CN103316615B - 具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备方法，该方法以光子晶体微球为模版，通过水凝胶的模版复制方法制备具有反蛋白石结构的磁性光子晶体水凝胶微球，然后将葡萄糖分子识别单元与所述磁性光子晶体水凝胶微球相结合，葡萄糖分子的有无或多少由光子晶体微球的反射峰位移或者颜色来体现；根据所述磁性微球具有磁性这一特质，进一步利用磁铁使所述磁性微球聚集，提高肉眼对磁性微球颜色观察的准确性。这种基于具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的葡萄糖可视化检测方法具有灵敏度高、特异性强、操作简易、成本低廉、观测准确等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学、分析检测领域，特别是涉及一种葡萄糖可视化检测方法。
背景技术
近10年来，我国糖尿病的发病率逐年上升，已成为仅次于肿瘤、心血管之后第3大危害人们健康的终身性疾病。调查显示，我国糖尿病患病率已经高达9.7%，也就是说每10个成人中约有1个糖尿病患者。未来的若干年内，我国糖尿病患病率还会持续上升。专家预计，到2015年，我国的糖尿病患者将超过6000万。糖尿病造成了严重的经济负担，资料显示，占人口约5%的糖尿病患者消耗了近10%的国家卫生事业费，糖尿病医疗费用的迅速增长，已经造成了严重的社会问题。
糖尿病是可预防可治疗的疾病。及早发现糖尿病并进行科学的治疗不仅是降低糖尿病死亡率和残废率的关键，也是降低社会和糖尿病患者经济负担的关键。然而，现阶段临床上诊断糖尿病依赖于复杂仪器，程序繁琐，再加上定期体检习惯的缺失导致绝大数糖尿病患者不能及早发现患病，延误早期治疗。寻找一种能够方便快捷实时检测葡萄糖浓度的方法已经刻不容缓。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备方法以及使用所述具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球进行葡萄糖可视化检测方法，方便快捷的检测出体液中的葡萄糖浓度，弥补了目前临床上检测葡萄糖需要复杂仪器的缺点。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：
提供一种具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备方法，所述磁性微球通过以下步骤制备得到：
（1）磁性光子晶体水凝胶微球的制备步骤：
将光子晶体微球加入含有磁性纳米粒子的水凝胶前聚体溶液中，再加入引发剂，经固化反应对水凝胶前聚体溶液进行固化，得到磁性光子晶体水凝胶微球，将得到的所述磁性光子晶体水凝胶微球剥落，洗涤之后置于溶剂中去除光子晶体微球模版，两小时后取出用纯水洗涤，而后保存在纯水中；
（2）具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备步骤：
通过化学键偶联的方法，将葡萄糖分子识别单元苯硼酸偶联在步骤（1）中制得的磁性光子晶体水凝胶微球上，制成具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球，将制备好的所述具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球用缓冲液洗涤之后，测定其反射光谱。
在一个较佳实例中，所述的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备方法中所述光子晶体微球由二氧化硅纳米粒子、聚甲基酸甲酯纳米粒子或聚苯乙烯纳米粒子组装而成。
在一个较佳实例中，所述的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备方法中所述水凝胶前聚体为丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、醋酸丁酸纤维素、硅氧烷甲基丙烯酸酯、氟硅甲基丙烯酸酯、全氟醚、N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯或二甲基丙烯酸乙二醇酯中的任意一种或多种混合而成。
在一个较佳实例中，所述的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备方法中所述磁性光子晶体水凝胶微球具有反蛋白石结构。
在一个较佳实例中，所述的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备方法中所述固化反应的方法具体为紫外光照射聚合或使用烘箱进行热固化。
在一个较佳实例中，所述的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备方法中所述化学键偶联方法包括氨基与氨基的反应、氨基与羧基的反应或羧基与羟基的反应。
