CN104248755A - 一种副猪嗜血杆菌病疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种副猪嗜血杆菌病疫苗组合物，该副猪嗜血杆菌病疫苗组合物包含免疫量的去除荚膜的副猪嗜血杆菌全菌抗原和兽医学上可接受的佐剂。本发明提供的去除荚膜的副猪嗜血杆菌病疫苗组合物不仅对同一血清型的副猪嗜血杆菌感染提供良好的免疫保护作用，还可以对我国目前流行的多种血清型的副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病有较好的预防和治疗效果。

Description

一种副猪嗜血杆菌病疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种副猪嗜血杆菌病疫苗，及其制备方法和应用。

背景技术

副猪嗜血杆菌病又称多发性纤维素性浆膜炎和关节炎，是一种临床上以体温升高、关节肿胀、呼吸苦难、多发性浆膜炎、关节炎和高死亡率为特征的传染病。该病又称为猪革拉泽氏病(Glsser’s Disease)，曾一度被认为是由应激所引起的散发性疾病，后来被证实是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）所引起。

副猪嗜血杆菌病可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的猪,发病率一般在10%～15%，严重时死亡率可达50%。主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。此外,副猪嗜血杆菌还可引起败血症，并且在急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行。随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病。

副猪嗜血杆菌属革兰氏阴性短小杆菌，形态多变。早在1910年,德国科学家Glsser就发现了副猪嗜血杆菌与猪的多发性浆膜炎和关节炎之间的联系。西方发达国家在大量分离副猪嗜血杆菌的基础上，发现该菌的血清型复杂多样，按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)琼脂扩散血清分型方法，至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型，另有20%以上的分离株血清型不可定；根据德国、美国、加拿大、日本和西班牙等国家的血清流行病学调查,以血清型4、5、13型最为流行；根据我国血清流行病学调查和分离菌株的鉴定，以4、5型最为流行，其次是12型、13型。

近年来，各副猪嗜血杆菌血清群之间交互免疫力不强，接种的疫苗菌株血清群与当时当地流行的副猪嗜血杆菌病的病原血清群不相符，给该病的预防和治疗带来了一定的难度。目前国内用于副猪嗜血杆菌病免疫预防的疫苗有勃林格殷格翰动物保健(美国)有限公司生产的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(Z-1517株)、西班牙海博莱生物大药厂生产的猪副猪嗜血杆菌病1型和6型灭活疫苗和华中农业大学、武汉科前动物生物制品有限责任公司、中牧实业股份有限公司生产的副猪嗜血杆菌病4型和5型灭活疫苗。这些疫苗的应用对副猪嗜血杆菌病起到了一定的预防作用。但是副猪嗜血杆菌病的病原流行株和多种血清型感染已经使现有疫苗很难达到预期的免疫效果。由于没有合适的毒株制备，加上各个抗原之间存在干扰，提供一种能够有效防治由副猪嗜血杆菌新病原引起的副猪嗜血杆菌病的疫苗为养殖业迫切需要解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种解决目前技术缺陷的改进型副猪嗜血杆菌病疫苗组合物，所述副猪嗜血杆菌病疫苗组合物包含去除荚膜的副猪嗜血杆菌全菌抗原和兽医学上可接受的载体。

所述去除荚膜的副猪嗜血杆菌全菌抗原包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，包含目前已鉴定的1～15个血清型去除荚膜的全菌抗原。

优选地，去除荚膜的副猪嗜血杆菌全菌抗原为灭活形式。灭活后的去除荚膜的副猪嗜血杆菌全菌抗原与兽医学上可接受的载体配制可获得一种副猪嗜血杆菌灭活疫苗。优选地，本发明所述的副猪嗜血杆菌全菌抗原来自副猪嗜血杆菌血清4型抗原、5型抗原或12型抗原。

