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CN102596248A - 在消化道中具有局部活性的抗体治疗剂 - Google Patents

在消化道中具有局部活性的抗体治疗剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了在消化道中或在消化道粘膜屏障下方有治疗效果，但不将已被证明对于全身施用抗体后获得临床益处所必需的抗体水平递送至体循环的方法和抗体治疗剂组合物。本发明进一步描述了抗体治疗剂的治疗性组合物，其在消化道中或在消化道粘膜屏障下方有治疗效果，但不将与全身施用后抗体后所出现的不良事件和全身免疫抑制相关的抗体水平递送至体循环。

Description

在消化道中具有局部活性的抗体治疗剂
发明背景
抗体治疗剂已被证明是有价值的药品。然而，它们的使用却往往由于抗体在身体各部位的活性所导致的副作用而受到限制。例如，对于TNF具有特异性的抗体(Remicade、Humira、Cimzia)可有效地治疗炎性肠病。然而，很可能是由于全身免疫抑制，它们的使用与恶性肿瘤的风险增加和严重感染的风险增加相关(Bongartz等，2006，JAMA，295，2275-85)。因此，需要开发出能够将抗体引导至使临床益处最大化同时使抗体在其它部位的活性最低的位置的方法和抗体治疗剂药物组合物。更具体地讲，需要开发出能够将抗体引导至消化道以治疗消化道疾病，同时使抗体在其它部位的活性最低的方法和抗体治疗剂药物组合物。
抗体治疗剂的使用还往往由于所施用抗体的免疫原性而受到限制。对针对治疗剂抗体的诱导与活性损失以及发生不良输注反应的可能性相关。在抗体来源于非人物种的情况下，可最清楚地观察到免疫原性。然而，人抗人抗体反应(HAHA)的存在也已被描述并引起显著临床关注(Ritter等，2001，Cancer Res，61，6851-9；Tracey等，2008，Pharmacol Ther，111，244-79)。因此，需要开发出能够使免疫原性最低，同时维持功效的方法和抗体治疗剂药物组合物。
在炎性肠病的治疗中，由于中和抗体的诱导，全身施用抗TNF抗体的患者往往变得对于抗体疗法无反应(Tracey等，2008，PharmacolTher，111，244-79)。需要开发出可用于治疗对于现有抗TNF抗体治疗剂已变得无反应的患者的方法和药物组合物。
发明概述
本发明提供了在消化道中或在消化道粘膜屏障下方有治疗效果，但不将已被证明对于全身施用抗体后获得临床益处所必需的抗体水平递送至体循环的方法和抗体治疗剂组合物。本发明进一步描述了抗体治疗剂的治疗性组合物，其在消化道中或在消化道粘膜屏障下方有治疗效果，但不将与全身施用后抗体后所出现的不良事件和全身免疫抑制相关的抗体水平递送至体循环。
附图简述
图1是显示与对照相比，在炎性肠病的小鼠模型中口服施用不同剂量抗TNF抗体AVX-470之后的内窥镜检查得分的图。
图2是显示用于检测牛血清免疫球蛋白抗体水平的ELISA分析的标准曲线的图。
图3是仓鼠颊囊染色切片的显微照片，其显示牛免疫球蛋白可在经照射的左面颊颊囊中被检测到(图A)，但是只在未经照射的右颊囊的外表面上被发现(图B)。
图4是显示通过口服抗TNF抗体治疗之后，患有GI急性辐射综合征的小鼠的存活率(以a％表示)的图。
图5是施用口服抗TNF抗体之后，患有GI急性辐射综合征的小鼠的空肠固有层的染色切片的显微照片。
发明详述
出于本发明目的，“消化道”由嘴、咽、食道、胃、小肠(十二指肠、空肠、回肠)、大肠(盲肠、结肠、直肠)和肛门组成。出于本发明目的，“口腔”应理解为包括嘴、咽和食道。出于本发明目的，“胃肠道”，或“GI道”应理解为包括胃、小肠(十二指肠、空肠、回肠)、大肠(盲肠、结肠、直肠)和肛门。
例如与临床益处相关的抗TNF抗体的血清水平是0.5μg/ml以上的浓度(Nestorov，2005，J Rheumatol Suppl，74，13-8；Tracey等，2008，Pharmacol Ther，111，244-79)。虽然尚不清楚与不良事件相关的抗TNF抗体的确切血清水平，但认为该血清水平大于临床益处所需要的水平(Nestorov，2005，J Rheumatol Suppl，74，13-8)。因此，与现有肠胃外TNF拮抗剂相比，本发明治疗性组合物和方法与全身免疫抑制降低、全身分布减少、免疫原性降低、快速免疫降低(不论由中和抗体诱导还是另一机制所引起)和即时副作用减小(例如输注反应)相关。
本发明治疗性抗体组合物使治疗性抗体在消化道外部的活性最低，并且进一步使针对治疗性抗体的中和免疫反应的诱导最低。治疗性组合物是被局部递送至消化道管腔表面的抗体。本发明抗体可例如通过口服施用、直肠施用而局部施用至消化道，并且包括所有口腔施用形式，诸如经颊、粘膜粘着性膜等。抗体可穿过消化道的粘膜屏障以进入粘膜下的空间以与其靶标相互作用，但是不进入体循环。本发明包括使用针对以下靶标的抗体：在消化道管腔表面上或附近以及在粘膜屏障下方(诸如在上皮细胞基面上)表达的生物靶标、在粘膜下层中表达的靶标、在外侧细胞间隙中表达的靶标，和在固有层中表达的靶标。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体由于先前存在的对于粘膜屏障的损害而得以穿过粘膜屏障。在健康受试者中，消化道通常对于施加于管腔表面的蛋白质是相对不可透过的。然而，在许多疾病状况中，消化道展示出增加的通透性(McGuckin等，2009，InflammBowel Dis，15，100-13)。此增加的通透性使得施加于消化道管腔表面的抗体得以穿过粘膜屏障(Worledge等，2000，Dig Dis Sci，45，2298-2305)。
在本发明的一个实施方案中，本发明抗体由于制剂有利于抗体穿越粘膜屏障的特定方面而得以穿过粘膜屏障。可利用渗透促进剂，包括壳聚糖、聚-L-精氨酸和卡波姆(Carbopol)。
患有在本领域中统称为炎性肠病的克罗恩氏病(Crohn′s disease)和溃疡性结肠炎的患者常常用针对炎性细胞因子TNF的抗体来治疗。在这些患者中，在通过抗体获得的临床益处和所施用抗TNF抗体的谷血清浓度之间存在相互关系(Seow等，Gut.，1/2010；59(1)：49-54)(Karmiris等，11/2009，Gastroenterology；137(5)：1628-40)。这些数据表明必须获得一定的血清抗体浓度以便使抗体可有效地治疗消化道炎症。
然而，本发明者意外地发现使用根据本发明的抗体来局部治疗消化道炎症在治疗上是有效的。此局部或表面应用可通过局部施用抗体，诸如通过口服或直肠施用来实现。术语“局部施用”于消化道定义为局部和/或表面施用于口腔、通过口服或直肠施用来递送至消化道，或通过使抗体与消化道的管腔方面接触的任何其它途径来施用。
因此，本发明的目标是通过将治疗有效量的本发明抗体施用至消化道，同时维持血清中的抗体水平低于先前被认为在通过注射来给予抗体时为临床功效所需的水平，从而治疗消化道炎症。根据本发明，如使用本领域中已知的标准分析测量，根据本发明施用的血清抗体水平小于约1μg/ml，优选小于约500ng/ml，优选小于约150μg/ml，并且优选小于约50ng/ml。