本发明的另一目的是提供一种葡萄糖可视化检测的方法：
将具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球在缓冲溶液中与葡萄糖溶液混合进行特异性结合反应，反应完毕之后，利用磁铁将游离的磁性微球聚合，比较反应前后磁性微球的颜色或通过测定磁性微球的反射光谱，确定葡萄糖的含量。
在一个较佳实例中，所述的使用具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球进行葡萄糖可视化检测的方法中所述的葡萄糖溶液为泪液、尿液、唾液或汗液。
本发明的有益效果是：
通过本发明制备的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球来检测葡萄糖浓度与现有的临床上检测葡萄糖浓度的方法相比具有以下优点：
（1）本发明以磁性光子晶体水凝胶微球为载体来进行葡萄糖的可视化检测，通过肉眼观察检测泪液、尿液或者唾液中的葡萄糖浓度，无需抽取血液即能有效发现糖尿病患者早期分泌液中葡萄糖浓度上升的症状，方便快捷且具有实时性，大大提高了糖尿病早期发现的可能性。
（2）本发明将葡萄糖分子识别单元与磁性光子晶体水凝胶微球相结合，利用葡萄糖分子识别单元结合葡萄糖分子后化学物理环境的变化导致磁性微球的光子带隙的变化来进行检测，所述光子带隙的变化会带来所述磁性微球颜色的变化，经磁性微球的聚集能轻易被人眼所鉴别，使得检测工具大大简化，检测成本大大降低。
（3）本发明提供的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球使葡萄糖浓度的检测方法简化，消除了抽取血液给人体带来的疼痛，且对人体无任何副作用。
附图说明
图1是本发明中使用具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球进行葡萄糖可视化检测的示意图；
附图中各部件的标记如下：1、具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球，2、葡萄糖溶液，3、磁铁，4、水凝胶，5、磁性纳米粒子，6、葡萄糖分子，7、葡萄糖分子识别单元。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体检测的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，应当可以作出各种修改与变更，因此本发明的保护范围应当视为所附的权力要求书所限定的范围。
图1是本发明中使用具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球进行葡萄糖可视化检测的示意图：制备好的磁性光子晶体水凝胶微球中含有磁性纳米粒子5与水凝胶4，通过化学键偶联的方法将葡萄糖分子识别单元7苯硼酸偶联在所述磁性光子晶体水凝胶微球中，制成具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球1，在进行葡萄糖溶液检测时，将具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球1在缓冲溶液中与葡萄糖溶液2混合进行特异性结合反应，反应完毕之后，利用磁铁3将游离的磁性微球聚合，比较反应前后磁性微球的颜色或通过测定磁性微球的反射光谱，确定葡萄糖的含量。
实施例1 使用所述磁性微球检测泪液中的葡萄糖含量：
（1）制备光子晶体微球
将单分散的280 nm的二氧化硅纳米粒子进行离心纯化，调节纳米粒子溶液中的胶体纳米粒子的质量百分数为20%，超声分散后作为微流控中的水相，外相采用含有表面活性剂的正十六烷，收集产生的液滴，待其加热固化后，放入马弗炉内进行800℃煅烧，以提高光子晶体微球的稳定性。
（2）制备磁性光子晶体水凝胶微球
磁性光子晶体水凝胶微球以步骤（1）中制备的光子晶体微球为模版，通过模版复制的方法来获得。将光子晶体微球加入含有光引发剂1173(0.1%，质量体积比)以及单分散的100nm的Fe3O4纳米粒子的丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的混合溶液中(29:1，摩尔比)，充分浸泡后，经高压汞灯照射15min后得磁性光子晶体水凝胶微球，将所得到的磁性光子晶体水凝胶微球剥落，洗涤后置于溶剂中2h，获得反蛋白石结构的磁性光子晶体水凝胶微球。
（3） 葡萄糖分子识别单元的修饰
将步骤（2）所制备的磁性光子晶体水凝胶微球在0.1M的NaOH（10% N,N,N',N'-四甲基乙二胺）溶液中还原1h后，用2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液洗涤，在MES缓冲液中加入1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化还原后，加入葡萄糖分子识别单元苯硼酸偶联制成葡萄糖分子修饰的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球，用磷酸盐缓冲液洗涤之后，测定所述磁性微球的反射光谱。
