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CN102647995A - 用于治疗胰岛素抵抗及与之相关的疾病的SorCS1样药剂 - Google Patents

用于治疗胰岛素抵抗及与之相关的疾病的SorCS1样药剂 Download PDF

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CN102647995A CN2010800357381A CN201080035738A CN102647995A CN 102647995 A CN102647995 A CN 102647995A CN 2010800357381 A CN2010800357381 A CN 2010800357381A CN 201080035738 A CN201080035738 A CN 201080035738A CN 102647995 A CN102647995 A CN 102647995A
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Abstract

本发明涉及SorCS1样药剂，包括SorCS1、编码SorCS1及其片段的表达的核酸分子以及含有所述核酸的载体，以及表达SorCS1和所述片段的细胞，在治疗胰岛素抵抗中的用途。

Description

用于治疗胰岛素抵抗及与之相关的疾病的SorCS1样药剂
将本申请中引用的所有专利和非专利文献全部引入作为参考。
技术领域
本发明涉及SorCS1样药剂(如SorCS1及其片段与变体)在制备治疗、减轻或延迟患者胰岛素抵抗的药物中的应用。本发明进一步涉及SorCS1样药剂(如SorCS1及其片段与变体)在敏化胰岛素受体中的应用。本发明还涉及SorCS1基因剔除小鼠作为胰岛素抵抗的动物模型的应用。
背景技术
胰岛素抵抗综合征
代谢紊乱，总体上被称作代谢综合征或胰岛素抵抗综合征在工业化国家的传播已经达到了流行性疾病的程度。胰岛素抵抗综合征是指一组结果，包括葡萄糖耐受不良、肥胖、脂质成分变化(血脂异常)和高血压，它们促进2型糖尿病、心血管疾病、癌症、多囊卵巢疾病和其他疾病的发展。在所有这些疾病中，病理生理学的核心部分在于胰岛素抵抗。这种综合征的潜在原因是超重/肥胖、身体不活动和一系列目前还未明确界定的遗传多态性(参见1+2)。对该综合征的生活方式干预及病理的药理治疗仅在一定程度上有效，当前急需新的治疗方法。
胰岛素和胰岛素抵抗
胰岛素是一种由胰腺中胰岛的β-细胞产生的激素。当血液葡萄糖水平升高时刺激胰岛素释放，通过位于靶组织(尤其是位于脂肪组织、骨骼肌和肝脏)细胞膜中的葡萄糖转运体的胰岛素依赖性刺激作用将葡萄糖从血液中除去。胰岛素通过结合并激活膜结合性的胰岛素受体(IR)，由此引发一连串细胞内信号事件来表现它的生物活性，它调节多种生物过程，如葡萄糖和脂质代谢、基因表达、蛋白质合成，以及非代谢过程，如细胞生长和分化。IR激活的多样化效应是通过胰岛素结合时聚集的多组分信号复合体来调节。这样，IR固有的蛋白质-络氨酸激酶活性导致几种络氨酸残基发生自体磷酸化，接着包括IR底物(IRS)蛋白质和含Scr-同源-2(Shc)的蛋白质在内的几种细胞内蛋白质底物进行募集和磷酸化。这启动了两种主要信号通路的激活：磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT/蛋白激酶B(PKB)通路，它负责大多数代谢活动，包括葡萄糖转运体GLUT4移位至细胞膜与刺激糖原合成；以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，它调节一些基因的表达并与(PI3K)-AKT通路配合以控制细胞生长和分化(参见3-8)。
胰岛素刺激葡萄糖清除的能力在看似健康的人群中是不断变化的，胰岛素最敏感和胰岛素最抵抗的人之间存在≥600％的差异。然而，在对胰岛素最抵抗的人群中有三分之一面临更大的患有几种异常情况和临床综合征的风险，包括2型糖尿病、心血管疾病、高血压、中风、非酒精性脂肪肝、多囊卵巢疾病和某些形式的癌症(参见9)。
某些个体被称为“胰岛素抵抗者”，因为他们的组织表现得好像血流中没有足够的胰岛素，这表现为肝脏、脂肪组织和骨骼肌中的胰岛素反应和葡萄糖摄取降低。胰岛素抵抗的第一反应是胰岛素的代偿性产生和分泌，以弥补机体降低的敏感性，导致高胰岛素血症。这样，高胰岛素水平和组织从血流中清除葡萄糖的反应性降低成为胰岛素抵抗的特征。胰岛素抵抗是导致一系列代谢变化的主要事件，包括代偿性高胰岛素血症、血脂异常、胰腺β细胞代偿机能减退以及高血糖症(参见6-8)。
2型糖尿病和胰岛素抵抗
2型糖尿病(非-胰岛素依赖性糖尿病)是一种与死亡率和发病率风险增大相关的复杂疾病。它的发病率稳步增加，该疾病目前在世界范围内影响超过1.5亿人口，使其成为公众关心的主要问题。该疾病是一种原型复杂的多基因疾病，带有强烈的可遗传成分，但是也深受环境因素如肥胖的影响。2型糖尿病的发病机制包括肝脏和外周组织中胰岛素抵抗的逐步发展，伴随胰腺β细胞的胰岛素分泌缺陷，导致明显的高血糖症(血液中葡萄糖含量异常高)。胰岛素抵抗的第一反应是代偿性产生和分泌胰岛素，以弥补机体降低的敏感性，导致高胰岛素血症，并产生个体的前期糖尿病。然而，当胰岛素抵抗个体的胰腺不能产生足够的激素以补偿增加的需求时，β细胞将最终被耗尽并衰退，导致高血糖症和明显的2型糖尿病(参见4和5)。因此，2型糖尿病仅在不能维持β细胞代偿性胰岛素反应的主体中产生。这些主体具有“敏感的”胰岛，与之相对的是“稳固的”胰岛—一种由遗传和/或后天获得的因素如肥胖所决定的状况(图14)。
识别能恢复葡萄糖代谢及治疗胰岛素抵抗的肽/蛋白很有希望成为新的治疗目标，用于潜在地结合对2型糖尿病、代谢综合征和其他以胰岛素抵抗为特征的疾病的治疗。
SorCS1受体
SorCS1是哺乳动物的Vps10p-域(Vps10p-D)受体家族的五个成员之一，该受体家族还包括分选蛋白(Sortilin)、SorLA、SorCS2和SorCS3。它们都是1型跨膜受体，具有与Vps10p高度同源性的N端Vps10p-D特征性的结构特征，Vps10p是酵母中的一种分选蛋白(10)。目前该受体家族的生理功能尚不清楚，但是最近的研究结果显示，分选蛋白和SorLA作为神经元存活和死亡的调控物发挥着重要的作用(11，12)。令人感兴趣的是，分选蛋白也与调节葡萄糖摄取的胰岛素相关，因为它可促进葡萄糖转运体GLUT4从细胞内室向血浆膜转移(13，14)。
SorCS1在Vps10p-D受体中是独特的，因为它以几种不同的剪接变体存在，表示为SorCS1-a、b、c、c+和d，它们编码相同的细胞外和跨膜部分，以及不同长度和序列的细胞质域(10，11)。本发明人和其他人已经发现，除了神经系统以外，SorCS1还在脂肪组织、骨骼肌和胰腺的β细胞；参与葡萄糖代谢的所有组织中表达。而且，每种剪接变体表现出不同的组织分布以及亚细胞表达模式，表明尾变体可能涉及不同的生物活性(15-17)。
发明内容
本发明人采用细胞研究研究了SorCS1及其不同剪接变体对治疗小鼠胰岛素抵抗的影响，以及SorCS1及不同剪接变体对胰岛素受体表达的影响，因此本发明的主要方面涉及用于治疗个体中胰岛素抵抗和/或与胰岛素抵抗相关的疾病的SorCS1样药剂，其中所述药剂能够在SorCS1结合位点与胰岛素受体(IR)结合并且能够敏化胰岛素受体。
SorCS1是哺乳动物Vps 10p-域(Vps10p-D)受体家族的五个成员之一，该受体家族还包括分选蛋白、SorLA、SorCS2和SorCS3(图1)。鼠科SorCS1在Vps10p-D受体中是独特的，因为它以几种不同的剪接变体存在，表示为mSorCS1-a、b、c、c+和d(图2)。
简言之，本发明人证实了在缺乏所有mSorCS1剪接变体的基因剔除小鼠中，老的雄性小鼠是高胰岛素但是是前期糖尿病，而老的SorCS1基因剔除的雌性小鼠是高血糖和高胰岛素，二者均是年龄相关性糖尿病，这是由于转基因小鼠中胰岛素抵抗的结果。而且，本发明人已经示出了，鼠科SorCS1与胰岛素受体结合，并且mSorCS1调节胰岛素受体的表达。
此外，本发明涉及编码上述用于治疗个体胰岛素抵抗或者与胰岛素抵抗相关疾病的多肽的核酸序列、以及包括所述核酸的用于治疗目的的载体、宿主细胞和包装细胞系。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，该药物组合物包括一种或多种上述药剂；或者上述分离的核酸序列；或者上述表达载体；或者上述宿主细胞的组分；或者上述包装细胞系；或者它们的结合。
此外，本发明又一方面涉及一种治疗胰岛素抵抗或者与胰岛素抵抗相关疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体施予治疗有效量的上述药剂；或者上述分离的核酸序列；或者上述表达载体；或者上述宿主细胞的组分；或者上述包装细胞系，或者它们的结合。
另一方面，本发明涉及一种上调有需要的患者中的胰岛素受体或其片段或变体的方法，所述方法包括向有需要的个体施予治疗有效量的上述药剂；或者上述分离的核酸序列；或者上述表达载体；或者上述宿主细胞的组分；或者上述包装细胞系；或者它们的结合。
另一方面，本发明涉及一种敏化胰岛素受体的方法，所述方法包括施予一种Vps10p域受体，所述Vps10p域受体选自：
a)SorCS1
b)SorCS2
c)SorCS3
d)分选蛋白，和
e)SorLA，
由此可用于治疗胰岛素抵抗或者与胰岛素抵抗相关疾病的方法中。
与胰岛素抵抗相关的疾病具体选自胰岛素抵抗综合征、2型糖尿病、糖耐受受损、代谢综合症、高血糖症、高胰岛素血症、动脉硬化、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高脂血症、血脂异常、肥胖、中心性肥胖、多囊卵巢综合征、凝血过快、高血压、微蛋白尿、胰岛素抵抗综合征(IRS)、2型糖尿病、糖耐受受损、代谢综合征、高血糖症和高胰岛素血症。
本发明的又另一方面涉及一套试剂盒，包括：
-本文所述的药物组合物；
-用于施予所述药物组合物的医疗器械或其他工具；
-如何使用该套试剂盒的说明。
在另一方面，本发明涉及一种转基因的基因剔除小鼠，其中内源性Vps10p域受体SorCS1基因被打断，以消除功能化SorCS1受体的表达，并且其中所述小鼠相对于非转基因对照小鼠表现出胰岛素应答下降。
在另一个重要的方面，本发明涉及一种筛选SorCS1样药剂降低血糖水平的能力的方法，所述方法包括步骤：
a)提供权利要求69所述的第一和第二转基因小鼠；
b)向所述第一转基因小鼠施予候选药剂，和
c)向所述第二转基因小鼠施予生理溶液，和
d)施予所述药剂后，在预定的时间间隔，如15分钟、30分钟、60分钟、2和4小时，分别从b)和c)的小鼠采取血液样品；和
e)比较d)样品的血糖水平；其中施予所述候选药剂的所述第一转基因小鼠的血糖相对于没有施予所述候选药剂的所述第二转基因小鼠降低，表明该候选药剂降低了血糖水平。
在另一个重要的方面，本发明涉及一种筛选SorCS1样药剂降低血糖水平的能力的方法，所述方法包括步骤：
a)提供第一和第二野生型小鼠；和
b)向所述第一小鼠施予权利要求1的药剂，和
c)向所述第二小鼠施予生理溶液，和
d)施予所述药剂后，在预定的时间间隔，如15分钟、30分钟、60分钟、2和4小时，分别从b)和c)的小鼠采取血液样品；和
e)比较d)样品的血糖水平；其中施予所述候选药剂的所述第一野生型小鼠的血糖相对于没有施予所述候选药剂的所述第二野生型小鼠降低，表明该候选药剂降低了血糖水平。
本发明另一方面涉及一种一旦激活表达，就能够以组织特异性方式编码可溶性和/或全长SorCS1的转基因小鼠。
本发明再一方面涉及一种能够加强SorCS1或其片段或变体与胰岛素受体之间的结合能力的药剂在治疗胰岛素抵抗和/或与胰岛素抵抗相关疾病中的用途。
附图简要说明
图1：Vps10p-域受体家族。显示了它们的结构组织。
图2：mSorCS1的剪接变体。A)导致产生不同细胞质尾区的鼠科SorCS1基因的组织。B)mSorCS1胞质域的氨基酸序列。
图3：不同mSorCS1剪接变体的表达。用特异性引物对RT-PCR从不同组织的mRNA获得的片段，用于鉴定SorCS1的细胞外部分(外)或五种尾变体中的每一种(a、b、c、c+和d)。
图4：mSorCS1基因剔除小鼠的产生。A)通过在胚胎干细胞中进行同源重组产生mSorCS1基因剔除小鼠的方案。B)mSorCS1 mRNA表达的分析，显示了缺乏所有mSorCS1剪接变体的转录。C)皮层的Western blot分析，显示mSorCS1基因剔除(KO)小鼠中缺乏mSorCS1蛋白。
图5：不同年龄的A)雄性和B)雌性小鼠的平均血糖。动物禁食过夜(16h)，通过眼眶采血获得血液样品，并且在自动监测仪上快速测量血浆葡萄糖。
图6：10-50周龄的雌性野生型和SorCS1基因剔除小鼠的血浆胰岛素水平。动物禁食过夜(16h)，通过眼眶采血获得血液样品，并且使用超灵敏小鼠胰岛素酶联免疫检测试剂盒测定血浆胰岛素水平。
图7：SorCS1基因剔除小鼠和野生型同窝出生小鼠的葡萄糖耐受测试。59周龄的小鼠禁食过夜(16h)，并经腹腔注射葡萄糖无菌盐水溶液推剂(2mg/g体重)。注射后的0、15、30、60和120min时通过眼眶采血获得血液样品，并且测量血浆A)葡萄糖和B)胰岛素水平。数据为每组四只小鼠的平均值±SEM。
图8：西方型饮食的野生型小鼠中空腹血浆葡萄糖和胰岛素水平升高。将雌性A)+C)和雄性B)+D)野生型和SorCS1基因剔除小鼠从10周龄到50周龄喂以高热量西方型饮食(WD)。在50周龄时将动物禁食过夜(16h)，通过眼眶采血获得血液样品，并且测量血浆葡萄糖A)+B)和血浆胰岛素水平C)+D)。数据是每组中4-10只小鼠的平均值±SEM。
图9：喂给西方型饮食的野生型和基因剔除小鼠的腹部脂肪组织
将雌性A)和雄性B)野生型和SorCS1基因剔除小鼠从10周龄到50周龄喂以高能量西方型饮食(WD)。在研究结束时，处死动物并且分离及称重腹部脂肪(脂肪组织)。数据是每组中4至10只小鼠的平均值±SEM。
图10：肌肉和脂肪组织中IR、磷酸化IR(pY-IR)和Glut4的表达。将50周龄的雌性SorCS1基因剔除小鼠(-/-)和野生型(+/+)对照小鼠禁食过夜，腹腔注射胰岛素无菌盐水溶液(10单位/kg体重)，并在15分钟后处死。通过western blotting分析A)脂肪和B)肌肉组织(100μg)，以抗-IR、抗-IR-pY、抗-Glut和抗-肌动蛋白作为内参。
图11：SorCS1和胰岛素受体之间的物理相互作用。A)将以指定受体转染的CHO细胞(仅以IRA和IRB瞬态转染)用胰岛素刺激并且以IR进行免疫沉淀，分别采用α-SorCS1-leu和α-IR通过western blotting进行分析。B)表面等离子体共振试验(BIAcore)显示SorCS1的可溶性全长细胞外部分与固定的可溶性胰岛素受体(IR)的直接相互作用。Kd估计约5nM。
图12：以SorCS1转染的CHO细胞中的胰岛素受体表达。将来自CHO细胞及稳定表达mSorCS1-A、mSorCS1-B、mSorCS1-C、mSorCS1-D和msol.SorCS1(SorCS1的细胞外部分)的CHO细胞的细胞裂解物进行SDS-PAGE和Western blot分析，以抗-IR、抗-SorCS1-leu和抗-肌动蛋白作为内参。
图13：细胞膜上IR和SorCS1的表达。将CHO细胞及稳定表达mSorCS1-A、mSorCS1-B和mSorCS1-C的CHO细胞进行表面生物素化，随后进行SDS-PAGE和Western印迹分析，以抗-IR、抗-SorCS1-leu和抗-肌动蛋白作为内参。Bio泳道包含生物素化的表面蛋白，Intra泳道包含细胞内蛋白，而细胞裂解物(lysat)用作输入对照。
图14：人2型糖尿病的发展阶段。图表(黑线)显示T2D发展期间血糖浓度增加，显示了在frank糖尿病发作之前，从正常到前期糖尿病的变化。此外，该图表上(虚线)还显示了T2D发展期间的胰岛素水平，表明前期糖尿病状态期间胰岛素增加，以补偿胰岛素抵抗，而在frank糖尿病发作时由于β细胞衰竭，胰岛素释放显著减少。
图15：20天龄的野生型和基因剔除小鼠中胰岛的胰岛素免疫染色。将胰腺切除，固定在多聚甲醛上，冷冻切片，然后以抗胰岛素抗体免疫染色。代表性图像如图所示。
图16：SorCS1的比对
源自人(homo sapiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)、乳牛(Bos Taurus)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、狗(Canis lupus familiaris)和鸡(Gallus gallus)的SorCS1序列比对。序列同一性如表2所示。
表2：人SorCS1的序列同一性
  种属   蛋白质(％同一性)  DNA(％同一性)
  人   100  100
  黑猩猩   99.6  99.4
  狗   97.6  92.5
  乳牛   92.9  89.8
  小鼠   93.2  87.7
  大鼠   93.2  88.0
  鸡   85.3  79.7
图17：在肝过表达可溶性SorCS1之后雌性野生型和SorCS1基因剔除小鼠中血浆葡萄糖水平降低
SorCS1基因剔除或野生型雌性小鼠注射腺病毒以便肝脏表达可溶性人SorCS1或者注射编码LacZ的对照病毒。在注射当日(0d)和施予病毒7天(7d)后，测定禁食16h小鼠的血浆葡萄糖。该图显示与第0天所得值进行标准化后的相对血浆葡萄糖(n＝4)。该图显示可溶性SorCS1(细胞外域)的过表达降低了野生型和SorCS1基因剔除小鼠的血浆葡萄糖。
图18：过表达可溶性SorCS1的SorCS1基因剔除雌性小鼠的肌肉和脂肪组织中IR、磷酸化IR(pY-IR)和Glut4的表达。40周龄的雌性SorCS1基因剔除小鼠(-/-)注射表达人可溶性SorCS1或LacZ(作为对照)的腺病毒载体。在病毒注射12天后，将小鼠禁食过夜，腹腔注射胰岛素的无菌盐水溶液(10单位/kg体重)，并在15分钟后处死。用抗-IR、抗-IR-pY和抗-Glut4，对来自肌肉(A)和脂肪组织(B)的50μg裂解物进行western blotting分析。该图显示，用编码SorCS1的病毒处理增加了IR表达、IR磷酰化以及Glut4表达。
图19：过表达可溶性SorCS1的糖尿病db/db雌性小鼠中血浆葡萄糖和胰岛素水平降低
10周龄的肥胖2型糖尿病雌性db/db小鼠注射表达人可溶性SorCS1或LacZ(作为对照)的腺病毒。在病毒感染前0天(d0)和感染后7天(7d)，通过眼眶采血获得禁食过夜(16h)的小鼠血液样品，并测量血糖(A)和血浆胰岛素(B)的水平。数据是每组5只小鼠的平均值±SEM，并表示为与0天比较的相对值。以SorCS1病毒、而非LacZ病毒处理过的小鼠显示出胰岛素敏感性增加，表现为血浆葡萄糖和胰岛素水平降低。在0至7天LacZ组中血浆葡萄糖和胰岛素都增加，表明动物处于发展糖尿病的过程。
图20：过表达可溶性SorCS1的糖尿病db/db雌性小鼠中的葡萄糖耐受试验
将以表达可溶性SorCS1或LacZ的腺病毒感染之后3天的禁食雌性db/db小鼠腹腔注射葡萄糖无菌盐水溶液(2mg/g体重)。在注射后0、15、30、90和150分钟通过眼眶采血获得血液样品，并测量血糖水平。数值是每组5只小鼠的平均值±SEM。试验显示，接受sol-SorCS1病毒的小鼠中，基线血糖在150分钟处恢复，而以LacZ病毒处理的小鼠仍保持高血糖。
图21：过表达可溶性SorCS1的糖尿病db/db雄性小鼠中的血浆葡萄糖和胰岛素水平
将6周龄肥胖雄性db/db小鼠注射表达人可溶性SorCS1或LacZ(作为对照)的腺病毒。在0天和7天，将小鼠禁食过夜(16h)，通过眼眶采血获得血液样品，并测量血糖(A)和血浆胰岛素(B)水平。数据是每组5只小鼠的平均值±SEM，并表示为与0天相比的相对变化。该图显示，以SorCS1病毒处理增加了葡萄糖敏感性，因为血浆葡萄糖下降，而胰岛素水平则与接受LacZ病毒的小鼠相似。两组中的血浆胰岛素在0至7天增加，表明动物处于发展糖尿病的过程中。在实验过程中，它们仍然可以通过增加胰岛素产生而补偿胰岛素敏感性的降低。
图22：过表达可溶性SorCS1的db/db雄性小鼠的肌肉组织中Glu4的亚细胞定位
将从过表达可溶性SorCS1或LacZ的五只db/db雄性小鼠肌肉组织中通过亚细胞分离得到的轻微体以0.8M至1.6M蔗糖速率梯度进行分级。梯度分级进行凝胶电泳并以Glut4抗体blot，由此识别Glut4在不同分级中的位置。实验表明，SorCS1表达改变了Glu4的亚细胞定位，与SorCS1在调节葡萄糖摄取中的重要作用相符。
图23：通过SPOT分析法分析SorCS1/IR接点接通序列(contact sequence)
A)将与人胰岛素受体重叠三个残基的连续16-mer氨基酸肽点到过滤膜上。然后将过滤膜以放射标记的鼠科SorCS1的细胞外域进行孵育，并且通过自动射线照相术检测结合情况。图中显示胰岛素受体中可能的SorCS1结合位点。
B)通过人SorCS1-a重叠三个残基的连续16-mer氨基酸肽点在过滤膜上，并使用带组氨酸标签的可溶性受体探测胰岛素受体结合。采用抗组氨酸标签的抗体，通过Western blotting可视观察能够结合SorCS1-a的肽。图中显示SorCS1-a中可能的结合顺序。
图24：通过PCR阵列，源自SorCS1基因剔除小鼠的脂肪组织的基因表达谱
检测与野生型脂肪组织相比，SorCS基因剔除小鼠的脂肪组织中的基因表达，A)与小鼠胰岛素信号通路有关的84个基因，和B)与小鼠脂蛋白信号&胆固醇代谢相关的84个基因。将SorCS1基因剔除小鼠的高于或低于野生型小鼠3倍量的基因列出，并显示它们的推定的功能。
发明详细说明
定义
除非特别说明，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域技术人员所理解的常用含义。为了理解本发明，对以下术语进行解释。
佐剂：与施予的免疫原决定簇/抗原混合，增强或者改变对所述决定簇的免疫反应的任意物质。
亲和力：大多数配体与它们的结合位点的相互作用可以根据结合亲和力来描述。一般来说，高亲和力配体结合是由在配体与它的受体之间较大的分子间力而产生的，而低亲和力配体结合涉及在配体与它的受体之间有较小的分子间力。一般来说，高亲和力结合与低亲和力结合相比，配体在它的受体结合位点处有更长的保留时间。当某些结合能可以用于引起受体的构象变化时，配体与受体的高亲和力结合通常在生理学上是很重要的，导致了相关离子通道或酶的行为发生改变。
可以与受体结合、改变受体功能并引发生理反应的配体被称为该受体的激动剂。与受体结合的激动剂可以根据引发生理反应的程度以及产生该生理反应所需的激动剂的浓度来描述。高亲和力配体结合意味着相对低浓度的配体就足以最大地占据配体结合位点并引发生理反应。低亲和力结合意味着需要相对高浓度的配体才能最大地占据结合位点并达到对该配体的最大生理反应。配体结合通常根据一半受体结合位点被占据时的配体浓度来表征，称为解离常数(kd)。亲和力也指受体与它们的配体(例如抗体与它的抗原)之间的结合强度。
醇：含有一个或多个羟基(OH)的一类有机化合物。在本文中，饱和或不饱和、分支或未分支的烃基作为较大分子上的取代基。
脂环基：术语“脂环基”表示性质类似于脂族基的环状烃基。
脂族基：本发明中术语“脂族基”表示饱和或不饱和的线性或分支烃基。该术语用于涵盖例如烷基、烯基和炔基。
烷基：术语“烷基”表示饱和的线性或分支烃基，包括例如甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、十二烷基、十八烷基、戊烷基、2-乙基己基等。
烯基：术语“烯基”表示带有一个或多个碳-碳双键的不饱和线性或分支烃基，例如乙烯基。
炔基：术语“炔基”表示带有一个或多个碳-碳三键的不饱和线性或分支烃基。
两亲性物质：同时包含极性、水溶性与非极性、水不溶性基团的物质。
激动剂：激动剂是能够增加或影响受体活性的化合物。具体地，Vps10p域受体激动剂是能够结合Vps10p域受体的一个或多个结合位点，从而引发与给定的内源性激动剂配体化合物相同生理反应的化合物。
拮抗剂：拮抗剂在本申请中与抑制剂同义。拮抗剂是能够降低效应体(如受体)活性的化合物。具体地，Vps10p域受体拮抗剂是能够结合Vps10p域受体的一个或多个结合位点，从而抑制另一种配体的结合并因此抑制生理反应的化合物。