测量血清抗体水平可使用现有技术中已知的标准分析来完成。一种分析是检测TNF与抗体结合的放射免疫分析法(RIA)(Svenson等，Rheumatology 2007 46：1828-1834)。简单地说，将1％患者血清添加至5,000计数/分钟/0.1毫升的125I-TNF。在4℃下孵育2小时之后，通过添加对用作治疗性抗体的抗体物质具有特异性的兔抗体来分离游离的和与抗体结合的示踪剂。为了检测患者血清中的牛抗TNF抗体，使用对于牛免疫球蛋白具有特异性的兔抗体(重链+轻链)。为了检测患者血清中的英夫利昔单抗(小鼠-人IgG1:κ嵌合抗体)，使用对于人Fcγ具有特异性的兔抗体。添加能够使＞95％的可利用治疗性抗体发生沉淀的量的兔抗体。再过2小时之后，添加2.5ml冷分析缓冲液，并且在4℃下以4000g离心10min来分离结合和游离的125I-TNF。沉淀(pellet)活性的放射性通过使用γ计数器来测量。治疗性抗体用作建立标准曲线的参考。对于英夫利昔单抗，分析的检测极限是0.4μg/ml全血清(Bendtzen，Arthritis and Rheumatism，第54卷，第12期，2006年12月，第3782-3789页，2006)。
另一种可用于检测血清抗体水平的分析是酶联免疫吸附分析(ELISA)(Wolbink，Ann Rheum Dis 2005；64：704-707)。简单地说，平底微量滴定板在室温下以针对TNF的小鼠单克隆抗体(每孔100μl中的2μg/ml)涂布过夜。添加HPE缓冲液中的重组TNF(每孔100μl中的0.1μg/ml)历时1小时。在用磷酸缓冲盐水/0.2％吐温洗涤之后，将患者的血清样品以HPE缓冲液中的不同稀释度添加并且在室温下孵育2小时。将板用磷酸缓冲盐水/0.2％吐温洗涤，然后以与对于用作治疗性抗体的抗体物种具有特异性的抗体偶联的辣根过氧物酶(HRP)孵育。为了检测患者血清中的牛抗TNF抗体，使用羊抗-牛IgG(h+1)。为了检测英夫利昔单抗，使用单克隆抗人IgG。在室温下添加100mlHPE缓冲液中的HRP-标记抗体历时1小时。随后，在洗涤之后，添加四甲基联苯胺。反应以2M H2SO4停止。然后确定在450nm处的吸光度。结果与每个板中的治疗性抗体(例如，牛抗TNF抗体或英夫利昔单抗)的滴定曲线相关。英夫利昔单抗的最低检测水平是0.2μg/ml(Wolbink，第704页，上述)。
这两个用来测量血清中的治疗性抗体水平的分析是基于检测抗体结合靶标抗原(例如TNF)的能力。另一种分析测量治疗性抗体本身的存在。当治疗性抗体是嵌合或人源化单克隆抗体时，这并非优选的，因为很难区分治疗性抗体和通常存在于患者体内的抗体。然而，这种方法可用于检测非人抗体治疗剂(参见实施例3)。对于多克隆抗体，仅一部分施用抗体对于靶标抗原具有特异性并与其结合。在本发明的上下文中，待测量的重要抗体浓度是对于靶标抗原具有特异性的治疗性抗体的浓度，因为这是生物活性的组成部分。因此，当施用抗体的血清水平通过检测抗体本身来量化时，必须进行实验以确定对于靶标抗原具有特异性的施用抗体的百分比。对可用于确定百分比的方法的描述提供于实施例1中。
已报道英夫利昔单抗的峰值血浆水平为118μg/ml，并且阿达木单抗的峰值血浆水平为4.7μg/ml(Tracey，2008上述)。所获得的峰值血浆水平取决于施用途径和给药方案。所注射抗TNF抗体的临床有效血清浓度是0.8-1.4μg/ml(Tracey等，2008，Pharmacol Ther，111，244-79)。
在本发明的一个实施方案中，将对于调节炎症的细胞因子(包括但不限于TNF、TNF-κ、Ifn-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL27、IL-32、IL-33和IL-35)具有特异性的抗体局部施用于消化道通透性增加的患者的消化道，以防止由于化学疗法或放射疗法而发生显性溃疡或炎症。
在本发明的一个实施方案中，将对于调节炎症的细胞因子(包括但不限于TNF、TNF-κ、Ifn-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL27、IL-32、IL-33和IL-35)具有特异性的抗体局部施用于消化道通透性增加的患者的消化道，以防止由于暴露于高水平辐射而发生胃肠急性辐射综合征。
在本发明的一个实施方案中，将对于炎性细胞因子(包括但不限于TNF、TNF-κ、Ifn-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL27、IL-32、IL-33和IL-35)具有特异性的抗体局部施用于消化道通透性增加的患者的消化道，以防止由于自身免疫疾病(包括炎性肠病)而发生显性溃疡或炎症。
在本发明的一个实施方案中，将对于炎性细胞因子(包括但不限于TNF、TNF-κ、Ifn-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL27、IL-32、IL-33和IL-35)具有特异性的抗体局部施用于消化道通透性增加的患者的消化道，以治疗乳糜泻。
在本发明的一个实施方案中，将对于表达于粘膜上皮细胞的基外侧表面上的Toll样受体具有特异性的抗体作为治疗剂施用于患有肠道炎性疾病的患者的消化道粘膜。
在本发明的一个实施方案中，将对于炎性细胞因子(包括但不限于TNF、TNF-κ、Ifn-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL27、IL-32、IL-33和IL-35)具有特异性的抗体作为治疗剂施用于患有肠易激综合征的患者的消化道。
在本发明的一个实施方案中，将针对肠道神经递质或其受体或在消化道粘膜屏障下方表达的转运蛋白，包括在消化道表达的血清素受体(5-HT1A、5-HT1B/B、5-HT2A、5-HT2B、5-HT3、5-HT4、5-HT7、5-HT1P)的抗体作为药剂用于消化道通透性增加的患者。
在本发明的一个实施方案中，将针对调节食物摄取的肽或此类肽的受体的抗体作为药剂用于消化道通透性增加的患者。此类肽包括但不限于CCK、GLP1、GIP、胃泌酸调节素、PYY3-36、肠抑素、APOAIV、PP、淀粉不溶素、GRP和NMB、胃瘦素和生长激素释放激素(Cummings和Overduin，2007，J Clin Invest，117，13-23)。
在本发明的一个实施方案中，将针对结直肠癌细胞上的表皮生长因子受体的抗体作为治疗剂用于消化道通透性增加的患者。
在本发明的一个实施方案中，递送至消化道的对于可溶性细胞因子具有特异性的抗体降低消化道中的那些细胞因子的水平，但是不降低体循环中的细胞因子的水平。细胞因子水平可通过直接测量细胞因子或通过分析对细胞因子起反应的替代标记物来确定。在本发明的一个方面，递送至消化道的对于可溶性细胞因子具有特异性的抗体降低消化道以及体循环中的那些细胞因子的水平。
在本发明的一个实施方案中，递送至消化道的具有临床益处的抗体不诱导对于所施用抗体的抗体反应，所述抗体反应足以抑制对于抗体的后续剂量的反应或引起对于抗体的后续剂量的有害反应。
