CN107319129A

CN107319129A - 一种富含虾青素的发酵豆粕的制备与饲料

Info

Publication number: CN107319129A
Application number: CN201710355273.1A
Authority: CN
Inventors: 刘雪连; 任道平; 刘建莉
Original assignee: Beijing Weinong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Weinong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-05-19
Filing date: 2017-05-19
Publication date: 2017-11-07

Abstract

本发明公开了一种富含虾青素的发酵豆粕的制备与应用方法。本发明以海洋红酵母为主要发酵剂，以豆粕为主要原料，通过发酵液的活化、低水分发酵及后熟、混合、制粒等步骤，制备得到富含虾青素的发酵豆粕及其饲料产品。本发明的工艺流程操作简便，可直接进入饲料生产、加工环节，减少干燥过程的能耗，降低加工成本，并保护发酵过程中产生的虾青素等益生因子，减少发酵豆粕运输环节，便于饲料产品的应用与推广，既适合饲料厂规模化生产，也适合规模养殖场直接生产投喂。本发明的有益效果是：满足了断奶仔猪、哺乳母猪的营养需求，提高动物的免疫力，减少仔猪腹泻的发生，提高了母猪的奶水质量，进而提高了哺乳仔猪的生产性能。

Description

一种富含虾青素的发酵豆粕的制备与饲料

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，同时也涉及饲料技术领域，具体涉及一种富含虾青素的发酵豆粕的制备与饲料。

背景技术

随着养殖业的迅速发展，对蛋白原料的需求日趋增大。而优质蛋白原料如鱼粉等受原料来源，市场供应等多种因素影响，供应量日趋不足。寻找替代鱼粉的新型蛋白源，特别是利用廉价的植物蛋白源部分或者全部替代鱼粉。在众多的植物蛋白源中，豆粕由于蛋白质含量高、价格适宜、供应量充足而成为最好的选择，成为制备畜禽精饲料的基本原料。

发酵豆粕利用生物发酵酶解技术克服了豆粕蛋白在营养学上的弱点，通过有益微生物作用提高了豆粕蛋白的溶解度，利于消化；减小了豆粕中蛋白的分子量，其中的一部分已达到小肽水平甚至氨基酸水平，可以直接被动物吸收；发酵豆粕具有一定的芳香气味和鲜味，有一定的诱食作用，适口性较好；并且豆粕中一些非淀粉性多糖在发酵过程中得到了分解，有利于动物消化。发酵豆粕已广泛地应用于饲料行业，成为替代鱼粉的最佳选择。

菌种开发和酶解技术，直接影响发酵豆粕的质量。发酵豆粕常用的菌种为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、酵母菌等。海洋红酵母是指自然海域中存在的酵母菌，其菌体营养丰富而全面，富含蛋白质、肝糖、不饱和脂肪酸、动物幼体生长激素和以虾青素为主的类胡萝卜素，是优良的虾青素(astaxanthin)生产菌、天然色素源、极具潜力的动物饲料蛋白和食品添加剂。虾青素即3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素，为萜烯类不饱和化合物，具有很强的清除氧自由基、促进抗体产生、增加宿主免疫力以及艳丽红色的作用。虾青素最大的市场是水产养殖业和家禽养殖业，主要用作鱼类和虾蟹等甲壳类动物及家禽的饲料添加剂，能提高仔猪的养分消化率和免疫力，减少腹泻的发生，进而提高仔猪的生产性能，并能够提高哺乳母猪的采食量、奶水质量和哺乳仔猪的日增重。加强研究与开发虾青素和虾青素产品在养猪领域的应用具有非常广阔的前景。

发明内容

本发明公开一种富含虾青素的发酵豆粕，其制备方法与饲料，该制备方法简单、有效地提高豆粕营养成分含量，尤其是提高了发酵豆粕中虾青素的含量。

本发明的一种富含虾青素的发酵豆粕的制备方法技术方案如下：

1)制备富含虾青素的海洋红酵母发酵液；

2)制备协同发酵所用复合发酵菌液；

3)配制发酵底物；

4)将步骤2)所得到的复合发酵菌液接种至步骤3)中的发酵底物中，并调节含水量，混合均匀；

5)将步骤4)接种菌液后的发酵底物在温控的条件下进行发酵，发酵完成即得发酵豆粕。

其中，将海洋红酵母接种至海洋红酵母液体培养基，温度25-30℃，转速为150-250rpm振荡培养44-48小时作为海洋红酵母发酵液；优选的，所述海洋红酵母为胶红酵母CGMCC No.13012。

本发明中的胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)新菌株，已于2016年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13012。

进一步的，所述的海洋红酵母培养基中各成分的浓度为：糖蜜20-30g/L，蛋白胨1.5-2.5g/L，酵母膏1.5-2.5g/L，硫酸铵2.5-5.0g/L，磷酸二氢钾1.0-1.5g/L，一水硫酸镁0.05-0.15g/L，硫酸亚铁0.1-0.15g/L，氯化钠10-15g/L，pH调节至5.5-6.0。

