BRPI0208124B1

BRPI0208124B1 - Uso de um anticorpo igy imunologicamente específico para a proteína paa associada à virulência de escherichia coli de ligação e eliminação (aeec)

Info

Publication number: BRPI0208124B1
Application number: BRPI0208124-5A
Authority: BR
Inventors: M. Fairbrother John; Harel Josee; Batisson Isabelle; Girard Francis; Guimond Marie-Pierre
Original assignee: Prevtec Microbia Inc.
Priority date: 2001-03-15
Filing date: 2002-03-14
Publication date: 2018-02-06
Also published as: WO2002074812A2; WO2002074812A3; US7727531B2; ATE356147T1; BRPI0208124B8; BR0208124A; US8623372B2; DE60218636T2; US20100183627A1; DE60218636D1; EP1368379A2; US7445782B2; AU2002242531B2; CA2339436A1; US20040086513A1; ES2283531T3; EP1368379B1; US20090092621A1; AU2002242531B8

Abstract

"anticorpos para a prevenção e tratamento de doenças associadas à escherichia coli em ligação e eliminação (aeec)". a presente invenção refere-se a anticorpos imunologicamente específicos para uma proteína associada à virulência de escherichia coli em ligação e eliminação (aeec), produtos, composições e métodos e ao seu. uso na prevenção de uma infecção por aeec em um mamífero. o anticorpo da invenção é imunologicamente específico para uma proteína associada à virulência de aeec e é capaz de prevenir uma infecção intestinal por aeec in vivo quando administrado a um mamífero. o anticorpo da invenção é de preferência útil para prevenção do desenvolvimento de lesões intestinais de a/e associadas à aeec. isso é conseguido de preferência através do uso de anticorpos igy imunologicamente específicos para uma ou mais proteínas associadas à virulência de aeec, tal como eae, tir, espa e paa.

Description

(54) Título: USO DE UM ANTICORPO IGY IMUNOLOGICAMENTE ESPECÍFICO PARA A PROTEÍNA PAA ASSOCIADA À VIRULÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI DE LIGAÇÃO E ELIMINAÇÃO (AEEC) (51) Int.CI.: C07K 16/00 (30) Prioridade Unionista: 15/03/2001 CA 2,339,436 (73) Titular(es): PREVTEC MICROBIA INC.

(72) Inventor(es): JOHN M. FAIRBROTHER; JOSEE HAREL; ISABELLE BATISSON; FRANCIS GIRARD; MARIE-PIERRE GUIMOND

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USO DE UM

ANTICORPO IGY IMUNOLOGICAMENTE ESPECÍFICO PARA A PROTEÍNA PAA ASSOCIADA À VIRULÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI DE LIGAÇÃO E ELIMINAÇÃO (AEEC).

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a anticorpos imunologicamente específicos para uma proteína associada à virulência de Escherichia coli de ligação e eliminação (attaching and effacing Escherichia coli, AEEC) e ao seu uso na prevenção de uma infecção por AEEC em um mamífero.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A Escherichia coli está associada a uma ampla variedade de doenças intestinais em humanos e em animais. Algumas Escherichia coli patogênicas produzem lesões de ligação e eliminação (A/E) caracterizadas por aderência bacteriana íntima a enterócitos e rompimento do citoesqueleto de base. Tais isolados foram chamados A/E de E. coli (AEEC).

Relatórios mostraram que as lesões de A/E são características de patógenos entéricos de humanos tal como E. coli enteropatogênica (EPEC) responsável por diarréia infantil grave em países desenvolvidos, e E. coli entero-hemorrágica que causa colite hemorrágica e síndrome urêmica hemolítica (HUS). Lesões de A/E têm sido também associadas à diarréia em diferentes espécies de animais tal como coelhos, bezerros, cachorros, gatos, cordeiros e porcos.

Lesões de A/E resultam da aderência bacteriana íntima à superfície apical dos enterócitos e ativação de vários produtos de gene cromossômi25 cos que interagem com componentes da célula hospedeiro. Tais produtos de gene são comumente chamados proteínas associadas à virulência de AEEC. Exemplos dessas proteínas associadas à virulência são a intimina (Eae) e as proteínas secretadas Tir (receptor intimina deslocado), EspA, EspD e EspB.

Atualmente, a única abordagem para o controle e tratamento de doenças associadas à AEEC é o uso de antibióticos, uma abordagem que está se tornando menos e menos desejada devido a problemas de resistência bacteriana e resíduos antibióticos. Desse modo, abordagens alternativas

Petição 870170057915, de 11/08/2017, pág. 6/11

para o controle de diarréia pós-desmame devem ser observadas.