抗体：本文所指的术语“抗体”包括整个抗体和任意抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。
多克隆抗体：多克隆抗体是识别给定的特异性抗原的抗体分子的混合物，因此多克隆抗体可识别所述抗原内的不同表位。
芳香基：术语“芳香基”或“芳基”表示单或多环芳香碳水化合物基团。
结合：术语“结合”是指化学实体或化合物或其部分之间接近的状态。结合可以是非共价的，其中氢键或范德华或者静电相互作用在能量上有利于并列(juxtaposition)，或者结合可以是共价的。本发明的药剂能够与胰岛素受体结合。结合分析可以是图11B中讨论的Biocore分析以及图11A中讨论的co.IP分析。
结合位点：本文使用的术语“结合位点”或“结合口袋”，指分子或分子复合体因其形状而有利地与另一种分子、分子复合体、化学实体或化合物相联系的区域。如本文所述，口袋包括至少一个深腔和可选的一个浅腔。
生物活性剂或生物活性的或生物活性：本文所用的术语指本申请中可使用的具有本发明的治疗或其他用途的任意物质的作用。生物活性指体外和/或体内的生物作用。本文中，根据本发明的药剂的生物活性是指能够与胰岛素受体结合和/或增强SorCS1样药剂与胰岛素受体的结合，在更优选的实施方式中，生物活性包括敏化胰岛素受体。生物活性药剂可以是中性的、带正电荷或带负电荷的。适宜的生物药剂包括，例如，前药、诊断剂、治疗剂、药物、药品、氧输送剂、血液代用品、合成的有机分子、多肽、肽、维生素、类固醇、类固醇类似物以及遗传决定簇，包括核苷、核苷酸和多核苷酸。
阳离子基团：当包含化学基团的化合物溶于溶剂中，优选溶于水中时，能够作为质子供体的该化学基团。
复合物：本文使用的术语“复合物”是指分子或蛋白、其保守类似物或截短物与化学实体相结合的结合物。
环基：术语“环基”表示闭合环状烃基，可分为脂环基、芳环基或杂环基。
环烯基：表示包括一个、两个或三个环的单价不饱和碳环基，每个环具有3至8个碳，其可选地被一个或两个取代基取代，取代基选自：羟基、氰基、低级烯基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、烯硫醇基、卤素、卤代烯基、羟烯基、硝基、烷氧羰基、氨基、烯基氨基、烯基磺酰基、芳基磺酰基、烯基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、烯基氨基羰基、烷基氨基羰基、烯基羰基氨基和芳基羰基氨基。
环烷基：表示包括一个、两个或三个环的单价饱和碳环基，每个环具有3至8个碳，其可以被一个或多个取代基取代，取代基选自：羟基、氰基、低级烷基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、烷巯基、卤素、卤代烷基、羟烷基、硝基、烷氧羰基、氨基、烷氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰基氨基和芳基羰基氨基。
静电相互作用：本文使用的术语“静电相互作用”指当带相反电荷的成分相互吸引时，带电成分、分子或离子之间由于吸引力而发生的任意相互作用。实施例包括但不限于：离子相互作用、共价相互作用、离子和偶极(离子和极性分子)之间的相互作用，两个偶极(极性分子的部分电荷)之间的相互作用，氢键和London分散键(可极化分子的诱导偶极)。因此，例如，“离子相互作用”或“静电相互作用”是指第一、正电荷分子与第二、负电荷分子之间的吸引。例如，离子或者静电相互作用包括负电荷生物活性剂之间的吸引。
成环：表示当形成环结构时，所述原子通过键连接。
片段：本发明的多肽片段包括它的任意功能等同物，在一个实施方式中可包括氨基酸序列的少于500个氨基酸残基，例如少于450个氨基酸残基，例如少于400个氨基酸残基，例如少于350个氨基酸残基，例如少于300个氨基酸残基，例如少于250个氨基酸残基，例如少于240个氨基酸残基，例如少于225个氨基酸残基，例如少于200个氨基酸残基，例如少于180个氨基酸残基，例如少于160个氨基酸残基，例如少于150个氨基酸残基，例如少于140个氨基酸残基，例如少于130个氨基酸残基，例如少于120个氨基酸残基，例如少于110个氨基酸残基，例如少于100个氨基酸残基，例如少于90个氨基酸残基，例如少于85个氨基酸残基，例如少于80个氨基酸残基，例如少于75个氨基酸残基，例如少于70个氨基酸残基，例如少于65个氨基酸残基，例如少于60个氨基酸残基，例如少于55个氨基酸残基，例如少于50个氨基酸残基，例如少于45个氨基酸残基，例如少于40个氨基酸残基，例如35个氨基酸残基，例如30个氨基酸残基，例如25个氨基酸残基，例如20个氨基酸残基，例如15个氨基酸残基，例如10个氨基酸残基，例如5个连续的氨基酸残基；所述氨基酸序列选自：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51，或者与所述序列至少70％同一性的变体。此外，本发明的多肽片段包括它们的任意功能的等同物，在一种实施方式中可包括氨基酸序列的5个以上氨基酸残基，例如10个以上氨基酸残基，例如15个以上氨基酸残基，例如20个以上氨基酸残基，例如25个以上氨基酸残基，例如50个以上氨基酸残基，例如75个以上氨基酸残基，例如100个以上氨基酸残基，例如125个以上氨基酸残基，例如150个以上氨基酸残基，例如175个以上氨基酸残基，例如200个以上氨基酸残基，例如225个以上氨基酸残基，例如250个以上氨基酸残基，例如275个以上氨基酸残基，例如300个以上氨基酸残基，例如325个以上氨基酸残基，例如350个以上氨基酸残基，例如375个以上氨基酸残基，例如400个以上氨基酸残基，例如425个以上氨基酸残基，例如450个以上氨基酸残基，例如475个以上氨基酸残基，例如500个以上氨基酸残基，例如525个以上氨基酸残基，例如550个以上氨基酸残基，例如575个以上氨基酸残基，例如600个以上氨基酸残基，例如625个以上氨基酸残基，例如650个以上氨基酸残基，例如675个以上氨基酸残基，例如700个以上氨基酸残基；所述氨基酸序列选自：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51，或者与所述序列至少70％同一性的变体。
功能等同物：根据一种优选实施方式，本发明中使用的“功能等同物”是通过参考序列的预定片段的相应功能来确立的。
SorCS1多肽或其片段的功能等同物或变体可理解为：随着插入、缺失和替代(包括保守替代)的数目与范围增大，表现出氨基酸序列分别逐步与优选的预定SorCS1多肽或SorCS1片段序列不同，但仍保持本申请中SorCS1多肽的生物活性。这种区别可通过优选的预定序列与片段或功能等同物之间同源性的降低来衡量。
如果含有功能类似的氨基酸侧链的残基被替代，通过替代而获得的功能变体可能更好地表现出某些形式或程度的天然SorCS1活性，只是同源性较小。在这方面，功能相似是指侧链的主要特征，如疏水性、碱性、中性或酸性，或者是否存在立体位阻。因此，本发明的一种实施方式中，同一性的程度并不是衡量一个片段是否是本发明的优选预定片段的变体或功能等同物的主要量度。
基因“沉默”：导致内源性基因的表达降低的过程。基因沉默更多是基因表达的转录后降低的结果。
基团：(实体(moiety)/取代)是本技术领域充分理解的，高度的取代不仅是容许的，也是常推荐的。在本发明物质上进行取代是预期的。作为一种简化讨论和陈述本申请全文使用的某些技术术语的方式，术语“基团”和“实体”用于区分允许取代或者可被取代的化学物质与不允许或者不可以那样被取代的化学物质。因此，当术语“基团”被用于描述化学取代，所描述的化学物质包括未取代的基团和例如链中带有O、N或S原子的基团，以及羰基或其他常规取代基。当术语“实体”用于描述化合物或取代物时，仅包括未取代的化学物质。例如，短语“烷基”用于不仅仅包括纯的开链饱和烃基取代基，如甲基、乙基、丙基、叔丁基等，还包括含有本领域已知的进一步取代的烷基取代基，如羟基、烷氧基、烷磺酰基、卤素原子、氰基、硝基、氨基、羰基等。因此，“烷基/烷基基团(alkyl group)”包括醚基、卤烷基、硝基烷基、羰基烷基、羟基烷基、磺烷基等。另一方面，短语“烷基实体(alkyl moiety)”仅限于包括纯的开链饱和烃烷基取代基，如甲基、乙基、丙基、叔丁基等。同样的定义应用于“烯基”和“烯基实体”、“炔基”和“炔基实体”、“环基”或“环基实体”、“脂环基”和“脂环基实体”、“芳香基”或“芳基”和“芳香基实体”、以及“杂环基”和“杂环基实体”。
杂环基：术语“杂环基”表示闭环烃基，其中环上的一个或多个原子是碳原子以外的元素(如氮、氧、硫等)。
杂环基表示包括1至2个环的单价饱和环基，每个环有3至8个原子，包含1或2个环杂原子(选自N、O或S(O)0-2)，它们可选地被选自如下基团的一个或两个取代基取代：羟基、氧、氰基、低级烷基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、烷巯基、卤素、卤代烷基、羟基烷基、硝基、烷氧基羰基、氨基、烷氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基氨基磺酸基、芳基氨基磺酸基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰基氨基或芳基羰基氨基。
杂芳基表示具有1至3个环的单价芳香环基，每个环有4至8个原子，环内包含1或2个杂原子(选自N、O或S)，环可选地被选自如下基团的一个或两个取代基取代：羟基、氰基、低级烷基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、烷巯基、卤素、卤代烷基、羟基烷基、硝基、烷氧基羰基、氨基、烷氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基氨基磺酸基、芳基氨基磺酸基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰基氨基或芳基羰基氨基。
同源性：氨基酸序列之间的同源性可用已知的计分矩阵进行计算，如BLOSUM30、BLOSUM40、BLOSUM45、BLOSUM50、BLOSUM55、BLOSUM60、BLOSUM62、BLOSUM65、BLOSUM70、BLOSUM75、BLOSUM80、BLOSUM85和BLOSUM90中的任意一种。
与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51的片段分别具有同源性的片段，当它们优选地与所述预定片段序列分别具有至少约60％的同源性时都落入本发明范围，例如至少65％同源性，例如至少70％同源性，例如至少75％同源性，例如至少80％同源性，例如至少85％同源性，例如至少90％同源性，例如至少92％同源性，例如至少94％同源性，例如至少95％同源性，例如至少96％同源性，例如至少97％同源性，例如至少98％同源性，例如至少99％同源性。根据本发明的一种实施方式，同源性百分比指同一性百分比。
US6,013,478中描述了另一种适合用于确定多肽片段的结构和功能关系的方法，将其在此引入作为参考。此外，分析氨基酸序列结合受体实体的方法也是所属领域的技术人员所知晓的。
除了在优选的预定SorCS1多肽或其片段的任意位置引入保守替代外，还可以在这种SorCS1多肽或其片段的任意一个或多个位置中引入非保守替代。
导致形成SorCS1多肽或其片段的功能等同物片段的非保守取代会例如i)极性显著不同，例如，带有非极性侧链的残基(Ala、Leu、Pro、Trp、Val、Ile、Leu、Phe或Met)替代带极性侧链的残基，如Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn或Gln，或带电荷氨基酸，如Asp、Glu、Arg或Lys；或者带电荷或者极性的残基替代非极性的残基；和/或ii)对多肽骨架定向的影响显著不同，例如Pro或Gly被另一种残基替代；和/或iii)电荷显著不同，例如，负电荷残基如Glu或Asp替代正电荷残基如Lys、His或Arg(反之亦然)；和/或iv)空间位阻显著不同，例如，大体积的残基如His、Trp、Phe或Tyr替代具有一种小侧链的残基如Ala、Gly或Ser(反之亦然)。
在一种优选实施方式中，基于疏水性和亲水性数值以及氨基酸侧链替代的相对相似度，包括电荷、大小等，通过氨基酸替代得到变体。考虑到上述不同特征的示范性氨基酸替代对本领域技术人员来说是已知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酸和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
除了此处描述的变体外，可形成空间相似的变体以模拟变体结构的关键部分，这种化合物也可以相同方式作为本发明的变体使用。这可以通过本领域技术人员知晓的模拟和化学设计的技术实现。可以理解的是，所有这些空间相似的结构都属于本发明的范围。
在另一种实施方式中，本发明涉及功能变体，该变体包含替代氨基酸，它的亲水性值或疏水性指数在它所取代的氨基酸值的+/-4.9以内，例如在+/-4.7以内，例如在+/-4.5以内，例如在+/-4.3以内，例如在+/-4.1以内，例如在+/-3.9以内，例如在+/-3.7以内，例如在+/-3.5以内，例如在+/-3.3以内，例如在+/-3.1以内，例如在+/-2.9以内，例如在+/-2.7以内，例如在+/-2.5以内，例如在+/-2.3以内，例如在+/-2.1以内，例如在+/-2.0以内，例如在+/-1.8以内，例如在+/-1.6以内，例如在+/-1.5以内，例如在+/-1.4以内，例如在+/-1.3以内，例如在+/-1.2以内，例如在+/-1.1以内，例如在+/-1.0以内，例如在+/-0.9以内，例如在+/-0.8以内，例如在+/-0.7以内，例如在+/-0.6以内，例如在+/-0.5以内，例如在+/-0.4以内，例如在+/-0.3以内，例如在+/-0.25以内，例如在+/-0.2以内。
亲水性和疏水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物功能方面的重要性在本领域是熟知的(Kyte & Doolittle，1982；Hopp，U.S.Pat.No.4,554,101，均引入本发明作为参考)。
本文使用的氨基酸疏水指数值为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)(Kyte &Doolittle，1982)。
本文使用的氨基酸亲水性值为：精氨酸(+3)；赖氨酸(+3)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酸(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)(U.S.4,554,101)。
除本文描述的肽基化合物以外，可形成空间相似的化合物，以模拟肽结构的关键部分，这种化合物也可以相同方式作为本发明的肽使用。这可以通过本领域技术人员知晓的模拟和化学设计的技术实现。例如酯化或者其他烷基化可以用于修饰例如双-精氨酸肽骨架的氨基酸末端，以模拟四肽结构。可以理解的是，所有这些空间相似的结构都属于本发明的范围。
N端烷基化和C端酯化的肽也包含在本发明内。功能等同物还包括糖基化和共价的或聚合的共轭物，它们由相同或其他的SorCS1多肽或其片段形成，包括二聚体或不相关的化学实体。这种功能等同物是通过本领域已知的方法，将功能团连接到包含N-端和C-端中任一个或两个的片段的基团中来制备。
因此，功能等同物可包括以下片段，该片段偶联脂肪族或芳香族酯或羧基末端的酰胺、烷基胺或含有羧基侧链的残基，例如偶联天冬氨酸残基的烷基胺；含羟基的残基的O-酰基衍生物以及氨基末端氨基酸的或包含氨基的残基的N-酰基衍生物，例如偶联fMet-Leu-Phe或免疫蛋白。酰基的衍生物选自烷基-实体(包括C3-C10正烷基)，从而形成链烷酰基类；以及碳环或杂环化合物，从而形成芳香烃酰基类。反应性基团优选为已知其本身用于将蛋白质通过反应性侧基交联到不溶性基质上的双功能性的化合物。
共价的或集合的功能等同物及其衍生物可作为试剂用于免疫分析或用于亲和纯化程序。例如，本发明的SorCS1多肽的片段可以是不溶解的，通过已知方法共价结合到溴化氰活化的琼脂糖上或者吸附到聚烯烃表面上，带有或者不带有戊二醛交联，用于分析或者纯化抗-SorCS1活性调节抗体或细胞表面受体。该片段也可以用可检测的基团进行标记，例如通过氯胺T程序进行放射性碘标记，共价地结合到稀土螯合物上或偶联到另一种荧光基团中，以便用于例如诊断分析。
优选的预定SorCS1多肽或其片段的突变可以通过进行氨基酸插入来实现，通常约为1至10个氨基酸残基的级别，优选1至5个氨基酸残基；或者通过缺失约1至10个残基，例如约2至5个残基来实现。
在一种实施方式中，结合位点1、2或3的配体是通过自动化合成而合成的寡肽。可以采用任意商业可得的固相技术，例如Merrifield固相合成法，其中氨基酸按顺序添加到增长的氨基酸链(参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2146，1963)。
多肽自动化合成设备可以从供应商商业获得，如Applied Biosystems Inc(Foster City，Calif)，通常可根据制造商的说明书进行操作。固相合成可以将所需的替代氨基酸加入到本发明SorCS1的任意片段中。可以理解的是，替代、缺失、插入或其任意亚组合可以相结合以获得最终序列的功能等同物。插入应该理解为包括氨基端和/或羧基端的融合，例如与疏水性或免疫原性蛋白或载体融合，例如所述载体为任意多肽或能够发挥载体作用的框架结构。
低聚体也在本发明中提供并属于本发明的范围，低聚体包括本发明分选蛋白抑制剂片段的二聚体，包括同型二聚体和异质二聚体。SorCS1多肽和片段及其功能等同物和变体可以与其他氨基酸序列或者与天然分选蛋白抑制剂序列生成为同型二聚体和异质二聚体。异质二聚体包括含有免疫反应活性的分选蛋白抑制片段和不需要具有或显示任何生物活性的分选蛋白抑制片段的二聚体。
SorCS1多肽或其片段和变体可以在体外和体内合成。体外合成的方法是众所周知的，适合或适于在体内合成分选蛋白抑制剂的方法也是现有技术中已有描述的。当体内合成时，宿主细胞用含有编码分选蛋白肽抑制剂或其片段的DNA的载体进行转化。载体定义为一种可复制的核酸结构。载体用于调节SorCS1多肽和/或片段或变体的表达。表达载体是可复制的DNA结构，其中可以在体内表达的编码预定分选蛋白抑制片段或其任意功能等同物的核酸序列可操作地与适宜的控制序列连接，该控制序列能够影响所述片段或等同物在适宜宿主内的表达。这种控制序列是本领域众所周知的。原核细胞和真核细胞都可以用于合成配体。
然而，源自多细胞生物体的细胞的培养物代表着优选的宿主细胞。原则上，任意较高级的真核细胞培养物都是可行的，无论是脊椎动物还是无脊椎动物培养物。有用的宿主细胞系的实施例是VERO和HeLa细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系和WI38、BHK、COS-7、293和MDCK细胞系。优选的宿主细胞是已经知晓的合成内源性分选蛋白抑制剂的真核细胞。这种宿主细胞的培养物可以被分离并用作片段的源，或者用于治疗的治疗性方法中，包括旨在促进或抑制生长状态的治疗性方法，或者用于在人或动物体上实施的诊断方法中。
疏水键：本文使用的术语“氢键”指引力或者键桥，其可以发生在与电负性原子如O、S或N共价结合的H原子与另一电负性原子之间。氢键可以发生在第一分子的H原子与第二分子的电负性原子之间(分子间氢键)。此外，氢键也可以发生在同一个分子内的H原子与电负性原子之间(分子内氢键)。
疏水相互作用：本文使用的术语“疏水相互作用”指于极性环境(例如水)中在位于相互吸引范围内的基本上为非极性(疏水)成分之间发生的任意相互作用。本文中，引力范围是0.1至2nm的范围。疏水相互作用的具体类型是通过“范德华力”，即非极性分子之间的引力来表示的，该引力通过量子力学解释。范德华力一般与瞬间偶极矩相关，它是由相邻的分子诱导产生并且涉及电荷分布方面的变化。
胰岛素：胰岛素是一种由胰腺的β细胞产生的激素。产生的胰岛素被释放至血液中，并转运到整个机体。胰岛素是一种重要的激素，它在机体内有许多作用。胰岛素的最大作用是针对碳水化合物(糖和淀粉)、脂质(脂肪)和蛋白的代谢(控制)。胰岛素在调节机体细胞包括它们的生长方面也具有重要作用。
胰岛素抵抗：胰岛素抵抗(IR)是机体细胞对胰岛素的作用具有抗性的一种状态，即对给定量的胰岛素的正常反应下降。因此，为了使胰岛素产生作用，需要更高水平的胰岛素。胰岛素抵抗早于2型糖尿病的产生，有时候早几年。在那些最终产生2型糖尿病的个体中，人们认为血糖和胰岛素水平多年来都正常；然后在某个时间点，产生了胰岛素抵抗。因此，对胰岛素抵抗成因的治疗优于对糖尿病症状的治疗。本发明主要目的在于提供一种治疗胰岛素抵抗的药物。
体外/体内：该术语按照它们通常的含义使用。
配体：一种物质、化合物或生物分子，例如蛋白，包括受体；它能够与(第二)生物分子结合并形成复合体以发挥生物用途。狭义上，配体是一种信号引发分子，通过分子间作用力如离子键、氢键或范德华力与目标蛋白的位点结合。对接(结合)通常是可逆的(解离)。配体与它的目标分子之间的实际不可逆的共价键合在生物系统内是很少见的。与金属有机和无机化学中的意义相反，在血红蛋白中，无论配体是否实际地结合在金属位点上都没有关系。与受体结合的配体可改变受体蛋白的化学构象，即受体蛋白的三维形状。受体蛋白的构象状态决定受体的功能状态。结合的趋势或者强度称为亲和力。配体包括底物、抑制剂、激活剂、非自身受体、共受体和神经传递素。
药剂：术语“药剂”或者“药品”或者“药物”指本发明具有治疗或预防用途的任意物质，该物质可以用于治疗(包括预防、诊断、缓解或者治愈)患者的弊病、痛苦、病症、疾病或伤害。治疗上有用的遗传决定簇、肽、多肽以及多核苷酸都属于术语药剂或药品的含义。根据该定义，“治疗剂”、“药剂”、或“药品”或者“药物”是一类生物活性物质。
药物组合物：或者药品、药物或者药剂指在适当地施予患者时，能够诱导所需的治疗效果的任意化学或生物物质、化合物或组分。某些药品以一种非活性的形式销售，其在体内转化成具有药理活性的代谢物。为此，术语“药剂组合物”和“药品”优选地包括本身活性物质、或者非活性药品和活性代谢物。
多肽：本文使用的术语“多肽”指包括至少两个氨基酸的分子。氨基酸可以是天然的或者合成的。本文的“寡肽”定义为长度不超过100个氨基酸的多肽。术语“多肽”也包括蛋白质，即包括至少一个多肽的功能生物分子；当包括至少两个多肽的时候，它们可以形成复合物，为共价连接或者非共价连接。蛋白质中的多肽可以是糖基化的和/或脂化的和/或包含辅基。
多核苷酸：本文使用的“多核苷酸”指包括至少两个核酸的分子。核酸可以是天然产生的或者经修饰的，例如锁核酸(LNA)或者肽核酸(PNA)。本文使用的多核苷酸通常属于：
i)包括预定编码序列的多核苷酸，或
ii)编码预定氨基酸序列的多核苷酸，或
iii)编码由(i)或(ii)的多核苷酸编码的多肽片段的多核苷酸，其中所述片段具有本文所述的至少一种预定活性；和
iv)一种多核苷酸，该多核苷酸的互补链在严格条件下与(i)、(ii)或(iii)中任一所述的多核苷酸杂交，并且编码具有本文所指出的至少一种预定活性的多肽或其片段，和
v)一种多核苷酸，其包括的核苷酸序列可降解为多核苷酸(iii)或(iv)的核苷酸序列；
或者这种多核苷酸的互补链。
前期糖尿病(prediabete)：前期糖尿病指正常和糖尿病葡萄糖稳态之间的中间代谢状态。它包括两个不同的阶段：受损的空腹葡萄糖(IFG)和受损的葡萄糖耐受(IGT)或者两者的结合，但是它本身并不是糖尿病。因此，这种情况下血糖水平比正常高，但是并没有高到可归类为2型糖尿病的水平。
纯化抗体：术语“纯化抗体”是这样的抗体，其重量的至少60％不含有与它天然相关的多肽及天然有机分子。优选地，制剂包括至少75％重量百分比的抗体，更优选至少90％重量百分比，最优选至少99％重量百分比。
均方根差：术语“均方根差”(RMSD)用于表示比较两组密切相关结构的均值，并且涉及比对中在结构上尽可能减小距离后，两个结构中相关原子之间的距离中的偏差。具有密切相关结构的相关蛋白的特征在于相对低的RMSD值，而较大的差别将导致RMSD值增加。
