CN111440355B - 一种用于膀胱癌蛋白多元分析的磁性结构色水凝胶微载体制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于膀胱癌蛋白多元分析的磁性结构色水凝胶微载体制备方法及应用，以二氧化硅光子晶体微结构为模板，通过在纳米粒子孔隙中填充力学性能佳的水凝胶，固化后除去模板得到具有反蛋白石结构的微载体；配置混合有磁性纳米粒子的功能性预凝胶并灌注于反蛋白石结构的空隙，经紫外光聚合得到与模板相似的周期性有序的磁性结构色水凝胶微载体。本发明具有制备成本低，重复性好，操作简便等优点，制备的磁性结构色水凝胶微载体有抗非特异性蛋白结合、供给探针偶联活性基团、定向磁控效应等特征，除具有液相芯片的编码稳定性好及灵活度高等性能外，用于膀胱癌蛋白多元分析还具有灵敏度、特异性高的性能优势。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种用于膀胱癌蛋白多元分析的磁性结构色水凝胶微载体制备方法及应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，目前在全球范围内其发病率及病死率居常见肿瘤的前列，严重威胁生命健康。膀胱癌具有明显的多中心发生特点且复发普遍。因此，有效的早期诊断和预后监测方法对膀胱癌的诊断和治疗具有重要意义。其中，检测肿瘤蛋白标志物的方法具有预测肿瘤进展，评估肿瘤恶性程度的潜力。
目前，临床实验室常用的肿瘤蛋白标志物定量测定方法包括酶联免疫分析法、电化学发光法等。然而，这些诊断技术存在的共同缺点是单次检测仅针对单个生物标志物且检测成本高，通量低，难以满足临床诊疗的需求。现有多路分析技术如传统的固相芯片及微阵列，通过将探针分子固定在平面基底上，根据其排列位置进行编码，亦存在空间位阻大，易交叉污染，重复性差等缺陷。
为解决上述问题，用作微编码载体的光子晶体微载体被开发出来。光子晶体的周期性有序纳米结构可产生光子带隙效应，从而呈现明亮的结构色，其特征性反射峰用于多元分析的编码元素。其优良的光谱学特征，在生物多元编码中具有良好的稳定性，同时又具有液相编码的灵活度高的优势。
发明内容
本发明的目在于解决传统固相芯片空间位阻大、易造成交叉污染、重复性较差的缺点，提供一种用于膀胱癌蛋白多元分析的磁性结构色水凝胶微载体制备方法及应用，以光子晶体微载体为模板构建反蛋白石支架，配制含有磁性纳米粒子的预凝胶并灌注于反蛋白石支架的连通孔隙中以制备磁性结构色水凝胶微载体。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种用于膀胱癌蛋白多元分析的磁性结构色水凝胶微载体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：以单分散二氧化硅纳米颗粒悬浮液为内相，以二甲基氟化硅油为外相，将所述外相和内相注入至微流控装置的相应通道中，经微流控装置的输出通道，收集在容器中，经固化结晶形成二氧化硅光子晶体微球；然后将二氧化硅光子晶体微球收集于坩埚中，用正己烷对微球进行多次清洗，清洗完毕后将正己烷完全吸除，将坩埚放置于马弗炉内进行高温处理，得到编码微载体模板；
S2：将步骤S1制备的编码微载体模板浸于乙二醇二甲基丙烯酸的溶液中，经光聚合固化、剥离、腐蚀得到具有反蛋白石结构的微球；
S3：配置混合有磁性纳米粒子的功能性预凝胶，灌注至步骤S2制备的具有反蛋白石结构的微球中，经光聚合后得到磁性结构色水凝胶微载体，所述磁性结构色水凝胶微载体集合光子晶体编码与定向磁控效应于一体，实现生物分子编码及多元分析。
