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CN102741403B - 二硫键连接的二聚体蛋白质在丝状噬菌体上的展示 - Google Patents

二硫键连接的二聚体蛋白质在丝状噬菌体上的展示 Download PDF

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CN102741403B CN201080052711.3A CN201080052711A CN102741403B CN 102741403 B CN102741403 B CN 102741403B CN 201080052711 A CN201080052711 A CN 201080052711A CN 102741403 B CN102741403 B CN 102741403B
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Abstract

本发明提供了用于复杂同型二聚体蛋白质在噬菌体颗粒的表面上展示的方法，以及展示为与丝状噬菌体pIX外壳蛋白形成的融合多肽的这种蛋白质的组合合成文库。异型二聚体的或更复杂的链间键合结构，如二硫键连接的多聚体蛋白质，可用本发明的方法展示。

Description

二硫键连接的二聚体蛋白质在丝状噬菌体上的展示
背景技术
优先权申请
本申请要求于2009年11月17日提交的美国申请No.61/261,767的优先权，将该专利以引用的方式全文并入本文。
技术领域
本发明涉及用于产生pIX噬菌体展示文库及使用该文库来制备二聚体抗体片段、完整抗体或其它二硫键连接的多聚构建体的组合物和方法。
关于本领域的讨论
丝状噬菌体展示是一种广泛使用的基于亲和力选择蛋白质的技术，因为在选择过程中每个噬菌体颗粒将编码多肽的核酸与其外壳蛋白的N端融合连接在一起。M13噬菌体编码五种外壳蛋白，在噬菌体的一端具有大概五个拷贝的次要外壳蛋白pIII和pVI，在噬菌体的另一端具有相同数目的pVII和pIX。噬菌体DNA由大概3000个拷贝的主要外壳蛋白pVIII包封。尽管已经用M13的每种外壳蛋白实现了外源多肽的展示，然而pIII和pVIII仍是目前最常用的融合伙伴。使用该技术，已构建了肽、Fab、scFv和其他蛋白结合物(proteinbinder)的文库并且可用于各种应用，具有极大商业价值。
pIII外壳蛋白由于其大小、构象和低拷贝数而较pVIII蛋白更受欢迎。pIII次要外壳蛋白是负责噬菌体感染进大肠杆菌中的404个氨基酸、42kD的蛋白质，其包括由柔性铰链区段连接的三个结构域。与pIII的N端融合可系住离开噬菌体表面的所展示的蛋白质，从而与融合至小的高拷贝数的pVIII外壳蛋白相比配体更有可能接近进行结合。pIII蛋白是感染和融合的初始步骤所必需的，除了小的肽和蛋白质之外所有肽和蛋白质可干扰该过程。该问题例如通过使用含有另一拷贝的野生型pIII蛋白的病毒载体或采用辅助噬菌体的噬菌粒系统来解决。与pIII和类似的pVIII形成对比，pVII和pIX是分别为33个和32个氨基酸的短螺旋蛋白质，在噬菌体表面紧密包装。然而，已在pIX上展示了scFv(Gao，C.等人，ProcNatlAcadSciUSA99，12612-12616，2002)和Fab(Shi，L等人，JMolBiol397，385-396，2010；Tornetta，M等人，JImmunolMeth360，39-46，2010)文库并进行了选择。已通过将不同的多肽与pVII和紧密相邻的pIX二者融合描述了Fv和肽的异型二聚体展示(Gao等人，1999ProcNatAcadSci96：6025-6030和JandaUS7078166)。此外，已报道了单一特异性scFv的pVII展示(Kwasnikowski等人，2005.JImmunolMethods307：135)。也已描述了一种备选的方法，在该方法中由噬菌体或噬菌粒载体编码的外源蛋白(exoprotein)不与外壳蛋白融合，而是通过二硫键键合共价连接至重新工程改造的外壳蛋白pIII和pIX(US6753136)。
在噬菌体颗粒的表面上展示二聚体蛋白质以及异型二聚体蛋白质的能力在以组合文库形式模拟更复杂的蛋白质结构方面是有利的。一直需要推进现有技术来产生筛选复杂蛋白质的变体的高通量方法，复杂蛋白质的变体为例如人IgG的变体，人IgG为通过分子间的二硫键连接的重链和轻链对(异型二聚体)的同型二聚体。至今，还不可能演示完整的抗体重链在丝状噬菌体上的正确装配和展示。本发明的文库和方法通过将全面的设计、装配技术以及噬菌体pIXFab展示相结合来满足这些需要。
发明内容
本发明提供了利用M13外壳蛋白pIX在丝状噬菌体上展示二硫键连接的二聚体蛋白质以及更复杂结构的容易手段。在本发明中，所展示的蛋白质为融合蛋白，其包含pIX外壳蛋白、折叠的结构域如CH2结构域，这两个结构域连接至包含半胱氨酸残基的多聚体化结构域，如铰链结构域。在一个特定的实施例中，该二聚体蛋白质是同型二聚体，其中成员是二硫键连接的，并且该蛋白质包含抗体Fc。在另一个实施例中，该二硫键连接的同型二聚体蛋白质包含人抗体蛋白质，其中至少铰链结构域和恒定结构域存在于包含该同型二聚体的多肽的每一者中，并且任选地，该同型二聚体结构还通过形成二硫键与独立表达的抗体轻链联合(associate)。
本发明提供了编码至少一种融合蛋白的可复制载体，其具有融合至编码pIX外壳蛋白的序列的编码外源多肽的序列，其中该外源的非噬菌体蛋白部分是形成同型二聚体的多肽链。在一个实施例中，该融合的形成同型二聚体的多肽形成Rc-融合蛋白。在另一个实施例中，该同型二聚体结构可进一步与异型多肽相连以形成更复杂的结构。在一个方面，抗体重链多肽和轻链多肽二者在单个噬菌体分子中的展示会导致功能性抗体分子在噬菌体颗粒表面装配，例如但不限于完整的IgG分子。包括在本发明中的是含有可复制载体和能够在其表面展示融合多肽为二硫键连接的二聚体蛋白质的噬菌体颗粒的宿主细胞。该载体可任选包含编码分泌信号的多核苷酸，所述分泌信号有效融合至编码所展示的多肽-外壳蛋白融合物的多核苷酸序列。
还提供了是用于构建二硫键连接的二聚体蛋白质的pIX噬菌体展示从头文库的方法和载体，所述文库组装、筛选以及诸如本领域实施用于抗体组合物的选择和改善之类的其他讯问性技术。在一个实施例中，提供了含有展示多种不同融合多肽的噬菌体颗粒的宿主细胞的文库，所述融合多肽能够在噬菌体颗粒表面上形成连接至pIX蛋白的二聚体结构。在一个方面，该文库在噬菌粒系统中编码。
在一个实施例中，本发明的文库可包含重链可变区的文库；其可还包含轻链可变区的文库；并且其还可包含变体Fc区的文库。可对本发明的文库进行淘选、分选或其他选择程序以便从该编码蛋白质的文库中鉴别和分离具有所需的、增强的或减少的性质如与靶配体的结合改变或对效应分子(如FcγR和/或C1q)的结合改变的多核苷酸。
附图说明
图1.用于表达pIX连接的Fab的起始载体的示意图。
图2A-B成Fc构建体的pIX噬菌粒载体的示意图(A)，该示意图示出了lacZ启动子、添加在细菌信号肽pelB的上游的核糖体结合位点(RIBS)的相对位置、连接编码Fc多肽、噬菌体次要外壳蛋白pIX或pVII的多核苷酸的柔性连接物(G4S)的位置；以及用于全长IgG结构在pIX上表达的双顺反子噬菌粒载体的示意图(B)。
