CN103275907B - 一种解淀粉芽胞杆菌及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌及制备方法和应用，一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）H6，保藏编号为：CCTCC NO：M2013249。所述的解淀粉芽孢杆菌对革兰氏阳性和阴性治病菌具有明显的生长抑制作用，并且具有很强的淀粉、蛋白及纤维素降解能力，环境耐受性强；在畜禽养殖饲喂中有很好的防治腹泻和促进生长效果，并且大剂量喂食不会产生不利作用；培养条件简单、成本低廉，具有良好的开发应用前景。

Description

一种解淀粉芽胞杆菌及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及动物饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）H6，还涉及一种解淀粉芽胞杆菌H6的制备方法，还涉及一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）H6在制备动物饲料添加剂中的应用。

背景技术

在饲料中全面禁止添加抗生素是全世界的发展趋势：欧盟于2006年正式禁止在饲料中添加任何抗生素；韩国于2010年开始禁止饲用抗生素的使用；日本和美国等国家也对饲料中添加的抗生素做了严格限制；停止使用抗生素饲料添加剂，必须要选择可以替代抗生素饲料添加剂的替代品，以保证畜牧业生产的效率与效益不受影响。在这种情况下，最有希望作为抗生素代用品饲料添加剂——微生物制剂的开发便随之引起各国重视。最早研究和应用畜禽微生态制剂的历史可以追溯到1947年，蒙哈德（Mollgaard）首先发现使用乳酸杆菌饲喂仔猪可有效的增加仔猪的体重并改善仔猪的身体健康。然而20世纪50、60年代正是抗生素研究、生产和使用的黄金时期，导致微生态制剂研究和开发工作处于低潮，一段时期以来没有受到足够的重视，直到80年代中期情况才有了根本性的扭转。近年来欧美诸国相继研制了许多微生物制剂，基本构思是用人畜正常微生物成员，经过人工繁殖，制成活菌制剂，然后再使其回到本来的生活环境，发挥其自然的生理作用。美国食品药物管理局和美国饲料管理协会1989年就公布了43种“可直接饲喂且通常认为是安全的微生物(GRAS)”作为微生态制剂的出发菌株，各国研发人员在此基础上开发出了丰富多样产品种类。尽管我国对微生物制剂的研究和应用比发达国家起步晚，但起点较高。仅在短短的几年里，微生物制剂的开发和应用对促进我国畜牧业的发展发挥了积极地作用，且潜力很大。其应用不但使得动物生长发育加快、疾病减少、饲料报酬增高，而且畜禽产品的品质也好了，避免了抗菌药物等兽药在动物体内的残留。因此，可以说，微生物制剂是畜禽的绿色食品。另一方面，从我国的经济发展状况看，发展微生物制剂应受到应有的重视。我国农业部于2008年公布了16种可直接使用的微生物饲料添加剂菌种，主要以乳酸菌、粪链球菌、芽孢杆菌、酵母菌、片球菌和光合细菌等为主；另外，嗜热链球菌和地衣芽孢杆菌还处在新饲料添加剂的保护期内。我国的动物专用抗生素品种较少，而且研究开发新的兽用抗生素的难度较大、成本高、周期长，相比之下，微生物制剂的研究和生产相对简单，使用比较安全，符合我国的国情，而且拥有巨大的应用市场。

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是广泛存在于自然界的一种非治病性细菌，在其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物，具有广泛地抑制细菌和真菌的活性，其在农业生产中广泛使用安全性也得到了欧洲食品安全委员会（EFSA）的认可。目前，国内对其应用研究仅局限代替有机农药，抑制植物病原真菌和病毒等生物防治；及降解农业废弃物，抑制水体中藻类生长等环境治理等领域。研究表明，解淀粉芽孢杆菌可以产生多种水解酶类和抗菌、抗病毒蛋白等活性物质，从更广泛的领域利用该菌种的优良性能为人们的生产及生活服务是很有必要的，更进一步丰富我国微生物饲料添加剂菌种资源，满足社会对环境友好化和资源节约化要求越来越高的绿色养殖的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）H6，该细菌已于2013年6月5日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：解淀粉芽孢杆菌H6 Bacillus amyloliquefaciens H6；保藏编号：CCTCCNO.M2013249，地址中国武汉武汉大学。该细菌具有抗菌效果好、酶活力高、抗逆性强的特点，对淀粉、蛋白和纤维素有很强降解力。