Alternativamente, uma outra abordagem conhecida na técnica sugere o uso de proteínas associadas à virulência AEEC como antígenos para imunizar um animal a fim de estimular a produção de anticorpo contra o patógeno relacionado. No entanto, nenhuma indicação da eficácia desta abordagem foi mostrada prevenir infecção por AEEC em um mamífero. Exemplos de tal abordagem alternativa são mostrados na Patente U.S. 6.204.004 e nos pedidos de patente internacionais WO 99/41614; WO 97/40063 e WO 99/24576.

Também conhecido na técnica é o uso de anticorpos de aves (IgY) em imunização passiva. Por exemplo, o WO 00/52055 descreve o uso de anticorpos IgY de gema de ovo específicos para imunoterapia em criação de animais e produção animal. Ele também descreve o uso de anticorpos IgY em kits para diagnóstico.

A patente US 5.932.250 refere-se ao tratamento de distúrbios vasculares particularmente arteriosclerose e aterosclerose em animais de sangue quente. Mais especificamente, esta patente U.S. descreve métodos de controle do nível de colesterol, depósitos de lipídeo e o desenvolvimento de lesões ateromatosas em animais de sangue quente através da ingestão de produtos de ovo contendo anticorpos anti IgY criados contra proteínas de Escherichia cofi.

A patente U.S. 6.162.441 descreve um método para a produção de anticorpos IgY 0157 anti-E coli em galinhas de postura de ovos.

O problema com os WO 00/52055, 5.932.250 e 6.162.441 é que a eficácia in vivo do IgY produzido não foi demonstrada. Na verdade, nenhum desses contém evidência com relação à viabilidade de uma abordagem consistindo em administrar a um mamífero um anticorpo imunologicamente específico para uma proteína associada à virulência de AEEC para prevenção de uma infecção intestinal por AEEC in vivo. Desse modo, há ainda a necessidade de anticorpos, produtos de ovo e métodos para a prevenção ou tratamento de doenças mediadas por AEEC.

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SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a anticorpos imunologicamente específicos para uma proteína associada à virulência de Escheríchia coli em ligação e eliminação (AEEC) e ao uso deles na prevenção de uma infecção por AEEC em um mamífero.

De acordo com um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo imunologicamente específico para uma proteína associada à virulência de AEEC, o anticorpo sendo capaz de prevenir uma infecção intestinal por AEEC in vivo quando administrado a um mamífero.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo da invenção é resistente à digestão gastrintestinal. Com mais preferência, o anticorpo da invenção é um anticorpo IgY.

O anticorpo da invenção é de preferência capaz de prevenir a adesão da AEEC ao intestino de um mamífero. Com mais preferência ainda, o anticorpo da invenção é capaz de prevenir o desenvolvimento de lesões intestinais de ligação e eliminação (A/E) associadas à AEEC. Este aspecto da invenção é conseguido particularmente através do uso de anticorpos imunologicamente específicos para uma ou mais proteínas associadas à virulência de AEEC, tal como Eae, Tir, EspA e Paa.

De acordo com um outro aspecto, a invenção refere-se a um ovo de ave e uma gema isolada de tal ovo contendo um anticorpo conforme acima definido.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma composição que compreende um veículo ou veículo biologicamente aceitável e um anticorpo conforme acima definido, um ovo de ave conforme acima definido; e/ou sua gema isolada conforme acima definido.

De acordo com um outro aspecto, a invenção refere-se a um aditivo alimentar que compreende um anticorpo conforme acima definido, um ovo de ave conforme acima definido, uma fração de gema conforme acima definido, e/ou uma composição conforme acima definido.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção refere-se a um processo para a obtenção de um anticorpo conforme acima definido, o pro30

cesso compreendendo as etapas de:

a) imunização ativa de um ovo de ave para elicitar a produção de anticorpos em um ovo da galinha; e

b) recuperação dos anticorpos do ovo.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para a prevenção de uma infecção de Escherichia coli por ligação e eliminação (AEEG) em um mamífero. O método compreende a etapa de administrar oraimente ao mamífero um anticorpo conforme acima definido, um ovo de ave conforme acima definido e/ou uma gema isolada conforme acima definido.

Uma vantagem principal da invenção é que ela provê anticorpos, produtos, composições e métodos úteis e eficientes para a prevenção de uma infecção por AEEC em um mamífero.

Além disso, é particularmente uma vantagem que os anticorpos, produtos, composições e métodos da invenção previnem especificamente o desenvolvimento de lesões intestinais de A/E associadas à AEEC.

Outros objetivos e vantagens da presente invenção ficarão aparentes quando da leitura da descrição não-restritiva que segue de várias modalidades preferidas, feitas com referência aos desenhos acompanhantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um gráfico em barra mostrando que as cepas de AEEC originárias de coelho, porco, cachorro, bovino e humano (incluindo EHEC e EPEC não-0157 ), e produzindo Eae dos subtipos α, β, õ ou ε, induziram as lesões de A/E igualmente bem em explantes de íleo de porcos recém-nascidos.