胰岛素受体的敏化：术语“胰岛素受体的敏化”用于解释本发明的药剂优选能够稳定胰岛素受体，并且还优选地增加胰岛素受体的数量。胰岛素受体的敏化可以通过施予本发明的药剂，然后进行葡萄糖耐受试验来测量，如图20所讨论。此外，敏化可通过评估施予本发明的药剂前后的胰岛素受体的量来评估，其中增加表明胰岛素受体敏化。此外，敏化可通过评估活化的胰岛素受体(即磷酸化胰岛素受体)的量来评估。此外，敏化也可通过测量胰岛素和胰岛素受体之间的亲和力来评估，因为亲和力增加是敏化的一种指示。
序列同一性：在一个实施方式中，序列同一性是通过用SorCS1多肽的片段来确定，该片段包括至少25个连续氨基酸并且氨基酸序列与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51的任意一个氨基酸序列分别具有至少80％，例如85％，例如90％，例如95％，例如99％同一性，其中同一性百分比是用威斯康星遗传学软件包7.0版中的GAP、BESTFIT或FASTA算法，用默认空位权重来确定。
以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸之间的序列关系：“预定序列”，“比较窗”，“序列同一性”，“序列同一性的百分比”和“基本同一性”。
用于比对比较窗的序列的最佳比对可通过Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源算法；通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源比对算法；通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444的相似方法的探究；通过这些算法(威斯康星遗传学软件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics ComputerGroup，575 Science Dr.，Madison，Wis.)的计算机化的实现；或者通过检查来进行；并且选择出通过不同算法产生的最佳比对(即在比较窗上产生同源性的最高比例)。
对于多肽，氨基酸序列同一性的程度是氨基酸序列共有的位点上相同氨基酸数目的函数。氨基酸序列同源性的程度或相似度是氨基酸序列共有的位点上(即结构相关的)氨基酸数目的函数。
“不相关的”或“非同源的”序列与本发明的SorCS1多肽序列享有小于40％的同一性，不过优选小于25％的同一性。术语“基本同一性”表示在例如通过GMP或BESTFIT程序利用默认空位权重进行最佳比对时，两个肽序列享有至少80％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性，更优选至少95％的序列同一性或者更高(例如99％的序列同一性)。优选地，不相同的残基位点的区别在于保守氨基酸替代。
保守氨基酸替代指具有相似侧链的残基相互替换。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组含有酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酸；一组具有芳香侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸替代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酸。
此外，变体也是基于如下所定义的保守氨基酸替代的预定数量来确定。本文使用的保守氨基酸替代涉及一个氨基酸(预定的氨基酸组)替代另一个氨基酸(属于相同组)，其中所述氨基酸显示出相似或基本相似的特性。
在本文所用的术语“保守氨基酸替代”的含义内，以下所示的氨基酸组内一种氨基酸可替代另一种：
i)具有极性侧链的氨基酸(Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr和Cys)
ii)具有非极性侧链的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro和Met)
iii)具有脂肪族侧链的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile)
iv)具有环状侧链的氨基酸(Phe、Tyr、Trp、His、Pro)
v)具有芳香族侧链的氨基酸(Phe、Tyr、Trp)
vi)具有酸性侧链的氨基酸(Asp、Glu)
vii)具有碱性侧链的氨基酸(Lys、Arg、His)
viii)具有酰胺侧链的氨基酸(Asn、Gln
ix)具有羟基侧链的氨基酸(Ser、Thr)
x)具有含硫侧链的氨基酸(Cys、Met)
xi)中性、弱疏水性氨基酸(Pro、Ala、Gly、Ser、Thr)
xii)亲水性、酸性氨基酸(Gln、Asn、Glu、Asp)，和
xiii)疏水性氨基酸(Leu、Ile、Val)
因此，本发明的变体或其片段可包括，在序列的相同变体或其片段内，或者在序列的不同变体或其片段之间，相互独立地引入的至少一个替代，例如多个替代。
从上述概述清楚可知，相同变体或其片段可包括来自上述一个以上的氨基酸组的一个以上的保守氨基酸替代。
增加或缺失至少一个氨基酸可以是优选地增加或缺失2至250个氨基酸，例如10至20个氨基酸，例如20至30个氨基酸，例如40至50个氨基酸。然而，增加或缺失50个以上氨基酸，例如增加50至100个氨基酸，增加100至150个氨基酸，增加150-250个氨基酸也包含在本发明的范围内。缺失和/或增加可以是-相互独立地-在序列内和/或在序列末端缺失和/或增加。
SorCS1样药剂：本文使用的表述“SorCS1样药剂”指能够结构上模拟Vps10p-域受体SorCS1，因此对胰岛素受体具有与本发明人在本文中所述作用相同或相似的生物作用的任意物质。因此，SorCS1样药剂可以是肽、多肽、有机小分子、siRNA、siDNA、编码多肽的核酸分子。在优选的实施方式中，SorCS1样药剂是SorCS1片段，优选为人可溶性SorCS1(SEQ ID NO：15)或其前体。
取代的低级烷基表示具有一至三个取代基的低级烷基，取代基选自羟基、烷氧基、氨基、酰胺、羰基、芳基、卤素、氰基、硝基和巯基。
治疗：本文使用的术语“治疗”指涉及治疗的方法，对包括人和动物体在内的个体的临床状况的外科诊疗。治疗可以是缓解、治愈或预防，即减低精神和行为的症状。
变体：本文使用的术语“变体”指氨基酸序列变体，所述变体优选地与任意的预定序列具有至少60％同一性，例如至少63％同一性，例如至少66％同一性，例如至少70％同一性，例如至少72％序列同一性，例如至少75％序列同一性，例如至少80％序列同一性，例如至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少91％序列同一性，例如至少92％序列同一性，例如至少93％序列同一性，例如至少94％序列同一性，例如至少95％序列同一性，例如至少96％序列同一性，例如至少97％序列同一性，例如至少98％序列同一性，例如至少99％序列同一性。
变体优选地包括例如图23B所示的与胰岛素受体结合的片段和/或例如图13所示的一种物种到另一物种保守的SorCS1序列的部分。
表达的上调：一种导致基因，优选地为内源性基因，表达增加的过程。
胰岛素抵抗
胰岛素抵抗(IR)是机体细胞对胰岛素的作用具有抗性的一种状态，即对给定量的胰岛素的正常反应下降。因此，为了使胰岛素产生作用，需要更高水平的胰岛素。抗性可见于机体自身的胰岛素(内源性)和通过注射施予的胰岛素(外源性)。
胰岛素抵抗可能有几种原因，正如前面所述有很强的基因因素。药物诱导的IR可能是另一个原因。此外，胰岛素抵抗常见于以下情况：代谢综合征、肥胖、妊娠、感染或严重疾病以及使用类固醇期间的应激。治疗这些情况下的胰岛素抵抗是本发明涉及的方面。
胰岛素抵抗和糖尿病之间的关系如下。2型糖尿病，是一种通常在生命后期出现的糖尿病类型。胰岛素抵抗早于2型糖尿病的产生，有时候早几年。在那些最终产生2型糖尿病的个体中，人们认为血糖和胰岛素水平多年来都正常；然后在某个时间点，很可能因超重/肥胖、身体不活动和/或一系列尚未明确界定的遗传多态性而产生胰岛素抵抗。因此，治疗胰岛素抵抗的原因优选地是治疗糖尿病的症状。本发明主要目的是提供一种治疗胰岛素抵抗的药物。
本领域技术人员熟知，胰岛素的作用之一是使机体细胞，尤其是肝实质细胞和其他肝细胞、肌肉和脂肪细胞，消除及耗用血液中的葡萄糖。以这种方式，胰岛素控制血糖水平。胰岛素通过与细胞表面上的胰岛素受体结合并且使葡萄糖进入细胞以用作细胞的能量来对细胞发挥上述作用。有了胰岛素抵抗，细胞基本不与胰岛素(它们有抗性)反应，并且一种需要产生更多胰岛素的信号被发送到胰腺，其随之导致血液中胰岛素水平升高，导致更强的信号通过胰岛素受体。以这种方式，细胞的胰岛素抵抗随时间增加。只要胰腺可以产生足够的胰岛素来克服这种抵抗，血糖水平就可保持正常。当胰腺不能再产生足够胰岛素时，血糖水平开始上升，最初是在饭后当葡萄糖水平处于它们的最高水平时需要更多胰岛素，但最终在禁食状态下也是如此。此时，胰岛素抵抗已经产生大量医学状况，包括2型糖尿病、脂肪肝、动脉硬化，其中后者反过来可能引起冠状动脉疾病(心绞痛和心脏病发作)、中风和外周血管疾病。与胰岛素抵抗相关的进一步医学状况，包括皮肤损伤、黑棘皮病(一种美容状况，包括有褶皱的部位如颈部和腋窝处的皮肤发黑)。与IR相关的进一步医学状况是皮垂、妇女生殖异常、多囊卵巢疾病、高雄激素血症、高雄性激素水平和生长异常。
胰岛素抵抗引起的生长异常是由高水平循环血液中可能存在的胰岛素而造成的。当胰岛素对葡萄糖代谢的作用受到损害时，它对其他机制的作用可能未受损害(或者至少损害较小)。胰岛素，是合成代谢性的，可以通过一种称作胰岛素样生长因子-1的药剂对生长产生影响。患者可能具有实际的线性生长和明显变粗的特征。上述皮垂的发生率的增长也可能是通过这种机制。
胰岛素刺激葡萄糖清除的能力在看似健康的人群中是不断变化的，对胰岛素最敏感和对胰岛素最抵抗的人之间存在≥600％的差异。这种可变性约50％可以归因于肥胖(25％)和体力(25％)，剩余50％可能是遗传起因。在对胰岛素最抵抗的人群中有三分之一面临更高的患有几种异常情况和临床综合征的风险，包括2型糖尿病、心血管疾病、高血压、中风、非酒精性脂肪肝、多囊卵巢疾病和某些形式的癌症。
胰岛素抵抗可以由内科医生诊断，医生可以根据详细的患者既往症、患者身体检查和利用风险因素的实验室测试，识别可能有胰岛素抵抗的个体。用于诊断IR的测试包括但不限于：血糖正常的胰岛素箝位和静脉容限测试。然而，这些是昂贵或复杂的，而且不是处理患者所必需的。
在通常的临床实践中，葡萄糖水平与空腹胰岛素水平可以就未患糖尿病的患者中是否存在胰岛素抵抗为医生提供一条线索。
糖尿病抵抗可以通过试图降低对胰岛素的需求，结合提高细胞对可增加的胰岛素作用的敏感性来治疗。
为了减小对胰岛素的需求，患有胰岛素抵抗的个体可以改变他/她的饮食，尤其是通过饮食所摄入的碳氢化合物。
如本文所述，本发明涉及用于敏化细胞(胰岛素受体)以增加胰岛素作用的方法。
在一个方面，本发明的药剂可用于治疗与胰岛素抵抗相关的疾病或紊乱，其中所述疾病和紊乱选自胰岛素抵抗综合征、2型糖尿病、葡萄糖耐受受损、代谢综合征、高血糖症、高胰岛素血症、动脉硬化、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高脂血症、血脂异常、肥胖、向心性肥胖、多囊卵巢综合征、血凝过快、高血压、微蛋白尿，以及它们的结合。
其他可通过本发明治疗的情况包括但不限于：胰岛素抵抗综合征(IRS)、2型糖尿病、葡萄糖耐受受损、代谢综合征、高血糖症、高胰岛素血症。
本发明的药剂
本发明人已经发现，SorCS1物理地与胰岛素受体相互作用(图11)，并通过细胞生物实验进一步显示，在稳定地过表达可溶性SorCS1或不同SorCS1剪接变体的细胞中，胰岛素受体的表达升高(图12)，而升高量的胰岛素受体仍然位于细胞表面(图13)。
此外，本发明人发现，可溶性SorCS1在SorCS1基因剔除小鼠中的过表达以及施予SorCS1减小了血浆葡萄糖水平(图17)，而增大了胰岛素受体以及葡萄糖转运体4型(Glut4)蛋白的表达和磷酸化(图18)。而且，2型糖尿病雌性小鼠中可溶性SorCS1的过表达降低了血浆葡萄糖和胰岛素水平(图19)并改变了Glut4的亚细胞定位，这可能由此调节葡萄糖摄取。
因此，在主要方面，本发明涉及治疗个体中胰岛素抵抗和/或与胰岛素抵抗相关的疾病的SorCS1样药剂，其中所述药剂能够与胰岛素受体(IR)在SorCS1结合位点结合，并且能够敏化胰岛素受体。胰岛素受体可以是任意胰岛素受体，但优选地胰岛素受体是具有SEQ ID NO：56序列的人胰岛素受体。
本发明人已经发现，SorCS1通过至少一个结合位点与胰岛素受体结合，并且一个或多个以下的SorCS1部分参与该结合：
SEQ ID NO：1氨基酸103-124
SEQ ID NO：1氨基酸125-143
SEQ ID NO：1氨基酸144-162
SEQ ID NO：1氨基酸197-218
SEQ ID NO：1氨基酸391-409
SEQ ID NO：1氨基酸661-684
SEQ ID NO：1氨基酸763-783
SEQ ID NO：1氨基酸859-876
因此，SorCS1药剂优选地与胰岛素受体上的结合位点结合，结合位点的特征在于一个或多个所示SorCS1片段与所述结合位点结合。
在优选实施方式中，胰岛素受体上的结合位点包括如下定义的一个或多个序列：
SEQ ID NO：56氨基酸100-120
SEQ ID NO：56氨基酸127-150
SEQ ID NO：56氨基酸284-310
SEQ ID NO：56氨基酸362-379
SEQ ID NO：56氨基酸593-610
SEQ ID NO：56氨基酸629-652
SEQ ID NO：56氨基酸749-772。
在一种优选实施方式中，本文如上定义的药剂选自：
a)分离的SorCS1多肽，选自：
i)SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51的氨基酸序列；
ii)a)的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与所述SEQ IDNO：1具有至少70％序列同一性；或者
iii)i或ii任一项的生物活性片段，其中所述片段包括a)至b)任一项中至少5个连续氨基酸，并且在至少5个氨基酸的重叠范围内与所述SEQ IDNO：1具有至少70％序列同一性，其中生物活性是敏化胰岛素受体，
或者它们药学上可接受的盐。
在一种实施方式中，多肽是选自如下序列的天然产生的等位基因变体：包括SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51，并且优选地，多肽包括选自如下的氨基酸序列：SEQ ID NO：5、10、15、21、27、33、37、39、43和47。
在另一种实施方式中，多肽是本文所述的变体多肽，其中将所选序列中指定的任意氨基酸改变以提供如上定义的保守替代。因此，多肽优选地与蛋白质的序列具有至少70％，例如75％，例如80％，例如85％，例如90％，例如95％，例如98％，例如99％序列同一性，所述蛋白质的序列选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51。
在一种实施方式中，多肽是糖基化的，例如多肽选自SEQ ID NO：1、2、3、4、6、7、8、9、11、12、13、14，其中所述多肽可以在一个或多个如下的氨基酸残基位点184、352、433、765、776、816、847、908和929上被糖基化，和/或其中多肽选自SEQ ID NO：16、17、18、19、20、22、26、28、29、30、31和32，其中所述多肽可以在一个或多个如下的氨基酸残基位点184、352、433、765、776、816、847、908和929上被糖基化，并且在另一种实施方式中，糖基化的片段的序列选自SEQ ID NO：5、10和15，或者糖基化多肽片段的序列选自SEQ ID NO：21、27和33。
然而，在一些实施方式中，优选多肽是去糖基化的。
SorCS-1样药剂可包括本文定义的多肽的可溶性片段，因此，在一种实施方式中，多肽是可溶性多肽，是选自如下序列的片段：SEQ ID NO：1、2、3、4、6、7、8、9、11、12、13、14，或者多肽是可溶性多肽，是权利要求15所述的序列的片段。
优选地，多肽能够形成至少一个分子内胱氨酸桥，更优选地，本文如上定义的多肽包括通过至少一个分子内胱氨酸桥连接的所述多肽的二聚体。
在一种实施方式中，本发明的多肽进一步包括亲和标签，如多聚组氨酸(poly-his)标签、GST标签、HA标签、Flag标签、C-myc标签、HSV标签、V5标签、麦芽糖结合蛋白标签、纤维素结合域标签。
核酸、载体和宿主细胞
一方面，本发明涉及能够编码本文如上定义的多肽的核酸序列，其中所述编码的多肽与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51的序列或其片段具有至少70％、例如75％、例如80％、例如85％、例如90％、例如95％、例如98％、例如99％的序列同一性。
另一方面，本发明涉及一种载体，所述载体包括本文如上定义的至少一种核酸分子，用于治疗个体中的胰岛素抵抗或者与胰岛素抵抗相关的疾病。
本发明的载体可以进一步包含一种启动子，该启动子可有效地与本发明的核酸分子连接。
该启动子可以是但不限于：CMV、人UbiC、RSV、Tet可调控启动子、Mo-MLV-LTR、Mx1、EF-1α、PDGFβ和CaMKII。
本发明的载体可选自源自逆转录病毒科(Retroviridae)家族的载体，包括慢病毒、HIV、SIV、FIV、EAIV、CIV。
本发明的其他载体选自甲病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、HSV、冠状病毒、牛乳头状瘤病毒、Mo-MLV，优选腺相关病毒。
在另一种优选实施方式中，本发明还涉及一种包括如上所述核酸的宿主细胞，本发明更优选的是一种以如上定义的至少一种载体转化或者转导的分离宿主细胞，用于治疗个体中胰岛素抵抗或者胰岛素抵抗相关的疾病。
分离的宿主可选自：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大肠杆菌(E.coli)、曲霉(Aspergillus)和Sf9昆虫细胞以及哺乳动物细胞，哺乳动物选自人、猫、猪、猴、狗、小鼠和大鼠，其中哺乳动物细胞可选自但不限于肌肉细胞、肝细胞、脂肪细胞以及胰腺细胞，如α细胞、β细胞和γ细胞。
在一种实施方式中，分离的宿主细胞选自CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b和BHK细胞。
在另一方面，本发明涉及如上定义的包装细胞系，其中所述包装细胞系能够产生感染性病毒颗粒，用于治疗个体中胰岛素抵抗或者与胰岛素抵抗相关的疾病，所述病毒颗粒包括源自逆转录病毒科的基因组，包括5’逆转录病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、有效地与编码如上所述多肽的多核苷序列连接的启动子、第二链DNA合成的起点、以及3’逆转录病毒LTR。
在一种实施方式中，包装细胞系的基因组源自慢病毒并且LTR是慢病毒。
如上所讨论，SorCS1样药剂是具有与胰岛素受体相关的SorCS1生物活性的任意一种药剂，即能够与胰岛素受体结合的药剂，更优选地，该药剂还能够敏化胰岛素受体，由此可以降低通过治疗胰岛素抵抗和与胰岛素抵抗相关的疾病而施予SorCS1样药剂的个体中的血糖浓度。该药剂可以是任意类型的化合物，例如多肽、抗体以及有机小分子，其中所述抗体选自抗胰岛素受体的多克隆抗体、单克隆抗体、人源抗体、单链抗体、重组抗体。
而且，如本文所讨论，施予裸露的核酸或者在宿主细胞或包装细胞中的核酸，其中核酸能够编码本文所讨论的多肽，用于治疗胰岛素抵抗和与胰岛素抵抗相关的疾病，也是本发明涉及的一个方面。
抗体
如上所述，本发明的药剂可以是抗体，尤其是抗胰岛素受体的抗体，或者更优选抗图23A所示的位于胰岛素受体上的一个或多个结合位点的抗体。
抗体也可以进一步用作筛选本发明的不同方面的研究工具。这样的方法对于所属领域的技术人员是熟知的，但是下文仍然进一步详细描述。用作研究工具的抗体是同时抗胰岛素受体和抗Vps10p-域受体(包括SorCS1)的抗体。
本发明的一个方面是提供抗体或者其功能等同物，它们特异性识别和结合Vps10p-域受体和胰岛素受体的表位。
所述抗体或其功能等同物可以是本领域已知的任意抗体，例如源自哺乳动物的多肽或单克隆抗体，或者合成抗体，例如单链抗体或包括抗体片段的水合物。此外，抗体可以是单克隆抗体或人工多克隆抗体的混合物。另外，抗体的功能等同物可以是抗体片段，尤其是表位结合片段。此外，抗体或者其功能等同物可以是模拟抗体的小分子。天然产生的抗体是由重链和轻链组成的免疫球蛋白分子。本发明优选的实施方式中，抗体是单克隆抗体。
本发明的抗体还可以是重组抗体。重组抗体是采用重组技术生产的抗体或其片段或其功能等同物。例如，重组抗体可采用合成库或者通过噬菌体显示技术来生产。重组抗体可根据任意常规的方法生产，例如Frank Breitling，StefanDübel，Jossey-Bass，September 1999“Recombinant Antibodies”中描述的方法。
本发明的抗体也可以是双特异性抗体，即特异性地识别两个不同表位的抗体。双特异性抗体一般可以由单克隆抗体，或者由重组抗体制备，例如通过化学交联或者采用重组技术，将两个杂交瘤融合，以便结合它们的特异性。本发明的抗体也可以是三特异性抗体。
在优选的实施方式中，抗体的功能等同物可以是抗体片段，优选抗原结合片段或者可变区。可用于本发明的抗体片段的实施例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。木瓜蛋白酶消化抗体产生两种相同的抗原结合片段，称作Fab片段，各自带有单一的抗原结合位点；以及残基“Fc”片段，其命名是由于它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab′)2片段，该片段具有能够交联抗原的两个抗原结合片段，以及一个残余的其他片段(称为pFc’)。另外的片段包括双体、线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性抗体。本文使用的与抗体相关的“功能片段”指Fv、F(ab)和F(ab′)2片段。
优选的抗体片段保留了抗体的某些或必需的所有能力，以选择性地结合其抗原或者受体。一些优选的片段定义如下：
(1)Fab是包括抗体分子的单价抗原结合片段的片段。Fab片段可以用酶木瓜蛋白酶通过消化整个抗体来生产，从而产生完整的轻链以及一部分重链。
(2)Fab’是抗体分子的片段，可以通过用木瓜蛋白酶处理整个抗体然后还原而获得，以产生完整的轻链和一部分重链。每个抗体分子可以获得两个Fab’片段。Fab′片段与Fab片段不同在于重链CH1域的羧基端添加了几个残基，包括一个或多个源自抗体铰链区的半胱氨酸。
(3)F(ab’)2是一种抗体片段，它可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体、不经后续还原而获得。F(ab’)2是2个Fab’片段通过两个双硫键联合在一起的二聚体。
(4)Fv是最小的抗体片段，它包含完整的抗原识别和结合位点。该区域包括一个重链和一个轻链可变区域以紧密的、非共价结合(VH-VL二聚体)形成的二聚体。在这种结构下，每一可变域的三个CDR相互作用以限定位于VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总体上，6个CDR赋予抗原对抗体的结合特异性。然而，即使单个可变域(或者Fv的一半，仅包括3个对抗原有特异性的CDR)也具有识别和结合抗原的能力，尽管与整个结合位点相比，亲和力较低。
本发明的一种实施方式中，抗体是单链抗体(“SCA”)，定义为一种基因工程分子，其包含轻链的可变区，重链可变区，它们通过适宜的多肽连接头连接为基因融合单链分子。这种单链抗体也指“单链”Fv或者“scFv”抗体片段。一般来说，Fv多肽进一步包括介于VH和VL域之间的多肽连接头，它能够使scFv形成所需的与抗原结合的结构。