在本发明的一个实施方案中，在维持疗法之后，观察到缺乏诱导抗体反应。在本发明的一个实施方案中，在间歇给药(episodic dosing)之后，观察到缺乏诱导抗体反应。抗体反应可通过直接测量对于治疗性抗体具有特异性的抗体或评定治疗性抗体的重复剂量的生理反应来测量。
在一个优选实施方案中，少于2％的患者在暴露于3个或更多个剂量的治疗性抗体后产生针对本发明治疗性抗体的抗体。在一个优选实施方案中，施用3个或更多个剂量的根据本发明的抗体不降低抗体功效。根据本发明，施用1个、2个、3个或更多个剂量之后，抗体功效在从第一次施用抗体之日起约1个月期间，并且优选在从第一次施用抗体之日起约6个月期间，更优选地在从第一次施用抗体起约1年期间，并且甚至更优选地在从第一次施用抗体起约10年期间并未降低。
治疗性抗体(TA)的抗体反应的测量可使用现有技术中已知的标准分析来完成。一种分析是RIA(Svenson 2007上述)。治疗性抗体使用氯胺-T以125I标记，通过分子大小色谱纯化，并且经测试以确保其保持与已知对于治疗性抗体具有特异性的合适抗体的结合。125I-标记的TA在4℃下与患者血清(1％或更低)一起共同孵育18小时。抗-TA活性通过125I-TA与含有能够特异性结合10％血清中的＞80％AA的第二抗体的亲和基质的结合来检测。对于英夫利昔单抗，此第二抗体是抗人-λ-轻链。对于牛抗TNF抗体，此第二抗体是抗牛IgG(h+1)。计算平均本底结合并且两倍本底值用来区分阳性和阴性样品。
可用于检测对于治疗性抗体的抗体反应的另一分析是固相RIA(Svenson，2007上述)。TA(8μg/ml)结合微量滴定板，然后用人血清白蛋白阻断未占据位点。使用10％或更低水平，以100微升/孔重复两次添加患者血清。在4℃下孵育过夜之后，将孔用冷分析缓冲液洗涤并且每孔添加0.1ml 6000cpm125I-标记的TA。在4℃下3小时之后，将孔洗涤并且确定结合的cpm。
本领域技术人员熟知对于治疗性抗体的抗体反应的分析需要适应具体情况并且对方法和考虑因素有充分的理解(Gorovits，The AAPSJournal，第11卷，第1期，2009年3月)。特别重要的是可能存在对于治疗性抗体的预先存在的抗体反应，这可能使经收集以计算用于区分阳性和阴性样品的分析截断参数的数据的统计分析复杂化。对于牛抗体治疗剂的抗体反应的分析，优选使用既定患者的预处理和后处理样品结果的直接比较。如果抗-TA抗体水平在用治疗性抗体治疗过程期间显著增加，则将患者定义为具有针对治疗性抗体的诱导抗体反应。对于未检测到预先存在的抗体反应的治疗性抗体，如果抗体反应高于本底两倍以上，则将患者定义为具有针对治疗性抗体的诱导抗体反应。
在炎性肠病的维持疗法期间，在2.8％-3.7％的用阿达木单抗治疗的患者中，在5％-18％的用英夫利昔单抗治疗的患者中并且在8％-12.3％的用赛妥珠单抗治疗的患者中观察到对于治疗性抗体的抗体反应(Cassinotti，Inflamm Bowel Dis，第15(8)卷，2009年8月)。间歇给药导致对治疗性抗体的抗体反应的发生率较高，其中36％-61％的接受英夫利昔单抗的患者产生抗体反应。
除了消化道以外，本发明也可用于具有粘膜屏障的其它组织，包括泌尿生殖系统和呼吸系统。此外，本发明也可用于具有上皮系统的其它组织，包括眼睛和皮肤。
根据本发明方法，可通过机械性创伤破坏或损害消化道粘膜屏障，所述创伤包括但不限于牙齿和口腔伤口、食道伤口，或归因于部分消化道切除术、空肠造口术、回肠造口术、结肠造口术或其它手术程序的手术引起的创伤。消化道粘膜屏障也可因局部缺血或再灌注损伤而被破坏。消化道粘膜屏障也可通过癌症化学疗法、癌症放射疗法，或在治疗环境以外的高剂量辐射暴露造成的损害而被破坏。
消化道粘膜屏障可因肉眼可见的炎症和/或溃疡而被破坏或损害，所述炎症和/或溃疡包括但不限于牙周疾病、口疮性口炎、消化道细菌、病毒、真菌或寄生虫感染、消化性溃疡、与压力或幽门螺杆菌感染相关的溃疡、食管返流、炎性肠病造成的损害、消化道癌症、食物不耐受(包括乳糜泻)造成的损害，或非甾体抗炎病(NSAID)或其它摄入或全身递送药物引起的溃疡。
消化道粘膜屏障的破坏或损害可为已在临床上描述过但其中屏障缺陷的生物学基础还未得到充分理解的破坏或损害，包括但不限于与以下相关的消化道屏障功能损失：外部烧伤、创伤、败血症或休克、肠易激综合征、糖尿病(尤其I型糖尿病)、特应性皮炎、患有自身免疫病症(包括强直性脊柱炎、舍格伦氏综合征、充血性心力衰竭或多发性硬化症)的患者。病原体感染也可能会导致屏障功能的特异性破坏。
在本发明可应用的一些疾病或病症中，改变的屏障通透性可在发生显性炎症和/或溃疡之前存在，并且抗体可在屏障通透性改变时以及在炎症和溃疡期间施用。在炎症之前包括增加的通透性的疾病和病症包括但不限于由化学疗法或放射疗法、暴露于高水平的非治疗性辐射、炎性肠病和乳糜泻所引起的粘膜炎。
在本发明可应用的一些疾病或病症中，改变的屏障通透性可能存在于消化道的分立部分，同时显性炎症和/或溃疡存在于消化道的其它部分。包括增加的通透性和炎症或溃疡的物理分离区域的疾病和病症包括但不限于克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。本发明抗体可用于接近改变通透性的区域以及显性炎症和溃疡的区域。
本发明包括使用旨在解决屏障缺陷的潜在原因的抗体治疗剂。此类抗体可针对增强伤口愈合、改变紧密联结部功能的生物靶标，或现在已知或将来会影响通透性的其它靶标。合适的靶标可包括但不限于闭合蛋白、claudin蛋白、连接粘附分子、ZO-1、E-钙粘着蛋白、柯萨奇(coxackie)腺病毒受体和涉及释放claudin蛋白的丝氨酸蛋白酶，诸如弹性蛋白酶。
本发明包括使用旨在结合与屏障缺陷的潜在原因无关的生物靶标的抗体药剂。此类抗体可用于治疗或预防与造成屏障缺陷的相同疾病状况有关的疾病和病症。此类抗体可用于治疗或预防与造成屏障缺陷的相同疾病状况无关的疾病和病症。
对于口腔病症，本发明抗体可以嗽口水、冲洗剂、糊剂、凝胶剂或其它适合制剂形式递送。本发明抗体可使用旨在增加活性抗体和粘膜表面之间接触的制剂，诸如口腔贴片剂、口腔条带、粘膜粘着性膜、舌下片剂、锭剂、糯米纸囊剂、咀嚼片剂、快速或迅速溶解片剂、泡腾片剂或口腔或舌下固体来递送。对于消化道病症，抗体可以胶囊剂、片剂、液体制剂形式或旨在将药物引入消化道的类似形式的口服摄取来递送。或者，抗体可通过栓剂或灌肠剂施用以便递送至下消化道。此类制剂是本领域技术人员熟知的。
本文所使用的术语“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因或其特异性结合和识别抗原的片段的构架区的多肽。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε、和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ轻链。重链分类为γ、μ、α、δ、或ε重链，其进而分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常情况下，抗体的抗原结合区在结合靶标受体的特异性和亲和力中是最关键的。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同多肽链组成，每一对具有一个“轻链”(约25kD)和一个“重链”(约50-70kD)。每个链的N-末端定义具有约100到110个或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。