A Figura 2 é um gráfico em barra mostrando que uma substituição de Eae do subtipo γ por Eae do subtipo α em uma cepa O157:H7 resultou em indução de lesões de A/E a um grau similar ao observado para a cepa de AEEC de porco homóloga.

A Figura 3 é um gráfico em barra mostrando que anticorpos de acordo com uma modalidade preferida da invenção são capazes de signifi5

cantemente bloquear o desenvolvimento de lesões de A/E em explantes do íleo causadas pela cepa homóloga 1390.

A Figura 4 é um gráfico em barra mostrando que anticorpos de acordo com uma modalidade preferida da invenção são capazes de significantemente bloquear o desenvolvimento de lesões de A/E em explantes de íleo causadas por várias cepas de AEEC de bezerro.

As Figuras 5 e 6 são gráficos em barra mostrando que anticorpos de acordo com uma modalidade preferida da invenção são capazes de significantemente bloquear o desenvolvimento de lesões de A/E em explantes de íleo causadas por várias cepas de AEEC de humano.

A Figura 7 é um gráfico em barra mostrando que os anticorpos de acordo com uma modalidade preferida da invenção são capazes de significantemente bloquear o desenvolvimento de lesões de A/E em explantes de íleo causadas por várias cepas de EPEC.

As Figuras 8A e 8B são gráficos em barra mostrando que administração oral de anticorpos de gema de ovo de acordo com uma modalidade preferida da invenção significantemente inibe o desenvolvimento de lesões de A/E no ceco e colo de porquinhos desafiados com uma cepa AEEC de porco homóloga.

As Figuras 9A e 9B são gráficos em barra mostrando que administração oral de anticorpos de gema de ovo de acordo com uma modalidade preferida da invenção significantemente inibe o desenvolvimento de lesões de A/E no ceco e colo de porquinhos desafiados com uma cepa AEEC de porco homóloga.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como anteriormente mencionado, a presente invenção refere-se a uma nova abordagem alternativa oposta a antibióticos para a prevenção de uma infecção por AEEC em um mamífero.

Mais precisamente, a presente invenção refere-se a anticorpos imunologicamente específicos para uma proteína associada à virulência de AEEC, esses anticorpos sendo capazes de prevenir uma infecção in vivo quando administrados em um mamífero. Mais particularmente, os anticorpos °ο da invenção são capazes de prevenir a adesão da AEEC ao intestino do mamífero, e com mais preferência ainda, eles previnem o desenvolvimento de lesões intestinais de A/E associadas à AEEC.

Conforme aqui usado, o termo prevenção refere-se a um pro5 cesso através do qual a infecção por AEEC é obstruída ou retardada.

Conforme aqui usado, o termo mamífero refere-se a qualquer animal que tenha a possibilidade de ser infectado por uma AEEC. Dentre os mamíferos que são conhecidos ser potencialmente infectados por uma AEEC estão humanos, porcos, bovinos, ovinos, caprinos, coelhos, cachorros e gatos. Ficará aparente a uma pessoa versada na técnica que os anticorpos da invenção pretendem ser imunologicamente específicos para proteínas de virulência isoladas de uma variedade de cepas de AEEC que podem causar lesões intestinais, tal como aquelas de E. coli enteropatogênicas (EPEC) e E. coli entero-hemorrágica (EHEC). Alguns exemplos de cepas de EPEC e

EHEC são mostrados na Tabela 1.

Com relação a anticorpos da invenção, o termo imunologicamente específico refere-se a anticorpos que se ligam com uma afinidade relativamente alta a um ou mais epitopos de uma proteína de interesse, mas que não reconhecem substancialmente e se ligam a moléculas outras que não a(s) de interesse. Conforme aqui usado, anticorpo e anticorpos incluem todas as possibilidades mencionadas aqui anteriormente: anticorpos ou seus fragmentos obtidos através de purificação, tratamento proteolítico ou através de engenharia genética, construtos artificiais compreendendo anticorpos ou seus fragmentos e construtos artificiais feitos para imitar a ligação de anticorpos ou seus fragmentos. Tais anticorpos são discutidos em Colcher e outros, (Q. J. Nucl. Med. 1998; 42:225-241). Eles incluem anticorpos completos, fragmentos F(ab’)2 , fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos scFv, outros fragmentos, peptídeos CDR e miméticos. Esses podem ser facilmente obtidos e preparados por aqueles versados na técnica. Por exem30 pio, digestão de enzima pode ser usada para se obter fragmentos F(ab’)2 e Fab submetendo uma molécula de IgG à divagem de pepsina ou papaína, respectivamente. Anticorpos recombinantes são também compreendidos

I

ΙΟ pela presente invenção.