其中，将芽孢杆菌菌粉、乳酸菌菌粉加入活化液中，活化8-10h，制备活化液；

海洋红酵母发酵菌种和活化液以体积比为2:1混合均匀后，形成复合发酵菌液。

其中，所述的活化液含有下述组分：蛋白胨1～5g/L，酵母膏4～9g/L，氯化钠3.5～4.5g/L，红糖9～12g/L，pH调节至6.5-7.0。

其中，所述芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.8148、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC No.2383复配而成，枯草芽孢杆菌的浓度为200亿CFU/g，地衣芽孢杆菌浓度为100亿CFU/g；所述乳酸菌由粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)CGMCC No.2385、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)复配而成，粪肠球菌的浓度为200亿CFU/g，植物乳杆菌为100亿CFU/g。芽孢菌菌粉在活化液中的浓度为：5-10g/L，乳酸菌菌粉的浓度为：5-10g/L。

按下述质量百分比配置发酵底物：豆粕(46％)70-95％，糖蜜1-5％，玉米面3-7％，硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.2％、七水合硫酸镁0.1％、碳酸钙0.1％，酸性蛋白酶0.04～0.05％，纤维素酶0.01～0.03％、淀粉酶0.02～0.04％，混合制得发酵底物；

进一步的，上述的富含虾青素的发酵豆粕的制备方法，所述的酸性蛋白酶的酶活力为50,000IU/g；纤维素酶的活力为6000IU/克，淀粉酶的酶活力为7000IU/g。

将步骤3)所得到的复合发酵菌液接种至步骤4)中的发酵底物中，接种量为3～6％(质量百分数)，并调节含水量至35～50％(质量百分数)混合均匀，

将步骤5)接种菌液后的发酵底物采用吨包或者发酵池的方式，在25℃至45℃的条件下，发酵48-96h后，形成发酵豆粕半成品；

本发明还提供一种富含虾青素的发酵豆粕，其通过上述制备方法得到；所述的发酵豆粕具有较浓郁的酸香味；水分含量35-50％，pH在4.0～5.5，粗蛋白含量25-40％(质量百分数)，较原豆粕粗蛋白含量提高5-15％。发酵后海洋红酵母母菌数1.5×10⁷cfu/g以上，虾青素含量为125.43μg/kg以上，乳酸菌数6.5×10⁸cfu/g以上，芽孢菌数1.0×10⁸cfu/g以上；呕吐毒素较原豆粕降低70～90％。

所述的发酵豆粕具有较浓郁的酸香味；水分含量优选35-42％，pH优选为4.52～5.28，粗蛋白含量优选为35.36～37.25％(质量百分数)，较原豆粕粗蛋白含量提高10.63-16.54％。发酵后海洋红酵母母菌数优选1.5×10⁷～2.5×10⁸cfu/g以上，虾青素含量优选为125.43～547.26μg/kg，乳酸菌数优选为6.5×10⁸～2.1×10⁹cfu/g，芽孢菌数优选为1.2×10⁸-3.5×10⁸cfu/g；呕吐毒素较原豆粕降低75～90％。

进一步的，本发明还提供一种富含虾青素的饲料，其由下述方法制备而成：

将玉米，豆粕经过初筛处理，用2.5mm的筛片将上述原料粉碎成粉状，进入待配料仓，将粉碎后的玉米，豆粕及麸皮，以及所述的富含虾青素的发酵豆粕的制备方法制备的发酵豆粕通过大料配料秤按比例加入混合机，然后分别将鱼粉、磷酸氢钙、石粉、食盐、L-赖氨酸、苏氨酸、复合预混合饲料、氯化胆碱从微量秤或手动称量加入混合机，混合10-15秒后再加入植物油混合均匀后进入待制粒仓进行制粒。

其中，经过120秒的混合时间混合均匀，在蒸汽压0.2Mpa，温度75℃的条件下进行制粒，粉碎粒度为2.0-3.0mm。

与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1采用具有自主知识产权的海洋红酵母菌种，结合了微生物发酵、酶制剂的使用，提高粗蛋白和酸溶蛋白的含量，减少霉菌毒素污染。

2发酵过程中，海洋红酵母和乳酸菌的使用，增加了发酵的酸香味，改善饲料的适口性，提高了动物的采食量，并且，乳酸菌等有益菌对畜禽的肠道起到一定的调节作用。芽孢菌分泌的酶类和抗菌物质，可以提高幼龄动物和母猪的消化率，并能改善动物肠道，对动物生产性能具有促进作用。

3通过海洋红酵母在发酵过程中的使用，增加了发酵豆粕中虾青素的含量，减少仔猪腹泻，并利用虾青素的作用提高动物的免疫力和抗氧化能力，提高仔猪生产性能。

4通过吨包等易于操作的发酵方式，减少占地和人员消耗，对设备的要求不高，制备方法简单易行，节能环保，降低发酵豆粕的使用成本。

5采用低水分发酵工艺，与饲料原料进行配料、混合、调制、制粒、冷却，发酵豆粕半成品直接进入饲料加工环节，减少干燥环节的能耗，以及运输成本，并保护发酵过程中产生的益生因子，便于发酵豆粕在规模养殖场和饲料厂的应用与推广。

