CN102911878A - 一株棘孢木霉菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株棘孢木霉菌株及其应用，该棘孢木霉菌株命名为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)Thz01，保藏号为CGMCC No.6422。本发明的棘孢木霉菌株是从辣椒生境中分离出来的，对辣椒疫霉菌具有显著的拮抗作用，明显重寄生于辣椒疫霉菌，能有效降解辣椒疫霉菌的菌丝体；用该菌株制备得到的生防制剂，可有效防治辣椒疫病。
Description
技术领域
本发明涉及植物病害的生物防治领域，尤其涉及一株棘孢木霉菌株及其应用。
背景技术
辣椒疫病俗称“死秧病”，是由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的一种土传病害。该病原菌的细胞壁的主要成份是纤维素，而不同于常见的真菌病原菌(如子囊菌和担子菌)细胞壁的主要成份是几丁质。辣椒疫病是我国辣椒上的一种毁灭性病害，可造成严重产量损失。由于该病害是一种土传病害，病原菌可长期存活在土壤中，该病害也是生产上最难防治的一种病害。尤其该病原菌生物学特征的独特性，病害防治的方法和技术也明显不同与其它病害的防治。
该病害目前主要采用化学农药防治，这些常规防控技术已难以有效控制，且易引起生态、环境问题。而生防制剂在该病害的应用更是罕见。虽然木霉菌是目前为止研究最多的生防真菌，其分布很广，生存于多种生态环境中。据不完全资料统计，木霉至少对18个属29种病原真菌在体外或体内表现有拮抗作用。木霉容易分离和培养，可在多种基质上生长，具有对一定逆境条件的忍耐能力，这些特点决定了木霉菌在植病生防中的重要地位。其作用机制一般认为有4种，竞争作用，重寄生作用，酶的溶菌作用和抗菌素类的产生。从致病的植株生境中分离生防菌是一种常用的得到生防微生物的做法。然而，研究木霉菌防治辣椒疫病的机制几乎未见。
公开号CN101485336B的发明专利公开了一种防治作物土传病害的木霉菌制剂及其制备方法。该制剂的组成是，在载体中含有有效量的哈茨木霉(Trichoderma Harzianum)菌株TH-192CGMCC NO.2634。制备方法包括菌株TH-192的扩大培养、液体和固体发酵培养及添加促进剂等步骤。该制剂对根腐病、白绢病、立枯病、菌核病等作物土传病害具有一定的防治作用，但其未公开对辣椒疫病的防治情况。
公开号CN102428966A的发明专利申请公开了一种作物病害防治复合生物制剂。其原料组成为：拟康氏木霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液、水溶性甲壳糖、味精残液、黄腐酸钾。其中，拟康氏木霉和枯草芽孢杆菌是经过筛选和诱变处理获得的高效菌株，并通过液体深层发酵技术获得拟康氏木霉和枯草芽孢杆菌发酵液，再组合制成作物病害防治复合生物制剂，特别地，对枯萎病和黄萎病具有较明显的防治效果。但该复合生物制剂需要多种菌株和原料，且配制过程较繁琐，不利于大规模推广应用。
这些木霉菌防治的病原菌都是由子囊菌和担子菌引起的，与生防辣椒疫病的机制完全不同。我们筛选的生防菌是针对具有纤维素细胞壁的辣椒疫霉菌，不同于这些研究报道。
发明内容
本发明提供了一株棘孢木霉菌株，具有较强的重寄生作用，能有效降解辣椒疫霉菌的菌丝体，具有较好的辣椒疫病生防潜力。
一株棘孢木霉菌株，命名为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）Thz01，保藏号为CGMCC No.6422。所述的棘孢木霉菌株已保藏，保藏单位：位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2012年8月13号，保藏号：CGMCC No.6422。依据形态学特征和分子数据分析，该菌株的分类命名为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。
所述的棘孢木霉Thz01菌株是从临安高山蔬菜园发病的辣椒根围土土壤中采集得到的，该菌株的生物学特性为：菌落在PDA固体培养基上25℃下培养，3-4天扩展为9cm，初期白色稀疏，菌丝沿培养基表面匍匐生长，后形成绿色产孢区，反面白色，菌丝具隔；分生孢子球形，近球形，单个近无色，聚集时呈淡黄绿色，壁光滑。瓶梗直、安瓶形，宽度3.0-5.6μm。CMD上分生孢子球形至亚球形，3.8-5.9×2.8-4.8μm。形态学特征符合棘孢木霉菌特征。依据ITS rDNA(SEQ ID NO.1)和转录因子1a(tef 1-a)序列分析，与GenBank中的模式和证实的棘孢木霉菌序列最一致。这些证实该菌株为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。
