CN102596243B

CN102596243B - 纳米乳剂疫苗

Info

Publication number: CN102596243B
Application number: CN201080036364.5A
Authority: CN
Inventors: N.W.卢卡茨; D.M.林德尔; J.R.小巴克
Original assignee: University of Michigan Ann Arbor
Current assignee: University of Michigan Ann Arbor
Priority date: 2009-06-16
Filing date: 2010-06-16
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2030-06-16
Also published as: HK1173661A1; EP2442827A4; EP2442827A1; JP6110140B2; CA2765511C; JP2012530146A; JP6122083B2; BRPI1014031A2; CN102596243A; EP3020412A1; EP2442827B1; US20100316673A1; WO2010148111A1; ES2566646T3; CA2765511A1; JP2016026202A; EP3020412B1

Abstract

本发明提供了用于免疫应答刺激的方法和组合物。具体而言，本发明提供了免疫原性纳米乳剂组合物和使用其诱导针对副粘病毒科的致病性病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）））的免疫应答（例如免疫（例如保护性免疫））的方法。本发明的组合物和方法尤其在临床（例如治疗和预防医学（例如接种疫苗））和研究应用中有用。

Description

纳米乳剂疫苗

本申请要求于2009年6月16日提交的美国临时专利申请系列号61/187,529的优先权，其在此整体引入作为参考。

发明领域

本发明提供了用于免疫应答刺激的方法和组合物。具体而言，本发明提供了免疫原性组合物和使用其诱导针对副粘病毒科（paramyxoviridae）的致病性病毒（例如副粘病毒亚科（Paramyxovirinae）病毒（例如副粘病毒属（Paramyxovirus）、腮腺炎病毒属（Rubulavirus）和/或麻疹病毒属（Morbillivirus））和/或肺炎病毒亚科（Pneumovirinae）病毒（例如呼吸道合胞病毒）））的免疫应答（例如免疫（例如保护性免疫））的方法。本发明的组合物和方法尤其在临床（例如治疗和预防医学（例如接种疫苗））和研究应用中有用。

发明背景

免疫接种是用于改善人们健康的主要特征。尽管针对许多常见病的多种成功疫苗的可利用性，传染病仍是健康问题和死亡的主因。在现有疫苗中固有的显著问题包括关于反复免疫接种的需要，和目前疫苗递送系统对于广谱疾病的无效。

为了开发针对已抗拒疫苗发展的病原体的疫苗和/或克服商购可得疫苗的缺点（例如由于不利结果、费用、复杂性和/或利用不足（underutilization）），必须开发抗原呈递的新方法，其允许更少的免疫接种、更有效的使用和/或对于疫苗的更少副作用。

发明概述

本发明提供了用于免疫应答刺激的方法和组合物。具体而言，本发明提供了免疫原性组合物和使用其诱导针对副粘病毒科的致病性病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）））的免疫应答（例如免疫（例如保护性免疫））的方法。本发明的组合物和方法尤其在临床（例如治疗和预防医学（例如接种疫苗））和研究应用中有用。

在一些实施方案中，本发明提供了包含纳米乳剂（nanoemulsion）灭活的免疫原（例如副粘病毒科的致病性病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）））的免疫原性组合物，所述纳米乳剂包含水相、油相和溶剂。在一些实施方案中，免疫原包含副粘病毒科的致病性病毒（例如灭活的RSV（例如使用本发明的乳剂或通过其他方式灭活的）。在一些实施方案中，RNA病毒是副粘病毒科的病毒。例如，在一些实施方案中，病毒是副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）。在一些实施方案中，病毒是肺炎病毒亚科病毒。在优选实施方案中，病毒是呼吸道合胞病毒（RSV）。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含纳米乳剂灭活的RSV。在一些实施方案中，纳米乳剂是W₈₀5EC，尽管本发明并不限于其。例如，在一些实施方案中，纳米乳剂选自本文描述的纳米乳剂制剂之一。在一些实施方案中，组合物包含1-50％纳米乳剂溶液，尽管更多和更少的量也在本发明中有用。例如，在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约1.0％- 10％、约10％-20％、约20％- 30％、约30％-40％、约40％- 50％、约50％-60％或更多纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约10％纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约15％纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约20％纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约12％纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约8％纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约5％纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约2％纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约1％纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物（例如施用于受试者以在受试者中生成免疫应答）包含2x10⁶噬斑形成单位（PFU）的副粘病毒科的灭活致病性病毒（例如RSV），尽管也可以利用更多（例如约4x10⁶ PFU、8x10⁶ PFU、1x10⁷ PFU、2x10⁷ PFU、4x10⁷ PFU、8x10⁷ PFU、1x10⁸ PFU、1x10⁹ PFU或更多PFU的通过纳米乳剂灭活的RSV）和更少（例如约1x10⁶ PFU、5x10⁵ PFU、1x10⁵ PFU、5x10⁴ PFU、1x10⁴ PFU、5x10³ PFU、1x10³ PFU或更少PFU的通过纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒（例如RSV））量。在一些实施方案中，组合物是稳定的（例如在室温（例如达12小时、1天、2天、3天、4天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、1年或更多）。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含药学可接受的载体。本发明并不限于任何具体药学可接受的载体。实际上，可以利用任何合适的载体，包括但不限于本文描述的那些。在一些实施方案中，免疫原性组合物进一步包含佐剂。本发明并不限于任何具体佐剂，并且本文描述的任何一种或多种佐剂在本发明的组合物中有用，包括但不限于偏向Th1免疫应答的佐剂。在一些实施方案中，免疫原包含病原体产物（例如包括但不限于衍生自病原体的蛋白质、肽、多肽、核酸、多糖或膜组分）。在一些实施方案中，免疫原和纳米乳剂在单一容器中组合。

在一些实施方案中，本发明提供了在受试者中诱导针对副粘病毒科的致病性病毒（例如呼吸道合胞病毒（RSV））的免疫应答的方法，其包括：提供包含纳米乳剂和免疫原的免疫原性组合物，其中所述免疫原包含通过纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）））；和在这样的条件下给受试者施用组合物，从而使得受试者生成针对病毒的免疫应答。本发明并不受选择用于施用本发明的组合物的途径的限制。在一些实施方案中，施用免疫原性组合物包含使受试者的粘膜表面与组合物接触。在一些实施方案中，粘膜表面包含鼻粘膜。在一些实施方案中，诱导免疫应答在受试者中诱导针对副粘病毒科的病毒（例如RSV）的免疫。在一些实施方案中，免疫包含全身免疫。在一些实施方案中，免疫包含粘膜免疫。在一些实施方案中，免疫应答包含在受试者中增加的IFN-γ表达。在一些实施方案中，免疫应答包含在受试者中增加的IL-17表达。在一些实施方案中，免疫应答包含增加的Th2型细胞因子（例如IL-4、IL-5和IL-13）表达的不存在。在一些实施方案中，免疫应答包含针对副粘病毒科的灭活的病毒（例如RSV）的全身IgG应答。在一些实施方案中，通过纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒（例如RSV）在这样的条件下施用于受试者，从而使得10 - 10³噬斑形成单位（PFU）的灭活的病毒存在于施用于受试者的剂量中，尽管也可以利用更多（例如约10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸ 或更多）和更少（例如约1-10或更少）PFU的通过纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒（例如RSV）。在一些实施方案中，15％纳米乳剂溶液用于灭活病毒。在一些实施方案中，纳米乳剂包含W₈₀5EC。在一些实施方案中，免疫保护受试者免于展示出通过副粘病毒科的病毒（例如RSV）引起的疾病的病征或症状。在一些实施方案中，免疫保护受试者免于由后续暴露于副粘病毒科的活病毒（例如RSV）的攻击。在一些实施方案中，组合物进一步包含佐剂。在一些实施方案中，受试者是人。

在一些实施方案中，诱导免疫应答在受试者中诱导针对副粘病毒科的病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）））的免疫。在一些实施方案中，诱导针对副粘病毒科的病毒（例如RSV）的免疫包含全身免疫。在一些实施方案中，免疫包含粘膜免疫。在一些实施方案中，免疫应答包含受试者中增加的IFN-γ表达。在一些实施方案中，免疫应答包含受试者中增加的IL-17或其他类型Th1细胞因子表达。在一些实施方案中，免疫应答包含针对免疫原的全身IgG应答。在一些实施方案中，免疫应答包含针对免疫原的粘膜IgA应答。在一些实施方案中，每个剂量包含副粘病毒科的纳米乳剂灭活的病毒（例如RSV）的量，其足以生成针对病毒的免疫应答。副粘病毒科的病毒（例如RSV）的有效量是无需进行定量的剂量，只要当施用于受试者时，副粘病毒科的病毒（例如RSV）的量在受试者中生成免疫应答。在一些实施方案中，当本发明的纳米乳剂用于灭活副粘病毒科的活病毒（例如RSV）时，预期每个剂量（例如施用于受试者以诱导免疫应答））包含10 - 10¹⁰ pfu病毒/剂量；在一些实施方案中，每个剂量包含10⁵ - 10⁸pfu病毒/剂量；在一些实施方案中，每个剂量包含10³ - 10⁵pfu病毒/剂量；在一些实施方案中，每个剂量包含10² - 10⁴pfu病毒/剂量；在一些实施方案中，每个剂量包含10 pfu病毒/剂量；在一些实施方案中，每个剂量包含10²pfu病毒/剂量；并且在一些实施方案中，每个剂量包含10⁴pfu病毒/剂量。在一些实施方案中，每个剂量包含超过10¹⁰pfu病毒/剂量。在一些优选实施方案中，每个剂量包含10³pfu病毒/剂量。

本发明并不限于任何具体纳米乳剂组合物。实际上，本文描述了在本发明中有用的多种纳米乳剂组合物。类似地，本发明并不限于纳米乳剂中存在的具体油。预期了多种油，包括但不限于大豆、鳄梨、角鲨烯、橄榄、低芥酸菜子、玉米、油菜籽、红花、向日葵、鱼、香料和水不溶性维生素。本发明也不限于具体溶剂。预期了多种溶剂，包括但不限于醇（例如包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和辛醇）、甘油、聚乙二醇和基于有机磷酸酯的溶剂。包括油、溶剂及其他的纳米乳剂组分在下文进一步详细描述。

在一些实施方案中，乳剂进一步包含表面活性剂。本发明并不限于具体表面活性剂。预期了多种表面活性剂，包括但不限于非离子和离子型表面活性剂（例如TRITON X-100；TWEEN 20；和TYLOXAPOL）。

在某些实施方案中，乳剂进一步包括阳离子含卤素化合物。本发明并不限于具体阳离子含卤素化合物。预期了多种阳离子含卤素化合物，包括但不限于十六烷基卤化吡啶、十六烷基三甲基卤化铵、十六烷基二甲基乙基卤化铵、十六烷基二甲基苄基卤化铵、十六烷基三丁基卤化、十二烷基三甲基卤化铵和十四烷基三甲基卤化铵。本发明并不限于具体卤化物。预期了多种卤化物，包括但不限于选自氯化物、氟化物、溴化物和碘化物的卤化物。

在再进一步的实施方案中，乳剂进一步包括含季铵化合物。本发明并不限于具体含季铵化合物。预期了多种含季铵化合物，包括但不限于烷基二甲基苄基氯化铵、二烷基二甲基苄基氯化铵、n-烷基二甲基苄基氯化铵、n-烷基二甲基乙基苄基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵和n-烷基二甲基苄基氯化铵。

在一些实施方案中，本发明提供了包含免疫原性组合物的疫苗，所述免疫原性组合物包含通过纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒（例如RSV）。在一些实施方案中，本发明提供了包含疫苗的试剂盒，所述疫苗包含乳剂和包含通过纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒（例如RSV）的免疫原性组合物，所述乳剂包含水相、油相和溶剂。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含关于使用试剂盒用于针对副粘病毒科的病毒（例如RSV）给受试者接种疫苗的说明书。

在再进一步的实施方案中，本发明提供了诱导针对副粘病毒科的一种或多种病毒（例如RSV）的免疫的方法，其包括提供包含水相、油相和溶剂的乳剂；和副粘病毒科的一种或多种病毒（例如RSV）；组合乳剂与副粘病毒科的一种或多种病毒（例如RSV），以生成疫苗组合物；和给受试者施用疫苗组合物。在一些实施方案中，施用包含使疫苗组合物与受试者的粘膜表面接触。例如，在一些实施方案中，施用包含鼻内施用。在一些优选实施方案中，施用在这样的条件下发生，从而使得受试者生成针对副粘病毒科的一种或多种病毒（例如RSV）的免疫（例如经由生成针对一种或多种免疫原的体液免疫应答）。

本发明并不受生成的免疫应答的性质的限制（例如包含通过纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒（例如RSV）的免疫原性组合物的施用后。实际上，多种免疫应答可以在施用组合物的受试者中生成且测量，所述组合物包含纳米乳剂和通过本发明的纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒（例如RSV），包括但不限于免疫系统的细胞（例如B细胞、T细胞、树突细胞、抗原呈递细胞（APCs）、巨噬细胞、天然杀伤（NK）细胞等）的活化、增殖或分化；标记和细胞因子的上调或下调的表达；IgA、IgM和/或IgG滴度的刺激；脾大（例如增加的脾细胞构成）；各种器官中的增生、混合细胞浸润、和/或免疫系统的其他应答（例如细胞的），其可以就本领域已知的免疫刺激而言进行评估。在一些实施方案中，施用包含使受试者的粘膜表面与组合物接触。本发明并不受接触的粘膜表面的限制。在一些优选实施方案中，粘膜表面包含鼻粘膜。在一些实施方案中，粘膜表面包含阴道粘膜。在一些实施方案中，施用包含肠胃外施用。本发明并不受选择用于施用本发明的组合物的途径的限制。在一些实施方案中，诱导免疫应答在受试者中诱导针对副粘病毒科的一种或多种病毒（例如RSV）的免疫。在一些实施方案中，免疫包含全身免疫。在一些实施方案中，免疫包含粘膜免疫。在一些实施方案中，免疫应答包含受试者中增加的IFN-γ和/或IL-17表达。在一些实施方案中，免疫应答包含全身IgG应答。在一些实施方案中，免疫应答包含粘膜IgA应答。在一些实施方案中，组合物包含15％纳米乳剂溶液。然而，本发明并不限于纳米乳剂的这个量（例如百分比）。例如，在一些实施方案中，组合物包含小于10％纳米乳剂（例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％）。在一些实施方案中，组合物包含超过10％纳米乳剂（例如12％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％或更多）。在一些实施方案中，本发明的组合物包含本文描述的任何纳米乳剂。在一些实施方案中，纳米乳剂包含W₂₀5EC。在一些优选实施方案中，纳米乳剂包含W₈₀5EC。在一些实施方案中，纳米乳剂是X8P。在一些实施方案中，免疫保护受试者免于展示出通过副粘病毒科的病毒（例如RSV）引起的疾病的病征或症状。

在一些实施方案中，免疫保护受试者免于由后续暴露于副粘病毒科的活病毒（例如RSV）的攻击。在一些实施方案中，组合物进一步包含佐剂。本发明并不受利用的佐剂类型的限制。在一些实施方案中，佐剂是CpG寡核苷酸。在一些实施方案中，佐剂是单磷酰脂质A。在本发明中有用的许多其他佐剂在本文中描述。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，免疫保护受试者免于展示出由副粘病毒科的病毒（例如RSV）的感染的病征或症状。在一些实施方案中，免疫减少在一次或多次暴露于副粘病毒科的病毒（例如RSV）时的感染危险。

附图描述

下述附图构成本说明书的部分并且包括以进一步证实本发明的某些方面和实施方案。通过参考与本文呈现的具体实施方案的描述组合的这些附图中的一个或多个，本发明可以得到更好理解。

图1显示通过纳米乳剂杀死呼吸道合胞病毒（RSV）。

图2显示在用纳米乳剂灭活的RSV（NE-RSV）免疫接种后RSV特异性抗体的诱导。

图3显示给受试者施用NE-RSV导致增强的RSV特异性CD8 T细胞应答。

图4显示给受试者施用NE-RSV增强来自RSV攻击的小鼠的气道的BAL流体中的抗病毒细胞因子。

图5显示用NE-RSV给小鼠接种疫苗增强在用活RSV攻击后在肺中的IL-17生产。

图6显示给受试者施用NE-RSV提供改善的清除且在后续活病毒攻击时诱导保护性应答。

图7显示在施用NE-RSV与对照比较的小鼠中各种基因的表达。

图8显示在施用NE-RSV与对照比较的小鼠中肺组织学切片的过碘酸-希夫氏（PAS）染色。

图9显示在施用NE-RSV与对照比较的小鼠中的细胞因子表达。

图10显示显著的RSV特异性抗体应答在用NE-RSV接种疫苗后在小鼠中全身生成（A）和在用活病毒攻击后2天时接种疫苗的小鼠的支气管肺泡灌洗液中的总Ig。

发明总体描述

尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但在一些实施方案中，用本发明的NE的NE处理（例如中和副粘病毒科的病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）））保存病毒的重要抗原表位（例如可通过受试者的免疫系统识别）（例如同时中和和/或根除病毒的感染性潜力），从而稳定其在乳剂的油和水界面中的疏水和亲水组分（例如从而提供受试者可以针对其产生免疫应答的一种或多种免疫原（例如稳定抗原））。在其他实施方案中，因为NE制剂通过孔穿透粘膜，所以它们可以将免疫原携带至树突细胞的粘膜下位置（例如从而起始和/或刺激免疫应答）。尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但在一些实施方案中，组合NE和副粘病毒科的病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）））稳定病毒免疫原，且提供正确的免疫原性材料用于生成免疫应答。

树突细胞贪婪地吞噬纳米乳剂（NE）油滴，并且这可以提供中和病毒免疫原的方式（例如用纳米乳剂的副粘病毒科的病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）））的灭活后生成的抗原蛋白质或其肽片段）用于抗原呈递。虽然其他疫苗依赖于炎症毒素或其他免疫刺激用于佐剂活性（参见例如，Holmgren和Czerkinsky，Nature Med. 2005，11；45-53），但当在动物和人中的研究中置于皮肤或粘膜上时，NEs未显示是炎症的。因此，尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但在一些实施方案中，本发明的包含NE的组合物（例如包含NE和副粘病毒科的一种或多种病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒））的组合物）可以充当对于免疫系统的“物理”佐剂（例如转运和/或呈递免疫原性组合物（例如副粘病毒科病毒的肽和/或抗原）。在一些实施方案中，本发明的组合物的粘膜施用生成粘膜（例如粘膜免疫的征兆（例如IgA抗体滴度的生成））以及全身免疫。

细胞和体液免疫在针对多重病原体的保护中起作用，并且两者都可以由本发明的NE制剂诱导。在一些实施方案中，给受试者施用（例如粘膜施用）本发明的组合物（例如肺炎病毒亚科病毒（例如RSV）的NE灭活）导致体液（例如特异性抗体的发展）和细胞（例如细胞毒性T淋巴细胞）免疫应答的诱导（例如针对肺炎病毒亚科病毒（例如RSV））。在一些实施方案中，本发明的组合物（例如NE灭活的肺炎病毒亚科病毒（例如RSV））用作疫苗（例如RSV疫苗）。

此外，在一些实施方案中，本发明的组合物（例如包含NE和副粘病毒科的病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒））的组合物）诱导（例如当施用于受试者时）全身和粘膜免疫。因此，在一些优选实施方案中，给受试者施用本发明的组合物导致针对暴露（例如致死性粘膜暴露）于副粘病毒科的病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）））的保护。尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但粘膜施用（例如接种疫苗）提供针对病毒感染（例如在粘膜表面起始的那种）的保护。尽管迄今已证明难以刺激针对在粘膜表面侵入的病原体的分泌性IgA应答和保护（参见例如，Mestecky等人，Mucosal Immunology. 3ed edn.（Academic Press，San Diego，2005）），但本发明提供了用于刺激针对副粘病毒科的病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）））的粘膜免疫（例如保护性IgA应答）的组合物和方法。

定义

为了促进本发明的理解，下文定义了许多术语和短语。

如本文使用的，术语“微生物”指微生物的任何物种或类型，包括但不限于细菌、病毒、古细菌、真菌、原生动物、支原体、朊病毒和寄生生物。术语微生物包含本身且自发地对于另一种生物（例如动物，包括人和植物）是致病性的那些生物，和产生对于另一种生物致病性的试剂的那些生物，虽然生物自身并非直接对于其他生物是致病性的或传染性的。

如本文使用的，术语“病原体”和语法等价物指通过直接感染其他生物或通过产生在另一种生物中引起疾病的试剂（例如产生致病性毒素的细菌等），在另一种生物（例如动物和植物）中引起疾病状况（例如感染、病理学状况、疾病等）的生物（例如生物学试剂）包括微生物。“病原体”包括但不限于病毒、细菌、古细菌、真菌、原生动物、支原体、朊病毒和寄生生物。

术语“细菌”指所有原核生物，包括在原核生物界中的所有门内的那些。预期该术语包含视为细菌的所有微生物，包括枝原体属（Mycoplasma）、衣原体属（Chlamydia）、放线菌属（Actinomyces）、链霉菌属（Streptomyces）和立克次氏体属（Rickettsia）。所有形式的细菌包括在这个定义内，包括球菌、杆菌、螺旋体、原生质球、原生质体等。

如本文使用的，术语“真菌”关于真核生物使用，例如霉菌和酵母，包括双态性真菌。

如本文使用的，除非本文另有说明，术语“疾病”和“病理学状况”可互换使用，以描述自对于物种或组（例如人）的成员视为正常或平均的状况的偏离，并且其在对于那个物种或组的大多数个体并非有害的条件下对于受累个体是有害的。此种偏离可以表现为与受试者或任何其器官或组织的正常状态的任何损害相关的状态、病征和/或症状（例如腹泻、恶心、发热、疼痛、水疱、疖、疹、免疫抑制、炎症等），这中断或改变正常功能的实现。疾病或病理状况可以由微生物（例如病原体或其他传染物（例如病毒或细菌））引起或起因于与所述微生物的接触，可以响应环境因素（例如营养不良、工业危害和/或气候），可以响应生物的先天不足（例如遗传异常）或这些及其他因素的组合。

如本文使用的，术语“宿主”或“受试者”指待通过本发明的组合物和方法治疗（例如施用）的个体。受试者包括但不限于哺乳动物（例如鼠、猿猴、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物等），且最优选包括人。在本发明的背景中，术语“受试者”一般指将被施用或已被施用本发明的一种或多种组合物（例如用于诱导免疫应答的组合物）的个体。

如本文使用的，当关于微生物（例如病原体（例如病毒））使用时，术语“灭活”和语法等价物指微生物（例如病原体（例如病毒））的杀死、消除、中和和/或感染和/或引起宿主中的病理学应答和/或疾病的能力的减少。例如，在一些实施方案中，本发明提供了包含纳米乳剂（NE）灭活的呼吸道合胞病毒（RSV）的组合物。因此，如本文提及的，包含“NE灭活的RSV”、“NE杀死的RSV”、NE中和的RSV”、“NE-RSV”或语法等价物的组合物指这样的组合物，当施用于受试者时，其特征在于在宿主内RSV复制的不存在或显著减少的存在（例如在一段时间内（例如在数天、数周、数月或更久的时间段内）。

如本文使用的，术语“融合（fusigenic）”意指能够与微生物试剂（例如细菌、细菌孢子或病毒衣壳）的膜融合的乳剂。融合乳剂的具体例子在本文中描述。

如本文使用的，术语“溶原的”指能够破裂微生物试剂（例如病毒（例如病毒包膜）或细菌或细菌孢子）的膜的乳剂（例如纳米乳剂）。在本发明的优选实施方案中，与单独的任一试剂相比较，溶原和融合试剂在相同组合物中的存在产生增强的灭活作用。使用这种改良的抗微生物组合物的方法和组合物（例如用于诱导免疫应答（例如用作疫苗）在本文中详细描述。

如本文使用的，术语“乳剂”包括典型水包油或油包水分散体或小滴，以及可以由于疏水性力形成的其他脂质结构，当水不能混合的油相与水相混合时，所述疏水性力驱动非极性残基（例如长烃链）远离水且驱动极性首基朝向水。这些其他脂质结构包括但不限于单层、少层（paucilamellar）和多层脂质小泡、微团和层状相。类似地，如本文使用的，术语“纳米乳剂”指包含小脂质结构的水包油分散体。例如，在优选实施方案中，纳米乳剂包含具有约0.1 - 5微米（例如直径150 +/-25 nm）的平均粒子大小的小滴的油相，尽管预期了更小和更大的粒子大小。术语“乳剂”和“纳米乳剂”在本文中经常可互换使用，以指本发明的纳米乳剂。

如本文使用的，当关于纳米乳剂和活微生物使用时，术语“接触”、“接触的”、“暴露”和“暴露的”指使一种或多种纳米乳剂与微生物（例如病原体）达到接触，从而使得纳米乳剂灭活微生物或致病性试剂，如果存在的话。本发明并不受用于微生物灭活的纳米乳剂的量或类型的限制。在本发明中有用的多种纳米乳剂在本文中和其他地方描述（例如美国专利申请20020045667和20040043041，以及美国专利号6,015,832、6,506,803、6,635,676和6,559,189中描述的纳米乳剂，所述文件各自为了所有目的整体引入本文作为参考）。在本发明中预期了纳米乳剂（例如足以灭活微生物（例如病毒灭活））和微生物（例如足以提供抗原组合物（例如能够诱导免疫应答的组合物））的比和量，包括但不限于本文描述的那些。

术语“表面活性剂”指具有有力地偏好通过水溶剂化的极性首基和通过水并非良好溶剂化的疏水尾的任何分子。术语“阳离子型表面活性剂”指具有阳离子首基的表面活性剂。术语“阴离子型表面活性剂”指具有阴离子首基的表面活性剂。

术语“亲水-亲油平衡指数”和“HLB指数”指用于关联表面活性剂分子的化学结构与其表面活性的指数。HLB指数可以通过多种经验公式进行计算，如例如由引入本文作为参考的Meyers描述的（参见例如，Meyers，Surfactant Science and Technology ，VCH Publishers Inc.，New York，第231-245页（1992））。如适当时在本文中使用的，表面活性剂的HLB指数是在McCutcheon的第1卷: Emulsifiers and Detergents North American Edition，1996（引入本文作为参考）中对那种表面活性剂指定的HLB指数。HLB指数对于商业表面活性剂范围为0 – 约70或更多。具有在水中的高可溶性和增溶性质的亲水表面活性剂在标度的高末端，而其为水在油中的良好增溶剂的在水中具有低可溶性的表面活性剂在标度的低末端。

如本文使用的，术语“相互作用增强剂”指作用于增强乳剂与微生物（例如与细菌（例如革兰氏阴性细菌）的细胞壁或病毒包膜的相互作用的化合物。预期的相互作用增强剂包括但不限于螯合试剂（例如乙二胺四乙酸（EDTA）、亚乙基双（氧亚乙基次氮基）四乙酸（EGTA）等）和某些生物学试剂（例如牛血清清蛋白（abulmin）（BSA）等）。

