CN102719417B

CN102719417B - 一种耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8及其基因和应用

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Publication number: CN102719417B
Application number: CN201210223320.4A
Authority: CN
Inventors: 詹志春; 顾爱玲
Original assignee: WUHAN SUNHY BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: Wuhan Sunhy Biological Co ltd
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2012-07-02
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2032-07-02
Also published as: CN102719417A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8及其基因和应用。本发明提供了一种来源于脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillussp.B8的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因abf51B8。本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶的具有以下性质：最适pH6.0，最适温度60℃，在70℃具有很好的热稳定性。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于饲料，食品、能源工业等。

Description

一种耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8及其基因和应用。

背景技术

木聚糖是半纤维素中最丰富的一类物质，广泛存在于硬木（15-30%）、软木（7-10%）和草本类植物（少于30%）。木聚糖的基本糖单元是D-吡喃木糖，它的主链由木糖以β-1,4糖苷键连接形成，侧链上被各种不同的取代基所修饰，同时，这些侧链取代基团通过化学键互相交联，形成复杂的结构(Collins et al.FEMSMicrobiology Reviews.2005,29:3-23.)。木聚糖的降解需要主链水解酶和支链水解酶的协同作用，主链酶包括β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶，侧链水解需要α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，α-葡萄糖醛酸，乙酰木聚糖酯酶等辅酶。其中，阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase，EC 3.2.1.55)能从含有阿拉伯糖残基的多聚物如阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯半乳聚糖等的非还原末端水解生成一个阿拉伯糖分子。目前，人们已将细菌、真菌和植物来源的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶进行分离纯化、或者通过基因克隆、异源表达之后，深入研究酶的各种性质。来源于微生物的阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应pH为酸性至中性之间(pH 3.0-7.0)，最适反应温度介于40-70℃之间。

作为半纤维素降解酶系之一，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶参与低价的农产品残渣的再利用，产生可用于发酵生成燃料乙醇的单糖及其他副产品。在纤维素发酵生产燃料乙醇的过程中，有约70%的原材料将不能被完全降解生成单糖，适当的纤维素预处理过程可以加大纤维素的利用率。利用酶预处理的方法则减少了这些问题的发生。阿拉伯呋喃糖酶是半纤维素的侧链降解酶，它能促进半纤维素的完全降解。另外，阿拉伯糖呋喃糖苷酶作为一种饲料添加剂，去除了木聚糖上阿拉伯糖侧链，促进木聚糖的降解，易于被动物消化吸收。阿拉伯呋喃糖苷酶还被广泛应用于食品行业中，L-阿拉伯糖做为一种低摄入量的甜味剂能代替传统的蔗糖，适于老年人和高血糖患者食用。阿拉伯呋喃糖苷酶还能增加酿酒过程中萜烯醇的浓度，提高酒的香味，增加果汁的澄清度，而被应用于果汁生产工业。因此，阿拉伯呋喃糖苷酶的产生、纯化、性质特征及其在饲料加工、酿酒工业、果汁加工、以及能源等领域的应用正在不断深入。

工业生产需要酶进行短期高温处理，目前多数阿拉伯呋喃糖苷酶最适温度在50℃左右，但较差的热稳定性质不能满足饲料制粒，酿造加工等工业的高温生产要求。因此获得热稳定性优良的酶能降低生产成本，满足不同工业对酶性质的要求。

本发明中来源于脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.B8的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8具有以下性质：最适pH6.0，并在pH5.0～8.0范围内具有40%以上的酶活力，具有很好的pH稳定性，37℃下作用1h后，在pH 4.0–11.0之间，剩余酶活性均在80%以上。最适温度60℃，80℃下仍具有50%以上的活性，良好的热稳定性，70℃都有较好的稳定性，保温60min后酶活几乎不损失。良好的pH和热稳定性等特性使其在饲料，食品工业应用上具有很大的潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8。

本发明的再一目的是提供编码上述耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶的应用。

本发明从脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.B8中分离得到一种新的耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8。

本发明提供了一种耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MSKSIARMTIDPQYQLADVDPRLFGSFIEHLGRAVYGGIYEPDHPSADEMGFRQDVLELVRELQVPIVRYPGGNFVSGYRWEDGVGPLASRPAQLDLAWRSLEPNRVGVNEFVEWAKRANSEVMMAVNLGTRGIDEAKQIVEYCNHPGGSYWSDLRKSHGYEQPHGIKVWCLGNEMDGPWQIGHKTAEEYGRIAEEAAKVMKWVDPSIELVACGSSGSKMPTFPDWERIVLEHTYDHVEYISMHSYYGNRENDLATYLAQSLDMDHFIRSVIATCDYVKAKKRSKKTINISFDEWNVWFHSNEADKQVAPWQVGPPLLEDVYTVEDALVVGCLLITLLRHADRVKMACLAQLVNVIAPIMTENGGVSWKQTIYYPFLHASRYGRGKVMHCSLQSPKYDCKEFTDVPLVESVAVWNQDIGELTIFAVNRSQDGGIELECDIRGFAQASVIEHTVLVHSDLKAANTKEEPQEVIPQHAQGAKVDGGLLFAPLPKLSWNVIRLRV