抗体以例如完整免疫球蛋白或通过各种肽酶降解所产生的能够与完整抗体竞争以进行特异性结合的大量良好表征片段形式存在，除非本文另外规定。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中的二硫键下方的抗体以产生F(ab)′2，即本身是通过二硫键连接至VH-CH1的轻链的Fab二聚体。F(ab)′2可在温和条件下还原以破坏铰链区中的二硫键，从而将F(ab)′2二聚体转换为Fab′单体。Fab′单体基本上是具有铰链区一部分的Fab(参见Fundamental Immunology(Paul编，第3版1993)。虽然各种抗体片段根据完整抗体的降解加以定义，但是本领域技术人员认识到此类片段可以化学方法或使用重组DNA方法来重新合成。因此，本文所使用的术语“抗体”还包括通过修饰全抗体产生的抗体片段，或使用化学或重组DNA方法重新合成的那些抗体片段(例如，单链Fv、互补决定区(CDR)片段或含有足以将特异性受体结合力赋予多肽的至少一部分免疫球蛋白的多肽)或使用噬菌体展示文库识别的那些抗体片段(参见，例如，McCafferty等，Nature 348：552-554(1990))。
本文所使用的术语“单克隆抗体”是指具有单一分子成分的抗体制剂。单克隆抗体成分对于靶标受体的特定表位显示单一结合特异性和亲和力。
“表位”是分子被抗体结合的部分。表位可包含分子的非连续部分(例如，在多肽中，氨基酸残基在多肽的一级序列中是不连续的，但是在多肽的三级和四级结构的情况下，彼此接近的程度足以由抗体结合)。
本文所使用的术语“多克隆抗体”是指能够结合同一抗原或不同抗原上的多种不同特定抗原决定簇或与其反应的不同抗体分子成分。多克隆抗体的抗原特异性的可变性位于构成多克隆抗体的个别抗体的可变区中，尤其在互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3区中。优选地，通过用以下指定的靶标抗原或其部分对动物进行免疫来制备多克隆抗体。或者，可通过将具有针对靶标受体的所需特异性的多种单克隆抗体(例如Nowakowski，A等，2002.Proc Natl Acad Sci USA 99，11346-11350和美国专利第5,126,130号)混合来制备多克隆抗体。
从免疫动物的血液、乳汁、初乳或卵分离的多克隆抗体制剂除了包含对于靶标抗原具有特异性的抗体以外，通常还包含对于免疫原不具有特异性的抗体。对于靶标抗原具有特异性的抗体可从多克隆抗体制剂纯化或多克隆抗体制剂可在未经进一步纯化的情况下使用。因此，本文所使用的术语“多克隆抗体”是指对于靶抗原具有特异性的抗体已得以富集的抗体制剂和未纯化的制剂。将多克隆抗体针对特定靶标的抗体加以富集的众多技术是本领域技术人员已知的。最近已开发了一种用于重组产生适合于预防性和治疗性施用的高度特异性多克隆抗体的技术(WO 2004/061104)。重组多克隆抗体(rpAb)可从生产生物反应器中以单一制剂形式纯化，而无需对构成重组多克隆蛋白的各成员进行单独的处理、制造、纯化或表征。
在一个实施方案中，抗体是来源于乳汁或初乳的多克隆抗体。在一个实施方案中，多克隆抗体来源于诸如奶牛、山羊、绵羊、骆驼或水牛的反刍动物的乳汁或初乳。在另一个实施方案中，抗体从人的乳汁或初乳分离。在一个优选实施方案中，多克隆抗体从牛，优选经免疫的牛的乳汁或初乳分离。牛初乳(早期乳)是本发明抗体的优选来源。在奶牛中，抗体不穿过胎盘，并且因此所有被动免疫力通过乳转移至新生小牛。因此，奶牛在分娩之后立即将大量抗体分泌至初乳中并且初乳中约50％的蛋白是免疫球蛋白。在出生之后前4小时，50mg/ml的免疫球蛋白浓度通常出现于初乳中(Butler和Kehrli，2005，Mucosal Immunology，1763-1793)，24小时后下降至25-30mg/ml(Ontsouka等，2003，J Dairy Sci，86，2005-11)。初乳和乳汁是口服递送的多克隆抗体的唯一安全来源。因为正常乳汁含有1.5g/L IgG，所以人已经广泛接触牛免疫球蛋白。
“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中：(a)恒定区或其一部分经改变、替换或交换以使得抗原结合部位(可变区)与不同或改变类别、效应子功能和/或物种，或将新的性质赋予嵌合抗体的完全不同分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等)的恒定区连接或(b)可变区或其一部分经改变、替换或与具有不同或改变抗原特异性的可变区交换。参见例如美国专利第4,816,567号和Morrison，1985，Science 229：1202-07。
本发明进一步涵盖使用用来模拟抗体的分子，诸如适体、纳米抗体和基于纤连蛋白的抗体模拟物。本发明还涵盖使用抗体分子的一部分与靶标受体的配体融合，从而变得对于靶标受体具有特异性的“融合蛋白”。在另一个方面，本发明提供对于靶标具有特异性的抗体的衍生物。衍生抗体可包含将所需性质(诸如在特定用途中增加的半衰期)赋予抗体的任何分子或物质。衍生抗体可包含例如可检测(或标记)部分(例如，放射性、比色、抗原或酶分子)、可检测颗粒(诸如磁性或电子密度高颗粒(例如，金颗粒))，或结合另一分子的分子(例如，生物素或链霉抗生物素蛋白)，治疗或诊断部分(例如，放射性、细胞毒性或药学活性部分)，或增加抗体对于特定用途(例如，施用于受试者(诸如人受试者)，或其它体内或体外用途)的适合性的分子。可用于衍生抗体的分子的实例包括白蛋白(例如，人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。可使用在本领域中熟知的技术来制备抗体的与白蛋白连接和聚乙二醇化的衍生物。在一个实施方案中，抗体与甲状腺素转运蛋白(TTR)或TTR变体偶联或以其它方式与其连接。TTR或TTR变体可以例如选自由以下组成的组的化学物化学修饰：右旋糖酐、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇和聚乙烯醇。
在一个方面，本发明提供使用本发明治疗性组合物来治疗患者的方法。本文所使用的术语“患者”是指动物。优选地，动物是哺乳动物。更优选地，哺乳动物是人。“患者”也指例如犬、猫、马、奶牛、猪、豚鼠、鱼、鸟类等。因此，本发明的组合物和方法也同样适合用于兽医治疗。在本发明的一个实施方案中，抗体用于治疗伴侣动物、役畜或饲养供食用的动物的疾病或病症。在本发明的一个实施方案中，使用稳定化抗体以向仔畜，优选奶牛、马、绵羊或猪提供被动免疫。