制备抗体的程序
抗特异性抗原或者抗原表位的多克隆和单克隆抗体，可以根据标准方法制备(例如参见Antibodies-A laboratory Manual by Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory 1998，ISBN 0-87969-314-2)。随后生成人源化抗体或其片段的方法也已有描述(例如A.M.Scott et al，Cancer Research60：3254-3261，2000；A.Nissim and Y.Chernajovsky，Handb.Exp.Pharmacol.181：3-18，2008；A.Mountain and J.R.Adair，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.10：1-142，1992)。
人源化抗体结构
将非人抗体用于人类治疗并不总是可取的，因为非人“外来”表位可能消除被治疗的个体的免疫反应。为消除或者减少与非人抗体相关的问题，可取的是构造嵌合抗体衍生物，即“人源化”抗体分子，它将非人Fab可变区决定簇与人恒定区(Fc)相结合。这种抗体的特征是具有上述单克隆和多克隆抗体同等的抗原特异性和亲和力，并且在施予人类时有较小的免疫原性，因此更可能被待治疗的个体耐受。
因此，在一种实施方式中，结合多肽具有位于人源化抗体框架上的结合域，也称作人源化抗体。
人抗体
本发明的人单克隆抗体可以通过各种技术制备，包括常规的单克隆抗体方法学，如Kohler和Milstein的标准体细胞杂交技术，Nature 256：495(1975)。尽管体细胞杂交方法是优选的，但原则上也可以采用其他用于制备单克隆抗体的技术，如B淋巴细胞的病毒或致癌基因转化，或者采用人抗体基因库的噬菌体展示技术。
为了本发明产生目标表位的全人单克隆抗体，可以将包含人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体小鼠(如HCo12、HCo7或KM小鼠)用富集抗原的制剂和/或表达本发明受体靶位表位的细胞进行免疫，如上所述，例如，通过Lonberg et al.(1994)，上文；Fishwild et al.(1996)，上文和WO 98/24884。或者，可以将小鼠用编码CaOU-1表位的DNA免疫。优选地，小鼠在第一次注射时为6-16周龄。
单价抗体
单特异性结合多肽可以是单价的，即仅具有一个结合域。
对于单价抗体，免疫球蛋白恒定区氨基酸残基序列包括本领域已知的抗体分子的结构部分，如CH1、CH2、CH3和CH4。优选的是本领域已知的那些结合多肽CL，优选的CL多肽选自Cκ和Cλ。
此外，目前恒定域可以是重链或轻链恒定域(分别是CH或CL)，各种单价结合多肽组合物也是本发明所考虑的。例如，轻链恒定域能够通过二硫化桥接到另一个轻链恒定域或者重链恒定域。相比之下，重链恒定域可以形成两个独立的二硫化桥，使得可以同时桥接到另一重链或轻链、或者形成重链的多聚体。
因此，在另一种实施方式中，本发明涉及一种分离的单价结合多肽，其中恒定链域C具有能形成至少一个双硫桥的半胱氨酸残基，并且至少两个单价多肽通过所述双硫桥共价连接。
在优选的实施方式中，恒定链区C可以是CL或CH，其中C为CL，则CL多肽优选地选自Cκ和Cλ。
在另一种实施方式中，本发明涉及一种包括上述单价多肽的结合多肽组合物，只是C为CL，其具有能形成双硫桥的半胱氨酸残基，使得该组合物包括通过所述双硫桥共价连接的两个单价多肽。
多特异性，包括双特异性
在优选的实施方式中，本发明涉及多特异性结合多肽，其具有亲和力并能够结合至少两个不同的实体。多特异性结合多肽可以包括双特异性结合多肽。
在一种实施方式中，多特异性分子为双特异性抗体(BsAb)，其携带至少两个不同的结合域，优选地，其中至少一个是抗体源。
本发明的双特异性分子也可以是单链特异性分子，例如单链双特异性抗体，包括一个单链抗体和结合域的单链双特异性分子，或者包括两个结合域的单链双特异性分子。多特异性分子也可以是单链分子或者可包括至少两个单链分子。
多特异性(包括双特异性)抗体可以通过本领域技术人员知晓的任意适合方式制备。
生产双特异性完整抗体的传统方法是将两个杂交瘤细胞系相融合，每一个产生一种具有所需特异性的抗体。由于免疫球蛋白重链和轻链随机关联，这些杂交-杂交瘤产生多达10种不同重链和轻链结合而成的混合物，其中仅有一种是双特异性抗体。因此，这些双特异性抗体必须以繁琐的程序进行纯化，这明显降低了所需产品的收率。
与单特异性/单价结合多肽相比，使用本发明的双特异性或多特异性结合多肽具有几个优点。
尽管人单克隆抗体是优选的，但本发明的双特异性或多特异性分子中也可以使用其他抗体：鼠源嵌合和人源化单克隆抗体。这种鼠源嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的方法制备。
本申请的发明人已经提出抗Vps10p-域受体几个部分的抗体。本发明涉及针对受体家族的统一特征-Vps10p域的抗体。以下的Vps10p-域的序列比对证实了属于该受体家族范围内的保守性。
表1：抗Vps10p-域受体的抗体
Figure BPA00001511266300361
Figure BPA00001511266300371
抗体的成功临床应用
许多治疗抗体都用于临床。实施例包括Genentech公司的Rituxan，一种抗CD20受体的抗体(用于类风湿关节炎)，Johnson&Johnson公司的Remicade，一种抗TNFα受体的抗体(用于牛皮癣)，Roch公司的Avastin，一种抗-VEGF抗体，用于治疗结直肠癌和肺癌，以及Herceptin，一种抗受体HRE2的抗体，用于治疗乳腺癌。
对结合受体进行评估是生物技术领域中技术人员的常规工作。在这一方面应提及的是，Vps10p-域受体家族与涉及的结合分析在本发明的优先权日时是已知的。
在一种实施方式中，本发明的药剂是抗-胰岛素受体多克隆或单克隆抗体。
转基因SorCS1小鼠
本发明人发现SorCS1在脂肪组织、骨骼肌和胰腺的β-细胞；所有涉及糖代谢的组织中表达(图3)。为了考察SorCS1以及它的不同剪接变体的作用，本发明人采用一种新开发的基于FLP重组的靶向战略和称为“重组酶-介导的盒式交换”的插入技术，产生了条件性基因剔除小鼠。这种模式用于产生缺乏所有SorCS1剪接形式的“全”基因剔除小鼠，因此所有剪接变体的表达都被中断(图4)。缺乏所有剪接变体的SorCS1小鼠(“全”剔除)没有显示出总体的异常或者行为变化的迹象，它们富有生机并且它们表现出正常的生命周期(未公开)。然而，糖代谢和产生2型糖尿病是SorCS1基因剔除小鼠表型特征，初步结果支持受体在2型糖尿病产生中的重要作用。17和50周龄的禁食雄性小鼠的血糖水平与对照的同窝出生的小鼠相似，然而与年龄相当的对照小鼠相比，50周龄的雌性小鼠显示出血糖水平显著增高(图5)。然而，两种性别在50周龄时均显示出胰岛素水平增高(图6，仅雌性)。与此一致，通过免疫着色测定β-细胞标记，它们的胰岛扩大到3倍(图15)。这些结果表明，老的SorCS1基因剔除雄性小鼠为高胰岛素，但是是前期糖尿病，而老的SorCS1基因剔除雌性小鼠是高血糖和高胰岛素，从而变成糖尿病。
此外，本发明人也发现雄性和雌性SorCS1基因剔除小鼠均具有正常体重。基因剔除小鼠中未出现肥胖可能使肥胖对前期糖尿病或糖尿病显型的影响相脱离，这使得几种现有糖尿病动物模型的分析变得复杂。然而，因为肥胖是2型糖尿病的重要风险因素，SorCS1缺失的动物也喂以高热量的西方型饮食，以研究肥胖对疾病进展的影响。生理测量表明，与正常饮食的野生型小鼠相比，高热量饮食的野生型小鼠的血浆葡萄糖、胰岛素水平和腹部脂肪都增加(图8+9)。相反，与正常饮食的小鼠相比，西方类型饮食的SorCS1基因剔除小鼠没有显示出显著的变化，因此没有显示出糖尿病状态的加深。与野生型小鼠相比，西方饮食的基因剔除小鼠腹部脂肪量较低，证实基因剔除小鼠有胰岛素抵抗，因为它导致脂肪组织中的葡萄糖摄取降低，因此腹部脂肪产生较少。
因此，本发明人显示，SorCS1基因剔除小鼠是唯一的用于研究胰岛素抵抗和与胰岛素抵抗尤其是糖尿病相关的疾病的动物模型，因为SorCS1基因剔除小鼠产生了通常与胰岛素抵抗和糖尿病相关的症状，包括糖尿病的后期症状，如神经性症状。
此外，本发明人还显示，50周龄的雄性和雌性SorCS1-/-小鼠与年龄相当的对照相比，表现出提高的磷酸化IR水平(图10)，表明SorCS1可以在外周组织中参与胰岛素信号传导。或者，在胰岛素信号通路上转化的源自SorCS1的信号可能消失，从而导致磷酸化IR的代偿性上调。因为SorCS1也参与细胞分选，受体也可调节IR的亚细胞分布。
因此，本发明的一个重要方面涉及转基因的基因剔除小鼠，其中内源性Vps10p-域受体SorCS1基因被打断以消除功能性SorCS1受体的表达，并且其中所述小鼠相对于非转基因对照小鼠显示出对胰岛素的反应降低。
在另一种实施方式中，本发明涉及如上定义的转基因小鼠，其中所述打断包括编码起始密码子的SorCS1受体基因核苷酸序列，或者细胞外域、跨膜域或细胞质域的小鼠SorCS1受体区域的缺失。
一方面，本发明涉及一种在激活表达时，能够以组织特异性方式编码可溶性和/或全长SorCS1的转基因小鼠。实施例12中描述了制备所述小鼠的程序。具体激活的组织可以选自但不限于：肝脏、肌肉、胰腺和脂肪组织。
筛选本发明的药剂的方法
本发明提供了特定目标和用于进一步筛选和评估包括SorCS1肽和多肽片段及其突变体和变种在内的候选药剂的方法。
尽管为某种生理活性而筛选大量的肽可能是一项繁重的工作，但本文对待实施的分析方法的完整披露使技术人员能够重复本发明，而不需要进行不必要的额外试验，也不需要创造性技巧。
为此，候选药剂的筛选库可以容易地在市场上购买可得。无论所述库是肽库还是化学库对本发明都没有任何影响，因为筛选化学库也是常规的工作。事实上，化学库的筛选是商业公司提供的服务，从它们的公开物(例如见http://www.analyticon.com/)可以清楚看出它们不认为这种筛选工作具有发明性。
最初，在筛选SorCS1样药剂的过程中，进行本文所讨论的结合研究也是很重要的，尤其是联系附图和实施例以证实所述药剂与胰岛素受体的结合。此外，表明药剂实际上可以敏化胰岛素受体也是很重要的。如上所讨论，可以间接通过以下来完成，例如通过进行葡萄糖耐受试验(GTT)显示出施予SorCS1样药剂实际上降低了血糖浓度，并且优选地，还显示出初始增加的胰岛素浓度被降低。此外，胰岛素受体的敏化也可以通过测量胰岛素受体的量来衡量，因为施予可溶性SorCS1导致胰岛素受体增加。
因此，在一种实施方式中，本发明涉及一种筛选如上定义SorCS1样药剂降低血糖水平的能力的方法，所述方法包括步骤：
a)提供权利要求69的第一和第二转基因小鼠；
b)向所述第一转基因小鼠施予候选药剂，和
c)向所述第二转基因小鼠施予生理溶液，和
d)施予所述药剂后，在预定的时间间隔，例如15分钟、30分钟、60分钟、2和4小时，分别采取小鼠b)和c)的血液样品，和
e)比较d)样品中的血浆葡萄糖水平；其中施予所述候选药剂的所述第一转基因小鼠的血糖水平相对于未施予所述候选药剂的所述第二转基因小鼠降低，表明所述候选药剂降低了血糖水平。
在另一种实施方式中，本发明涉及一种筛选本发明的SorCS1样药剂降低血糖水平的能力的方法，所述方法包括步骤：
a)提供第一和第二野生型小鼠；和
f)向所述第一小鼠施予权利要求1所述的药剂，和
g)向所述第二小鼠施予生理溶液，和
h)施予所述药剂后，在预定的时间间隔，如15分钟、30分钟、60分钟、2和4小时，分别采取小鼠b)和c)的血液样品，和
e)比较d)样品中的血浆葡萄糖水平；其中施予所述候选药剂的所述第一野生型小鼠的血糖水平相对于未施予所述候选药剂的所述第二野生型小鼠降低，表明所述候选药剂降低了血糖水平。
药物组合物和给药形式
本发明也包括包含本文定义的药剂的药物组合物。本发明全文中，在讨论药物组合物时，术语药剂和化合物视为同义。
本发明的药物传输的主要途径是经肠外、经口或经肠，和局部施用，以便将药剂引导至血流中以最终指向胰岛素受体的位点。
所述药剂经给药可以穿过被施予生物活性物质的动物的任意粘膜，例如鼻、阴道、眼睛、口、生殖道、肺、胃肠道或直肠，优选鼻或口的粘膜。
所述药剂可以口服或者经肠给药。
本发明的化合物也可以是非肠道给药，即通过静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻内、直肠内、叶鞘内或腹腔内给药。一般优选的是皮下注射或者肌肉注射的非肠道给药形式。这种给药的适宜剂型可以通过常规的技术制备。所述化合物也可以通过吸入给药，其可以通过鼻内和口内吸入给药。这种给药的适宜剂型，例如气雾剂制剂或计量吸入器可以通过常规的技术制备。
本发明的化合物可以与至少一种其他化合物(如胰岛素)一并给药。所述化合物可以同时给药，可以是单独的处方或者结合在一单位剂型中，或者依次给药。
本发明的一种实施方式中，以上定义的药物组合物活性成分的剂量介于每公斤体重10μg至500mg之间，例如20μg和400mg之间，例如30μg和300mg之间，例如40μg和200mg之间，例如50μg和100mg之间，例如60μg和90μg之间，例如70μg和80μg之间。
此外，所述剂量可以作为丸剂给药或者连续给药。对于丸剂给药，药物组合物可以按30分钟至24小时的间隔给药，如1至6小时的间隔。当连续给药时，通常按6小时至7天的时间间隔给药。然而，通常剂量是按丸剂每天1-3次给药。
本发明的一个重要方面，治疗的持续期是终生。
制剂
本发明的化合物或其盐可作为原料给药，优选将其制成药物制剂的形式。因此，本发明进一步提供一种药用的药物制剂，包括本文限定的本发明的一种化合物，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
本发明的药剂可以配制成多种不同的剂型，适于如上讨论的各种给药形式。
所述药物组合物和剂型可包括本发明的药剂或者其药学上可接受的盐或其晶形作为活性成分。
此外，所述药物组合物可包括药学上可接受的固体或液体形式的载体。
固体形式的制剂一般提供为口服或者肠内给药，如粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和分散颗粒。固体载体可以是一种或多种物质，也可作为稀释剂、芳香剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、防腐剂、润湿剂、片剂崩解剂或者灌封材料。
优选地，所述组合物包括按重量计约0.5％至75％的本发明化合物，剩余的由适宜的药物赋形剂组成。对于口服给药，那些赋形剂包括药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。
在粉剂中，载体是磨碎的固体，是一种带有磨碎的活性成分的混合物。在片剂中，活性成分与载体混合，在适宜的比例下具有必要的结合能力，并且被压制成所需的形状和大小。粉剂和片剂优选地包含1％至约70％的活性成分。适宜的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可油等。术语“制剂”指包括活性化合物与作为载体的灌封材料的制剂制成胶囊，其中活性化合物，带有或不带有载体，被与之相关的载体包围。类似地，包括扁囊剂和锭剂。片剂、粉剂、胶囊、丸剂、扁囊剂和锭剂可以作为适于口服给药的固体药剂。
本发明的滴剂可以包括无菌或非无菌溶液或者油溶液或者悬浮液，可通过将活性成分溶解在适宜的水溶液中制备，可选地包括杀菌和/或杀真菌剂和/或任意其他适宜的防腐剂，并且可选地包括表面活性剂。所得溶液再经过过滤使澄清，转移至适宜的容器中，容器再经过密封并通过高压灭菌或在98-100℃保持半小时进行灭菌。或者，所述溶液可通过过滤并转移至无菌容器中进行灭菌。适于包含在滴剂中的杀菌或杀真菌剂的实施例为苯汞硝酸盐或醋酸盐(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和苯扎氯铵(0.01％)。用于制备油性溶液的适宜溶剂包括甘油、稀释酒精和丙二醇。
还包括在临用前转化成口服给药的液体形式制剂的固体形式制剂。所述液体形式包括溶液、悬浮液和乳剂。这些制剂除了活性成分外可以包含着色剂、香料、稳定剂、缓冲剂、人造和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
适于口服给药的其他剂型包括液体形式制剂，包括乳剂、糖浆、酏剂、水溶液、水悬浮液、膏剂、凝胶膏、咀嚼胶；或者在临用前转化成液体形式制剂的固体形式制剂。乳剂可以在丙二醇水溶液的溶液中制备，或者可含有乳化剂，如卵磷脂、山梨醇酐单油酸酯、阿拉伯树胶。水溶液可以通过将活性成分溶解于水中，并添加适宜的着色剂、香料、稳定剂和增稠剂来制备。水悬浮液可以通过将磨碎的活性成分分散在含有粘性材料的水中来制备，粘性材料为例如天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其他熟知的助悬剂。固体形式制剂包括溶液、悬浮液和乳剂，并且除了活性成分外可以包含着色剂、香料、稳定剂、缓冲剂、人造和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
本发明的化合物可以配制成非肠道给药(如通过注射，例如快速注射或连续输注)，并且可以设置为单位剂量形式，其存在于安瓿瓶、预填充注射器、小容量注射器或者多剂量容器中，并带有添加的防腐剂。该组合物可采用诸如油性或水性媒介中的悬浮液、溶液或乳剂，例如在水性聚乙二醇中的溶液。油性或非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介的实施例包括丙烯醇、聚乙烯醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)，并且可包含处方剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂或悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，通过无菌隔离灭菌固体或从溶剂组成中通过冷冻干燥获得，临用前溶于适宜的媒介，例如无菌，无热原的水。
用于非肠道制剂的油包括凡士林、动物油、植物油或合成油。用于这种制剂中的油的具体实施例包括花生、大豆、芝麻、棉籽、玉米、橄榄、凡士林和矿物油。用于非肠道制剂的适宜脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是适宜的脂肪酸酯的例子。
用于非肠道制剂的适宜的皂包括脂肪碱金属、铵盐和三乙醇胺盐，并且适宜的洗涤剂包括(a)阳离子洗涤剂，例如二甲基二烷基铵盐卤化物，和烷基吡啶盐卤化物；(b)阴离子洗涤剂，例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐，烷基、烯烃、醚和单甘油酯硫酸盐以及磺化琥珀酸盐；(c)非离子型洗涤剂，例如脂肪胺氧化物，脂肪酸烷醇酰胺，和聚氧乙烯聚丙烯共聚物；(d)两性洗涤剂，例如氨基-β-氨基丙酸酯，和2-烷基-咪唑啉季铵盐，和(e)它们的混合物。
非肠道制剂典型地包含溶液中约0.5％至约25％重量的活性成分。可以使用防腐剂和缓冲剂。为减小或消除注射位置处的刺激，这种组合物可以包含一种或多种具有亲水-亲油平衡(HLB)为约12至约17的非离子型表面活性剂。这种制剂中表面活性剂的量典型地为约5％至约15％重量。适宜的表面活性剂包括聚乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，例如失水山梨醇单油酯以及环氧乙烷与疏水性基质的高分子量添加剂，其通过氧化丙烯与丙二醇缩合而成。非肠道制剂可以以单剂量或多剂量密封容器的形式存在，如安瓿瓶和药水瓶，并且可以储存在冷冻干燥的条件，临用前仅需要添加无菌液体赋形剂，例如水，以便注射。临时的注射溶液和悬浮液可以由先前描述的无菌粉、颗粒和片剂来制备。
本发明的化合物也可以局部地经皮肤或者跨膜给药。局部给药的区域包括皮肤表面，也包括阴道、直肠、鼻、口和喉的粘膜组织。经皮肤和粘膜局部给药的组合物不应出现刺激现象，例如红肿或发红。跨膜给药典型地包括将药物经皮通道的药剂传输至患者的体循环中。皮肤位点包括跨膜给药的解剖区域，包括前臂、腹部、胸部、背部、臀部、乳突部位等。
局部的组合物可包括适于局部给药的药学上可接受的载体。因此，例如组合物的形式可以是悬浮液、溶液、软膏、洗液、性交润滑剂、霜剂、泡沫剂、气雾剂、喷剂、栓剂、植入剂、吸入剂、片剂，例如舌下片、胶囊、干粉、糖浆、药膏或锭剂。制备这种组合物的方法是制药行业所熟知的。
本发明的化合物可以配制成软膏、霜剂或洗液，或者贴剂，用于局部表皮给药。例如，软膏和霜剂可以用水性或油性基质添加适宜的增稠剂和/或胶凝剂配制而成。洗液可以用水性或油性基质制成，并且一般还包含一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、助悬剂、增稠剂或着色剂。适于口内局部给药的制剂包括锭剂，包含的活性成分位于香料基质中，一般是蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶；药片，包含的活性成分位于惰性基质中，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶；以及漱口剂，包含的活性成分位于适宜的液体载体中。
本发明的霜剂、软膏或糊剂是外用的活性成分的半-固体制剂。它们可以通过借助于适宜的器械，将磨碎的或粉末形式的活性成分，单独地或者在水性或非水性液体的溶液或悬浮液中，与油腻或不油腻的基质混合而制成。所述基质可包括碳氢化合物，例如硬、软或液体的石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂；粘液；天然来源的油，如杏仁、玉米、花生、蓖麻或橄榄油；羊毛脂或它的衍生物，或脂肪酸，如硬脂酸、油酸，以及醇，如丙二醇或大粒凝胶。该制剂可包括任意适宜的表面活性剂，例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂，例如失水山梨醇酯或其聚氧乙烯衍生物。也可以包括助悬剂，例如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料，如二氧化硅(silicaceous silicas)，以及其他成分，如羊毛脂。
本发明的洗液包括适用于皮肤或眼睛的洗液。眼用洗液可包括无菌水溶液，可选地包含杀菌剂，并且可通过制备滴剂的相似方法来制备。用于皮肤的洗液或擦剂也可包括加快干燥并冷却皮肤的成分，如酒精或丙酮，和/或保湿剂，如甘油或油，如蓖麻油或花生油。
透皮传输可通过将复合物源暴露于患者的皮肤上一段时间来完成。透皮贴剂具有另外的优势，它提供了将药剂-化学改性剂复合物可控地传输至机体。参见Transdermal Drug Delivery：Developmental Issues and Research Initiatives，Hadgraft and Guy(eds.)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；Controlled Drug Delivery：Fundamentals and Applications，Robinson and Lee(eds.)，Marcel Dekker Inc.，(1987)；以及Transdermal Delivery of Drugs，Vols.1-3，Kydonieus and Berner(eds.)，CRC Press，(1987)。这种剂型可以通过将药剂-化学改性剂复合物溶解、分散或以其他方式加入到适宜的介质中，如弹性基质材料。吸收增强剂也可以用于增加化合物透皮的流动。这种流动的速率可以通过设置一种速率控制膜或者将该化合物分散在聚合物基质或凝胶中来进行控制。
例如，简单的粘性贴剂可以由背衬材料和丙烯酸酯粘合剂来制备。药剂-化学改性剂复合物和任意增强剂可以配制成粘性的铸膜液，并使其充分混合。该溶液直接浇铸在背衬材料上，并且浇铸溶剂在干燥炉中蒸发，留下粘性膜。贴上防粘衬里就完成了该系统。
泡沫基质贴剂在设计和成分上与储液系统相似，不同的是胶凝的药剂-化学改性剂溶液保存在厚的泡沫层内，典型的是聚氨酯。这种泡沫层位于背衬和膜之间，背衬和膜已经在贴剂的外周被热封。