为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：
上述步骤S1中，外相和内相在微流控装置相应通道中的流速分别为3.0 mL/h和1.5 mL/h。
上述步骤S1中，所述单分散二氧化硅纳米颗粒悬浮液中二氧化硅纳米颗粒的浓度为20m/v%；其中，二氧化硅纳米颗粒的粒径包括215nm，237nm和247nm中的任一种，二氧化硅纳米颗粒分散在乙醇中。根据单分散二氧化硅纳米颗粒的粒径，通过布拉格衍射方程可以计算出制备得到的光子晶体微球的反射峰波长。
上述步骤S3中，所述的功能性预凝胶由聚乙二醇双丙烯酸酯、丙烯酸、Fe3O4纳米粒子以及光引发剂组成；其中，所述聚乙二醇双丙烯酸酯的浓度为10~30 v/v%，所述丙烯酸的浓度为0~20 v/v%，所述Fe3O4纳米粒子的浓度为Fe3O4 为1~8 m/v%，所述光引发剂的浓度为0.1m/v%。
上述步骤S3后，对制备的磁性结构色水凝胶微载体表面进行探针分子修饰，通过双抗体夹心原理对膀胱癌蛋白进行捕获和标记，并通过荧光显微镜对所述膀胱癌蛋白进行多元分析。编码信号用于标志物识别，荧光强度用于标志物定量，从而实现磁性结构色水凝胶微载体对膀胱癌蛋白的多元分析。
上述膀胱癌蛋白包括BTA蛋白分子、NMP22蛋白分子或FDP蛋白分子中任一种。
上述分子包括抗BTA抗体、抗NMP22抗体或抗FDP抗体中的任一种；其中，探针分子的浓度为0.001~0.5mg/mL，探针分子捕获膀胱癌蛋白的反应时间为20~120min。
本发明还保护所述的方法制备的磁性结构色水凝胶微载体在制备用于膀胱癌蛋白标记材料中的应用。
本发明的有益效果在于：
1）本发明基于微流控技术，以二氧化硅光子晶体微球作为微载体模板，制备方法简便，快速高效，可针对其应用及功能要求对微载体制备方法进行调控。
2）本发明应用液相编码，具有稳定性好，灵活度高的优势，为生物多元分析提供了高效的方法。
3）本发明制备的磁性结构色水凝胶微载体，有抗非特异性蛋白结合、供给探针偶联活性基团、定向磁控效应等特征，除具有液相芯片的编码稳定性好及灵活度高等性能外，用于膀胱癌蛋白多元分析还具有灵敏度、特异性高的性能优势。
附图说明
图1为本发明磁性结构色水凝胶微载体的制备流程示意图。
图2为本发明磁性结构色水凝胶微载体的纳米微结构表征图。
图3为聚乙二醇双丙烯酸酯浓度随编码信号强度变化示意图。
图4为丙烯酸浓度随编码信号强度变化示意图。
图5为抗体探针稀释梯度随荧光强度变化示意图。
图6为探针分子捕获膀胱癌蛋白的反应时间随荧光强度变化示意图。
图7为磁性结构色水凝胶微载体用于膀胱癌蛋白标志物多元分析的性能表征图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例中未注明具体条件的，按照本领域熟知的常规条件或制造商建议的条件进行，所用仪器或试剂未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
磁性结构色水凝胶微载体的制备
（1）参见图1的制备过程，分别选择粒径为215nm的二氧化硅纳米颗粒，配置浓度为20 m/v%的单分散二氧化硅纳米颗粒悬浮液作为内相，以二甲基氟化硅油（50cSt）为外相，将外相和内相注入至微流控装置的相应通道中，经微流控装置的输出通道，收集在容器中，在65℃下，所述二氧化硅纳米颗粒的液滴随水分蒸发而自组装，经12h固化结晶形成二氧化硅光子晶体微球；升温至95℃对所述二氧化硅光子晶体微球固化2h；然后将二氧化硅光子晶体微球收集于坩埚中，用正己烷对微球进行多次清洗，清洗完毕后将正己烷完全吸除，将坩埚缓慢放置于马弗炉内进行高温处理，以提高其机械稳定性，得到编码微载体模板；