本发明还有一个目的在于提供了一种解淀粉芽孢杆菌H6菌粉的制备方法。制备方法简单，易行，适于大规模生产，利用该方法制得的菌粉，其解淀粉芽孢杆菌H6菌粉产量为粉产量为40kg/m³发酵液，活菌量达到4.7×10¹¹cfu/g。

本发明还有一个目的在于提供了一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）H6在制备饲料添加剂中的应用，利用本发明中的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）H6制备的饲料添加剂，可明显预防肠道疾病、改善动物生长特性和净化养殖环境，并且具有安全、有效、成本低廉，的特点。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种解淀粉芽孢杆菌，通过以下步骤筛选得到：

1）从湖北黄陂自然养殖土猪场采集健康猪新鲜粪便，将粪样在营养肉汤（NB）培养基中好氧富集培养浑浊，在80℃水浴锅中处理15min，如此再富集及热筛选一次，适当稀释后涂平板，根据菌落形态挑取典型单菌落（菌落近圆形，3-4.5mm，无光泽，中央隆凸，边缘钝齿状，灰白色），通过镜检粗筛出芽孢杆菌。

2）通过牛津杯抑菌试验筛选对金黄色葡萄球菌（G⁺）、大肠杆菌（G^-）致病菌生长抑制性能好的芽孢杆菌，通过生理生化及16s鉴定，最终筛选到一株解淀粉芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）H6（以下简称H6菌株或H6），该细菌已于2013年6月5日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名:解淀粉芽孢杆菌H6 Bacillusamyloliquefaciens H6保藏编号：CCTCC NO：M2013249，地址中国武汉武汉大学。16SrDNA序列为SEQ ID NO.1所示。

H6菌株具体有典型的解淀粉芽孢杆菌生理生化特征：该菌株在营养琼脂（NA）培养基上繁殖生长形成的菌落为近圆形，3-4.5mm，无光泽，中央隆凸，边缘钝齿状，灰白色，通过镜检G+，菌体杆状，单个排列，芽孢柱状，次端生，孢囊不膨大。生理生化特征为：明胶液化。发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖和麦芽糖，不发酵半乳糖、阿拉伯糖和海藻糖。V.P阳性，M.R.阳性，H₂S弱阳性，脲酶阴性，接触酶阳性，好氧，耐7%NaCl。最适温度28～32℃，最高温度50℃。石蕊牛奶反应产碱，胨化，还原。利用硝酸盐。

NB培养基的配方（1L）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g；NA再加琼脂15g。

一种解淀粉芽孢杆菌H6菌粉的制备方法，其步骤如下：

用接种环挑取解淀粉芽孢杆菌斜面种子，接种NB摇瓶种子培养基，37℃培养7～10h，OD值达到1.0左右。将培养的种子液按1%(V/V)的接种量接种50L发酵罐中放大培养，发酵培养基装液量65%，培养过程中实时在线补加消泡剂，控制溶氧浓度在30%～50%，控温32℃，培养10～12h，OD值达到4.0以上。将放大培养的种子发酵液按10%(V/V)的接种量接种500L发酵罐发酵液中，装液量65%，30℃培养40h左右，实时消泡和控制溶氧，至芽孢形成率达到70%～80%。放罐后经陶瓷膜微滤，在表压0.2～0.3MPa浓缩至原体积1/8～1/4体积，喷雾干燥，得到解淀粉芽孢杆菌菌粉。

发酵培养基配方（1L）：玉米粉10～50g、豆粕粉10～50g、酵母膏5～20g、蛋白胨5～20g、CaCO31～5g、NaCl1～5g、MgSO41～5g、KH₂PO41～5g、聚醚0.5～3ml，在线补加硅油消泡剂。