本发明提供了上述棘孢木霉菌株在抑制辣椒疫霉生长中的应用。该菌株在与辣椒疫霉对峙培养时，生长迅速，能有效覆盖辣椒疫霉的菌落，明显重寄生于辣椒疫霉菌，并将其菌丝体完全降解，已显示是一个具有较好 生防潜力的微生物资源。
本发明还提供了一种防治辣椒疫病的生防制剂的制备方法，包括：将棘孢木霉Thz01种子液接种到煮熟灭菌的麦粒中，培养12-20天，培养期间及时翻动，制得生防制剂。
所述的棘孢木霉Thz01种子液可以通过如下方法制备：将棘孢木霉Thz01接种到PDA培养基中，于23-28℃下培养5-6天；培养完成后，将孢子刮入灭菌水中，配制得到棘孢木霉Thz01种子液。
所述的棘孢木霉Thz01种子液的活菌浓度优选为107-108个/mL。
所述的麦粒是适合棘孢木霉Thz01生长的基质。
棘孢木霉Thz01种子液接入麦粒后的培养时间优选为15天，便于菌种充分生长。
培养期间及时翻动可以使麦粒上充分长上棘孢木霉Thz01孢子。
以每千克麦粒计，所述的棘孢木霉Thz01种子液的用量优选为2-4mL。
本发明还提供了一种采用上述制备方法制得的生防制剂，该生防制剂为颗粒状，含有棘孢木霉Thz01。
本发明还提供了一种防治辣椒疫病的方法，包括：将上述生防制剂与辣椒种子混合，然后进行接种、栽培；
或者，在辣椒苗移植后，将上述生防制剂施加于辣椒苗根部，然后进行栽培。
为了获得更好的生防效果，所述的生防制剂的用量优选为1.0-1.5g/株辣椒，约为20-30粒/株辣椒。
本发明提供的棘孢木霉Thz01是从辣椒生境中分离出来的，对辣椒疫霉菌具有显著的拮抗作用，明显重寄生于辣椒疫霉菌，在培养基上能完全降解辣椒疫霉菌的菌丝体；用该菌株制备得到的生防制剂，可有效防治辣椒疫病。
附图说明
图1为棘孢木霉Thz01与辣椒疫霉对峙培养实验结果，其中，1号为对照；2、3、4号皿左边的菌碟为辣椒疫霉，右边的菌碟为棘孢木霉Thz01。
图2为本发明实施例3中制得的生防制剂。
具体实施方式
实施例1菌株的分离、纯化、鉴定和保藏
1、木霉菌的分离、纯化
将从发病的辣椒根围土采集的土壤充分混匀后，去少量土粒放于含有氯霉素的PDA平板上，每个平板4个土粒，重复三次。置于25℃下黑暗培养。等到木霉产孢后，及时挑出到新的PDA平板上。
短期保存的菌种于PDA斜面试管中，保存于4℃冰箱中。长期保存的木霉菌在-20℃的冰箱中(孢子+17％脱脂奶粉+硅胶颗粒)。
2、木霉菌的种类鉴定
该菌株的生物学特性为：菌落在PDA固体培养基上25℃下培养，3-4天扩展为9cm，初期白色稀疏，菌丝沿培养基表面匍匐生长，后形成绿色产孢区，反面白色，菌丝具隔；分生孢子球形，近球形，单个近无色，聚集时呈淡黄绿色，壁光滑。瓶梗直、安瓶形，宽度3.0-5.6μm。CMD上分生孢子球形至亚球形，3.8-5.9×2.8-4.8μm。形态学特征符合棘孢木霉菌特征。
对该菌株进行分子生物学鉴定：
(1)真菌基因组的提取：采用CTAB法提取真菌基因组。
(2)基因片段的扩增：1TS rDNA、tef 1-a的PCR扩增
ITS1-5.8S-ITS2片段采用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS6(5’-GAAGGTGAAGTCGTAACAAGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)扩增ITS和5.8S rDNA(Cooke & Duncan 1997)。
建立PCR反应体系，按如下反应体系(50μl)顺序加样：
PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，51℃退火30sec，72℃延伸1min共31个循环；72℃延伸7min。4℃停止反应。取8μl扩增产物在1.2％琼脂糖电泳检测，并在凝胶成像系统(Gel Doc1000)进行拍照、分析。
Tef 1-a基因采用通用引物Ef728M(Carbone and Kohn 1999)和tef1R(Kullnig-Gradinger et al.2002)。
在50ul反应体系中，加入：