本发明的富含虾青素的发酵豆粕在断奶仔猪上应用，能够减少仔猪的腹泻，增强免疫球蛋白的含量，提高动物的免疫力，对动物的生产性能具有促进作用。在母猪上应用能够提高母猪的繁殖性能，减少哺乳仔猪腹泻的发生，增加断奶重，并提高母乳中乳蛋白、乳脂肪和乳糖的含量，减少仔猪的应激。

附图说明

图1所示为胶红酵母Y4-5(HYH4-5-21)菌株传代类胡萝卜素含量测定结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1分离筛选高产类胡萝卜素海洋红酵母菌株

取来自于福建、江苏鱼塘和虾塘的水样、泥样及动物肠道样品、公园泥样及红树叶等，取1mL液体样品或1g固体样品于18ml试管的9mL YPD液体培养基中，加入青霉素钠(80万单位每瓶灭菌蒸馏水稀释成1mL，添加1uL/试管)，85℃水浴处理10min后。试管放入温度为28℃，转速为180rpm条件下振荡培养16h后得到富集培养液。

采用倍比稀释法将富集培养液进行梯度稀释，涂布于YPD固体培养基上，放置于28℃培养箱中48h，挑取平板上所生长的粉红色、红色或橙色单菌落进行划线，并纯化两次，获得活的单菌落，共47株菌，菌种甘油保藏。

实施例2测定生物干重及类胡萝卜素产量，筛选优秀菌株

在超净台中，将47株待测菌株单菌落接入筛选培养基中，重复数为3。培养方法为：250mL摇瓶装液50mL，培养温度28℃，转速180rpm，培养时间36h。

其中，液体培养基P3配方为：酵母膏15g，七水硫酸镁1g，蔗糖40g，海水1000mL(海盐20g)。固体培养基琼脂为20g/L。

细胞干重测定方法：取发酵液10ml，8000r/min离心5min，倒去上清液，加入蒸馏水洗涤三次，再8000r/min离心5min，倒去上清液，在50度烘干至恒重即得干菌体(单位g/L)。

类胡萝卜素的提取方法：1)破壁方法--超声波辅助酸热法：取干菌体放入带帽试管中，按照15ml/g干菌体的量加入3mol/L盐酸(需要配制)，浸泡40min。浸泡过程中将试管至于超声波条件下。破壁完成之后，向细胞碎片中加入丙酮。2)2倍于盐酸破壁液体积作为浸提液，浸泡30min，4000r/min离心15min，所得上清液即为丙酮的类胡萝卜素浸提液。将浸提液用484nm测定。

类胡萝卜素含量测定(μg/g)＝OD×D×V/(0.16×W)

(D为稀释倍数；V为有机溶剂体积；W为提取用菌体干重；0.16为有机溶剂消光系数。)测定吸光度，单位：μg/g。

9株优选菌株测定结果如表1，由表1可见，菌株HYH4-5细胞干重和总类胡萝卜素产量都为最高。

表1生物干重及类胡萝卜素产量前9的菌株

实施例3海洋红酵母菌株HYH4-5的ITS rRNA基因序列分析

将获得的菌株HYH4-5进行ITS rRNA基因序列分析，序列如SEQ ID No.1所示。将基因序列输GenBank，通过Blast程序对数据库中所有序列进行比较分析。结果发现，海洋红酵母菌株HYH4-5的ITS rRNA基因序列与胶红酵母属模式菌株有较高的相似性。

实施例4海洋红酵母菌株HYH4-5的生理生化特性分析

本发明中的海洋红酵母新菌株HYH4-5，其生理生化特性如下：不发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、棉子糖和蜜二糖中的任何一种。可对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、蜜二糖、纤维二糖、海藻糖、木糖、D-阿拉伯糖和L-阿拉伯糖进行同化，对半乳糖、乳糖和可溶性淀粉不能进行同化。

综上所述，确定海洋红酵母菌株HYH4-5为胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)。

实施例5获得胶红酵母诱变菌株Y4-5

采用亚硝基胍对海洋红酵母HYH4-5进行诱变，操作方法如下：

1)制备菌悬液。取摇瓶培养液10mL 4000rpm离心10min收集酵母。培养方法：250mL摇瓶装液50mL，培养温度28℃，转速180rpm，培养时间24h。用0.1mol/L pH5.5柠檬酸钠缓冲液洗涤2次，用柠檬酸缓冲溶液将细胞悬浮，制成细胞浓度为10⁸CFU/g的菌悬液。

2)配制亚硝基胍原液。滴加2-3滴丙酮溶液至10mg亚硝基胍中，然后加入10mL0.1mol/L pH5.5柠檬酸钠缓冲液使之完全溶解。实验确定亚硝基胍溶液诱变浓度为42μg/mL时，细胞致死率为95％左右，此时突变率最高。