图3A-B为示出了如实例1中所述构建的重组噬菌体颗粒上的ELISA的结果的曲线图，说明了Fc融合蛋白(A)或EMP-1-Fc(B)的增加，其中重组噬菌体颗粒被捕集于包被有抗Fc单克隆抗体(A)或抗EMP1单克隆抗体CNTO3443(B)的板上，捕集的噬菌体用HRP缀合的抗pVIII单克隆抗体检测。辅助噬菌体为阴性对照，在B中Fc噬菌体为阴性对照。实验中使用了两份独立的噬菌体制备物。
图4为来自结合测定法的曲线图，示出了在噬菌体上展示的Fc结构域能够与蛋白A结合。
图5A-B为来自在最佳结合酸度pH6.0下(上图)和在非特异性结合条件pH7.5下(下图)进行的FcRn结合测定法的曲线图。
图6示出了使用抗人Fc抗体来检测的蛋白质印记，证实了分离和且在非还原条件下(泳道1，NR)和还原条件下(泳道2，R)跑电泳的蛋白质的二聚体性质，显示在非还原条件下主要的带的分子量大约为还原条件下主要的带的分子量的两倍。
图7A-D为示出了ELISA方法中产生的关于使用多种对噬菌体上表达的抗体结构域、表达的EMP-1-Fc构建体或噬菌体本身具有特异性的配体，从所指明的在具有或不具有lac诱导剂IPTG的条件下培养的制备物捕集的噬菌体的信号的柱状图：(A)抗Fd(CH1)抗体捕集；(B)抗k抗体；(C)抗CH2抗体；和(D)抗CH3抗体。将在pIX上展示6-2Fab或非免疫球蛋白的噬菌体包括在内作为阴性对照。
图8为柱状图，示出了使用商购的抗IL13抗体以及在存在或不存在竞争性可溶性抗IL13单克隆抗体(与抗IL13IgGpIX具有相同的特异性)的条件下(方格状柱条)，ELISA方法中产生的关于从所指明的制备物捕集的噬菌体的信号。EMP-1-Fc构建体为不结合IL13的阴性对照，将IL13特异性的在噬菌体上展示为pIX融合物的6-2Fab包括在内作为阳性对照。
图9A-B为示出了ELISA方法中产生的关于板中由商购抗IL13抗体捕集的噬菌体的信号的柱状图，其中在添加IL13抗体后添加渐增量的噬菌体上的竞争性抗IL13抗体(6-2全长IgG)或对IL13无特异性的对照抗体(抗EMMPRIN)(A)以及板中由商购抗IL13抗体捕集的噬菌体的信号的柱状图，其中在添加商购的抗IL13抗体后，添加噬菌体上的6-2Fab。添加了渐增量的抗IL13单克隆抗体或抗EMMPRIN单克隆抗体(B)。
图10示出了在将生物素化IL13或IL17A抗原用于捕集展示IL13或IL17A的全长IgG构建体后以及在存在或不存在竞争性可溶性抗IL13单克隆抗体或抗IL17A单克隆抗体的情况下，来自由结构域特异性抗体抗Fd、抗k、抗CH2和抗CH3任一者捕集的噬菌体的信号。用抗M13抗体(y轴)检测噬菌体。
序列表简述
SEQ ID NO： 说明 特征
1 IgG1铰链 核心11-15
2 IgG2铰链 核心8-12
3 IgG3铰链 核心13-61
4 IgG4铰链 核心8-12
5 IgG1 CH2
6 IgG2 CH2
7 IgG3 CH2
8 IgG4 CH2
9 IgG1 CH3
10 IgG2 CH3
11 IgG3 CH3
12 IgG4 CH3
13 J-片
14 pel B P6S
15 OmpA A11P
16 EMP-1
17 突变型IgG4成Fc 1型多肽
18 突变型IgG4成Fc 2型多肽
19 人IgG1 CH1结构域
20 人IgG1成Fc蛋白
具体实施方式
缩写
ADCC＝抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，ADMC＝抗体依赖性单核细胞介导的细胞毒性，c1q＝补体因子1q，EPO＝重组促红细胞生成素，FcR＝Fc受体；Ig＝免疫球蛋白；Hc＝重链；Lc＝轻链；IPTG＝异丙基硫代-β-半乳糖苷；
定义
如本文所用，除非另外指明或根据上下文显而易见，否则抗体结构域、区域和片段与本领域众所周知的标准定义一致。本发明的蛋白质源自一种或多种免疫球蛋白类型的抗体的部分或包含一种或多种免疫球蛋白类型的抗体的部分。免疫球蛋白类型包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同种型，在IgG和IgA的情形中，包括它们的亚型如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
所谓“顺反子”其意指DNA分子中编码氨基酸序列的核苷酸序列并且包括上游和下游DNA表达控制元件。
所谓“外源多肽”或“外源蛋白质”或“外源蛋白”其意指不是由野生型丝状噬菌体基因组正常编码的蛋白质，而是对正常噬菌体蛋白质来说是外来的。典型的外源多肽是所关注的任何多肽，包括抗体免疫球蛋白重链(Hc)结构域或免疫球蛋白轻链(Lc)结构域、免疫球蛋白重链可变结构域(VH)、免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)、天然的或合成的多肽、单链抗体(scFv)或免疫球蛋白结构域的序列或组合，例如它们特别是作为可包括CH3、CH2、铰链区域和/或CH1结构域或它们的片段的Fc结构域天然出现。
所谓“Fc”(给予木瓜蛋白酶消化的IgG的可结晶裂解片段的标签)其意指抗体的功能性片段，该片段包含源自抗体恒定结构域的多肽链且具有链间的二硫键键合的二聚体结构。在人IgG1中，木瓜蛋白酶产生C端至Cys226(用如Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1991)所述的EU索引进行编号，将该文献以引用的方式明确地并入本文)的片段。“如Kabat中所述的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。尽管Fc的N端残基的定义可能会不同，但其通常理解为包括Kabat编号系统中的至少残基223，其为第一个链间键合的半胱氨酸N端的第三个残基(Kabat系统中的C226)。该分子的Fc部分不直接涉及抗体与其特异性靶抗原接触，但介导效应物功能。这些功能具有两种类型：(1)要求抗体与抗原结合的功能，如C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性或IgG的Fc受体γ型结合、IgE的Fc受体ε结合、IgA的Fc受体α结合后的ADCC和ADMC；以及(2)不依赖于抗原结合的功能，如通过结合FCRn和胞转穿过细胞和组织屏障(如肠)的能力保持在循环中。特别是通过Fc的融合显著增加抗体分子或其他分子的血清半衰期的能力是高度有利的。存活更长的分子可减少临床治疗中所需的量，从而减少施用的频率。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体的Fc区结合的受体。FcR包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类，包括这些受体的等位基因变体以及这些受体的选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，它们具有主要在它们的胞质结构域不同的相似氨基酸序列。活化性受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸活化基序(FAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(参见Annu.Rev.Immunol.，1997，15：203-234中的综述；Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，1991，9：457-92；Capel等人，Immunomethods，1994，4：25-34；以及deHaas等人，J.Lab.Clin.Med.，1995，126：330-41中对FcRs进行了综述，将上述每一篇文献以引用的方式并入本文)。