Altemativamente, o anticorpo da invenção pode ser um derivado de anticorpo. Tal anticorpo pode compreender uma região de ligação de antígeno ligada ou não a uma região de não-imunoglobulina. A região de ligação de antígeno é um domínio variável de cadeia leve ou um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo. Tipicamente, o anticorpo compreende ambos domínios de variável de cadeia leve e pesada, que podem ser inseridos em construtos tal como fragmentos Fv de cadeia única (scFv), fragmentos de Fv estabilizados por dissulfeto (dsFv), fragmentos de scFV multiméricos, diacorpos, minicorpos ou outras formas relacionadas (Colcher e outros. Q. J. Nucl. /Wed.1998; 42:225-241). Tal anticorpo derivado pode ser algumas vezes preferido uma vez que ele é destituído da porção Fc do anticorpo natural que pode se ligar a vários efetores do sistema imune e elicitar uma resposta imune quando administrado a um humano ou animal. Na verdade, anticorpo derivado normalmente não leva a doença imuno-complexa e ativação complementar (reação de hipersensibilidade do tipo III).

Alternativamente, uma região de não-imunoglobulina é fundida à região de ligação de antígeno do anticorpo da invenção. A região de nãoimunoglobulina é tipicamente uma porção de não-imunoglobulina e pode ser uma enzima, uma região derivada de uma proteína tendo especificidade de ligação conhecida, uma região derivada de uma toxina de proteína ou na verdade de qualquer proteína expressa por um gene, ou uma entidade química mostrando atividade(s) de inibição ou bloqueio contra as proteínas associadas à virulência de AEEC. As duas regiões desse anticorpo modificado podem ser conectadas através de uma seqüência de ligante clivável ou uma permanente.

Uma vez que a infecção por AEEC está geralmente localizada no trato intestinal, é bastante preferido que o anticorpo da invenção seja resistente à digestão gastrintestinal. Conforme aqui usado, o termo resistente refere-se a um anticorpo que vai substancialmente reter sua função imunológica mesmo após estar em contato com ácidos gástricos por um período de tempo necessário para prevenir uma infecção por AEEC in vivo. De prefe30 δ

rência, ο anticorpo da invenção é uma imunoglobulina de ave, tal como IgY. Na verdade, é conhecido que anticorpos IgY mostram maior resistência a ácido e ao calor. O anticorpo da invenção pode ser também uma imunoglobulina humana ou animal tal como lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA, IgE ou IgD carregando regiões variáveis de rato ou camundongo (quiméricas) ou CDRs (humanizadas ou animalizadas¹¹). No entanto, a invenção não está restrita a anticorpos IgY uma vez que é concebível que a capacidade de resistência do anticorpo, se não houver, pode ser provida ou aumentada através de engenharia genética ou através de qualquer outro meio conhecido de uma pessoa versada na técnica. Além disso, o anticorpo da invenção pode ser também conjugado a qualquer veículo adequado conhecido de um versado na técnica a fim de aumentar a sua resistência a ácidos gástricos ou para prover, por exemplo, uma aplicação específica e retenção prolongada do anticorpo, ou em uma área local marcada, tal como o intestino, ou para uma aplicação sistêmica.

Conforme acima mencionado, o anticorpo da invenção é imunologicamente específico para uma ou mais proteínas associadas à virulência de AEEC. As proteínas associadas à virulência de AEEC preferidas compreendidas pela invenção são Eae, Tir, EspA, Paa e seus derivados imunológicos. Conforme aqui usado, o termo derivado imunológico refere-se a uma proteína/peptídeo que possui uma atividade imunológica que é substancialmente similar à atividade imunológica de toda proteína/peptídeo, e tal atividade imunológica refere-se à capacidade de estimulação da produção de anticorpos imunologicamente específicos para uma proteína associada à virulência de AEEC ou seu derivado. O termo derivado imunológico compreende fragmentos, segmentos, variantes¹¹ ou análogos de uma proteína/peptídeo.

Em uma modalidade bastante preferida, a presente invenção usa anticorpos IgY uma vez que e conforme acima mencionado, eles vantajosamente mostram resistência ao ácido gástrico. Além disso, anticorpos IgY têm a vantagem de não reagir com complemento de mamífero, receptor de Fc, proteína A ou proteína G. Também, anticorpos IgY produzidos em ovos e οΟ °ο sua extração das gemas do ovo podem ser realizados em uma larga escala sem investimento alto.

