.2μM，KHV-FIP 1.6μM，KHV-BIP 1.6μM，KHV-LF 0.8μM，KHV-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液13.0μl，DNA聚合酶8U，待检DNA 1~100ng，用DEPC水补齐到25μl；然后于63～65℃反应60～90min；
3）结果分析：根据有无S型扩增曲线来判断检测结果；
上述所用到的所有试剂均来自权利要求2~7任一所述的检测试剂盒；
上述检测方法用于非疾病检测或诊断。
本发明的有益效果是：
本发明具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等有益效果：
1）高特异性：
本发明根据锦鲤疱疹病毒（KHV）的主要包膜蛋白基因（env基因，GenBank登录号为AB195965.1）设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
2）高灵敏度：最低检测极限可达到1pg /ul KHV DNA；
3）快速高效：整个扩增只用60～90min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；
4）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要恒温荧光检测仪器，条件比较温和；
5）结果易读：通过便捷式的恒温荧光检测仪器即可判读检测结果，无需电泳等其他任何分析步骤，适合非专业人士的现场检测。
附图说明
图1是实施例3特异性的检测结果图（1、2：DEPC水对照；3、4：KHV DNA；5、6：CVV DNA；7、8：CyHV-1 DNA；9、10：CyHV-2 DNA）；
图2是实施例4灵敏度的检测结果图（KHV DNA，1：100ng/ul DNA(KHV)；2：10ng/ul DNA(KHV)；3：1ng/ul DNA(KHV)；4：100pg/ul DNA(KHV)；5：10pg/ul DNA(KHV)；6：1pg/ul DNA(KHV)；7：100fg/ul DNA(KHV)；8：DEPC水对照）。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 锦鲤疱疹病毒RT-LAMP检测试剂盒的建立
锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP（Real -Time Loop-mediated Isothermal Amplification，恒温实时荧光扩增反应）检测试剂盒，包括RT-LAMP引物组、RT-LAMP反应液、BstDNA聚合酶、阳性对照和阴性对照。
（1）RT-LAMP引物设计：以锦鲤疱疹病毒（KHV）的主要包膜蛋白基因（env基因，GenBank登录号为AB195965.1）为靶基因，利用在线设计KHV 特异性RT-LAMP引物。引物序列见表1。
表1. KHV特异性的RT-LAMP引物序列表
（2）RT-LAMP反应液：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液、10×SYTO-9溶液。
（3）阳性对照为含有锦鲤疱疹病毒（KHV）主要包膜蛋白基因env基因片段的质粒DNA，其制备方法为：以分离鉴定的锦鲤疱疹病毒DNA为模板，利用表1中的外引物（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2）对KHV DNA进行PCR，所得基因片段长度为179bp，序列如SEQ ID NO:7所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中构建质粒，即为阳性对照。
（4）阴性对照为DEPC水。
实施例2 锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测方法
用上述试剂盒按以下方法对待测锦鲤疱疹病毒（KHV）进行检测：
（1）待检样品DNA的提取：迪澳生物的水生动物病毒基因组DNA提取试剂盒提取待检样品的DNA；
（2）恒温实时荧光扩增反应（Real -Time Loop-mediated Isothermal Amplification，RT-LAMP）：
25μl反应体系含有：KHV-F3 0.2μM， KHV-B3 0.2μM，KHV-FIP 1.6μM，KHV-BIP 1.6μM，KHV-LF 0.8μM，KHV-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液13.0μl， BstDNA聚合酶8U，待检DNA1~100ng，用DEPC水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，于65℃反应60min。
（3）结果判断：将上述反应管中置于迪澳生物的恒温荧光检测仪308C中，设置反应程序，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果，如果出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
实施例3 特异性实验
用实施例2的方法分别对分离纯化的锦鲤疱疹病毒（KHV）DNA、鲤痘疮病毒（CyHV-1）DNA、金鱼造血器官坏死病毒（CyHV-2）DNA、叉尾鮰病毒（CVV）DNA进行检测。
鉴定结果显示：以锦鲤疱疹病毒（KHV）RT-LAMP引物为引物，KHV DNA出现正常扩增曲线，阴性水对照及CyHV-1、CyHV-2、CVV等都没有扩增曲线（见图1），显示出本发明检测引物及方法具有良好的特异性。
实施例4 灵敏度实验
将已纯化的锦鲤疱疹病毒（KHV）DNA作10倍梯度稀释，用实施例2的操作方法分别对稀释后的锦鲤疱疹病毒（KHV）DNA进行检测。
鉴定结果显示：以KHV引物组为引物，KHV DNA按10倍梯度进行稀释，结果显示100ng/μl到1pg/μl的浓度的KHV DNA有S型扩增曲线，100 fg/μl的浓度及阴性水对照没有扩增。经DNA含量的测量，测得锦鲤疱疹病毒（KHV）引物组能检测到1pg/μl的KHV DNA（见图2）。
以上实施例表明，本发明的方法具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点，适于在各级检测单位和水产养殖用户中进行推广应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心
广州迪澳生物科技有限公司
<120> 锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其检测方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
agtcaccaaa gctcaactg 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
gattccgatg ccgatgaa 18
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