所谓“融合多肽”或“融合蛋白”其意指包含分别由第一和第二核酸序列编码的第一和第二多肽的融合多肽(蛋白质)，这两条多肽是有效连接的。如本文所用，应该理解，融合蛋白含有“有效连接的”组分和结构域意指例如，融合的多肽或多核苷酸元件被连接使得每一者可按预期行使功能或发挥作用。例如，可将调节表达的元件，如启动子、操纵子或增强子有效连接至要对其表达进行调节的核苷酸序列。元件之间以及其中的连接可以是直接的或间接的，如通过接头连接。元件不必是相邻的。
术语“文库”表示所编码的蛋白质的集合，这些编码的蛋白质是变体，也就是说，其中某些区域相同或相似，而其他区域可有差别。变异区域可以是通过定向变异或随机变异(随机或非随机的改变)。文库或变体可就不同变体的数目或文库的“大小”来描述。可用的从头抗体文库具有高的多样性(＞1010)，可进行改变，易于组建，并且具有低的不期望序列的背景。结合如下方法可加速文库组建并且可导致低的背景：(a)基于Kunkel的单链诱变；(b)具有限制性位点的回文环；以及(c)使用巨引物方法。
“噬菌粒”或“噬菌体载体”是含有源自噬菌体染色体和外源DNA(如来自质粒的那些)二者的组分的克隆和表达载体。因为噬菌粒含有噬菌体基因组的一部分，在用辅助噬菌体同时感染宿主时，其可包装成噬菌体颗粒。本发明的噬菌粒可包装成噬菌体M13颗粒。已通过插入或掺入异源DNA(如编码本发明融合蛋白的核酸或本发明提供的表达盒)来操纵噬菌粒或噬菌体载体。这种表达载体通常含有用于在宿主细胞中有效转录插入的核酸的启动子序列。
概述
天然的抗体(其为二价抗原结合蛋白)依赖Fc恒定结构域和铰链区来正常结合重链。优选CH2结构域和CH3结构域源自人种系序列如WO2005005604中描述的那些或可通过搜索包含天然的或经工程改造的抗体序列的数据库发现的那些。通常，本发明的蛋白质构建体包含与一个或多个恒定结构域或其部分连接的铰链区。一般期望掺入通常存在于Fc中的全部恒定结构域；如SEQIDNO：1-4中所示的铰链或其含有一个或多个半胱氨酸残基或其他成硫键或硒硫键的残基的部分；SEQIDNO：5-8所示例的CH2或其变体，以及SEQIDNO：9-12所示例的CH3或其变体，以便保留全部的相关功能如结合受体的能力以及增加在体内的持久性。本领域技术人员应该理解，由本文提供的那些序列所描述的序列是非限制性的，天然抗体结构域序列的和变体抗体结构域序列可在通过互联网在多个数据库中或在许多出版物中找到，这些序列可用于实践本发明。此外，构建体可任选包含CH1结构域的一些或全部，或者抗体可变结构域的一些或全部也可存在，如SEQIDNO：13的可变结构域。当然，这些结构域会存在于全长IgG构建体中。必要时为了抗体结构域的正确表达和折叠可将其他抗体序列和非抗体序列包括在内，如信号肽或分泌肽如编码SEQIDNO：14(pelB)和15(ompA)的氨基酸序列的那些。然而，本发明考虑仅包括某些恒定结构域且不包括其他的结构，以及其中可存在非抗体来源的结构域的结构。
因为Fc功能依赖于Fc的不同部分，如果不足完全功能性是所需的话，可将较少的CH结构域掺入重链。例如，明显的补体激活需要IgG的CH2或IgM的CH3。本发明还考虑使用经修饰的铰链和Fc重链结构域，这些结构域可具有氨基酸置换、缺失、插入或修饰，只要该重链可联合成稳定的复合物。
此外，共价连接的二聚体结构(其通常会形成为二硫键连接的结构)也可通过硒代半胱氨酸键合、高半胱氨酸键合或硫-硒键合(sulphide-selenidebonding)来形成。除了包含链间共价键合残基的抗体铰链外，可用其他多聚体化结构域代替来形成二聚体结构或更高级结构。这些多聚体化结构域可以是天然的或人工的，如单个半胱氨酸或硒代半胱氨酸残基或者包括基序，如亮氨酸拉链基序，以帮助外源蛋白-外壳蛋白融合蛋白的多肽在噬菌体颗粒的表面联合。
就全长抗体蛋白质而言，重链-轻链异型二聚体通过特定的重链恒定结构域联合，而形成更高级的结构。例如，IgG型抗体包含四聚体结构中的共价键连接的两个重链-轻链异型二聚体。某些其他抗体类型包含类似的四聚体结构，这些四聚体结构整合成包含例如两个四聚体(IgA)或十个四聚体(IgM)的更高级结构。
在使用噬菌体外壳蛋白来展示大的外源蛋白分子时，如果连接至所有拷贝的外壳蛋白的话，所展示的蛋白质可干扰重组噬菌体颗粒的装配。为了避免装配干扰，可使用噬菌粒系统，如(Gao等人，ProcNatlAcadSciUSA，99：12612-12616，2002)描述用于pIX展示的噬菌粒系统，其中野生型编码序列和外源蛋白连接的编码序列二者均存在于载体中，并且这两种蛋白质均掺入重组噬菌体颗粒中。
本发明的申请人已出乎意料地发现，形成本文所述的抗体的Fc部分的抗体组分可在丝状噬菌体颗粒表面展示为与pIX或pVII外壳蛋白的融合蛋白，其作为二硫键连接的同型二聚体蛋白，显示出天然抗体的Fc结构域的已知生物活性，如Fc受体结合，并且当为二价抗原结合蛋白的形式时，能够进行抗原结合。因而，与噬菌体颗粒上的抗体结合片段的单体、单价展示形成对比，多价蛋白质展示的多聚体展示是受考虑的。因而，本发明提供了一种系统，用于在更完全范围的天然抗体的功能特性中进行操纵和选择。这种特性包括促进针对在细胞表面展示所关注的特定抗原的细胞的免疫应答和为所制造的抗体样治疗剂的生物活性的重要组分的那些Fc功能。免疫系统效应细胞包括抗原特异性细胞如T细胞(其激活细胞免疫应答)和非特异性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞和天然杀伤(NK)细胞(其介导细胞免疫应答)。
实施本发明的方法
在丝状噬菌体颗粒上展示的融合蛋白中，外源多肽与丝状噬菌体pVII或pIX蛋白之间的“融合”可以是通过酰胺键直接连接，或者可包含连接多肽(即“接头”)。可使用多种接头中的任何一者，所述接头通常为一段长度为约5至50个氨基酸的序列。尤其优选的接头可在接头处给融合蛋白提供高度的活动性。缺乏二级结构的接头，如主要由甘氨酸(G，Gly)残基构成的那些，如具有G4S(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)重复或G3S(Gly-Gly-Gly-Ser)的那些(其中重复的数目通常为1至12)可用于该目的。
第一多肽为外源蛋白质，第二多肽为丝状噬菌体pVII或pIX蛋白，其中该外源蛋白质融合至该丝状噬菌体蛋白的氨基末端。另外，当融合蛋白为非成熟形式时，即其中引导序列还未被加工(移除)时，融合蛋白还可含有如本文所述的氨基末端的原核分泌信号，如野生型或突变型pelB或ompA序列(分别为SEQIDNO：14和15)等等。
在天然抗体中，轻链多肽链和重链多肽链独立地编码和表达。IgG类分子的典型异型二聚体结构依赖于该分子的四条多肽链(两条重链和两条轻链)中和之间的正确装配和二硫键形成。因而，在本发明中，抗体的二聚Fc部分的装配和/或轻链的联合(在存在时)重现了抗体形成的天然过程，其中蛋白质的各结构域自我联合并在二者间形成二硫键。