Com relação a isso e de acordo com um outro aspecto, a presente invenção refere-se também a um processo para a obtenção do anti5 corpo mencionado acima imunologicamente específico para uma proteína associada à virulência de AEEC. No entanto, muitos processos conhecidos na técnica podem ser adequados para se obter esses anticorpos considerados pelos inventores, é preferível que o processo da presente invenção compreenda as etapas de: a) imunizar ativamente um ovo de galinha para elicitar a produção de anticorpos em um ovo da galinha; e b) recuperação dos anticorpos do ovo. Uma pessoa versada na técnica vai compreender que a etapa de imunização é conseguida através de métodos bem conhecidos. Por exemplo, a proteína de virulência de AEEC pode ser dada parenteralmente, por exemplo, intravenosamente, intramuscularmente, subcutane15 amente. Conforme aqui usado, o termo ave*' refere-se a quaisquer aves que podem ser imunizadas. Dentre essas, a galinha domesticada comum é preferida. O processo da invenção pode também compreender uma etapa de administração de pelo menos um realçador das proteínas para manter um estado hiperimune na galinha. Além disso, o processo da invenção compre20 ende de preferência uma etapa de purificar os anticorpos de uma fração de gema do ovo. Novamente, a etapa de purificação é conseguida com métodos bem conhecidos daqueles versados na técnica. Tal pessoa vai também compreender que a etapa de realce não é limitada a ser feita antes de etapa de postura do ovo. Na verdade, um realçador pode ser dado à mesma gali25 nha mesmo durante ou após a etapa de postura do ovo.

Conseqüentemente, a presente invenção refere-se também a um ovo de ave que contém um anticorpo da invenção. A presente invenção refere-se ainda a uma gema isolada do ovo.

A presente invenção também descreve um método e composi30 ções para a prevenção de doenças associadas à AEEC. Muitos métodos poderiam ser usados para reduzir à prática a presente invenção. No entanto, é particularmente acreditado que um método que compreende a etapa de β

administrar oralmente a um mamífero um anticorpo da invenção, uma gema de ovo e/ou uma gema isolada conforme anteriormente definido é particularmente vantajoso a partir de um ponto de vista comercial. Não obstante, métodos que envolvem uma administração parenteral do anticorpo da invenção podem ser considerados por um versado na técnica.

De acordo com uma modalidade preferida, a composição da invenção compreende pelo menos um elemento imunologicamente ativo contra AEEC e um veículo ou veículo biologicamente aceitável. Tal elemento pode ser ou um anticorpo, um ovo de ave ou uma gema isolada conforme acima definido. Para a preparação das composições da presente invenção, métodos bem conhecidos na técnica podem ser usados. Conforme aqui usado, o termo imunologicamente ativo, ou referência à atividade imunológica de um elemento, tal como um anticorpo da invenção, refere-se nesse caso à habilidade de tal anticorpo em prevenir uma infecção por AEEC em um mamífero através da ligação a uma proteína associada à virulência de AEEC. Conforme aqui usado, o termo biologicamente aceitável refere-se a um veículo ou um veículo que pode ser administrado seguramente a um mamífero, particularmente humanos e animais, sem efeitos colaterais negativos ou tóxicos acentuados. Tal veículo ou veículo pode ser usado para vários propósitos, tal como agentes conservantes, agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, adoçantes, corantes, odorizantes, sais, tampões, agentes de revestimento ou antioxidantes e similar. Eles podem ser imediatamente preparados por aqueles versados na técnica usando métodos bem conhecidos.

De acordo com uma outra modalidade, a composição da invenção é formulada sob a forma de uma composição farmacêutica ou nutracêutica. A presente invenção também provê um aditivo alimentar compreendendo pelo menos um dos elementos acima mencionados e compreende ainda uma composição conforme acima definido. Ficará aparente para um versado na técnica que embora as composições da invenção sejam de preferência administradas oralmente, elas podem ser administradas através de outra via adequada. Na verdade, é concebível que elas podem ser dadas através de

oo outros meios. No caso onde as composições são dadas oralmente, elas podem estar na forma de comprimidos, cápsulas, pós, xaropes, etc.

As composições da invenção podem ser usadas em conjunto com composições farmacêuticas conhecidas na técnica. Por exemplo, alguém poderia achar vantajoso combinar um dos elementos da composição da invenção com outros agentes ativos que podem ser usados para tratar ou prevenir doenças outras que não aquelas induzidas por AEEC.

A quantidade de anticorpos específicos que é administrada a um humano ou um animal ou que está presente na composição da invenção é uma quantidade terapeuticamente eficaz. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo é aquela quantidade necessária para obtenção de resultados benéficos sem causar efeitos secundários negativos acentuados no hospedeiro ao qual o anticorpo ou composição é administrada. Além disso, uma quantidade eficaz de um anticorpo para tratamento de uma doença em particular é uma quantidade que é suficiente para melhorar, ou de alguma maneira reduzir os sintomas associados à doença. Tal quantidade pode ser administrada como uma dose única ou pode ser administrada de acordo com um regime, por meio do qual ela é eficaz. A quantidade pode curar a doença mas, tipicamente, é administrada a fim de melhorar os sintomas da doença.