3)进行诱变。取上述菌悬液10mL，加入亚硝基胍溶液0.44mL，使其在菌悬液中的最终浓度达到42μg/mL，于28℃保温30min，取出后立即离心弃去上清液，用0.1mol/L pH7.0磷酸钾缓冲液洗涤2次再用10mL P3液体培养基使菌体悬浮于24℃培养过夜。

4)筛选突变株：将培养好的菌液适当稀释涂布于培养基P3固体平板上(灭菌后固体培养基P3，降温至45℃左右时加入二苯胺溶液中，终浓度为25μg/mL：抑制酵母合成类胡萝卜素的能力，该浓度可杀死90％的细胞)。24℃培养7d，待形成菌落后，挑选出红色较深的菌落，划线保存培养，测定突变株总类胡萝卜素含量。由表2可知，菌株HYH4-5-14类胡萝卜素产量最高，菌株HYH4-5-21的类胡萝卜素总量为最高，因此将HYH4-5-21选为产品候选菌株，重新编号为Y4-5。

表2胶红酵母HYH4-5菌株突变菌株类胡萝卜素含量测定结果

突变株稳定性测试和保藏。将Y4-5菌株接种于P3固体斜面上保存菌株，连续传代10次，每次传代测定其类胡萝卜素含量。结果见图1。结果表明Y4-5具有传代稳定性。本发明中的胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)新菌株Y4-5，已于2016年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13012。

实施例6胶红酵母Y4-5耐受性测定

(1)低温耐受试验:分别在12℃、15℃、18℃、21℃、24℃、28℃下，在P3固体培养基平板上，进行梯度(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4)海洋红发酵液点种生长实验(用移液枪吸取发酵稀释液2uL，接种在培养基平板上)，培养时间均为36h，期间每4h进行观察生长状况(菌落大小和颜色)，表征其低温耐受性。

观察结果：在不同温度下，发酵液菌株均可正常生长，但在温度为12-18℃范围内比21-28℃生长速度较慢(体现为同一稀释梯度发酵液，同一时间菌落较小)，但温度越低越有利于色素的产生(菌落颜色越深)，说明该菌株在低温时，类胡萝卜素产生的量不受影响。

(2)高盐耐受试验：在盐度分别为0‰、10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰的P3固体培养基平板上，进行梯度(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4)培养液点种生长实验(用移液枪吸取培养稀释液2uL，接种在培养基平板上)，培养时间36h，培养温度28℃。期间每4h进行观察生长状况(菌落大小和颜色)，表征其高盐耐受性。

观察结果：在不同盐度下，发酵液菌株均可正常生长，但在盐度为20-30‰范围内生长效果最佳(体现为同一稀释梯度发酵液，同一时间菌落大，菌落颜色深)。

实施例7海洋红酵母菌株Y4-5的中试发酵培养

(1)一级摇瓶种子液制备：在超净台中，将分离获得的海洋红酵母菌株单菌落接种至液体培养基P3中，250mL摇瓶装液50mL，180rpm，28℃培养30h。

(2)二级摇瓶种子液制备：将步骤(1)中制备的菌株种子液按照10％的接种量接入以二级摇瓶进行发酵，1000mL摇瓶装液300mL，发酵温度28℃，转速200rpm，发酵时间24h；

(3)发酵罐发酵：将步骤(2)中制备的菌株种子液按照5％的接种量接入100L发酵罐(装液量为60L)中进行发酵，发酵温度28℃，转速300rpm，灌压0.05Mpa，通风比是1:0.5，初始pH值为6.0左右，发酵时间24h。

在此中试条件下，测得类胡萝卜素的产量为10.45mg/L，蛋白含量为41％。

实施例8一种富含虾青素的发酵豆粕的制备

将海洋红酵母CGMCC No.13012接种至海洋红酵母液体培养基，温度28℃，转速为180rpm振荡培养45小时作为海洋红酵母发酵液；所述的海洋红酵母培养基中各成分的浓度为：糖蜜20g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母膏1.5g/L，硫酸铵5.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，一水硫酸镁0.15g/L，硫酸亚铁0.1g/L，氯化钠10g/L，pH调节至6.0。

其中，将芽孢杆菌菌粉、乳酸菌菌粉加入活化液中，活化8-10h，制备活化液；所述的活化液含有下述组分：蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3.5g/L，红糖10g/L，pH调节至6.5。所述芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.8148、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC No.2383复配而成，枯草芽孢杆菌的浓度为200亿CFU/g，地衣芽孢杆菌浓度为100亿CFU/g；所述乳酸菌由粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCCNo.2385、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)复配而成，粪肠球菌的浓度为200亿CFU/g，植物乳杆菌为100亿CFU/g。芽孢菌菌粉在活化液中的浓度为：5g/L，乳酸菌菌粉的浓度为：10g/L。