术语“缓冲剂”或“缓冲试剂”指当添加到溶液中时，促使溶液抵抗pH中的改变的材料。

术语“还原剂”和“电子供体”指对第二种材料贡献电子以还原一种或多种第二种材料的原子的氧化状态的材料。

术语“单价盐”指其中金属（例如Na、K或Li）在溶液中具有净1+电荷的任何盐（即比电子多一个质子）。

术语“二价盐”指其中金属（例如Mg、Ca或Sr）在溶液中具有净2+电荷的任何盐。

术语“螯合剂”或“螯合试剂”指具有可用于与金属离子键合的含非孤对电子的超过一种原子的任何材料。

术语“溶液”指水性或非水性混合物。

如本文使用的，术语“用于诱导免疫应答的组合物”、“免疫原性组合物”或语法等价物指这样的组合物，一旦施用于受试者（例如1次、2次、3次或更多（例如通过数周、数月或数年分开）），其在受试者中刺激、生成和/或引发免疫应答（例如导致针对能够引起疾病的微生物（例如病原体）的总体或部分免疫）。在本发明的优选实施方案中，组合物包含纳米乳剂和免疫原。在进一步优选的实施方案中，包含纳米乳剂和免疫原的组合物包含一种或多种其他化合物或试剂，包括但不限于治疗剂、生理学可耐受的液体、凝胶、载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、水杨酸盐、类固醇、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗体、细胞因子、抗生素、粘合剂、填充剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂和/或缓冲剂。免疫应答可以是先天性（例如非特异性）免疫应答或习得性（例如获得性）免疫应答（例如减少受试者中的感染性、发病或发病开始的那种（例如通过暴露于致病性微生物引起的）或预防受试者中的感染性、发病或发病开始的那种（例如通过暴露于致病性微生物引起的））。因此，在一些优选实施方案中，包含纳米乳剂和免疫原的组合物作为疫苗施用于受试者（例如以预防或减弱疾病（例如通过给受试者提供针对疾病的总体或部分免疫或疾病病征、症状或状况的总体或部分减弱（例如抑制）。

如本文使用的，术语“佐剂”指可以刺激免疫应答（例如粘膜免疫应答）的任何物质。一些佐剂可以引起免疫系统的细胞活化（例如佐剂可以引起免疫细胞产生且分泌细胞因子）。可以引起免疫系统的细胞活化的佐剂的例子包括但不限于由皂树（Q. saponaria）的树皮纯化的皂苷，例如QS21（由HPLC分级分离在第21个峰中洗脱的糖脂；Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Worcester，Mass.）；聚二（羧基苯氧基）磷腈（PCPP聚合物；Virus Research Institute，USA）；脂多糖例如单磷酰脂质A（MPL；Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Mont.）、胞壁酰二肽（MDP；Ribi）和苏氨酰胞壁酰二肽（t-MDP；Ribi）的衍生物；OM-174（与脂质A相关的葡糖胺二糖；OM Pharma SA，Meyrin，瑞士）；和利什曼虫属（Leishmania）延伸因子（纯化的利什曼虫属蛋白质；Corixa Corporation，Seattle，Wash.）。传统佐剂是本领域众所周知的，并且包括例如磷酸铝或氢氧化物盐（“明矾”）。在一些实施方案中，本发明的组合物（例如包含纳米乳剂灭活的RSV）与一种或多种佐剂（例如以使免疫应答偏向Th1或Th2型应答）一起施用。

如本文使用的，术语“有效诱导免疫应答的量”（例如用于诱导免疫应答的组合物）指在受试者中刺激、生成和/或引发免疫应答所需的剂量水平（例如当施用于受试者时）。有效量可以在一次或多次施用（例如经由相同或不同途径）、应用或剂量中施用，并且不预期限制于具体制剂或施用途径。

如本文使用的，术语“在这样的条件下，从而使得所述受试者生成免疫应答”指免疫应答（例如先天性或获得性）的任何定性或定量诱导、生成和/或刺激。

如本文使用的，术语“免疫应答”指通过受试者的免疫系统的应答。例如，免疫应答包括但不限于Toll受体活化、淋巴因子（例如细胞因子（例如Th1或Th2型细胞因子）或趋化因子）表达和/或分泌、巨噬细胞活化、树突细胞活化、T细胞活化（例如CD4+或CD8+ T细胞）、NK细胞活化和/或B细胞活化（例如抗体生成和/或分泌）中的可检测改变（例如增加）。免疫应答的另外例子包括免疫原（例如抗原（例如免疫原性多肽））与MHC分子的结合和诱导细胞毒性T淋巴细胞（“CTL”）应答，诱导针对免疫原性多肽由其衍生的抗原的B细胞应答（例如抗体产生）和/或T辅助淋巴细胞应答、和/或迟发型超敏反应（DTH）应答，免疫系统的细胞（例如T细胞、B细胞（例如任何发育阶段（例如浆细胞）的扩增（例如细胞群体的生长），和抗原通过抗原呈递细胞的增加的加工和呈递。免疫应答可以针对受试者的免疫系统识别为外来的免疫原（例如来自微生物（例如病原体）的非自身抗原），或识别为外来的自身抗原）。因此，应当理解，如本文使用的，“免疫应答”指任何类型的免疫应答，包括但不限于先天性免疫应答（例如Toll受体信号级联放大的活化）、细胞介导的免疫应答（例如由免疫系统的T细胞（例如抗原特异性T细胞）和非特异性细胞介导的应答）和体液免疫应答（例如由B细胞介导的应答（例如经由抗体生成和分泌到血浆、淋巴和/或组织液内）。术语“免疫应答”意欲包括受试者的免疫系统响应抗原和/或免疫原（例如对于免疫原（例如病原体）的起始应答以及作为适应性免疫应答的结果的获得性（例如记忆）应答）的能力的所有方面。

如本文使用的，术语“免疫”指在暴露于能够引起疾病的微生物（例如病原体）时，免于疾病的保护（例如预防或减弱（例如抑制）疾病的病征、症状或状况）。免疫可以是先天性的（例如在不存在先前暴露于抗原的情况下存在的非适应性（例如非获得性）免疫应答），和/或获得性的（例如在先前暴露于抗原后由B和T细胞介导的免疫应答（例如其显示出对于抗原增加的特异性和反应性））。

如本文使用的，术语“免疫原”指在受试者中能够引发免疫应答的试剂（例如微生物（例如细菌、病毒或真菌）和/或其部分或组分（例如蛋白质抗原））。在优选实施方案中，当与本发明的纳米乳剂组合施用时，免疫原引发针对免疫原（例如微生物（例如病原体或病原体产物））的免疫。

如本文使用的，术语“病原体产物”指衍生自病原体的任何组分或产物，包括但不限于多肽、肽、蛋白质、核酸、膜级分和多糖。

如本文使用的，术语“增强的免疫”指相对于尚未施用组合物（例如用于诱导本发明的免疫应答的组合物）的受试者中的适应性和/或获得性免疫水平，在组合物（例如用于诱导本发明的免疫应答的组合物）施用后，在受试者中针对给定免疫原（例如微生物（例如病原体））的适应性和/或获得性免疫水平中的增加。

如本文使用的，术语“纯化的”或“待纯化”指从样品或组合物中去除污染物或不需要的化合物。如本文使用的，术语“基本上纯化的”指从样品或组合物中去除约70 - 90 ％、最高到100％污染物或不需要的化合物。

如本文使用的，术语“施用”指对受试者给予本发明的组合物（例如用于诱导免疫应答的组合物（例如包含纳米乳剂和免疫原的组合物））的动作。对于人体的示例性施用途径包括但不限于通过眼（眼的）、口（经口）、皮肤（经皮）、鼻（鼻的）、肺（吸入的）、口腔粘膜（口腔含化）、耳、直肠、通过注射（例如静脉内、皮下、腹膜内等）、局部等。

如本文使用的，术语“共施用”指至少2种试剂（例如包含纳米乳剂和免疫原的组合物和一种或多种其他试剂 – 例如佐剂）或治疗对于受试者的施用。在一些实施方案中，2种或更多试剂或治疗的共施用是并发的。在其他实施方案中，第一种试剂/治疗在第二种试剂/治疗之前施用。在一些实施方案中，共施用可以经由相同或不同施用途径。本领域技术人员理解使用的各种试剂或治疗的制剂和/或施用途径可以改变。对于共施用的合适剂量可以由本领域技术人员容易地决定。在一些实施方案中，当试剂或治疗共施用时，各自的试剂或治疗以低于对于其单独施用合适的剂量施用。因此，共施用在其中试剂或治疗的共施用降低一种或多种潜在有害的（例如毒性）试剂的必需剂量的实施方案中，和/或当2种或更多试剂的共施用导致经由其他试剂的共施用受试者对试剂之一的有利作用的致敏时是尤其希望的。在其他实施方案中，共施用是优选的，以同时或接近同时（例如，当受试者不太可能可用于第二种、第三种或更多组合物的后续施用用于诱导免疫应答时）引发受试者中针对2种或更多不同免疫原（例如微生物（例如病原体））的免疫应答。

如本文使用的，术语“局部地”指本发明的组合物（例如包含纳米乳剂和免疫原的组合物）应用于皮肤和/或粘膜细胞和组织（例如肺泡、口腔、舌、咀嚼、阴道或鼻粘膜，以及给中空器官或体腔做衬里的其他组织和细胞）的表面。

在一些实施方案中，本发明的组合物以局部乳剂、可注射组合物、可摄食溶液等的形式施用。当途径是局部的时，形式可以是例如喷雾剂（例如鼻喷雾剂）、乳膏或其他粘性溶液（例如包含在聚乙二醇中的纳米乳剂和免疫原的组合物）。

如本文使用的，术语“药学可接受的”或“药理学可接受的”指当施用于受试者时，基本上不产生不利反应（例如毒性、变应性或免疫反应）的组合物。

如本文使用的，术语“药学可接受的载体”指任何标准药学载体，包括但不限于磷酸缓冲盐水溶液、水和各种类型的润湿剂（例如月桂基硫酸钠）、任何和所有溶剂、分散介质、包衣、月桂基硫酸钠、等渗和吸收延迟剂、崩解剂（例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠）、聚乙二醇等。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和佐剂的例子已得到描述且是本领域已知的（参见例如，引入本文作为参考的Martin，Remington's Pharmaceutical Sciences，第15版，Mack Publ. Co.，Easton，Pa.（1975））。

如本文使用的，术语“药学可接受的盐”指在靶受试者中生理学耐受的本发明的组合物的任何盐（例如通过与酸或碱反应获得的）。本发明的组合物的“盐”可以衍生自无机或有机酸和碱。酸的例子包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、延胡索酸、马来酸、磷酸、羟基乙酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸例如草酸虽然本身不是药学可接受的，但可以用于制备在获得本发明的组合物及其药学可接受的酸加成盐中作为中间体有用的盐。

碱的例子包括但不限于碱金属（例如钠）氢氧化物、碱土金属（例如镁）氢氧化物、氨和式NW₄ ⁺的化合物，其中W是C_1-4烷基等。

盐的例子包括但不限于：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐（flucoheptanoate）、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐（palmoate）、果胶酸盐、过硫酸盐、苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐等。盐的其他例子包括与合适阳离子例如Na⁺、NH₄ ⁺和NW₄ ⁺（其中W是C_1-4烷基）等化合的本发明的化合物的阴离子。对于治疗用途，预期本发明的化合物的盐为药学可接受的。然而，并非药学可接受的酸和碱的盐也可以例如在药学可接受的化合物的制备或纯化中有用。

对于治疗用途，预期本发明的组合物的盐为药学可接受的。然而，并非药学可接受的酸和碱的盐也可以例如在药学可接受的组合物的制备或纯化中有用。

如本文使用的，术语“处于疾病的危险中”指倾向于经历特定疾病的受试者。这种素因可以是遗传的（例如经历疾病例如遗传病的特定遗传倾向），或由于其他因素（例如年龄、环境条件、暴露于环境中存在的有害化合物等）。因此，不预期本发明限制于任何具体危险（例如受试者可以仅仅通过暴露于其他人和与其他人相互作用而“处于疾病的危险中”），也不预期本发明限制于任何具体疾病。

如本文使用的，“鼻应用”意指通过鼻应用到鼻或窦通道或两者内。应用可以例如通过应用于鼻和窦通道的滴剂、喷雾剂、雾、包衣或其混合物来完成。

如本文使用的，术语“试剂盒”指用于递送材料的任何递送系统。在免疫原性试剂（例如包含纳米乳剂和免疫原的组合物）的背景中，此种递送系统包括允许免疫原性试剂和/或支持材料（例如关于使用材料的书面说明书等）从一个位置到另一个的贮存、转运或递送的系统。例如，试剂盒包括含有相关免疫原性试剂（例如纳米乳剂）和/或支持材料的一个或多个外壳（例如盒）。如本文使用的，术语“分割的（fragmented）试剂盒”指包含2个或更多分开容器的递送系统，所述容器各自含有总试剂盒组分的亚部分。容器可以一起或分开地递送给预期接受者。例如，第一个容器可以含有用于特定用途的包含纳米乳剂和免疫原的组合物，而第二个容器含有第二种试剂（例如抗生素或喷雾剂施用器）。实际上，包含各自含有总试剂盒组分的亚部分的2个或更多分开容器的任何递送系统包括在术语“分割的试剂盒”内。相比之下，“组合试剂盒”指含有在单一容器中（例如在容纳所需组分中的每一种的单个盒中）对于特定用途所需的免疫原性试剂的所有组分的递送系统。术语“试剂盒”包括分割的和组合试剂盒。

发明详述

呼吸道合胞病毒（RSV）感染2岁前的几乎所有婴儿并且是全世界儿童中的细支气管炎的主因。由CDC估计在美国每年最高达125,000例儿科住院治疗是由于RSV，每年费用超过$300,000,000（1）。尽管RSV特异性适应性免疫应答的生成，但RSV不赋予保护性免疫并且一生自始至终的复发性感染是常见的（2，3）。虽然RSV在其气道小且容易堵塞的非常幼小的婴儿中是尤其有害的，但RSV也广泛变得公认为是移植接受者、具有慢性阻塞性肺病（COPD）的患者、老年人、以及具有慢性肺病尤其是哮喘的其他患者中的重要病原体。近期数据暗示来自1990-2000的关于所有年龄组合的死亡率已是约30/100,000，其中在美国每年平均死亡率超过17,000（4，5）。这些数目可能是严重低估的，因为它仍未在成年人中以一致方式彻底检查。因此，RSV不仅在年轻和年老的人中引起严重恶化的肺病，还与显著量的死亡率直接相关。尽管抗RSV抗体是可获得的且看起来减轻严重疾病，但它们仅在预防地（propholactically）给予时执行，并且存在很少其他选项用于对抗易感患者群体中的RSV感染（6-10）。

在二十世纪六十年代晚期，用明矾沉淀的福尔马林灭活的RSV疫苗制剂给儿童接种疫苗的尝试失败，且在用活RSV再感染时引起严重恶化的疾病。临床表现看起来是增强的Th2疾病、粘液产生和嗜曙红细胞增多的结果，这在未接种疫苗的儿童中未观察到。这些相同症状可以在严重感染的婴儿亚群中出现。

几项流行病学研究将严重RSV应答与甚至在感染已消除后数年的反应过度气道疾病的以后发展联系起来（3）。Sigurs等人发现与健康对照相比较，由于RSV细支气管炎住院治疗的婴儿在1、3和7岁时处于发展哮喘和喘鸣发作的更高危险中（11-13）。RSV也已与哮喘恶化相关且可以引起病的延长发作（14）。一项有趣研究暗示因果联系，这是因为用RSV免疫球蛋白治疗具有严重RSV疾病的婴儿显著减少其发展儿童期哮喘和肺功能障碍的以后危险（15）。可以使儿童和成人倾向于慢性疾病的RSV疾病的一个临床相关特征是由于改变的免疫应答，不能获得保护性免疫。更近期的研究已暗示具有受损的肺功能的患者群体（尤其是患者）也处于由于RSV感染的严重并发症的危险中，所述严重并发症几乎与和流感感染相关的那些一样流行（16-20）。这些并发症可以通过即使在急性疾病已消除后RSV也具有在肺中持续长时间段的能力的可能性混合。这已假定与较不有效地清除病毒的改变的免疫环境的发展相关。因此，可以用于儿童和成人中的有效疫苗具有用于跨越群体广泛应用的潜力，且可以提供免于慢性肺病的起始和恶化的显著保护。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于特异性免疫应答刺激的方法和组合物。特别地，本发明提供了免疫原性纳米乳剂组合物和使用其诱导针对副粘病毒科的致病性病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）））的免疫应答（例如免疫（例如保护性免疫））的方法。本发明的组合物和方法尤其在临床（例如治疗和预防医学（例如接种疫苗））和研究应用中有用。示例性免疫原性组合物（例如疫苗组合物）和施用组合物的方法在下文更详细地描述。

在一些实施方案中，本发明提供了用于诱导免疫应答的组合物，其包含纳米乳剂和一种或多种免疫原（例如灭活的病原体或病原体产物（例如灭活的病毒（例如灭活的呼吸道合胞病毒）））。本发明并不限于任何具体纳米乳剂。实际上，多种纳米乳剂在本发明中有用，包括但不限于在本文中描述的那些和在其他地方描述的那些（例如美国专利申请20020045667和20040043041，以及美国专利号6,015,832、6,506,803、6,635,676和6,559,189中描述的纳米乳剂，所述文件各自为了所有目的整体引入本文作为参考）。

本发明的免疫原（例如病原体或病原体产物（例如灭活的病原体或病原体产物（例如灭活的病毒（例如灭活的呼吸道合胞病毒））））和纳米乳剂可以以任何合适量组合，且利用多种递送法递送给受试者。可以利用任何合适的药物制剂，包括但不限于本文公开的那些。合适的制剂可以使用任何合适的方法就免疫原性进行测试。例如，在一些实施方案中，免疫原性通过定量抗体滴度和特异性T细胞应答进行研究。本发明的纳米乳剂组合物还可以在传染病状态的动物模型中进行测试。用于免疫原性的合适动物模型、病原体和测定包括但不限于下文描述的那些。

在一些实施方案中，本发明提供了在本发明的开发过程中鉴定且表征的包含纳米乳剂（NE）灭活的副粘病毒科的病毒（例如RSV）的组合物的粘膜施用（例如粘膜接种疫苗）后，在受试者中免疫（例如针对副粘病毒科的病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）））的免疫）的发展。如实施例1-2中所述，将NE与RSV混合，从而导致这样的制剂（例如NE杀死的RSV组合物），其在室温稳定（例如在一些实施方案中，达超过2周、更优选超过3周、甚至更优选超过4周、且最优选超过5周），且可以用于在受试者中诱导针对RSV的免疫应答（例如可以单独或作为佐剂使用用于诱导抗RSV免疫应答）。

包含NE和RSV（例如NE杀死的RSV）的组合物对受试者的粘膜施用导致高滴度抗体应答和特异性Th1细胞免疫（参见例如，实施例1-4）。进一步地，使动物被保护免于用RSV的后续攻击（参见例如，实施例4）。此外，与明矾沉淀的福尔马林灭活的RSV疫苗制剂（例如上文描述的）形成鲜明对比，本发明的NE灭活的RSV导致强Th1免疫（例如如通过增强的IFN-γ和IL-17表达证明的（参见例如，实施例4）应答，且不增强和/或升高与Th2型应答相关的Th2细胞因子（例如IL-4、IL-5或IL-13）的表达。在施用后4周，施用即使单剂的包含NE杀死的RSV的组合物的小鼠也发展抗RSV IgG的血清浓度，其在施用后8周时继续增加并且在加强施用后显著升高（参见例如，实施例2-4）。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含NE杀死的RSV的组合物的单次施用（例如粘膜施用）足以在受试者中诱导保护性免疫应答（例如保护性免疫（例如粘膜和全身免疫））。在一些实施方案中，对受试者的后续施用（例如初次施用后的一次或多次加强施用）提供针对受试者中的RSV的增强的免疫应答的诱导。因此，本发明证实包含NE杀死的RSV的组合物对受试者的施用提供针对RSV感染的保护性免疫。

细胞和体液免疫都可能在针对RSV的保护中起作用，并且两者由NE制剂诱导（参见例如，实施例1-4）。RSV特异性抗体滴度被视为对于人受试者和接种疫苗的动物模型中的保护性免疫估计是重要的。

在本发明的实施方案的开发过程中生成的数据证明NE有效杀死RSV且生成适合于用于在受试者中诱导针对RSV的免疫应答的非传染性免疫接种组合物（例如用于用作疫苗）。在施用于受试者后，免疫原性组合物诱导特异性抗RSV血清抗体滴度，且起始重要的抗病毒细胞免疫应答（例如诱导增加的抗病毒细胞因子生产和RSV特异性CD8+细胞毒性T细胞的发展）。本发明的免疫原性组合物还提供了在活RSV攻击时改善的病毒清除。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供了生成合适的先天性免疫应答的能力（例如起因于暴露于以可识别形式维持于NE中的抗原，其模拟通过主动感染提供的抗原），从而提供更合适的疫苗策略（例如与福尔马林杀死的RSV相比较）。

因此，在一些实施方案中，本发明的组合物（例如NE杀死的RSV）对受试者的施用（例如粘膜施用）提供了体液（例如特异性抗体的发展）和细胞（例如细胞毒性T淋巴细胞）免疫应答（例如针对RSV）的诱导。在一些优选实施方案中，本发明的组合物（例如NE杀死的RSV）用作疫苗。

抗体的生成

包含纳米乳剂（NE）灭活的副粘病毒科的病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）））的免疫原性组合物可以用于免疫接种动物，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴或人，以产生多克隆抗体。若需要，则肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）抗原可以与载体蛋白质缀合，所述载体蛋白质例如牛血清清蛋白、甲状腺球蛋白、匙孔血蓝蛋白或本文描述的其他载体。取决于宿主物种，各种佐剂可以用于增加免疫应答。此种佐剂包括但不限于弗氏佐剂、矿物凝胶（例如氢氧化铝）和表面活性物质（例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、本文描述的纳米乳剂、匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚）。在人中使用的佐剂中，BCG（卡介苗）和短小棒杆菌（Corynebacterium parvum）是尤其有用的。

与肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）抗原特异性结合的单克隆抗体可以使用任何技术进行制备，所述技术提供通过在培养中的连续细胞系的抗体分子产生。这些技术包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术、和EBV杂交瘤技术（参见例如，Kohler等人，Nature 256，495 497，1985；Kozbor等人，J. Immunol. Methods 81，3142，1985；Cote等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 80，2026 2030，1983；Cole等人，Mol. Cell. Biol. 62，109 120，1984）。

此外，可以使用为了产生“嵌合抗体”开发的技术，小鼠抗体基因与人抗体基因的剪接，以获得具有合适抗原特异性和生物学活性的分子（参见例如，Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 81，68516855，1984；Neuberger等人，Nature 312，604 608，1984；Takeda等人，Nature 314，452 454，1985）。单克隆及其他抗体也可以是“人源化的”，以阻止当它在治疗上使用时，患者产生针对抗体的免疫应答。此种抗体可以与待直接用于治疗中的人抗体在序列中足够类似，或可能需要少数关键残基的改变。通过经由个别残基的位点定向诱变或通过嫁接整个互补性决定区替换与人序列中的那些不同的残基，在啮齿类动物抗体和人序列之间的序列差异可以降到最低。

可替代地，人源化抗体可以使用重组法产生，如下文描述的。与特定抗原特异性结合的抗体可以含有部分或全部人源化的抗原结合部位，如美国专利号5,565,332中公开的。

可替代地，对于单链抗体产生描述的技术可以使用本领域已知的方法进行修改，以产生与特定抗原特异性结合的单链抗体。具有相关特异性但具有不同独特型组成的抗体可以通过链改组由随机组合免疫球蛋白文库生成（参见例如，Burton，Proc. Natl. Acad. Sci. 88，11120 23，1991）。

单链抗体还可以使用DNA扩增法例如PCR进行构建，其中使用杂交瘤cDNA作为模板（参见例如，Thirion等人，1996，Eur. J. Cancer Prev. 5，507-11）。单链抗体可以是单或双特异性的，并且可以是二价或四价的。四价、双特异性单链抗体的构建例如在Coloma & Morrison，1997，Nat. Biotechnol. 15，159-63中教导。二价、双特异性单链抗体的构建例如在Mallender & Voss，1994，J. Biol. Chem. 269，199-206中教导。

编码单链抗体的核苷酸序列可以使用手动或自动化核苷酸合成进行构建，使用标准重组DNA法克隆到表达构建体内，并且引入细胞内以表达编码序列，如下文描述的。可替代地，单链抗体可以使用例如丝状噬菌体技术直接产生（参见例如，Verhaar等人，1995，Int. J. Cancer 61，497-501；Nicholls等人，1993，J. Immunol. Meth. 165，81-91）。

如文献中公开的，通过在淋巴细胞群体中诱导体内产生或通过筛选高度特异性结合试剂的免疫球蛋白文库或实验对象组，也可以产生与特定抗原特异性结合的抗体（参见例如，Orlandi等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 86，3833 3837，1989；Winter等人，Nature 349，293 299，1991）。

嵌合抗体可以如WO 93/03151中公开的进行构建。还可以制备衍生自免疫球蛋白且是多价和多特异性的结合蛋白，例如WO 94/13804中描述的“双抗体”。抗体可以通过本领域众所周知的方法进行纯化。例如，抗体可以通过经过相关抗原与之结合的柱进行亲和纯化。结合的抗体随后可以使用具有高盐浓度的缓冲剂从柱中洗脱。

纳米乳剂

本发明的纳米乳剂疫苗组合物并不限于任何具体纳米乳剂。任何数目的合适纳米乳剂组合物都可以用于本发明的疫苗组合物中，包括但不限于Hamouda等人，J. Infect Dis.，180:1939（1999）；Hamouda和Baker，J. Appl. Microbiol.，89:397（2000）；和Donovan等人，Antivir. Chem. Chemother.，11:41（2000）中公开的那些，以及表1和2以及图4和9中显示的那些。本发明的优选纳米乳剂是在杀死或灭活病原体中有效且对于动物无毒的那些。因此，优选乳剂制剂利用无毒溶剂，例如乙醇，且在更低浓度的乳剂时达到更有效的杀死。在优选实施方案中，在本发明的方法中利用的纳米乳剂是稳定的，并且即使在长贮存时间段（例如一年或多年）后也不分解。另外，优选乳剂即使暴露于高温和冷冻后也维持稳定性。如果它们待在极端条件中（例如在战场上）应用，那么这是尤其有用的。在一些实施方案中，利用表1中描述的纳米乳剂之一。

在一些优选实施方案中，乳剂包含（i）水相；（ii）油相；和至少一种另外化合物。在本发明的一些实施方案中，这些另外化合物混合到组合物的水或油相内。在其他实施方案中，这些另外化合物混合到先前乳化的油和水相的组合物内。在这些实施方案的某些中，一种或多种另外化合物紧接在其使用前混合到现有乳剂组合物内。在其他实施方案中，一种或多种另外化合物在组合物立即使用前混合到现有乳剂组合物内。

适合于在本发明的组合物中使用的另外化合物包括但不限于一种或多种有机物和更具体而言基于有机磷酸酯的溶剂、表面活性剂和去污剂、含季铵化合物、阳离子含卤素化合物、萌发增强剂、相互作用增强剂和药学可接受的化合物。预期用于本发明的组合物中的各种化合物的一些示例性实施方案在下文呈现。

本发明的一些实施方案采用含乙醇的油相。例如，在一些实施方案中，本发明的乳剂含有（i）水相和（ii）含有乙醇作为有机溶剂和任选地萌发增强剂的油相，和（iii）TYLOXAPOL作为表面活性剂（优选2-5％、更优选3％）。这种制剂针对微生物是高度有效的，并且对于哺乳动物使用者也是无刺激性和无毒的（并且因此可以与粘膜接触）。

在一些其他实施方案中，本发明的乳剂包含在第二种乳剂内乳化的第一种乳剂，其中（a）第一种乳剂包含（i）水相；和（ii）包含油和有机溶剂的油相；和（iii）表面活性剂；和（b）第二种乳剂包含（i）水相；和（ii）包含油和含阳离子化合物的油相；和（iii）表面活性剂。