术语“治疗”涵盖缓和、治愈或预防病症、疾病、病患或其它病状(在本文中统称为“病状”)中的至少一个症状或其它方面，或降低病状的严重性等。为了构成可行的治疗剂，本发明组合物不必实现完全治愈，或根除疾病的每一种症状或表现。如相关领域中所公认，作为治疗剂使用的药物可降低指定疾病状况的严重性，但是不必消除疾病的每一种表现以便被视为有用的治疗剂。同样，为了构成可行的预防剂，预防性施用的疗法不必完全有效地预防病状的发生。仅仅减少疾病的影响(例如，通过减少其症状的数量或严重程度，或增加另一种疗法的有效性，或产生另一种有益的效果)，或减少疾病在受试者中发生或恶化的可能性就已足够。在一个实施方案中，治疗有效量的组合物已施用于患者的指示是反映特定病症的严重性的指标相比于基线的持续改善。
本发明药物组合物包含与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂一起配制的治疗有效量的本发明抗体。本发明抗体的“治疗有效量”是指在适用于任何医学疗法的合理利弊比率(benefit/risk ratio)下向所治疗受试者赋予治疗效果的组合物的量。本文所使用的术语治疗效果是指足以“治疗”患者。
如本文所使用的术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指无毒、惰性固体、半固体或液体填料、稀释剂、封装材料或任何类型的配制助剂。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例是糖诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂诸如椰子油和栓剂蜡；油诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和通过大豆油；二醇诸如丙二醇；酯诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂诸如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇，和磷酸盐缓冲溶液，以及其它无毒相容润滑剂诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可根据配方设计师的判断而存在于组合物中。
口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物以外，液体剂型可含有在本领域中通常使用的惰性稀释剂，诸如例如水或其它溶剂、溶解剂和乳化剂诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇酐的脂肪酸酯和其混合物。除了惰性稀释剂以外，口服组合物可还包含佐剂诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
直肠施用的组合物优选是可通过使本发明化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体混合来制备的栓剂，所述赋形剂或载体诸如椰子油、聚乙二醇或在环境温度下是固体但是在体温下是液体并且因此在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物的栓剂蜡。在一个实施方案中，直肠施用组合物呈灌肠剂形式。
口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒。在此类固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性、药学上可接受的赋形剂或载体诸如柠檬酸钠或磷酸氢钙和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；b)粘合剂诸如例如羧甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；c)保湿剂诸如甘油；d)崩解剂诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液延缓剂诸如烷烃；f)吸收加速剂诸如季铵化合物；g)润湿剂诸如例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂诸如高岭土和膨润土，和i)润滑剂诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。相似类型的固体组合物也可使用诸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)的赋形剂以及高分子量聚乙二醇等来用作软质和硬质填充明胶胶囊中的填充剂。
虽然稳定化抗体具有针对胃降解的增强的稳定性，但是在一些条件下可能需要提供防止胃降解的额外水平的保护。如果需要，存在肠溶包衣的许多选择方案(参见例如美国专利4,330,338和4,518,433)。在一个实施方案中，肠溶包衣利用胃后pH值变化以溶解膜包衣并释放活性成分。已开发出包衣和制剂以便将蛋白治疗剂递送至小肠并且这些方法可经调适以递送本发明抗体。例如，已开发出包有肠溶衣形式的胰岛素以便口服递送(Toorisaka等，2005，J Control Release，107，91-6)。
另外，固体剂型的片剂、糖衣药丸、胶囊、丸剂和颗粒可使用药物配制领域中所熟知的其它包衣和壳层来制备。它们可任选地含有乳浊剂并且还可具有使得其仅在或优先在肠道的某一部分，任选地以延迟方式释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。
有效剂量取决于途径施用，以及与其它药剂共同使用的可能性而有所不同。然而，应理解，本发明化合物和组合物的总每日用量由主治医师在合理医学判断范围内决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平取决于多种因素：包括所治疗的病症和病症的严重性；所使用的具体化合物的活性；所使用的具体组合物；患者年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所使用的具体化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；相对于食物摄取的化合物递送时间；治疗持续时间；与所使用的具体化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域中熟知的相似因素。
根据本发明，施用途径包括经由导管或饲管口服施用。
本发明的特定实施方案涉及按以下量向受试者施用包含本发明抗体的药物组合物：1mg/天至约1克/天，更优选地约10毫克/天至约500毫克/天，并且最优选地约20毫克/天至约100毫克/天剂量。在一个实施方案中，多克隆抗体制剂以约100mg至约50克/天，更优选地约500毫克/天至约10克/天，并且最优选地约1克/天至约5克/天的抗体剂量向受试者施用，其中多克隆抗体制剂未针对对于靶标抗原具有特异性的抗体而富集。