针对被动传输系统，释放速率典型地是通过置于储层与皮肤之间的膜来控制，通过从单片装置扩散，或者通过在给药系统中以皮肤本身作为速率控制屏障。参见美国专利No.4,816,258；4,927,408；4,904,475；4,588,580和4,788,062等。药物传输的速率在一定程度上依赖于膜的性质。例如，机体内的药物跨膜传输速率一般高于跨真皮屏障。复合物从装置传输至膜的速率很大程度上通过采用位于储备与皮肤之间的速率限制膜来有利地控制。假定皮肤对于复合物而言是可充分渗透的(即通过皮肤的吸收大于通过膜的速率)，所述膜将发挥作用控制患者的加药率。
适宜的可渗透膜材料可以根据所需的渗透性程度、复合物的性质以及与构建该装置相关的机械考量来选择。示范性的可渗透膜材料包括多种天然和合成聚合物，例如聚二甲基硅氧烷(硅酮橡胶)、乙烯-乙酸乙烯共聚物(EVA)、聚氨酯、聚氨酯-聚醚共聚物、聚乙烯、聚酰胺、聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE)、纤维素材料，如三醋酸纤维素和硝酸/醋酸纤维素以及水凝胶，如2-羟乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)。
本发明的化合物也可配制用于栓剂给药。首先熔化低熔点的蜡，例如脂肪酸甘油酯或者可可油的混合物，并均匀地分散活性成分，例如通过搅拌。然后将熔化的均匀混合物倾倒至常规尺寸的模具内，使其冷却并固化。
所述活性化合物可以配制成栓剂，例如包括约0.5％至约50％的本发明的化合物，分散在聚乙烯醇(PEG)载体内(如PEG1000[96％]和PEG 4000[4％])。
本发明的化合物可以配制用于阴道给药。除了活性成分外还包含载体的阴道栓、栓塞、霜剂、凝胶剂、膏剂、泡沫剂或喷剂都是本领域已知适用的。
本发明的化合物可配制用于鼻腔给药。溶液或悬浮液以常规的方法直接应用于鼻腔，如通过滴管、吸管或喷雾。所述制剂可设置为单剂量或多剂量的形式。在滴管或者吸管的后一种情况下，这可通过向患者施予适宜的、预定量的溶液或悬浮液来实现。对于喷雾来说，这可以通过计量雾化喷雾泵来实现。
本发明的化合物可配制用于气雾剂给药，尤其是呼吸道和包括鼻内给药。该化合物一般具有小颗粒粒径，例如5微米或更小的级别。这种粒径可以通过本领域已知的方法获得，例如通过微粉化。将活性成分以适宜的推进物置于加压包装内，例如氯氟碳(CFC)，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、或二氯四氟甲烷，二氧化碳或其他适宜的气体。该喷雾剂也可方便地包括表面活性剂，例如卵磷脂。药物的剂量通过计量阀控制。或者，活性成分可以以干粉形式提供，例如化合物位于适宜粉末基质中的粉末混合物，所述粉末基质为例如乳糖、淀粉或淀粉衍生物，如羟丙甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷(PVP)。粉末载体在鼻腔中形成凝胶。粉末混合物可以制成单位剂量，例如胶囊或者例如凝胶或铝塑包装形式的药盒，其中粉末可以通过吸入器给药。
当需要的时候，制剂可以用肠道衣来制备，适用于缓释或控释释放活性成分。
药物制剂优选是单位剂量形式，这种形式中，制剂可以细分为包含适宜量的活性成分的单位剂量。单位剂量形式可以是包装的制剂，该包装包含离散量的制剂，例如在小瓶或安瓿瓶内的压缩片、胶囊和粉末。此外，单位剂量形式可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者它可以是适宜数量的任意这些包装形式。
药学上可接受的盐
本发明化合物的药学上可接受的盐，只要它们可以制备，也包含在本发明的范围内。这些盐是指在它们在药学用途中可接受的盐。这说明所述盐保留了母体化合物的生物活性，并且所述盐在用途和治疗疾病的使用上不会产生不好或者有害的影响。
药学上可接受的盐是以标准的方式制备。如果母体化合物是碱，则将它在适宜溶剂中用过量的有机或无机酸处理。如果母体化合物是酸，则将它在适宜溶剂中用无机或有机碱处理。
本发明的化合物可以它的碱金属或碱土金属盐的形式给药，同时、同步或者连同药学上可接受的载体或稀释剂，尤其并优选以它的药物组合物的形式，以有效的量通过口服、直肠或非肠道(包括皮下)途径给药。
用于本发明的药物组合物种的药学上可接受的酸加成盐的实施例包括那些源自以下物质的盐：无机酸，如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸，以及有机酸，如酒石酸、醋酸、柠檬酸、马来酸、乳酸、反丁烯二酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸、对甲苯磺酸和芳基磺酸。
在一种实施方式中，本文以上定义的药物组合物包括药学上可接受的载体。
在本发明的一种实施方式中，本文以上定义的药物组合物的pH为pH4和pH9之间。
一套试剂盒
本发明的一个方面涉及一套试剂盒，包括：
-本文如上定义的药物组合物
-用于施予所述药物的医疗器械或其他工具
-如何使用该套试剂盒的说明书
-可选地本文以上定义的第二活性成分
在进一步的实施方式中，本文如上定义的器械也称作胰岛素笔，如美国专利US5,462,535、US 5,999,323和US 5,984,906中所述。
所述第二成分可以是通常施予患有胰岛素抵抗或者与胰岛素抵抗相关的疾病的个体的意适宜的活性成分，如胰岛素。通过施予本文定义的药物组合物而敏化胰岛素受体，可以相信对降低胰岛素受体的需求会降低。
治疗
如上所讨论，本发明还涉及治疗胰岛素抵抗或与胰岛素抵抗相关的疾病，所述方法包括向需要的个体施予药学上治疗有效量的如上定义的药剂；或者如上定义的分离的核酸序列；或者如上定义的表达载体；或者如上定义的宿主细胞组分；或者如上定义的包装细胞系，或者它们的结合。
与胰岛素抵抗相关的疾病特别选自胰岛素抵抗综合征、2型糖尿病、葡萄糖耐受受损、代谢综合征、高血糖、高胰岛素血症、动脉硬化、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高脂血症、血脂异常、肥胖、中心性肥胖、多囊卵巢综合征、血凝过快、高血压、微量白蛋白尿、胰岛素抵抗综合征(IRS)、2型糖尿病、葡萄糖耐受受损、代谢综合征、高血糖、和高胰岛素血症。
本发明发现，施予SorCS1样药剂敏化了胰岛素受体，因为其稳定胰岛素受体，增加胰岛素受体的量，和/或增加激活的胰岛素受体的量(测量磷酸化胰岛素受体)。因此，另一方面，本发明涉及一种敏化胰岛素受体的方法，所述方法包括施予选自如下的Vps10p-域受体：
f)SorCS1
g)SorCS2
h)SorCS3
i)分选蛋白和
j)SorLA，
从而可用于治疗胰岛素抵抗或与胰岛素抵抗相关的疾病的方法中。
此外，本发明人发现，当施予SorCS1样药剂时，胰岛素受体可被上调，因此，本发明涉及一种上调有需要的患者中的胰岛素受体或其片段或变体的方法，所述方法包括向有需要的个体施予治疗有效量的如上定义的药剂；或者如上定义的分离的核酸序列；或者如上定义的表达载体；或者如上定义的宿主细胞组分；或者如上定义的包装细胞系，或者它们的结合。
此外还发现SorCS1样药剂增加了胰岛素敏感性，因此本发明也涉及一种增加胰岛素敏感性的方法，包括向有需要的个体施予如上定义的治疗有效量的药剂；或者如上定义的分离的核酸序列；或者如上定义的表达载体；或者如上定义的宿主细胞组分；或者如上定义的包装细胞系，或者它们的结合。所述个体典型地是患有上述任意疾病的个体，更可能是患有1型或2型糖尿病的个体。
附图详细说明
图1：Vp s10p-域受体家族。显示了它们的结构组织。
图2：mSorCS1的剪接变体。A)导致产生不同细胞质尾区的鼠科SorCS1基因的组织。黑色框表示具有典型剪接位点的外显子23和24。在复合的内部/终端外显子25(灰色)和26(白色)中，虚线表示潜在的剪接位点。可替换使用的终端外显子25、26、27和28以白色显示。B)mSorCS1细胞质域的氨基酸序列。下划线的是双亮氨酸模体，上划线的是SH3结合域模体，下短划线的是SH2结合域模体，以及上短划线的是
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模体。
图3：不同mSorCS1剪接变体的表达。通过逆转录-PCR(RT-PCR)用特异性引物对测定在成年小鼠的组织中SorCS1的细胞外部分(SorCS1.ex)或五种尾剪接变体SorCS1-a、-b、-c、c+和-d。SorCS1.ex特异性引物跨越外显子21至24接合点，得到390bp的产物。SorCS1-a特异性引物跨越外显子21至25接合点，得到586bp的产物。SorCS1-b特异性引物跨越外显子21至25接合点和外显子25-27结合点，得到621bp的产物。SorCS1-c特异性引物跨越外显子21至26接合点，得到626bp的产物。SorCS1-d特异性引物跨越外显子21至25接合点和外显子25至28结合点，产生636bp的产物。总RNA制备是采用Versagene总RNA纯化试剂盒(Gentra Systems)，由约8周龄的野生型分离出的海马体、肝脏、脂肪组织(脂肪)、肌肉、胰腺和睾丸以及来自SorCS1-KO小鼠的海马和肝脏进行制备。简而言之，组织经手术摘除，并在干冰上冷冻。冷冻的组织样品经转子定子(Ultra-Turrax，IKA-Werke)在800μl含5mM三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)的裂解缓冲液中被破坏并均质化60秒，并且根据试剂盒的制造商说明纯化总RNA。RT-PCR是采用TITANIUM One-stepRT-PCT试剂盒(Clontech)，用取自每个样品的0.75μg至1μg的总RNA进行。所有反应是在50μl体积中进行，其中包含1 x One-step缓冲液(40mM三甲基甘氨酸，20mM KCl，3mM MgCl2，3.75μg/μl BSA)，0.2mM每种dNTP，25μl热稳定试剂，10μl GC-melt，20μM Oligo(dT)引物，20个单位重组核糖核酸酶抑制剂，1 x RT-TITANIUMTM Taq酶混合物(均随试剂盒提供)和45μM各引物。PCR条件是：50℃，1h；94℃，5min；94℃，30秒，循环35次；64℃，30s；68℃，1min，以及68℃，2min。
图4：mSorCS1基因剔除小鼠的产生。A)通过在胚胎干细胞中进行同源重组产生mSorCS1基因剔除小鼠的方案。示意图显示野生型鼠科的SorCS1基因座(上)，靶向载体(中)和同源重组基因组(下)。B)mSorCS1 mRNA表达的分析，显示缺乏所有mSorCS1剪接变体的转录。通过RT-PCR在源自野生型(WT)和SorCS1基因剔除(KO)小鼠的海马体的mRNA上获得片段，采用特异性引物对识别SorCS1细胞外部分(ext)或者五种尾变体中的每一种(a、b、c、c+和d)(见图3)。C)皮层的Western印迹分析显示mSorCS1基因剔除(KO)小鼠中缺乏mSorCS1蛋白。从E14.5中获得的皮层中提取蛋白质作为裂解物。该组织通过强涡流溶解于100μl TNE-缓冲液(10mMTris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1％nonidet P-40(Sigma Aldrich)pH.8)，该缓冲液包含蛋白激酶抑制剂(CompleteMini)。在20℃冷冻ON之后，裂解物涡旋并以1000 x g离心10min。裂解物(上清液)转移至新的试管中，并且用Bio-Rad蛋白质分析测定蛋白质浓度。裂解物(200μg)再溶解于SDS-PAGE上，并转移至硝基纤维素上。然后以抗SorCS1的富亮氨酸(α-hSorCS1-leu)部分的兔多克隆抗体探测印迹。箭头指示SorCS1带。Neo；新霉素，TK；胸苷激酶，FRT/F3；Flp重组酶靶点。
图5：不同年龄的A)雄性和B)雌性小鼠的平均血糖。动物禁食过夜(16h)。野生型(wt)和SorCS1基因剔除(KO小鼠)用乙醚麻醉，通过眼眶采血获得血液样品，并且立刻在自动监测仪(Bayer公司的Ascensia Contour)上测量血浆葡萄糖。基因剔除相对于野生型小鼠的血糖水平的统计学显著增加用星号表示。误差线指示SEM。
图6：10-50周龄的雌性野生型和SorCS1基因剔除小鼠的血浆胰岛素水平。动物禁食过夜(16h)。小鼠用乙醚麻醉。通过眼眶采血获得血液样品，并且使用超灵敏小鼠胰岛素酶联免疫检测试剂盒(DRG Diagnostics，Marburg，Germany)测定血浆胰岛素水平。数据是每组4至10只小鼠的平均值±SEM。基因剔除小鼠相对于野生型小鼠的血糖水平的统计学显著增加用星号表示。
图7：SorCS1基因剔除小鼠和野生型同窝出生小鼠的葡萄糖耐受试验。
59周龄的雌性野生型(wt)和SorCS1基因剔除(KO)小鼠禁食过夜(16h)，并经腹腔注射葡萄糖无菌盐水溶液推剂(2mg/g体重)。小鼠用乙醚麻醉，并在注射后的0、15、30、60和120分钟时通过眼眶采血获得血液样品，并且测量血浆A)葡萄糖和B)胰岛素水平。采样后立刻在自动监测仪(Bayer公司的Ascensia Contour)上测量血浆葡萄糖。使用超灵敏小鼠胰岛素酶联免疫检测试剂盒(DRG Diagnostics，Marburg，Germany)测定胰岛素水平。数据为每组四只小鼠的平均值±SEM。
图8：西方饮食的野生型小鼠中血糖和胰岛素水平升高。雌性A)+C)和雄性B)+D)野生型(wt)和SorCS1基因剔除(KO)小鼠从10周龄到50周龄喂给高热量西方型饮食(WD)(24％蛋白质、41％碳水化合物、24％脂肪)(Research Diets.D12451)。在50周龄时将动物禁食过夜(16h)，用乙醚麻醉，通过眼眶采血获得血液样品。采样后立刻在自动监测仪(Bayer公司的AscensiaContour)上测量血浆葡萄糖水平A)+B)，并用超灵敏小鼠胰岛素酶联免疫检测试剂盒(DRG Diagnostics，Marburg，Germany)测定血浆胰岛素水平C)+D)。数据是每组中4至10只小鼠的平均值±SEM。
图9：喂给西方型饮食的野生型和基因剔除小鼠的腹部脂肪组织
将雌性A)和雄性B)野生型和SorCS1基因剔除小鼠从10周龄到50周龄喂给高能量西方型饮食(WD)(24％蛋白质、41％碳水化合物、24％脂肪)(Research Diets.D12451)。在研究结束时，处死动物并且分离及称重腹部脂肪(脂肪组织)。数据是每组中4至10只小鼠的平均值±SEM。
图10：肌肉和脂肪组织中IR、磷酸化IR(pY-IR)和Glut4的表达。将50周龄的雌性SorCS1基因剔除小鼠(-/-)和野生型(+/+)对照小鼠禁食过夜，腹腔注射胰岛素(Novorapid，Novo Nordisk A/S)无菌盐水溶液(10单位/kg体重)，并在15分钟后处死。将A)脂肪B)肌肉组织摘除并在含蛋白激酶的裂解缓冲液TNE-缓冲液(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1％nonidet P-40(Sigma Aldrich)pH.8)中均质化。
裂解物以1000 x g离心10min进行澄清，通过Bio-Rad蛋白质分析测定蛋白质浓度。等量的不同样品(100μg)的总蛋白在4-16％的SDS-PAGE凝胶上分离并转移到偏二氟丙烯(PVDF)膜(Amersham Pharmacia)上。
通过western blotting分析上述膜，以抗-IR(Santa Cruz Biotechnology，sc-711)、抗-IR-pY(R&D systems，AF2507)、抗-Glut4(Abcam，ab654)和抗-肌动蛋白(Sigma，AF5441)作为内参。结合抗体通过Super-Signal West Pico试剂(Pierce)和富士胶片LAS3000显影。
图11：SorCS1和胰岛素受体之间的物理相互作用。A)将以指定受体转染的CHO细胞(仅以IRA和IRB瞬态转染)用胰岛素刺激30分钟接着5nM DSP(Pierce)进行交联，随后裂解。将细胞裂解物用结合在Gammabind珠(GEHealthcare)上的抗IR抗体(Santa Cruz Biotechnology，sc-711)孵育。将沉淀复合物用SDS上样缓冲液从洗涤珠中洗脱。洗脱物用α-SorCS1-leu和α-IR进行SDS-PAGE和Western blot分析，以揭示SorCS1:IR复合物的存在。将用α-SorCS1-leu和α-IR进行Western blot分析的粗裂解物也包含在内，以评估转染效率。B)表面等离子体共振实验(BIAcore)显示SorCS1的可溶性全长细胞外部分与固定的可溶性胰岛素受体(IR)(R&D系统)的直接相互作用。采用的可溶性SorCS1浓度是50nM、75nM和150nM。Kd估计约5nM。
图12：以SorCS1转染的CHO细胞中的胰岛素受体表达。将中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用四种鼠科SorCS1剪接变体(SorCS1-a、-b、-c、-d)稳定地转染，并且msol.SorCS1(SorCS1的细胞外部分)在补以抗生素(50U/ml盘尼西林/50μg/ml链霉素)的无血清HyQ-CCM5 CHO(HyClone)培养基中长至融合。细胞用PBS冲洗，并在补以蛋白酶抑制剂(CompleteMini，RocheMolecular Biochemicals)的裂解-缓冲液(1％Triton X-100，20mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH 8.0)中裂解。将等分的裂解物，相当于10μg蛋白质，溶解于SDS上样缓冲液中，并采用4-16％的丙烯酰胺凝胶进行还原SDS-PAGE。为进行免疫点，蛋白质电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Amersham Pharmacia)上，并以抗-IR(Santa Cruz Biotechnology，sc-711)、抗-SorCS1-leu和抗β-肌动蛋白(Sigma，AF5441)作为内参进行探测。结合抗体通过Super Signal West Pico试剂(Pierce)和富士胶片LAS3000显影。
图13：细胞膜上IR和SorCS1的表达。通过细胞表面生物素化测定胰岛素受体和SorCS1的细胞表面表达。采用膜不可渗透的生物素化试剂NHS-SS-biotin(Pierce)，将CHO细胞及稳定表达mSorCS1-A、mSorCS1-B和mSorCS1-C的CHO细胞进行表面生物素化。细胞生长至融合，随后细胞用磷酸化缓冲盐水(PBS)洗涤。生物素化是用0.5mg/ml的NHS-SS-生物素的PBS溶液在4℃轻微振荡90分钟来进行。标记之后，细胞用冰冻的PBS洗涤两次，以去除残留的NHS-SS-生物素。随后，细胞溶解于含有蛋白激酶抑制剂(CompleteMini)的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1％nonidet P-40(Sigma Aldrich)pH.8)中。裂解物通过在4℃以14,000 x g离心5分钟而澄清，保留20μl的澄清裂解物(裂解部分)，剩余部分的裂解物以100μl链霉亲和素琼脂糖珠(Sigma)在4℃轻微搅拌孵育过夜。孵育之后，裂解物/珠混合物在4℃以14,000 x g离心5分钟。裂解部分包含细胞的细胞内蛋白质(Intra)。珠子以PBS冲洗两次，以150μl SDS样品缓冲液将捕获的生物素化的蛋白质(Bio)从珠上洗脱。最后，部分生物素化的(Bio)(30μl)、细胞内部分(Intra)(25μl)和粗裂解物(Lysate)进行SDS-PAGE和Western印迹分析，以抗-IR(Santa Cruz Biotechnology，sc-711)、抗-IR-pY(R&D systems，AF2507)、抗-Glut4(Abcam，ab654)和抗-β-肌动蛋白(Sigma，AF5441)作为内参。结合抗体通过Super Signal West Pico试剂(Pierce)和富士胶片LAS3000显影。
图14：人2型糖尿病的发展阶段。2型糖尿病(T2D)响应主体的肥胖而发展，该主体患有潜在的遗传和后天的胰岛素抵抗和β细胞功能障碍的倾向。随着时间推移，针对胰岛素抵抗的胰岛β细胞代偿衰退，导致β细胞功能逐步降低。因此，该主体从正常葡萄糖耐受发展到葡萄糖耐受受损(前期糖尿病)，并最终形成T2D。图中显示了在糖尿病发展期间血糖浓度的增大(黑线)，显示了在frank糖尿病发作之前，从正常到前期糖尿病的变化。此外，该图上还揭示了T2D发展期间胰岛素的水平(虚线)，显示了前期糖尿病状态期间胰岛素增加作为胰岛素抵抗的补偿，以及frank糖尿病发作时由于β细胞衰竭引起的胰岛素释放的显著降低。
图15：20天龄的野生型和基因剔除小鼠中胰岛的胰岛素免疫染色。
将胰腺摘除，用4％多聚甲醛固定，在PBS中新鲜制备。样品嵌入组织-Tek(Sakura)。从整个胰腺的几个位点获得冷冻切片(10μm)，并在-80℃保存。为进行免疫染色，将切片在PBS中放置2x5min，在-20℃下在0.2％双氧水(H2O2)甲醇溶液封闭15分钟，用PBS(1x5min)和PBS+0.1％TritonX-100(2x10min)冲洗，然后用10％胎牛血清(FCS)PBS溶液预孵育30min。随后将切片用PBS(3x2min)冲洗，并在4℃下在PBS+10％FCS(1∶500)稀释的原代抗体豚鼠抗胰岛素(I-8510，Sigma)中孵育过夜。将切片用PBS(3x15min)冲洗，并在PBS+FCS(1∶500)中稀释的Cy3共轭的抗豚鼠二级抗体(706-165-148，Jackson ImmunoResearch)中在室温下避光孵育1h，然后用PBS(3x15min)冲洗，并晾干。最后，将切片用带有DAPI的Vectashield(H-1200，Vector Labs)固定，并通过共焦激光扫描显微镜(LMS 510，Carl Zeiss)进行分析。
图16：SorCS1的比对
源自人(homo sapiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)、乳牛(Bos Taurus)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、狗(Canis lupus familiaris)和鸡(Gallus gallus)的SorCS1序列比对。序列同一性如表2所示。
表2：与人SorCS1的序列一致性
  种属   蛋白质(％同一性)  DNA(％同一性)
  人   100  100
  黑猩猩   99.6  99.4
  狗   97.6  92.5
  乳牛   92.9  89.8
  小鼠   93.2  87.7
  大鼠   93.2  88.0
  鸡   85.3  79.7
图17：在肝过表达可溶性SorCS1之后，雌性野生型和SorCS1基因剔除小鼠中血浆葡萄糖水平降低
野生型和SorCS1基因剔除雌性小鼠注射腺病毒，过表达可溶性SorCS1。用于表达人可溶性SorCS1(hsol.SorCS1)的重组腺病毒的产生如下：将编码人可溶性SorCS1 cDNA(氨基酸1-1100)的pcDNA3.1/Zeo(-)/hsol.SorCS1用Pme1和Apa1消化，将编码hsol.SorCS1的片段插入到穿梭质粒pVQpacAd5CMVK-NpA(ViraQuest Inc，North Liberty，IA)中，ViraQuest Inc，North Liberty，IA，然后使用这种穿梭质粒产生和增殖过表达hsol.SorCS1的腺病毒。将40周龄的雌性SorCS1基因剔除和野生型小鼠禁食过夜。在第0天上午，通过眼眶采血获得血液样品，并立刻在自动监测仪(Ascentia Contour，Bayer)上测量血浆葡萄糖。然后，将小鼠通过尾静脉注射2E9 pfu′s的带有hsol.SorCS1或LacZ(作为阴性对照)的腺病毒载体(来自ViraQuest Inc，NorthLiberty，IA)。在第7天，重复测量禁食过夜的小鼠的血浆葡萄糖，以评估SorCS1和LacZ蛋白质的影响。数据是每组中3只小鼠的平均值±SEM。SorCS1基因剔除小鼠和野生型小鼠中，过表达可溶性SorCS1的小鼠表现出显著的血糖下降(≈40％)。在接受对照病毒LacZ的小鼠中没有看到这种增加。
