CN118126994B - 一种偏好降解杂合褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种偏好降解杂合褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明的褐藻胶裂解酶对杂合褐藻寡糖PolyMG具有底物偏好性，能很好地降解PolyMG和海藻酸钠，且在25～55℃范围内酶活力较高，具有较宽泛的作用温度，在和不同底物偏好性的褐藻胶裂解酶联用开发褐藻资源，以及降解海藻酸钠制备特定功能褐藻寡糖方面具有优势。

Description

一种偏好降解杂合褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种偏好降解杂合褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶及其应用。

背景技术

褐藻是一种重要的生物质能源，其细胞壁含有丰富的褐藻胶成分。褐藻胶(又名海藻酸钠)具有良好的稳定性、增稠性、凝胶性、安全性和生物相容性等特性，在医药、食品、化妆品、农业、纺织、化学和饲料等领域广泛应用。褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)两种单体通过1，4-糖苷键连接形成的高分子多糖，含有三种不同形式的组成片段：聚β-D-甘露糖醛酸(Polymannuronic acid，PolyM)片段、聚α-L-古罗糖醛酸(Polyguluronic acid，PolyG)片段以及杂合褐藻寡糖(PolyMG)片段。研究发现，来源于褐藻胶降解的褐藻寡糖具有抗肿瘤、抗凝、抗血脂、抗病毒、促进细胞生长等诸多生物学功能，在医疗、食品、保健品、化妆品、农业等领域具有极大的应用价值。

生物酶法降解褐藻胶是制备褐藻寡糖的重要手段之一，其反应条件温和，对环境友好，且特异性强，在褐藻胶裂解酶的作用下，褐藻胶被降解为不同聚合度的褐藻寡糖或单体。褐藻胶裂解酶来源广泛，在真菌、细菌、病毒、海藻及海洋软体动物中都有发现。由于细菌生长速度快、易于培养和便于遗传操作等特点，对细菌来源的褐藻胶裂解酶研究最多，产褐藻胶裂解酶的细菌主要有弧菌属、微泡菌属、假交替单胞菌属、黄杆菌属和芽孢杆菌属等。当前发现的褐藻胶裂解酶多数能有效降解聚古罗糖醛酸PolyG和聚甘露糖醛酸PolyM两种底物，但极少数能够有效降解杂合褐藻寡糖PolyMG，且酶活力很低和稳定性较差。因此开发具有优良特性的偏好性降解杂合褐藻寡糖PolyMG的褐藻胶裂解酶，可与具有不同底物偏好性的褐藻胶裂解酶协同作用高效降解海藻酸钠，对于提高特定功能的褐藻寡糖的产量和品质具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种偏好降解杂合褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶(命名为VAL6)及其应用从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种褐藻胶裂解酶，所述的褐藻胶裂解酶包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶：

CNSESSNTPVNKPEAPEVPGIPDVPHSPDVPDIPDVPDNPDVPDTPEVPDTPEVPILGWNIAQWKITLPVSESYYKEHFGVSSGLNERSSANELLPEKCSGKDVFSLDTNLPYFYVANDNDIHFIVDLGDPGVATTTNTKYARSELRELYNYNASSICSSSGQNWAVDDNNNHQLEAQLKIEDHPNIPGELPKVIVGQVHGYKIKQALIKLQWEGGDKPVRAILNNTFLPNDQSCNHCKSFSVDLGTASAGTDWRYKIEVNEQAIVLEAAGVKKSFAWGEKIENTGYSLDPAWADSANSFYFKAGIYPQIEPSTSFSGQVFDVSFSEIKITHQ(SEQ ID NO:1)；