治疗方案包括每天一次、每天两次或每天三次或更多次施用本发明抗体组合物以治疗本文公开的医学病症。在一个实施方案中，本发明抗体组合物每天四次、每天6次或每天8次施用以治疗本文公开的医学病症。在一个实施方案中，本发明抗体组合物每周一次、每周两次，或每周三次或更多次施用以治疗本文公开的医学病症。
本发明方法和组合物包括结合一种或多种适用于治疗患者所患病状的额外治疗剂来使用本发明抗体。此类药剂的实例包括蛋白质和非蛋白质药物。如在相关领域中所公认，当多种治疗剂共同施用时，可相应地调整剂量。“共同施用”和组合疗法不限于同时施用，而且包括在涉及向患者施用至少一种其它治疗剂的治疗过程期间施用本发明抗体至少一次的治疗方案。
在一个优选实施方案中，本发明包括使用对于TNF具有特异性的抗体，并且优选多克隆乳源抗TNF抗体来治疗炎症，特别是炎性肠病，同时维持峰值抗TNF抗体血清浓度低于1μg/ml，优选低于300ng/ml，优选低于100ng/ml的组合物和方法。在另一个优选实施方案中，本发明包括使用多克隆乳源抗TNF抗体来治疗粘膜炎和尤其口腔粘膜炎，同时维持峰值抗TNF抗体血清浓度低于1μg/ml的组合物方法。本文还描述针对能够使用治疗的消化道病症的其它优选实施方案，本发明抗体在局部施用至消化道时对于此类抗体可接近的靶标具有特异性，同时维持抗体血清浓度低于1μg/ml。
提供以下实施例以用于说明本发明的具体实施方案或特征并且不欲限制其范围。
实施例
实施例1：牛抗TNF抗体的分析
牛多克隆抗TNF抗体(AVX-470)通过用鼠TNF对奶牛进行免疫并且收集分娩后的初乳来产生。免疫球蛋白通过硫酸铵沉淀从初乳乳清中纯化；通过SDS-PAGE发现制剂为70％纯。对来自用谷蛋白免疫的奶牛初乳的对照牛免疫球蛋白并行地进行纯化。半纯化免疫球蛋白制剂的蛋白质浓度使用BCA分析来确定。
使用标准L929分析来检测AVX-470的TNF中和活性。因为用AVX-470进行的首批功能性实验在仓鼠中进行，所以评估中和仓鼠TNF的能力。将仓鼠脾细胞用2ng/ml的LPS刺激24hr并且将上清液用作仓鼠TNF来源。将不同浓度的AVX-470、对照牛抗-谷蛋白抗体或经纯化的兔抗TNF抗体(Biovision)在37℃下与1∶100稀释度的仓鼠LPS上清液(以下称为仓鼠TNF)一起孵育2hr。将仓鼠TNF-抗体组合与1μg/ml放线菌素D一起转移至已涂布过夜的L929细胞(每孔3.5×104细胞)中。将培养物孵育过夜并且使用WST测量细胞增殖。所有分析重复进行三次。
如表I中所示，仓鼠TNF抑制L929细胞增殖。此抑制以剂量依赖性方式被经纯化的兔抗TNF抗体和AVX-470阻断，但是不被对照牛抗-谷蛋白抗体阻断。半最大抑制通过0.5μg/ml经纯化的抗TNF抗体和200μg/ml AVX-470来获得。基于这些数据，估计AVX-470中的0.25％抗体对于TNF具有特异性。
Figure BDA0000154857720000201
实施例2：以口服抗TNF抗体来治疗TNBS-诱导的结肠炎
将多克隆牛抗TNF抗体(AVX-470)从已用鼠TNF免疫的奶牛的初乳中分离。通过在pH 4.6下孵育来使初乳脱脂并使酪蛋白沉淀，从而产生初乳乳清。将来自免疫奶牛的乳清汇集，并且通过嗜硫吸附剂色谱法纯化。并行地将来自未免疫动物的初乳的对照抗体加以纯化。
以直肠内方式向C57BL/6小鼠((8-9周龄)Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA)施用50％乙醇中的0.1mL TNBS(三硝基苯磺酸盐)(4mg)。TNBS模型是炎性肠病的广泛接受模型。向对照动物给予单独乙醇。在TNBS处理组中使用十二只动物并且在其它组的每个组中使用八只动物。通过以0.1ml口服灌胃向动物每天两次给予AVX-470(5mg、1.5mg或0.5mg)、对照牛抗体(1.5mg)或盐水。从第1天到第3天施用抗体。
正好在将动物处死之前第5天，将每一只小鼠在异氟醚麻醉下使用视频内窥检查法来分析。在每次内窥镜检查程序期间，记录静止图像以及视频以便评价结肠炎程度和对于治疗的反应。结肠炎严重性由不知情的观察者使用0-4量表(0＝正常；1＝血管分布丧失；2＝血管分布丧失和脆性；3＝脆性和糜烂；4＝溃疡和出血)来记分。使用斯氏T检验来分析各组之间的差异。
如图1中所示，口服施用AVX-470在炎性肠病的此广泛接受模型中降低结肠炎严重程度。
实施例3：以口服抗TNF抗体来治疗TNBS诱导的结肠炎之后 的血清抗体水平
将实施例2中的小鼠处死之后，通过心脏穿刺来收集血样并且制备和冷冻血清。通过ELISA来分析每个个别小鼠的血清中是否存在牛免疫球蛋白。将板以5μg/ml的绵羊抗-牛IgG(h+1)抗体(BethylLaboratories，Montgomery，TX)涂布。将连续稀释的小鼠血清(3倍稀释，开始于1∶100稀释度)一式两份进行分析。将抗体用10ng/ml的HRP-标记的绵羊抗-牛IgG(h+1)抗体和TMB底物(SigmaAldrich，St.Louis，MO)检测。对于每一个ELISA板执行使用牛参考血清(BethylLaboratories)的标准曲线分析。如图2中所示，所述分析很容易地检测到大于10ng/ml的牛免疫球蛋白浓度。
来自所有小鼠的血清以ELISA分析。在第5天，接受牛抗体(AVX-470或对照抗体)的32只小鼠中有31只在血清中不具有可检测到的牛免疫球蛋白。ELISA中的检测极限是10ng/ml并且血清以1∶100稀释度分析。因此，血清样品包含＜1μg/ml牛免疫球蛋白。
在#23小鼠的血清中检测到很高水平的牛免疫球蛋白(0.95mg/ml)。这个小鼠是在用最高剂量的AVX-470(5mg)治疗的组中。小鼠的血清体积为约1ml，并且这些数据提示20％的施用剂量存在于血清中。然而，鉴于本组中的其它7只小鼠具有＜1μg/ml的血清牛免疫球蛋白水平(低＞1000倍)，可能这一结果反映了样品受到污染。应当指出的是在高剂量治疗组中，23号小鼠具有最高内窥镜检查得分。
实施例1中显示的数据表明AVX-470中的＜1％的免疫球蛋白对于TNF具有特异性。因此，此实验中，TNF-特异性抗体的血清浓度小于10ng/ml，在此浓度下观察到显著临床效果。经注射抗TNF抗体的临床有效血清浓度是0.8-1.4μg/ml(Tracey等，2008，Pharmacol Ther，117，244-79)。
实施例4：用局部抗TNF抗体治疗口腔粘膜炎
将多克隆牛抗TNF抗体(AVX-470)从已用鼠TNF免疫的奶牛的初乳中分离。通过在pH 4.6下孵育来使初乳脱脂并使酪蛋白沉淀，从而产生初乳乳清。将来自免疫奶牛的乳清汇集，并且通过硫酸铵沉淀来纯化。并行地将来自用谷蛋白免疫的奶牛的初乳的对照抗体加以纯化。
将Syrian Golden仓鼠(每组8只仓鼠)麻醉并且将左颊囊外翻、固定并使用铅屏来分离。在第0天，以2.0戈瑞/分钟的速率将单一剂量的辐射(40戈瑞/剂量)施用至所有动物。在50cm的焦距下，辐射以16千伏电位(15-ma)源产生，以0.35mm Cu过滤体系硬化。在此模型中，粘膜炎严重程度在14天达到最大，并且在第18天开始愈合。在辐射之后，立即从第0天开始，在28天研究中自始至终每天两次向仓鼠左颊囊施用1mg于盐水缓冲液中的AVX-470。