（2）利用制备的编码微载体模板，经酒精脱水干燥为乳白色，浸于100v/v%的乙二醇二甲基丙烯酸的溶液中，加入0.1m/v%光引发剂，通过紫外光照射30s使水凝胶固化；转移至洁净的培养皿中，置于显微镜下从固化的水凝胶中将微球剥离出来；收集于EP管中，使用低浓度的氢氟酸溶液对模板进行腐蚀，得到具有反蛋白石结构的微球；
（3）取20v/v%的聚乙二醇双丙烯酸酯、15 v/v%的丙烯酸、4 m/v%的Fe3O4纳米粒子以及0.1 m/v%光引发剂，加入到去离子水中配置得到混合有磁性纳米粒子的功能性预凝胶，将具有反蛋白石结构的微球浸泡于功能性预凝胶中，直到反蛋白石结构的连通孔隙填充完整，在紫外光照射30s使水凝胶固化，得到磁性结构色水凝胶微载体。
参见图2，a图为光子晶体微载体的SEM表征；b图为反蛋白石结构SEM表征；c图为磁性结构色水凝胶微载体SEM表征，由图可知，二氧化硅光子晶体微球内部呈现周期性有序的纳米结构，以此为模板复制制备的水凝胶具有类似的高度有序的反蛋白石结构；随着功能性预凝胶的再灌注，微载体的平均折射率随之改变，但仍具有周期有序性的纳米排列，作为光子晶体通过光子禁带原理而发挥其编码效应的结构基础。
实施例2
磁性结构色水凝胶微载体的制备
（1）参见图1的制备过程，分别选择粒径为237nm的二氧化硅纳米颗粒，配置浓度为20 m/v%的单分散二氧化硅纳米颗粒悬浮液作为内相，以二甲基氟化硅油（50cSt）为外相，将外相和内相注入至微流控装置的相应通道中，经微流控装置的输出通道，收集在容器中，在65℃下，所述二氧化硅纳米颗粒的液滴随水分蒸发而自组装，经12h固化结晶形成二氧化硅光子晶体微球；升温至95℃对所述二氧化硅光子晶体微球固化2h；然后将二氧化硅光子晶体微球收集于坩埚中，用正己烷对微球进行多次清洗，清洗完毕后将正己烷完全吸除，将坩埚缓慢放置于马弗炉内进行高温处理，以提高其机械稳定性，得到编码微载体模板；
（2）利用制备的编码微载体模板，经酒精脱水干燥为乳白色，浸于100v/v%的乙二醇二甲基丙烯酸的溶液中，加入0.1m/v%光引发剂，通过紫外光照射30s使水凝胶固化；转移至洁净的培养皿中，置于显微镜下从固化的水凝胶中将微球剥离出来；收集于EP管中，使用低浓度的氢氟酸溶液对模板进行腐蚀，得到具有反蛋白石结构的微球；
（3）取10v/v%的聚乙二醇双丙烯酸酯、20 v/v%的丙烯酸、1m/v%的Fe3O4纳米粒子以及0.1m/v%光引发剂，加入到去离子水中配置得到混合有磁性纳米粒子的功能性预凝胶，将具有反蛋白石结构的微球浸泡于功能性预凝胶中，直到反蛋白石结构的连通孔隙填充完整，在紫外光照射30s使水凝胶固化，得到磁性结构色水凝胶微载体。
实施例3
磁性结构色水凝胶微载体的制备
（1）参见图1的制备过程，分别选择粒径为247nm的二氧化硅纳米颗粒，配置浓度为20 m/v%的单分散二氧化硅纳米颗粒悬浮液作为内相，以二甲基氟化硅油（50cSt）为外相，将外相和内相注入至微流控装置的相应通道中，经微流控装置的输出通道，收集在容器中，在65℃下，所述二氧化硅纳米颗粒的液滴随水分蒸发而自组装，经12h固化结晶形成二氧化硅光子晶体微球；升温至95℃对所述二氧化硅光子晶体微球固化2h；然后将二氧化硅光子晶体微球收集于坩埚中，用正己烷对微球进行多次清洗，清洗完毕后将正己烷完全吸除，将坩埚缓慢放置于马弗炉内进行高温处理，以提高其机械稳定性，得到编码微载体模板；