更优选地，本发明所述的副猪嗜血杆菌全菌抗原选自副猪嗜血杆菌血清4型菌株JS株、副猪嗜血杆菌血清5型菌株ZJ株或副猪嗜血杆菌血清12型菌株HeB株。

副猪嗜血杆菌血清4型（Haemophilus Parasuis，HPs）菌株JS株，已在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）进行保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏号为CCTCC No：M2011172。

副猪嗜血杆菌血清5型（Haemophilus Parasuis，HPs）菌株ZJ株，已在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）进行保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏号为CCTCC No：M2011173。

副猪嗜血杆菌血清12型（Haemophilus Parasuis，HPs）菌株HeB株，已在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）进行保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏号为CCTCC No：M2011174。

优选地，本发明的疫苗组合物中所述副猪嗜血杆菌全菌抗原含量为10⁸CFU/ml～10¹⁰CFU/ml；更优选地，所述副猪嗜血杆菌全菌抗原含量为10⁹CFU/ml。

本发明所用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”可互换使用，是指包含至少一种在动物中诱导免疫应答的免疫原性物质的药物组合物。疫苗或疫苗组合物可另外包含疫苗或疫苗组合物的典型的其他成分，例如佐剂等。

本发明所用的术语“抗原含量”是指所述副猪嗜血杆菌全菌抗原灭活前的活菌数的含量。

本发明所用的术语“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活细菌的混悬液。灭活疫苗的例子包括全菌疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理细菌可获得全菌灭活疫苗。

本发明所用的术语“载体”是指与所述副猪嗜血杆菌全菌抗原一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或溶媒等。

优选地，所述载体为佐剂，所述佐剂为白油佐剂、氢氧化铝胶、以卡波姆（Carbomer）为基础的Montanide IMS1313VG、Montanide IMS251C VG、Montanide ISA15A VG或Montanide GEL PR聚合物、矿物油、蜂胶、ISA206、ISA760VG、氢氧化铝、磷酸铝、皂苷、植物油、油酸乙酯、二（辛酸／癸酸）丙二醇酯、三（辛酸／癸酸）甘油酯、二油酸丙二醇酯、异硬脂酸酯、山梨聚糖、二缩甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一种或几种的组合物。

更优选地，所述佐剂为白油佐剂、氢氧化铝胶或者以卡波姆（Carbomer）为基础的Montanide IMS1313VG、Montanide IMS251CVG、Montanide ISA15A VG和Montanide GEL PR聚合物中的一种或几种组合物。

优选地，所述副猪嗜血杆菌全菌抗原为所述疫苗组合物50%～90%体积百分比。

优选地，本发明的疫苗组合物可制备成口服剂型或非口服剂型。更优选地，所述疫苗组合物制备成可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。

本发明的又一目的在于提供如上所述的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的制备方法，包括培养副猪嗜血杆菌菌株；去除荚膜，并灭活、浓缩；将抗原成分按比例辅以载体制备成疫苗。具体包括如下步骤：

（1）将副猪嗜血杆菌菌种培养繁殖得到菌液；

（2）将所述培养得到的菌液去除荚膜；

（3）将所述去除荚膜的菌液进行灭活，并浓缩菌液；

（4）将所述已灭活并浓缩的菌液和兽医学上可接受的载体进行乳化。

优选地，上述步骤（2）中所述去除荚膜通过将菌液置于60℃水浴30分钟实现。

优选地，上述步骤（3）中所述浓缩采用超滤法，浓缩倍数为3倍。

优选地，上述步骤（3）中所述灭活采用甲醛灭活法；更优选地，所采用甲醛溶液的终浓度为0.1%～0.3%（v/v），灭活时间为24～48h，灭活温度为37℃。

在上述改进型副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的制备过程中，对步骤（1）培养好的菌液取样，进行纯粹性检验和活菌计数；对步骤（3）已灭活好的菌液取样进行灭活检验和安全检验；对步骤（4）得到的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗进行无菌检验、安全检验和效力检验，以确保疫苗的安全性、可靠性。