A quantidade exata do anticorpo ou de cada um dos componentes na composição e quantidade da composição a ser administrada vão variar de acordo com fatores tal como o tipo da condição a ser tratada, ou outros ingredientes na composição, o modo de administração, a idade e o peso do mamífero, etc. Sem ser limitado por qualquer dosagem em particular, acredita-se que, por exemplo, para administração oral, uma dosagem diária de cerca de 100 a cerca de 600 mg/kg de gema de ovo liofilizada contendo anticorpos imunologicamente específicos para uma proteína associada à virulência de AEEC (geralmente presente como parte de uma composição conforme acima indicado) pode ser adequada para prevenção de uma infecção por AEEC mamífera em um adulto típico. Esta dosagem pode ser repetida com a freqüência apropriada. Tipicamente, a administração pode ser de 1 a 21 vezes por semana. Se efeitos colaterais se desenvolve30

°ο rem, a quantidade e/ou frequência da dosagem pode ser reduzida.

EXEMPLO

O exemplo que segue é ilustrativo de uma ampla variedade de aplicabilidade da presente invenção e não pretende limitar seu escopo. Modificações e variações podem ser feitas nela sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Embora qualquer método e material similar ou equivalente àqueles descritos aqui possam ser usados na prática para teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos.

Sumário

Os inventores produziram com sucesso anticorpos da gema do ovo contra proteínas de fusão purificadas de fatores de virulência de ligação e eliminação Eae, EspA, EspB, EspD e Tir e de um novo fator de virulência de ligação e eliminação putativo Paa. Eles mostraram que apenas os anticorpos anti-Eae, anti-Tir e anti-Paa foram capazes de significantemente bloquear o desenvolvimento de lesões de ligação e eliminação (A/E) devido à cepa de H coli de porco homóloga ex vivo no modelo de cultura de órgão íleo de porco. Esses anticorpos eram também capazes de bloquear o desenvolvimento de lesões de A/E devido à E. coli de ligação e eliminação originária de várias outras espécies de animais tal como bovino e cachorro, e de humanos, incluindo ambos E. coli O157;H7 e não-0157;H7. Finalmente, os inventores mostraram que os anticorpos anti-Eae eram capazes de reduzir significantemente o desenvolvimento de lesões de A/E devido à ligação e eliminação de E. cofi homóloga de porco e O157;H7 humana in vivo em um modelo de infecção de porco recém-nascido. Esses resultados mostram claramente que os anticorpos da gema do ovo de galinha específicos para certos dos fatores de virulência envolvidos em ligação e eliminação são capazes de bloquear infecção bacteriana e desenvolvimento de lesões intestinais causadas por ligação e eliminação de E. coli. Eles são também um candidato potencial como um aditivo alimentar para administração oral a bovino a fim de eliminar Ο157.Ή7 e outras E. coii de ligação e eliminação do intestino e prevenir contaminação da carne e conseqüente infecção de humanos.

ο ο

Materiais e Métodos

Cepas bacterianas, plasmídios e meio. E. coli M155(pREP4®) foi usada como a cepa hospedeiro para proteínas recombinantes. A E. coli de ligação e eliminação de porco (AEEC) P86-1390 (sorogrupo 045, resistente à estreptomicina, SM®) foi isolada na Faculte de Médecine Vétérinaire, Saint-Hyacinthe, Québec, Canadá, de um porco de 4 semanas de vida sem diarréia pós-desmame. 045 da cepa P86-1390 induz lesões de ligação e eliminação típicas (A/E) (Zhu e outros, 1994 Infect. Immun. 62:4153-4159; Zhu e outros, 1995 Can. J. Vet. Res. 59:118-123) e seu DNA genômico foi usado como molde para amplificar os genes de fator de virulência no local da eliminação do enterócito (LEE).

Para desafio de modelo de explante (vide Tabela 2 quanto às características das cepas), as bactérias foram cultivadas da noite para o dia em Caldo de Soja Tripticase (TSB, Difco) com agitação (150 rpm) a 37°C, então transferidas para Meio da Eagle Modificado da Dubelcco (DMEM, GibcoBRL) e cultivadas para fase exponencial recente antes do uso (ODeoo 0,7, correspondendo a aproximadamente 2,0 x 10⁸ CFU, determinado através de curvas de crescimento específicas). D-manose final a 1% foi adicionada a cada cultura de caldo para minimizar a aderência mediada por fimbriae do Tipo 1 antes da infecção.

Construção dos genes de fusão. A extremidade 3’ (carbóxi) ou o gene eae completo (maduro), os genes espA, espB e espD, gene tir, e a extremidade 3’ (carbóxi) do gene paa completo (maduro) foram amplificados através de PCR usando pares de primer listados na Tabela 3. Os amplicons foram inseridos no vetor pGEMpT® (Promega) e então introduzidos no vetor de expressão pQE-30® (Qiagen) usando o sítio de clonagem apropriado (entre os sítios San?HI e Sa/I para carbóxi de eae, espA, espB, espD, genes carbóxi de paa, entre fíamHI e Sphl para o gene maduro eae, e entre H/nólll e Seal para o gene tir}. As fusões de gene foram checadas através de seqüenciamento.