下述描述提供了许多示例性乳剂，包含用于组合物X8P和X₈W₆₀PC的制剂。X8P包含油包水纳米乳剂，其中油相由溶于80％水中的大豆油、磷酸三正丁酯和TRITON X-100制成。X₈W₆₀PC包含X8P与W₈₀8P的等体积混合物。W₈₀8P是脂质体样化合物，由甘油单硬脂酰酯、精制大豆固醇（例如GENEROL固醇）、TWEEN 60、大豆油、阳离子离子含卤素CPC和薄荷油制成。GENEROL家族是一组聚乙氧基化大豆固醇（Henkel Corporation，Ambler，Pennsylvania）。用于本发明的某些实施方案的乳剂制剂在表1中给出。这些特定制剂可以在整体引入本文作为参考的美国专利号5,700,679（NN）；5,618,840；5,549,901（W₈₀8P）；和5,547,677中找到。

X8W₆₀PC乳剂通过首先分开制备W₈₀8P乳剂和X8P乳剂进行制造。这2种乳剂的混合物随后再乳化，以产生称为X8W₆₀PC的新鲜乳剂组合物。产生此种乳剂的方法在美国专利号5,103,497和4,895,452中描述（整体引入本文作为参考）。这些化合物具有广谱抗微生物活性，并且能够通过膜破裂来灭活营养型细菌。

上文列出的组合物仅是示例性的，并且本领域技术人员将能够改变组分的量，以达到适合于本发明目的的纳米乳剂组合物。本领域技术人员将理解油相与水的比以及个别油载体、表面活性剂CPC和有机磷酸缓冲剂，每种组合物的组分可以不同。

尽管包含X8P的某些组合物具有4:1的水与油比，但应当理解X8P可以配制为具有更多或更少的水相。例如，在一些实施方案中，对于每份油相存在3、4、5、6、7、8、9、10或更多份水相。这对于W₈₀8P制剂同样是正确的。类似地，磷酸三正丁酯:TRITON X-100:大豆油的比也可以是不同的。

尽管表1列出了用于W₈₀8P的甘油单油酸酯、聚山梨醇酯60、GENEROL 122、十六烷基氯化吡啶和载体油的具体量，但这些仅是示例性的。可以配制具有W₈₀8P性质的乳剂，其具有不同浓度的这些组分中的每一种或将实现相同功能的实际上不同的组分。例如，乳剂可以具有在起始油相中约80 – 约100g的甘油单油酸酯。在其他实施方案中，乳剂可以具有在起始油相中约15 – 约30 g的聚山梨醇酯60。在另外一个实施方案中，组合物可以包含在起始油相中约20 – 约30 g的GENEROL固醇。

本发明的乳剂的某些实施方案的纳米乳剂结构可以在其杀生物活性以及促成这些乳剂的无毒中起作用。例如，X8P中的活性组分，TRITON-X100显示在等价于11％X8P的浓度针对病毒的更少杀生物活性。将油相添加到去污剂和溶剂中显著减少这些试剂在组织培养中在相同浓度时的毒性。尽管不受任何理论束缚（机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体机制），但暗示纳米乳剂增强其组分与病原体的相互作用，从而促进病原体的灭活且减少个别组分的毒性。应当指出当X8P的所有组分在一种组合物中组合但不在纳米乳剂结构中时，混合物不如当组分在纳米乳剂结构中时一样作为抗微生物剂有效。

下文呈现了具有类似组成的制剂类别中呈现的众多另外实施方案。下述组合物叙述活性组分的各种比和混合物。本领域技术人员将认识到下述制剂是示例性的，并且包含所述组分的相似百分比范围的另外制剂在本发明的范围内。

在本发明的某些实施方案中，本发明制剂包含约3 – 8体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、约1体积％的十六烷基氯化吡啶（CPC）、约60 – 70体积％的油（例如大豆油）、约15 – 25体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）、和在一些制剂中小于约1体积％的1N NaOH。这些实施方案中的一些包含PBS。预期1N NaOH和/或PBS在这些实施方案的一些中的添加允许使用者有利地控制制剂的pH，从而使得pH范围为约4.0 – 约10.0，并且更优选达到约7.1 - 8.5。例如，本发明的一个实施方案包含约3体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约64体积％的大豆油、和约24体积％的DiH₂O（本文指定为Y3EC）。另一个相似实施方案包含约3.5体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、和约1体积％的CPC、约64体积％的大豆油、和约23.5体积％的DiH₂O（本文指定为Y3.5EC）。另外一个实施方案包含约3体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约0.067体积％的1N NaOH，从而使得制剂的pH是约7.1、约64体积％的大豆油、和约23.93体积％的DiH₂O（本文指定为Y3EC pH 7.1）。另外一个实施方案包含约3体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约0.67体积％的1N NaOH，从而使得制剂的pH是约8.5、和约64体积％的大豆油、和约23.33体积％的DiH₂O（本文指定为Y3EC pH 8.5）。另一个相似实施方案包含约4％TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、约1％CPC、和约64体积％的大豆油、和约23体积％的DiH₂O（本文指定为Y4EC）。在另外一个实施方案中，制剂包含约8％TYLOXAPOL、约8％乙醇、约1体积％的CPC、和约64体积％的大豆油、和约19体积％的DiH₂O（本文指定为Y8EC）。进一步的实施方案包含约8体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约64体积％的大豆油、约19体积％的1x PBS（本文指定为Y8EC PBS）。

在本发明的一些实施方案中，本发明制剂包含约8体积％的乙醇、和约1体积％的CPC、和约64体积％的油（例如大豆油）、和约27体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）（本文指定为EC）。

在本发明中，一些实施方案包含约8体积％的十二烷基硫酸钠（SDS）、约8体积％的磷酸三丁酯（TBP）、和约64体积％的油（例如大豆油）、和约20体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）（本文指定为S8P）。

在本发明的某些实施方案中，本发明制剂包含约1 – 2体积％的TRITON X-100、约1 – 2体积％的TYLOXAPOL、约7 - 8体积％的乙醇、约1体积％的十六烷基氯化吡啶（CPC）、约64 - 57.6体积％的油（例如大豆油）、和约23体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。另外，这些制剂中的一些进一步包含约5 mM L-丙氨酸/肌苷和约10 mM氯化铵。这些制剂中的一些包含PBS。预期PBS在这些实施方案的一些中的添加允许使用者有利地控制制剂的pH。例如，本发明的一个实施方案包含约2体积％的TRITON X-100、约2体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约64体积％的大豆油、和约23体积％的水相DiH₂O。在另一个实施方案中，制剂包含约1.8体积％的TRITON X-100、约1.8体积％的TYLOXAPOL、约7.2体积％的乙醇、约0.9体积％的CPC、约5 mM L-丙氨酸/肌苷、和约10 mM氯化铵、约57.6体积％的大豆油、和剩余部分的1x PBS（本文指定为90％X2Y2EC/GE）。

在本发明的优选实施方案中，制剂包含约5体积％的TWEEN 80、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约64体积％的油（例如大豆油）、和约22体积％的DiH₂O（本文指定为W₈₀5EC）。

在本发明的另外其他实施方案中，制剂包含约5体积％的TWEEN 20、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约64体积％的油（例如大豆油）、和约22体积％的DiH₂O（本文指定为W₂₀5EC）。

在本发明的另外其他实施方案中，制剂包含约2 - 8体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约60 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约15 - 25体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。例如，本发明预期了包含约2体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约64体积％的大豆油、和约26体积％的DiH₂O的制剂（本文指定为X2E）。在其他相似实施方案中，制剂包含约3体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约64体积％的大豆油、和约25体积％的DiH₂O（本文指定为X3E）。在再进一步的实施方案中，制剂包含约4体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约64体积％的大豆油、和约24体积％的DiH₂O（本文指定为X4E）。在另外其他实施方案中，制剂包含约5体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约64体积％的大豆油、和约23体积％的DiH₂O（本文指定为X5E）。本发明的另一个实施方案包含约6体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约64体积％的大豆油、和约22体积％的DiH₂O（本文指定为X6E）。在本发明的再进一步实施方案中，制剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约64体积％的大豆油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为X8E）。在本发明的再进一步实施方案中，制剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约64体积％的橄榄油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为X8E O）。在另外一个实施方案中包含8体积％的TRITON X-100、约8体积％乙醇、约1体积％CPC、约64体积％的大豆油、和约19体积％的DiH₂O（本文指定为X8EC）。

在本发明的可替代实施方案中，制剂包含约1 – 2体积％的TRITON X-100、约1 – 2体积％的TYLOXAPOL、约6 - 8体积％的TBP、约0.5 - 1.0体积％的CPC、约60 - 70体积％的油（例如大豆油）、和约1 - 35体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。另外，这些制剂中的某些可以包含约1 – 5体积％的胰胨豆胨培养液、约0.5 - 1.5体积％的酵母提取物、约5 mM L-丙氨酸/肌苷、约10 mM氯化铵、和约20-40体积％的液态婴儿代乳品（formula）。在包含液态婴儿代乳品的一些实施方案中，代乳品包含酪蛋白水解物（例如Neutramigen或Progestimil等）。在这些实施方案的一些中，本发明制剂进一步包含约0.1 - 1.0体积％的硫代硫酸钠、和约0.1 - 1.0体积％的柠檬酸钠。包含这些基本组分的其他相似实施方案采用磷酸缓冲盐水（PBS）作为水相。例如，一个实施方案包含约2体积％的TRITON X-100、约2体积％TYLOXAPOL、约8体积％TBP、约1体积％的CPC、约64体积％的大豆油、和约23体积％的DiH₂O（本文指定为X2Y2EC）。在另外其他实施方案中，本发明制剂包含约2体积％的TRITON X-100、约2体积％TYLOXAPOL、约8体积％TBP、约1体积％的CPC、约0.9体积％的硫代硫酸钠、约0.1体积％的柠檬酸钠、约64体积％的大豆油、和约22体积％的DiH₂O（本文指定为X2Y2PC STS1）。在另一个相似实施方案中，制剂包含约1.7体积％的TRITON X-100、约1.7体积％TYLOXAPOL、约6.8体积％TBP、约0.85％CPC、约29.2％NEUTRAMIGEN、约54.4体积％的大豆油、和约4.9体积％的DiH₂O（本文指定为85％X2Y2PC/婴儿）。在本发明的另外一个实施方案中，制剂包含约1.8体积％的TRITON X-100、约1.8体积％的TYLOXAPOL、约7.2体积％的TBP、约0.9体积％的CPC、约5 mM L-丙氨酸/肌苷、约10 mM氯化铵、约57.6体积％的大豆油、和剩余体积％的0.1x PBS（本文指定为90％X2Y2 PC/GE）。在另外一个实施方案中，制剂包含约1.8体积％的TRITON X-100、约1.8体积％的TYLOXAPOL、约7.2体积％TBP、约0.9体积％的CPC、和约3体积％胰胨豆胨培养液、约57.6体积％的大豆油、和约27.7体积％的DiH₂O（本文指定为90％X2Y2PC/TSB）。在本发明的另一个实施方案中，制剂包含约1.8体积％TRITON X-100、约1.8体积％TYLOXAPOL、约7.2体积％TBP、约0.9体积％的CPC、约1体积％酵母提取物、约57.6体积％的大豆油、和约29.7体积％的DiH₂O（本文指定为90％X2Y2PC/YE）。

在本发明的一些实施方案中，本发明制剂包含约3体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的TBP、和约1体积％的CPC、约60 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约15 - 30体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。在本发明的特定实施方案中，本发明制剂包含约3体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的TBP、和约1体积％的CPC、约64体积％的大豆、和约24体积％的DiH₂O（本文指定为Y3PC）。

在本发明的一些实施方案中，本发明制剂包含约4 - 8体积％的TRITON X-100、约5 - 8体积％的TBP、约30 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约0 - 30体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。另外，这些实施方案中的某些进一步包含约1体积％的CPC、约1体积％的苯扎氯铵、约1体积％十六烷基溴化吡啶、约1体积％十六烷基二甲基乙基溴化铵、500 µM EDTA、约10 mM氯化铵、约5 mM肌苷、和约5 mM L-丙氨酸。例如，在这些实施方案的某些中，本发明制剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约64体积％的大豆油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为X8P）。在本发明的另一个实施方案中，本发明制剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约1％的CPC、约64体积％的大豆油、和约19体积％的DiH₂O（本文指定为X8PC）。在另外一个实施方案中，制剂包含约8体积％TRITON X-100、约8体积％的TBP、约1体积％的CPC、约50体积％的大豆油、和约33体积％的DiH₂O（本文指定为ATB-X1001）。在另外一个实施方案中，制剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约2体积％的CPC、约50体积％的大豆油、和约32体积％的DiH₂O（本文指定为ATB- X002）。本发明的另一个实施方案包含约4体积％TRITON X-100、约4体积％的TBP、约0.5体积％的CPC、约32体积％的大豆油、和约59.5体积％的DiH₂O（本文指定为50％X8PC）。另外一个相关实施方案包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约0.5体积％CPC、约64体积％的大豆油、和约19.5体积％的DiH₂O（本文指定为X8PC_1/2）。在本发明的一些实施方案中，本发明制剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约2体积％的CPC、约64体积％的大豆油、和约18体积％的DiH₂O（本文指定为X8PC2）。在其他实施方案中，本发明制剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8％的TBP、约1％的苯扎氯铵、约50体积％的大豆油、和约33体积％的DiH₂O（本文指定为X8P BC）。在本发明的可替代实施方案中，制剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约1体积％的十六烷基溴化吡啶、约50体积％的大豆油、和约33体积％的DiH₂O（本文指定为X8P CPB）。在本发明的另一个示例性实施方案中，制剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约1体积％的十六烷基二甲基乙基溴化铵、约50体积％的大豆油、和约33体积％的DiH₂O（本文指定为X8P CTAB）。在再进一步的实施方案中，本发明包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约1体积％的CPC、约500 µM EDTA、约64体积％的大豆油、和约15.8体积％的DiH₂O（本文指定为X8PC EDTA）。另外相似的实施方案包含8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约1体积％的CPC、约10 mM氯化铵、约5 mM肌苷、约5 mM L-丙氨酸、约64体积％的大豆油、和约19体积％的DiH₂O或PBS（本文指定为X8PC GE_1x）。在本发明的另一个实施方案中，本发明制剂进一步包含约5体积％的TRITON X-100、约5％的TBP、约1体积％的CPC、约40体积％的大豆油、和约49体积％的DiH₂O（本文指定为X5P₅C）。

在本发明的一些实施方案中，本发明制剂包含约2体积％的TRITON X-100、约6体积％TBP、约8体积％乙醇、约64体积％的大豆油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为X2Y6E）。

在本发明的另外实施方案中，制剂包含约8体积％的TRITON X-100、和约8体积％的甘油、约60 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约15 - 25体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。某些相关实施方案进一步包含约1体积％L-抗坏血酸。例如，一个特定实施方案包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的甘油、约64体积％的大豆油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为X8G）。在另外一个实施方案中，本发明制剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的甘油、约1体积％的L-抗坏血酸、约64体积％的大豆油、和约19体积％的DiH₂O（本文指定为X8GV_c）。

在再进一步的实施方案中，本发明制剂包含约8体积％的TRITON X-100、约0.5 – 0.8体积％的TWEEN 60、约0.5 – 2.0体积％的CPC、约8体积％的TBP、约60 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约15 - 25体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。例如，在一个特定实施方案中，制剂包含约8体积％的TRITON X-100、约0.70体积％的TWEEN 60、约1体积％的CPC、约8体积％的TBP、约64体积％的大豆油、和约18.3体积％的DiH₂O（本文指定为X8W60PC₁）。另一个相关实施方案包含约8体积％的TRITON X-100、约0.71体积％的TWEEN 60、约1体积％的CPC、约8体积％的TBP、约64体积％的大豆油、和约18.29体积％的DiH₂O（本文指定为W60_0.7X8PC）。在另外其他实施方案中，本发明制剂包含约8体积％的TRITON X-100、约0.7体积％的TWEEN 60、约0.5体积％的CPC、约8体积％的TBP、约64 - 70体积％的大豆油、和约18.8体积％的DiH₂O（本文指定为X8W60PC₂）。在另外其他实施方案中，本发明包含约8体积％的TRITON X-100、约0.71体积％的TWEEN 60、约2体积％的CPC、约8体积％的TBP、约64体积％的大豆油、和约17.3体积％的DiH₂O。在本发明的另一个实施方案中，制剂包含约0.71体积％的TWEEN 60、约1体积％的CPC、约8体积％的TBP、约64体积％的大豆油、和约25.29体积％的DiH₂O（本文指定为W60_0.7PC）。

在本发明的另一个实施方案中，本发明制剂包含约2体积％的琥珀酸二辛酯磺酸盐、约8体积％的甘油、或约8体积％TBP、加上约60 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约23体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。例如，本发明的一个实施方案包含约2体积％的琥珀酸二辛酯磺酸盐、约8体积％的甘油、约64体积％的大豆油、和约26体积％的DiH₂O（本文指定为D2G）。在另一个相关实施方案中，本发明制剂包含约2体积％的琥珀酸二辛酯磺酸盐、和约8体积％的TBP、约64体积％的大豆油、和约26体积％的DiH₂O（本文指定为D2P）。

在本发明的另外其他实施方案中，本发明制剂包含约8 - 10体积％的甘油、和约1 – 10体积％的CPC、约50 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约15 - 30体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。另外，在这些实施方案的某些中，组合物进一步包含约1体积％的L-抗坏血酸。例如，一个特定实施方案包含约8体积％的甘油、约1体积％的CPC、约64体积％的大豆油、和约27体积％的DiH₂O（本文指定为GC）。一个另外相关实施方案包含约10体积％的甘油、约10体积％的CPC、约60体积％的大豆油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为GC10）。在本发明的另外一个实施方案中，本发明制剂包含约10体积％的甘油、约1体积％的CPC、约1体积％的L-抗坏血酸、约60体积％的大豆或油、和约24体积％的DiH₂O（本文指定为GCV_c）。

在本发明的一些实施方案中，本发明制剂包含约8 - 10体积％的甘油、约8 – 10体积％的SDS、约50 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约15 - 30体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。另外，在这些实施方案的某些中，组合物进一步包含约1体积％的卵磷脂和约1体积％的对羟基苯甲酸甲酯。此种制剂的示例性实施方案包含约8体积％SDS、8体积％的甘油、约64体积％的大豆油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为S8G）。相关制剂包含约8体积％的甘油、约8体积％的SDS、约1体积％的卵磷脂、约1体积％的对羟基苯甲酸甲酯、约64体积％的大豆油、和约18体积％的DiH₂O（本文指定为S8GL1B1）。

在本发明的另外一个实施方案中，本发明制剂包含约4体积％的TWEEN 80、约4体积％的TYLOXAPOL、约1体积％的CPC、约8体积％的乙醇、约64体积％的大豆油、和约19体积％的DiH₂O（本文指定为W₈₀4Y4EC）。

在本发明的一些实施方案中，本发明制剂包含约0.01体积％的CPC、约0.08体积％的TYLOXAPOL、约10体积％的乙醇、约70体积％的大豆油、和约19.91体积％的DiH₂O（本文指定为Y.08EC.01）。

在本发明的另外一个实施方案中，本发明制剂包含约8体积％的月桂基硫酸钠、和约8体积％的甘油、约64体积％的大豆油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为SLS8G）。

上文描述的具体制剂仅仅是举例说明在本发明中有用的多种组合物的例子。本发明预期上述制剂的许多变动、以及另外的纳米乳剂在本发明的方法有用。为了测定候选乳剂是否适合于与本发明一起使用，可以分析3个标准。使用本文描述的方法和标准，可以容易地测试候选乳剂，以测定它们是否合适。首先，使用本文描述的方法制备所需成分，以测定是否可以形成乳剂。如果不能形成乳剂，那么候选物被淘汰。例如，由4.5％硫代硫酸钠、0.5％柠檬酸钠、10％正丁醇、64％大豆油和21％DiH₂O制成的候选组合物不形成乳剂。

其次，在优选实施方案中，候选乳剂应形成稳定乳剂。如果乳剂以乳剂形式保持足够时间段，以允许其预期用途，那么它是稳定的。例如，对于待贮存、运输等的乳剂，可能希望组合物以乳剂形式保持数月到数年。相对不稳定的一般乳剂将在一天内丧失其形式。例如，由8％1-丁醇、5％TWEEN 10、1％CPC、64％大豆油和22％DiH₂O制成的候选组合物不形成稳定乳剂。下述候选乳剂使用本文描述的方法显示是稳定的：0.08％TRITON X-100、0.08％甘油、0.01％十六烷基氯化吡啶、99％黄油和0.83％diH₂O（本文指定为1％X8GC黄油）；0.8％TRITON X-100、0.8％甘油、0.1％十六烷基氯化吡啶、6.4％大豆油、1.9％diH₂O和90％黄油（本文指定为10％X8GC黄油）；2％W₂₀5EC、1％Natrosol 250L NF和97％diH₂O（本文指定为2％W₂₀5EC L GEL）；1％十六烷基氯化吡啶、5％TWEEN 20、8％乙醇、64％70粘性矿物油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC 70矿物油）；1％十六烷基氯化吡啶、5％TWEEN 20、8％乙醇、64％350粘性矿物油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC 350矿物油）。

第三，候选乳剂应具有用于其预期用途的功效。例如，抗细菌乳剂应杀死病原体或使病原体无能力至可检测水平。如本文显示的，本发明的某些乳剂具有针对特定微生物的功效，但不针对其他。使用本文描述的方法，人们能够测定特定候选乳剂针对所需微生物的适合性。一般地，这涉及使微生物在与合适对照样品（例如阴性对照例如水）的并列实验中暴露于乳剂一个或多个时间段，并且测定乳剂是否杀死微生物或使微生物无能力，和至何种程度。例如，由1％氯化铵、5％TWEEN 20、8％乙醇、64％大豆油和22％DiH₂O制成的候选组合物显示不是有效乳剂。下述候选乳剂使用本文描述的方法显示是有效的：5％TWEEN 20、5％十六烷基氯化吡啶、10％甘油、60％大豆油和20％diH₂O（本文指定为W₂₀5GC5）；1％十六烷基氯化吡啶、5％TWEEN 20、10％甘油、64％大豆油和20％diH₂O（本文指定为W₂₀5GC）；1％十六烷基氯化吡啶、5％TWEEN 20、8％乙醇、64％橄榄油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC橄榄油）；1％十六烷基氯化吡啶、5％TWEEN 20、8％乙醇、64％亚麻子油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC亚麻子油）；1％十六烷基氯化吡啶、5％TWEEN 20、8％乙醇、64％玉米油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC玉米油）；1％十六烷基氯化吡啶、5％TWEEN 20、8％乙醇、64％椰子油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC椰子油）；1％十六烷基氯化吡啶、5％TWEEN 20、8％乙醇、64％棉籽油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC棉籽油）；8％葡萄糖、5％TWEEN 10、1％十六烷基氯化吡啶、64％大豆油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5C葡萄糖）；8％PEG 200、5％TWEEN 10、1％十六烷基氯化吡啶、64％大豆油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5C PEG 200）；8％甲醇、5％TWEEN 10、1％十六烷基氯化吡啶、64％大豆油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5C甲醇）；8％PEG 1000、5％TWEEN 10、1％十六烷基氯化吡啶、64％大豆油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5C PEG 1000）；2％W₂₀5EC、2％Natrosol 250H NF和96％diH₂O（本文指定为2％W₂₀5EC Natrosol 2，也称为2％W₂₀5EC GEL）；2％W₂₀5EC、1％Natrosol 250H NF和97％diH₂O（本文指定为2％W₂₀5EC Natrosol 1）；2％W₂₀5EC、3％Natrosol 250H NF和95％diH₂O（本文指定为2％W₂₀5EC Natrosol 3）；2％W₂₀5EC、0.5％Natrosol 250H NF和97.5％diH₂O（本文指定为2％W₂₀5EC Natrosol 0.5）；2％W₂₀5EC、2％Methocel A和96％diH₂O（本文指定为2％W₂₀5EC Methocel A）；2％W₂₀5EC、2％Methocel K和96％diH₂O（本文指定为2％W₂₀5EC Methocel K）；2％Natrosol、0.1％X8PC、0.1x PBS、5 mM L-丙氨酸、5 mM肌苷、10 mM氯化铵和diH₂O（本文指定为0.1％X8PC/GE+2％Natrosol）；2％Natrosol、0.8％TRITON X-100、0.8％磷酸三丁酯、6.4％大豆油、0.1％十六烷基氯化吡啶、0.1x PBS、5 mM L-丙氨酸、5 mM肌苷、10 mM氯化铵和diH₂O（本文指定为10％X8PC/GE+2％Natrosol）；1％十六烷基氯化吡啶、5％TWEEN 20、8％乙醇、64％猪油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC猪油）；1％十六烷基氯化吡啶、5％TWEEN 20、8％乙醇、64％矿物油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC矿物油）；0.1％十六烷基氯化吡啶、2％Nerolidol、5％TWEEN 20、10％乙醇、64％大豆油和18.9％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC_0.1N）；0.1％十六烷基氯化吡啶、2％法尼醇、5％TWEEN 20、10％乙醇、64％大豆油和18.9％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC_0.1F）；0.1％十六烷基氯化吡啶、5％TWEEN 20、10％乙醇、64％大豆油和20.9％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC_0.1）；10％十六烷基氯化吡啶、8％磷酸三丁酯、8％TRITON X-100、54％大豆油和20％diH₂O（本文指定为X8PC₁₀）；5％十六烷基氯化吡啶、8％TRITON X-100、8％磷酸三丁酯、59％大豆油和20％diH₂O（本文指定为X8PC₅）；0.02％十六烷基氯化吡啶、0.1％TWEEN 20、10％乙醇、70％大豆油和19.88％diH₂O（本文指定为W₂₀0.1EC_0.02）；1％十六烷基氯化吡啶、5％TWEEN 20、8％甘油、64％Mobil 1和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5GC Mobil 1）；7.2％TRITON X-100、7.2％磷酸三丁酯、0.9％十六烷基氯化吡啶、57.6％大豆油、0.1x PBS、5 mM L-丙氨酸、5 mM肌苷、10 mM氯化铵和25.87％diH₂O（本文指定为90％X8PC/GE）；7.2％TRITON X-100、7.2％磷酸三丁酯、0.9％十六烷基氯化吡啶、57.6％大豆油、1％EDTA、5 mM L-丙氨酸、5 mM肌苷、10 mM氯化铵、0.1x PBS和diH₂O（本文指定为90％X8PC/GE EDTA）；和7.2％TRITON X-100、7.2％磷酸三丁酯、0.9％十六烷基氯化吡啶、57.6％大豆油、1％硫代硫酸钠、5 mM L-丙氨酸、5 mM肌苷、10 mM氯化铵、0.1x PBS和diH₂O（本文指定为90％X8PC/GE STS）。

1. 水相

在一些实施方案中，乳剂包含水相。在某些优选实施方案中，乳剂包含5 - 50、优选10 - 40、更优选15 - 30体积％水相，基于乳剂的总体积（尽管还预期了其他浓度）。在优选实施方案中，水相包含处于pH约4 - 10、优选约6 - 8的水。水优选是去离子的（在下文中“DiH₂O”）。在一些实施方案中，水相包含磷酸缓冲盐水（PBS）。在一些优选实施方案中，水相是无菌和无致热原的。

2. 油相

在一些实施方案中，乳剂包含油相。在某些优选实施方案中，本发明的乳剂的油相（例如载体油）包含30-90、优选60-80、和更优选60-70体积％的油，基于乳剂的总体积（尽管更高和更低浓度也在本文描述的乳剂中有用）。

在本发明的纳米乳剂疫苗中的油可以是任何美容或药学可接受的油。油可以是挥发性或不挥发性的，并且可以选自动物油、植物油、天然油、合成油、烃油、硅油、其半合成衍生物及其组合。