制备的海洋红酵母发酵菌种、芽孢杆菌和乳酸菌活化液以体积比为2:1混合均匀后，形成复合发酵菌液。

按下述质量百分比配置发酵底物：豆粕(46％)93％，糖蜜1％，玉米面5％，硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.2％、七水合硫酸镁0.1％、碳酸钙0.1％，酸性蛋白酶0.04％，纤维素酶0.04％、淀粉酶0.02％，混合制得发酵底物。所述的酸性蛋白酶的酶活力为50,000IU/g；纤维素酶的活力为6000IU/克，淀粉酶的酶活力为7000IU/g。

将复合发酵菌液接种至发酵底物中，接种量为3％(质量百分数)，并调节含水量至40％(质量百分数)混合均匀，采用吨包或者发酵池的方式，在30℃的条件下，发酵72h后，形成发酵豆粕半成品。

实施例9一种富含虾青素的发酵豆粕的制备

将海洋红酵母CGMCC No.13012接种至海洋红酵母液体培养基，温度30℃，转速为150rpm振荡培养44小时作为海洋红酵母发酵液；所述的海洋红酵母培养基中各成分的浓度为：糖蜜30g/L，蛋白胨1.5g/L，酵母膏2.5g/L，硫酸铵5.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，一水硫酸镁0.10g/L，硫酸亚铁0.1g/L，氯化钠10g/L，pH调节至5.5。

其中，将芽孢杆菌菌粉、乳酸菌菌粉加入活化液中，活化8h，制备活化液；所述的活化液含有下述组分：蛋白胨5g/L，酵母膏6g/L，氯化钠4.5g/L，红糖10g/L，pH调节至6.5。所述芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.8148、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC No.2383复配而成，枯草芽孢杆菌的浓度为200亿CFU/g，地衣芽孢杆菌浓度为100亿CFU/g；所述乳酸菌由粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCCNo.2385、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)复配而成，粪肠球菌的浓度为200亿CFU/g，植物乳杆菌为100亿CFU/g。芽孢菌菌粉在活化液中的浓度为：10g/L，乳酸菌菌粉的浓度为：5g/L。

按下述质量百分比配置发酵底物：豆粕(46％)92％，糖蜜2％，玉米面5％，硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.2％、七水合硫酸镁0.1％、碳酸钙0.1％，酸性蛋白酶0.05％，纤维素酶0.03％、淀粉酶0.02％，混合制得发酵底物。所述的酸性蛋白酶的酶活力为50,000IU/g；纤维素酶的活力为6000IU/克，淀粉酶的酶活力为7000IU/g。

将复合发酵菌液接种至发酵底物中，接种量为5％(质量百分数)，并调节含水量至35％(质量百分数)混合均匀，采用吨包或者发酵池的方式，在25℃的条件下，发酵96h后，形成发酵豆粕半成品。

实施例10一种富含虾青素的发酵豆粕的制备

将海洋红酵母CGMCC No.13012接种至海洋红酵母液体培养基，温度25℃，转速为250rpm振荡培养48小时作为海洋红酵母发酵液；所述的海洋红酵母培养基中各成分的浓度为：糖蜜30g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母膏2.5g/L，硫酸铵2.5g/L，磷酸二氢钾1.2g/L，一水硫酸镁0.05g/L，硫酸亚铁0.15g/L，氯化钠15g/L，pH调节至6.0。

其中，将芽孢杆菌菌粉、乳酸菌菌粉加入活化液中，活化10h，制备活化液；所述的活化液含有下述组分：蛋白胨2.5g/L，酵母膏9g/L，氯化钠4.0g/L，红糖12g/L，pH调节至7.0。所述芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.8148、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC No.2383复配而成，枯草芽孢杆菌的浓度为200亿CFU/g，地衣芽孢杆菌浓度为100亿CFU/g；所述乳酸菌由粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCCNo.2385、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)复配而成，粪肠球菌的浓度为200亿CFU/g，植物乳杆菌为100亿CFU/g。芽孢菌菌粉在活化液中的浓度为：10g/L，乳酸菌菌粉的浓度为10g/L。

按下述质量百分比配置发酵底物：豆粕(46％)87％，糖蜜5％，玉米面7％，硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.2％、七水合硫酸镁0.1％、碳酸钙0.1％，酸性蛋白酶0.05％，纤维素酶0.03％、淀粉酶0.02％，混合制得发酵底物。所述的酸性蛋白酶的酶活力为50,000IU/g；纤维素酶的活力为6000IU/克，淀粉酶的酶活力为7000IU/g。

将复合发酵菌液接种至发酵底物中，接种量为5％(质量百分数)，并调节含水量至50％(质量百分数)混合均匀，采用吨包或者发酵池的方式，在40℃的条件下，发酵48h后，形成发酵豆粕半成品。

实施例11发酵豆粕指标的测定

得到的富含虾青素的发酵豆粕半成品的指标检测结果见表2。其中，粗蛋白含量是通过GB/T 6432-1994测定；pH通过pH计测得；海洋酵母菌数含量依据GB4789.15-2010方法测得，乳酸菌菌数含量依据GB4789.35-2010方法测得，芽孢菌菌数含量依据NY/T 2131-2012、NY/T 1461-2007方法测得。虾青素含量依据DB23/T 1275-2008方法测得。呕吐毒素的测定参照呕吐毒素检测试剂盒操作规程进行。