一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）H6在制备饲料添加剂中的应用：其应用过程为：

将解淀粉芽孢杆菌H6活菌粉或与其他菌剂复合，按0.01%～0.1%（w/w）比例添加到畜禽饲料或饮水中，解淀粉芽胞杆菌菌粉在大剂量动物饲喂中安全性好，在畜禽养殖生产的不同阶段饲喂可以用于改善肠道健康、防止便秘、防治细菌性腹泻、促进肠道吸收从而提高生产和繁殖性能，减轻粪污对环境的污染。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明提供一种抗菌效果好、酶活力高、抗逆性强的解淀粉芽孢杆菌，可以廉价地大规模生产制备和有效使用，部分代替目前对环境和健康造成越来越大威胁的抗生素的使用。

2.本发明所述的解淀粉芽孢杆菌对革兰氏阳性和阴性治病菌具有明显的生长抑制作用，在畜禽肠道中能抑制有害微生物的生长，并且具有很强的淀粉、蛋白及纤维素降解能力，环境耐受性强；在畜禽养殖饲喂中有很好的防治腹泻和促进生长效果，并且大剂量喂食不会产生不利作用；培养条件简单、成本低廉，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为一种解淀粉芽孢杆菌H6芽胞形态示意图。

图2为解淀粉芽孢杆菌H6在发酵罐中的生长曲线图。

具体实施方式

本发明实施例中实验方法及条件如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：

菌株分离

从湖北黄陂某自然养殖土猪场采集健康猪新鲜粪便，将粪样在营养肉汤（NB）培养基中好氧富集培养浑浊，在80℃水浴锅中处理15min，如此再富集及热筛选一次，适当稀释后涂平板，根据菌落形态挑取典型单菌落（菌落近圆形，3-4.5mm，无光泽，中央隆凸，边缘钝齿状，灰白色），通过镜检粗筛出芽孢杆菌。

NB培养基的配方（1L）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15g。

复筛及鉴定

通过牛津杯抑菌试验筛选对金黄色葡萄球菌（G⁺）、大肠杆菌（G^-）等致病菌生长抑制性能好的芽孢杆菌，通过生理生化及16s鉴定，最终筛选到一株解淀粉芽孢杆菌，命名为Bacillus amyloliquefaciens H6。该细菌已于2013年6月5日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：解淀粉芽孢杆菌H6 Bacillus amyloliquefaciens H6保藏编号：CCTCCNO.M2013249，地址中国武汉武汉大学。

H6菌株具体有典型的解淀粉芽孢杆菌生理生化特征：该菌株在NB培养基上繁殖生长形成的菌落为近圆形，3-4.5mm，无光泽，中央隆凸，边缘钝齿状，灰白色，通过镜检G+，菌体杆状，单个排列，芽孢柱状，次端生，孢囊不膨大（图1）。生理生化特征为：明胶液化。发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖和麦芽糖，不发酵半乳糖、阿拉伯糖和海藻糖。V.P阳性，M.R.阳性，H₂S弱阳性，脲酶阴性，接触酶阳性，好氧，耐7%NaCl。最适温度28～32℃，最高温度50℃。石蕊牛奶反应产碱，胨化，还原。利用硝酸盐。

实施例2：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）H6的放大培养

按玉米粉15g/L、豆粕粉20g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨10g/L、CaCO₃3g/L、NaCl5g/L、MgSO₄2g/L、KH₂PO₄3g/L、聚醚2ml/L，以65%（V/V）装液量配制发酵液，经121℃高温蒸汽消毒20min，降温至40℃，向其中接种菌龄10h的种子液1%，在32℃培养，控制搅拌转速维持溶氧（DO值30%以上），在线自动补加消泡剂（硅油）。每2h取样测OD值，发酵24h放罐，平板计数解淀粉芽孢杆菌H6活菌量为1.78×10¹⁰cfu/ml（图2）。

实施例3：解淀粉芽孢杆菌菌粉制备

将实施例2发酵的菌液经振动筛粗过滤除去大的固形物，再经0.2μm陶瓷膜微滤浓缩至原体积的1/6，浓缩液直接用蠕动泵泵人喷雾干燥塔，进口温度180±3℃，出口温度67～70，控制进料流速和加热开关，维持温度平衡，收料后计算菌粉产量为40kg/m³发酵液,平板计数菌粉菌量为4.7×10¹¹cfu/g。