2)在序列为SEQ ID NO:1的蛋白质序列上取代、缺失、添加一个或数个氨基酸残基，由1)衍生的酶；

用于编码上述褐藻胶裂解酶的一种基因，其中一种具体的核苷酸序列为SEQ IDNO:2：

tgtaactcagagtctagcaatacgcccgtgaataaacctgaagctcctgaagttccaggtattcctgatgtaccgcattcgcctgatgtaccggatattcctgatgttccagataatcctgatgttccagatactcctgaggttccagatactcctgaggttcctattctcgggtggaatattgcccagtggaaaattacacttcctgtaagtgagtcatactataaagaacactttggcgtgagctctggtcttaacgagcgtagcagtgctaatgaactacttcctgaaaaatgcagtggtaaggatgttttctcactagatacaaacctcccatatttttatgttgccaatgataatgacatacacttcattgttgatttaggcgatcctggggtagcaaccacaaccaatactaaatatgcccgttctgaactacgtgagctatacaactacaatgcttcaagcatttgttcttcttctgggcaaaactgggccgttgacgataacaacaatcatcaacttgaagcacaactgaagatagaagaccatccaaacatacctggagagttaccaaaggtcatagtcggtcaggttcacggctacaaaattaagcaggcacttatcaaattgcagtgggaaggcggggacaaaccggtcagagctatcttaaataacaccttcttgccgaatgaccaatcttgtaatcattgcaagtcattcagtgttgatttaggtacagcgagcgctggtaccgactggcgatacaagattgaagtgaacgaacaagcgatagtgttagaagctgccggcgttaagaagtcatttgcgtggggagagaagatcgaaaatacaggctattcactcgacccagcttgggctgattcagcaaatagcttctactttaaagctggtatctatccgcagatagagcctagtacttctttttccggccaagtcttcgacgtaagcttcagcgagatcaaaatcactcaccagtaa(SEQ ID NO:2)。

本发明再一个方面还提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体中插入了用于编码上述褐藻胶裂解酶的核酸片段；

所述的重组表达载体为原核表达载体或真核表达载体。

本发明另一个方面还提供一种基因工程菌株，所述的基因工程菌株中转化有上述的重组表达载体；

所述的基因工程菌株，可以是真核工程菌株，也可以是原核工程菌株；作为一个实施例的具体记载，为大肠杆菌工程菌株。

本发明还提供所述的褐藻胶裂解酶的用途，即用于褐藻资源开发利用以及降解海藻酸钠来制备褐藻寡糖中的应用。

本发明的褐藻胶裂解酶对杂合褐藻寡糖PolyMG具有底物偏好性，能很好地降解PolyMG和海藻酸钠，且在25～55℃范围内酶活力较高，具有较宽泛的作用温度，在和不同底物偏好性的褐藻胶裂解酶联用开发褐藻资源，以及降解海藻酸钠制备特定功能褐藻寡糖方面具有优势。

附图说明

图1为纯化后的酶蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图2为酶对不同底物水解作用的效果图；

图3为酶的降解产物分析图；

图4为不同温度对酶活力的影响图；

图5为不同pH对酶活力的影响图；

图6为化学试剂对酶活力的影响图。

具体实施方式

本发明从弧菌Vibrio sp.MCCC 1A13243基因组测序数据中分析获得了氨基酸序列为SEQ ID NO:1的一种褐藻胶裂解酶，本发明还保护从弧菌中分离的，与氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶具有高同源性的褐藻胶裂解酶，包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；

2)在序列为SEQ ID NO:1的蛋白质序列上取代、缺失、添加一个或数个氨基酸残基，由1)衍生的酶；

编码上述酶的一种基因，其具体核苷酸序列为SEQ ID NO:2，但还可以是根据宿主菌来进行优化后的核酸序列。

下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1制备褐藻胶裂解酶

弧菌Vibrio sp.MCCC 1A13243(由中国海洋微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为1A13243，购买方式得到)，大肠杆菌E.coli TOP10、大肠杆菌E.coil BL21(DE3)、表达载体pET-22b(购自ThermoFisher公司)；赛百盛细菌基因组DNA提取试剂盒(购自厦门精聚公司)；DNA聚合酶、限制性内切酶NdeI和XhoI(购自全式金公司)；T4连接酶(购自Takara公司)；LB培养基(每升含蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g)；氨苄青霉素(购自上海生工)；结合缓冲液(1×PBS缓冲液：10mM磷酸盐，pH7.4)；漂洗缓冲液(500mM NaCl,20mM咪唑，20mM磷酸盐，pH7.4)；洗脱缓冲液(500mM NaCl，500mM咪唑，20mM磷酸盐，pH7.4)；3，5－二硝基水杨酸(DNS)(购自上海生工)；Ni-NTA Resin(购自全式金公司)；30kDa超滤管(购自泰京公司)；PolyM、PolyG、PolyMG、褐藻胶寡糖及单糖标准品(购自博智汇力公司)；海藻酸钠(购自上海国药集团)。本发明中使用的含氨苄青霉素的LB培养基，其氨苄青霉素浓度均为100μg/mL。