图18：过表达可溶性SorCS1的SorCS1基因剔除雌性小鼠的肌肉和脂肪组织中IR、磷酸化IR(pY-IR)和Glut4的表达。
40周龄的雌性SorCS1基因剔除小鼠(-/-)注射表达hsol.SorCS1或LacZ(作为阴性对照)的腺病毒载体(详见图17中的方案)。在注射病毒12天后，将小鼠禁食过夜，腹腔注射胰岛素(Novorapid，Novo Nordisk A/S)的无菌盐水溶液(10单位/kg体重)，并在15分钟后处死。将A)肌肉和B)脂肪组织摘除并在含有蛋白酶抑制剂(Complete Mini，Roche)和磷酸酶抑制剂(cocktail1，Sigma Aldrich)的裂解缓冲液TNE-缓冲液(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1％nonidet P-40，pH.8)中均质化。将裂解物以10.000 x g离心10分钟澄清，通过Bio-Rad蛋白质分析测定蛋白质浓度。在4-12％Bis-tris凝胶(Nupage，Invitrogen)上分离等量的不同样品的总蛋白(50μg)，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Amersham Pharmacia)上。用抗-IR(Santa CruzBiotechnology，sc-711)、抗-IR-pY(R&D systems，AF2507)和抗-Glut4(Abcam，ab654)，通过western blotting分析上述膜。结合抗体通过Super Signal West Pico试剂(Pierce)和富士胶片LAS3000显影。与表达LacZ对照蛋白质的小鼠相比，在过表达可溶性SorCS1的SorCS1基因剔除小鼠的A)肌肉和B)脂肪组织中，IR、磷酸化IR和Glut4的量均升高，表明接受hsol.SorCS1病毒的小鼠的胰岛素敏感性增加。
图19：过表达可溶性SorCS1的糖尿病db/db雌性小鼠中血浆葡萄糖和胰岛素水平降低
为评估可溶性SorCS1在自发产生2型糖尿病的肥胖小鼠模型中的影响，使用db/db小鼠系(来自Taconic的BKS.Cg-m+/+Lprdb/BomTac)。这些小鼠缺乏瘦素受体，因此小鼠变得肥胖并产生胰岛素抵抗，并且最终在6-8周龄时产生严重的糖尿病。注射了表达hsol.SorCS1或LacZ(作为对照)的腺病毒(如图17所述)，以考察对血浆葡萄糖和胰岛素水平的影响。具体地，将10周龄的db/db雌性小鼠禁食过夜。在第0天上午，将小鼠用乙醚麻醉，通过眼眶采血获得血液样品。A)立刻在自动监测仪(Ascentia Contour，Bayer)上测量血糖，以及B)用超灵敏的小鼠胰岛素酶联免疫检测试剂盒(DRG Diagnostics)测定血浆胰岛素水平。小鼠随后在尾静脉注射带有hsol.SorCS1或LacZ(作为阴性对照病毒)的2E9 pfu′腺病毒载体(来自ViraQuest Inc，North Liberty，IA)。在第7天，重复测量禁食过夜小鼠的血糖和血浆胰岛素，以评估SorCS1和LacZ蛋白质的影响。数据是各组中5只小鼠的平均值±SEM。在第7天，过表达可溶性SorCS1的db/db雌性小鼠与接受对照LacZ病毒的小鼠相比表现出血糖明显降低(≈35％)。而且，在第7天，过表达可溶性SorCS1的db/db雌性小鼠与表达对照病毒的小鼠相比血浆胰岛素水平明显降低。因此，可溶性SorCS1的过表达增加了2型糖尿病小鼠模型的糖尿病状态。
图20：过表达可溶性SorCS1的糖尿病db/db雌性小鼠中的葡萄糖糖耐受试验
向雌性db/db小鼠注射表达可溶性SorCS1或LacZ的腺病毒(见图17)，在第3天禁食过夜(16hrs)。在第4天，小鼠腹腔注射葡萄糖无菌盐水溶液推剂(2mg/g体重)。动物用乙醚麻醉，并在注射后0、15、30、90和150分钟时通过眼眶采血获得血液样品。采样后立刻在自动监测仪(Ascentia Contour，Bayer)上测量血糖水平。数据是每组中5只小鼠的平均值±SEM。结果显示，可溶性SorCS1的过表达使小鼠对胰岛素更敏感，在150分钟后血糖水平恢复到基线。相比之下，实验期间，表达LacZ的小鼠中的血糖水平在150分钟后仍然升高。因此，过表达可溶性SorCS1的db/db雌性小鼠有较小的胰岛素抵抗。
图21：过表达可溶性SorCS1的糖尿病db/db雄性小鼠中的血浆葡萄糖和胰岛素水平
为评估可溶性SorCS1在自发产生2型糖尿病的肥胖小鼠模型中的影响，使用db/db小鼠品系(来自Taconic的BKS.Cg-m+/+Lprdb/BomTac)。这些小鼠缺乏瘦素受体，因此小鼠变得肥胖并产生胰岛素抵抗，并且最终在6-8周龄时产生严重的糖尿病。注射了表达hsol.SorCS1或LacZ(作为对照)的腺病毒(如图17所述)，以考察对血浆葡萄糖和胰岛素水平的影响。具体地，将6周龄的db/db雌性小鼠禁食过夜。在第0天上午，将小鼠用乙醚麻醉，通过眼眶采血获得血液样品。A)立刻在自动监测仪(Ascentia Contour，Bayer)上测量血糖，并且B)用超灵敏的小鼠胰岛素酶联免疫检测试剂盒(DRG Diagnostics)测定血浆胰岛素水平。小鼠随后在尾静脉注射带有hsol.SorCS1或LacZ(作为阴性对照病毒)的2E9 pfu′腺病毒载体(ViraQuest Inc，North Liberty，IA)。在第7天，重复测量过夜禁食小鼠的血糖和血浆胰岛素，以评估SorCS1和LacZ蛋白质的影响。数据是各组中5只小鼠的平均值±SEM。在第7天，过表达可溶性SorCS1的db/db雄性小鼠与接受对照LacZ病毒的小鼠相比表现出血糖的明显降低(≈35％)。因为与接受对照LacZ病毒的小鼠相比，血糖水平的下降并不是由胰岛素浓度增加引起，结论是SorCS1的过表达改善了雄性2型糖尿病db/db小鼠的糖尿病状态。
图22：过表达可溶性SorCS1的db/db雄性小鼠的肌肉组织中Glu4的亚细胞定位
为了评估可溶性SorCS1过表达是否可改变Glut4的分布，对过表达可溶性SorCS1的db/db雄性小鼠的肌肉组织进行亚细胞分级。具体地，将6周龄的db/db小鼠在尾静脉注射表达hsol.SorCS1或LacZ(作为对照)的腺病毒载体，如图17所示。病毒注射后第7天，小鼠禁食过夜，腹腔注射胰岛素(Novorapid，Novo Nordisk A/S)无菌盐水溶液(10单位/kg体重)，并于15分钟后处死。将注射相同病毒的5只小鼠的肌肉组织摘除、剥离并转移到5mlHEPES-缓冲蔗糖(0.25M sucrose，1mM EDTA，20mM HEPES-KOH，pH 7.4)，用聚四氟乙烯通过10杵上下杵动均质化，并以1000 x g离心10分钟。因此，通过几轮离心，获得重线粒体、轻线粒体和微粒体部分。首先，将上清液以3.000 x g离心10分钟，然后将所得的上清液以16.000 x g离心10分钟，最后将所得的上清液以100.000 x g离心45分钟，得到含有微粒体部分的微球(pellet)。微粒体部分重悬于0.5ml HEPES-缓冲溶液中并进行蔗糖(速率)梯度离心。0.5ml微粒样品上样于1M HEPES，pH 7.2中的12ml线性0.8M至1.6M蔗糖梯度上，并在水平转子中(SW41 Ti)以84.000 x g离心18h。每个梯度从管的顶部开始分成24个部分。最后，凝胶电泳和Western blotting分析不同部分中Glut4的表达。结果显示，过表达SorCS1的肌肉组织中Glut4的沉淀分布不同于表达对照蛋白质lacZ的肌肉组织。因此，Glut4的积累从LacZ处理后的2-4部分向SorCS1组中的8-12部分偏移。这表明可溶性SorCS1的过表达可能改变Glut4的分布，从而调节葡萄糖摄取。
图23A+B：通过SPOT分析法分析SorCS1/IR接点接通序列
共-免疫沉淀反应和BIAcore(表面等离子体共振)实验显示SorCS1可以在物理上与胰岛素受体相关联。这里采用SPOT合成分析来识别可参与蛋白质-蛋白质相互作用的两个受体中任一个的线性氨基酸序列。操作中，将过滤膜用从SorCS1(B)和IR(A)的N-至C-端有三个氨基酸重叠的连续15-mer肽污染。随后将过滤膜用(A)125I-标记的可溶性人SorCS1或(B)组氨酸-标记的胰岛素受体(R&D系统，no1544-IR/CF)探测。然后，冲洗过滤膜，并目测结合肽。通过免疫检测或者结合蛋白的放射显影，直接在肽膜上进行结合分析。具体地，将膜在96％乙醇中冲洗1 x 10min，随后用1 x TBS(500mMTris-HCl，1500mM NaCl)，pH.8.0洗涤3 x 10min，并在膜封闭缓冲液(BB；1x 封闭缓冲液(B6429，Sigma)，1 x TBS，5％蔗糖)中孵育3小时。将封闭的IR膜用125I-sol.SorCS1(400.000cpm/ml BB)孵育过夜，而SorCS1-膜用his-IR(10μg/ml BB)孵育过夜。这两种膜都用1 x TBS洗涤3 x 10min。A)采用抗组氨酸标记，α-组氨酸(Invitrogen)(小鼠单克隆)的一级抗体，然后HRP-标记的二级抗小鼠抗体(Sigma)，通过免疫检测法检测SorCS1膜上结合的his-IR。采用增强的化学发光(ECL)Western blotting检测试剂(Amersham biosciences)和富士胶片LAS1000显影该结合抗体。采用富士相板通过放射显影，并在曝光12小时后采用富士胶片FLA3000显影，来检测IR-膜上所结合的放射性标记的SroCS1。信号(SPOT)表明配体结合到了肽上。重叠的线性结合表位是以相邻的斑点的信号来表征。在膜图上显示SPOT′s的构架，并且膜下显示与SPOT′s对应的关键序列。
图24A+B：通过PCR阵列，源自SorCS1基因剔除小鼠的脂肪组织的基因表达谱
采用SorCS1基因剔除野生型肥胖小鼠的脂肪组织的基因阵列分析，测试A)与小鼠胰岛素信号通路相关的84个基因和B)与小鼠脂蛋白信号&胆固醇代谢相关的84个基因的表达。实践中，第一链cDNA由50周龄的雌性小鼠(n＝3)SorCS1基因剔除(-/-)和野生型(+/+)脂肪组织中的总RNA(应用生命系统)合成。然后，A)小鼠胰岛素信号通路(PAMM-030A RT2 Profiler PCR阵列)或B)型小鼠脂蛋白信号&胆固醇代谢(PAMM-080-A RT2 Profiler PCR阵列)的超阵列是用ABI7900平台(应用生命系统)和SYBR Green/Rox PCR(SABiosciences)处理。用AROS Applied Biotechnology，Aarhus，丹麦)完成该表达分析。上表中列出了与野生型小鼠相比，SorCS1基因剔除小鼠中显示上调或下调表达超过3倍的基因，并且下表中显示了它们的已知功能。A)和B)中的一些基因显示出SorCS1基因剔除小鼠与野生型小鼠相比表达变化，表明SorCS1基因剔除小鼠中胰岛素和胆固醇信号通路和代谢发生了改变。
实施例
实施例1：小鼠组织中mSorCS1剪接体的表达
在成年小鼠的不同组织中测定SorCS1的细胞外部分(SorCS1.ex)或五种尾剪接变体SorCS1-a、-b、-c、c+和-d。剪接变体的细胞质域的SorCS1基因的组织和氨基酸序列分别如图2A和2B所示。SorCS1的细胞外部分(SorCS1.ex)和剪接变体的表达是用特异性引物对通过逆转录PCR(RT-PCR)来测定。SorCS1.ex特异性引物(SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58)跨越外显子21至24接合点，得到390bp的产物。SorCS1-a特异性引物(SEQ ID NO：59和SEQID NO：60)跨越外显子21至25接合点，得到586bp的产物。SorCS1-b特异性引物(SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62)跨越外显子21至25接合点和外显子25-27结合点，得到621bp的产物。SorCS1-c特异性引物(SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64)跨越外显子21至26接合点，得到626bp的产物。SorCS1-d特异性引物(SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66)跨越外显子21至25接合点和外显子25至28结合点，产生636bp的产物。总RNA制备是采用Versagene总RNA纯化试剂盒(Gentra Systems)，由约8周龄的野生型分离出的海马体、肝脏、脂肪组织(脂肪)、肌肉、胰腺和睾丸以及来自SorCS1-KO小鼠的海马和肝脏进行制备。简而言之，组织经手术摘除，并在干冰上冷冻。冷冻的组织样品经转子定子(Ultra-Turrax，IKA-Werke)在800μl含5mM三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)的裂解缓冲液中被打破和均质化60秒，并且根据试剂盒的制造商说明纯化总RNA。RT-PCR是采用TITANIUM One-step RT-PCT试剂盒(Clontech)，用取自每个样品的0.75μg至1μg的总RNA进行。所有反应是在50μl体积中进行，其中包含1 x One-step缓冲液(40mM tricine，20mM KCl，3mM MgCl2，3.75μg/μl BSA)，0.2mM每个dNTP，25μl T热稳定试剂，10μlGC-melt，20μM Oligo(dT)引物，20个单位重组核糖核酸酶抑制剂，1 xRT-TITANIUMTM Taq酶混合物(均随试剂盒提供)和45μM各引物。PCR条件是：50℃，1h；94℃，5min；94℃，30秒，循环35次；64℃，30s；68℃，1min，以及68℃，2min。
实施例2：mSorCS1基因剔除小鼠的产生
为研究SorCS1和它的不同剪接变体的功能，通过在胚胎肝细胞中同源重组产生条件性基因剔除小鼠。同源重组是通过位于FRT位点的位点特异性FLP重组酶引发，产生“重组酶介导的盒式交换”。该重组事件如图4A所示，其中SorCS1基因与Neo基因“交换”，从而生产全基因剔除小鼠，其中所有SorCS1剪接变体都被打断。
采用特异性引物对，在源自野生型(WT)和SorCS1基因剔除(KO)小鼠的海马体的mRNA上通过RT-PCR测试野生型和SorCS1基因剔除小鼠中SorCS1的表达，以识别SorCS1细胞外部分(ext)或者五种尾变体中的每一种(a、b、c、c+和d)。图4B所示的结果揭示，在SorCS1基因剔除小鼠中所有mSorCS1剪接变体的转录都被打断。
皮层的Western印迹分析显示mSorCS1基因剔除(KO)小鼠中缺乏mSorCS1蛋白。从E14.5中获得的皮层中提取蛋白质作为裂解物。该组织通过强涡流溶解于100μl TNE-缓冲液(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mMEDTA，1％nonidet P-40(Sigma Aldrich)pH.8)，该缓冲液包含蛋白激酶抑制剂(CompleteMini)。在20℃冷冻ON之后，裂解物涡旋并以1000 x g离心10min。裂解物(上清液)转移至新的试管中，并且Bio-Rad蛋白质分析测定蛋白质浓度。裂解物(200μg)再溶解于SDS-PAGE上，并转移至硝基纤维素。然后以抗SorCS1的富亮氨酸(α-hSorCS1-leu)部分的兔多克隆抗体探测印迹。
实施例3：SorCS1基因剔除小鼠中的血糖水平
2型糖尿病(T2D)响应主体的肥胖而发展，该主体患有潜在的遗传和后天的胰岛素抵抗和β细胞功能障碍的倾向。随着时间推移，针对胰岛素抵抗的胰岛β细胞代偿衰退，导致β细胞功能逐步降低。因此，该主体从正常葡萄糖耐受发展到葡萄糖耐受受损(前期糖尿病)，并最终形成T2D。图中显示了在糖尿病发展期间血糖浓度的增大(黑线)，显示了在frank糖尿病发作之前，从正常到前期糖尿病的变化。此外，该图上还揭示了T2D发展期间胰岛素的水平(虚线)，显示了前期糖尿病状态期间胰岛素增加作为胰岛素抵抗的补偿，以及frank糖尿病发作时由于β细胞衰竭引起的胰岛素释放的显著降低(图14)。
为检测SorCS1基因剔除小鼠的葡萄糖代谢，在不同年龄段的雄性(图5A)和雌性小鼠(图5B)中测定血浆葡萄糖水平。动物禁食过夜(16h)。小鼠用乙醚麻醉，通过眼眶采血获得血液样品，并立刻在自动监测仪(AscensiaContour，Baye)上测量血浆葡萄糖水平。图5B中的结果显示，23和50周龄的雌性SorCS1基因剔除小鼠相对于野生型小鼠的血糖水平统计学显著增加。
实施例4：雌性SorCS1基因剔除小鼠的血浆胰岛素水平
为进一步考察SorCS1基因剔除小鼠的葡萄糖代谢，测定10至20周龄的雌性SorCS1基因剔除小鼠中的血浆胰岛素水平(图6)。动物禁食过夜(16h)。小鼠用乙醚麻醉。通过眼眶采血获得血液样品，并且使用超灵敏小鼠胰岛素酶联免疫检测试剂盒(DRG Diagnostics，Marburg，Germany)测定血浆胰岛素水平。数据是每组4至10只小鼠的平均值±SEM。与图5B显示的结果一致，图6中的结果显示，23和50周龄的雌性SorCS1基因剔除小鼠相对于野生型小鼠的血浆胰岛素水平统计学显著增加。
通过对20日龄的野生型和SorCS1基因剔除小鼠的组织进行免疫染色进一步研究胰岛素水平。
将胰腺摘除，用4％多聚甲醛固定，在PBS中新鲜制备。将样品嵌入组织-Tek(Sakura)中。从整个胰腺的几个位点获得冷冻切片(10μm)，并在-80℃保存。为进行免疫染色，将切片在PBS中放置2x5min，在-20℃下在0.2％双氧水(H2O2)甲醇溶液中封闭15分钟，用PBS(1x5min)和PBS+0.1％TritonX-100(2x10min)冲洗，然后用10％胎牛血清(FCS)PBS溶液预孵育30min。随后将切片用PBS(3x2min)冲洗，并在4℃下在PBS+10％FCS(1∶500)稀释的原代抗体豚鼠抗胰岛素(I-8510，Sigma)中孵育过夜。将切片用PBS(3x15min)冲洗，并在PBS+FCS(1∶500)中稀释的Cy3共轭的抗豚鼠二级抗体(706-165-148，Jackson ImmunoResearch)中在室温下避光孵育1h，然后用PBS(3x15min)冲洗，并晾干。最后，将切片用带有DAPI的Vectashield(H-1200，Vector Labs)固定，并通过共焦激光扫描显微镜(LMS 510，CarlZeiss)进行分析。该数据表明，通过增加β-细胞团的尺寸和胰岛素产生，胰腺努力补偿胰岛素敏感性的降低。
实施例5：雌性SorCS1基因剔除小鼠的葡萄糖耐受试验
通过注射葡萄糖后在不同时间点测量葡萄糖和胰岛素水平，测试雌性SorCS1基因剔除小鼠的葡萄糖耐受(图8)。59周龄的雌性鼠禁食过夜(16h)，腹腔注射D-葡萄糖(Sigma)的无菌盐水溶液推剂(2mg/g体重)。小鼠用乙醚麻醉，并在注射后的0、15、30、60和120分钟时通过眼眶采血获得血液样品，并且测量血浆葡萄糖水平(图8A)和胰岛素水平(图8B)。采样后立刻在自动监测仪(Ascensia Contour，Bayer)上测量血浆葡萄糖。使用超灵敏小鼠胰岛素酶联免疫检测试剂盒(DRG Diagnostics，Marburg，Germany)测定胰岛素水平。图7B中的结果显示，注射后在所有时间点(0-120min)雌性SorCS1基因剔除小鼠中的胰岛素水平都增大。
实施例6：西方饮食的野生型小鼠的血浆葡萄糖和胰岛素的水平增高
雌性(图8A+8C)和雄性(图8B+8D)野生型和SorCS1基因剔除小鼠从10周龄到50周龄喂给高热量西方型饮食(WD)(24％蛋白质、41％碳水化合物、24％脂肪)(Research Diets.D12451)。在50周龄时将动物禁食过夜(16h)，用乙醚麻醉，通过眼眶采血获得血液样品。采样后立刻在自动监测仪(Bayer公司的Ascensia Contour)上测量血浆葡萄糖水平(图8A+8B)，并用超灵敏小鼠胰岛素酶联免疫检测试剂盒(DRG Diagnostics，Marburg，Germany)测定血浆胰岛素水平(图8C+8D)。图6中描述的结果显示，血浆葡萄糖和胰岛素水平在西方型饮食的野生型小鼠中增高。
实施例7：SorCS1基因剔除小鼠中胰岛素受体磷酸化增加的验证
将40和50周龄的雌性SorCS1基因剔除小鼠(-/-)和野生型(+/+)对照小鼠禁食过夜，腹腔注射胰岛素(10单位/kg体重)的无菌盐水溶液，并在15分钟后处死。将肌肉组织摘除并在含蛋白酶(Complete Mini，Roche)和磷酸酶抑制剂(Cocktail 1，Sigma Aldrich)的裂解缓冲液TNE-缓冲液(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1％nonidet P-40(Sigma Aldrich)pH＝8)中均质化。裂解物以1000 x g离心10min进行澄清，通过Bio-Rad蛋白质分析测定蛋白质浓度。等量的不同样品的总蛋白(100μg)在4-16％的SDS-PAGE凝胶上分离并转移到偏二氟丙烯(PVDF)膜(Amersham Pharmacia)上。将膜进行westernblotting分析，以抗-IR(Santa Cruz Biotechnology，sc-711)、抗-IR-pY(R&Dsystems，AF2507)、抗-Glut4(Abcam，ab654)和抗-肌动蛋白(Sigma，AF5441)作为内参。此外，用抗磷酸化抗体(4G10)通过免疫沉淀分析IR的络氨酸磷酸化。免疫沉淀按如下进行。取自肌肉组织的100μg蛋白质用涂覆了抗磷酸络氨酸(4G10，Upstate/Millipore)的Gammabind G-琼脂糖珠(AmershamBioscience)在4℃孵育过夜。珠子随后冲洗4 x 5min，最后在还原样品缓冲液(20mM DTE，2.5％SDS)中重悬并煮沸。煮沸的样品的上清液，包含沉淀蛋白，采用抗-IR(Santa Cruz Biotechnology，sc-711)进行western blotting分析。所有的结合抗体通过Super Signal West Pico试剂(Pierce)和富士胶片LAS3000显影。图
10显示50周龄的SorCS1基因剔除小鼠胰岛素受体的表达增加，胰岛素受体磷酸化降低，表明IR在SorCS1基因剔除小鼠中积累，从而阻止受体磷酸化和激活。结果表明SorCS1在胰岛素受体的信号和激活中发挥作用。
实施例8：SorCS1与胰岛素受体之间的物理相互作用