（4） 葡萄糖分子检测
将制备得到的具有可视化检测功能的磁性微球用三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲溶液洗涤后，在0.5 ml的Tris缓冲液中与待测泪液混合，35℃反应1h。反应完毕后，用磁铁使游离的磁性微球聚集，根据反应前后磁性微球的颜色或通过测定磁性微球的反射光谱，确定泪液中葡萄糖的含量。
实施例2 使用所述磁性微球检测尿液中的葡萄糖含量
（1）制备光子晶体微球
将单分散的200 nm的二氧化硅纳米粒子进行离心纯化，调节纳米粒子溶液中胶体纳米粒子的质量百分数为35%，超声分散后作为微流控中的水相，外相采用含有表面活性剂的硅油，收集产生的液滴，待其加热固化后，放入马弗炉内进行800℃煅烧以提高光子晶体微球的稳定性。
（2）制备磁性光子晶体水凝胶微球
磁性光子晶体水凝胶微球以步骤（1）中制备的光子晶体微球为模版，通过模版复制的方法来获得。将光子晶体微球加入含有光引发剂HMPP(0.1%，质量体积比) 以及单分散的80nm的Fe3O4纳米粒子的15%的聚乙二醇双丙烯酸酯溶液中，充分浸泡后，经高压汞灯照射1 min后得磁性光子晶体水凝胶微球，将所得到的磁性光子晶体水凝胶微球剥落，洗涤后置于溶剂中2h，获得反蛋白石结构的磁性光子晶体水凝胶微球。
（3）葡萄糖分子识别单元的修饰
将步骤（2）所制备的磁性光子晶体水凝胶微球在0.1M的NaOH（10% N,N,N',N'-四甲基乙二胺）溶液中还原1h后，用2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液洗涤，在MES缓冲液中加入1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化还原后，加入葡萄糖分子识别单元苯硼酸偶联制成葡萄糖分子修饰的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球，用磷酸盐缓冲液洗涤之后，测定磁性微球的反射光谱。
（4）葡萄糖分子检测
将制备得到的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球用磷酸盐缓冲液洗涤后，在0.5 ml的磷酸盐缓冲液中与待测尿液混合，35℃反应1h。反应完毕后，用磁铁使游离的磁性微球聚集，根据反应前后磁性微球的颜色或通过测定磁性微球的反射光谱，确定尿液中葡萄糖的含量。
实施例3 使用所述磁性微球检测唾液中的葡萄糖含量
（1） 制备光子晶体微球
将单分散的180 nm的二氧化硅纳米粒子进行离心纯化，调节纳米粒子溶液中胶体纳米粒子的质量百分数为30%，超声分散后作为微流控中的水相，外相采用含有表面活性剂的正十六烷，收集产生的液滴，待其加热固化后，放入马弗炉内进行800℃煅烧以提高光子晶体微球的稳定性。
（2）制备磁性光子晶体水凝胶微球
磁性光子晶体水凝胶微球以步骤（1）中制备的光子晶体微球为模版，通过模版复制的方法来获得。将光子晶体微球加入含有光引发剂HMPP(0.1%，质量体积比) 以及单分散的100nm的Ni纳米粒子的聚乙二醇双丙烯酸酯与丙烯酸的溶液中，充分浸泡后，经高压汞灯照射8 min后得磁性光子晶体水凝胶微球，将所得到的磁性光子晶体水凝胶微球剥落，洗涤后置于溶剂中2 h，获得反蛋白石结构的磁性光子晶体水凝胶微球。
（3） 葡萄糖分子识别单元的修饰
将步骤（2）所制备的磁性光子晶体水凝胶微球在0.1M的NaOH（10% N,N,N',N'-四甲基乙二胺）溶液中还原1h后，用2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液洗涤，在MES缓冲液中加入1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化还原后，加入葡萄糖分子识别单元苯硼酸偶联制成葡萄糖分子修饰的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球，用磷酸盐缓冲液洗涤之后，测定磁性微球的反射光谱。
（4） 葡萄糖分子检测
将制备得到的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球用磷酸盐缓冲液洗涤后，在0.5 ml的磷酸盐缓冲液中与待测唾液混合，35℃反应0.5 h。反应完毕后，用磁铁使游离的磁性微球聚集，根据反应前后磁性微球的颜色或通过测定磁性微球的反射光谱，确定唾液中葡萄糖的含量。
实施例4 使用所述磁性微球检测汗液中的葡萄糖含量
（1）制备光子晶体微球