通过分析弧菌Vibrio sp.MCCC 1A13243基因组测序数据获得褐藻胶裂解酶的成熟蛋白基因VAL6，其编码基因的序列为SEQ ID NO:2，翻译的蛋白质的序列为SEQ ID NO:1。利用NCBI在线的BlastP工具分析发现，褐藻胶裂解酶VAL6的成熟蛋白质序列与其同源蛋白的最高同源性不超过85％(与来源于Vibrio comitans的多糖裂解酶家族7的蛋白的氨基酸序列一致性为84.85％)；表明本发明所筛选的酶为一新型的褐藻胶裂解酶。

下面对重组表达该酶的具体过程进行描述。

1)基于VAL6序列，设计并合成扩增褐藻胶裂解酶的成熟蛋白基因的引物，其序列如下：

上游引物VAL6F:5′-GATCACATATGTGTAACTCAGAGTCTAGC-3’

下游引物VAL6R:5’-GATCACTCGAGCTGGTGAGTGATTTTGAT-3’

(2)PCR扩增及重组质粒的构建

利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取弧菌Vibrio sp.MCCC 1A13243的基因组DNA，以提取的弧菌基因组DNA为模板，使用VAL6F和VAL6R引物进行扩增。扩增体系(50μL)如下：VAL6F(10μM)1μL，VAL6R(10μM)1μL，5×TransStart FastPfu Fly Buffer 10μL，dNTP(2.5mM)4μL，基因组DNA 2μL，TransStart FastPfu DNA Polymerase 1μL，ddH₂O 31μL。扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃20s，52℃20s，72℃60s，30个循环。将PCR产物进行胶回收，经限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后，用T4连接酶连接到用同样限制性内切酶酶切的pET-22b载体上；将连接产物与大肠杆菌E.coli Top10感受态混合，冰上放置30min，42℃热激90s后，加入800μL LB液体培养基，于37℃、100rpm复苏1h，离心后涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，筛选重组质粒，并对重组质粒进行双酶切和测序验证，获得含有褐藻胶裂解酶基因VAL6的重组质粒。

(3)基因的诱导表达及粗酶液的制备

将重组质粒转化入E.coli BL21中，获得含有褐藻胶裂解酶基因的重组菌株。将重组菌株接种于5mL含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养，按1％接种量接种于500mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至OD₆₀₀为0.6左右，加入IPTG使其终浓度为0.5mmol/L进行诱导，18℃、180rpm条件下过夜诱导表达，8000rpm离心20min收集菌体。然后将菌体重悬于50mL结合缓冲液中，加入适量蛋白酶抑制剂，以功率300W，工作/间隙时间为3s/5s超声破碎30min，4℃、5000rpm离心10min，收集上清即得到粗酶液。

(4)酶的纯化

将制备的粗酶液加入至预先平衡好的His纯化柱Ni-NTA Resin，4℃混匀2h，然后弃去废液。之后先用10ml含有20mM咪唑的漂洗缓冲液漂洗3次，漂洗结束后用含有500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱4次(第一次洗脱体积为2mL，第二次、第三次和第四次洗脱体积均为6mL)，分批收集洗脱液，对洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测其纯度(图1)。用30kDa超滤管进行超滤以去除咪唑和高浓度的NaCl，获得纯化好的酶液。

实施例2：褐藻胶裂解酶的酶学性质检测

(1)褐藻胶裂解酶活性测定方法

采用DNS法测定还原糖含量。将20μL稀释的酶液和80μL 0.3％海藻酸钠底物混合，在35℃条件下反应10min。反应完成后加入200μL DNS试剂，煮沸5min，立即置于冰水中冷却，短暂离心后取上清，测定OD₅₄₀值(以灭活酶液作为对照)，根据标准曲线计算还原糖量和酶活力。酶活力单位定义：在上述测定条件下，每分钟裂解海藻酸钠产生1μmol还原糖所需酶量定义为一个酶活力单位(U)。

(2)酶的底物特异性

在35℃、pH7.4条件下，分别以0.3％的海藻酸钠、PolyM、PolyG和PolyMG为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算褐藻胶裂解酶水解不同底物的相对活力。结果显示，该酶能够很好地降解海藻酸钠和杂合褐藻寡糖PolyMG，其中对PolyMG降解效果最好；该酶对聚甘露糖醛酸PolyM降解效果比较差，且几乎不能降解聚古罗糖醛酸PolyG，是一种对PolyMG具有底物偏好性的褐藻胶裂解酶。结果见图2。