Produção e Purificação de proteínas de fusão. Uma pré-cultura de caldo de LB da noite para o dia foi usada para inocular 1 litro de uma ίΐ &

cultura de caldo de LB. As células foram cultivadas a 37°C com agitação até que o ODeoonm fosse 0,7-0,8. Isopropiltiogalactosídeo (IPTG) foi então adicionado para uma concentração final de 1mM. Após incubação por cerca de 4 horas, as células foram colhidas através de centrifugação a 4000 x g por 10 minutos e ressuspensas em dois volumes de tampão A (Qiagen). As amostras podem ser centrifugadas e o pelete armazenado congelado a -70°C até o uso. As amostras foram descongeladas em temperatura ambiente e ressuspensas em um tampão A. Um mg/ml de lisozima e uma concentração final de 100 pM de PMSF foram adicionados. A suspensão geral foi incuba10 da 30 minutos em gelo e sonificada. Para cada ml de amostra, 10 pg de Rnase A e 5 pg de Dnase 1 foram adicionados e após incubação por 15 minutos em gelo, a amostra foi clarificada através de centrifugação a 15000 x g por 20 minutos. O sobrenadante foi misturado com uma pasta fluida a 50% de resina Ni-NTA (Qiagen) em tampão A (8 ml de pasta fluida por litro de células). Após mistura suave em um tubo giratório por uma noite, a resina foi adicionada a uma coluna Qiagen, lavada com tampão A até que o OD₂₈onm fosse menos do que 0,01, lavada com tampão B (Qiagen) até que o OD₂₈onm fosse menos do que 0,02, lavada com 0,1 M de imidazol em tampão B (20 ml por litro de células), e eluída com 0,25 M de imidazol em tampão B (10 ml por litro de células). As frações (1-1,5 ml), coletadas sob estratificação do 0,25 M da eluição de imidazol, foram analisadas através de SDS-PAGE através de acrilamida a 15%. Aquelas contendo proteínas de interesse foram agrupadas, quantificadas através do método Lowry, e armazenadas a -70°C.

Western immunobloting. Proteínas purificadas em coluna de ati25 vidade marcada em His foram misturadas com um volume igual de tampão 2X Laemmli, fervidas por 5 minutos, aplicadas a um SDS-PAGE a 15%, e eletrotransferidas para membrana de nitrocelulose de 0,2 pm (BioRad). As manchas foram bloqueadas e lavadas com albumina de soro bovino a 1% (BSA), - Tween® 20 a 0,1% em solução salina tamponada com Tris (TBS), e incubadas da noite para o dia com os anticorpos, incluindo anticorpo RGSHis (Qiagen) e o anti-Eae, anti-EspA, anti-EspB, antí-EspD e anti-Tir gentilmente fornecidos pelo Dr. Gad Frankel e pelo Dr. Frank Ebel. Para análise ,ο de produção de anticorpo (IgY) de galinha, IgY purificado especificamente direcionado contra cada um dos fatores de virulência LEE foi usado como os anticorpos principais. Filtros foram então desenvolvidos com IgG conjugado com HRP anti-coelho de cabra (1/1000), anti-camundongo de cabra (1/1000) ou anti-galinha de coelho (1/5000) e com H₂02-a-cloronaftol como o substrato.

Imunização de animais e purificação de anticorpos. Duas e oito galinhas de postura foram imunizadas em seu músculo peitoral em sítios múltiplos com 50 pg de proteínas purificadas e emulsificadas em adjuvante de Freund incompleto nos dias 1, 14, 28, 42 e 56. Proteínas totais M15 (pREP4®) foram usadas como controle negativo para produção de IgY de fator antivirulência. Os ovos foram coletados do dia 28 e mantidos a 4°C até purificação dos anticorpos. Para a purificação dos anticorpos, as gemas foram separadas da membrana da gema e da clara do ovo, armazenadas e um volume de PBS 1X foi adicionado. A mistura geral foi homogeneizada, misturada com um volume de clorofórmio, e centrifugada a 15000 x g por 10 minutos. Uma solução de cor laranja contendo o vitelo, uma emulsão semisólida amarela dos lipídeos em clorofórmio, e uma fase aquosa contendo IgY de galinha foram então observadas do fundo até o topo do tubo. IgY purificado foi analisado através de SDS-PAGE tingido com Coomassie azul e através de Western immunoblotting conforme acima explicado.