本发明的又一目的在于提供如上所述的副猪嗜血杆菌病疫苗组合物在制备预防和治疗副猪嗜血杆菌感染相关疾病的药物中的应用。

本文所用的术语“副猪嗜血杆菌感染相关疾病”指由副猪嗜血杆菌感染引起的疾病。它的例子包括主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。此外，副猪嗜血杆菌还可引起败血症，并且在急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行。但不限于此。

本文所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制副猪嗜血杆菌感染或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使副猪嗜血杆菌感染引起的症状减轻或转好的所有行为。

技术效果

发明人意外地将分离获得的副猪嗜血杆菌通过去除荚膜，制备副猪嗜血杆菌病灭活疫苗，通过试验发现该灭活疫苗不仅免疫原性没有降低，对同一血清型的副猪嗜血杆菌感染提供良好的免疫保护作用，还可以对我国目前流行的多种血清型的副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病有较好的预防和治疗效果，特别是可以解决目前由于副猪嗜血杆菌新发病原而导致的现有疫苗治疗效果不佳的问题，克服了现有商品化疫苗只能预防1种或者2种副猪嗜血杆菌流行毒株引起的副猪嗜血杆菌感染的不足，可以满足不同养殖户和大型养殖场的需求，并达到了一针多防的效果。

其次，多价疫苗常常由于抗原的相互影响而导致免疫失败，特别是对于多血清型的副猪嗜血杆菌引起的疾病，由于血清型众多，选择抗原的种类和比例更加困难，而且对于大动物（猪）的免疫学实验往往时间漫长、费用昂贵，这也是一直以来市场上未出现有效预防多种血清型副猪嗜血杆菌感染的副猪嗜血杆菌病的疫苗的原因。而本发明在获得的一株副猪嗜血杆菌基础上，通过去除荚膜制备的灭活疫苗的免疫效果良好，可以有效治疗和预防副猪嗜血杆菌相关疾病，解决了长期以来的多血清型副猪嗜血杆菌相关疾病的多价疫苗效果不理想的问题。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。如未特别声明，本发明的一般实验方法可使用本领域常用的试验方法进行，或参考《中华人民共和国兽药典（二〇一〇年版）》及附录的试验方法完成。

实施例1副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的制备与效力试验

1.菌种

a.副猪嗜血杆菌血清4型JS株，分类命名：副猪嗜血杆菌病JS（Haemophilus parasuis JS），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏号为：CCTCC M2011172。

b.副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株，分类命名：副猪嗜血杆菌病ZJ（Haemophilus parasuis ZJ），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏号为：CCTCC M2011173。

c.副猪嗜血杆菌血清12型HeB株，分类命名：副猪嗜血杆菌病HeB（Haemophilus parasuis HeB），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏号为：CCTCC M2011174。

2.菌种的繁殖

a.一级种子的繁殖

上述冻干菌种，划线接种于TSA/NAD平板上，置37℃培养18～24小时，选取符合要求的菌落，接种于TSB/NAD液体培养基中，37℃培养12小时，作为一级种子。

b.二级种子的繁殖

取一级种子的培养物，按1%V的量加入TSB/NAD液体培养基中，37℃培养12小时，经检验纯粹后作为二级种子。

3.菌液的培养

在副猪嗜血杆菌培养基（商售TSB）中，加入0.01%～0.05%（V/V）的NAD、5%～10%（V/V）的血清、0.1%～5%（V/V）的葡萄糖，将副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌种分别按1%（V/V）的量加进培养基中分别培养，混匀后置37℃培养18小时，得到三种菌液。