ttgaatcgct cagcgtctac gcctgatgaa caaggtgcc 39
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
ccgctgacga tgggcatttg agatcaaagt tgggatcg 38
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 5
cttgacgagg agcttgct 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 6
gcacgccatg tactccaa 18
Claims (8)
1.一种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物：
KHV-F3：AGTCACCAAAGCTCAACTG（SEQ ID NO:1）；
KHV-B3：GATTCCGATGCCGATGAA（SEQ ID NO:2）；
内引物：
KHV-FIP：TTGAATCGCTCAGCGTCTACGCCTGATGAACAAGGTGCC（SEQ ID NO:3）；
KHV-BIP：CCGCTGACGATGGGCATTTGAGATCAAAGTTGGGATCG（SEQ ID NO:4）；
环引物：
KHV-LF：CTTGACGAGGAGCTTGCT（SEQ ID NO:5）；
KHV-LB：GCACGCCATGTACTCCAA（SEQ ID NO:6）。
2.一种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：该检测试剂盒包括权利要求1所述的检测引物组。
3.根据权利要求2所述的锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：该检测试剂盒包含权利要求1所述的引物组、DNA聚合酶、RT-LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。
4.根据权利要求3所述的锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：外引物、内引物、环引物的摩尔比为1：8：4。
5.根据权利要求3所述的锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
6.根据权利要求3所述的锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述RT-LAMP反应液含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液和10×SYTO-9溶液。
7.根据权利要求3所述的锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为DEPC水。
8.一种锦鲤疱疹病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）待检样品DNA的提取；
2）恒温实时荧光扩增反应：配制25μl反应体系，含有KHV-F3 0.2μM，KHV-B3 0.2μM，KHV-FIP 1.6μM，KHV-BIP 1.6μM，KHV-LF 0.8μM，KHV-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液13.0μl，DNA聚合酶8U，待检DNA 1~100ng，用DEPC水补齐到25μl；然后于63～65℃反应60～90min；
3）结果分析：根据有无S型扩增曲线来判断检测结果；
上述所用到的所有试剂均来自权利要求2~7任一所述的检测试剂盒；
上述检测方法用于非疾病检测或诊断。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105219884A (zh) * | 2015-10-30 | 2016-01-06 | 广东省实验动物监测所 | 猴逆转录病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法 |
| CN105256071A (zh) * | 2015-11-11 | 2016-01-20 | 四川农业大学 | 一种快速检测鲤疱疹病毒iii型的方法 |
| CN105755014A (zh) * | 2016-03-23 | 2016-07-13 | 中国科学院水生生物研究所 | CaHV-TNFR特异基因及应用 |
| CN107287351A (zh) * | 2017-07-13 | 2017-10-24 | 河北农业大学 | 环介导等温扩增结合侧向流动试纸条检测锦鲤疱疹病毒 |
| CN108315487A (zh) * | 2018-04-16 | 2018-07-24 | 福建省农业科学院生物技术研究所 | 一种检测鳗鲡疱疹病毒的引物组、试剂盒及其应用 |
| CN114085931A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-02-25 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 检测鲍疱疹病毒的引物组及其在构建病毒检测方法和试剂盒中的应用 |
-
2015
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105219884A (zh) * | 2015-10-30 | 2016-01-06 | 广东省实验动物监测所 | 猴逆转录病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法 |
| CN105256071A (zh) * | 2015-11-11 | 2016-01-20 | 四川农业大学 | 一种快速检测鲤疱疹病毒iii型的方法 |
| CN105755014A (zh) * | 2016-03-23 | 2016-07-13 | 中国科学院水生生物研究所 | CaHV-TNFR特异基因及应用 |
| CN107287351A (zh) * | 2017-07-13 | 2017-10-24 | 河北农业大学 | 环介导等温扩增结合侧向流动试纸条检测锦鲤疱疹病毒 |
| CN108315487A (zh) * | 2018-04-16 | 2018-07-24 | 福建省农业科学院生物技术研究所 | 一种检测鳗鲡疱疹病毒的引物组、试剂盒及其应用 |
| CN108315487B (zh) * | 2018-04-16 | 2021-06-22 | 福建省农业科学院生物技术研究所 | 一种检测鳗鲡疱疹病毒的引物组、试剂盒及其应用 |
| CN114085931A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-02-25 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 检测鲍疱疹病毒的引物组及其在构建病毒检测方法和试剂盒中的应用 |
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