实施例4：H6菌株酶活性检测

准备好淀粉、酪蛋白和纤维素琼脂平板（以上三种培养基均为市售青岛海博商品化培养基），将H6菌株在PA瓶中复苏，取5ul点接于平板上，培养。观察酪素和纤维素平板是否有水解环，往淀粉平板点接菌的四周滴加碘液，观察是否有水解环，并测定水解环直径。

表1H6菌株降解能力

降解平板	淀粉平板	酪蛋白平板	纤维素平板
				降解圈（mm）	26.6	27.53	20.18

实施例5：H6菌株抗逆性检测

热耐受能力：取H6生长末期已完全形成芽胞的培养液离心，0.9%生理盐水洗涤两次后重新悬浮（活均量(1～2×l0⁹cfu/m）于75、80、85、90、95℃水浴中处理15min后，迅速流水冷却，然后采用稀释平板法测定芽抱存活率。

表2H6菌株在不同温度处理下的存活率

温度（℃）	75	80	85	90	95
						存活率（%）	90.5	86.7	73.5	54.8	37.2

取质量分数为10%的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值为2.0，每100mL盐酸溶液中加1g胃蛋白酶，充分溶解后用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，得到人工胃液。取H6生长末期已完全形成芽胞的培养物离心，0.9%生理盐水洗涤两次后重新悬浮，以10⁷cfu/ml终浓度接种于人工胃液中，震荡混匀，37℃水浴孵育，每隔0.5h取样进行活菌计数。

表3H6菌株在模拟胃酸条件下处理活菌量变化

处理时间（h）	0	0.5	1	1.5	2
						菌量（cfu/ml）	1.2*107	10.3*106	8.2*106	7.6*106	5.9*106

配制额外添加1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%（w/v）猪胆盐的NB培养基。取1ml H6菌液(1～2×l0⁸cfu/mL)，接种于9mL不同浓高胆盐浓度NB培养基，37℃培养12h后，测定培养液浊度变化，判定菌体生长情况，见表1.

表4：不同浓度猪胆盐对H6生长的影响

注：++代表生长良好，+代表生长一般，-代表不能生长。

实施例6：H6菌株抑菌能力检测

将已灭菌的NB琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿15ml（下层），待其凝固。此外，将融化的NB培养基冷却到50℃左右混入致病试验菌培养液5ml加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯（内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管的两端要光滑），轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入待检样品（发酵液），牛津杯一般可以装200微升,勿使其外溢。加满后置37℃培养16-18小时，观察结果，抑菌圈用尺直接量就可以。

表5H6对不同致病菌的抑菌圈直径

致病菌	大肠杆菌	巴氏杆菌	鸡白痢沙门氏菌	金黄色葡萄球菌
					抑菌圈（mm）	19.32	15.71	16.01	16.84

实施例7：小鼠安全试验

将60只体重20g左右的昆明小鼠随机分为3组，每组20只，雌雄各半。其中一组做空白对照，实验组一每只按1×10⁹cfu/kg小鼠体重（常规剂量100倍）连续一周灌服H6发酵液，实验组二一次性腹腔注射0.2ml的菌悬液（1×10⁹cfu/ml）。观察一周，记录各组小鼠的生长及死亡情况。所有小鼠饲喂试验均在干燥、清洁、通风良好的室内完成，小鼠均为死亡情况，实验组二小鼠在腹腔注射后两天体重相对较轻，后恢复正常，实验组一小鼠生长情况最好。

表6：小鼠实验称重结果

实验分组	初重（g）	3天称重（g）	7天称重（g）
				对照组	19.3±2.04	20.15±2.37	23.29±2.25
实验组一	20.4±0.35	22.4±0.70	25.30±0.15

实验组二

19.5±2.21

19.8±1.80

23.89±2.28

实施例8：仔猪实验：

选取体重相近的、同批次26日龄仔猪28头，分为4组，每组7头，一组为对照组，实验组A每头按占体重10⁷cfu/kg的菌量拌水灌服，实验组B每头按占体重10⁸cfu/kg的菌量拌水灌服，实验组C每头按占体重10⁹cfu/kg的菌量拌水灌服实验组每天灌一次，连续灌7天，观察21天。自由采食，每日记录精神及采食状况，实验结束时称重。经过20多天的实验观察在大剂量连续灌服下均没有异常反应，采食及生长情况正常，且芽胞杆菌组有较明显的促生长效果。