合适的油包括但不限于矿物油、角鲨烯油、香味油（flavor oils）、硅油、精油、水不溶性的维生素、硬脂酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸辛酯、棕榈酸十六酯、山酸十三酯、己二酸二异丙酯、癸二酸二辛脂、邻氨基苯甲酸薄荷酯（Menthyl anthranhilate）、辛酸十六酯、水杨酸辛酯、肉豆蔻酸异丙酯、neopenty glycol dicarpate cetols、Ceraphyls®、油酸癸酯、己二酸二异丙酯、乳酸C_12-15烷基酯、乳酸十六酯、乳酸月桂酯、新戊酸异硬脂醇酯、乳酸肉豆蔻酯、硬脂酸异十六烷基硬脂酰酯、硬脂酸辛基十二烷基硬脂酰酯、烃油、异链烷烃、液体石蜡、异十二烷、矿脂、阿甘（Argan）油、低芥酸菜子油、辣椒油（Chile oil）、椰子油、玉米油、棉籽油、亚麻子油、葡萄子油、芥子油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、花生油、松子油、罂粟子油、南瓜子油、米糠油、红花油、茶油、松露油（Truffle oil）、植物油、杏（仁）油、霍霍巴油（simmondsia chinensis种子油）、葡萄子油、澳洲坚果油（Macadamia oil)、小麦胚芽油、杏仁油、菜子油、葫芦油、大豆油、芝麻油、榛子油、玉蜀黍油、向日葵油、大麻油、Bois oil、夏威夷果（Kuki nut）油、鳄梨油、核桃油、鱼油、浆果油、众香子油、杜松油、种子油、杏仁种子油、茴香子油、芹菜子油、枯茗子油、肉豆蔻子油、叶油、罗勒叶油、月桂叶油、肉桂叶油、荔枝草叶油、桉叶油、柠檬草叶油、白千层叶油、牛至叶油、广霍香叶油、薄荷叶油、松针油、迷迭香叶油、留兰香叶油、茶树叶油、百里香叶油、冬青叶油、花油、春黄菊油、鼠尾草油、丁子香油、天竺葵花油、牛膝草花油、茉莉花油、薰衣草花油、麦卢卡树（manuka）花油、Marhoram花油、橙花油、玫瑰花油、衣兰花油、树皮油、中国肉桂树皮油、肉桂皮油、檫树树皮油、木油、樟脑木油、柏木油、玫瑰木油、檀香油）、根茎（姜）木油、树脂油、乳香油、没药油、果皮油、香柠檬皮油、柚子皮油、柠檬皮油、酸橙皮油、橙皮油、红橘皮油、根油、缬草油、油酸、亚油酸、油醇、异十八烷醇、其半合成衍生物及其任何组合。

油可以进一步包含硅氧烷组分，例如挥发性硅氧烷组分，其可以是硅氧烷组分中的唯一油或可以与其他硅氧烷和非硅氧烷、挥发性和不挥发性油组合。合适的硅氧烷组分包括但不限于甲基苯基聚硅氧烷、西甲硅油（simethicone）、二甲基硅氧烷、苯基三甲基硅氧烷（或其有机改性的形式）、聚合硅氧烷的烷基化衍生物、十六烷基二甲基硅氧烷、月桂基三甲基硅氧烷、聚合硅氧烷的羟基化衍生物例如聚二甲基硅氧烷醇、挥发性硅油、环状和线性硅氧烷、环甲基硅酮、环甲基硅酮的衍生物、六甲基环丙硅氧烷、八甲基环四硅氧烷、十甲基环戊硅氧烷、挥发性线性二甲基聚硅氧烷、异十六烷、异二十烷、异二十四烷、聚异丁烯、异辛烷、异十二烷、其半合成衍生物及其组合。

挥发性油可以是有机溶剂，或可以存在除有机溶剂外的挥发性油。合适的挥发性油包括但不限于萜、单萜、倍半萜、驱风剂、甘菊环、薄荷醇、樟脑、酮、麝香草酚、橙花醇、沉香醇、烯、香叶醇、紫苏子醇、橙花叔醇、法尼醇、衣兰烯、红没药醇、法尼烯、驱蛔脑、土荆芥油、香茅醛、柠檬醛、香茅醇、母菊、蓍草、愈创木、春黄菊、其半合成衍生物或组合。

在本发明的一个方面，在硅氧烷组分中的挥发性油不同于油相中的油。

在一些实施方案中，油相包含3-15且优选5-10体积％的有机溶剂，基于乳剂的总体积。虽然本发明并不限于任何具体机制，但预期在乳剂中采用的基于有机磷酸酯的溶剂作用于去除或破裂病原体的膜中的脂质。因此，去除微生物膜中的固醇或磷脂的任何溶剂在本发明的方法中有用。合适的有机溶剂包括但不限于基于有机磷酸酯的溶剂或醇。在一些优选实施方案中，无毒醇（例如乙醇）用作溶剂。油相和在油相中提供的任何另外化合物优选是无菌和无致热原的。

3. 表面活性剂和去污剂

在一些实施方案中，乳剂进一步包含表面活性剂或去污剂。在一些优选实施方案中，乳剂包含约3 – 15％且优选约10％的一种或多种表面活性剂或去污剂（尽管还预期了其他浓度）。虽然本发明并不限于任何具体机制，但预期当存在于乳剂中时，表面活性剂帮助稳定乳剂。预期了非离子型（非阴离子型）和离子型表面活性剂。另外，来自表面活性剂的BRIJ家族的表面活性剂在本发明的组合物中有用。表面活性剂可以在水或油相中提供。适合于与乳剂一起使用的表面活性剂包括多种阴离子和非离子型表面活性剂，以及能够促进水包油乳剂形成的其他乳化化合物。一般而言，乳化化合物是相对亲水的，并且乳化化合物的掺合物可以用于达到必需质量。在一些制剂中，非离子型表面活性剂具有超过离子型乳化剂的优点，这是因为它们基本上与广泛pH范围更相容，且经常形成比离子型（例如皂型）乳化剂更稳定的乳剂。

在本发明的纳米乳剂疫苗中的表面活性剂可以是药学可接受的离子型表面活性剂、药学可接受的非离子型表面活性剂、药学可接受的阳离子型表面活性剂、药学可接受的阴离子型表面活性剂、或药学可接受的两性离子型表面活性剂。

示例性有用的表面活性剂在Applied Surfactants: Principles and Applications. Tharwat F. Tadros，Copyright 8 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA，Weinheim ISBN: 3-527-30629-3）中描述，其特别引入作为参考。

进一步地，表面活性剂可以是药学可接受的离子型聚合物表面活性剂、药学可接受的非离子型聚合物表面活性剂、药学可接受的阳离子型聚合物表面活性剂、药学可接受的阴离子型聚合物表面活性剂、或药学可接受的两性离子型聚合物表面活性剂。聚合物表面活性剂的例子包括但不限于具有多条（至少一条）聚环氧乙烷（PEO）侧链的聚（甲基丙烯酸甲酯）主链的接枝共聚物、聚羟基硬脂酸、烷氧基化烷基酚甲醛缩合物、具有脂肪酸疏水物的聚烷撑二醇改性的聚酯、聚酯、其半合成衍生物或其组合。

表面活化剂或表面活性剂是两亲分子，其由与极性或离子亲水部分附着的非极性疏水部分组成，通常为含8-18个碳原子的直链或支链烃或碳氟化合物链。亲水部分可以是非离子、离子或两性离子的。烃链在水环境中与水分子弱相互作用，而极性或离子首基经由偶极或离子-偶极相互作用与水分子强相互作用。基于亲水基团的性质，将表面活性剂分类为阴离子型、阳离子型、两性离子型、非离子型和聚合物表面活性剂。

合适的表面活性剂包括但不限于包含9 – 10个乙二醇单位的乙氧基化壬基酚、包含8个乙二醇单位的乙氧基化十一醇、聚氧乙烯（20）山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯（20）山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯（20）山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚氧乙烯（20）山梨糖醇酐单油酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、乙氧基化氢化蓖麻油、十二烷基硫酸钠、环氧乙烷（ethyleneoxyde）和环氧丙烷（propyleneoxyde）的二嵌段共聚物、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、和基于环氧乙烷和环氧丙烷的四官能嵌段共聚物、甘油单酯、癸酸甘油酯、辛酸甘油酯、椰油酸甘油酯（Glyceryl cocate）、甘油芥酸酯、羟基硬脂酸甘油酯、异硬脂酸甘油酯、羊毛脂酸甘油酯、月桂酸甘油酯、亚油酸甘油酯、肉豆蔻酸甘油酯、油酸甘油酯、甘油基PABA、棕榈酸甘油酯、蓖麻醇酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、巯基乙酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二油酸甘油酯、二肉豆蔻酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、倍半油酸甘油酯（Glyceryl sesuioleate）、甘油硬脂酸酯乳酸酯、聚氧乙烯鲸蜡基/硬脂基醚、聚氧乙烯胆固醇醚、聚氧乙烯月桂酸酯或二月桂酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯或二硬脂酸酯、聚氧乙烯脂肪族醚、聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯硬脂基醚、聚氧乙烯肉豆蔻基醚、类固醇、胆固醇、β谷甾醇、红没药醇、醇的脂肪酸酯、肉豆蔻酸异丙酯、脂族正丁酸异丙酯、正己酸异丙酯、正癸酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸辛基十二醇酯、烷氧基化醇、烷氧基化酸、烷氧基化酰胺、烷氧基化糖衍生物、天然油和蜡的烷氧基化衍生物、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、壬苯聚醇-14、PEG-8月桂酸酯、PEG-6 椰油酰胺（Cocoamide）、PEG-20甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯、PEG40羊毛脂、PEG-40蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、聚氧乙烯脂肪族醚、甘油基二酯、聚氧乙烯硬脂基醚、聚氧乙烯肉豆蔻基醚、和聚氧乙烯十二烷基醚、二月桂酸甘油酯、二肉豆蔻酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、其半合成衍生物或其混合物。

另外合适的表面活性剂包括但不限于非离子脂质，例如月桂酸甘油酯、肉豆蔻酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二肉豆蔻酸甘油酯、其半合成衍生物及其混合物。

在另外实施方案中，表面活性剂是具有范围为约2 – 约100个基团的聚氧乙烯首基的聚氧乙烯脂肪族醚，或具有结构R₅ --（OCH₂ CH₂）_y –OH的烷氧基化醇，其中R₅是具有约6 – 约22个碳原子的分支或不分支烷基，并且y是约4 – 约100，并且优选约10 – 约100。优选地，烷氧基化醇是其中R₅是月桂基并且y具有23的平均值的种类。

在不同实施方案中，表面活性剂是烷氧基化醇，其为羊毛脂醇的乙氧基化衍生物。优选地，羊毛脂醇的乙氧基化衍生物是laneth-10，其是具有10的平均乙氧基化值的羊毛脂醇的聚乙二醇醚。

非离子型表面活性剂包括但不限于乙氧基化表面活性剂、乙氧基化醇、乙氧基化烷基酚、乙氧基化脂肪酸、乙氧基化单链烷醇酰胺、乙氧基化山梨糖醇酐酯、乙氧基化脂肪族氨基、环氧乙烷-环氧丙烷共聚物、双（聚乙二醇双[咪唑基羰基]）、壬苯醇醚-9、双（聚乙二醇双[咪唑羰基]）、Brij^®35、Brij^® 56、Brij^® 72、Brij^® 76、Brij^® 92V、Brij^® 97、Brij^® 58P、Cremophor^® EL、十甘醇单十二烷基醚、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、n-癸基α-D-吡喃型葡糖苷、癸基β-D-吡喃型麦芽糖苷、n-十二烷酰-N-甲基葡糖酰胺、n-十二烷基α-D-麦芽糖苷、n-十二烷基β-D-麦芽糖苷、n-十二烷基β-D-麦芽糖苷、七甘醇单癸基醚、七甘醇单十二烷基醚、七甘醇单十四烷基醚、n-十六烷基β-D-麦芽糖苷、六甘醇单十二烷基醚、六甘醇单十六烷基醚、六甘醇单十八烷基醚、六甘醇单十四烷基醚、Igepal CA-630、Igepal CA-630、甲基-6-O-（N-庚基氨基甲酰基）α-D-吡喃型葡糖苷、九甘醇单十二烷基醚、N-壬酰-N-甲基葡糖胺、N-壬酰-N-甲基葡糖胺、八甘醇单癸基醚、八甘醇单十二烷基醚、八甘醇单十六烷基醚、八甘醇单十八烷基醚、八甘醇单十四烷基醚、辛基-β-D-吡喃型葡糖苷、五甘醇单癸基醚、五甘醇单十二烷基醚、五甘醇单十六烷基醚、五甘醇单己基醚、五甘醇单十八烷基醚、五甘醇单辛基醚、聚乙二醇二环氧甘油醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20异十六烷基醚、聚氧乙烯20油基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯双（咪唑基羰基）、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、来自皂树皮的皂苷、Span^® 20、Span^® 40、Span^® 60、Span^® 65、Span^® 80、Span^® 85、Tergitol, Type 15-S-12、Tergitol, Type 15-S-30、Tergitol, Type 15-S-5、Tergitol, Type 15-S-7、Tergitol, Type 15-S-9、Tergitol, Type NP-10、Tergitol, Type NP-4、Tergitol, Type NP-40、Tergitol, Type NP-7、Tergitol, Type NP-9、Tergitol、Tergitol, Type TMN-10、Tergitol, Type TMN-6、十四烷基-β-D-麦芽糖苷、四甘醇单癸基醚、四甘醇单十二烷基醚、四甘醇单十四烷基醚、三甘醇单癸基醚、三甘醇单十二烷基醚、三甘醇单十六烷基醚、三甘醇单辛基醚、三甘醇单十四烷基醚、Triton CF-21、Triton CF-32、Triton DF-12、Triton DF-16、Triton GR-5M、Triton QS-15、Triton QS-44、Triton X-100、Triton X-102、Triton X-15、Triton X-151、Triton X-200、Triton X-207、Triton^® X-100、Triton^® X-114、Triton^® X-165、Triton^® X-305、Triton^® X-405、Triton^® X-45、Triton^® X-705-70、TWEEN^® 20、TWEEN^® 21、TWEEN^® 40、TWEEN^® 60、TWEEN^® 61、TWEEN^® 65、TWEEN^® 80、TWEEN^® 81、TWEEN^® 85、泰洛沙泊、n-十一基β-D-吡喃型葡糖苷、其半合成衍生物或其组合。

此外，非离子型表面活性剂可以是泊洛沙姆。泊洛沙姆是由聚氧乙烯的嵌段、随后为聚氧丙烯的嵌段、随后为聚氧乙烯的嵌段制成的聚合物。聚氧乙烯和聚氧丙烯单位的平均数目基于与聚合物有关的数目而改变。例如，最小聚合物泊洛沙姆101由具有平均2个聚氧乙烯单位的嵌段、具有平均16个聚氧丙烯单位的嵌段、随后为具有平均2个聚氧乙烯单位的嵌段组成。泊洛沙姆范围从无色液体和糊剂到白色固体。在化妆品和个人护理产品中，泊洛沙姆用于皮肤清洁剂、沐浴产品、洗发剂、护发素、漱口水、眼部卸妆液及其他皮肤和毛发产品的配制中。泊洛沙姆的例子包括但不限于泊洛沙姆101、泊洛沙姆105、泊洛沙姆108、泊洛沙姆122、泊洛沙姆123、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆183、泊洛沙姆184、泊洛沙姆185、泊洛沙姆188、泊洛沙姆212、泊洛沙姆215、泊洛沙姆217、泊洛沙姆231、泊洛沙姆234、泊洛沙姆235、泊洛沙姆237、泊洛沙姆238、泊洛沙姆282、泊洛沙姆284、泊洛沙姆288、泊洛沙姆331、泊洛沙姆333、泊洛沙姆334、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338、泊洛沙姆401、泊洛沙姆402、泊洛沙姆403、泊洛沙姆407、泊洛沙姆105苯甲酸酯和泊洛沙姆182二苯甲酸酯。

合适的阳离子型表面活性剂包括但不限于季铵化合物、烷基三甲基氯化铵化合物、二烷基二甲基氯化铵化合物、阳离子含卤素化合物例如十六烷基氯化吡啶、苯扎氯铵、苯扎氯铵、苄基二甲基十六烷基氯化铵、苄基二甲基十四烷基氯化铵、苄基十二烷基二甲基溴化铵、苄基三甲基四氯碘酸铵、二甲基双十八烷基溴化铵、十二烷基乙基二甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、乙基十六烷基二甲基溴化铵、Girard氏试剂T、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、N,N’,N’-聚氧乙烯（10）-N-牛脂-1,3-二氨基丙烷、铵溴通佐、三甲基（十四烷基）溴化铵、1,3,5-三嗪-1,3,5（2H,4H,6H）-三乙醇、1-Decanaminium、N-癸基- N，N-二甲基氯化物、二癸基二甲基氯化铵、2-（2-（对-（二异丁基）甲苯氧基（cresosxy））乙氧基）乙基二甲基苄基氯化铵、2-（2-（对-（二异丁基）苯氧基）乙氧基）乙基二甲基苄基氯化铵、烷基1或3苄基-1-（2-羟乙基）-2-氯化咪唑啉、烷基双（2-羟乙基）苄基氯化铵、烷基去甲基苄基氯化铵、烷基二甲基3,4-二氯苄基氯化铵（100％C12）、烷基二甲基3,4-二氯苄基氯化铵（50％C14、40％C12、10％C16）、烷基二甲基3,4-二氯苄基氯化铵（55％C14、23％C12、20％C16）、烷基二甲基苄基氯化铵、烷基二甲基苄基氯化铵（100％C14）、烷基二甲基苄基氯化铵（100％C16）、烷基二甲基苄基氯化铵（41％C14、28％C12）、烷基二甲基苄基氯化铵（47％C12、18％C14）、烷基二甲基苄基氯化铵（55％C16、20％C14）、烷基二甲基苄基氯化铵（58％C14、28％C16）、烷基二甲基苄基氯化铵（60％C14、25％C12）、烷基二甲基苄基氯化铵（61％C11、23％C14）、烷基二甲基苄基氯化铵（61％C12、23％C14）、烷基二甲基苄基氯化铵（65％C12、25％C14）、烷基二甲基苄基氯化铵（67％C12、24％C14）、烷基二甲基苄基氯化铵（67％C12、25％C14）、烷基二甲基苄基氯化铵（90％C14、5％C12）、烷基二甲基苄基氯化铵（93％C14、4％C12）、烷基二甲基苄基氯化铵（95％C16、5％C18）、烷基二甲基苄基氯化铵、烷基二癸基二甲基氯化铵、烷基二甲基苄基氯化铵、烷基二甲基苄基氯化铵（C12-16）、烷基二甲基苄基氯化铵（C12-18）、烷基二甲基苄基氯化铵、二烷基二甲基苄基氯化铵、烷基二甲基二甲基苄基氯化铵、烷基二甲基乙基溴化铵（90％C14、5％C16、5％C12）、烷基二甲基乙基溴化铵（如在大豆油的脂肪酸中的混合烷基和链烯基）、烷基二甲基乙基苄基氯化铵、烷基二甲基乙基苄基氯化铵（60％C14）、烷基二甲基异丙基苄基氯化铵（50％C12、30％C14、17％C16、3％C18）、烷基三甲基氯化铵（58％C18、40％C16、1％C14、1％C12）、烷基三甲基氯化铵（90％C18、10％C16）、烷基二甲基（乙基苄基）氯化铵（C12-18）、二-（C8-10）-烷基二甲基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、二烷基甲基苄基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、二异癸基二甲基氯化铵、二辛基二甲基氯化铵、十二烷基双（2-羟乙基）辛基氢氯化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵、十二烷基氨基甲酰基甲基二甲基（dinethyl）苄基氯化铵、十七烷基羟乙基氯化咪唑啉、六氢-1,3,5 –三（2-羟乙基）-s-三嗪、六氢-1,3,5-三（2-羟乙基）-s-三嗪、十四烷基二甲基苄基氯化铵（和）Quat RNIUM 14、N,N-二甲基-2-羟丙基氯化铵聚合物、n-十四烷基二甲基苄基氯化铵一水合物、辛基癸基二甲基氯化铵、辛基十二烷基二甲基氯化铵、辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苄基氯化铵、氧基二亚乙基双（烷基二甲基氯化铵）、季铵化合物、二椰油烷基二甲基氯化物、三甲氧基甲硅烷基丙基二甲基十八烷基氯化铵、三甲氧基甲硅烷基quats、三甲基十二烷基苄基氯化铵、其半合成衍生物及其组合。

示例性阳离子含卤素化合物包括但不限于十六烷基卤化吡啶、十六烷基三甲基卤化铵、十六烷基二甲基乙基卤化铵、十六烷基二甲基苄基卤化铵、十六烷基三丁基卤化、十二烷基三甲基卤化铵、或十四烷基三甲基卤化铵。在一些特定实施方案中，合适的阳离子含卤素化合物包括但不限于十六烷基氯化吡啶（CPC）、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基苄基二甲基氯化铵、十六烷基溴化吡啶（CPB）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十六烷基二甲基乙基溴化铵、十六烷基三丁基溴化、十二烷基三甲基溴化铵、和十四烷基三甲基溴化铵。在特别优选的实施方案中，阳离子含卤素化合物是CPC，尽管本发明的组合物并不限于具有特定含阳离子化合物的制剂。

合适的阴离子型表面活性剂包括但不限于羧酸盐、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、鹅脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸钠盐、胆酸、公牛或绵羊胆汁、脱氢胆酸、脱氧胆酸、脱氧胆酸、脱氧胆酸甲酯、毛地黄皂苷、毛地黄毒苷配基、N,N-二甲基十二烷胺N-氧化物、多库酯钠盐、甘氨鹅脱氧胆酸钠盐、合成的甘氨胆酸水合物、合成的甘氨胆酸钠盐水合物、甘氨脱氧胆酸一水合物、甘氨脱氧胆酸钠盐、甘氨脱氧胆酸钠盐、甘氨石胆酸3-硫酸二钠盐、甘氨石胆酸乙酯、N-月桂酰基肌氨酸钠盐、N-月桂酰基肌氨酸溶液、N-月桂酰基肌氨酸溶液、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸锂、Lugol溶液、Niaproof 4，Type 4、1-辛烷磺酸钠盐、1-丁烷磺酸钠、1-癸烷磺酸钠、1-癸烷磺酸钠、1-十二烷磺酸钠、无水1-庚烷磺酸钠、无水1-庚烷磺酸钠、1-壬烷磺酸钠、1-丙磺酸钠一水合物、2-溴乙磺酸钠、胆酸钠水合物、胆酸钠、脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钠一水合物、十二烷基硫酸钠、无水己烷磺酸钠、辛基硫酸钠、无水戊烷磺酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺鹅脱氧胆酸钠盐、牛磺脱氧胆酸钠盐一水合物、牛磺猪脱氧胆酸钠盐水合物、牛磺石胆酸3-硫酸二钠盐、牛磺熊脱氧胆酸钠盐、Trizma^®十二烷基硫酸盐、TWEEN^® 80、熊脱氧胆酸、其半合成衍生物及其组合。

合适的两性离子型表面活性剂包括但不限于N-烷基甜菜碱，月桂基酰氨基（amindo）丙基二甲基甜菜碱，烷基二甲基氨基乙酸盐，N-烷基氨基丙酸盐，CHAPS，最低限度98％（TLC），CHAPS，SigmaUltra，最低限度98％（TLC），CHAPS，用于电泳，最低限度98％（TLC），CHAPSO，最低限度98％，CHAPSO，SigmaUltra，CHAPSO，用于电泳，3-（癸基二甲基铵）丙磺酸内盐，3-十二烷基二甲基铵）丙磺酸内盐，SigmaUltra，3-（十二烷基二甲基铵）丙磺酸内盐，3-（N,N-二甲基肉豆蔻基铵）丙磺酸盐，3-（N,N-二甲基十八烷基铵）丙磺酸盐，3-（N,N-二甲基辛基铵）丙磺酸内盐，3-（N,N-二甲基棕榈基铵）丙磺酸盐，其半合成衍生物及其组合。

本发明并不限于本文公开的表面活性剂。在本发明的组合物中有用的另外表面活性剂和去污剂可以由参考工作（例如包括但不限于McCutheon的第1卷: Emulsions and Detergents - North American Edition，2000）和商业来源进行确定。

4. 阳离子含卤素化合物

在一些实施方案中，乳剂进一步包含阳离子含卤素化合物。在一些优选实施方案中，乳剂包含约0.5 – 1.0重量％或更多阳离子含卤素化合物，基于乳剂的总重量（尽管还预期了其他浓度）。在优选实施方案中，阳离子含卤素化合物优选与油相预混合；然而，应当理解阳离子含卤素化合物可以与在不同制剂中的乳剂组合物组合提供。合适的阳离子含卤素化合物可以选自包含氯化物、氟化物、溴化物和碘化物离子的化合物。在优选实施方案中，合适的阳离子含卤素化合物包括但不限于十六烷基卤化吡啶、十六烷基三甲基卤化铵、十六烷基二甲基乙基卤化铵、十六烷基二甲基苄基卤化铵、十六烷基三丁基卤化、十二烷基三甲基卤化铵、或十四烷基三甲基卤化铵。在一些特定实施方案中，合适的阳离子含卤素化合物包括但不限于十六烷基氯化吡啶（CPC）、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基苄基二甲基氯化铵、十六烷基溴化吡啶（CPB）、和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十六烷基二甲基乙基溴化铵、十六烷基三丁基溴化、十二烷基三甲基溴化铵、和十四烷基三甲基溴化铵。在特别优选的实施方案中，阳离子含卤素化合物是CPC，尽管本发明的组合物并不限于具有任何特定含阳离子化合物的制剂。

5. 萌发增强剂

在本发明的其他实施方案中，纳米乳剂进一步包含萌发增强剂。在一些优选实施方案中，乳剂包含约1 mM – 15 mM，且更优选约5 mM – 10 mM一种或多种萌发增强化合物（尽管还预期了其他浓度）。在优选实施方案中，萌发增强化合物在乳剂形成前在水相中提供。本发明预期了当萌发增强剂添加到纳米乳剂组合物中时，纳米乳剂的杀孢子性质得到增强。本发明进一步预期了此种萌发增强剂接近中性pH（pH 6 – 8，且优选7）起始杀孢子活性。此种中性pH乳剂可以例如通过用磷酸缓冲盐水（PBS）稀释或通过制备中性乳剂来获得。纳米乳剂的杀孢子活性优选在孢子起始萌发时出现。

在特定实施方案中，已证实在本发明的疫苗中利用的乳剂具有杀孢子活性。虽然本发明并不限于任何具体机制，并且机制的理解不是实践本发明必需的，但认为乳剂的融合组分作用于起始萌发，并且在至营养体型的逆转完成前，乳剂的融合组分作用于裂解新萌发的孢子。乳剂的这些组分因此协同作用，以使得孢子对通过乳剂的破裂易感。萌发增强剂的添加进一步促进乳剂的抗杀孢子活性，例如通过加速杀孢子活性在其下发生的速率。

细菌内生孢子和真菌孢子的萌发与增加的代谢以及对热和化学反应物减少的抗性相关。为了萌发发生，孢子必须感觉环境足以支持营养体和繁殖。氨基酸L-丙氨酸刺激细菌孢子萌发（参见例如，Hills，J. Gen. Micro. 4:38（1950）；以及Halvorson和Church，Bacteriol Rev. 21:112（1957））。L-丙氨酸和L-脯氨酸也已报道起始真菌孢子萌发（Yanagita，Arch Mikrobiol 26:329（1957））。简单α-氨基酸例如甘氨酸和L-丙氨酸在代谢中占据中心位置。α-氨基酸的转氨基作用或脱氨基作用获得生糖原或生酮碳水化合物以及代谢和生长所需的氮。例如，L-丙氨酸的转氨基作用或脱氨基作用获得丙酮酸，其是糖酵解代谢的终产物（Embden-Meyerhof途径）。通过丙酮酸脱氢酶复合物的丙酮酸氧化获得乙酰辅酶A、NADH、H⁺和CO₂。乙酰辅酶A是关于三羧酸循环（Kreb's循环）的起始底物，这又供应线粒体电子传递链。乙酰辅酶A也是关于脂肪酸合成以及关于固醇合成的最终碳源。简单的α-氨基酸可以提供萌发和随后的代谢活性所需的氮、CO₂、生糖原和/或生酮等价物。