（2）利用制备的编码微载体模板，经酒精脱水干燥为乳白色，浸于100v/v%的乙二醇二甲基丙烯酸的溶液中，加入0.1m/v%光引发剂，通过紫外光照射30s使水凝胶固化；转移至洁净的培养皿中，置于显微镜下从固化的水凝胶中将微球剥离出来；收集于EP管中，使用低浓度的氢氟酸溶液对模板进行腐蚀，得到具有反蛋白石结构的微球；
（3）取30v/v%的聚乙二醇双丙烯酸酯、8 m/v%的Fe3O4纳米粒子以及0.1m/v%光引发剂，加入到去离子水中配置得到混合有磁性纳米粒子的功能性预凝胶，将具有反蛋白石结构的微球浸泡于功能性预凝胶中，直到反蛋白石结构的连通孔隙填充完整，在紫外光照射30s使水凝胶固化，得到磁性结构色水凝胶微载体。
实验例
磁性结构色水凝胶微载体的制备影响其生物相容性及磁控效应，通过比较水凝胶构建过程中的工作条件，以优化磁性结构色水凝胶微载体的生物分析性能。参见图3，随所述聚乙二醇双丙烯酸酯的浓度增加，磁性结构色水凝胶微载体的编码信号强度会相应地降低；参见图4，随所述丙烯酸浓度的增加，所述磁性结构色水凝胶微载体的编码信号强度会相应地增强；所述Fe3O4纳米粒子的浓度多少将直接改变所述磁性结构色水凝胶微载体的磁效应，通过肉眼宏观上判断其震动的频率可知，在一定范围内增加所述Fe3O4纳米粒子的浓度比例，所述磁性结构色水凝胶微载体的定向磁控效应相应增强；通过设置聚乙二醇双丙烯酸酯、丙烯酸及Fe3O4纳米粒子的比例，检测其编码信号强度作为优选标准，同时结合其在灌注反蛋白石结构中的扩散效率及力学性能，以20 v/v%的PEGDA、15 v/v%的AA及4 m/v%的Fe3O4纳米粒子作为检测平台构建的优选条件。
应用例
对制备的磁性结构色水凝胶微载体表面进行探针分子修饰，通过双抗体夹心原理对膀胱癌蛋白进行捕获和标记，并通过荧光显微镜对所述膀胱癌蛋白进行多元分析。膀胱癌蛋白选择获FDA批准应用于临床肿瘤标志物的BTA、NMP22及FDP三种蛋白分子；探针分子包括抗BTA抗体、抗NMP22抗体及抗FDP抗体，用以捕获所述膀胱癌蛋白BTA、NMP22及FDP。
将磁性结构色水凝胶微载体经过APTES氨基化、丁二酸酐羧基化后，在MES（pH6.0）缓冲液中，经NHS和EDC活化羧基，与目标蛋白抗体Anti-BTA、Anti-NMP22及Anti-FDP的氨基发生共价反应将抗体修饰到微载体上。参见图5和图6，设置抗体探针稀释梯度0.001~0.5mg/mL，及探针分子捕获膀胱癌蛋白的反应时间20~120min，测定不同实验条件下的信号强度以作为优化标准。选取探针抗体浓度0.01 mg/mL，蛋白标志物反应时间60min作为磁性结构色水凝胶微载体的生物分析优选条件。
参见图7，在经过优化的条件下，对膀胱癌蛋白标志物BTA、NMP22及FDP进行定量添加，其浓度梯度设置为0.001ng/mL~0.01 mg/mL，通过浓度-信号强度相关性分析，拟合平台的检测曲线。随着蛋白标志物浓度升高，检测信号强度相应增加，当蛋白标志物BTA、NMP22及FDP浓度从1.0 ng/mL增至1000 ng/mL，浓度-信号强度相关系数R2分别为0.9970、0.9925及0.9912。同时，在蛋白标志物的多元分析中，交叉反应性的评价通过增加检测溶液中其他蛋白标志物的浓度（0 ng/mL~100 ng/mL），分析特定标志物（20 ng/mL）的信号强度变化幅度≤5%，表明该体系多元分析的交叉反应不影响系统的检测特异性。