两个对照组包括在内-盐水组和接受7mg牛初乳抗谷蛋白抗体的组。从第6天开始并且持续直至第28天，每隔一天评估口腔粘膜炎的严重程度。将动物麻醉并且左颊囊外翻并拍照。在研究结束时，将图像随机分组并且由不知道每个图像标识的2名记分者以独立的方式记分。
通过与经验证的照相量表比较，在视觉上对口腔粘膜炎进行记分。记分0：囊完全健康。没有红斑或血管扩张；记分1：轻度至重度的红斑及血管扩张。没有粘膜糜烂；记分2：严重红斑和血管扩张。粘膜表面部位糜烂留下裸露区域。粘膜加点减少；记分3：在一个或多个部位形成灰白色溃疡。由于假膜，溃疡可能有黄色/灰色。溃疡累积大小等于～1/4囊袋。严重红斑及血管扩张；记分4：溃疡累积大小等于约1/2囊袋。失去柔韧性。严重红斑及血管扩张；记分5：几乎所有囊袋溃烂。失去柔韧性(囊袋只能部分地从嘴中取出)。
各组之间的粘膜炎严重程度的差异通过计算每只动物出现溃疡的天数(即3或高等的评分)来评估。溃疡是在疾病发展过程中的口腔粘膜的物理完整性被破坏的时点并且是临床显著端点。如表II中所示，以1mg AVX-470治疗的动物在3级或更大级别粘膜炎的动物天数方面具有26％减少。以抗-谷蛋白抗体治疗对于疾病结果没有影响。
Figure BDA0000154857720000231
实施例5：用局部抗TNF抗体治疗口腔粘膜炎之后的血清抗体水 平
将实施例4中的仓鼠处死之后，通过心脏穿刺来收集血样并且制备和冷冻血清。通过ELISA来分析每个个别仓鼠的血清中是否存在牛免疫球蛋白。将板以5μg/ml的绵羊抗-牛IgG(h+1)抗体(BethylLaboratories，Montgomery，TX)涂布。将连续稀释的小鼠血清(3倍稀释，开始于1∶100稀释度)一式两份进行分析。将抗体用10ng/ml的HRP-标记的绵羊抗-牛IgG(h+1)抗体和TMB底物(SigmaAldrich，St.Louis，MO)检测。对于每一个ELISA板执行使用牛参考血清(BethylLaboratories)的标准曲线分析。
来自所有仓鼠的血清以ELISA分析。在第28天，没有一个接受牛抗体(AVX-470或对照抗-谷蛋白抗体)的仓鼠在血清中具有可检测的牛免疫球蛋白。ELISA中的检测极限是10ng/ml并且血清以1∶100稀释度分析。因此，血清样品包含＜1μg/ml牛免疫球蛋白。
实施例6：照射颊囊之后通过免疫组织化学检测局部组织中的牛 抗体
如在实施例4中，Syrian Golden仓鼠接受对于左颊囊的40Gy照射。照射后十二天，动物在两个颊囊中接受单一剂量的1mgAVX-470。给药后一小时，将动物处死并将颊囊切除，固定于福尔马林中，包埋于石蜡并且切片。使用来自Vector Laboratories的VectastainElite ABC试剂盒将切片染色以确定牛免疫球蛋白的存在。试剂盒旨在识别山羊IgG，但是可与牛免疫球蛋白交叉反应。如图3所示，牛免疫球蛋白可在左颊囊的整个粘膜下空间中很容易地被检测到(图A)，但是只在未经照射的右颊囊的外表面上被发现(图B)。
实施例7：用口服抗TNF抗体治疗GI急性辐射综合征
将多克隆牛抗TNF抗体(AVX-470)从已用鼠TNF免疫的奶牛的初乳中分离。通过在pH 4.6下孵育来使初乳脱脂并使酪蛋白沉淀，从而产生初乳乳清。将来自免疫奶牛的乳清汇集，并且通过嗜硫吸附剂色谱法纯化。
在第0天，向C3H/HeNcrl小鼠施用单一剂量的全身辐射(8戈瑞/剂量)。在50cm的焦距下，辐射以160千伏电位(15-ma)源产生，以使用Kimtron Polaris II辐射源的0.35mm Al过滤系统硬化。将照射以＜100厘戈瑞/分钟的速率输送至全身。每天两次给予动物盐水或6mgAVX-470。在照射之后10分钟给予首次剂量并且向动物给药直至第10天。在第1天和第7天，将每个组中的三只动物处死并且用于实施例8描述的实验。对每组余下的16只动物的存活进行了监测。
如图4所示，以AVX-470治疗的组(实心方形)在卡普兰-梅耶(Kaplan-Meier)对数秩检验中显示存活的在统计上显著的改善(p＝0.002)，其中3只小鼠存活到研究结束，相比之下在对照盐水治疗组中没有一个存活到研究结束(空心圆)。
实施例8：以口服抗TNF抗体来治疗GIARS之后的血清抗体水 平
在第1天和第7天，将实施例7中的小鼠处死之后，通过心脏穿刺来收集血样并且制备和冷冻血清。通过ELISA来分析每个个别小鼠的血清中是否存在牛免疫球蛋白。将板以5μg/ml的绵羊抗-牛IgG(h+1)抗体(Bethyl Laboratories，Montgomery，TX)涂布。将连续稀释的小鼠血清(3倍稀释，开始于1∶100稀释度)一式两份进行分析。将抗体用10ng/ml的HRP-标记的绵羊抗-牛IgG(h+1)抗体和TMB底物(SigmaAldrich，St.Louis，MO)检测。对于每一个ELISA板执行使用牛参考血清(Bethyl Laboratories)的标准曲线分析。
来自所有小鼠的血清以ELISA分析。在第1天或第7天，没有一个接受牛抗体(AVX-470或对照抗体)的小鼠在血清中具有可检测的牛免疫球蛋白。ELISA中的检测极限是10ng/ml并且血清以1∶100稀释度分析。因此，血清样品包含＜1μg/ml牛免疫球蛋白。
实施例9：TBI之后通过免疫组织化学在小肠固有层中检测到牛 抗体
如实施例8所描述，向C3H/HeN小鼠施用8.55Gy的全身照射剂量。照射之后，立即开始每天一次向动物给予10mg AVX-470。96hr照射后，将动物处死并取出小肠。将空肠切片固定于福尔马林中，包埋于石蜡中并切片。使用来自Vector Laboratories的Vectastain EliteABC试剂盒将切片染色以确定牛免疫球蛋白的存在。试剂盒旨在识别山羊IgG，但是可与牛免疫球蛋白交叉反应。如图5所示，牛免疫球蛋白可在固有层中检测到。
本文提到的专利和科技文献建立了可为本领域技术人员所利用的知识。本文引用的所有美国专利和公布或未公布美国专利申请以引用方式并入。本文引用的所有公布的外国专利和专利申请以引用方式并入本文。本文引用的所有其它公布的参考文献、文件、手稿和科技文献以引用方式并入本文。
虽然本发明已参考其优选实施方案而具体予以展示和描述，但是本领域技术人员理解其中在不背离附加权利要求涵盖的本发明范围的情况下可进行形式和细节上的各种变化。还应理解本文所述的实施方案不是相互排斥的，而且根据本发明，来自各种实施方案的特征可全部或部分地组合。

Claims (38)