在某些实施方案中，本发明的合适萌发增强试剂包括但不限于-氨基酸包含甘氨酸，以及丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的L-对映体及其烷基酯。关于氨基酸对萌发的作用的另外信息可以在美国专利号5,510,104中发现；整体引入本文作为参考。在一些实施方案中，还可以使用葡萄糖、果糖、天冬酰胺、氯化钠（NaCl）、氯化铵（NH₄Cl）、氯化钙（CaCl₂）和氯化钾（KCl）的混合物。在本发明的特定优选实施方案中，制剂包含萌发增强剂L-丙氨酸、CaCl₂、肌苷和NH₄Cl。在一些实施方案中，组合物进一步包含一种或多种常见形式的生长培养基（例如胰胨豆胨培养液等），其另外可以自身包含或不包含萌发增强剂和缓冲剂。

上述化合物仅是示例性萌发增强剂，并且应当理解其他已知萌发增强剂将在本发明的一些实施方案中利用的纳米乳剂中有用。候选萌发增强剂应满足用于包括在本发明的组合物中的2个标准：它应能够与本文公开的乳剂结合，并且当掺入本文公开的乳剂中时，它应增加靶孢子的萌发率。本领域技术人员可以测定特定试剂是否具有充当萌发增强剂的所需功能，这通过将与本文公开的纳米乳剂组合的此种试剂应用于靶，且比较当通过与混合物接触时靶的灭活与通过不含试剂的本发明组合物的类似靶的灭活来实现。增加萌发且从而减少或抑制生物生长的任何试剂视为用于在本文公开的纳米乳剂组合物中使用的合适增强剂。

在另外其他实施方案中，萌发增强剂（或生长培养基）对中性乳剂组合物的添加产生用于在本发明的疫苗组合物中使用的组合物，其在灭活细菌孢子加上有包膜病毒、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌中有用。

6. 相互作用增强剂

在另外其他实施方案中，纳米乳剂包含能够增加组合物与靶病原体（例如革兰氏阴性细菌的细胞壁，例如弧菌属（Vibrio）、沙门氏菌属（Salmonella）、志贺氏菌属（Shigella）和假单胞菌属（Pseudomonas））的相互作用的一种或多种化合物（即“相互作用增强剂”）。在优选实施方案中，相互作用增强剂优选与油相预混合；然而，在其他实施方案中，相互作用增强剂与在乳化后的组合物组合提供。在某些优选实施方案中，相互作用增强剂是螯合试剂（例如在缓冲液（例如tris缓冲液）中的乙二胺四乙酸（EDTA）、亚乙基双（氧亚乙基次氮基）四乙酸（EGTA））。应当理解螯合试剂仅是示例性相互作用增强化合物。实际上，预期了增加在本发明的一些实施方案中使用的纳米乳剂与微生物试剂和/或病原体的相互作用的其他试剂。在特别优选实施方案中，相互作用增强剂处于约50 – 约250 µM的浓度。本领域技术人员将能够测定特定试剂是否具有充当相互作用增强剂的功能，这通过将与本发明的组合物组合的此种试剂应用于靶，且比较当通过与混合物接触时靶的灭活与通过不含试剂的本发明组合物的类似靶的灭活来实现。与在不存在其的情况下的那种参数相比较，增加乳剂与细菌的相互作用且从而减少或抑制细菌的生长的任何试剂视为相互作用增强剂。

在一些实施方案中，相互作用增强剂对纳米乳剂的添加产生用于在本发明的疫苗组合物中使用的组合物，其在灭活有包膜病毒、一些革兰氏阳性细菌和一些革兰氏阴性细菌中有用。

7. 季铵化合物

在一些实施方案中，本发明的纳米乳剂包括含季铵化合物。示例性季铵化合物包括但不限于烷基二甲基苄基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、烷基二甲基苄基和二烷基二甲基氯化铵、N,N-二甲基-2-羟丙基氯化铵聚合物、二癸基二甲基氯化铵、n-烷基二甲基苄基氯化铵、n-烷基二甲基乙基苄基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、n-烷基二甲基苄基氯化铵、n-十四烷基二甲基苄基氯化铵一水合物、n-烷基二甲基苄基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、六氢-1,3,5 –三（2-羟乙基）-s-三嗪、十四烷基二甲基苄基氯化铵（和）Quat RNIUM 14、烷基双（2-羟乙基）苄基氯化铵、烷基去甲基苄基氯化铵、烷基二甲基3,4-二氯苄基氯化铵、烷基二甲基苄基氯化铵、烷基二甲基苄基二甲基苄基铵、烷基二甲基二甲基苄基氯化铵、烷基二甲基乙基溴化铵、烷基二甲基乙基溴化铵、烷基二甲基乙基苄基氯化铵、烷基二甲基异丙基苄基氯化铵、烷基三甲基氯化铵、烷基1或3苄基-1-（2-羟乙基）-2-氯化咪唑啉、二烷基甲基苄基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、2-（2-（对-（二异丁基）甲苯氧基（cresosxy））乙氧基）乙基二甲基苄基氯化铵、2-（2-（对-（二异丁基）苯氧基）乙氧基）乙基二甲基苄基氯化铵、二辛基二甲基氯化铵、十二烷基双（2-羟乙基）辛基氢氯化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵、十二烷基氨基甲酰基甲基二甲基（dinethyl）苄基氯化铵、十七烷基羟乙基氯化咪唑啉、六氢-1,3,5-三（2-羟乙基）-s-三嗪、辛基癸基二甲基氯化铵、辛基十二烷基二甲基氯化铵、辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苄基氯化铵、氧基二亚乙基双（烷基二甲基氯化铵）、季铵化合物、二椰油烷基二甲基氯化物、三甲氧基甲硅烷基quats、和三甲基十二烷基苄基氯化铵。

8. 其他组分

在一些实施方案中，纳米乳剂包含一种或多种另外组分，其对纳米乳剂提供所需性质或功能性。这些组分可以掺入纳米乳剂的水相或油相内和/或可以在乳化前或后添加。例如，在一些实施方案中，纳米乳剂进一步包含酚类（例如三氯酚、苯基苯酚）、酸化剂（例如柠檬酸（例如1.5-6％）、乙酸、柠檬汁）、烷化剂（例如氢氧化钠（例如0.3％））、缓冲液（例如柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、及用于维持特定pH的其他缓冲液）、和卤素（例如聚乙烯吡咯烷酮、次氯酸钠、过氧化氢）。

用于制备纳米乳剂（例如用于灭活病原体和/或本发明的免疫原性组合物的生成）的示例性技术在下文描述。另外，许多特异性尽管示例性的制剂配方也在下文阐述。

配制技术

本发明的纳米乳剂可以使用标准乳剂形成技术来形成。简言之，在相对高剪切力下（例如使用高水力和机械力），使油相与水相混合，以获得水包油纳米乳剂。在范围为约1:9 - 5:1、优选约5:1 - 3:1、最优选4:1油相与水相的体积与体积基础上，通过将油相与水相掺合形成乳剂。油和水相可以使用能够产生足以形成乳剂的剪切力的任何装置进行掺合，例如弗氏压碎器或高剪切混合器（例如FDA批准的高剪切混合器例如从Admix，Inc.，Manchester，NH可获得）。产生此种乳剂的方法在美国专利号5,103,497和4,895,452中描述，所述专利整体引入本文作为参考。

在优选实施方案中，在本发明的方法中使用的组合物包含在水连续相例如水中分散的油不连续相的小滴。在优选实施方案中，本发明的纳米乳剂是稳定的，并且即使在长贮存时间段（例如超过一年或多年）后也不分解。另外，在一些实施方案中，在与免疫原（例如病原体）组合后，纳米乳剂是稳定的（例如在一些实施方案中，超过3个月，在一些实施方案中，超过6个月，在一些实施方案中，超过12个月，在一些实施方案中，超过18个月）。在优选实施方案中，当施用于（例如经由喷雾或接触粘膜表面、吞咽、吸入等）受试者时，本发明的纳米乳剂是无毒和安全的。

在一些实施方案中，乳剂的部分可以处于脂质结构的形式，包括但不限于单层、多层和少层脂质小泡、微团和层状相。

本发明的一些实施方案采用含乙醇的油相。例如，在一些实施方案中，本发明的乳剂含有（i）水相和（ii）含有乙醇作为有机溶剂和任选地萌发增强剂的油相，和（iii）TYLOXAPOL作为表面活性剂（优选2-5％、更优选3％）。这种制剂对于病原体灭活是高度有效的，并且对于哺乳动物受试者也是无刺激性和无毒的（例如并且因此可以施用于粘膜表面）。

示例性制剂

下述描述提供了许多示例性乳剂，包含用于组合物BCTP和X₈W₆₀PC的制剂。BCTP包含油包水纳米乳剂，其中油相由溶于80％水中的大豆油、磷酸三正丁酯和TRITON X-100制成。X₈W₆₀PC包含BCTP与W₈₀8P的等体积混合物。W₈₀8P是脂质体样化合物，由甘油单硬脂酰酯、精制大豆固醇（例如GENEROL固醇）、TWEEN 60、大豆油、阳离子离子含卤素CPC和薄荷油制成。GENEROL家族是一组聚乙氧基化大豆固醇（Henkel Corporation，Ambler，Pennsylvania）。在本发明中有用的示例性乳剂制剂在表1B中提供。这些特定制剂可以在美国专利号5,700,679（NN）；5,618,840；5,549,901（W₈₀8P）；和5,547,677中找到，所述专利各自在此整体引入作为参考。某些其他乳剂制剂呈现于在此整体引入作为参考的美国专利申请系列号10/669,865中。

X₈W₆₀PC乳剂通过首先分开制备W₈₀8P乳剂和BCTP乳剂进行制造。这2种乳剂的混合物随后再乳化，以产生称为X₈W₆₀PC的新鲜乳剂组合物。产生此种乳剂的方法在美国专利号5,103,497和4,895,452中描述（其各自整体引入本文作为参考）。

表1B

尽管包含BCTP的某些组合物具有4:1的水与油比，但应当理解BCTP可以配制为具有更多或更少的水相。例如，在一些实施方案中，对于每份油相存在3、4、5、6、7、8、9、10或更多份水相。这对于W₈₀8P制剂同样是正确的。类似地，磷酸三正丁酯:TRITON X-100:大豆油的比也可以是不同的。

尽管表1B列出了用于W₈₀8P的甘油单油酸酯、聚山梨醇酯60、GENEROL 122、十六烷基氯化吡啶和载体油的具体量，但这些仅是示例性的。可以配制具有W₈₀8P性质的乳剂，其具有不同浓度的这些组分中的每一种或将实现相同功能的实际上不同的组分。例如，乳剂可以具有在起始油相中约80 – 约100g的甘油单油酸酯。在其他实施方案中，乳剂可以具有在起始油相中约15 – 约30 g的聚山梨醇酯60。在另外一个实施方案中，组合物可以包含在起始油相中约20 – 约30 g的GENEROL固醇。

纳米乳剂（例如在本发明的免疫原性组合物中）的个别组分可以作用于灭活病原体以及促成乳剂的无毒。例如，BCTP中的活性组分，TRITON-X100显示在等价于11％BCTP的浓度灭活病毒的更少能力。将油相添加到去污剂和溶剂中显著减少这些试剂在组织培养中在相同浓度时的毒性。尽管不受任何理论束缚（机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体机制），但暗示纳米乳剂增强其组分与病原体的相互作用，从而促进病原体的灭活且减少个别组分的毒性。此外，当BCTP的所有组分在一种组合物中组合但不在纳米乳剂结构中时，混合物不如当组分在纳米乳剂结构中时一样在灭活病原体方面有效。

在本发明的某些实施方案中，纳米乳剂包含约3 – 8体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、约1体积％的十六烷基氯化吡啶（CPC）、约60 – 70体积％的油（例如大豆油）、约15 – 25体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）、和在一些制剂中小于约1体积％的1N NaOH。这些实施方案中的一些包含PBS。预期1N NaOH和/或PBS在这些实施方案的一些中的添加允许使用者有利地控制制剂的pH，从而使得pH范围为约7.0 – 约9.0，并且更优选达到约7.1 - 8.5。例如，本发明的一个实施方案包含约3体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约64体积％的大豆油、和约24体积％的DiH₂O（本文指定为Y3EC）。另一个相似实施方案包含约3.5体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、和约1体积％的CPC、约64体积％的大豆油、和约23.5体积％的DiH₂O（本文指定为Y3.5EC）。另外一个实施方案包含约3体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约0.067体积％的1N NaOH，从而使得制剂的pH是约7.1、约64体积％的大豆油、和约23.93体积％的DiH₂O（本文指定为Y3EC pH 7.1）。另外一个实施方案包含约3体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约0.67体积％的1N NaOH，从而使得制剂的pH是约8.5、和约64体积％的大豆油、和约23.33体积％的DiH₂O（本文指定为Y3EC pH 8.5）。另一个相似实施方案包含约4％TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、约1％CPC、和约64体积％的大豆油、和约23体积％的DiH₂O（本文指定为Y4EC）。在另外一个实施方案中，制剂包含约8％TYLOXAPOL、约8％乙醇、约1体积％的CPC、和约64体积％的大豆油、和约19体积％的DiH₂O（本文指定为Y8EC）。进一步的实施方案包含约8体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约64体积％的大豆油、约19体积％的1x PBS（本文指定为Y8EC PBS）。

在本发明的一些实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的乙醇、和约1体积％的CPC、和约64体积％的油（例如大豆油）、和约27体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）（本文指定为EC）。

在一些实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的十二烷基硫酸钠（SDS）、约8体积％的磷酸三丁酯（TBP）、和约64体积％的油（例如大豆油）、和约20体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）（本文指定为S8P）。

在一些实施方案中，纳米乳剂包含约1 – 2体积％的TRITON X-100、约1 – 2体积％的TYLOXAPOL、约7 - 8体积％的乙醇、约1体积％的十六烷基氯化吡啶（CPC）、约64 - 57.6体积％的油（例如大豆油）、和约23体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。另外，这些制剂中的一些进一步包含约5 mM L-丙氨酸/肌苷和约10 mM氯化铵。这些制剂中的一些包含PBS。预期PBS在这些实施方案的一些中的添加允许使用者有利地控制制剂的pH。例如，本发明的一个实施方案包含约2体积％的TRITON X-100、约2体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约64体积％的大豆油、和约23体积％的水相DiH₂O。在另一个实施方案中，制剂包含约1.8体积％的TRITON X-100、约1.8体积％的TYLOXAPOL、约7.2体积％的乙醇、约0.9体积％的CPC、约5 mM L-丙氨酸/肌苷、和约10 mM氯化铵、约57.6体积％的大豆油、和剩余部分的1x PBS（本文指定为90％X2Y2EC/GE）。

在一些实施方案中，纳米乳剂包含约5体积％的TWEEN 80、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约64体积％的油（例如大豆油）、和约22体积％的DiH₂O（本文指定为W₈₀5EC）。

在本发明的另外其他实施方案中，纳米乳剂包含约5体积％的TWEEN 20、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约64体积％的油（例如大豆油）、和约22体积％的DiH₂O（本文指定为W₂₀5EC）。

在本发明的另外其他实施方案中，纳米乳剂包含约2 - 8体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约60 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约15 - 25体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。例如，本发明预期了包含约2体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约64体积％的大豆油、和约26体积％的DiH₂O的制剂（本文指定为X2E）。在其他相似实施方案中，纳米乳剂包含约3体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约64体积％的大豆油、和约25体积％的DiH₂O（本文指定为X3E）。在再进一步的实施方案中，制剂包含约4体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约64体积％的大豆油、和约24体积％的DiH₂O（本文指定为X4E）。在另外其他实施方案中，纳米乳剂包含约5体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约64体积％的大豆油、和约23体积％的DiH₂O（本文指定为X5E）。在一些实施方案中，纳米乳剂包含约6体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约64体积％的大豆油、和约22体积％的DiH₂O（本文指定为X6E）。在本发明的再进一步实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约64体积％的大豆油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为X8E）。在再进一步实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的乙醇、约64体积％的橄榄油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为X8E O）。在另外一个实施方案中，纳米乳剂包含8体积％的TRITON X-100、约8体积％乙醇、约1体积％CPC、约64体积％的大豆油、和约19体积％的DiH₂O（本文指定为X8EC）。

在本发明的可替代实施方案中，纳米乳剂包含约1 – 2体积％的TRITON X-100、约1 – 2体积％的TYLOXAPOL、约6 - 8体积％的TBP、约0.5 - 1.0体积％的CPC、约60 - 70体积％的油（例如大豆油）、和约1 - 35体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。另外，这些纳米乳剂中的某些可以包含约1 – 5体积％的胰胨豆胨培养液、约0.5 - 1.5体积％的酵母提取物、约5 mM L-丙氨酸/肌苷、约10 mM氯化铵、和约20-40体积％的液态婴儿代乳品。在包含液态婴儿代乳品的一些实施方案中，代乳品包含酪蛋白水解物（例如Neutramigen或Progestimil等）。在这些实施方案的一些中，纳米乳剂进一步包含约0.1 - 1.0体积％的硫代硫酸钠、和约0.1 - 1.0体积％的柠檬酸钠。包含这些基本组分的其他相似实施方案采用磷酸缓冲盐水（PBS）作为水相。例如，一个实施方案包含约2体积％的TRITON X-100、约2体积％TYLOXAPOL、约8体积％TBP、约1体积％的CPC、约64体积％的大豆油、和约23体积％的DiH₂O（本文指定为X2Y2EC）。在另外其他实施方案中，本发明制剂包含约2体积％的TRITON X-100、约2体积％TYLOXAPOL、约8体积％TBP、约1体积％的CPC、约0.9体积％的硫代硫酸钠、约0.1体积％的柠檬酸钠、约64体积％的大豆油、和约22体积％的DiH₂O（本文指定为X2Y2PC STS1）。在另一个相似实施方案中，纳米乳剂包含约1.7体积％的TRITON X-100、约1.7体积％TYLOXAPOL、约6.8体积％TBP、约0.85％CPC、约29.2％NEUTRAMIGEN、约54.4体积％的大豆油、和约4.9体积％的DiH₂O（本文指定为85％X2Y2PC/婴儿）。在本发明的另外一个实施方案中，纳米乳剂包含约1.8体积％的TRITON X-100、约1.8体积％的TYLOXAPOL、约7.2体积％的TBP、约0.9体积％的CPC、约5 mM L-丙氨酸/肌苷、约10 mM氯化铵、约57.6体积％的大豆油、和剩余体积％的0.1x PBS（本文指定为90％X2Y2 PC/GE）。在另外一个实施方案中，纳米乳剂包含约1.8体积％的TRITON X-100、约1.8体积％的TYLOXAPOL、约7.2体积％TBP、约0.9体积％的CPC、和约3体积％胰胨豆胨培养液、约57.6体积％的大豆油、和约27.7体积％的DiH₂O（本文指定为90％X2Y2PC/TSB）。在本发明的另一个实施方案中，纳米乳剂包含约1.8体积％TRITON X-100、约1.8体积％TYLOXAPOL、约7.2体积％TBP、约0.9体积％的CPC、约1体积％酵母提取物、约57.6体积％的大豆油、和约29.7体积％的DiH₂O（本文指定为90％X2Y2PC/YE）。

在本发明的一些实施方案中，纳米乳剂包含约3体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的TBP、和约1体积％的CPC、约60 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约15 - 30体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。在本发明的特定实施方案中，纳米乳剂包含约3体积％的TYLOXAPOL、约8体积％的TBP、和约1体积％的CPC、约64体积％的大豆、和约24体积％的DiH₂O（本文指定为Y3PC）。

在本发明的一些实施方案中，纳米乳剂包含约4 - 8体积％的TRITON X-100、约5 - 8体积％的TBP、约30 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约0 - 30体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。另外，这些实施方案中的某些进一步包含约1体积％的CPC、约1体积％的苯扎氯铵、约1体积％十六烷基溴化吡啶、约1体积％十六烷基二甲基乙基溴化铵、500 µM EDTA、约10 mM氯化铵、约5 mM肌苷、和约5 mM L-丙氨酸。例如，在某些优选实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约64体积％的大豆油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为X8P）。在本发明的另一个实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约1％的CPC、约64体积％的大豆油、和约19体积％的DiH₂O（本文指定为X8PC）。在另外一个实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％TRITON X-100、约8体积％的TBP、约1体积％的CPC、约50体积％的大豆油、和约33体积％的DiH₂O（本文指定为ATB-X1001）。在另外一个实施方案中，制剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约2体积％的CPC、约50体积％的大豆油、和约32体积％的DiH₂O（本文指定为ATB- X002）。在一些实施方案中，纳米乳剂包含约4体积％TRITON X-100、约4体积％的TBP、约0.5体积％的CPC、约32体积％的大豆油、和约59.5体积％的DiH₂O（本文指定为50％X8PC）。在一些实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约0.5体积％CPC、约64体积％的大豆油、和约19.5体积％的DiH₂O（本文指定为X8PC_1/2）。在本发明的一些实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约2体积％的CPC、约64体积％的大豆油、和约18体积％的DiH₂O（本文指定为X8PC2）。在其他实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8％的TBP、约1％的苯扎氯铵、约50体积％的大豆油、和约33体积％的DiH₂O（本文指定为X8P BC）。在本发明的可替代实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约1体积％的十六烷基溴化吡啶、约50体积％的大豆油、和约33体积％的DiH₂O（本文指定为X8P CPB）。在本发明的另一个示例性实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约1体积％的十六烷基二甲基乙基溴化铵、约50体积％的大豆油、和约33体积％的DiH₂O（本文指定为X8P CTAB）。在再进一步的实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约1体积％的CPC、约500 µM EDTA、约64体积％的大豆油、和约15.8体积％的DiH₂O（本文指定为X8PC EDTA）。在一些实施方案中，纳米乳剂包含8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约1体积％的CPC、约10 mM氯化铵、约5 mM肌苷、约5 mM L-丙氨酸、约64体积％的大豆油、和约19体积％的DiH₂O或PBS（本文指定为X8PC GE_1x）。在本发明的另一个实施方案中，纳米乳剂包含约5体积％的TRITON X-100、约5％的TBP、约1体积％的CPC、约40体积％的大豆油、和约49体积％的DiH₂O（本文指定为X5P₅C）。

在本发明的一些实施方案中，纳米乳剂包含约2体积％的TRITON X-100、约6体积％TBP、约8体积％乙醇、约64体积％的大豆油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为X2Y6E）。

在本发明的另外实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、和约8体积％的甘油、约60 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约15 - 25体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。某些纳米乳剂组合物（例如用于生成免疫应答（例如用于作为疫苗使用）包含约1体积％L-抗坏血酸。例如，一个特定实施方案包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的甘油、约64体积％的大豆油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为X8G）。在另外一个实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约8体积％的甘油、约1体积％的L-抗坏血酸、约64体积％的大豆油、和约19体积％的DiH₂O（本文指定为X8GV_c）。

在再进一步的实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约0.5 – 0.8体积％的TWEEN 60、约0.5 – 2.0体积％的CPC、约8体积％的TBP、约60 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约15 - 25体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。例如，在一个特定实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约0.70体积％的TWEEN 60、约1体积％的CPC、约8体积％的TBP、约64体积％的大豆油、和约18.3体积％的DiH₂O（本文指定为X8W60PC₁）。在一些实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约0.71体积％的TWEEN 60、约1体积％的CPC、约8体积％的TBP、约64体积％的大豆油、和约18.29体积％的DiH₂O（本文指定为W60_0.7X8PC）。在另外其他实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约0.7体积％的TWEEN 60、约0.5体积％的CPC、约8体积％的TBP、约64 - 70体积％的大豆油、和约18.8体积％的DiH₂O（本文指定为X8W60PC₂）。在另外其他实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的TRITON X-100、约0.71体积％的TWEEN 60、约2体积％的CPC、约8体积％的TBP、约64体积％的大豆油、和约17.3体积％的DiH₂O。在本发明的另一个实施方案中，纳米乳剂包含约0.71体积％的TWEEN 60、约1体积％的CPC、约8体积％的TBP、约64体积％的大豆油、和约25.29体积％的DiH₂O（本文指定为W60_0.7PC）。

在本发明的另一个实施方案中，纳米乳剂包含约2体积％的琥珀酸二辛酯磺酸盐、约8体积％的甘油、或约8体积％TBP、加上约60 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约23体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。例如，在一些实施方案中，纳米乳剂包含约2体积％的琥珀酸二辛酯磺酸盐、约8体积％的甘油、约64体积％的大豆油、和约26体积％的DiH₂O（本文指定为D2G）。在另一个相关实施方案中，纳米乳剂包含约2体积％的琥珀酸二辛酯磺酸盐、和约8体积％的TBP、约64体积％的大豆油、和约26体积％的DiH₂O（本文指定为D2P）。

在本发明的另外其他实施方案中，纳米乳剂包含约8 - 10体积％的甘油、和约1 – 10体积％的CPC、约50 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约15 - 30体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。另外，在这些实施方案的某些中，纳米乳剂进一步包含约1体积％的L-抗坏血酸。例如，在一些实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的甘油、约1体积％的CPC、约64体积％的大豆油、和约27体积％的DiH₂O（本文指定为GC）。在一些实施方案中，纳米乳剂包含约10体积％的甘油、约10体积％的CPC、约60体积％的大豆油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为GC10）。在本发明的另外一个实施方案中，纳米乳剂包含约10体积％的甘油、约1体积％的CPC、约1体积％的L-抗坏血酸、约60体积％的大豆或油、和约24体积％的DiH₂O（本文指定为GCV_c）。

在本发明的一些实施方案中，纳米乳剂包含约8 - 10体积％的甘油、约8 – 10体积％的SDS、约50 - 70体积％的油（例如大豆或橄榄油）、和约15 - 30体积％的水相（例如DiH₂O或PBS）。另外，在这些实施方案的某些中，纳米乳剂进一步包含约1体积％的卵磷脂和约1体积％的对羟基苯甲酸甲酯。此种制剂的示例性实施方案包含约8体积％SDS、8体积％的甘油、约64体积％的大豆油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为S8G）。相关制剂包含约8体积％的甘油、约8体积％的SDS、约1体积％的卵磷脂、约1体积％的对羟基苯甲酸甲酯、约64体积％的大豆油、和约18体积％的DiH₂O（本文指定为S8GL1B1）。

在本发明的另外一个实施方案中，纳米乳剂包含约4体积％的TWEEN 80、约4体积％的TYLOXAPOL、约1体积％的CPC、约8体积％的乙醇、约64体积％的大豆油、和约19体积％的DiH₂O（本文指定为W₈₀4Y4EC）。

在本发明的一些实施方案中，纳米乳剂包含约0.01体积％的CPC、约0.08体积％的TYLOXAPOL、约10体积％的乙醇、约70体积％的大豆油、和约19.91体积％的DiH₂O（本文指定为Y.08EC.01）。

在本发明的另外一个实施方案中，纳米乳剂包含约8体积％的月桂基硫酸钠、和约8体积％的甘油、约64体积％的大豆油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为SLS8G）。