表2豆粕发酵前后指标的变化情况

实施例12富含虾青素的发酵豆粕在断奶仔猪饲料中的应用

饲料配制：饲料配制参照NRC(2012)和猪饲养标准(2004)，试验日粮组成及营养水平见表3。将玉米，豆粕经过初筛处理，用2.5mm的筛片将上述原料粉碎成粉状，进入待配料仓，将粉碎后的玉米，豆粕，以及所述的富含虾青素的发酵豆粕半成品，通过大料配料秤按比例加入混合机，然后分别将鱼粉、乳清粉、磷酸氢钙、石粉、食盐、L-赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、0.5％复合预混合饲料、氯化胆碱、三氧化二铬、氧化锌从微量秤或手动称量加入混合机，混合10-15秒后再加入大豆油混合均匀后进入待制粒仓进行制粒。市售发酵豆粕由上海某公司提供。

其中，混合时间为120秒，蒸汽压0.2Mpa，调制器温度75℃的条件下进行制粒，制粒冷却后再次进行超微粉碎，粉碎粒度为(400-500μm)。

表3试验日粮组成及营养水平

注：0.5％复合预混合混料为每kg全价饲料提供Cu≥40g，Fe≥1040mg，Mn≥14.4g，Se≥120g，I≥160mg，钴≥200mg，铁≥36.8g，水分≤10％。维生素A(KIU)≥2000，维生素D₃(KIU)≥375，维生素E(IU)≥5300，维生素K≥400mg，维生素B₁≥450mg，维生素B₂≥600mg，维生素B₆≥530mg，维生素B₁₂≥6.4mg，叶酸≥216mg，生物素≥8.8mg，烟酸≥7800mg，泛酸钙≥6000mg。

试验动物与饲养管理：本试验选用144头(公母各半)的健康(杜×长×大)21日龄断奶仔猪，试验期10d。试验在河北省唐山市玉田县某猪场进行。采用全封闭式猪舍，舍内温度、湿度、通风、二氧化碳和氨浓度自动化控制，试验期间舍温保持在24-26℃。试验仔猪分栏饲养，漏缝地板，不锈钢可调式料槽，乳头式饮水器。采用自由采食和饮水的饲喂方式。

试验设计：将144头健康断奶仔猪按体重和性别完全随机分组为4个处理，每个处理6个重复，每个重复6头猪(公母各半)。日粮处理组分别为：(1)对照组：玉米-豆粕-市售发酵豆粕基础日粮；(2)添加12％实施例8发酵豆粕组；(3)添加12％实施例9发酵豆粕组；(4)添加12％实施例10发酵豆粕组。保证各试验组的粗蛋白水平一致。

检测指标与测定方法：平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)，料重比。试验期间，为了观测断奶仔猪腹泻的严重程度，每天记录粪便指数，如表4，当指数为4、5则认定为腹泻。

试验结束当天从每个重复中随机选取1头猪，每头猪前腔静脉采血10mL，3000r/min离心10min制备血清样品，分装后冷冻存放于-80℃待测。免疫球蛋白A、免疫球蛋白G和免疫球蛋白M的测定根据定量测定试剂盒(R&D，中国)的说明，进行酶联免疫吸附试验。

表4粪便指数

粪便指数	腹泻程度	粪便状态
			1	便秘	羊粪状(球状)
2	正常	条状成型
			3	轻度腹泻	粪便呈粘粥状
4	中度腹泻	粪便呈稀泥浆状
			5	严重腹泻	粪便呈水状

统计方法：试验数据统计利用SAS9.0软件包中的平衡实验设计ANOVA过程进行方差分析，采用Duncan法进行均值的多重比较。

试验结果：

血液指标：如表5所示，对照组、实施例8发酵豆粕组、实施例9发酵豆粕组和实施例10发酵豆粕组仔猪血液中IgA和IgM均无明显差异，IgG指标各试验组均高于对照组，表明本发明的发酵豆粕能够提高断奶仔猪的免疫球蛋白水平，增强动物免疫力。

表5发酵豆粕替代日粮中豆粕对断奶仔猪血液指标的影晌

生产性能：含虾青素的发酵豆粕替代日粮中市售发酵豆粕对断奶仔猪生长性能的影响结果见表6。各组仔猪初始体重没有差异。结果表明，含虾青素的发酵豆粕各试验组比对照组日增重和日采食量有显著的提高(P<0.05)，各试验组之间差异不显著。各试验组与对照组相比料肉比均有下降趋势，实施例8和实施例9发酵豆粕试验组之间差异不显著(P>0.05)，但与对照组差异显著(P<0.05)。根据上表数据显示，含虾青素的发酵豆粕替代日粮中普通发酵豆粕能够提高断奶仔猪的生长性能，并降低断奶后的仔猪腹泻率。