在一个实施例中，要在丝状噬菌体颗粒的表面上展示的含Fc蛋白质是天然的抗体，并且构建了用于Fc构建体-pIX融合蛋白以及将会自己联合的独立编码和表达的抗体Lc或抗原结合结构域的表达的双顺反子载体。本发明的抗原结合蛋白可具有任何表位、抗原位点或蛋白质的结合位点。优选的抗原结合蛋白可通过直接与受体结合或通过与它们的同源配体结合来中和受体蛋白质活化。一般来讲，抗原结合结构域将由与包含Fc结构域的天然抗体Hc序列融合的抗体Lc和抗体Hc可变结构域形成。在另一个实施例中，pIX融合蛋白包括与Fc结构域连接的scFv。在本发明的另一个方面，构成scFv的重链和轻链的抗原结合位点可有变化以提供两种不同的结合特异性，从而使在噬菌体表面展示的自装配的二硫键连接的构建体蛋白质为双特异性的二价分子。例如，替代IgG分子的VL和VH结构域的是具有不同特异性的scFv结构域，使得所得的分子能够同时结合两种不同的表位。产生具有多个可变结构域对的双特异性抗体分子的其他方法在US20020103345A1中有教导，这些双特异性抗体分子可用本发明的方法在噬菌体颗粒上展示，将该文献以引用的方式并入本文。
在一个实施例中，抗原结合或受体结合结构域不是源于抗体结构域而是与Fc结构域融合的已知的或随机的肽序列。连接到Fc的交替链上的生物活性肽(任选在二者之间具有接头部分)可以相同或不同。只要最终缀合物表现出所需生物活性，该生物活性肽可以从该肽的任何残基连接到居间的接头或Fc。生物活性可通过体外测定法测量，例如对于结合活性来说，可通过例如动物疾病模型的体内活性或通过受试者施用缀合物之后的响应来测量。
申请人共同待审的申请WO04/002417、WO04/002424、WO05/081687和WO05/032460描述了在本文中称为MIMETIBODYTM结构的结构，将这些专利申请的每一者以引用的方式全文并入本文，并且将所述结构包括在内作为本发明的二硫键连接的二聚体结构，其可与pIX或pVII噬菌体外壳蛋白融合并在噬菌体颗粒的外表面展示。
在一个实施例中，MIMETIBODY包含一对生物活性肽-接头-铰链-CH2-CH3多肽，该对多肽通过缔合或共价键，特别是Cys-Cys二硫键连接。生物活性肽可具有任何长度并且可以是源自任何物种的天然存在的序列或为人工序列。该肽通常将由噬菌粒载体编码并与用于在噬菌体颗粒上展示的构建体的Fc部分融合。这种组合物的一个例子包含作为生物活性肽的EPO-拟肽。因而，拟EPOCH1缺失型MIMETIBODY模拟具有其固有的特性和功能的抗体结构，同时展示出治疗性肽及其固有的或获得的体外、体内或原位性质或活性。本发明还涵盖类似结构的其他构建体，其中肽不具有已知的生物活性，但其表现出起到标记物、标签、抗原的作用，或者提供报告基团、螯合基团等的缀合。
在一个典型的实施例中，含Fc融合蛋白或“MIMETIBODYTM”具有缺少少许或整个免疫球蛋白CH1结构域的式(I)：
V1o-Pepa-Flexn-V2m-Hinge-CH2-CH3(I)
其中Pep表示能特异性识别靶标的生物活性肽或多肽，Flex为可任选的通过让MIMETIBODY具有可供选择的取向和结合性质而提供结构柔性的柔性接头多肽，V1和V2为托架序列(bracketingsequence)，Hinge为免疫球蛋白铰链区的至少一部分，例如SEQIDNO：1-4，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，例如SEQIDNO：5-8，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，例如SEQIDNO：9-12；m、n和o可以是0或者可以是1至10的整数，a可以是1至10的整数。Pep序列可任选包括出于稳定目的或任何数目的生物物理功能的序列。在典型的实施例中，托架序列源于抗体可变(V)结构域如Vh骨架，V1为序列QIQ，V2表示源于免疫球蛋白J基因结构域的序列，为GTLVTVSS(SEQIDNO：13)。所得的多肽可通过缔合或共价键(例如但不限于Cys-Cys二硫键)连接至其他多肽。
可另外在转录水平上控制pIX融合蛋白的表达水平。融合蛋白处于LacZ启动子/操纵子系统的诱导型控制之下(见图1)。其他诱导型启动子也可使用并且是本领域技术人员已知的。为了高水平表面表达，将抑制子文库(suppressorlibrary)在LacZ启动子的诱导剂如异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)中培养。诱导型控制是有利的，因为相当非功能性pIX融合蛋白的生物选择可通过在非表达条件下培养该文库来最少化。然后可仅在筛选时诱导表达以确保文库中整个抗体群体精确地呈现于噬菌体表面。
编码二聚化多肽噬菌体外壳蛋白融合蛋白的载体可在外源蛋白编码区和噬菌体外壳蛋白编码区的接合处包括翻译终止密码子。当在携带相应的转录终止抑制子的细菌细胞中表达时，该融合蛋白得以产生。当在不具有相应的抑制子的细菌细胞中表达时，游离的外源蛋白不会产生。
使用本发明的方法
将本文示例的噬菌体载体用作起点，可利用定点诱变在特定的各分立残基位置或在诸如N-连接糖基化序列(通常称为NXT序列)之类的区域对蛋白质进行多样化处理以产生分子文库。特别有用的是改良的Kunkel诱变方法，该方法可用于产生亿万个大肠杆菌菌落，每个菌落具有不同的外源蛋白序列。虽然有效，但当产生高度复杂的序列文库时，非诱变亲本DNA的百分比增加。此外，当用于制备在较远区域包含序列多样性的文库时，长寡核苷酸合成的技术限制降低了该方法的有效性。为了克服这些限制，可使用另外的产生超过350个碱基的寡核苷酸的技术。这些技术包括使用巨引物和在诱变模板中产生含有限制性酶识别位点的颈-环序列结合标准的Kunkel诱变方法(Kunkel等人1987MethodsEnzymol154：367-382)，如US20050048617中所述。与其他文库技术如限制性酶切克隆(restrictioncloning)(Marks等人，1991J.Mol.Biol.222：581-597；Griffiths等人，1994EMBOJ.13，3245-3260；Hoet等人，2005NatureBiotechnol23，344-348)、噬菌体重组(Gigapack，Invitrogen)和序列特异性重组相比较，该改良的基于Kunkel的方法在产生序列多样性文库(大于109)方面明显更有效并且更易于在靶DNA的任何位置引入序列多样性。
在期望针对所需的结合特性筛选大的这种分子群体时，含Fc蛋白质在丝状噬菌体上的展示特别有用。在一个实施例中，用允许携带Fc构建体-pIX融合基因的载体DNA优先包装成噬菌体颗粒的M13变体感染表达Fc构建体-pIX蛋白融合物的细菌细胞。每一所得的噬菌体颗粒可展示特定的Fc构建体-pIX融合蛋白并且含有编码该Fc构建体-pIX融合物的载体。可通过淘选程序针对所需的结合特性富集这种噬菌体颗粒的群体。通常，将所需的颗粒固定于包被有所需噬菌体颗粒可与之结合的抗原的固体表面上。收集结合的颗粒并用于进一步感染细菌细胞。重复该淘选程序以针对所需的结合特性进一步进行富集。
在一个实施例中，将噬菌体文库用于针对与天然的或重组的Fc受体，如FcRγIII(CD16)、FcRγII(CD32)和FcRγI(CD64)的结合的增强、降低或改变，来筛选分子的Fc部分的变体。