4.纯粹检验

从上述培养好的三种菌液中取样，用TSA/NAD培养基依《中华人民共和国兽药典》附录进行纯粹检验，结果为纯粹。

5.活菌计数

从上述培养好的三种菌液中取样，用TSA/NAD平板培养进行活菌计数，以确定培养的菌数。

6.去除荚膜

将上述培养好的三种菌液分别置于60℃水浴30分钟，去除荚膜。

7.灭活

向上述三种去除荚膜的菌液中，按总量的0.3%（V/V）加入甲醛溶液，放置于37℃灭活24h，期间搅拌3～5次。

8.灭活检验

灭活后，取上述三种已经灭活的菌液5mL接种于100mL含0.01%～0.05%（V/V）NAD、5%～10%（V/V）的血清、0.1%～5%（V/V）的葡萄糖的副猪嗜血杆菌TSB培养基中，37℃培养18小时，再移植于上述100mL培养基中37℃培养18小时。取灭活的菌液0.1mL划线接种于TSA/NAD平板培养基，37℃培养24小时。以上两种培养基培养后，均无菌生长。

9.安全检测

取上述三种已灭活的菌液静脉注射18～22g的Balb/C小鼠5只，每只0.2mL，结果为三天内5/5健活，为灭活彻底。

10.疫苗的配制

表1各组疫苗菌株和抗原含量

以白油为佐剂制成副猪嗜血杆菌病灭活疫苗。具体方法如下：

油相制备：白油94份，再加入6份司本-80，充分混均，121℃，30分钟；

水相制备：参照菌落计数结果，将去除荚膜、灭活并检验合格的菌液，加入终浓度为4%灭菌吐温-80，边加边搅拌，至完全溶解；

乳化：水相与油相的比例为1:1.5，即1份水相配1.5份油相在高速搅拌器中乳化2-5分钟。

根据所采用菌株和抗原含量不同共制成9组疫苗，各组疫苗的菌株和抗原含量如表1所示。

11.效力试验

在普莱柯生物工程股份有限公司试验动物房进行试验。取上述制备的疫苗，每组疫苗各用28日龄的健康易感猪5头（普莱柯生物工程股份有限公司试验动物房饲养并提供），各肌肉注射2mL，含1个使用剂量，28天后，将注射了每组疫苗的免疫试验猪分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌株攻毒。对照猪15头，分三组，分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌株攻毒。

副猪嗜血杆菌血清4型JS株：分别选取注射了上述制备的副猪嗜血杆菌苗的免疫试验猪各5头，连同条件相同的对照猪5头，腹腔注射1个发病量的血清4型JS株毒菌液，观察10天，免疫猪5/5以上保护，对照猪5/5发病。

副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株：分别选取注射了上述制备的副猪嗜血杆菌苗的免疫试验猪各5头，连同条件相同的对照猪5头，腹腔注射1个致死量的血清5型ZJ株强毒菌液，观察10天，免疫猪5/5以上保护，对照猪4/5死亡。

副猪嗜血杆菌血清12型HeB株：分别选取注射了上述制备的副猪嗜血杆菌苗的免疫试验猪各5头，连同条件相同的对照猪5头，腹腔注射1个致死量的血清12型HeB株强毒菌液，观察10天，免疫猪5/5以上保护，对照猪4/5死亡。

效力试验结果如表2所示。

表2效力试验结果

注：副猪嗜血杆菌病发病标准：发病猪出现发热（体温40.5℃以上，持续1～5日）、精神萎靡、咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱等临床症状。对濒死猪剖检，可见多发性浆膜炎（胸膜炎、心包炎、腹膜炎）、关节炎和脑膜炎等病变，各浆膜面（关节囊、心包膜、胸膜和腹膜）出现浆液性或纤维素性渗出物。

实施例2交叉保护试验

在普莱柯生物工程股份有限公司试验动物房进行试验。取上述制备的疫苗2、疫苗5及疫苗8，每组疫苗各用28日龄的健康易感猪15头（普莱柯生物工程股份有限公司试验动物房饲养并提供），各肌肉注射2mL，含1个使用剂量，28天后，将注射了每组疫苗的免疫试验猪随机分为三组，分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌株攻毒。同时选择对照猪15头，分三组，分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌株攻毒。具体如下：

选取实施例1制备的副猪嗜血杆菌疫苗2免疫试验猪15头，随机分为三组，分别腹腔注射1个发病量的血清4型JS株毒菌液、1个致死量的血清5型ZJ株强毒菌液和1个致死量的血清12型HeB株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护。