表6含虾青素的发酵豆粕替代日粮中市售发酵豆粕对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响

实施例13富含虾青素的发酵豆粕在规模猪场母猪饲料中的应用

饲料配制：饲料配制参照NRC(2012)和中国瘦肉型哺乳母猪饲养标准(2004)，试验日粮组成及营养水平见表7。饲料为规模猪场自配料，将玉米、豆粕、麸皮、鱼粉用3mm的筛片粉碎后，加入配料仓，然后按比例加入富含虾青素的发酵豆粕半成品、预混料和大豆油，混合均匀后即可饲喂。

表7试验日粮及营养水平

注：4％复合预混合混料为每kg全价饲料提供Cu≥5g，Fe≥130mg，Zn≥5g，Mn≥1.8g，Se≥15g，I≥20mg，钴≥25mg，钙≥160-270g，铁≥4.6g，磷≥38g，水分≤10％。维生素A(KIU)≥253，维生素D₃(KIU)≥47，维生素E(IU)≥662，维生素K≥53mg，维生素B₁≥58mg，维生素B₂≥75mg，维生素B₆≥67mg，维生素B₁₂≥0.8mg，叶酸≥27mg，生物素≥1.1mg，烟酸≥975mg，泛酸钙≥750mg，氯化胆碱≥5g。

试验动物与饲养管理：试验地点在北京市顺义区某种猪养殖场进行，选取品种相同、年龄、体况和预产期接近七天内的妊娠期110天左右的母猪48头，随机分为4组，每组12头母猪，每头母猪为1个重复。分别为对照组(基础日粮)、实施例8发酵豆粕试验组、实施例9发酵豆粕试验组、实施例10发酵豆粕试验组。试验从母猪产前7天转至彻底消毒的分娩舍开始直至仔猪断奶，饲养于全漏缝式的限位栏中单圈饲养，舍内清洁干燥、通风性良好、温度适宜25-28℃。试验期间饲养管理和免疫程序均按规模化猪场统一要求执行。从转分娩舍至分娩，母猪根据体况每天限饲在2.0-2.5kg。母猪分娩当天不喂料，分娩后第1天和第2天每日喂料1-2kg，以后每天增加1.0kg，第6天自由采食(以吃饱后料槽中略有剩料为准)，每天观察试验猪的精神、食欲状况，记录母猪有无便秘现象，发现病猪及时隔离治疗。母猪在仔猪断奶(21天)后转至配种舍

检测指标与测定方法：记录分娩前及泌乳期母猪采食量，计算平均日采食量,记录产仔数、活仔数、木乃伊数、死胎数、分娩持续时间(产程)、初生窝重，计算初生仔猪成活率(初生活仔数/窝产仔数)、初生个体均重。根据母猪产活仔数和产乳情况组内调整母猪带仔数在10头左右，记录每头母猪的带仔数、仔猪断奶头数、断奶窝重，计算哺乳仔猪平均日增重、断奶个体均重、断奶成活率(窝试验期间，为了观测断奶仔猪腹泻的严重程度，每天记录粪便指数，指数4、5则认定为腹泻。腹泻系数统计标准参照表4。

母猪分娩后第20天(理论上泌乳高峰期)，每处理随机选取四头猪分别从前、中、后3个部位的乳头采集乳样，每头猪采集20m1左右，-20℃保存。用快速乳成分分析仪(MILKYWAY-CP2)测定指标：乳蛋白、乳脂肪、乳糖。

试验结果：

发酵豆粕替代哺乳日粮中豆粕对母猪和哺乳仔猪生长性能的影响见表8。各组母猪窝均产健仔数、初生个体均重均无显著差异。使用发酵豆粕后母猪的日均采食量显著升高(P<0.05)，但各实施例间无显著差异。添加发酵豆粕后母猪的断配间隔有缩短的趋势，但与对照组无显著差异。使用发酵豆粕后哺乳仔猪的平均日增重较对照组明显提高(P<0.05)，腹泻率显著下降(P<0.05)。试验结果表明，添加富含虾青素的发酵豆粕替代日粮中能够提高母猪的采食量，并提高哺乳仔猪的平均日增重，减少哺乳仔猪腹泻的发生。

表8发酵豆粕替代日粮中豆粕对母猪和哺乳仔猪生产性能和腹泻率的影响

富含虾青素的发酵豆粕替代哺乳日粮中豆粕对哺乳母猪乳成分均有不同程度提高。其中乳蛋白和乳脂肪的含量较对照组显著提高(P<0.05)。发酵豆粕组的乳糖水平较对照组均呈上升的趋势。富含虾青素的发酵豆粕能够提高泌乳期母猪奶水中乳蛋白和乳脂肪的水平。