噬菌体和其他抗体展示方法为操纵相对抗原或受体靶标的体外选择提供了机会。体外选择方法的一个特定的优点是能够操纵选择程序来获得与靶蛋白质上的多种位点结合的抗体。作为另一种选择，可将完整细胞用于选择结合物。
噬菌体文库简化了对与功能属性相关的遗传材料的检索，然而，需要多步骤的淘选策略来从文库分离最佳的候选物。结构域或表位引导的淘选已成为选择与靶蛋白质结合的抗体的常规方式。这种选择已主要通过利用分别称为选择性淘选(selectivepanning)、去除选择淘选(de-selectivepanning)、配体捕集(ligandcapture)、减法淘选(subtractivepanning)或引导选择(pathfinderselection)的方法，采用对抗体的分步选择来实现。
在减法淘选中，可将具有重叠的但不完全相同的位点的靶标用于去除对不期望的结合物的选择。已将该策略用于鉴别甚至未知的抗原的结合物，如使用正常细胞来去选择癌细胞的结合物的用法一样。作为另一种选择，将具有一些共同结构域或结构的天然存在的蛋白质用于顺序选择或竞争选择以获得与相关抗原中不同的或相同的位点结合的抗体。在一些情况下，可将天然存在的蛋白质如相关的趋化因子或蛋白质的突变形式用于减法淘选。
配体捕集引导的淘选与在如下方面与ELISA夹心测定法类似：将针对不相关的或不相邻的表位的固定化抗体用于捕集靶配体的优选的结合面并将其提供用于噬菌体淘选(US6376170)。有人已使用竞争性抗体来在非所需靶结构域处选择性地遮蔽抗原(Tsui，P.等人，2002.J.Immunol.Meth.263：123-132)。引导选择技术使用单克隆抗体和多克隆抗体，以及直接或间接与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的天然配体。在存在生物素酪胺的情况下，这些分子催化紧邻靶抗原结合的噬菌体的生物素化，从而使得能用链霉亲和素从总全体中特异性回收“带标签”的噬菌体。以该方式，与靶标本身结合，或紧邻靶标处结合的噬菌体得以选择性回收(Osborn，J.K.等人，1998.Immunotechnol.3：293-302)。可采用这些方法、这些方法的变型形式以及本领域技术人员已知的其他方法来查询本发明的pIX-外源蛋白文库。
虽然已概括地描述了本发明，但是本发明的实施例还将在以下的实例中进一步公开，所述实例不应理解为对权利要求所保护的范围的限制。
实例1.Fc融合蛋白在pIX上的展示
A.噬菌粒载体构建
噬菌粒载体pCGMT9(Gao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.96：6025-6030，1999，US6472147)用作开发噬菌粒pIX展示载体的骨架，该噬菌粒pIX展示载体能够插入重链恒定结构域用于通过pIX融合进行噬菌体展示。在该噬菌粒中，存在大肠杆菌的复制起始点(colE1)和丝状噬菌体的复制起始点(f1)，以及还存在可赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
基于已经改造而适于双顺反子表达的Gao载体pCNTO-Fab-pIX(如WO2009/085462和图1中所公开的)构建了用于展示含Fc蛋白(包括MIMETIBODYTM分子)的pIX噬菌粒载体。与用于Fab噬菌体展示的策略不同，未表达可溶性Fc(图2A)，在用于Fab噬菌体展示的策略中可溶性轻链在相同细胞中表达并与系住的多肽联合。
删除该载体中的Fab轻链序列。将该载体中的Fab重链序列用Fc或构建体或MIMETIBODYTM构建体替换。如下实现噬菌粒载体的构建，该载体具有含半胱氨酸对的Fc，具有核心铰链。通过PCR从含Fc的质粒扩增编码人IgG1的核心铰链、CH2和CH3的Fc基因片段。将Nco限制性位点掺入5’引物端，将SacII限制性内切酶位点掺入3’引物端。用NcoI和SacII限制性内切酶消化PCR扩增的DNA片段和噬菌粒载体(pCNTO-Fc-pIX核心Hg)。纯化消化产物，用快速连接试剂盒进行连接，并转化进DH10B大肠杆菌中。利用DNA测序筛选转化的克隆，然后将显示正确序列的克隆转化进用于噬菌体制备的TG-1大肠杆菌中。
通过限制性酶克隆，用编码完整CNTO530融合蛋白的序列替换Fc编码序列，构建编码EMP-1(SEQIDNO：16)-Fc(SEQIDNO：17)构建体(在美国专利7393662以及其中的SEQIDNO：88中描述，称为“EPOMIMETIBODYTM”或CNTO530)的pIX噬菌粒载体(p2467)。通过PCR从质粒p2467扩增CNTO530编码序列。分别将限制性内切酶位点NcoI和SpeI包括在5’-和3’-端引物中。用NcoI和SpeI消化PCR产物和噬菌粒载体(pCNTO-Fc-pIX核心Hg)，纯化，用快速连接试剂盒连接，并转化进DH10B大肠杆菌中。通过DNA测序筛选转化的克隆，并将具有正确序列的克隆转化进用于噬菌体展示的TG-1大肠杆菌中。
B.重组噬菌体的制备和表征
将用噬菌粒载体转染的TG-1大肠杆菌在液体培养基中培养至OD600＝0.5-0.6。将VCSM13辅助噬菌体母液添加至该培养物，37℃下以静态温育进行感染45分钟。将培养物离心获得细菌的沉淀物，再悬浮于补充有羧苄青霉素、卡那霉素和IPTG的培养基中，伴随以250RPM振荡在30℃下温育12-16小时。将过夜培养物离心并将含有噬菌体的上清液转移至新鲜的试管，添加十分之一体积的冷氯化钠/PEG溶液(NaCl和PEG的浓度如何？或者说是用标准方法(参考文献)进行PEG沉淀)。将每管进行混合并伴随偶尔进行混合在冰上温育大约三小时，此后将试管离心得到噬菌体沉淀。将噬菌体沉淀物小心地再悬浮于PBS中，转移至新试管，再次离心以移除任何残余的细胞碎片。将纯化的噬菌体以等份试样在-80℃下保存。进行点滴定(spottitration)以估计噬菌体滴度，单位为集落形成单位(cfu)/毫升。
C.展示的蛋白质的表征
Fc和肽-Fc构建体的展示的确认。
实验中使用了两份独立的噬菌体制备物。为了检测带有Fc或带有CNTO530的噬菌体，用抗人Fcγ特异性多克隆抗体或抗EMP1肽单克隆抗体(CNTO3443)包被黑色ELISA板。将包被的板用TBST中的5％牛奶封闭并用TBST洗涤。将辅助噬菌体、Fc-或CNTO530重组噬菌体添加至该板，室温下温育一小时，洗涤以除去未结合的噬菌体。用HRP缀合的抗M13单克隆抗体和化学发光底物检测结合的噬菌体。用HRP缀合的抗pVIII单克隆抗体检测捕集的噬菌体。将辅助噬菌体以及在带CNTO530噬菌体的情形中，将无EMP1肽的Fc重组噬菌体用作阴性对照。
蛋白A结合.在4℃下将纯化的重组蛋白A包被于黑孔ELISA板上过夜。将包被的板用TBST中的5％牛奶封闭并用TBST洗涤。将辅助噬菌体或Fc展示噬菌体的适当稀释物添加至该板。将板在室温下温育一小时并洗涤以除去未结合的噬菌体。为了封闭包被的蛋白A上的任何剩余的未占据的Fc结合位点，将源于人抗体的Fc以饱和浓度添加至所述板。温育30分钟后，用HRP缀合的抗M13单克隆抗体和化学发光底物检测结合的噬菌体。