将单分散的160 nm的聚苯乙烯纳米粒子进行离心纯化，调节纳米粒子溶液中胶体纳米粒子的质量百分数为50%，超声分散后作为微流控中的水相，外相采用含有表面活性剂的正十六烷，收集产生的液滴，待其加热固化后，放入马弗炉内进行800℃煅烧以提高光子晶体微球的稳定性。
（2）制备磁性光子晶体水凝胶微球
磁性光子晶体水凝胶微球以步骤（1）中制备的光子晶体微球为模版，通过模版复制的方法来获得。将光子晶体微球加入含有热引发剂过硫酸铵、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(0.1%，质量体积比)以及单分散的80nm的Ni纳米粒子的N-异丙基丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的混合溶液中(29:1，摩尔比)，充分浸泡后，经室温聚合30 min后得磁性光子晶体水凝胶微球，将所得到的磁性光子晶体水凝胶微球剥落，洗涤后置于溶剂中2 h，获得反蛋白石结构的磁性光子晶体水凝胶微球。
（3） 葡萄糖分子识别单元的修饰
将第二步所制备的光子晶体水凝胶微球在0.1 M的NaOH（10% N,N,N',N'-四甲基乙二胺）溶液中还原1h后，用2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液洗涤，在MES缓冲液中加入1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化还原后，加入葡萄糖分子识别单元苯硼酸偶联制成葡萄糖分子修饰的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球，用磷酸盐缓冲液洗涤之后，测定磁性微球的反射光谱。
（4） 葡萄糖分子检测
将制备得到的磁性微球用三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲溶液洗涤后，在0.5 ml的Tris缓冲液中与待测汗液混合，35℃反应1 h。反应完毕后，用磁铁使游离的磁性微球聚集，根据反应前后磁性微球的颜色或通过测定磁性微球的反射光谱，确定汗液中葡萄糖的含量。
Claims (6)
1.一种具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备方法，其特征在于，所述磁性微球通过以下步骤制备得到：
（1）磁性光子晶体水凝胶微球的制备步骤：
将光子晶体微球加入含有磁性纳米粒子的水凝胶前聚体溶液中，再加入引发剂，经固化反应对水凝胶前聚体溶液进行固化，得到磁性光子晶体水凝胶微球，将得到的所述磁性光子晶体水凝胶微球剥落，洗涤之后置于溶剂中去除光子晶体微球模版，两小时后取出用纯水洗涤，而后保存在纯水中；
（2）具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备步骤：
通过化学键偶联的方法，将葡萄糖分子识别单元苯硼酸偶联在步骤（1）中制得的磁性光子晶体水凝胶微球上，制成具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球，将制备好的所述具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球用缓冲液洗涤之后，测定其反射光谱。
2.根据权利要求1所述的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备方法，其特征在于，所述光子晶体微球由二氧化硅纳米粒子、聚甲基酸甲酯纳米粒子或聚苯乙烯纳米粒子组装而成。
3.根据权利要求1所述的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备方法，其特征在于，所述水凝胶前聚体为丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、醋酸丁酸纤维素、硅氧烷甲基丙烯酸酯、氟硅甲基丙烯酸酯、全氟醚、N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯或二甲基丙烯酸乙二醇酯中的任意一种或多种混合而成。
4.根据权利要求1所述的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备方法，其特征在于，所述磁性光子晶体水凝胶微球具有反蛋白石结构。
5.根据权利要求1所述的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备方法，其特征在于，所述固化反应的方法具体为紫外光照射聚合或使用烘箱进行热固化。
6.根据权利要求1所述的具有葡萄糖可视化检测功能的磁性微球的制备方法，其特征在于，所述化学键偶联方法包括氨基与氨基的反应、氨基与羧基的反应或羧基与羟基的反应。
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