表9泌乳期母猪母乳生化指标的测定

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京伟农生物科技有限公司

<120> 一种富含虾青素的发酵豆粕的制备与饲料

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 620

<212> DNA

<213> 胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）

<400> 1

cttccgtagg gtgaacctgc ggaaggatca ttagtgaata taggacgtcc aacttaactt 60

ggagtccgaa ctctcacttt ctaaccctgt gcatttgttt gggatagtaa ctctcgcaag 120

agggcgaact cctattcact tataaacaca aagtctatga atgtattaaa ttttataaca 180

aaataaaact ttcaacaacg gatctcttgg ctctcgcatc gatgaagaac gcagcgaaat 240

gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa cgcaccttgc 300

gctccatggt attccgtgga gcatgcctgt ttgagtgtca tgaatacttc aaccctcctc 360

tttcttaatg attgaagagg tgtttggttt ctgagcgctg ctggccttta gggtctagct 420

cgttcgtaat gcattagcat ccgcaatcga acttcggatt gacttggcgt aatagactat 480

tcgctgagga attctagtct tcggactaga gccgggttgg gttaaaggaa gcttctaatc 540

agaatgtcta cattttaaga ttagatctca aatcaggtag gactacccgc tgaacttaag 600

catatcaata agcggaggaa 620

Claims

1.一种富含虾青素的发酵豆粕的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)制备富含虾青素的海洋红酵母发酵液；

2)制备协同发酵所用复合发酵菌液；

3)配制发酵底物；

2.根据权利要求1所述的富含虾青素的发酵豆粕的制备方法，其特征在于，将海洋红酵母接种至海洋红酵母液体培养基，温度25-30℃，转速为150-250rpm，振荡培养44-48小时制备所述海洋红酵母发酵液，所述海洋红酵母为胶红酵母CGMCC No.13012。

3.根据权利要求1所述的富含虾青素的发酵豆粕的制备方法，其特征在于，制备协同发酵所用复合发酵菌液具体包括如下步骤：

将芽孢杆菌菌粉、乳酸菌菌粉加入活化液中，活化8-10h，制备活化液；

将海洋红酵母发酵液和活化液以体积比为2:1混合均匀后，形成复合发酵菌液。

4.根据权利要求3所述的富含虾青素的发酵豆粕的制备方法，其特征在于：所述的活化液含有下述组分：蛋白胨1～5g/L，酵母膏4～9g/L，氯化钠3.5～4.5g/L，红糖9～12g/L，pH调节至6.5-7.0。

5.根据权利要求3所述的富含虾青素的发酵豆粕的制备方法，其特征在于，所述芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.8148、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)CGMCC No.2383组成，枯草芽孢杆菌的浓度为2000亿CFU/g，地衣芽孢杆菌浓度为2000亿CFU/g；所述乳酸菌由粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC No.2385、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)组成，粪肠球菌的浓度为200亿CFU/g，植物乳杆菌为100亿CFU/g，芽孢菌菌粉在活化液中的浓度为：5-10g/L，乳酸菌菌粉的浓度为：5-10g/L。

6.根据权利要求1所述的富含虾青素的发酵豆粕的制备方法，其特征在于：步骤3)所述的发酵底物，按下述质量百分比配置：豆粕70-95％，糖蜜1-5％，玉米面3-7％，硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.2％、七水合硫酸镁0.1％、碳酸钙0.1％，酸性蛋白酶0.04～0.05％，纤维素酶0.01～0.03％、淀粉酶0.02～0.04％，所述的酸性蛋白酶的酶活力为50,000IU/g；纤维素酶的活力为6000IU/克，淀粉酶的酶活力为7000IU/g。

7.根据权利要求1所述的富含虾青素的发酵豆粕的制备方法，其特征在于：复合发酵菌液接种至发酵底物中，接种量为3～6％，并调节含水量至35～50％，混合均匀，采用吨包或者发酵池的方式，在25℃至45℃的条件下，发酵48-96h。

8.一种富含虾青素的发酵豆粕，其特征在于，由权利要求1-7任一项所述的制备方法制备而成，其中，水分含量35-50％，pH在4.0～5.5，粗蛋白含量25-40％，海洋红酵母菌数1.5×10⁷cfu/g以上，虾青素含量为125.43μg/kg以上，乳酸菌数6.5×10⁸cfu/g以上，芽孢菌数1.0×10⁸cfu/g以上。

9.一种富含虾青素的饲料，其特征在于：由下述方法制备而成：

将玉米，豆粕经过初筛处理，用2.5mm的筛片将上述原料粉碎成粉状，进入待配料仓，将粉碎后的玉米，豆粕，以及所述的富含虾青素的发酵豆粕半成品，通过大料配料秤按比例加入混合机，然后分别将鱼粉、乳清粉、磷酸氢钙、石粉、食盐、L-赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、0.5％复合预混合饲料、氯化胆碱、三氧化二铬、氧化锌从微量秤或手动称量加入混合机，混合10-15秒后再加入大豆油混合均匀后进入待制粒仓进行制粒，其中，发酵豆粕的含量为5-20％。

10.根据权利要求9所述的富含虾青素的饲料，其特征在于，在蒸汽压0.2Mpa，调制器温度75℃的条件下进行制粒，制粒冷却后再次进行超微粉碎，粉碎粒度为400-500μm。