FcRn结合.FcRn(新生儿Fc受体)允许抗体再摄取、区室转运(compartmentaltranslocation)和再循环，因而可延长抗体的循环半衰期。Fc与FcRn结合是pH依赖的，据此进行ELISA结合测定法。在中性链亲和素(Neutravidin)包被的96孔板上捕集FcRn结合的噬菌体并用HRP缀合的抗pVIII单克隆抗体检测。简而言之，用中性链亲和素包被黑孔ELISA板并用SuperBlockT20(TBS)和Chemiblocker的50/50混合物封闭。用TBST洗涤板并捕集生物素化的FcRn一小时。在TBST在pH＝6或pH＝7.5下制备辅助噬菌体或Fc展示噬菌体的适当稀释物。将未结合的FcRn从板洗去，添加噬菌体并温育一小时。作为另一种选择，在添加至板前将生物素化的FcRn与噬菌体在室温下混合一小时。为了封闭包被的FcRn上的剩余的未占据的Fc结合位点，将源于人抗体的Fc以饱和浓度添加至所述板。用HRP缀合的抗M13单克隆抗体和化学发光底物检测结合的噬菌体。
D.结果
设计了ELISA测定法来显示展示Fc的噬菌体的比例，因为用抗Fc抗体捕集了展示Fc的噬菌体并用抗pVIII抗体进行了检测(图3A)。对Fc重组噬菌体观察到强的信号，对辅助噬菌体没有观察到信号，表明Fc被有效展示于噬菌体表面上。将EMP-1特异性抗体用作捕集配体确认了EMP1融合蛋白构建体CNTO530的展示，如图3B所示。为了确认Fc区保留了适当的生物活性(因而为二聚体)，进行了特异性结合测定法：蛋白A结合和FcRn结合。如图4中所示，Fc展示于其表面上的噬菌体与蛋白A结合，而缺少Fc的对照辅助噬菌体不结合蛋白A。蛋白A的化学发光信号与用人免疫球蛋白γ特异性多克隆抗体捕集的Fc展示噬菌体的该信号相似，从而表明噬菌体展示的Fc的大部分折叠成能结合蛋白A的构象。
在pH6.0下Fc与FcRn结合，但在pH7.5下的亲和力丧失若干量级。在pH6.0(图5A)或pH7.5(图5B)下将噬菌体与生物素化的FcRn一起温育。如pH6.0下观察到的强信号所证明的，在pH6.0下Fc重组噬菌体有效结合至FcRn。相比之下，所有测试的浓度下，相同噬菌体显示出低很多的信号。因而，对于用pIX噬菌粒系统展示的Fc，pH依赖性结合得以保留。
IgG和其他含Fc分子通过CH3结构域的相互作用形成了同型二聚体。该同型二聚体通过其核心铰链区中的两个二硫键稳定。由于该Fc噬菌粒展示载体仅编码单个拷贝的Fc基因，我们通过蛋白质印记检验了所展示的Fc的聚集状态。在还原或非还原条件下将浓缩的噬菌体颗粒直接上样至SDS凝胶。如图4中所示，在非还原条件下，蛋白质的大部分作为二聚体迁移，分子量为约62kD，正如对二聚体Fc-pIX融合蛋白所预计的分子量。相反，在还原条件下，Fc-pIX蛋白的大部分作为31kD的单体迁移。因而，在噬菌体表面上展示的Fc分子的大部分为同型二聚体并且以与IgG或其他含Fc分子相同的方式用二硫键共价连接。
E.总结
对重组噬菌体观察到强的信号以及对辅助噬菌体而言缺少信号，表明EPO受体激动剂(EMP-1)-Fc构建体得以有效展示，如在噬菌体颗粒上检测到该肽以及Fc所证明的。数据表明，含Fc蛋白质在噬菌体上有效地展示为同型二聚体，该二聚体具有允许与天然配体结合的特征性构象特征。
实例2：肽-Fc融合文库
为了产生肽-Fc融合文库，产生了模板噬菌粒，该模板噬菌粒在随机氨基序列的位点含有发夹环。以使得独特的限制性位点被设置在发夹形成双链DNA的地方的方式设计该发夹。这将在后面被用于通过用XbaI进行限制性消化来移出模板DNA，从而减少最终构建的文库中噬菌体用模板噬菌粒包装。将双链模板噬菌体转化进dut-/ung-大肠杆菌宿主菌株CJ236中，因为通过该细胞系传代会引起尿嘧啶掺入ssDNA中。最终的文库宿主细胞的酶则会降解含有尿嘧啶的ssDNA模板。将带有该质粒的单个菌落在液体培养基中培养，随后用VCS-M13辅助噬菌体进行感染。用PEG加盐水沉淀噬菌体并用于纯化单链DNA。
用改良的Kunkel诱变规程产生DNA文库。编码随机化文库核苷酸的寡聚物以及5’和3’旁侧序列用T4激酶进行酶促磷酸化。采用分三步的降温程序使磷酸化的寡聚物退火至它们各自的ssDNA模板上。通过将T7DNA聚合酶和T4DNA连接酶添加至反应混合物来形成共价闭合环状DNA(CCC-DNA)来进行第二链的合成。纯化该CCC-DNA，然后在发夹序列处用XbaI进行消化以切除模板DNA来减少背景。在将文库制备物引入细胞前，通过琼脂糖凝胶电泳检验了消化前和消化后的CCC-DNA产物二者来评价文库制备物的质量。然后将连接混合物转化进MC1061F’宿主细胞系(大肠杆菌)中。
构建了四个pIX展示文库，其中以二硫键约束七氨基酸环(A1和A2)或八氨基酸环(B3和B4)，各处于两个含FcMIMETIBODYTM构建体中(参见上面的式1)，其中接头为GGSG或GS，V区J-片(SEQIDNO：13)存在或不存在，铰链包含具有或不具有相邻序列的IgG1型铰链的CPPC核心氨基酸。给出的这两种变体Fc区在下面显示，其中与天然存在的IgG4不同的残基用下划线标出，并且这两个变体由SEQIDNO：17和18表示。在约束的环的各末端处再添加两个随机氨基酸。
A.7NNK文库(XXCXXXXXXXCXX)
1)Fc＝具有V区和全长铰链的突变型IgG4(SEQIDNO：18)。2)Fc＝具有铰链核心的突变型IgG4(SEQIDNO：17)
B.8NNK文库(XXCXXXXXXXXCXX)
3)Fc＝具有V区和全长铰链的突变型IgG4(SEQIDNO：18)
4)Fc＝具有铰链核心的突变型IgG4(SEQIDNO：17)
对于产生的每个文库，进行了总共31次电穿孔。在移出一小份用于滴定转化效率后，立刻将生长晕培养物放大至一升培养体积，将其培养至OD600为1.0。此时将培养物分盘：将十分之一的培养物用VCSM13辅助噬菌体感染以产生噬菌体文库，而其余体积的培养物用于建立细菌文库的甘油储液。将噬菌体感染的培养物再次扩增至增加的规模并培养过夜。在冰上利用PEG/NaCl沉淀，从培养物上清液纯化噬菌体文库。利用点滴定法估计所得的噬菌体滴度来测量每毫升的集落形成单位数(cfu/mL)。将来自点滴定制备物的1×10-9和1×10-10稀释液的等份试样涂布在LB培养基板上，该板补充有葡萄糖和羧苄青霉素来分离单一集落。对于每个文库，对九十六个单一集落进行测序以评价最终噬菌体文库的多样性和功能性。这还可用于确定残余模板提供了多少背景污染。
总结
两个Fc支架，一个具有短的柔性甘氨酸-丝氨酸接头(GS)、核心铰链、CH2和CH3(由SEQIDNO：17表示)，另一个具有柔性甘氨酸-丝氨酸接头(GGGS)、Vh结构域的一部分、突变的IgG4铰链、CH2和CH3(由SEQIDNO：18表示)，产生了具有约1-3×109的复杂度的文库。对来自每个文库的96个克隆进行测序显示，所述克隆的序列都不相同，从而表明文库的多样性很好。
实例3：噬菌体颗粒上的全长IgG展示
A.载体设计。
使用图1中所示以及如WO2009/085462中所述的pCNTOFabIX构建体来构建全长IgG展示噬菌粒(vDR47，图2B)，该pCNTOFabIX构建体包含重链的Vh和CH1(SEQIDNO：19)结构域。添加编码人IgG1的铰链、CH2和CH3结构域的序列(SEQIDNO：20)以及变体pelB信号序列(在野生型序列中具有单点突变)即P6S(SEQIDNO：14)，从而引起多肽在pVII次要外壳蛋白上的展示以及蛋白质分泌的显著改善(申请人共同待审的专利申请)，并且该载体不具有lacI基因，而是具有lac启动子。
B.用于全长IgG展示的构建体的表征。