上文描述的具体制剂仅仅是举例说明在本发明中有用（例如灭活和/或中和病原体，和用于在受试者中生成免疫应答（例如用于作为疫苗使用））的多种纳米乳剂的例子。本发明预期上述制剂的许多变动、以及另外的纳米乳剂在本发明的方法有用。可以容易地测试候选乳剂，以测定它们是否合适。首先，使用本文描述的方法制备所需成分，以测定是否可以形成乳剂。如果不能形成乳剂，那么候选物被淘汰。例如，由4.5％硫代硫酸钠、0.5％柠檬酸钠、10％正丁醇、64％大豆油和21％DiH₂O制成的候选组合物不形成乳剂。

其次，候选乳剂应形成稳定乳剂。如果乳剂以乳剂形式保持足够时间段，以允许其预期用途（例如用于在受试者中生成免疫应答），那么它是稳定的。例如，对于待贮存、运输等的乳剂，可能希望组合物以乳剂形式保持数月到数年。相对不稳定的一般乳剂将在一天内丧失其形式。例如，由8％1-丁醇、5％Tween 10、1％CPC、64％大豆油和22％DiH₂O制成的候选组合物不形成稳定乳剂。已显示是稳定的纳米乳剂包括但不限于8体积％的TRITON X-100、约8体积％的TBP、约64体积％的大豆油、和约20体积％的DiH₂O（本文指定为X8P）；5体积％的TWEEN 20、约8体积％的乙醇、约1体积％的CPC、约64体积％的油（例如大豆油）、和约22体积％的DiH₂O（本文指定为W₂₀5EC）；0.08％TRITON X-100、0.08％甘油、0.01％十六烷基氯化吡啶、99％黄油和0.83％diH₂O（本文指定为1％X8GC黄油）；0.8％TRITON X-100、0.8％甘油、0.1％十六烷基氯化吡啶、6.4％大豆油、1.9％diH₂O和90％黄油（本文指定为10％X8GC黄油）；2％W₂₀5EC、1％Natrosol 250L NF和97％diH₂O（本文指定为2％W₂₀5EC L GEL）；1％十六烷基氯化吡啶、5％TWEEN 20、8％乙醇、64％70粘性矿物油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC 70矿物油）；1％十六烷基氯化吡啶、5％Tween 20、8％乙醇、64％350粘性矿物油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC 350矿物油）。在一些实施方案中，本发明的纳米乳剂稳定超过1周、超过1个月、或超过1年。

第三，候选乳剂应具有用于其预期用途的功效。例如，纳米乳剂应灭活（例如杀死或抑制其生长）病原体至所需水平（例如1个对数、2个对数、3个对数、4个对数、. . .减少）。使用本文描述的方法，人们能够测定特定候选乳剂针对所需病原体的适合性。一般地，这涉及使病原体在与合适对照样品（例如阴性对照例如水）的并列实验中暴露于乳剂一个或多个时间段，并且测定乳剂是否灭活（例如杀死和/或中和）微生物，和至何种程度。例如，由1％氯化铵、5％Tween 20、8％乙醇、64％大豆油和22％DiH₂O制成的候选组合物显示不是有效乳剂。下述候选乳剂使用本文描述的方法显示是有效的：5％Tween 20、5％十六烷基氯化吡啶、10％甘油、60％大豆油和20％diH₂O（本文指定为W₂₀5GC5）；1％十六烷基氯化吡啶、5％Tween 20、10％甘油、64％大豆油和20％diH₂O（本文指定为W₂₀5GC）；1％十六烷基氯化吡啶、5％Tween 20、8％乙醇、64％橄榄油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC橄榄油）；1％十六烷基氯化吡啶、5％Tween 20、8％乙醇、64％亚麻子油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC亚麻子油）；1％十六烷基氯化吡啶、5％Tween 20、8％乙醇、64％玉米油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC玉米油）；1％十六烷基氯化吡啶、5％Tween 20、8％乙醇、64％椰子油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC椰子油）；1％十六烷基氯化吡啶、5％Tween 20、8％乙醇、64％棉籽油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC棉籽油）；8％葡萄糖、5％Tween 10、1％十六烷基氯化吡啶、64％大豆油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5C葡萄糖）；8％PEG 200、5％Tween 10、1％十六烷基氯化吡啶、64％大豆油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5C PEG 200）；8％甲醇、5％Tween 10、1％十六烷基氯化吡啶、64％大豆油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5C甲醇）；8％PEG 1000、5％Tween 10、1％十六烷基氯化吡啶、64％大豆油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5C PEG 1000）；2％W₂₀5EC、2％Natrosol 250H NF和96％diH₂O（本文指定为2％W₂₀5EC Natrosol 2，也称为2％W₂₀5EC GEL）；2％W₂₀5EC、1％Natrosol 250H NF和97％diH₂O（本文指定为2％W₂₀5EC Natrosol 1）；2％W₂₀5EC、3％Natrosol 250H NF和95％diH₂O（本文指定为2％W₂₀5EC Natrosol 3）；2％W₂₀5EC、0.5％Natrosol 250H NF和97.5％diH₂O（本文指定为2％W₂₀5EC Natrosol 0.5）；2％W₂₀5EC、2％Methocel A和96％diH₂O（本文指定为2％W₂₀5EC Methocel A）；2％W₂₀5EC、2％Methocel K和96％diH₂O（本文指定为2％W₂₀5EC Methocel K）；2％Natrosol、0.1％X8PC、0.1x PBS、5 mM L-丙氨酸、5 mM肌苷、10 mM氯化铵和diH₂O（本文指定为0.1％X8PC/GE+2％Natrosol）；2％Natrosol、0.8％Triton X-100、0.8％磷酸三丁酯、6.4％大豆油、0.1％十六烷基氯化吡啶、0.1x PBS、5 mM L-丙氨酸、5 mM肌苷、10 mM氯化铵和diH₂O（本文指定为10％X8PC/GE+2％Natrosol）；1％十六烷基氯化吡啶、5％Tween 20、8％乙醇、64％猪油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC猪油）；1％十六烷基氯化吡啶、5％Tween 20、8％乙醇、64％矿物油和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC矿物油）；0.1％十六烷基氯化吡啶、2％Nerolidol、5％Tween 20、10％乙醇、64％大豆油和18.9％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC_0.1N）；0.1％十六烷基氯化吡啶、2％法尼醇、5％Tween 20、10％乙醇、64％大豆油和18.9％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC_0.1F）；0.1％十六烷基氯化吡啶、5％Tween 20、10％乙醇、64％大豆油和20.9％diH₂O（本文指定为W₂₀5EC_0.1）；10％十六烷基氯化吡啶、8％磷酸三丁酯、8％Triton X-100、54％大豆油和20％diH₂O（本文指定为X8PC₁₀）；5％十六烷基氯化吡啶、8％Triton X-100、8％磷酸三丁酯、59％大豆油和20％diH₂O（本文指定为X8PC₅）；0.02％十六烷基氯化吡啶、0.1％Tween 20、10％乙醇、70％大豆油和19.88％diH₂O（本文指定为W₂₀0.1EC_0.02）；1％十六烷基氯化吡啶、5％Tween 20、8％甘油、64％Mobil 1和22％diH₂O（本文指定为W₂₀5GC Mobil 1）；7.2％Triton X-100、7.2％磷酸三丁酯、0.9％十六烷基氯化吡啶、57.6％大豆油、0.1x PBS、5 mM L-丙氨酸、5 mM肌苷、10 mM氯化铵和25.87％diH₂O（本文指定为90％X8PC/GE）；7.2％Triton X-100、7.2％磷酸三丁酯、0.9％十六烷基氯化吡啶、57.6％大豆油、1％EDTA、5 mM L-丙氨酸、5 mM肌苷、10 mM氯化铵、0.1x PBS和diH₂O（本文指定为90％X8PC/GE EDTA）；和7.2％Triton X-100、7.2％磷酸三丁酯、0.9％十六烷基氯化吡啶、57.6％大豆油、1％硫代硫酸钠、5 mM L-丙氨酸、5 mM肌苷、10 mM氯化铵、0.1x PBS和diH₂O（本文指定为90％X8PC/GE STS）。

在本发明的优选实施方案中，纳米乳剂是无毒（例如对于人、植物或动物）、无刺激性（例如对于人、植物或动物）、和无腐蚀性的（例如对于人、植物或动物或环境），同时具有针对广泛范围的微生物包括细菌、真菌、病毒和孢子的效力。虽然许多上述纳米乳剂满足这些资格，但下述描述提供了本发明的许多优选无毒、无刺激性、无腐蚀性、抗微生物纳米乳剂（下文在这个部分称为“无毒纳米乳剂”）。

在一些实施方案中，无毒纳米乳剂包含用于用作广谱抗微生物试剂的表面活性剂脂质制剂（SLPs），其针对细菌及其孢子、有包膜病毒和真菌有效。在优选实施方案中，这些SLPs包含油、去污剂、溶剂和阳离子含卤素化合物加上增强其杀生物活性的几种离子的混合物。这些SLPs特征在于与高度刺激性和/或毒性的商购可得的杀细菌和杀孢子试剂相比较，稳定、无刺激性和无毒的化合物。

用于在无毒纳米乳剂中使用的成分包括但不限于：去污剂（例如TRITON X-100（5-15％）或TRITON家族的其他成员、TWEEN 60（0.5-2％）或TWEEN家族的其他成员、或TYLOXAPOL（1-10％））；溶剂（例如磷酸三丁酯（5-15％））；醇（例如乙醇（5-15％）或甘油（5-15％））；油（例如大豆油（40-70％））；阳离子含卤素化合物（例如十六烷基氯化吡啶（0.5-2％）、十六烷基溴化吡啶（0.5-2％）），或十六烷基二甲基乙基溴化铵（0.5-2%））；季铵化合物（例如苯扎氯铵（0.5-2％）、N-烷基二甲基苄基氯化铵（0.5-2％））；离子（氯化钙（1mM-40mM）、氯化铵（1mM-20mM）、氯化钠（5mM-200mM）、磷酸钠（1mM-20mM））；核苷（例如肌苷（50μM-20mM））；和氨基酸（例如L-丙氨酸（50μM-20mM））。通过在高剪切混合器中混合3-10分钟制备乳剂。乳剂可以在82℃混合1小时前加热或不加热。

用于在本发明中使用的季铵化合物包括但不限于N-烷基二甲基苄基糖精铵；1,3,5-三嗪-1,3,5（2H,4H,6H）-三乙醇；1- Decanaminium、N-癸基- N，N-二甲基氯化物（或）二癸基二甲基氯化铵；2-（2-（对-（二异丁基）甲苯氧基（cresosxy））乙氧基）乙基二甲基苄基氯化铵；2-（2-（对-（二异丁基）苯氧基）乙氧基）乙基二甲基苄基氯化铵；烷基1或3苄基-1-（2-羟乙基）-2-氯化咪唑啉；烷基双（2-羟乙基）苄基氯化铵；烷基去甲基苄基氯化铵；烷基二甲基3,4-二氯苄基氯化铵（100％C12）；烷基二甲基3,4-二氯苄基氯化铵（50％C14、40％C12、10％C16）；烷基二甲基3,4-二氯苄基氯化铵（55％C14、23％C12、20％C16）；烷基二甲基苄基氯化铵；烷基二甲基苄基氯化铵（100％C14）；烷基二甲基苄基氯化铵（100％C16）；烷基二甲基苄基氯化铵（41％C14、28％C12）；烷基二甲基苄基氯化铵（47％C12、18％C14）；烷基二甲基苄基氯化铵（55％C16、20％C14）；烷基二甲基苄基氯化铵（58％C14、28％C16）；烷基二甲基苄基氯化铵（60％C14、25％C12）；烷基二甲基苄基氯化铵（61％C11、23％C14）；烷基二甲基苄基氯化铵（61％C12、23％C14）；烷基二甲基苄基氯化铵（65％C12、25％C14）；烷基二甲基苄基氯化铵（67％C12、24％C14）；烷基二甲基苄基氯化铵（67％C12、25％C14）；烷基二甲基苄基氯化铵（90％C14、5％C12）；烷基二甲基苄基氯化铵（93％C14、4％C12）；烷基二甲基苄基氯化铵（95％C16、5％C18）；烷基二甲基苄基氯化铵（和）二癸基二甲基氯化铵；烷基二甲基苄基氯化铵（如在脂肪酸中）；烷基二甲基苄基氯化铵（C12-16）；烷基二甲基苄基氯化铵（C12-18）；烷基二甲基苄基和二烷基二甲基苄基氯化铵；烷基二甲基二甲基苄基氯化铵；烷基二甲基乙基溴化铵（90％C14、5％C16、5％C12）；烷基二甲基乙基溴化铵（如在大豆油的脂肪酸中的混合烷基和链烯基）；烷基二甲基乙基苄基氯化铵；烷基二甲基乙基苄基氯化铵（60％C14）；烷基二甲基异丙基苄基氯化铵（50％C12、30％C14、17％C16、3％C18）；烷基三甲基氯化铵（58％C18、40％C16、1％C14、1％C12）；烷基三甲基氯化铵（90％C18、10％C16）；烷基二甲基（乙基苄基）氯化铵（C12-18）；二-（C8-10）-烷基二甲基氯化铵；二烷基二甲基氯化铵；二烷基二甲基氯化铵；二烷基二甲基氯化铵；二烷基甲基苄基氯化铵；二癸基二甲基氯化铵；二异癸基二甲基氯化铵；二辛基二甲基氯化铵；十二烷基双（2-羟乙基）辛基氢氯化铵；十二烷基二甲基苄基氯化铵；十二烷基氨基甲酰基甲基二甲基（dinethyl）苄基氯化铵；十七烷基羟乙基氯化咪唑啉；六氢-1,3,5-三（2-羟乙基）-s-三嗪；十四烷基二甲基苄基氯化铵（和）Quat RNIUM 14；N,N-二甲基-2-羟丙基氯化铵聚合物；n-烷基二甲基苄基氯化铵；n-烷基二甲基乙基苄基氯化铵；n-十四烷基二甲基苄基氯化铵一水合物；辛基癸基二甲基氯化铵；辛基十二烷基二甲基氯化铵；辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苄基氯化铵；氧基二亚乙基双（烷基二甲基氯化铵）；季铵化合物，二椰油烷基二甲基氯化物；三甲氧基甲硅烷基丙基二甲基十八烷基氯化铵；三甲氧基甲硅烷基quats、三甲基十二烷基苄基氯化铵；n-十二烷基二甲基乙基苄基氯化铵；n-十六烷基二甲基苄基氯化铵；n-十四烷基二甲基苄基氯化铵；n-十四烷基二甲基乙基苄基氯化铵；和n-十八烷基二甲基苄基氯化铵。

一般而言，优选的无毒纳米乳剂特征在于下述：它们直径是约200-800 nm，尽管预期了更大和更小直径纳米乳剂；电荷取决于成分；它们稳定相对长时间段（例如最高达2年），保存其杀生物活性；与其个别组分相比较，它们是无刺激性和无毒的，这至少部分是由于其显著减少去污剂和溶剂的毒性的油组分；它们在低至0.1％的浓度是有效的；它们具有在15分钟内针对大多数营养性细菌（包括革兰氏阳性和革兰氏阴性生物）、真菌、以及有包膜和无包膜病毒的抗微生物活性（例如99.99％杀死）；并且当用萌发增强剂产生时，它们在1-4小时内具有杀孢子活性（例如99.99％杀死）。

D. 动物模型

在一些实施方案中，潜在纳米乳剂组合物（例如用于生成免疫应答（例如用于作为疫苗使用）在传染病的动物模型中进行测试。充分开发的动物模型的使用提供在施用于人受试者前测量疫苗的有效性和安全的方法。疾病的示例性动物模型显示于表3中。这些动物是商购可得的（例如从Jackson Laboratories Charles River；Portage，MI）。

蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）（与炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）紧密相关）的动物模型用于测试本发明的炭疽疫苗。2种细菌都是产芽孢革兰氏阳性杆菌，并且通过每种细菌产生的疾病综合征在很大程度上是由于毒素产生和这些毒素对受感染宿主的作用（Brown等人，J. Bact.，75:499（1958）；Burdon和Wende，J. Infect Dis.，107:224（1960）；Burdon等人，J. Infect. Dis.，117:307（1967））。蜡状芽孢杆菌感染模拟由炭疽芽孢杆菌引起的疾病综合征。据报道小鼠快速屈服于蜡状芽孢杆菌毒素的作用，并且是用于急性感染的有用模型。豚鼠在用蜡状芽孢杆菌的皮下感染以后发展皮肤病灶，这类似皮肤形式的炭疽。

在小鼠和豚鼠中的产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）感染已用作用于抗生素药物的体内测试的模型系统（Stevens等人，Antimicrob. Agents Chemother.，31:312（1987）；Stevens等人，J. Infect. Dis.，155:220（1987）；Alttemeier等人，Surgery，28:621（1950）；Sandusky等人，Surgery，28:632（1950））。众所周知破伤风梭菌（Clostridium tetani）在多种哺乳动物物种中感染且引起疾病。小鼠、豚鼠和兔都已在实验上使用（Willis，Topley and Wilson's Principles of Bacteriology，Virology and Immunity. Wilson，G.，A. Miles和M.T. Parker，编辑第442-475页1983）。

霍乱弧菌（Vibrio cholerae）感染已在小鼠、豚鼠和兔中成功起始。根据公开的报道，优选改变正常肠细菌菌群用于感染在这些实验宿主中确立。这通过施用抗生素以抑制正常肠菌群来完成，并且在一些情况下，扣留来自这些动物的食物（Butterton等人，Infect. Immun.，64:4373（1996）；Levine等人，Microbiol. Rev.，47:510（1983）；Finkelstein等人，J. Infect. Dis.，114:203（1964）；Freter，J. Exp. Med.，104:411（1956）；和Freter，J. Infect. Dis.，97:57（1955））。

弗氏志贺氏菌（Shigella flexnerii）感染已在小鼠和豚鼠中成功起始。如对于弧菌感染的情况一样，优选改变正常肠细菌菌群，以帮助感染在这些实验宿主中的确立。这通过施用抗生素以抑制正常肠菌群来完成，并且在一些情况下，扣留来自这些动物的食物（Levine等人，Microbiol. Rev.，47:510（1983）；Freter，J. Exp. Med.，104:411（1956）；Formal等人，J. Bact.，85:119（1963）；LaBrec等人，J. Bact. 88:1503（1964）；Takeuchi等人，Am. J. Pathol.，47:1011（1965））。

小鼠和大鼠已广泛用于利用鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和肠炎沙门氏菌（Salmonella enteriditis）的实验研究中（Naughton等人，J. Appl. Bact.，81:651（1996）；Carter和Collins，J. Exp. Med.，139:1189（1974）；Collins，Infect. Immun.，5:191（1972）；Collins和Carter，Infect. Immun.，6:451（1972））。

小鼠和大鼠是用于由仙台（Sendai）病毒感染的充分确立的实验模型（Jacoby等人，Exp. Gerontol.，29:89（1994）；Massion等人，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9:361（1993）；Castleman等人，Am. J. Path.，129:277（1987）；Castleman，Am. J. Vet. Res.，44:1024（1983）；Mims和Murphy，Am. J. Path.，70:315（1973））。

小鼠的辛德比斯（Sindbis）病毒感染通常通过新生小鼠的大脑内接种来完成。可替代地，断奶小鼠在爪垫中进行皮下接种（Johnson等人，J. Infect. Dis.，125:257（1972）；Johnson，Am. J. Path.，46:929（1965））。

优选将动物圈养（house）3-5天，以从运输中恢复且在实验中使用前适应新圈养环境。在每次实验开始时，处死对照动物并且收获组织以确立基线参数。通过任何合适方法（例如包括但不限于异氟烷（Isofluorane）吸入用于短程序或氯胺酮/赛拉嗪注射用于更长程序）麻醉动物。

E. 用于疫苗评价的测定

在一些实施方案中，使用几种合适的模型系统之一评价候选纳米乳剂疫苗。例如，细胞介导的免疫应答可以在体外进行评价。此外，动物模型可以用于评价针对病原体攻击的体内免疫应答和免疫。可以利用任何合适的动物模型，包括但不限于表3中公开的那些。

在动物系统中测试纳米乳剂疫苗前，研究病原体暴露于足以灭活病原体的纳米乳剂的量。预期病原体例如细菌孢子需要更长时间段用于通过纳米乳剂灭活，以充分中和以允许免疫接种。灭活所需的时间段可以使用任何合适的方法进行研究，包括但不限于下文举例说明性例子中描述的那些。

此外，评价特别是在时间和贮存条件范围内的乳剂开发的疫苗的稳定性，以确保疫苗是长期有效的。还评价了其他稳定材料（例如树枝状聚合物）增强疫苗稳定性和免疫原性的能力。

一旦已配制给定纳米乳剂/病原体疫苗以导致病原体灭活，疫苗引发免疫应答且提供免疫的能力就得到最佳化。用于测定疫苗有效性的方法的非限制性例子在下文实施例1-4中描述。例如，可以改变疫苗的时间选择和剂量，并且测定最有效的剂量和施用时间表。免疫应答的水平通过测量血清抗体水平进行定量。此外，体外测定通过测量H³-胸苷摄取用于监控增殖活性。除增殖外，测量Th1和Th2细胞因子应答（例如包括但不限于，包括IL-2、TNF-γ、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-11、IL-12等的水平），以定量评价免疫应答。

最后，动物模型用于评价纳米乳剂粘膜疫苗的作用。使纯化的病原体在乳剂中混合（或使乳剂与预感染动物接触），施用，并且测定免疫应答。随后通过用特定病原体攻击动物且随后评价疾病症状的水平来评价保护水平。测量随着时间过去的免疫水平，以测定加强免疫接种的必要性和间隔。

III. 治疗和预防

此外，在优选实施方案中，本发明的组合物诱导（例如当施用于受试者时）全身和粘膜免疫。因此，在一些优选实施方案中，本发明的组合物施用于受试者导致针对暴露（例如粘膜暴露）于RSV的保护。尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但粘膜施用（例如接种疫苗）提供针对RSV感染（例如在粘膜表面起始的那种）的保护。尽管迄今已证明难以刺激针对在粘膜表面侵入的病原体的分泌性IgA应答和保护（参见例如，Mestecky等人，Mucosal Immunology. 3ed edn.（Academic Press，San Diego，2005）），但在一些实施方案中，本发明提供了用于在受试者中刺激来自病原体的粘膜免疫（例如保护性IgA应答）的组合物和方法。

在一些实施方案中，本发明提供了组合物（例如包含NE和来自RSV的免疫原性蛋白质抗原（例如M2肽、F蛋白质和/或其他蛋白质/肽抗原或毒力因子的组合物）以充当粘膜疫苗。在一些实施方案中，这种材料可以容易地用NE和M2、F蛋白质和/或其他蛋白质/肽（例如病毒衍生的蛋白质、活病毒载体衍生的蛋白质、重组蛋白质、重组变性蛋白质/抗原、小肽区段蛋白质/抗原，且诱导粘膜和全身免疫）产生。快速产生这种制剂且经由粘膜（例如鼻）滴注施用其的能力提供了可以以大规模施用（例如对于镇、村、城市、州或国家的群体）的疫苗。

在一些优选实施方案中，本发明提供了包含NE和免疫原（例如纯化、分离或合成的蛋白质或其衍生物、变体或类似物；或通过纳米乳剂灭活的RSV的一个或多个血清型）的用于生成免疫应答的组合物。当施用于受试者时，本发明的组合物在受试者内刺激针对免疫原的免疫应答。尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但在一些实施方案中，免疫应答的生成（例如起因于包含纳米乳剂和免疫原的组合物的施用）对受试者提供了总体或部分免疫（例如来自疾病（例如RSV）的病征、症状或状况）。不希望受任何具体理论束缚，在暴露于本发明的免疫原性组合物后，来自疾病的保护和/或免疫（例如受试者的免疫系统预防或减弱（例如抑制）疾病的病征、症状或状况的能力）是由于适应性（例如获得性）免疫应答（例如在暴露于本发明包含免疫原的NE后，由B和T细胞介导的免疫应答（例如显示出针对RSV增加的特异性和反应性的免疫应答）。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物和方法在预防或治疗上用于预防或减弱与RSV相关的病征、症状或状况。

在一些实施方案中，包含免疫原（例如重组RSV蛋白质）的NE单独施用。在一些实施方案中，包含NE和免疫原（例如重组RSV蛋白质）的组合物包含一种或多种其他试剂（例如药学可接受的载体；佐剂、赋形剂等）。在一些实施方案中，本发明用于刺激免疫应答的组合物以诱导体液免疫应答的方式进行施用。在一些实施方案中，本发明用于刺激免疫应答的组合物以诱导细胞（例如细胞毒性T淋巴细胞）免疫应答而不是体液应答的方式进行施用。在一些实施方案中，本发明包含NE和免疫原的组合物诱导细胞和体液免疫应答。

本发明并不受在包含NE和免疫原（例如通过纳米乳剂灭活的RSV）的组合物中使用的副粘病毒科的病毒（例如副粘病毒亚科病毒（例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属）和/或肺炎病毒亚科病毒（例如呼吸道合胞病毒）））的类型或毒株的限制。实际上，每个副粘病毒科成员单独或与另一个科成员组合可以用于生成本发明包含NE和免疫原的组合物（例如用于生成免疫应答）。在一些实施方案中，病毒是RSV毒株A2（可从ATCC，Manassas，VA获得，ATCC登记号VR-1540）。在一些实施方案中，病毒是RSV毒株B（B WV/14617/85，ATCC登记号VR-1400）。在一些实施方案中，病毒是RSV毒株9320（ATCC登记号VR-955）。在一些实施方案中，病毒是RSV毒株18537 （ATCC登记号VR-1580）。在一些实施方案中，病毒是RSV毒株Long（ATCC登记号VR-26）。在一些实施方案中，病毒是RSV毒株Line 19（参见例如，Lukacs等人，Immunopathology and Infection，169，977-986（2006））。因此，在一些实施方案中，利用的病毒（例如RSV）毒株是展示出更大致病性能力（例如引起更严重的RSV诱导的疾病（例如包含增强的气道高反应性和/或粘液超量生产））的修饰的（例如遗传修饰的（例如经由自然选择天然修饰的或使用重组遗传学技术修饰的））毒株。在一些实施方案中，副粘病毒科成员的任何成员用于本发明的免疫反应性组合物中，包括但不限于副粘病毒属、腮腺炎病毒属、麻疹病毒属和呼吸道合胞病毒及其他。本发明并不受使用的病毒毒株的限制。实际上，多种病毒毒株预期在本发明中是有用的，包括但不限于典型毒株、减毒毒株、非复制毒株、修饰的毒株（例如遗传或机械修饰的毒株（例如以变得更多或更少毒力）），或病毒的其他系列稀释的毒株。包含NE和免疫原的组合物可以包含RSV和/或副粘病毒科病毒的其他类型的一种或多种毒株。另外，包含NE和免疫原的组合物可以包含RSV的一种或多种毒株和加上非RSV病毒免疫原的一种或多种毒株。

在一些实施方案中，免疫原可以包含衍生自病原体（例如RSV）的一种或多种抗原。例如，在一些实施方案中，免疫原是纯化、重组、合成或以其他方式分离的蛋白质（例如添加到NE中以生成免疫原性组合物）。类似地，免疫原性蛋白质可以是来自病原体的蛋白质的衍生物、类似物或以其他方式修饰的（例如加入聚乙二醇的）形式。