选取实施例1制备的副猪嗜血杆菌疫苗5免疫试验猪15头，随机分为三组，分别腹腔注射1个发病量的血清4型JS株毒菌液、1个致死量的血清5型ZJ株强毒菌液和1个致死量的血清12型HeB株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护。

选取实施例1制备的副猪嗜血杆菌疫苗8免疫试验猪15头，随机分为三组，分别腹腔注射1个发病量的血清4型JS株毒菌液、1个致死量的血清5型ZJ株强毒菌液和1个致死量的血清12型HeB株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护。

同时设立对照组，选择对照猪15头，同等条件下随机分为三组，分别腹腔注射1个发病量的血清4型JS株毒菌液、1个致死量的血清5型ZJ株强毒菌液和1个致死量的血清12型HeB株强毒菌液，观察10天，对照组4/5以上发病或死亡。

试验结果如表3所示。

表3交叉保护试验结果

注：副猪嗜血杆菌病发病标准：发病猪出现发热（体温40.5℃以上，持续1～5日）、精神萎靡、咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱等临床症状。对濒死猪剖检，可见多发性浆膜炎（胸膜炎、心包炎、腹膜炎）、关节炎和脑膜炎等病变，各浆膜面（关节囊、心包膜、胸膜和腹膜）出现浆液性或纤维素性渗出物。

实施例3不同佐剂配制的新型副猪嗜血杆菌病灭活疫苗及效力试验

利用不同佐剂配制副猪嗜血杆菌病灭活疫苗：由实施例1制备的已经去除荚膜、灭活、浓缩并且安全检验合格的副猪嗜血杆菌病血清4型菌株制备获得，即用副猪嗜血杆菌血清4型菌株制备抗原，分别与Montanide IMS1313VG、Montanide IMS251C VG、Montanide ISA15AVG、Montanide GEL PR或氢氧化铝胶佐剂混合配制疫苗。具体配方见表4。

水性佐剂疫苗的配制：用Montanide IMS1313VG或者MontanideIMS251C VG或者Montanide GEL PR为佐剂制成的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗。具体方法如下：将菌液用中空纤维超滤器浓缩，弃去上清，并用生理盐水重悬沉淀物，参照菌落计数结果，根据配苗标准加入10%～50%（V/V）的Montanide IMS1313VG或者Montanide IMS251C VG或者Montanide GEL PR，低速搅拌乳化，使得疫苗中抗原的含量均为10⁹CFU/ml。

水包油疫苗的配制：以Montanide ISA15A VG为佐剂制成的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗。具体方法如下：将菌液用中空纤维超滤器浓缩，弃去上清，并用生理盐水重悬沉淀物，参照菌落计数结果，根据配苗标准加入10%～20%（V/V）的Montanide ISA15A VG，低速搅拌乳化，使得疫苗中抗原的含量为10⁹CFU/ml。

铝胶佐剂的配制：用氢氧化铝胶为佐剂制成的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗。具体方法如下：将菌液用中空纤维超滤器浓缩，弃去上清，并用生理盐水重悬沉淀物，参照菌落计数结果，根据配苗标准加入15%～25%（V/V）灭菌的氢氧化铝胶摇匀；使得疫苗中抗原的含量为10⁹CFU/ml，充分搅拌，得到氢氧化铝胶佐剂的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗。

表4不同佐剂配制疫苗的配方

效力试验

在普莱柯生物工程股份有限公司试验动物房进行试验。取上述制备的疫苗，每组疫苗各免疫28日龄的健康易感猪15头（普莱柯生物工程股份有限公司试验动物房饲养并提供），各肌肉注射2mL，含1个使用剂量，28天后，将注射了每组疫苗的免疫试验猪分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌株攻毒。对照猪15头，分三组，分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌株攻毒。具体如下：