制备一系列测试构建体来评估全长IgG在pIX上的展示。选择针对IL13的抗体(命名为6-2和16-7)和抗细胞因子抗体9-4作为原型来构建新的全长IgG分子。为了确定不同密码子选择的效果，为抗IL13抗体的每一者制备两个构建体，一个进行了人密码子优化，一个进行了大肠杆菌密码子优化。表1列出了五个全长IgG测试构建体的载体名称。如美国专利6,670,127和6,521,427所述合成优化的基因并组装成双链DNA。此外，将与pIX融合的EMP-1Fc(实例1)包括在内作为对照，因为其含有IgG铰链、CH2和CH3结构域但无轻链。
表1.用于全长IgG展示的测试构建体
pDR# 同种型 密码子选择 说明 抗原特异性
pDR2129 huIgG1/HuKappa 人密码子 6-2全长IgG h IL13
pDR2130 huIgG1/HuKappa 人密码子 16-7全长IgG h IL13
pDR2131 huIgG1/HuKappa 大肠杆菌密码子 6-2全长IgG h IL13
pDR2132 huIgG1/HuKappa 大肠杆菌密码子 16-7全长IgG h IL13
pDR3041 huIgG1/HuKappa 人密码子 9-4全长IgG h IL17A
C.噬菌体制备
根据标准规程将上面“小节B”中描述的全长IgG展示构建体转化进两个不同的F’大肠杆菌菌株TG-1和XL-1blue中。测试这两个菌株的原因是它们的生长速率不同，据推测这可影响全长IgGpIX融合蛋白的包装和展示。选取单独的转化株并在补充有羧苄青霉素(总是以100μg/ml使用)的2XYT培养基中培养过夜。然后将该过夜培养物(500μl)用于接种25ml2XYT/羧苄青霉素，将培养物在37℃、250rpm下培养直至OD(600nm)达到0.5。在30分钟的温育期间(37℃，不振荡)用1011pfu/ml的VCSM13辅助噬菌体(Stratagene，LaJolla，CA)感染该细菌，然后在3,000rpm下进行离心步骤15分钟。在该步骤，标准规程要求用2XYT/羧苄青霉素/IPTG(1mM)诱导该细菌培养物。但是我们将培养物分成两份，将1mMIPTG添加至一份，另一份未添加，假设该系统的泄漏(leakiness)将足以产生具有随后的噬菌体包装的融合蛋白。概括地说，对于每个构建体，制备了四份不同的噬菌体制备物：(i)TG-1，使用IPTG(ii)TG-1，不使用IPTG(iii)XL-1blue，使用IPTG(iv)XL-1blue，不使用IPTG。将该培养物在30℃下以250rpm培养过夜，第二天，以3,000rpm离心15分钟，然后在PEG/NaCl中沉淀噬菌体上清液。在冰上2小时后，将沉淀的噬菌体在10,000rpm下离心15分钟，将噬菌体沉淀物再悬浮于2mlPBS中。通过以10,000rpm离心10分钟将噬菌体制备物进一步净化除去任何残余的细菌沉淀物并在4℃下保存于2ml试管中。
D.噬菌体滴度
根据标准规程测定噬菌体滴度。简而言之，将TG-1细胞在2XYT中培养直至OD(600nm)达到0.5。将噬菌体制备物在96孔板中用PBS进行系列稀释，将TG-1细胞添加至该噬菌体并在37℃下温育以进行感染。30分钟后，通过将每孔2ul分配至含有1％葡萄糖和羧苄青霉素的LB琼脂板上来进行点滴定。将板在37℃下温育过夜，测定噬菌体的浓度，单位为集落形成单位(cfu)/ml。表2示出了针对所有构建体和培养条件的噬菌体滴定的结果。所有的克隆均产生高的噬菌体滴度，在10^11-10^13cfu/ml之间，这是所预计的范围并且表明噬菌体得以有效制备。
表2.
E.用以评估功能性展示的IgG结构域特异性夹心ELISA
为了评估全长IgG分子在噬菌体pIX上的展示，建立了一系列夹心ELISA。用1μg/ml的在TBS中稀释的如下捕集抗体中的一种包被黑色maxisorp板：绵羊抗人IgG(Fd，CH1)抗体(TheBindingSite，Birmingham，UK)、小鼠抗人k轻链(SouthernBiotech，Birmingham，AL)、小鼠抗人IgG(CH2结构域)抗体(AbDSerotec，Raleigh，NC)和小鼠抗人IgG(CH3结构域)抗体(AbDSerotec)。在用Chemiblocker(Chemicon/Millipore，Billerica，MA)对板进行封闭后，洗涤板并以2×1011cfu/ml的浓度(在10％Chemiblocker/TBST中稀释)添加噬菌体并温育一小时。洗涤板并将HRP缀合的小鼠抗M13抗体添加至板。温育30分钟后，洗涤板并将化学发光底物添加至孔中，在Envision读板仪中进行读板。图7A-D分别示出了来自CH1(图7A)、k(图7B)、CH2(图7C)和CH3(图7D)夹心ELISA的结果。用于ELISA的对照为展示vDR10中的克隆6-2的Fab-pIX融合物(经人密码子优化，在TG-1细胞中制备，用IPTG诱导)(为一种非特异性支架蛋白-pIX融合物)或CNTO530-pIX融合物的噬菌体。在CH1和kELISA中，6-2Fab用作阳性对照，而EMP-1构建体(CNTO530)分子用作阴性对照。在CH2和CH3ELISA中，6-2Fab用作阴性对照，CNTO530分子用作阳性对照。该支架蛋白噬菌体在所有ELISA中用作阴性对照，因为其携带任何抗体结构域。还以5ug/ml的浓度添加抗IL13全长IgG1抗体作为可溶性竞争物进行ELISA测定以防止噬菌体与不同的捕集抗体结合。
如图7A-D中所示，在所有的夹心ELISA中检测到噬菌体，从而提供证据表明所述噬菌体事实上在表面上展示不同的抗体结构域。在XL-1blue细胞中产生的噬菌体具有最高的信号，并且添加IPTG对结合信号具有正面效果。可通过添加可溶性抗IL13抗体抑制噬菌体的结合，这可指示特异性相互作用。然而，可溶性抗IL13抗体不能竞争噬菌体与CH3结构域之间的相互作用(图7D)。对于全长IgG-pIX融合物以及对于EMP-1-Fc-pIX融合物(CNTO530)二者均观察到这一点。
F.全长IgGpIX噬菌体与IL13结合
在证实可通过ELISA在噬菌体颗粒上检测到IgG分子的所有结构域后，有必要确定所述构建体是否还保留与它们各自的抗原结合的能力。通过用1μg/ml市售抗IL13抗体(小鼠抗人IL13，MAB213，R&DSystems)包被黑色Maxisorp板建立IL13结合ELISA。MAB213不与6-2或16-7竞争与IL13的结合，因而其作为夹心ELISA捕集抗体是理想的。在洗涤和封闭后，以100nM添加生物素化的人IL13R130Qhuman(Peprotech)并温育一小时。洗涤板并以2×1011cfu/ml添加在pIX上展示全长IgG形式的6-2和16-7的噬菌体，该添加是单独添加或与用于竞争的可溶性抗IL13抗体一起添加。用HRP缀合的小鼠抗M13抗体检测结合的噬菌体，在Envision仪中读取化学发光。图8示出了IL13噬菌体ELISA的结果。在多大数条件下检测到了结合，其中使用1mMIPTG在XL-1blue细胞中产生的噬菌体显示出最高的信号。肽-Fc-pIX和备选的支架分子-pIX融合物为阴性(正如所预料的)，6-2FabpIX对照为阳性。添加可溶性抗IL13抗体抑制了结合，从而显示该结合是特异性的。为了进一步检验IL13结合，建立了ELISA，其中将可溶性竞争抗体从50μg/ml-0.01μg/ml进行系列稀释。还包括了对照抗体。图9A和B分别示出了可溶性抗体对6-2IgGpIX和6-2FabpIX的IL13结合的影响。对于这两个构建体均观察到了结合的抑制，IC50为大约0.1μg/ml。然而，对于全长IgGpIX构建体，即使是在十分高的竞争物浓度下该抑制是不完全的，从而表明存在一定水平的非特异性相互作用。