本发明并不受本发明包含NE和免疫原的组合物的具体制剂的限制。实际上，本发明包含NE和免疫原的组合物可以包含一种或多种不同试剂加上NE和免疫原。这些试剂或辅因子包括但不限于佐剂、表面活性剂、添加剂、缓冲剂、增溶剂、螯合剂、油、盐、治疗剂、药物、生物活性剂、抗细菌剂和抗微生物剂（例如抗生素、抗病毒剂等）。在一些实施方案中，本发明包含NE和免疫原的组合物包含增强免疫原诱导免疫应答的能力的试剂和/或辅因子（例如佐剂）。在一些优选实施方案中，一种或多种辅因子或试剂的存在减少关于免疫应答（例如保护性免疫应答（例如保护性免疫接种））诱导所需的免疫原的量。在一些实施方案中，一种或多种辅因子或试剂的存在可以用于使免疫应答偏向细胞（例如T细胞介导的）或体液（例如抗体介导的）免疫应答。本发明并不受在本发明的治疗剂中使用的辅因子或试剂类型的限制。

佐剂一般而言在Vaccine Design--the Subunit and Adjuvant Approach，由Powell和Newman编辑，Plenum Press，New York，1995中描述。本发明并不受利用的佐剂类型（例如用于在包含NE和免疫原的组合物（例如药物组合物）中使用）的限制。例如，在一些实施方案中，合适的佐剂包括铝盐例如氢氧化铝凝胶（明矾）或磷酸铝。在一些实施方案中，佐剂可以是钙、铁或锌盐，或可以是酰化酪氨酸或酰化糖的不溶性悬浮液、阳离子或阴离子衍生化的多糖或聚磷腈。

在一些实施方案中，优选本发明包含NE和免疫原的组合物包含诱导Th1型应答的一种或多种佐剂。然而，在其他实施方案中，将优选本发明包含NE和免疫原的组合物包含诱导Th2型应答的一种或多种佐剂。

一般而言，通过抗原与免疫系统的细胞的相互作用生成针对抗原的免疫应答。免疫应答可以广泛分类成2个种类：体液和细胞介导的免疫应答（例如分别通过抗体和细胞效应子保护机制传统表征的）。应答的这些种类已命名为Th1型应答（细胞介导的应答）和Th2型免疫应答（体液应答）。

免疫应答的刺激可以起因于免疫系统的细胞或组分对干预（例如暴露于免疫原）的直接或间接应答。免疫应答可以以许多方式进行测量，包括免疫系统的细胞（例如B细胞、T细胞、树突细胞、APCs、巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞等）的活化、增殖或分化；标记和细胞因子的表达上调或下调；IgA、IgM或IgG滴度的刺激；脾大（包括增加的脾细胞构成）；在各种器官中的增生和混合细胞浸润。可以就免疫刺激而言进行评估的免疫系统的其他应答、细胞和组分是本领域已知的。

尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但在一些实施方案中，本发明的组合物和方法诱导细胞因子的表达和分泌（例如通过巨噬细胞、树突细胞和CD4+ T细胞）。特定细胞因子的表达调节可以局部或全身地发生。已知细胞因子概况可以决定免疫应答中的T细胞调节和效应子功能。在一些实施方案中，可以诱导Th1型细胞因子，并且因此本发明的免疫刺激组合物可以促进Th1型抗原特异性免疫应答，包括细胞毒性T细胞（例如从而避免不需要的Th2型免疫应答（例如Th2型细胞因子（例如IL-13）的生成与增强疾病的严重性（例如粘液形成的IL-13诱导）有关））。

细胞因子在指导T细胞应答中起作用。辅助（CD4+）T细胞通过可溶性因子的产生来协调哺乳动物的免疫应答，所述可溶性因子作用于其他免疫系统细胞，包括B和其他T细胞。大多数成熟CD4+T辅助细胞表达2种细胞因子概况之一：Th1或Th2。Th1型CD4+ T细胞分泌IL-2、IL-3、IFN-γ、GM-CSF和高水平的TNF-α。Th2细胞表达IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、GM-CSF和低水平的TNF-α。Th1型细胞因子促进细胞介导的免疫，和特征在于在小鼠中至IgG2a和在人中至IgG1的免疫球蛋白类别转换的体液免疫。Th1应答还可以与迟发型超敏反应和自身免疫病相关。Th2型细胞因子主要诱导体液免疫，并且诱导至IgG1和IgE的类别转换。与Th1应答相关的抗体同种型一般具有中和和调理能力，而与Th2应答相关的那些与变应性应答更相关。

已显示几种因子影响免疫应答朝向Th1或Th2型应答的偏斜。最佳表征的调节剂是细胞因子。IL-12和IFN-γ是正Th1和负Th2调节剂。IL-12促进IFN-γ产生，并且IFN-γ提供用于IL-12的正反馈。IL-4和IL-10看起来对于Th2细胞因子概况确立和下调Th1细胞因子产生是重要的。

因此，在优选实施方案中，本发明提供了在受试者中刺激Th1型免疫应答的方法，其包括给受试者施用包含NE和免疫原的组合物。然而，在其他实施方案中，本发明提供了在受试者中刺激Th2型免疫应答（例如如果需要T细胞介导的应答的平衡）的方法，其包括给受试者施用包含NE和免疫原的组合物。在进一步优选的实施方案中，可以使用佐剂（例如可以与本发明的组合物共施用），以使免疫应答偏向Th1或Th2型免疫应答。例如，诱导Th2或弱Th1应答的佐剂包括但不限于明矾、皂苷和SB-As4。诱导Th1应答的佐剂包括但不限于MPL、MDP、ISCOMS、IL-12、IFN-γ和SB-AS2。

几种其他类型的Th1型免疫原可以用于（例如作为佐剂）本发明的组合物和方法中。这些包括但不限于下述。在一些实施方案中，使用单磷酰脂质A（例如特别是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A（3D-MPL））。3D-MPL是由Ribi Immunochem，Montana制造的众所周知的佐剂。以化学方法，它经常作为具有4、5或6条酰化链的3-脱-O-酰化单磷酰脂质A的混合物供应。在一些实施方案中，使用二磷酰脂质A及其3-O-脱酰化变体。这些免疫原各自可以通过在此整体引入作为参考的GB 2122204B中所述方法进行纯化且制备。其他纯化和合成的脂多糖已得到描述（参见例如，美国专利号6,005,099和EP 0 729 473；Hilgers等人，1986，Int.Arch.Allergy.Immunol.，79（4）:392-6；Hilgers等人，1987，Immunology，60（1）:141-6；和EP 0 549 074，其各自在此整体引入作为参考）。在一些实施方案中，3D-MPL以颗粒制剂的形式使用（例如具有直径小于0.2 μm的小粒子大小，在此整体引入作为参考的EP 0 689 454中描述的）。

在一些实施方案中，皂苷在本发明的组合物中用作免疫原（例如Th1型佐剂）。皂苷是众所周知的佐剂（参见例如，Lacaille-Dubois和Wagner （1996）Phytomedicine 第2卷第363-386页）。皂苷的例子包括Quil A（衍生自南美洲树Quillaja Saponaria Molina的树皮），及其级分（参见例如，美国专利号5,057,540；Kensil，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12（1-2）:1-55；和EP 0 362 279，其各自在此整体引入作为参考）。还预期在本发明中有用的是溶血皂苷QS7、QS17和QS21（Quil A的HPLC纯化的级分；参见例如Kensil等人（1991）. J. Immunology 146,431-437，美国专利号5,057,540；WO 96/33739；WO 96/11711和EP 0 362 279，其各自在此整体引入作为参考）。还预期有用的是QS21和聚山梨醇酯或环糊精的组合（参见例如，WO 99/10008，在此整体引入作为参考。

在一些实施方案中，含有未甲基化CpG二核苷酸（“CpG”）的免疫原性寡核苷酸在本发明中用作佐剂。CpG是关于DNA中存在的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序的缩写。当通过全身和粘膜途径施用时，CpG在本领域已知是佐剂（参见例如，WO 96/02555，EP 468520，Davis等人，J.Immunol，1998，160（2）:870-876；McCluskie和Davis，J.Immunol.，1998，161（9）:4463-6；和美国专利申请号20050238660，其各自在此整体引入作为参考）。例如，在一些实施方案中，免疫刺激序列是嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶；其中CG基序不是甲基化的。

尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但在一些实施方案中，一个或多个CpG寡核苷酸的存在活化各种免疫亚群，包括天然杀伤细胞（其产生IFN-γ）和巨噬细胞。在一些实施方案中，将CpG寡核苷酸配制到本发明的组合物内用于诱导免疫应答。在一些实施方案中，CpG的游离溶液与抗原（例如存在于NE溶液内共施用（参见例如，WO 96/02555；在此引入作为参考）。在一些实施方案中，CpG寡核苷酸与抗原共价缀合（参见例如，WO 98/16247，在此引入作为参考），或与载体例如氢氧化铝一起配制（参见例如，Brazolot-Millan等人，Proc.Natl.AcadSci.，USA，1998，95（26），15553-8）。

在一些实施方案中，佐剂例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂、细胞因子（例如白细胞介素（例如IL-2、IFN-γ、IL-4等）、巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子等），细菌ADP-核糖基化毒素的解毒突变体，例如霍乱毒素（CT）、百日咳毒素（PT）或大肠杆菌（E.coli）热不稳定毒素（LT），特别是LT-K63（其中赖氨酸取代在位置63上的野生型氨基酸）、LT-R72（其中精氨酸取代在位置72上的野生型氨基酸）、CT-S109（其中丝氨酸取代在位置109上的野生型氨基酸）、和PT-K9/G129（其中赖氨酸取代在位置9上的野生型氨基酸和甘氨酸取代在位置129上）（参见例如，WO93/13202和WO92/19265，其各自在此引入作为参考），及其他免疫原性物质（例如增强本发明的组合物的有效性的那种）与本发明包含NE和免疫原的组合物一起使用。

在本发明中有用的佐剂的另外例子包括聚（二（羧基苯氧基）磷腈（PCPP聚合物；Virus Research Institute，USA）；脂多糖例如单磷酰脂质A（MPL；Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Mont.）、胞壁酰二肽（MDP；Ribi）和苏氨酰胞壁酰二肽（t-MDP；Ribi）的衍生物；OM-174（与脂质A相关的葡糖胺二糖；OM Pharma SA，Meyrin，瑞士）；和利什曼虫属（Leishmania）延伸因子（纯化的利什曼虫属蛋白质；Corixa Corporation，Seattle，Wash.）。

佐剂可以添加到包含NE和免疫原的组合物中，或在与包含NE和免疫原的组合物组合或共施用前，佐剂可以与载体例如脂质体或金属盐（例如铝盐（例如氢氧化铝））一起配制。

在一些实施方案中，包含NE和免疫原的组合物包含单一佐剂。在其他实施方案中，包含NE和免疫原的组合物包含2种或更多佐剂（参见例如，WO 94/00153；WO 95/17210；WO 96/33739；WO 98/56414；WO 99/12565；WO 99/11241；和WO 94/00153，其各自在此整体引入作为参考）。

在一些实施方案中，本发明包含NE和免疫原的组合物包含一种或多种粘膜粘着剂（参见例如，在此整体引入作为参考的美国专利申请号20050281843）。本发明并不受利用的粘膜粘着剂类型的限制。实际上，多种粘膜粘着剂预期在本发明中是有用的，包括但不限于聚（丙烯酸）的交联衍生物（例如卡波泊尔和聚卡波非）、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖（例如藻酸盐和壳聚糖）、羟丙基甲基纤维素、凝集素、菌毛蛋白和羧甲基纤维素。尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但在一些实施方案中，粘膜粘着剂的使用（例如在包含NE和免疫原的组合物中）增强受试者（例如施用了本发明的组合物）中免疫应答的诱导，这是由于与在不存在使用粘膜粘着剂的情况下，暴露于免疫原的持续时间和/或量相比较，当使用粘膜粘着剂时，受试者经历的暴露于免疫原的持续时间和/或量中的增加。

在一些实施方案中，本发明的组合物可以包含无菌水性制剂。可接受的载体和溶剂包括但不限于水、林格液、磷酸缓冲盐水和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油照常规用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以采用任何温和的固定矿物或非矿物油，包括合成甘油单或二酯。此外，脂肪酸例如油酸在可注射剂的制备中有用。适合于粘膜、皮下、肌内、腹膜内、静脉内或经由其他途径施用的载体制剂可以在Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.中找到。

本发明包含NE和免疫原的组合物可以在治疗上（例如以增强免疫应答）或作为预防剂（例如用于免疫接种（例如以预防疾病的病征或症状））使用。本发明包含NE和免疫原的组合物可以经由许多不同递送途径和方法施用于受试者。

例如，本发明的组合物可以通过多种方法施用于受试者（例如粘膜（例如鼻粘膜、阴道粘膜等）），包括但不限于：悬浮于溶液中且应用于表面；悬浮于溶液中且使用喷雾剂施用器喷射到表面上；与粘膜粘着剂混合且应用（例如喷射或擦拭）到表面（例如粘膜表面）上；置于或浸渗到鼻和/或阴道施用器上且应用；通过控释机制应用；作为脂质体应用；或在聚合物上应用。

在一些优选实施方案中，本发明的组合物粘膜施用（例如使用标准技术；参见例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，第19版，1995（例如用于粘膜递送技术，包括鼻内、肺、阴道和直肠技术），以及欧洲公开号517,565和Illum等人，J. Controlled Rel.，1994，29:133-141（例如用于鼻内施用的技术），其各自在此整体引入作为参考）。可替代地，本发明的组合物可以皮肤或经皮施用，其中使用标准技术（参见例如，Remington: The Science arid Practice of Pharmacy，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，第19版，1995）。本发明并不受施用途径的限制。

尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但在一些实施方案中，粘膜接种疫苗是优选施用途径，这是因为已显示抗原的粘膜施用具有在粘膜表面――许多病原体的进入途径――诱导保护性免疫应答（例如粘膜免疫）的更大功效。此外，粘膜接种疫苗例如鼻内接种疫苗不仅在鼻粘膜中，还在遥远粘膜位点例如生殖粘膜中可以诱导粘膜免疫（参见例如，Mestecky，Journal of Clinical Immunology，7:265-276，1987）。更有利地，在进一步优选的实施方案中，除诱导粘膜免疫应答外，粘膜接种疫苗还诱导全身免疫。在一些实施方案中，非肠胃外施用（例如疫苗的粘膜施用）提供加强全身免疫的有效和方便方式（例如通过肠胃外或粘膜接种疫苗诱导的（例如在其中多重加强用于维持强有力全身免疫的情况下））。

在一些实施方案中，本发明包含NE和免疫原的组合物可以用于保护或治疗对疾病易感或患有疾病的受试者，这借助于经由粘膜途径（例如经口/饮食或鼻途径）施用本发明的组合物来实现。可替代粘膜途径包括阴道内和直肠内途径。在本发明的优选实施方案中，使用施用的鼻途径，本文称为“鼻内施用”或“鼻内接种疫苗”。鼻内接种疫苗的方法是本领域众所周知的，包括小滴或喷雾形式的疫苗施用到待免疫接种的受试者的鼻咽内。在一些实施方案中，提供了包含NE和免疫原的雾化或气溶胶化组合物。用于经口施用的肠制剂例如胃抗性胶囊、用于直肠或阴道施用的栓剂也构成本发明的部分。本发明的组合物还可以经由经口途径施用。在这些环境下，包含NE和免疫原的组合物可以包含药学可接受的赋形剂和/或包括碱性缓冲剂或肠胶囊。用于鼻递送的制剂可以包括具有葡聚糖或环糊精（cyclodextran）和皂苷作为佐剂的那些。

本发明的组合物还可以经由阴道途径施用。在此种情况下，包含NE和免疫原的组合物可以包含药学可接受的赋形剂和/或乳化剂、聚合物（例如CARBOPOL）、以及阴道乳膏和栓剂的其他已知稳定剂。在一些实施方案中，本发明的组合物经由直肠途径施用。在此种情况下，包含NE和免疫原的组合物可以包含本领域已知用于形成直肠栓剂的赋形剂和/或蜡和聚合物。

在一些实施方案中，选择相同施用途径（例如粘膜施用）用于初免（priming）和加强接种疫苗。在一些实施方案中，利用多重施用途径（例如同时或可替代地序贯地），以刺激免疫应答（例如使用本发明包含NE和免疫原的组合物）。

例如，在一些实施方案中，包含NE和免疫原的组合物在初免或加强接种疫苗方案中施用于受试者的粘膜表面。可替代地，在一些实施方案中，包含NE和免疫原的组合物在初免或加强接种疫苗方案中全身施用。在一些实施方案中，包含NE和免疫原的组合物在初免接种疫苗方案中经由粘膜施用和加强方案经由全身施用施用于受试者。在一些实施方案中，包含NE和免疫原的组合物在初免接种疫苗方案中经由全身施用和加强方案经由粘膜施用施用于受试者。全身施用途径的例子包括但不限于肠胃外、肌内、真皮内、经皮、皮下、腹膜内或静脉内施用。包含NE和免疫原的组合物可以用于预防和治疗目的。

在一些实施方案中，本发明的组合物通过肺递送进行施用。例如，本发明的组合物可以经由吸入（例如从而穿过肺上皮衬里到血流递送至受试者（例如人）的肺（参见例如，Adjei等人Pharmaceutical Research 1990；7:565-569；Adjei等人Int. J. Pharmaceutics 1990；63:135-144；Braquet等人J. Cardiovascular Pharmacology 1989 143-146；Hubbard等人（1989）Annals of Internal Medicine，第III卷，第206-212页；Smith等人J. Clin. Invest. 1989；84:1145-1146；Oswein等人"Aerosolization of Proteins"，1990；Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone，Colorado；Debs等人J. Immunol. 1988；140:3482-3488；和给予Platz等人的美国专利号5,284,656，其各自在此整体引入作为参考）。用于全身效应的用于药物的肺递送的方法和组合物于在此引入作为参考的给予Wong等人的美国专利号5,451,569中描述；还参见在此整体引入作为参考的给予Licalsi等人的美国专利号6,651,655））。

进一步预期用于在本发明的实践中使用的是设计用于药物试剂的肺和/或鼻粘膜递送的广泛范围的机械设备，包括但不限于喷洒器、计量剂量吸入器和粉末吸入器，所有这些是本领域技术人员熟悉的。适合于本发明实践的商购可得设备的一些具体例子是Ultravent喷洒器（Mallinckrodt Inc.，St. Louis，Mo.）；Acorn II喷洒器（Marquest Medical Products，Englewood，Colo.）；Ventolin计量剂量吸入器（Glaxo Inc.，Research Triangle Park，N.C.）；和Spinhaler粉末吸入器（Fisons Corp.，Bedford，Mass.）。所有此种设备需要适合于治疗剂分配的制剂的使用。一般地，每种制剂对于采用的设备类型是特异性的，并且可以涉及合适推进剂材料的使用，加上通常的稀释剂、佐剂、表面活性剂、载体和/或在治疗中有用的其他试剂。同样，预期了脂质体、微胶囊或小球体、包含复合物或其他类型载体的使用。

因此，在一些实施方案中，本发明包含NE和免疫原的组合物可以用于保护或治疗对疾病易感或患有疾病的受试者，这借助于经由粘膜、肌内、腹膜内、真皮内、经皮、肺、静脉内、皮下或本文描述的其他施用途径施用包含NE和免疫原的组合物来实现。疫苗制剂的全身施用方法可以包括常规注射器和针、或设计用于固体疫苗的弹道递送的设备（参见例如，在此引入作为参考的WO 99/27961）、或无针压力液体喷射设备（参见例如，美国专利号4,596,556；美国专利号5,993,412，其各自在此引入作为参考）、或经皮贴片（参见例如，WO 97/48440；WO 98/28037，其各自在此引入作为参考）。本发明还可以用于增强应用于皮肤的抗原的免疫原性（经皮或经皮肤递送，参见例如，WO 98/20734 ；WO 98/28037，其各自在此引入作为参考）。因此，在一些实施方案中，本发明提供了由本发明的疫苗组合物预装填的，用于全身施用的递送设备。

本发明并不受本发明的组合物施用（例如以刺激免疫应答（例如以生成保护性免疫（例如粘膜和/或全身免疫）））的受试者类型的限制。实际上，广泛多样的受试者预期将获益于本发明的组合物的施用。在优选实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，人受试者具有任何年龄（例如成人、儿童、婴儿等），其已经或可能变得暴露于微生物（例如RSV）。在一些实施方案中，人受试者是更可能接受对于致病微生物的直接暴露或在暴露于病原体后更可能展示出疾病的病征和症状的受试者（例如免疫抑制的受试者）。在一些实施方案中，给公众施用（例如用其接种疫苗）本发明的组合物（例如以预防疾病的出现或传播）。例如，在一些实施方案中，本发明的组合物和方法用于给一群人（例如地区、城市、州和/或国家的群体）接种疫苗用于其自身健康（例如以预防或治疗疾病）。在一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物（例如猪、牛、山羊、马、绵羊或其他家畜；或小鼠、大鼠、豚鼠或其他动物）。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法用于研究背景中（例如用研究动物）。

本发明的组合物可以配制用于通过任何途径施用，例如粘膜、经口、局部、肠胃外或本文描述的其他途径。组合物可以为任何一种或多种不同形式，包括但不限于片剂、胶囊、粉末、颗粒、锭剂、泡沫、乳膏或液体制剂。

本发明的局部制剂可以作为例如软膏、乳膏或洗剂、泡沫和气溶胶呈现，并且可以含有合适的常规添加剂，例如在软膏和乳膏中的防腐剂、溶剂（例如以帮助穿透）和软化剂。

局部制剂还可以包括增强活性成分通过皮肤的穿透的试剂。示例性试剂包括N-（羟乙基）吡咯烷酮和胞外被膜无序化化合物的二元组合，与亚砜或氧化膦组合的糖酯，以及蔗糖单油酸酯、癸基甲基亚砜和醇。

增加皮肤穿透的其他示例性材料包括表面活性剂或润湿剂，包括但不限于聚氧乙烯水山梨糖醇酐单油酸酯（聚山梨醇酯80）；失水山梨糖醇单油酸酯（Span 80）；对异辛基聚氧乙烯-酚聚合物（Triton WR-1330）；聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯（Tween 85）；琥珀酸二辛酯磺酸钠；和肌氨酸钠（Sarcosyl NL-97）；及其他药学可接受的表面活性剂。

在本发明的某些实施方案中，组合物可以进一步包含一种或多种醇、含锌化合物、软化剂、湿润剂、增稠和/或胶凝剂、中和剂和表面活性剂。在制剂中使用的水优选是具有中性pH的去离子水。在局部制剂中的另外添加剂包括但不限于硅酮液、染料、香料、pH调节剂和维生素。

局部制剂还可以含有相容的常规载体，例如乳膏或软膏基质和用于洗剂的乙醇或油醇。此种载体可以呈现为约1％直到约98％的制剂。软膏基质可以包含矿脂、矿物油、地蜡、羊毛脂醇、泛醇、甘油、红没药醇、可可脂等中的一种或多种。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以配制且作为泡沫使用。药物泡沫包括制剂例如但不限于乳剂、微乳剂、乳膏、胶冻和脂质体。虽然在性质中基本上相似，但这些制剂在最终产物的组分和一致性中不同。

本发明的组合物可以另外含有在药物组合物中照常规发现的其他附加组分。因此，例如，组合物可以含有另外、相容的药学活性的材料，例如止痒药、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可以含有在物理上配制本发明的组合物的各种剂型中有用的另外材料，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加时，此种材料优选不会不适当地干扰本发明组合物的组分的生物学活性。制剂可以是无菌的，并且如果需要的话，与辅助试剂（例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味和/或芳香物等）混合，所述辅助试剂不与制剂的NE和免疫原有害地相互作用。在一些实施方案中，本发明的免疫刺激组合物以药学可接受的盐的形式施用。当使用时，盐应是药学可接受的，但非药学可接受的盐可以方便地用于制备其药学可接受的盐。此种盐包括但不限于由下述酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸、和苯磺酸。同样，此种盐可以制备为碱金属或碱土盐，例如羧酸基团的钠、钾或钙盐。

合适的缓冲试剂包括但不限于乙酸和盐（1-2％w/v）；柠檬酸和盐（1-3％w/v）；硼酸和盐（0.5-2.5％w/v）；以及磷酸和盐（0.8-2％w/v）。合适的防腐剂可以包括苯扎氯铵（0.003-0.03％w/v）；氯代丁醇（0.3-0.9％w/v）；对羟基苯甲酸酯（0.01-0.25％w/v）和硫柳汞（0.004-0.02％w/v）。

在一些实施方案中，包含NE和免疫原的组合物与一种或多种抗生素共施用。例如，一种或多种抗生素可以与包含NE和免疫原的组合物的施用一起、在其之前和/或在其之后施用。本发明并不受共施用的抗生素类型的限制。实际上，多种抗生素可以共施用，包括但不限于β-内酰胺抗生素、青霉素（例如天然青霉素、氨基青霉素、青霉素酶抗性青霉素、羧基青霉素、脲基青霉素）、头孢菌素（第一代、第二代和第三代头孢菌素）、及其他β-内酰胺（例如亚胺青霉烯、单环内酰胺）、β-内酰胺酶抑制剂、万古霉素、氨基糖苷和壮观霉素、四环素、氯霉素、红霉素、林可霉素、克林霉素、利福平、甲硝唑、多粘菌素、多西环素、喹诺酮（例如环丙沙星）、磺胺、甲氧苄啶和喹啉。

存在目前可用于在治疗细菌、真菌和病毒感染中使用的大量抗微生物剂。对于关于此种药物的一般类别及其作用机制的广泛论文，技术人员参考Goodman & Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics" 编辑Hardman等人，第9版，Pub. McGraw Hill，第43到50章，1996，（整体引入本文作为参考）。一般地，这些试剂包括抑制细胞壁合成的试剂（例如青霉素、头孢菌素、环丝氨酸、万古霉素、杆菌肽）；和咪唑抗真菌剂（例如咪康唑、酮康唑和克霉唑）；直接作用于破裂微生物的细胞膜的试剂（例如去污剂，例如多粘菌素（polmyxin）和粘菌素M和抗真菌剂制霉菌素和两性霉素B）；影响核糖体亚单位以抑制蛋白质合成的试剂（例如氯霉素、四环素、红霉素（erthromycin）和克林霉素）；改变蛋白质合成且导致细胞死亡的试剂（例如氨基糖苷）；影响核酸代谢的试剂（例如利福霉素和喹诺酮）；抗代谢物（例如甲氧苄啶和磺胺）；和核酸类似物例如齐多夫定、更昔洛韦（gangcyclovir）、阿糖腺苷和阿昔洛韦，其作用于抑制对于DNA合成必需的病毒酶。可以采用抗微生物剂的各种组合。

本发明还包括涉及包含NE和免疫原的组合物与一种或多种另外的活性和/或免疫刺激剂（例如包含NE和不同免疫原、抗生素、抗氧化剂等的组合物）的共施用的方法。实际上，本发明的进一步方面是提供通过共施用本发明的组合物用于增强现有技术免疫刺激方法（例如免疫接种法）和/或药物组合物的方法。在共施用程序中，试剂可以同时或序贯施用。在一个实施方案中，本文描述的组合物在一种或多种其他活性试剂之前施用。药物制剂和施用方式可以是本文描述那些中的任何一种。此外，2种或更多共施用的试剂可以各自使用不同方式（例如途径）或不同制剂进行施用。待共施用的另外试剂（例如抗生素、佐剂等）可以是本领域众所周知的试剂中的任何一种，包括但不限于目前在临床使用中的那些。

在一些实施方案中，包含NE和免疫原的组合物经由超过一个途径施用于受试者。例如，将获益于具有针对致病性微生物的保护性免疫应答（例如免疫）的受试者可以获益于接受粘膜施用（例如鼻施用或本文描述的其他粘膜途径），和另外接受一个或多个其他施用途径（例如肠胃外或肺施用（例如经由喷洒器、吸入器或本文描述的其他方法）。在一些优选实施方案中，经由粘膜途径的施用足以诱导针对免疫原或免疫原由其衍生的生物的粘膜以及全身免疫。在其他实施方案中，经由多重途径的施用作用于提供粘膜和全身免疫。因此，尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但在一些实施方案中，预期经由多重施用途径（例如免疫接种（例如本发明包含NE和免疫原的组合物的粘膜以及气道或肠胃外施用）施用本发明的组合物的受试者可以具有比经由仅一个途径施用组合物的受试者更强的针对免疫原的免疫应答。