(3)降解产物分析

采用薄层层析(TLC)法分析褐藻胶裂解酶产物。将20μL的纯酶加入80μL的含有0.3％底物(海藻酸钠/PolyM/PolyG/PolyMG)的10mM PBS缓冲液(pH7.4)中，混匀后于35℃条件下过夜反应，将反应混合物在100℃条件下加热40min，然后于4℃、12000rpm离心10min，取上清进行薄层层析分析，上样量为4μL。展开剂为正丁醇：甲酸：水(4：6：1，v/v/v)，显色剂为10％硫酸乙醇。结果显示，该酶对杂合褐藻寡糖PolyMG具有底物偏好性，降解海藻酸钠和PolyMG的终产物主要为单糖、二糖和三糖(图2)；降解PolyM效果比较差，产物主要为二糖和三糖，还产生微弱的单糖成分；该酶几乎不能降解PolyG，仅产生微弱的二糖成分。

(4)酶的作用温度

将酶液在0～100℃范围内，以50mM Glycine-NaOH缓冲液(pH9.0)配制的0.3％的海藻酸钠作为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算不同温度下的相对酶活力。结果表明，该酶最适反应温度为35℃，在25～55℃范围内酶活力较高，其相对酶活力均保持80％以上；在10～70℃范围内，其相对酶活力均保持50％以上。结果见图4。

(5)酶的作用pH

将酶液在35℃下，以不同缓冲液(50mM Na-acetate缓冲液，pH4.5～6.0；50mM Na-phosphate缓冲液，pH6.0～8.0；50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.0～8.5；50mM Glycine-NaOH，pH8.5～11.0)配制的0.3％的海藻酸钠作为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算不同pH下该酶的相对活力。

结果表明，该酶的最适pH为9.0，在pH8.0～9.5范围内酶活力较高，其酶活力均保持85％以上；在pH7.5～10.0范围内，该酶活力均保持65％以上；在pH7.0以下和pH10.5以上酶活性偏低；在相同pH条件下，Tris-HCl缓冲液优于Na-phosphate缓冲液。结果见图5。

(6)化学试剂对酶活力的影响

在35℃、pH8.0条件下，在反应体系中分别加入终浓度为1mM/1％(v/v)的不同化学试剂，然后测定酶活，以未添加任何化学试剂条件下的相对酶活力为100％，计算不同化学试剂影响下的酶的相对活力。结果表明，Ca²⁺对该酶活力有轻微促进作用，Na⁺、K⁺、Fe²⁺和EDTA对酶活力影响不大，Co²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺和DTT部分抑制酶的活性；Ba²⁺、Cu²⁺和Mg²⁺明显抑制该酶活性，其中Ba²⁺抑制该酶活性70％以上(图6)。

实验结果表明该酶的最适温度为35℃，最适pH为9.0，在25～55℃和pH8.0～9.5范围内酶活力较高，其酶活力均保持80％以上；1mM的Na⁺、K⁺、Fe²⁺和EDTA对酶活力影响不大，Ba²⁺显著抑制该酶活性；该酶对杂合褐藻寡糖PolyMG具有底物偏好性，能很好地降解PolyMG和海藻酸钠，产物主要为单糖、二糖和三糖组分，可与具有不同底物偏好性的褐藻胶裂解酶协同作用高效降解褐藻胶。

Claims (10)

1.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，所述的褐藻胶裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的褐藻胶裂解酶。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体中插入了用于编码权利要求1所述的褐藻胶裂解酶的核酸片段。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体为原核表达载体或真核表达载体。

6.一种基因工程菌株，其特征在于，所述的基因工程菌株中转化有权利要求4所述的重组表达载体。

7.如权利要求6所述的基因工程菌株，其特征在于，所述的基因工程菌株为真核工程菌株或原核工程菌株。

8.权利要求1所述的褐藻胶裂解酶在褐藻资源开发利用中的应用。

9.权利要求1所述的褐藻胶裂解酶在降解海藻酸钠来制备褐藻寡糖中的应用。

10.一种制备褐藻寡糖的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的褐藻胶裂解酶降解海藻酸钠或褐藻来制备褐藻寡糖。