G.全长IgGpIX噬菌体与IL13和IL17结合
进行了第二个确证性实验。通过克隆全长IgG形式的抗IL17A抗体来进行该实验。如上所述将该构建体转化进XL-1blue细胞中并制备噬菌体。进行ELISA来确认IL17IgG在pIX上的展示以及其与人IL17Amut6抗原的结合，如图6中所示。对于每个ELISA(Fd捕集、k捕集、CH2捕集、CH3捕集、IL13捕集和IL17捕集)，单独添加噬菌体或者将其与可溶性抗IL13单克隆抗体或可溶性抗IL17A单克隆抗体一起添加。添加竞争性单克隆抗体可显示ELISA的特异性。如图10中可看出的，IL17IgG在pIX上展示，但水平低于IL13IgG。这与Fab表达水平在这些构建体之间的不同(数据未显示)一致。可以看出抗原结合的特异性，因为噬菌体上的抗IL13IgG不与IL17结合，噬菌体上的抗IL17IgG不与IL13结合。此外，可通过它们的可溶性单克隆抗体对应物抑制这两种类型的噬菌体中每一者的结合。
实例4：与pVII融合的含Fc蛋白质的展示
另外，我们已证明Fc和MIMETIBODYTM蛋白可用pVII噬菌粒系统在噬菌体表面展示。

Claims (30)

1.一种用于在丝状噬菌体颗粒的表面上展示功能性的、多聚体的、链间二硫键连接的蛋白质的可复制噬菌体载体；包含与编码源于外源蛋白的第一氨基酸序列的多核苷酸序列融合的编码噬菌体pIX或pVII蛋白的核酸序列，其中所述编码的外源蛋白氨基酸序列包含CH3、CH2、铰链区域和于铰链区域的至少一个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基能与表达为与pIX或pVII形成的外源蛋白融合物的第二多肽链上的半胱氨酸残基氧化性键合，其中所述第二多肽链与所述第一氨基酸序列相同或为所述第一氨基酸序列的变体，或者为不同的蛋白质；并且从而如此形成的半胱氨酸键为在同一丝状噬菌体颗粒的表面上展示的功能性多聚体结构的链间二硫键。
2.根据权利要求1所述的噬菌体载体，其中所述蛋白质结构的功能活性选自蛋白A结合和FcRn结合。
3.根据权利要求1所述的噬菌体载体，其中所述编码的外源蛋白氨基酸序列包含选自SEQIDNO:1-3和4的抗体铰链结构域，以及SEQIDNO:1-3和4的核心残基。
4.根据权利要求3所述的噬菌体载体，其中所述链间二硫键处于所述抗体铰链结构域氨基酸序列内。
5.根据权利要求4的噬菌体载体，其中所述链间二硫键处于所述抗体的核心铰链残基内。
6.根据权利要求4所述的噬菌体载体，所述噬菌体载体还包含选自SEQIDNO:5-16和17-20的序列或它其中至少一个残基被置换的变体。
7.根据权利要求1所述的噬菌体载体，其中所述载体还包含编码与所述外源蛋白编码序列中的一者有效融合的细菌分泌信号的序列。
8.根据权利要求7所述的噬菌体载体，其中所述细菌分泌信号选自如SEQIDNO:14中所示的pelB序列或变体pelB序列，或者为SEQIDNO:15中所示的ompA或ompA的变体。
9.根据权利要求1所述的噬菌体载体，所述噬菌体载体还包含诱导型启动子。
10.根据权利要求9所述的噬菌体载体，其中所述诱导型启动子为lac启动子或lac的突变体。
11.一种包封有编码融合多肽的载体并且在表面上具有功能性的、多聚体的、链间二硫键连接的蛋白质的丝状噬菌体颗粒；其中所述蛋白质包含具有CH3、CH2、铰链区域和于铰链区域的至少一个半胱氨酸残基和与丝状噬菌体pVII或pIX蛋白的氨基末端融合的半胱氨酸残基的第一外源多肽，因此当所述蛋白质在丝状噬菌体蛋白质的表面表达时，所述半胱氨酸残基与融合至pIX或pVII的第二多肽链上的半胱氨酸残基氧化性键合，其中所述第二多肽链与所述第一氨基酸序列相同或为所述第一氨基酸序列的变体，或者为不同的蛋白质；并且从而如此形成的半胱氨酸键为在同一丝状噬菌体颗粒的表面上展示的功能性多聚体结构的链间二硫键。
12.根据权利要求11所述的丝状噬菌体颗粒，其中所述蛋白质结构的功能活性选自蛋白A结合和FcRn结合。
13.一种细菌宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求11所述的丝状噬菌体。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其中所述功能性蛋白质能够从所述原核宿主细胞的培养基回收。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述蛋白质在丝状噬菌体颗粒的表面上展示。
16.一种由根据权利要求13所述的细菌宿主细胞表达的二聚体或多聚体融合蛋白，所述融合蛋白具有可测量的功能蛋白结合活性。
17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述可测量的蛋白结合活性为蛋白A结合或FcRn受体结合。
18.一种包含根据权利要求4所述的核酸噬菌体载体的细菌宿主细胞的噬菌体文库，其中所述载体内编码所述抗体序列内的各个分立残基或结构域的特定位置进行了多样化。
19.根据权利要求18所述的噬菌体文库，其中所述载体含有编码具有氨基酸置换的形成Fc的序列。
20.根据权利要求19所述的噬菌体文库，其中所述形成Fc的序列还包含配体结合结构域。
21.根据权利要求20所述的噬菌体文库，其中所述配体结合结构域选自受体结合配体、受体胞外结构域、包含可变结构域和恒定结构域的抗体Fab结构域以及单链Fv构建体。
22.根据权利要求21所述的噬菌体文库，其中所述配体结合结构域包含在所述结合结构域内各特定残基处相互不同的序列。
23.根据权利要求22所述的噬菌体文库，其中所述配体结合结构域在选自CDR1、CDR2和CDR3的种系重链互补决定区中包含多个各异变异。
24.一种在根据权利要求13所述的细菌宿主细胞中产生抗体或含Fc片段的文库的方法，所述方法包括：
a.用包含如权利要求1中的多核苷酸的载体的文库感染宿主细胞群体，所述多核苷酸编码与噬菌体外壳蛋白融合的重组抗体或其片段；以及
b.在使得所述抗体或其含Fc的片段能在所述噬菌体表面上表达的条件下培养所述细胞的群体，以及
c.选择展示具有所需的或增强的特性的抗体或其片段的噬菌体。
25.一种使用根据权利要求20所述的噬菌体文库来选择具有改善的特性的变体的方法。
26.根据权利要求25所述的选择变体的方法，其中所述特性选自改善的靶标结合、与特定靶表位的结合、Fc受体结合亲和力、减少的糖基化位点、增加的糖基化位点和增强的热稳定性。
27.一种使用根据权利要求23所述的噬菌体文库来选择所需的生物活性的方法，其中所述选择包括(a)从根据权利要求14所述的宿主细胞表达抗体Fc片段，以及(b)选择具有所需生物活性的噬菌体颗粒。
28.一种编码含Fc的抗体或抗体片段的核酸，所述核酸从根据权利要求22所述的文库获得。
29.根据权利要求23所述的噬菌体文库，所述抗体或抗体片段选自IgA、IgE、IgM、IgD、IgY和IgG。
30.根据权利要求23所述的噬菌体文库，其中所述抗体或其片段为鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
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