其他递送系统可以包括时间-释放、延迟释放或持续释放递送系统。此种系统可以避免组合物的反复施用，从而增加对于受试者和医生的方便。许多类型的释放递送系统是本领域普通技术人员可获得且已知的。它们包括基于聚合物的系统，例如聚（丙交酯-乙交酯）、共聚草酸酯（copolyoxalates）、聚己酸内酯、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚羟丁酸和聚酐。前述含有聚合物的药物的微胶囊在例如在此引入作为参考的美国专利号5,075,109中描述。递送系统还包括非聚合物系统，其为：脂质包括固醇例如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪例如甘油单、二和三酯；水凝胶释放系统；sylastic系统；基于肽的系统；蜡包衣；使用常规粘合剂和赋形剂的压片剂；部分融合的植入体；等。具体例子包括但不限于：（a）其中本发明的试剂以在基质内的形式包含的侵蚀系统，例如美国专利号4,452,775、4,675,189和5,736,152中描述的那些，其各自在此整体引入作为参考，和（b）其中活性组分以控制速率从聚合物中渗透的扩散系统，如美国专利号3,854,480、5,133,974和5,407,686中所述的，其各自在此整体引入作为参考。此外，可以使用基于泵的硬件递送系统，其中一些适合于植入。

在优选实施方案中，当施用于受试者时，本发明包含NE和免疫原的组合物包含合适量的免疫原，以在受试者中诱导免疫应答。在优选实施方案中，免疫应答足以给受试者提供针对后续暴露于免疫原或免疫原由其衍生的微生物（例如细菌或病毒）的保护（例如免疫保护）。本发明并不受使用的免疫原的量的限制。在一些优选实施方案中，在包含NE和免疫原的组合物中免疫原（例如通过NE中和的病毒或细菌，或重组蛋白质）的量（例如，用于用作免疫接种剂量）选择为诱导免疫保护应答而无显著不利副作用的量。该量将取决于采用的具体免疫原或其组合而改变，并且可以从受试者到受试者不等，这取决于许多因素，包括但不限于受试者的物种、年龄和一般状况（例如健康），和施用方式。用于测定施用于受试者以在受试者中引发免疫应答（例如保护性免疫应答（例如保护性免疫））的免疫原的合适量的程序是本领域技术人员众所周知的。

在一些实施方案中，预期每个剂量（例如包含NE和免疫原的组合物（例如施用于受试者以诱导免疫应答（例如保护性免疫应答（例如保护性免疫））的）包含0.05-5000 μg每种免疫原（例如重组和/或纯化的蛋白质），在一些实施方案中，每个剂量将包含1-500 μg，在一些实施方案中，每个剂量将包含350-750μg，在一些实施方案中，每个剂量将包含50-200μg，在一些实施方案中，每个剂量将包含25-75μg免疫原（例如重组和/或纯化的蛋白质）。在一些实施方案中，每个剂量包含足以生成免疫应答的免疫原的量。在剂量中免疫原的有效量无需是定量的，只要当施用于受试者时，免疫原的量在受试者中生成免疫应答。关于具体施用的最佳量（例如以诱导免疫应答（例如保护性免疫应答（例如保护性免疫）））可以通过本领域技术人员使用标准研究进行确定，所述标准研究涉及抗体滴度和受试者中的其他应答的观察。

在一些实施方案中，预期每个剂量（例如包含NE和免疫原的组合物（例如施用于受试者以诱导免疫应答）的）为按重量计0.001 - 15％或更多（例如0.001-10％、0.5-5％、1-3％、2％、6％、10％、15％或更多）免疫原（例如中和的细菌或病毒，或重组和/或纯化的蛋白质）。在一些实施方案中，起始或初免施用剂量含有比后续加强剂量更多的免疫原。

在一些实施方案中，当本发明的NE用于灭活活微生物（例如病毒（例如RSV））时，预期每个剂量（例如施用于受试者以诱导免疫应答））包含10 – 10⁹ pfu病毒/剂量；在一些实施方案中，每个剂量包含10⁵ - 10⁸pfu病毒/剂量；在一些实施方案中，每个剂量包含10³ - 10⁵pfu病毒/剂量；在一些实施方案中，每个剂量包含10² - 10⁴pfu病毒/剂量；在一些实施方案中，每个剂量包含10pfu病毒/剂量；在一些实施方案中，每个剂量包含10²pfu病毒/剂量；并且在一些实施方案中，每个剂量包含10⁴pfu病毒/剂量。在一些实施方案中，每个剂量包含超过10⁹pfu病毒/剂量。在一些优选实施方案中，每个剂量包含10³pfu病毒/剂量。

本发明并不受用于灭活活微生物（例如病毒（例如RSV的一个或多个类型））的NE的量的限制。在一些实施方案中，使用0.1％- 5％NE溶液，在一些实施方案中，使用5％-20％NE溶液，在一些实施方案中，使用20％NE溶液，并且在一些实施方案中，使用超过20％的NE溶液，以灭活致病性微生物。在优选实施方案中，使用15％NE溶液。

类似地，本发明并不受活微生物在本发明的NE中温育以变得灭活的持续时间的限制。在一些实施方案中，微生物在NE中温育1-3小时。在一些实施方案中，微生物在NE中温育3-6小时。在一些实施方案中，微生物在NE中温育超过6小时。在优选实施方案中，微生物在NE（例如10％NE溶液）中温育3小时。在一些实施方案中，温育在37℃执行。在一些实施方案中，温育在大于或小于37℃的温度执行。本发明也不受用于灭活的微生物的量的限制。微生物的量可以取决于许多因素，包括但不限于所需的免疫原性组合物（例如NE和免疫原）的总量、所需的溶液浓度（例如在稀释用于施用前）、微生物和NE。在一些优选实施方案中，在灭活程序中使用的微生物的量是产生待在单一剂量（例如由浓原液稀释的）中施用于受试者的免疫原（例如如本文描述的）所需量的那个量。

在一些实施方案中，本发明包含NE和免疫原的组合物以浓缩剂量进行配制，所述浓缩剂量可以在施用于受试者之前进行稀释。例如，浓缩组合物的稀释物可以这样施用于受试者，从而使得受试者接受本文提供的任何一个或多个具体剂量。在一些实施方案中，浓缩组合物的稀释可以这样进行，使得受试者施用（例如在单一剂量中）包含在浓缩组合物中存在的0.5-50％NE和免疫原的组合物。在一些优选实施方案中，受试者在单一剂量中施用包含在浓缩组合物中存在的1％NE和免疫原的组合物。浓缩组合物预期在其中大量受试者可能施用本发明的组合物（例如免疫接种诊所、医院、学校等）的背景中是有用的。在一些实施方案中，本发明包含NE和免疫原的组合物（例如浓缩组合物）在室温稳定超过1周，在一些实施方案中，超过2周，在一些实施方案中，超过3周，在一些实施方案中，超过4周，在一些实施方案中，超过5周，并且在一些实施方案中，超过6周。

一般地，本发明的乳剂组合物将包含至少0.001％- 100％、优选0.01 - 90％乳剂/ml液体组合物。预计制剂可以包含约0.001％、约0.0025％、约0.005％、约0.0075％、约0.01％、约0.025％、约0.05％、约0.075％、约0.1 ％、约0.25％、约0.5％、约1.0％、约2.5％、约5％、约7.5％、约10％、约12.5％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％乳剂/ml液体组合物。应当理解在上文列出的任何2个数字之间的范围特别预期在本发明的边界和界限内包含。在剂量中的一些变动将必然发生，这取决于具体病原体和待免疫接种的受试者的状况。

在一些实施方案中，在本发明的组合物的起始施用（例如起始接种疫苗）后，受试者可以接受在第一次、第二次、第三次、第四次、第五次、第六次、第七次、第八次、第九次、第十次和/或超过第十次施用后的一次或多次加强施用（例如约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约10周、约3个月、约4个月、约6个月、约9个月、约1年、约2年、约3年、约5年、约10年）。尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但在一些实施方案中，在加强剂量中免疫原的再引入使得受试者中的强有力全身免疫成为可能。加强可以用对于初次免疫应答给予的相同制剂，或可以用含有免疫原的不同制剂。剂量方案还将至少部分由受试者的需要决定且取决于从业者的判断。

剂量单位可以基于几种因素按比例增加或减少，包括但不限于受试者的重量、年龄和健康状态。此外，剂量单位可以对于后续施用（例如加强施用）增加或减少。

本发明的包含免疫原的组合物在下述情况中有用：其中传染和/或致病试剂（例如对于其寻求引发保护性免疫）的性质是已知的，以及其中传染和/或致病试剂的性质是未知的（例如在新出现的疾病中（例如具有大流行比例的（例如流感或疾病的其他爆发）））。例如，本发明预期了本发明的组合物在治疗或预防（例如经由用经由本发明的NE中和的传染和/或致病的RSV或RSV样试剂的免疫接种）与仍有待鉴定的新出现的传染和/或致病试剂相关的感染（例如从患病个人中分离和/或培养的，但无传染和/或致病试剂的遗传、生物化学或其他表征）中的用途。

预期本发明的组合物和方法将在各种背景包括研究背景中有用。例如，本发明的组合物和方法也在免疫系统的研究（例如适应性免疫应答（例如保护性免疫应答（例如粘膜或全身免疫））的表征）中有用。由本发明提供的组合物和方法的使用包含人和非人受试者以及来自这些受试者的样品，并且还包含使用这些受试者的研究应用。本发明的组合物和方法也在研究和最佳化纳米乳剂、免疫原及其他组分和用于筛选新组分中有用。因此，不预期本发明限制于任何具体受试者和/或应用背景。

制剂可以在体内在开发用于研究粘膜和其他递送途径的许多动物模型中进行测试。如显而易见的，本发明的组合物用于预防和/或治疗由病毒、细菌、寄生物和真菌引起的广泛多样的疾病和感染，以及用于引发针对多种抗原的免疫应答。组合物不仅可以在预防或治疗上使用，如上所述，而且组合物还可以用于制备抗体，多克隆和单克隆的（例如用于诊断目的），以及用于目的抗原的免疫纯化。如果需要多克隆抗体，那么所选哺乳动物（例如小鼠、兔、山羊、马等）可以用本发明的组合物进行免疫接种。动物通常在用抗原的一次或多次施用后2-6周进行加强。多克隆抗血清随后可以从免疫接种的动物中获得且根据已知程序使用（参见例如，Jurgens等人，J. Chrom. 1985，348:363-370）。

在一些实施方案中，本发明提供了包括包含NE和免疫原的组合物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒进一步提供了用于施用组合物的设备。本发明并不受试剂盒中包括的设备类型的限制。在一些实施方案中，设备配置用于本发明的组合物的鼻应用（例如鼻施用器（例如注射器）或鼻吸入器或鼻细粒喷雾发生器（mister））。在一些实施方案中，试剂盒包含以浓缩形式（例如其可以在施用于受试者之前进行稀释）的包含NE和免疫原的组合物。

在一些实施方案中，所有试剂盒组分存在于单一容器（例如小瓶或管）内。在一些实施方案中，每种试剂盒组分位于单一容器（例如小瓶或管）中。在一些实施方案中，一种或多种试剂盒组分位于单一容器（例如小瓶或管）中，而相同试剂盒的其他组分位于分开容器（例如小瓶或管）中。在一些实施方案中，试剂盒包含缓冲剂。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含使用说明书。

实施例

下述实施例作用于举例说明本发明的某些优选实施方案和方面，并且不应解释为限制其范围。

在下述实验公开内容中，应用下述缩写：eq（当量）；μ（微米）；M（摩尔的）；μM（微摩尔的）；mM（毫摩尔的）；N（正常）；mol（摩尔）；mmol（毫摩尔）；μmol（微摩尔）；nmol（纳摩尔）；g（克）；mg（毫克）；μg（微克）；ng（纳克）；L（升）；ml（毫升）；μl（微升）；cm（厘米）；mm（毫米）；μm（微米）；nM（纳摩尔的）；℃（摄氏度）；和PBS（磷酸缓冲盐水）。

实施例1

包含纳米乳剂灭活的呼吸道合胞病毒的组合物和利用其的方法

材料与方法

小鼠。Balb/c小鼠购自Jackson Laboratories。所有动物工作依照University of Michigan Committee on Use and Care of Animals政策执行。

病毒噬斑测定。收获来自受感染小鼠的肺右叶，并且使用研钵和研杵用沙研磨。将来自肺的样品旋转2x，或在与纳米乳剂一起温育后获得，并且将上清液系列稀释到Vero细胞的~90％汇合单层上。使样品伴随轻轻旋转在37℃温育2小时，随后去除受感染上清液，并且用0.9％甲基纤维素替换。在37℃温育5天后，去除甲基纤维素，用甲醇替换，并且在-80℃温育1小时。在甲醇去除后，将样品贮存于-80℃直至噬斑发展。使用修饰的ELISA规程发展噬斑。简言之，细胞在37℃用25％Blotto（在磷酸缓冲盐水中稀释的奶粉）封闭1小时，洗涤且在37℃与山羊抗人RSV多克隆Ab（Chemicon International）一起温育1小时。将细胞再次洗涤，且与辣根过氧化物酶缀合的抗山羊/绵羊IgG（Serotec）一起温育1小时。将细胞洗涤且在室温与氯萘酚一起温育，并且计数噬斑。

RSV纳米乳剂的制备。RSV（RSV毒株Line 19（参见例如，Lukacs等人，Immunopathology and Infection，169，977-986（2006））（2 X 10⁶ pfu）与15％W₈₀5EC纳米乳剂一起温育60分钟，在本发明的实施方案发展过程中进行的实验中测定为完全灭活病毒的时间。RSV疫苗制剂对于每次免疫接种新鲜制备。每只动物在第0天和第28天时接受进入左鼻孔内的10 μl乳剂或乳剂 + RSV。这意味着每次接种疫苗/小鼠使用总共1 X 10⁴ pfu。

支气管肺泡灌洗细胞因子测量。使用1 ml无菌PBS对受感染小鼠执行支气管肺泡灌洗（BAL）。将细胞悬浮液离心，并且收集上清液用于细胞因子分析，且通过Bioplex使用购自R&D系统的试剂盒进行测量。

在体外的肺分散和RSV再攻击。在1 ml PBS-EDTA灌洗后取出肺，且在旋转水浴（37C）中用胶原酶（0.2％，Type IV，Sigma）分散45分钟。随后计数分散的细胞。随后将单细胞悬浮液以2 x 10⁶/ml的浓度铺平板，并且与RSV（MOI-0.5）一起温育。在36小时后收集无细胞上清液，并且通过Bioplex就产生的细胞因子水平进行评估。这种测定允许我们评估在接种疫苗与未接种疫苗的小鼠组的肺内的总体应答。

实施例2

纳米乳剂有效灭活RSV

为了测试乳剂灭活RSV的能力，使RSV（10⁶粒子形成单位（PFU）以不同浓度（0％- 20％）和不同时间（1小时 – 3小时）与纳米乳剂一起温育（参见图1）。传染性病毒的数目经由噬斑测定使用Vero细胞进行测定。纳米乳剂温育的病毒用于感染亚汇合的Vero细胞。RSV噬斑使用免疫组织化学技术得到显现。在少至1％纳米乳剂温育3小时时，如通过标准噬斑测定评估的不存在活性病毒的检测（参见图1）。因此，本发明提供了在少至1小时内以2％的浓度，或在3小时内少至1％完全杀死RSV方面有效的纳米乳剂。因此，在一些实施方案中，本发明提供了在减少和/或完全灭活RSV感染性方面有效的纳米乳剂。

实施例3

纳米乳剂免疫接种增强在RSV攻击时的免疫

接下来测定纳米乳剂是否可以用作免疫增强试剂，以诱导对于针对病毒感染的保护重要的免疫应答。为了检查这个方面，利用免疫接种规程，包含通过在第0天时和在第28天时加强的用纳米乳剂灭活的病毒的鼻内致敏（纳米乳剂（15％）-RSV混合物（总共10 μl，5 μl/鼻孔））或仅不含RSV的单独的纳米乳剂作为对照组免疫接种动物。动物随后用活的、传染性RSV在第56天（8周）时进行攻击，并且就保护性免疫的证据进行评估。一个目的是监控在免疫接种规程过程中的RSV特异性抗体生产。在血清中RSV特异性抗体的滴度倒数经由酶联免疫吸附测定（ELISA）针对RSV蛋白质提取物进行测定。收获血液且在免疫接种后的特定时间点收集血清，包括第0天、1周、4周和8周（在RSV攻击时），且评估对于RSV特异的总血清IgG。如图2中所示，抗RSV IgG滴度在免疫接种后1周时是不可检测的，在4周后在加强前增加，并且到起始免疫接种后8周时显著增加。因此，本发明提供了用纳米乳剂灭活的RSV给受试者免疫接种（例如鼻内免疫接种）在受试者中诱导抗RSV免疫应答。在一些实施方案中，抗RSV免疫应答在受试者中在纳米乳剂灭活的RSV施用于受试者后4周内诱导。在一些实施方案中，抗RSV免疫应答在受试者中在纳米乳剂灭活的RSV第二次施用于受试者时（例如在“加强”施用后）诱导。在一些实施方案中，本发明提供了对于在施用组合物的受试者中生成抗RSV特异性免疫应答有用的包含纳米乳剂灭活的RSV的组合物。

实施例4

RSV-纳米乳剂免疫接种诱导细胞毒性和Th1型抗病毒免疫应答

因为与用于RSV的其他疫苗类型相关的严重问题（例如在福尔马林灭活的RSV施用于受试者后在感染时严重恶化的疾病的生成），所以接下来测定在纳米乳剂灭活的RSV施用于受试者时生成何种类型的免疫应答。

NE-RSV的施用增强在来自受RSV攻击的小鼠的气道的BAL流体中的抗病毒细胞因子。利用气道的1 ml PBS洗涤，并且经由在攻击后第8天时来自肺的BAL流体的多路分析（Bioplex，R&D系统）测定肺中的细胞因子水平，当T细胞细胞因子达到峰值的时间。

如图3中所示，与纳米乳剂对照免疫接种组相比较，施用（例如经鼻）纳米乳剂灭活的RSV的受试者展示出M2肽特异性细胞毒性CD8+细胞毒性T细胞数目的增加。使用用于M82-90的免疫显性肽的特异性识别TCR的特异性MHC I类四聚体，在攻击后第4天时通过酶促消化的肺的流式细胞术分析测定RSV M82-90特异性CD8 T细胞的数目。此外，使用BAL流体在气道中抗病毒环境的评估指出在受试者中增加的IFN-γ和IL-17产生，但在病毒攻击阶段过程中在致病性Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13中无增加（参见图4）。如上所述，Th2型细胞因子鉴定为在用福尔马林灭活的RSV执行的先前疫苗试验中具有原因作用。此外，Th2细胞因子白细胞介素-13（IL-13）是肺粘液分泌的介质（参见Hershey，G. K. 2003. J. Allergy Clin. Immunol. 111:677–690，Walter等人，2001 J. Immunol. 167:4668–4675；Zhu等人，1999 J. Clin. Investig. 103:779–788），并且表达IL-13的RSV特异性T细胞在RSV细支气管炎中发现（deWaal，2003 J. Med. Virol. 70:309–318）。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含NE灭活的RSV的免疫原性组合物和利用其在受试者中生成针对RSV的免疫应答的方法，而无增强的粘液产生、气道狭窄、气道高反应性、空气滞俘获、缺氧（hpoxia）和/或部分肺萎陷（例如起因于增强的Th2型细胞因子（例如IL-13）表达）。

为了进一步评估施用NE-RSV的受试者中的细胞因子应答，从未感染的动物中或从接种疫苗且攻击的那些中分离肺，并且与未接种疫苗且用RSV攻击的动物进行比较。取出肺且胶原酶分散成单细胞悬浮液，随后为用病毒的体外再攻击。从未感染对照（UC）、接种疫苗且攻击（疫苗）、或对照RSV攻击的（未接种疫苗的）小鼠的肺中分离肺总白细胞。细胞以2 x 10⁶/ml的浓度在活RSV的存在下（MOI = 0.5）培养36小时。经由bioplex多路分析在上清液中测量细胞因子浓度。

观察到虽然IL-17产生再次显著上调，并且IFN增加，但Th2细胞因子IL-4未改变（参见图5）。因此，本发明提供了用NE-RSV的接种疫苗不使小鼠预先致敏（presensitize）至更致病性应答（例如与用福尔马林灭活的RSV获得的结果形成对比）。尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但在一些实施方案中，IFN-γ和IL-17中的增加反映由纳米乳剂灭活的RSV免疫接种规程诱导的更抗病毒的免疫环境。

对于任何免疫接种规程的结果重要的是测定在免疫接种和暴露于活病毒后是否存在病毒清除率中的增加。小鼠用在15％NE中的10⁶ PFU RSV（NE-RSV）或单独的15％NE（NE）作为对照鼻内免疫接种2次，间隔4周。小鼠随后在第二次接种疫苗后4周（总共8周）进行攻击，并且经由右肺的噬斑测定来测定活病毒颗粒数目。当受试者通过噬斑测定进行评估，以测定接种疫苗且随后受病毒感染的受试者的肺中存在的活病毒计数时，纳米乳剂-RSV免疫接种的受试者显示与未免疫接种的受试者相比较，显著增加的清除率（减少的病毒噬斑）（参见图6）。因此，本发明提供了纳米乳剂灭活的RSV（NE-RSV）的施用在受试者中确立了保护性应答。

实施例5

RSV-纳米乳剂免疫接种和变应性哮喘

流行病学研究已暗示在早期严重RSV感染和变应性哮喘的后续发展之间的联系。因此，为了测定用NE-RSV的接种疫苗随后为活病毒攻击是否将影响对变应性哮喘模型的后续应答，将小鼠用NE-RSV接种疫苗2次，用10⁵ PFU RSV进行鼻内攻击，并且对蟑螂变应原致敏。在这个模型中，在RSV攻击后第21天时，小鼠接受在不完全弗氏佐剂中乳化的临床皮肤测试级别蟑螂变应原（100μg）的腹膜内/皮下施用。小鼠随后接受14天后的1次鼻内攻击（15μg），以及在鼻内攻击后5和7天的2次气管内攻击（40μg）。在末次气管内攻击后24小时，小鼠就变应性疾病进行评估。

变应性肺病的特点之一是粘液的分泌过多。与未接种疫苗的小鼠相比较，NE-RSV接种疫苗的小鼠显示出减弱的变应原诱导的粘液应答，如通过经由肺组织学切片的过碘酸希夫（PAS）染色（参见图8），以及在总肺RNA中粘液基因Gob5的表达减少（参见图7和8）评估的。类似于单独的病毒攻击，变应原攻击的NE-RSV接种疫苗的动物具有在肺中显著更高的IL-17诱导，如经由QPCR评估的（参见图9A）。Th2细胞因子对于促进变应性肺病是重要的。NE-RSV接种疫苗的小鼠显示出减弱的Th2细胞因子产生，包括IL-4（均化的肺和BAL）和IL-5（肺）（参见图9B）。还注意到朝向减少的IL-13 mRNA的趋势。在NE-RSV接种疫苗的动物中不存在变应性疾病的增强。另外，接种疫苗的动物具有显著更低的可替代地活化的巨噬细胞标记Fizz-1表达。可替代地活化的巨噬细胞与Th2应答以及纤维化疾病相关。尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但在一些实施方案中，Fizz-1中的减少反映接种疫苗的小鼠中减少的Th2细胞因子的结果，并且还提供了通过其NE-RSV接种疫苗保护免于变应性肺病的后续发展的机制。

实施例6

RSV-纳米乳剂免疫接种诱导RSV特异性抗体产生

小鼠用NE/RSV的鼻内接种疫苗导致RSV特异性抗体产生。在本发明的实施方案的发展过程中进行实验，以测定NE-RSV接种疫苗是否将促进施用NE-RSV组合物的受试者中的抗体应答（例如与针对病毒感染的保护有关）。利用由接受间隔28天的2次NE-RSV鼻内剂量的接种疫苗小鼠的免疫接种规程。在第0天和第28天时，小鼠用含有10⁵病毒颗粒Line 19的NE/RSV进行免疫接种。使用纯化的RSV蛋白质提取物经由ELISA在第55天时测定血清中的总RSV特异性抗体水平。如图10中所示，在用NE-RSV接种疫苗后全身地生成显著RSV特异性应答（参见例如，图10A）。这些包括总RSV特异性Ig的显著诱导，而无RSV特异性IgE滴度中的增强（参见例如，图10A）。

在本发明的实施方案的发展过程中也进行实验，以测定接种疫苗是否可以促进在肺中局部地RSV特异性抗体的诱导。在用活RSV（10⁵）气管内攻击后第2天时，通过支气管肺泡（bronchalveolar）灌洗样品（BAL）的ELISAs评估RSV特异性总Ig和IgA的存在。具体而言，使用纯化的RSV蛋白质提取物经由ELISA在第55天时测定血清中的总RSV特异性抗体水平。对1:1600稀释的样品评估由血清测量的总Ig，其他样品以1:50评估。（B）

如图10B中所示，与对照未接种疫苗的小鼠（首次用于实验的对照）和接受用NE-RSV的初次攻击的小鼠（初次RSV）相比较，在用活病毒攻击后第2天时，接受间隔28天的2次NE-RSV鼻内剂量的接种疫苗的小鼠（NE-RSV）展示出在支气管灌洗液中增加的RSV特异性IgA和RSV特异性总Ig（参见例如，图10B）。这些数据证实NE-RSV接种疫苗诱导显著的RSV特异性抗体，并且在活病毒攻击时增强RSV特异性抗体的局部诱导。

上述说明书中提及的所有出版物和专利都引入本文作为参考。在不背离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述组合物和方法的各种修饰和变动对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管本发明已与具体优选实施方案结合进行描述，但应当理解如请求保护的本发明不应不适当地限于此种具体实施方案。实际上，对于相关领域技术人员显而易见的用于执行本发明的所述方式的各种修饰预期在本发明的范围内。

Claims

1.一种免疫原性组合物，其包含纳米乳剂灭活的呼吸道合胞病毒（RSV），其中用于灭活RSV的所述纳米乳剂包含选自聚氧乙烯（20）山梨糖醇酐单月桂酸酯（TWEEN 20）和聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯（TWEEN 80）的表面活性剂、乙醇、十六烷基氯化吡啶（CPC）、油和水。

2.权利要求1的免疫原性组合物，其中用于灭活RSV的所述纳米乳剂包含约5体积％的表面活性剂、约8体积％的乙醇、约1体积％的十六烷基氯化吡啶（CPC）、约64体积％的油和约22体积％的水。

3.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述组合物包含1-50％纳米乳剂溶液。

4.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述组合物包含5-15％纳米乳剂溶液。

5.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述组合物包含15％纳米乳剂溶液。

6.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述组合物包含10⁴ PFU灭活的呼吸道合胞病毒。

7.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述组合物是耐热的。

8.权利要求1的免疫原性组合物，其进一步包含药学可接受的载体。

9.权利要求1的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。

10.权利要求9的免疫原性组合物，其中所述佐剂偏向Th1型免疫应答。

11.权利要求1-10任一项的免疫原性组合物，其用于治疗或预防呼吸道合胞病毒感染。

12.权利要求1-10任一项的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗中的用途。

13.一种疫苗，其包含权利要求1-8任一项的免疫原性组合物和药学可接受的载体。