选取上述制备的副猪嗜血杆菌疫苗A免疫猪15头，随机分为三组，分别腹腔注射1个发病量的血清4型JS株毒菌液、1个致死量的血清5型ZJ株强毒菌液和1个致死量的血清12型HeB株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护。

选取上述制备的副猪嗜血杆菌疫苗B免疫猪15头，随机分为三组，分别腹腔注射1个发病量的血清4型JS株毒菌液、1个致死量的血清5型ZJ株强毒菌液和1个致死量的血清12型HeB株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护。

选取上述制备的副猪嗜血杆菌疫苗C免疫猪15头，随机分为三组，分别腹腔注射1个发病量的血清4型JS株毒菌液、1个致死量的血清5型ZJ株强毒菌液和1个致死量的血清12型HeB株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护。

选取上述制备的副猪嗜血杆菌疫苗D免疫猪15头，随机分为三组，分别腹腔注射1个发病量的血清4型JS株毒菌液、1个致死量的血清5型ZJ株强毒菌液和1个致死量的血清12型HeB株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护。

选取上述制备的副猪嗜血杆菌疫苗E免疫猪15头，随机分为三组，分别腹腔注射1个发病量的血清4型JS株毒菌液、1个致死量的血清5型ZJ株强毒菌液和1个致死量的血清12型HeB株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护。

同时设立对照组，选择对照猪15头，同等条件下随机分为三组，分别腹腔注射1个发病量的血清4型JS株毒菌液、1个致死量的血清5型ZJ株强毒菌液和1个致死量的血清12型HeB株强毒菌液，观察10天，对照组4/5以上发病或死亡。

试验结果如表5所示。

表5不同佐剂配制疫苗的效力试验结果

注：副猪嗜血杆菌病发病标准：发病猪出现发热（体温40.5℃以上，持续1～5日）、精神萎靡、咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱等临床症状。对濒死猪剖检，可见多发性浆膜炎（胸膜炎、心包炎、腹膜炎）、关节炎和脑膜炎等病变，各浆膜面（关节囊、心包膜、胸膜和腹膜）出现浆液性或纤维素性渗出物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种副猪嗜血杆菌病疫苗组合物，所述副猪嗜血杆菌病疫苗组合物包含免疫量的去除荚膜的副猪嗜血杆菌全菌抗原和兽医学上可接受的载体。

2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病疫苗组合物，其特征在于，所述去除荚膜的副猪嗜血杆菌全菌抗原为灭活形式。

3.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病疫苗组合物，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌全菌抗原为副猪嗜血杆菌血清4型、5型或12型抗原。

4.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病疫苗组合物，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌全菌抗原为副猪嗜血杆菌血清4型菌株JS株、5型菌株ZJ株或12型菌株HeB株抗原。

5.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病疫苗组合物，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌全菌抗原含量为10⁸～10¹⁰CFU/ml，优选10⁹CFU/ml。

6.根据权利要求1或2所述的副猪嗜血杆菌病疫苗组合物，其特征在于，所述载体为白油佐剂、氢氧化铝胶佐剂或者以卡波姆为基础的Montanide IMS1313VG、Montanide IMS251C VG、Montanide ISA15AVG或Montanide GEL PR聚合物佐剂。

7.根据权利要求6所述的副猪嗜血杆菌病疫苗组合物，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌全菌抗原为疫苗组合物50%～90%体积百分比。

8.一种制备所述副猪嗜血杆菌病疫苗组合物的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）将副猪嗜血杆菌菌种培养增殖得到菌液；

（2）将所述培养得到的菌液去除荚膜；

（3）将所述去除荚膜的菌液进行灭活，并浓缩菌液；

（4）将所述已灭活并浓缩的菌液和兽医学上可接受的载体进行乳化。

9.根据权利要求8所述的副猪嗜血杆菌病疫苗组合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述去除荚膜通过将培养得到的菌液置于60℃水浴30分钟实现。

10.如权利要求1～7所述的副猪嗜血杆菌病疫苗组合物在制备预防和治疗副猪嗜血杆菌感染相关疾病的药物中的应用。