其中，该酶包含502个氨基酸，无信号肽序列。

本发明筛选到脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.B8，其产生阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8，该酶同时具有好的热稳定性，在常温下在中性的范围内均具有高活性，其最适pH值为6.0，在pH5.0～7.0的范围内维持60%以上的酶活性；最适温度为60℃，在40～80℃仍具有50％以上的酶活力。

本发明提供了编码上述耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶的基因abf51B8。具体地，该基因的基因组序列如SEQ IDNO.2所示：

atgtccaagtcgattgcacgtatgacgattgatccgcagtaccagctcgccgatgtcgatccaaggttgttcgggtcgttcatcgagcatctcgggcgcgccgtatatgggggtatttacgagcctgatcacccgtctgccgacgaaatgggtttccgtcaggacgtcctcgaactggtgcgcgaactccaggtgcccatcgtgcgctacccgggaggcaactttgtgtcaggttaccgttgggaagacggggtggggccgcttgcgtccaggcccgcccaactcgatctcgcttggcgaagcttggaacccaatcgtgtaggtgtcaacgaatttgtcgagtgggccaagcgggcaaactccgaagtcatgatggctgtcaatctcggcacgcgtggtatcgacgaagcgaagcagattgtcgagtactgcaatcatcctggcggcagttattggagcgatctacgaaaatcgcatggctatgaacagccgcacggcatcaaggtgtggtgcctgggcaacgagatggatggcccgtggcaaattgggcacaaaacggccgaagaatacggccgaatcgctgaagaagcggctaaggtcatgaaatgggtcgatccgtcgatagagcttgtcgcatgcggtagctccggctcgaaaatgcctacgtttcccgattgggaacgaattgtcctcgaacacacatacgatcacgtcgagtacatttccatgcacagctactacggaaatcgcgagaatgacctcgcgacgtaccttgctcaatcgctcgatatggaccatttcatccgttcggtgattgcgacatgtgactatgtcaaagcgaaaaaacgcagcaagaaaaccatcaacatctcgtttgacgagtggaatgtgtggtttcactcaaacgaagcggacaaacaagttgcaccgtggcaggttggcccgccgttgcttgaggacgtatatacggtcgaagatgcgcttgttgtcgggtgtttgttgatcacgcttttgcgccatgcggatcgggtgaagatggcgtgtcttgctcagttggtcaatgtgattgcgcccatcatgacggagaacggcggggtgtcctggaaacagaccatttactatccctttttgcacgcttcgcggtacggtagagggaaagtgatgcactgctcgctacaatcgccgaagtacgattgtaaggaatttaccgacgtgccgctggtcgagagcgttgcagtgtggaatcaggatatcggagagttgaccatttttgcggtcaaccgttcgcaagatggcggcatcgagttggaatgtgacatccgcgggtttgctcaagccagcgtgatcgagcatacggtgcttgtgcattcggatttgaaagcggcgaacacgaaagaagagccacaggaagtgattccgcagcatgcacaaggcgcaaaggtcgatgggggcttgctcttcgctccattacccaaactgtcttggaacgtcattcgattgcgcgtgtaa

根据本发明的具体实施例，通过PCR的方法分离克隆了阿拉伯呋喃糖苷酶abf51B8，DNA全序列分析结果表明，阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51B8全长1509bp。成熟蛋白理论分子量为56.6kDa，将阿拉伯呋喃糖苷酶abf51B8序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于GeobacillusStearothermophilus T6的阿拉伯呋喃糖苷酶序列一致性为68%。说明Abf51B8是一种新的阿拉伯呋喃糖苷酶。

本发明还提供了包含上述阿拉伯呋喃糖苷酶abf51B8的重组载体，优选为pPET-abf51B8。将本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶基因插入到质粒pPET-30a(+)上的Nde I和Not I限制性酶切位点之间，得到重组酵母表达质粒pPET-abf51B8。

本发明还提供了包含上述耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21/abf51B8。

本发明还提供了一种制备耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组阿拉伯呋喃糖苷酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌株BL21/abf51B8。

本发明还提供了上述阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、酿酒、食品工业中应用新的阿拉伯呋喃糖苷酶。本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶最适pH为6.0，在pH5.0～7.0都有较高的酶活性；pH稳定性好。其耐高温特性，可使其在需求高温环境的工业生产上应用。本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶适用于饲料工业，可与木聚糖酶协同作用，有效消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在酿酒工业中，可有效降解可溶性和不可溶性的阿拉伯木聚糖，有效降低麦芽汁的粘度提高过滤效率澄清啤酒。另外，在白酒、清酒的酿造中有助于增加酿酒过程中萜烯醇的浓度，增加香味。因此，本阿拉伯呋喃糖苷酶在食品工业中的应用显示出其巨大的潜力。