为了考察SorCS1与胰岛素受体(IR)之间的相互作用，将中国仓鼠卵巢细胞(CHO)用四种鼠科SorCS1剪接变体(SorCS1-a、-b、-c、-d)稳定地转染，并且msol.SorCS1(SorCS1的细胞外部分)在补以抗生素(50U/ml盘尼西林/50μg/ml链霉素)的无血清HyQ-CCM5 CHO(HyClone)培养基中长至融合。细胞用PBS冲洗，并在补以蛋白酶抑制剂(CompleteMini，RocheMolecular Biochemicals)的裂解-缓冲液(1％Triton X-100，20mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH 8.0)中裂解。将等分的裂解物，相当于10μg蛋白质，溶解于SDS上样缓冲液中，并采用4-16％的丙烯酰胺凝胶进行还原SDS-PAGE。为进行免疫点，蛋白质电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Amersham Pharmacia)上，并以抗-IR(Santa Cruz Biotechnology，sc-711)、抗-SorCS1-leu和抗β-肌动蛋白(Sigma，AF5441)作为内参进行探测。结合抗体通过Super Signal West Pico试剂(Pierce)和富士胶片LAS3000显像。与没有SorCS1表达的CHO细胞相比，用SorCS1的不同剪接变体稳定转染的细胞系显示出IR的表达升高(图12)。为了识别SorCS1转染细胞中IR的升高量的细胞本地化，进行了表面生物素化。采用膜不可渗透的生物素化试剂NHS-SS-生物素(Pierce)，将CHO细胞及稳定表达mSorCS1-A、mSorCS1-B和mSorCS1-C的CHO细胞进行表面生物素化。将融合的细胞单层用磷酸化缓冲盐水(PBS)冲洗，生物素化是用0.5mg/ml的NHS-SS-生物素的PBS溶液在4℃轻微振荡90分钟来进行。标记之后，细胞用冰冻的PBS洗涤两次，以去除残留的NHS-SS-生物素。随后，细胞溶解于含有蛋白激酶抑制剂(CompleteMini)的裂解缓冲液(10mMTris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1％nonidet P-40(Sigma Aldrich)pH.8)中。裂解物通过在4℃以14,000 x g离心5分钟而澄清，保留20μl的澄清裂解物(裂解部分)，剩余部分的裂解物以100μl链霉亲和素琼脂糖珠(Sigma)在4℃轻微搅拌孵育过夜。孵育之后，裂解物/珠混合物在4℃以14,000 x g离心5分钟。裂解部分包含细胞的细胞内蛋白质(Intra)。珠子以PBS冲洗两次，以150μl SDS样品缓冲液将捕获的生物素化的蛋白质(Bio)从珠上洗脱。最后，部分生物素化的(Bio)(30μl)、细胞内部分(Intra)(25μl)和粗裂解物(Lysate)进行SDS-PAGE和Western blot分析，以抗-IR(Santa CruzBiotechnology，sc-711)、抗-IR-pY(R&D systems，AF2507)、抗-Glut4(Abcam，ab654)和抗-β-肌动蛋白(Sigma，AF5441)作为内参。SorCS1-B和SorCS1-C细胞中胰岛素受体的增高量位于细胞表面(在Bio部分中)，与部分SorCS1蛋白质共存(图13)，表明SorCS1通过物理相互作用和/或通过降低IR蛋白质的翻转，调控IR的表达。
实施例9：SorCS1:IR复合物形成的验证
为了考察SorCS1和IR之间潜在的物理相互作用，将用编码SorCS1-B和-C的质粒稳定转染随后用IRA和IRB瞬时转染的CHO细胞进行免疫沉淀。根据供应商的说明，用HiFect试剂盒(Amaxa)用编码IRA和IRB的质粒转染细胞。在生长2天并达到80％融合时，细胞与DSP(Peirce)交联并裂解。细胞裂解物用与Gammabind珠(GE Healthcare)结合的抗IR抗体(Santa CruzBiotechnology，sc-711)孵育。用SDS上样缓冲液从冲洗珠上洗脱沉淀复合物，并用抗-SorCS1-leu和抗-IR(Santa Cruz Biotechnology，sc-711)进行SDS-PAGE和Western印迹分析。Western印迹分析揭示SorCS1:IR复合物的存在(图11A)。用表面等离子共振(Biacore，Sweden)，用CaHBS作为标准电泳缓冲液(10mMHEPES，pH 7.4，140mM NaCl，2mM CaCl2，1mM EGTA，0.005％tween-20)，验证SorCS1细胞外域与IR的直接相互作用。用供应商描述的NHS/EDC法激活生物传感器(Biacore)(CM5，cat.no.BR-1000-14)的生物传感芯片，接着涂覆可溶性IR(R&D systems，28-956)。可溶性SorCS1显示出与可溶性胰岛素受体的强结合，Kd估计约5nM(图11B)。
实施例10：基于SPOT合成的SorCS1/IR接触位点的分析
免疫共沉淀和生物传感器试验显示了整体分子水平上的蛋白质相互作用。然而，SPOT合成法用于识别氨基酸水平上的蛋白质相互作用，使用SorCS1或IR的重叠肽的源于蛋白质的扫描，从而识别小的SorCS1肽激动剂。通过利用来自人SorCS1-a(图23A)或人(图23B)的整个一级序列的重叠肽，SPOT合成描绘了线性表位(相互作用中涉及的蛋白质链)。具体地，将SorCS1和IR序列分段，并用从C-端到N-端的短重叠肽(15个氨基酸长和3个氨基酸转化)在纤维素上合成，随后用探针探测以便结合各自的配对蛋白质，IR-蛋白质(组氨酸-标记)(R&D systems，no1544-IR/CF)和可溶性小鼠SorCS1蛋白质(I125-标记)。通过免疫检测或者结合蛋白的放射显影，直接在肽膜上进行结合分析。具体地，将膜在96％乙醇中冲洗1 x 10min，随后用1 x TBS(500mM Tris-HCl，1500mM NaCl)，pH.8.0洗涤3 x 10min，并在膜封闭缓冲液(BB；1 x 封闭缓冲液(B6429，Sigma)，1 x TBS，5％蔗糖)中孵育3小时。将封闭的IR膜用125I-sol.SorCS1(400.000cpm/ml BB)孵育过夜，而SorCS1-膜用his-IR(10μg/mlBB)孵育过夜。这两种膜都用1 x TBS洗涤3 x 10min。在图23A中，采用抗组氨酸标记，α-组氨酸(Invitrogen)(小鼠单克隆)的一级抗体，然后HRP-标记的二级抗小鼠抗体(Sigma)，通过免疫检测法检测SorCS1膜上结合的his-IR。采用增强的化学发光(ECL)Western blotting检测试剂(Amershambiosciences)和富士胶片LAS1000显影该结合抗体。在图23B中，膜暴露于富士相板12h，接着用富士胶片FLA3000显影，通过放射显影检测IR-膜上的结合抗体。特异性信号(SPOT)显示，肽与应用的配体相互作用。SPOT膜上相邻的肽中出现了线性结合表位，代表着结合位点。
实施例11：特异性肽与SorCS1或IR的结合
SPOT分析识别了与它们的配体蛋白质(IR和SorCS1)相结合的合成SorCS1或IR候选肽。所述结合进一步使用CaHBS作为标准电泳缓冲液(10mM HEPES，pH 7.4，140mM NaCl，2mM CaCl2，1mM EGTA，0.005％tween-20)，通过表面等离子共振(Biacore，Sweden)分析加以确认(图11B)。将Biocore(CM5，目录号BR-1000-14)的生物传感芯片用供应商描述的NHS/EDC法激活，接着涂覆可溶性IR(R&D systems，28-956)。通过绕过生物传感芯片与IR结合来测试全长SorCS1，显示出正的S型结合曲线，表明SorCS1的可溶性全长细胞外部分与固定的可溶性胰岛素受体(IR)直接相互作用。
实施例6：竞争研究
将与配体蛋白质相结合的合成SorCS1和IR肽用于竞争研究中，以建立它们对SorCS1:IR复合物中SorCS1与IR之间的相互作用的影响。将Biocore(CM5，目录号BR-1000-14)的生物传感芯片用供应商描述的NHS/EDC法激活，接着涂覆可溶性IR(R&D系统，28-956)或可溶性SorCS1。在缺乏竞争肽的情况下，将芯片用纯的可溶性SorCS1或可溶性IR(R&D系统，28-956)(300nM，40μl)孵育，以确定最大的结合能力，设定用于表示100％结合(见实施例5)。在随后的实验中，在存在不同浓度的竞争肽的情况下，将相似量的可溶性SorCS1或IR注射到配体船中，以确定它们减小或损害SorCS1与IR之间的相互作用的能力。
实施例7：竞争研究
将与配体蛋白质相结合的合成SorCS1和IR肽用于细胞的竞争研究中，建立它们对SorCS1:IR复合物中SorCS1与IR之间的相互作用的影响。A)用编码SorCS1的不同剪接变体的质粒稳定转染的CHO细胞，随后用IRA和IRB瞬时转染，用于免疫沉淀反应。使用Hifect试剂盒(Amaxa)，根据供应商的说明，将细胞用编码IR的质粒转染。在不带有或者带有不同浓度的竞争性合成SorCS1或IR肽的条件下，将细胞在培养基中生长2天，并且在80％融合时，将细胞与DSP交联，随后裂解。将细胞裂解物用结合Gammabind珠(GEHealthcare)的抗IR抗体(Santa Cruz Biotechnology，sc-711)孵育。用SDS上样缓冲液从冲洗珠上洗脱沉淀复合物，并用抗-SorCS1-leu和抗-IR(Santa CruzBiotechnology，sc-711)进行SDS-PAGE和Western印迹分析。Western印迹分析用于揭示SorCS1:IR复合物的存在或缺乏，从而确定合成肽减小或损害SorCS1与IR之间相互作用的能力。B)考察CHO细胞和用四种鼠科SorCS1剪接变体(SorCS1-a，-b，-c，-d)和msol.SorCS1(SorCS1的细胞外部分)稳定转染的CHO细胞中，在缺乏或存在合成SorCS1肽的情况下内源IR的表达。细胞在补以不同浓度合成SorCC1肽的无血清HyQ-CCM5 CHO培养基(HyClone)和无血清HyQ-CCM5 CHO培养基中生长到80％融合。细胞用PBS冲洗，并在裂解缓冲液中裂解，并且裂解物的等分试样用抗-SorCS1-leu和抗-IR(SantaCruz Biotechnology，sc-711)进行SDS-PAGE和Western印迹分析。Western印迹分析用于揭示在没有或者有SorCS1稳定表达的情况下，合成SorCS1肽对细胞中IR表达的影响，从而确定合成肽减小或损害表达SorCS1的细胞中IR上调的能力。
实施例8：可溶性SorCS1或SorCS1肽在治疗胰岛素抵抗中的施用
将能够与IR结合的小鼠SorCS1肽的可溶性域(见实施例5)在哺乳动物细胞培养物中大规模地重组表达，随后通过例如免疫亲和层析进行纯化。通过腹腔、静脉、肌内或皮下注射，将蛋白质/肽施予例如SorCS1基因剔除小鼠或显示胰岛素抵抗的另一种糖尿病动物模型(1mg至1g/kg体重，每天或每周)，与野生型对照小鼠平行。获得了良好的效果，并用人SorCS1将相同的方法用于患有胰岛素抵抗的患者。
实施例9：编码可溶性SorCS1或SorCS1肽的DNA在治疗胰岛素抵抗中的应用
临床场合的基因疗法
基因疗法定义为将外源性遗传物质引入到细胞或组织中以便治愈疾病或消除相关症状，本发明中指胰岛素抵抗。遗传物质可以用不同的传递方法/化合物引入活细胞/患者中：a)作为裸露的治疗性遗传分子(DNA)，其中遗传材料本身被直接引入组织/患者中(实施例9)；b)作为特定的基因传递载体，其中所述基因在引入患者之前，被插入不同的适合基因传递的生物实体中(实施例10)；和c)作为病毒，其中基因在引入患者之前，被插入病毒载体中。蛋白质在被引入到小鼠或患者中时可能具有短时寿命，所以额外应用的治疗是，通过腹腔注射、口服给药或直接注射到肌肉或脂肪组织，将编码可溶性SorCS1或SorCS1肽的质粒DNA传输给SorCS1基因剔除小鼠。将编码可溶性SorCS1或SorCS1肽的DNA转录到机体的蛋白质内，恢复SorCS1水平，由此治疗胰岛素抵抗。相同的方法可用于缺乏SorCS1的人或者治疗患者的症状显示出胰岛素抵抗的人。
实施例10：含有可溶性SorCS1或特异性SorCS1片段的基因传递载体在用于治疗胰岛素抵抗中的应用
为了克服使用质粒DNA或腺病毒来表达SorCS1(可溶性或特异性片段)的局限，使用专门的基因传递载体(GDVs)，该载体改善传递效率和细胞特异性同时预防免疫识别。产生了几种不同的GDV：A)将带有所需性能的细菌系用含有SorCS1的质粒运载体进行转化并扩增以产生GDV。B)将噬菌粒，一种内部带有噬菌体序列的改性细菌质粒，用作SorCS1的运载体并转化到细菌内。将细菌用复制缺陷型辅助噬菌体感染，产生用于将噬菌粒载体包装到噬菌体GDV内的必需基因。C)病毒表面蛋白在细胞培养物中产生并纯化为衣壳单体。然后，当该单体转运到促进病毒体装配的缓冲液中时，含有基因运送的SorCS1被包装到病毒体中。D)收集患者的红细胞并裂解以产生红细胞血影。在重新引入到患者之前，血影就是通过渗透压装载了含有SorCS1的基因运载体。E)收集并刺激来自患者的原代细胞，以产生外切体，然后在重新引入到患者之前，通过电解蛋白将它们纯化并装载含有SorCS1的基因运载体。
实施例12：表达可溶性SorCS1或特异性SorCS1片段的腺病毒在治疗胰岛素抵抗中的应用
表达可溶性SorCS1或特异性SorCS1的基因材料插入到腺相关的病毒载体中。选择腺相关的病毒载体，因为与含有病毒蛋白质全部补体的第一代腺病毒不同，这种病毒不编码病毒蛋白质，并且具有可忽略不计的毒性。此外，该病毒产生延长且稳定的转基因(SorCS1)表达，其降低了向患者反复注射病毒的需要。具体地，将编码可溶性SorCS1或SorCS1片段的DNA构建体插入腺相关的病毒载体中。该腺相关的病毒还伴随着带有导入细胞培养物中的辅助质粒并且大量腺相关病毒产生。最后，将1x1011腺相关的病毒颗粒注射到SorCS1基因剔除小鼠中。病毒表达的SorCS1治愈了基因剔除小鼠的胰岛素抵抗，并且该相同的方法用于治疗胰岛素抵抗的患者。
实施例13：过表达SorCS1的小鼠的产生
为了组织特异性诱导小鼠中的SorCS1表达，将一表达构建体通过同源重组引入ROSA基因座中，该表达构建体在lox-STOP-lox盒的上游含有CAAG启动子(鸡β-肌动蛋白/最小CMV)，接着是全长SorCS1的cDNA(所有剪接变体)或可溶性SorCS1的cDNA。为了促进表达，通过用以组织特异性方式表达Cre-重组酶的转基因小鼠进行杂交育种，将终止盒切除。或者，可将表达Cre的重组病毒施予小鼠，其含有CAAG启动子(鸡β-肌动蛋白/最小CMV)，lox-STOP-lox盒，接着是全长SorCS1(所有剪接变体)或可溶性SorCS1的cDNA，以分别诱导全长或可溶性SorCS1的表达。因此，通过将表达Cre的腺病毒注射到例如尾静脉内，实现肝脏表达。小鼠可用于但不限于筛选目的，用于测量诱导前后的葡萄糖和胰岛素水平以及胰岛素受体表达和磷酸化(例如葡萄糖耐受和胰岛素应变)。此外，该小鼠可与SorCS1基因剔除小鼠杂交，以便研究SorCS1过表达是否可以正常化或改善表型。
实施例13：过表达可溶性SorCS1的小鼠中血浆葡萄糖水平降低
为了考察SorCS1用于治疗胰岛素抵抗的用途，将野生型和SorCS1基因剔除雌性小鼠注射过表达可溶性SorCS1的腺病毒。表达人可溶性SorCS1(hsol.SorCS1)的重组腺病毒产生如下：pcDNA3.1/Zeo(-)/hsol。将编码人可溶性SorCS1 cDNA的SorCS1(氨基酸1-1100)用Pme1和Apa1消化，并且将编码hsolSorCS1的片段插入到穿梭质粒pVQpacAd5CMVK-NpA(ViraQuestInc，North Liberty，IA)中。然后，使用这种穿梭质粒来产生并增殖过表达hsol.SorCS1的腺病毒。将40周龄的雌性基因剔除和野生型小鼠禁食过夜。在第0天上午，通过眼眶采血获得血液样品，并且立刻在自动化监测仪上测量血浆葡萄糖(Ascentia Contour，Bayer)。小鼠随后在尾静脉注射带有hsol.SorCS1或LacZ(作为阴性对照)的2E9 pfu′腺病毒载体(ViraQuest Inc，North Liberty，IA)。在第7天，重复测量禁食过夜小鼠的血浆葡萄糖，以评估SorCS1和LacZ蛋白质的影响。如图17中显示，过表达可溶性SorCS1蛋白质的野生型和SorCS1基因剔除小鼠，二者都表现出血浆葡萄糖水平的显著降低(≈40％)。不出所料，在接受LacZ对照病毒的小鼠中没有观察到葡萄糖水平的显著降低。
实施例14：过表达可溶性SorCS1的SorCS1基因剔除小鼠中IR的表达和磷酸化及Glut4的表达
为了进一步考察SorCS1对胰岛素抵抗的影响，在过表达SorCS1的小鼠中测定胰岛素受体(IR)的表达、IR的磷酸化和葡萄糖转运体4型(Glut4)的表达。40周龄的雌性SorCS1基因剔除小鼠(-/-)注射表达hsol.SorCS1或LacZ(作为阴性对照)的腺病毒载体(见实施例13)。在注射病毒12天后，将小鼠禁食过夜，腹腔注射胰岛素(Novorapid，Novo Nordisk A/S)的无菌盐水溶液(10单位/kg体重)，并在15分钟后处死。将肌肉和脂肪组织摘除并在含有蛋白酶抑制剂(Complete Mini，Roche)和磷酸酶抑制剂(cocktail 1，SigmaAldrich)的裂解缓冲液TNE-缓冲液(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1％nonidet P-40，pH.8)中均质化。将裂解物以10.000 x g离心10分钟澄清，通过Bio-Rad蛋白质分析测定蛋白质浓度。在4-12％Bis-tris凝胶(Nupage，Invitrogen)上分离等量的不同样品的总蛋白(50μg)，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Amersham Pharmacia)上。用抗-IR(Santa Cruz Biotechnology，sc-711)、抗-IR-pY(R&D systems，AF2507)和抗-Glut4(Abcam，ab654)，通过western blotting分析上述膜。结合抗体通过Super Signal West Pico试剂(Pierce)和富士胶片LAS3000显影。与表达LacZ对照蛋白质的小鼠相比，在过表达可溶性SorCS1的SorCS1基因剔除小鼠的肌肉(图18A)和脂肪组织(图18B)中，IR、磷酸化IR和Glut4的量均增高，表明接受hsol.SorCS1病毒的小鼠的胰岛素敏感性增加。
实施例15：过表达SorCS1的糖尿病db/db雌性小鼠中血浆葡萄糖和胰岛素水平降低
为评估可溶性SorCS1在自发产生2型糖尿病的肥胖小鼠模型中的影响，使用db/db小鼠系(Taconic的BKS.Cg-m+/+Lprdb/BomTac)。这些小鼠缺乏瘦素受体，因此小鼠变得肥胖并产生胰岛素抵抗，并且最终在6-8周龄时产生严重的糖尿病。为了考察对血浆葡萄糖和胰岛素水平的影响，向小鼠注射表达hsol.SorCS1或LacZ(作为对照)的腺病毒(见实施例13)。具体地，将10周龄的db/db雌性小鼠禁食过夜。在第0天上午，将小鼠用乙醚麻醉，通过眼眶采血获得血液样品。立刻在自动监测仪(Ascentia Contour，Bayer)上测量血糖，并且用超灵敏的小鼠胰岛素酶联免疫检测试剂盒(DRG Diagnostics)测定血浆胰岛素水平。小鼠随后在尾静脉注射带有hsol.SorCS1或LacZ(作为阴性对照病毒)的2E9 pfu′腺病毒载体(ViraQuest Inc，North Liberty，IA)。在第7天，重复测量禁食过夜小鼠的血糖和血浆胰岛素，以评估SorCS1和LacZ蛋白质的影响。图19中的数据是各组中5只小鼠的平均值±SEM。在第7天，过表达可溶性SorCS1的db/db雌性小鼠与接受对照LacZ病毒的小鼠相比表现出血糖明显降低(≈35％)(图19A)。而且，在第7天，过表达可溶性SorCS1的db/db雌性小鼠与表达对照病毒的小鼠相比血浆胰岛素水平明显降低(图19B)。因此，可溶性SorCS1的过表达增加了2型糖尿病小鼠(db/db)模型的糖尿病状态。
实施例16：过度表达可溶性SorCS1的糖尿病db/db雌性小鼠中的葡萄糖糖耐受试验
为了考察对SorCS1葡萄糖耐受的影响，向雌性db/db小鼠注射表达可溶性SorCS1或LacZ的腺病毒(见实施例13)，在第3天禁食过夜(16h)。在第4天，小鼠腹腔注射葡萄糖的无菌盐水溶液推剂(2mg/g体重)。动物用乙醚麻醉，并在注射后0、15、30、90和150分钟时通过眼眶采血获得血液样品。采样后立刻在自动监测仪(Ascentia Contour，Bayer)上测量血糖水平。图20中的数据是每组中5只小鼠的平均值±SEM。图20中的结果显示，可溶性SorCS1的过表达使小鼠对胰岛素更敏感，在150分钟后血糖水平变正常(即与葡萄糖注射前相同)。相比之下，实验期间，表达LacZ的小鼠中的血糖水平在150分钟的过程中仍然增高。因此，这些结果显示过表达可溶性SorCS1的db/db雌性小鼠有较小的胰岛素抵抗。
实施例17：过表达可溶性SorCS1糖尿病db/db雄性小鼠中的空腹血糖和胰岛素水平
为评估可溶性SorCS1在自发产生2型糖尿病的肥胖小鼠模型中的影响，使用了db/db小鼠品系(来自Taconic的BKS.Cg-m+/+Lprdb/BomTac)。将小鼠注射表达hsol.SorCS1或LacZ(作为对照)的腺病毒(如实施例13)，以考察对血浆葡萄糖和胰岛素水平的影响。具体地，将6周龄的db/db雌性小鼠禁食过夜。在第0天上午，将小鼠用乙醚麻醉，通过眼眶采血获得血液样品。立刻在自动监测仪(Ascentia Contour，Bayer)上测量血糖，并且用超灵敏的小鼠胰岛素酶联免疫检测试剂盒(DRG Diagnostics)测定血浆胰岛素水平。小鼠随后在尾静脉注射带有hsol.SorCS1或LacZ(作为阴性对照)的2E9 pfu′腺病毒载体(ViraQuest Inc，North Liberty，IA)。在第7天，重复测量过夜禁食小鼠的血糖和血浆胰岛素，以评估SorCS1和LacZ蛋白质的影响。图21中的数据是各组中5只小鼠的平均值±SEM。在第7天，过表达可溶性SorCS1的db/db雄性小鼠与接受对照LacZ病毒的小鼠相比表现出血糖的明显降低(≈35％)(图21A)。因为与接受对照LacZ病毒的小鼠相比，血糖水平的下降并不是由胰岛素浓度增加引起(图21B)，结论是SorCS1的过表达改善了雄性2型糖尿病db/db小鼠的糖尿病状态。
实施例18：过量表达可溶性SorCS1的db/db雄性小鼠的肌肉组织中Glut4的亚细胞定位
为了评估可溶性SorCS1过表达是否可改变Glut4的分布，对过表达可溶性SorCS1的db/db雄性小鼠的肌肉组织进行亚细胞分级。具体地，将6周龄的db/db小鼠在尾静脉注射表达hsol.SorCS1或LacZ(作为对照)的腺病毒载体(见实施例13)。病毒注射后第7天，小鼠禁食过夜，腹腔注射胰岛素(Novorapid，Novo Nordisk A/S)无菌盐水溶液(10单位/kg体重)，并于15分钟后处死。将注射相同病毒的5只小鼠的肌肉组织摘除、剥离并转移到5mlHEPES-缓冲蔗糖(0.25M sucrose，1mM EDTA，20mM HEPES-KOH，pH 7.4)，用聚四氟乙烯通过10杵上下杵动均质化，并以1000 x g离心10分钟。因此，通过几轮离心，获得重线粒体、轻线粒体和微粒体部分。首先，将上清液以3.000 x g离心10分钟，然后将所得的上清液以16.000 x g离心10分钟，最后将所得的上清液以100.000 x g离心45分钟，得到含有微粒体部分的微球(pellet)。微粒体部分重悬于0.5ml HEPES-缓冲溶液中并进行蔗糖(速率)梯度离心。0.5ml微粒样品上样于1M HEPES，pH 7.2中的12ml线性0.8M至1.6M蔗糖梯度上，并在水平转子中(SW41 Ti)以84.000 x g离心18h。每个梯度从管的顶部开始分成24个部分。最后，凝胶电泳和Western blotting分析不同部分中Glut4的表达。图22中的结果显示，过表达SorCS1的肌肉组织中Glut4的沉淀分布(下板)不同于表达对照蛋白质lacZ的肌肉组织(上板)。因此，db/db雄性小鼠中可溶性SorCS1的过表达可改变Glut4的分布，从而调节葡萄糖摄取。
实施例19：通过PCR分析SorCS1基因剔除小鼠的脂肪组织的基因表达谱
为了考察SorCS1基因剔除小鼠的基因表达谱，用微阵列分析测定与小鼠胰岛素信号通路相关的84个基因以及与小鼠脂蛋白信号及胆固醇代谢相关的84个基因的表达。微阵列分析是用来自SorCS1基因剔除野生型肥胖小鼠的脂肪组织的RNA来进行。实践中，第一链cDNA由50周龄的雌性小鼠(n＝3)SorCS1基因剔除(-/-)和野生型(+/+)脂肪组织中的总RNA(应用生命系统)合成。然后，小鼠胰岛素信号通路(PAMM-030A RT2 Profiler PCR阵列)的超阵列或B)型小鼠脂蛋白信号&胆固醇代谢(PAMM-080-A RT2 Profiler PCRarrays)是用ABI7900平台(应用生命系统)和SYBR Green/Rox PCR(SABiosciences)处理。用AROS应用生物技术(奥尔胡斯，丹麦)完成该表达分析。上表中列出了与野生型小鼠相比，SorCS1基因剔除小鼠中显示上或下调表达超过3倍的基因，并且下表中显示了它们的已知功能。图24的数据显示，与野生型小鼠相比，几种基因的表达在SorCS1基因剔除小鼠中发生变化，表明SorCS1基因剔除小鼠中胰岛素和胆固醇信号通路和代谢发生了改变。
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20.WO 2004/022719(Attie et al.)