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于膀胱癌蛋白多元分析的磁性结构色水凝胶微载体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：以单分散二氧化硅纳米颗粒悬浮液为内相，以二甲基氟化硅油为外相，将所述外相和内相注入至微流控装置的相应通道中，经微流控装置的输出通道，收集在容器中，经固化结晶形成二氧化硅光子晶体微球；然后将二氧化硅光子晶体微球收集于坩埚中，用正己烷对微球进行多次清洗，清洗完毕后将正己烷完全吸除，将坩埚放置于马弗炉内进行高温处理，得到编码微载体模板；
S2：将步骤S1制备的编码微载体模板浸于乙二醇二甲基丙烯酸的溶液中，经光聚合固化、剥离、腐蚀得到具有反蛋白石结构的微球；
S3：配置混合有磁性纳米粒子的功能性预凝胶，灌注至步骤S2制备的具有反蛋白石结构的微球中，经光聚合后得到磁性结构色水凝胶微载体，所述的功能性预凝胶由聚乙二醇双丙烯酸酯、丙烯酸、Fe3O4纳米粒子以及光引发剂组成；其中，所述聚乙二醇双丙烯酸酯的浓度为10~30v/v%，所述丙烯酸的浓度为0~20 v/v%，所述Fe3O4纳米粒子的浓度为Fe3O4 为1~8 m/v%，所述光引发剂的浓度为0.1 m/v%。
2.根据权利要求1所述的一种用于膀胱癌蛋白多元分析的磁性结构色水凝胶微载体制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，外相和内相在微流控装置相应通道中的流速分别为3.0 mL/h和0.5 mL/h。
3.根据权利要求1所述的一种用于膀胱癌蛋白多元分析的磁性结构色水凝胶微载体制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述单分散二氧化硅纳米颗粒悬浮液中二氧化硅纳米颗粒的浓度为20m/v%；其中，二氧化硅纳米颗粒的粒径包括215nm，237nm和247nm中的任一种，二氧化硅纳米颗粒分散在乙醇中。
4.根据权利要求1所述的一种用于膀胱癌蛋白多元分析的磁性结构色水凝胶微载体制备方法，其特征在于：步骤S3后，对制备的磁性结构色水凝胶微载体表面进行探针分子修饰，通过双抗体夹心原理对膀胱癌蛋白进行捕获和标记，并通过荧光显微镜对所述膀胱癌蛋白进行多元分析。
5.根据权利要求4所述的一种用于膀胱癌蛋白多元分析的磁性结构色水凝胶微载体制备方法，其特征在于：所述膀胱癌蛋白包括BTA蛋白分子、NMP22蛋白分子或FDP蛋白分子中任一种。
6.根据权利要求5所述的一种用于膀胱癌蛋白多元分析的磁性结构色水凝胶微载体制备方法，其特征在于：探针分子包括抗BTA抗体、抗NMP22抗体或抗FDP抗体中的任一种；其中，探针分子的浓度为0.001~0.5mg/mL，探针分子捕获膀胱癌蛋白的反应时间为20~120min。
7.权利要求1所述的方法制备的磁性结构色水凝胶微载体在制备用于膀胱癌蛋白标记材料中的应用，其特征在于，在所述磁性结构色水凝胶微载体表面进行探针分子修饰，通过双抗体夹心原理对膀胱癌蛋白进行捕获和标记，并通过荧光显微镜对所述膀胱癌蛋白进行多元分析，所述探针分子包括抗BTA抗体、抗NMP22抗体或抗FDP抗体中的任一种；所述膀胱癌蛋白包括BTA蛋白分子、NMP22蛋白分子或FDP蛋白分子中任一种，其中，探针分子的浓度为0.001~0.5mg/mL，探针分子捕获膀胱癌蛋白的反应时间为20~120min。
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