1.一种治疗炎性肠病的方法，所述方法包括将多克隆乳源抗TNF抗体施用于消化道，其中在施用所述抗TNF抗体之后，患者血清中的抗TNF抗体的峰值水平小于约1μg/ml。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在暴露于3个或更多个剂量的治疗性抗TNF抗体之后，少于约2％的患者产生针对所述治疗性抗TNF抗体的抗体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中施用3个或更多个剂量的所述抗TNF抗体在6个月期间不降低所述抗TNF抗体的功效。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在施用所述抗TNF抗体之后，可在患者血清中检测到的抗TNF抗体的峰值水平小于约10ng/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗TNF抗体经口服施用或经直肠施用。
6.一种包含牛源多克隆抗TNF抗体的组合物，其中所述抗体以可有效地局部治疗炎性肠病的量存在于所述组合物中，其中在施用所述组合物后，施用所述抗TNF抗体之后的抗TNF抗体在患者血清中的峰值水平小于1μg/ml。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中在施用所述抗TNF抗体之后，抗TNF抗体在患者血清中的峰值水平小于10ng/ml。
8.根据权利要求6所述的组合物，其经配制以便经口服施用或经直肠施用。
9.包含牛源多克隆抗TNF抗体的组合物用于局部治疗患有炎性肠病的患者的用途，其中在施用所述抗TNF抗体之后，可在患者血清中检测到的抗体的峰值水平小于约1μg/ml。
10.根据权利要求9所述的用途，其中在暴露于3个或更多个剂量的治疗性抗TNF抗体之后，少于约2％的患者产生针对所述治疗性抗TNF抗体的抗体。
11.根据权利要求9所述的用途，其中3个或更多个剂量的所述抗TNF抗体在6个月内不降低所述抗TNF抗体的功效。
12.根据权利要求9所述的用途，其中在施用所述抗TNF抗体之后，可在患者血清中检测到的抗TNF抗体的水平小于约10ng/ml。
13.根据权利要求9所述的用途，其中所述抗TNF抗体经口服施用或经直肠施用。
14.一种包含对于抗炎性细胞因子具有特异性的牛源多克隆抗体的组合物，其中所述抗体以可有效地局部治疗患者消化道炎症的量存在于所述组合物中，其中在施用所述抗体之后，可在患者血清中检测到的抗体的峰值水平小于1μg/ml。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述抗炎性细胞因子选自：TNF、TNF-κ、Ifn-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL27、IL-32、IL-33、IL-35或其任何组合。
16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述抗炎性细胞因子是TNF。
17.根据权利要求14所述的组合物，其经配制以便经口服施用或经直肠施用。
18.一种治疗患者消化道炎症的方法，所述方法包括向患者消化道施用对于炎性细胞因子具有特异性的抗体，其中在施用所述抗体之后，抗体在患者血清中的峰值水平小于1μg/ml。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述GI道的通透性由于所述炎症而增加。
20.根据权利要求18所述的方法，其中炎症由化学疗法、放射疗法、非治疗性辐射暴露、炎性肠病、乳糜泻、肠易激综合征、癌症、非甾体抗炎病引起。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述炎性细胞因子选自：TNF、TNF-κ、Ifn-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL32、IL-33、IL-35或其任何组合。
22.根据权利要求18所述的方法，其中在暴露于3个或更多个剂量的治疗性抗体之后，少于2％的患者产生针对所述治疗性抗体的抗体。
23.包含对于抗炎性细胞因子具有特异性的牛源多克隆抗体的组合物用于局部治疗患者胃肠道炎症的用途，其中在施用所述抗体之后，可在患者血清中检测到的抗体的峰值水平小于1μg/ml。
24.根据权利要求23所述的用途，其中炎症由化学疗法、放射疗法、非治疗性辐射暴露、炎性肠病、乳糜泻、肠易激综合征、癌症、非甾体抗炎病引起。
25.根据权利要求23所述的用途，其中所述炎性细胞因子选自：TNF、TNF-κ、Ifn-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL32、IL-33、IL-35或其任何组合。
26.根据权利要求23所述的用途，其中在施用所述抗体之后，可在患者血清中检测到的抗体的峰值水平小于约10ng/ml。
27.根据权利要求23所述的用途，其中在暴露于3个或更多个剂量的治疗性抗体之后，少于2％的患者产生针对所述治疗性抗体的抗体。
28.根据权利要求23所述的用途，其中施用3个或更多个剂量的所述抗体在6个月期间不降低所述抗体的功效。
29.一种治疗粘膜炎的方法，所述方法包括将多克隆乳源抗TNF抗体施用于胃肠(GI)道，其中在施用所述抗TNF抗体之后，患者血清中的抗TNF抗体的峰值水平小于1μg/ml。
30.根据权利要求29所述的方法，其中在施用所述抗TNF抗体之后，可在患者血清中检测到的抗TNF抗体的峰值水平小于10ng/ml。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述粘膜炎是口腔粘膜炎。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述抗TNF抗体经配制以施用于口腔。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述粘膜炎是胃肠粘膜炎。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述抗TNF抗体经配制以施用于胃肠道。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗TNF抗体经配制以便口服或经直肠递送。
36.一种将抗体递送至消化道的方法，所述方法包括使所述抗体与所述消化道接触，其中患者消化道的粘膜屏障任选地受到损害以使得其可使所述抗体透过，其中所述抗体对于所述消化道的管腔表面上或所述消化道的粘膜屏障下方的生物靶标具有特异性，并且其中在施用所述抗体之后，抗体在患者血清中的峰值水平小于约1μg/ml。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述抗体是多克隆乳源抗体。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述抗体对选自以下的生物靶标具有特异性：TNF、TNF-κ、Ifn-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL27、IL-32、IL-33、IL-35、toll样受体、肠道神经递质或其受体或转运蛋白、调节食物摄取的肽或受体、结直肠癌细胞上的表皮生长因子受体。
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