序列表概述
SEQ ID NO 1：Homo sapiens preproSorCS1b(同工型1)
SEQ ID NO 2：Homo sapiens preproSorCS1(同工型2)
SEQ ID NO 3：Homo sapiens preproSorCS1c(同工型3)
SEQ ID NO 4：Homo sapiens preproSorCS1a(同工型4)
SEQ ID NO 5：Soluble Homo sapiens preproSorCS1
SEQ ID NO 6：Homo sapiens proSorCS1b(同工型1)
SEQ ID NO 7：Homo sapiens proSorCS1(同工型2)
SEQ ID NO 8：Homo sapiens proSorCS1c(同工型3)
SEQ ID NO 9：Homo sapiens proSorCS1a(同工型4)
SEQ ID NO 10：可溶性Homo sapiens proSorCS1
SEQ ID NO 11：Homo sapiens成熟SorCS1b(同工型1)
SEQ ID NO 12：Homo sapiens成熟SorCS1(同工型2)
SEQ ID NO 13：Homo sapiens成熟SorCS1c(同工型3)
SEQ ID NO 14：Homo sapiens成熟SorCS1a(同工型4)
SEQ ID NO 15：可溶性Homo sapiens成熟SorCS1
SEQ ID NO 16：小鼠preproSorCS1b(同工型1)
SEQ ID NO 17：小鼠preproSorCS1a(同工型2)
SEQ ID NO 18：小鼠preproSorCS1c(同工型3)
SEQ ID NO 19：小鼠preproSorCS1c+(同工型4)
SEQ ID NO 20：小鼠preproSorCS1d
SEQ ID NO 21：可溶性mouse preproSorCS1
SEQ ID NO 22：小鼠proSorCS1b(同工型1)
SEQ ID NO 23：小鼠proSorCS1a(同工型2)
SEQ ID NO 24：小鼠proSorCS1c(同工型3)
SEQ ID NO 25：小鼠proSorCS1c+(同工型4)
SEQ ID NO 26：小鼠proSorCS1d
SEQ ID NO 27：可溶性小鼠proSorCS1
SEQ ID NO 28：小鼠成熟SorCS1b(同工型1)
SEQ ID NO 29：小鼠成熟SorCS1a(同工型2)
SEQ ID NO 30：小鼠成熟SorCS1c(同工型3)
SEQ ID NO 31：小鼠成熟SorCS1c+(同工型4)
SEQ ID NO 32：小鼠成熟SorCS1d
SEQ ID NO 33：可溶性小鼠成熟SorCS1
SEQ ID NO 34：黑猩猩preproSorCS1
SEQ ID NO 35：黑猩猩proSorCS1
SEQ ID NO 36：黑猩猩成熟SorCS1
SEQ ID NO 37：黑猩猩可溶性SorCS1
SEQ ID NO 38：狗成熟SorCS1
SEQ ID NO 39：狗可溶性SorCS1
SEQ ID NO 40：乳牛preproSorCS1
SEQ ID NO 41：乳牛proSorCS1
SEQ ID NO 42：乳牛成熟SorCS1
SEQ ID NO 43：乳牛可溶性SorCS1
SEQ ID NO 44：大鼠preproSorSC1
SEQ ID NO 45：大鼠proSorCS1
SEQ ID NO 46：大鼠成熟SorCS1
SEQ ID NO 47：大鼠可溶性SorCS1
SEQ ID NO 48：鸡preproSorCS1
SEQ ID NO 49：鸡proSorCS1
SEQ ID NO 50：鸡成熟SorCS1
SEQ ID NO 51：鸡可溶性SorCS1
SEQ ID NO 52：Homo sapiens Sortilin
SEQ ID NO 53：Homo sapiens SorLA
SEQ ID NO 54：Homo sapiens SorCS2
SEQ ID NO 55：Homo sapiens SorCS3
SEQ ID NO 56：Homo sapiens人胰岛素受体(IR)
SEQ ID NO：57
SorCS1(ex24)，正向引物
5′-AAGTCTCTGCTGGGAACGCCATACTGCAAG-3
SEQ ID NO：58
SorCS1(ex24)，反向引物
5′-GTGGACAAGAACTTGGACGCCAGGCTTCAG-3
SEQ ID NO：59
SorCS1-a(ex25)，正向引物
5′-AAGTCTCTGCTGGGAACGCCATACTGCAAG-3
SEQ ID NO：60
SorCS1-a(ex25)，反向引物
5′-TATTGCTTCTGAACCTGGCAGAAAGAGGAG-3′
SEQ ID NO：61
SorCS1-b(ex27)，正向引物
5′-AAGTCTCTGCTGGGAACGCCATACTGCAAG-3
SEQ ID NO：62
SorCS1-b(ex27)，反向引物
5′-GCTTTGGCGATGAAGGTGGAGTTGCTGGCT-3′
SEQ ID NO：63
SorCS1-c(ex26)，正向引物
5′-AAGTCTCTGCTGGGAACGCCATACTGCAAG-3
SEQ ID NO：64
SorCS1-c(ex26)，反向引物
5′-CAGGGTGAGGGACACTGGGCCTGCTTTCAG-3
SEQ ID NO：65
SorCS1-d(ex28)，正向引物
5′-AAGTCTCTGCTGGGAACGCCATACTGCAAG-3
SEQ ID NO：66
SorCS1-d(ex28)，反向引物
5′-CGGATCTCTTGGAACTGAAGTTACAGATGCTTG-3
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Claims (71)

1.一种治疗个体中胰岛素抵抗和/或与胰岛素抵抗相关疾病的SorCS1样药剂，其中所述药剂能够与胰岛素受体在SorCS1结合位点结合并且能够敏化胰岛素受体。
2.如权利要求1所述的药剂，其中所述胰岛素受体是人胰岛素受体。
3.如前面任一项权利要求所述的药剂，其中所述胰岛素受体上的结合位点是包括如下限定的一个或多个序列的肽的结合位点：
SEQ ID NO：1氨基酸103-124
SEQ ID NO：1氨基酸125-143
SEQ ID NO：1氨基酸144-162
SEQ ID NO：1氨基酸197-218
SEQ ID NO：1氨基酸391-409
SEQ ID NO：1氨基酸661-684
SEQ ID NO：1氨基酸763-783
SEQ ID NO：1氨基酸859-876。
4.如前面任一项权利要求所述的药剂，其中所述胰岛素受体上的结合位点包括如下限定的一个或多个序列：
SEQ ID NO：56氨基酸100-120
SEQ ID NO：56氨基酸127-150
SEQ ID NO：56氨基酸284-310
SEQ ID NO：56氨基酸362-379
SEQ ID NO：56氨基酸593-610
SEQ ID NO：56氨基酸629-652
SEQ ID NO：56氨基酸749-772。
5.如前面任一项权利要求所述的药剂，其中所述药剂选自：
j)分离的SorCS1多肽，选自：
iv)氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51；
v)a)的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与所述SEQID NO：1具有至少70％的序列同一性；或
vi)i或ii任一项的生物活性片段，其中所述片段包括a)至b)任一项的至少5个连续氨基酸，并且在至少5个氨基酸的重叠范围中与所述SEQ IDNO：1具有至少70％的序列同一性，其中所述生物活性是敏化胰岛素受体。
6.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽是选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51的序列的天然产生的等位基因变体。
7.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽包括选自SEQ ID NO：5、10、15、21、27、33、37、39、43和47的氨基酸序列。
8.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽是其中所述的变体多肽，其中在选择的序列中指定的任意氨基酸被改变以提供保守性替代。
9.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽与具有选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51的序列的蛋白质有至少70％的序列同一性。
10.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽与具有选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51的序列的蛋白质有至少75％的序列同一性。
11.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽与具有选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51的序列的蛋白质有至少80％的序列同一性。
12.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽与具有选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51的序列的蛋白质有至少85％的序列同一性。
13.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽与具有选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51的序列的蛋白质有至少90％的序列同一性。
14.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽与具有选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51的序列的蛋白质有至少95％的序列同一性。
15.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽与具有选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51的序列的蛋白质有至少98％的序列同一性。
16.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽与具有选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51的序列的蛋白质有至少99％的序列同一性。
17.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽选自SEQ ID NO：1、2、3、4、6、7、8、9、11、12、13、14。
18.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽选自SEQ ID NO：16、17、18、19、20、22、26、28、29、30、31和32。
19.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽是被糖基化的。
20.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽是在氨基酸残基位点184、352、433、765、776、816、847、908和929处被糖基化的。
21.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽是可溶性多肽，是权利要求17所述序列的片段。
22.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述糖基化片段具有选自SEQ ID NO：5、10和15的序列。
23.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽是在氨基酸残基位点184，352，433，775，815，846，907和929处被糖基化的。
24.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽是可溶性多肽，是权利要求18所述序列的片段。
25.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述糖基化片段具有选自SEQ ID NO：21、27和33的序列。
26.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽包括以下的一个或多个序列：
SEQ ID NO：1氨基酸103-124
SEQ ID NO：1氨基酸125-143
SEQ ID NO：1氨基酸144-162
SEQ ID NO：1氨基酸197-218
SEQ ID NO：1氨基酸391-409
SEQ ID NO：1氨基酸661-684
SEQ ID NO：1氨基酸763-783
SEQ ID NO：1氨基酸859-876
或它们的变体，其中所述变体与所述一个或多个序列具有至少70％的序列同一性。
27.如前面任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽能够形成至少一个分子内胱氨酸桥。
28.如前面任一项权利要求所述的多肽，包括通过至少一个分子内胱氨酸桥连接的所述蛋白质的二聚体。
29.如前面任一项权利要求所述的多肽，进一步包括一亲和标签，例如多聚组氨酸标签、GST标签、HA标签、Flag标签、C-myc标签、HSV标签、V5标签、麦芽糖结合蛋白标签、纤维素结合域标签。
30.如前面任一项权利要求所述的药剂，其中所述药剂选自抗体、反义RNA、反义DNA、有机小分子和siRNA。
31.如权利要求30所述的药剂，其中所述抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、源化抗体、单链抗体、重组抗体。
32.如权利要求30或31所述的药剂，其中所述抗体是抗胰岛素受体抗体。
33.一种核酸序列，编码如权利要求5-32任一项限定的多肽，用于治疗个体中胰岛素抵抗或者与胰岛素抵抗相关的疾病。
34.一种载体，包括如权利要求33限定的至少一个核酸分子，用于治疗个体中胰岛素抵抗或者与胰岛素抵抗相关的疾病。
35.如权利要求34所述的载体，进一步包括有效地与所述核酸分子连接的启动子。
36.如权利要求35所述的载体，其中所述启动子选自CMV、人UbiC、RSV、Tet-可调控启动子、Mo-MLV-LTR、Mx1、EF-1α、PDGFβ和CaMK II。
37.如权利要求34至36所述的载体，其中所述载体选自源自逆转录病毒科家族的载体，包括慢病毒、HIV、SIV、FIV、EAIV、CIV。
38.如权利要求34至37所述的载体，其中所述载体选自甲病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、单纯疱疹病毒、冠状病毒、牛乳头状瘤病毒、Mo-MLV，优选腺相关病毒。
39.一种分离的宿主细胞，所述宿主细胞是用权利要求34至38任一项的至少一种载体转化或转导，用于治疗个体中胰岛素抵抗或者与胰岛素抵抗相关的疾病。
40.如权利要求39所述的分离的宿主细胞，所述宿主细胞选自酿酒酵母、大肠杆菌、曲霉和Sf9昆虫细胞。
41.如权利要求40所述的分离的宿主细胞，所述宿主细胞选自人、猫、猪、猴、狗、小鼠和大鼠的哺乳动物细胞。
42.如权利要求41所述的分离的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞选自肌肉细胞、肝细胞、脂肪细胞和胰腺细胞、如α细胞、β细胞和δ细胞。
43.如权利要求41或42所述的分离的宿主细胞，所述宿主细胞选自CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b和BHK细胞。
44.一种能够产生感染病毒颗粒的包装细胞系，用于治疗个体中胰岛素抵抗或者与胰岛素抵抗相关的疾病，所述病毒颗粒包括源自逆转录病毒的基因组，包括5’逆转录病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、可操作地连接编码权利要求4至32任一项所述多肽的多核苷酸序列的启动子、第二链DNA合成的源、以及3’逆转录病毒LTR。
45.如权利要求44所述的包装细胞系，其中所述基因组源自慢病毒，并且LTR是慢病毒。
46.一种治疗胰岛素抵抗或与胰岛素抵抗相关的疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体施予治疗有效量的：
a)权利要求1至32任一项所述的药剂；或
b)权利要求33所述的分离的核酸序列；或
c)权利要求34至38任一项所述的表达载体；或
d)权利要求39至43任一项所述的宿主细胞的组分；或
e)权利要求44至45任一项所述的包装细胞系，或
f)a)至e)任两项或更多项的结合。
47.一种在有需要的个体中上调胰岛素受体或其片段或变体的方法，所述方法包括施予治疗有效量的：
a)权利要求1至32任一项所述的药剂；或
b)权利要求33所述的分离的核酸序列；或
c)权利要求34至38任一项所述的表达载体；或
d)权利要求39至43任一项所述的宿主细胞的组分；或
e)权利要求44至45任一项所述的包装细胞系，或
f)a)至e)任两项或更多项的结合。
48.一种药物组合物，包括以下一项或多项的结合：
a)权利要求1至32任一项所述的药剂；或
b)权利要求33所述的分离的核酸序列；或
c)权利要求34至38任一项所述的表达载体；或
d)权利要求39至43任一项所述的宿主细胞的组分；或
e)权利要求44至45任一项所述的包装细胞系，或
f)a)至e)任两项或更多项的结合。
49.如权利要求48所述的药物组合物，包括第二活性成分。
50.如权利要求48至49所述的药物组合物，包括药学上可接受的载体。
51.如权利要求48至50任一项所述的药物组合物，其中所述组合物的pH为pH 4和pH 10之间。
52.如权利要求48至51任一项所述的药物组合物，其被配制为通过注射、栓剂、口服、舌下含片或喷剂、经皮给药、吸入给药或用植入的生物相容性胶囊局部给药。
53.如权利要求52所述的药物组合物，其中所述注射包括椎管内静脉注射、肌肉注射、脊柱注射、腹腔注射、皮下注射，经推注或连续给药。
54.如权利要求48至53任一项所述的药物组合物，其中给药以间隔30分钟至24小时进行。
55.如权利要求48至54任一项所述的药物组合物，其中给药以间隔1至6小时进行。
56.如权利要求48至55任一项所述的药物组合物，其中治疗的持续期为6至72小时。
57.如权利要求48至56任一项所述的药物组合物，其中治疗的持续期为终生。
58.如权利要求48至57任一项所述的药物组合物，其中活性成分的剂量为10μg至500mg/kg体重之间。
59.一种敏化胰岛素受体的方法，所述方法包括向胰岛素受体或个体施予选自如下的Vps10p-域受体：
a)SorCS1
b)SorCS2
c)SorCS3
d)分选蛋白，和
e)SorLA，
或它们的生物活性片段。
60.如权利要求1-32任一项所述的药剂，如权利要求33所述的核酸，如权利要求34-38任一项所述的载体，如权利要求39-43任一项所述的宿主细胞，如权利要求44-45任一项所述的包装细胞系，如权利要求46-47任一项所述的方法，或者如权利要求48至58任一项所述的药物组合物，其中所述与胰岛素抵抗相关的疾病选自胰岛素抵抗综合征、2型糖尿病、糖耐受受损、代谢综合征、高血糖、高胰岛素血症、动脉硬化、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高脂血症、血脂异常、肥胖、中心性肥胖、多囊卵巢综合征、血凝过快、高血压、微量白蛋白尿、以及它们的任意结合。
61.如权利要求60所述的药剂，其中所述与胰岛素抵抗相关的疾病选自胰岛素抵抗综合征、2型糖尿病、糖耐受受损、代谢综合征、高血糖、高胰岛素血症。
62.一套试剂盒，包括：
-如权利要求48至58任一项所限定的药物组合物，
-用于施加所述药物组合物的医疗器械或其他工具，
-关于如何使用该套试剂盒的说明。
63.如权利要求62所述的一套试剂盒，包括第二活性成分。
64.一种转基因的基因剔除小鼠，其中内源性Vps10p-域受体SorCS1基因被打断以消除功能性SorCS1受体的表达，并且其中所述小鼠相对于非转基因对照小鼠表现出对胰岛素的反应减小。
65.如权利要求64所述的转基因小鼠，其中所述打断包括在外域、跨膜结构域、或细胞质域缺失编码起始密码子的SorCS1受体基因核苷酸序列或小鼠SorCS1受体区域。
66.一种筛选权利要求1所述的SorCS1样药剂降低血糖水平的能力的方法，其中所述方法包括步骤：
f)提供权利要求64的第一和第二转基因小鼠；
g)向所述第一转基因小鼠施予候选药剂，和
h)向所述第二转基因小鼠施予生理溶液，和
i)施予所述药剂后，在预定的时间间隔，如15分钟、30分钟、60分钟、2和4小时，分别采取小鼠b)和c)的血液样品，和
j)比较d)的样品中的血糖水平；其中施予所述候选药剂的所述第一转基因小鼠的血糖水平相对于未施予所述候选药剂的所述第二转基因小鼠降低，表明所述候选药剂降低了血糖水平。
67.一种筛选权利要求1所述SorCS1样药剂降低血糖水平的能力的方法，其中所述方法包括步骤：
f)提供第一和第二野生型小鼠；和
g)向所述第一小鼠施予权利要求1所述的药剂，和
h)向所述第二小鼠施予生理溶液，和
i)施予所述药剂后，在预定的时间间隔，如15分钟、30分钟、60分钟、2和4小时，分别采取小鼠b)和c)的血液样品，和
j)比较d)的样品中的血浆葡萄糖水平；其中施予所述候选药剂的所述第一野生型小鼠的血糖水平相对于未施予所述候选药剂的所述第二野生型小鼠降低，表明所述候选药剂降低了血糖水平。
68.一种转基因小鼠，其一旦表达激活后，能够以组织特异性方式编码可溶性和/或全长SorCS1。
69.如权利要求68所述的小鼠，其中所述组织选自肝脏、肌肉、胰腺和脂肪组织。
70.能够增强SorCS1或其片段或变体与胰岛素受体之间的结合活性的药剂在用于治疗胰岛素抵抗和/或与胰岛素抵抗相关的疾病中的用途。
71.如权利要求70所述的药剂，其中所述药剂选自多肽、抗体、反义RNA、反义DNA、有机小分子和siRNA。
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