附图说明

图1重组阿拉伯呋喃糖苷酶的最适pH。

图2重组阿拉伯呋喃糖苷酶的pH稳定性。

图3重组阿拉伯呋喃糖苷酶的最适温度。

图4重组阿拉伯呋喃糖苷酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.B8中分离得到一种新的耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8。大肠杆菌表达载体pPET-30(a)及菌株EcoliBL21(DE3)购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。p-nitrophenyl-a-L-arabionfuranoside(pNPAf)购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

（1）Alicyclobacillus sp.B8培养基为MEA培养基：麦芽提取物，17.0g/l；蛋白胨，3.0g/l；琼脂。通过1:1(w/w)的柠檬酸调整pH值为3.5

（2）大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.B8阿拉伯呋喃糖苷酶编码基因abf51B8的克隆

提取瓶霉Alicyclobacillus sp.B8基因组DNA：

将液体培养3天的菌体离心后放入研钵中,加入2mL提取液，研磨5min,然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次,在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白,再取上清加入等体积异丙醇,于室温静置5min后,4℃下10000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70%的乙醇洗涤两次,真空干燥,加入适量TE溶解,置于-20℃备用。

根据第51家族阿拉伯呋喃糖苷酶基因的保守(GNEMDG和DEWNVW)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1:5'-GGNAAYGARATGGAYGG-3'；

P2:5'-CCANACRTTCCAYTCRTC-3')。

以Alicyclobacillus sp.B8总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约378bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1,usp2,usp3(上游特异性引物),dsp1,dsp2,dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。拼接后阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8基因全长1509bp，编码502个氨基酸和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明该基因无信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为56.6kDa。

实施例2重组阿拉伯呋喃糖苷酶的制备

将表达载体pPET-30a进行双酶切(Nde I+Not I)，同时将编码阿拉伯呋喃糖苷酶的基因abf51B8双酶切(Nde I+Not I)，切出编码成熟阿拉伯呋喃糖苷酶的基因片段与表达载体pPET-30a连接，获得含有阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51B8的重组质粒pPET-abf51B8并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组毕赤酵母菌株BL21/abf51B8。

取含有重组质粒的BL21菌株，接种于300mL LB培养液中，37℃227rpm振荡培养2h后，加入终浓度0.6mM IPTG在30℃进行诱导4h。重组阿拉伯呋喃糖苷酶表达量为5.6U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组阿拉伯呋喃糖苷酶在大肠杆菌中得到了表达。重组木聚糖的比活为98.8U/mg。

实施例3重组阿拉伯呋喃糖苷酶的活性分析

阿拉伯呋喃糖苷酶活性的测定：在405nm下测定酶水解底物pNPAf生成的产物p-nitrophenol的量。反应步骤：250μL 2mM pNPAf底物与150μL缓冲液混匀，加入100μL适当稀释的酶液，于40℃反应10min，加入1.5mL 1M Na₂CO₃终止反应，于405nm处测定OD值。

实施例4重组阿拉伯呋喃糖苷酶的性质测定

1、重组阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将纯化的重组阿拉伯呋喃糖苷酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中60℃下进行活力测定。结果(图1)表明，重组酶Abf51B8的最适pH为6.0，在pH5.0~7.0有50%以上的相对酶活性。阿拉伯呋喃糖苷酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH6.0缓冲液体系中60℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明酶在pH 4.0-11.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在85%以上，这说明此酶在宽泛的pH范围内具有较好的pH稳定性。

2、阿拉伯呋喃糖苷酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

阿拉伯呋喃糖苷酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为阿拉伯呋喃糖苷酶在不同温度下处理不同时间，再在60℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为60℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，Abf51B8有良好的热稳定性，在60℃下温育1h，酶活几乎不丧失，在70℃下温育1h，能保持80%以上的酶活。

3、阿拉伯呋喃糖苷酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的pNPAf为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)缓冲液体系中，60℃下测定酶活性，计算出其在60℃下的K_m值。经测定，K_m值为0.5mg/mL，最大反应速度V_max为138.23μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对阿拉伯呋喃糖苷酶酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1mmol/L。在60℃、pH6.0条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂β-巯基乙醇和EDTA在浓度为1mmol时重组阿拉伯呋喃糖苷酶的活力没有明显变化。但是Ag⁺、Hg²⁺几乎可以完全抑制其活力，而SDS也强烈抑制其活力。

Claims

1.一种耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51B8，其特征在于，编码权利要求1所述的耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8。

3.如权利要求2所述的耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51B8，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求3所述耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51B8的重组载体。

5.包含权利要求3所述耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51B8的重组载体pPET-abf51B8。

6.包含权利要求3所述耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51B8的重组菌株。

7.一种制备耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8表达；

3)回收并纯化所表达的耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8。

8.权利要求1所述耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8在饲料工业、在酿酒工业中的应用。