表7：仔猪灌服不同剂量H6对增重的影响

组别	初体重kg	末体重kg	增重kg	增重率
					空白组	7.20	11.93	4.73	65.6%
实验组A	7.08	12.91	5.83	82.3%
					实验组B	7.13	13.87	6.74	94.5%
实验组C	6.71	12.62	5.91	88.1%

实施例9：妊娠母猪实验

选取同一批次妊娠母猪20头，分为2组，每组10头，一组为对照组，另一组为实验组每头产前一个月到断奶，按猪体重2×10⁷cfu/kg的菌量拌H6菌粉到饲料日粮中喂食，每日观察母猪精神及粪便情况，产后称乳猪初重及产仔存活率。观察到实验组母猪便秘及生产情况明显改善，对照组平均乳猪初重为1.35公斤，产仔数为9.4，而实验组平均乳猪初重为1.42公斤，产仔数为10.1。

实施例10：

选取体重相近的、同批次26日龄仔猪40头（平均体重7公斤左右），分2组，每组20头，对照组饲喂基础日粮，实验组分别将H6菌粉拌入基础日粮饲喂（拌料比为0.03%重量比），每头猪日食入菌量约占体重为2*10⁷cfu/kg，现拌现用，饲喂35天，自由采食，记录日采食量，每周空腹称重。考核指标：腹泻率，料肉比。

表8：防腹泻及增重实验结果

实施例11：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）H6菌剂在育肥仔猪、肉仔鸡及草鱼养殖中的应用效果。

使用实施例3制备的菌粉，分别应用于育肥仔猪、肉仔鸡及草鱼的养殖，均设空白组、抗生素组和H6实验组，每组3个重复，实验期为一个月。其中，空白对照组饲喂基础日粮；抗生素组在基础日粮中添加基础日粮添加杆菌肤锌(有效含量50g/t)和硫酸粘菌素口(有效含量10g/t)，H6实验组添加实验例的菌剂，添加量为100g/t.

表9解淀粉芽孢杆菌H6在育肥仔猪、肉仔鸡及草鱼养殖中的生长促进效果

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉科前动物生物制品有限责任公司

 

<120>  一种解淀粉芽胞杆菌及制备方法和应用

 

<130>  一种解淀粉芽胞杆菌及制备方法和应用

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  1400

<212>  DNA

<213>  Bacillus amyloliquefaciens

 

<400>  1

tgaagcccga aagggagctt gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg     60

 

gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt    120

 

ttgaaccgca tggttcagac ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc    180

 

ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg    240

 

agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag    300

 

tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg    360

 

ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt gccgttcaaa tagggcggca    420

 

ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac    480

 

gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa    540

 

gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag    600

 

tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa    660

 

caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg    720

 

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ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg    840

 

tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt    900

 

ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag    960

 

ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt   1020

 

cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt   1080

 

cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca   1140

 

aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacag aacaaagggc   1200

 

agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg   1260

 

caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat   1320

 

acgttcccgg gccttgtaca caccgcctcg tcacaccacg agagtttgta acacccgaag   1380

 

tcggtgatag tatataagtc                                               1400

 

 

Claims (3)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)H6，CCTCC NO：M2013249。 

2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的菌粉的制备方法，其步骤如下： 

1)用接种环挑取解淀粉芽孢杆菌斜面种子，接种NB摇瓶种子培养基，37℃培养7～10h，O D值达到1.0； 

所述的NB摇瓶种子培养基1L的配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g； 

2)将培养的种子液按1％的接种量接种50L发酵罐中放大培养，发酵培养基装液量65％，培养过程中实时在线补加消泡剂，控制溶氧浓度在30％～50％，控温32℃，培养10～12h，O D值达到4.0； 

3)将放大培养的种子发酵液按10％的接种量接种500L发酵罐发酵液中，装液量65％，30℃培养40h，实时消泡和控制溶氧，至芽孢形成率达到70％～80％； 

4)放罐后经陶瓷膜微滤，在表压0.2～0.3MPa浓缩至原体积1/8～1/4体积，喷雾干燥，得到解淀粉芽孢杆菌菌粉。 

3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌或权利要求2所述的菌粉在在制备动物饲料添加剂中的应用。