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，63℃退火45s，72℃延伸1min共35个循环；72℃延伸7min。4℃停止反应。取8μl扩增产物在1.2％琼脂糖电泳检测，并在凝胶成像系统(Gel Doc1000)进行拍照、分析。
(3)PCR产物序列测序
PCR产物直接进行双向测序，ITS、tef 1-a扩增产物分别用扩增引物测序。
(4)序列分析
测序后的序列用Clustal X程序进行rDNA序列的联配(alignment)比较、编辑，然后提交Gen Bank。将序列与Gen Bank中的木霉的ITS1、ITS2和5.8S rDNA序列进行同源性比较。
用引物ITS4、ITS6测序拼接后得到的序列如SEQ ID NO.1所示。
用引物Ef728M和tef1R测序拼接后得到的序列如SEQ ID NO.2所 示。
将序列与Gene Bank上的序列进行比对，可确定该菌株为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，命名为棘孢木霉Thz01。
3、木霉菌的保藏
将棘孢木霉Thz01保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2012年8月13号，保藏号：CGMCC No.6422。
实施例2对峙培养法
将棘孢木霉Thz01和辣椒疫霉菌株转接在PDA培养基上活化，辣椒疫霉生长48h后，用直径0.5cm打孔器在菌落边缘切成菌饼，将菌饼接种到培养皿的一端，25℃培养48h后，将打好孔的木霉菌株接种到培养皿另一端，每个木霉菌株处理三次，同时以只接疫霉菌做空白对照，培养7天后观察是否有拮抗作用，并拍照记录。
棘孢木霉Thz01菌株与辣椒疫霉菌株对峙培养实验结果见图1。1号为对照，2、3、4号皿左边的菌碟为辣椒疫霉，右边的菌碟为棘孢木霉Thz01，可见棘孢木霉Thz01完全覆盖辣椒疫霉的菌丝，并将其菌丝消解，使其无法侵染辣椒，说明该棘孢木霉能够抑制辣椒疫病的发生。
实施例3防治辣椒疫病
生防制剂的制备：利用饲料小麦粒作为基质，将棘孢木霉Thz01制成生防制剂。具体步骤为：
(1)菌株活化：将棘孢木霉Thz01接种到PDA培养基中，于25℃下培养5天；
(2)制备种子液：菌株活化后，将孢子刮下来，刮入灭菌水中配制成活菌浓度为107个/mL的孢子悬浮液，即为种子液；
(3)将种子液接种到煮熟灭菌的麦粒中，培养15天，培养期间及时翻动，使麦粒上充分长上棘孢木霉Thz01孢子，制得生防制剂；其中，以每千克麦粒计，种子液的用量为3mL。
所制得的生防制剂产品见图2。
生防实验：
(1)辣椒定殖(即移苗)期间，在根际周围施用生防制剂，每株施 用25-30粒(约1.25-1.5g)。
(2)一个月后，用灌根接种方法接种疫霉菌孢子悬浮液，悬浮液浓度为107个/ml，每株辣椒接种3mL。每个处理15株，设计3个重复。
(3)接种病原菌后，每天记录发病情况，并计算发病率和病情。
经分析，接种生防制剂的防治效果达到了65％-72％。
Claims (8)
1.一株棘孢木霉菌株，其特征在于，命名为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)Thz01，保藏号为CGMCC No.6422。
2.如权利要求1所述的棘孢木霉菌株在抑制辣椒疫霉生长中的应用。
3.一种防治辣椒疫病的生防制剂的制备方法，其特征在于，包括：将棘孢木霉Thz01种子液接种到煮熟灭菌的麦粒中，培养12-20天，培养期间及时翻动，制得生防制剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的棘孢木霉Thz01种子液的活菌浓度为107-108个/mL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，以每千克麦粒计，所述的棘孢木霉Thz01种子液的用量为2-4mL。
6.采用如权利要求3-5任一所述的制备方法制得的生防制剂。
7.一种防治辣椒疫病的方法，其特征在于，包括：将如权利要求6所述的生防制剂与辣椒种子混合，然后进行接种、栽培；
或者，在辣椒苗移植后，将如权利要求6所述的生防制剂施加于辣椒苗根部，然后进行栽培。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的生防制剂的用量为1.0-1.5g/株辣椒。
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