ELISA. Títulos de IgY de fator antivirulência em gema de ovos foram determinados usando placas de microtitulação (Immulon 2HB, Dynec) pré-revesti d as com 100 ng de proteínas purificadas em tampão de carbonato (pH 9,6). IgY purificado serialmente diluído em PBS (pH 7,4) contendo BSA a 1% e Tween 20 a 0,05% foi adicionado às cavidades e incubado por 2 horas a 37°C. Após lavar três vezes com PBS contendo Tween® 20 a 0,05%, os anticorpos ligados foram detectados através de adição de igG anti-galinha de coelho (1/25000) conjugado à peroxidase (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.). Após uma reação de substrato de enzima por 10 minutos, a absorbância a 405 nm foi lida e os títulos de anticorpo foram expressos como o logi₀ da diluição recíproca. Para monitorar as reações não30 específicas as absorbâncias medidas com IgY de galinhas imunizadas com o extrato de proteína total da cepa M14 (pREP4®) foram subtraídas de absorbância obtida com amostras de teste.

Extração de anticorpo de gemas de ovo. IgY específico de fator 5 de virulência foi extraído de gemas de ovo através de um método descrito por [Akita e Nakai, (1993) Immunoí. Methods 18: 162(e): 155-164; 1993 lmmunoí Methods. 2: 160(2): 207-214], com algumas modificações. Em resumo, as gemas de ovo foram separadas da albumina, então postas em uma toalha. As gemas do ovo foram gentilmente enroladas na toalha para remo10 ver os resíduos de albumina, então puncionadas para aspirar a gema sem o vitelo. Um volume igual de Solução Salina Tamponada de Fosfato (PBS) foi adicionado às gemas, então homogeneizado através de agitação em Vórtex. Um volume igual de clorofórmio foi adicionado à solução, então misturado até que houvesse um homogenato sólido. A preparação foi centrifugada por

5 minutos a 14000 rpm, e o sobrenadante contendo IgY foi removido. O sobrenadante foi liofilizado antes do uso.

Coleta e cultura de tecidos de explante. A técnica de cultura de explante foi derivada de Zhu e outros, 1994 (supra). Em resumo, os tecidos mucosais do íleo foram obtidos de porquinhos privados de colostro recém20 nascidos de em rebanho convencional. Os porquinhos foram tranquilizados com cloridrato de cetamina antes de serem eutanizados com uma overdose de pentobarbital. O tempo que passou entre a morte e o início da cultura de explante foi de aproximadamente 1 hora e cada cepa foi testada em pelo menos 2 porquinhos. Quando da coleta, a serosa foi cuidadosamente remo25 vida e o muco foi gentilmente descartado com esfregão estéril. Os tecidos foram imersos em meio RPMI 1640® completo estéril (GibcoBRL), transportados para o laboratório em gelo, e postos em uma plataforma de giratória por 30 minutos. Antes da cultura, os tecidos foram cortados em pedaços de 5 x 5 mm e postos com o lado da mucosa para cima em almofadas de biópsia (Curtin Matheson Scientific, Inc.) em placas de cultura de tecido Delta® Surface Nunclon de quatro cavidades de multiprato (Nalge Nunc International). Um tecido (agora chamado explante) foi posto em cada esponja qo

Ο'Ο com 1 esponja por cavidade. Meio 1640 RPMI completo foi adicionado às cavidades sem submergir os explantes. As placas foram incubadas a 37°C em um girador (posição 2,5) em uma atmosfera de 95% de O₂ e 5% de CO₂.

Inoculação e exame dos explantes. Os explantes foram infectados três vezes em intervalos de uma hora com 50 μΙ de cultura em caldo (aproximadamente 1 χ 10⁷ CFU) aplicados à superfície da mucosa e incubados por 8 horas. Para prevenir supercresci mento bacteriano e pH ácido, mudanças de hora em hora com meio RPMI 1640® completo fresco estéril foram realizadas durante a cultura começando 2 horas após infecção inicial do explante.

Tratamento com anticorpos no modelo de explante· Culturas em caldo foram incubadas a 37°C com um volume igual de preparação de anticorpo liofilizada, anteriormente constituída com PBS, por 30 minutos antes da infecção do explante.

Microscopía de luz. Após cultura, os explantes foram fixados em formalina tamponada a 10% para exame microscópico. O mesmo protocolo foi usado para seções de porquinhos recém-nascidos experimental mente infectados in vivo. As seções fixadas com formalina foram adicionalmente postas em bolsas de biópsia de tecido Nylon® (Shadon Inc.), processadas, embebidas em parafina, seccionadas a 5 pm, e tingidas com hematoxilina, floxina e safranina (HPS) de acordo com técnicas padrão. As seções tingidas com HPS foram examinadas através de microscopía de luz quanto a bactérias com aderência epitelial íntima. Cada vilo intacto foi examinado quanto à presença de bactérias de aderência íntima, e a avaliação de superfície epitelial média coberta com bactérias de aderência íntima foi realizada, de acordo com uma escala de 0 a 100%.

Imunofluorescência. Seções em lâminas de vidro foram desparafínadas em xileno por 5 minutos antes de reidratação em soluções de etanol progressivas. As seções foram enxaguadas em PBS então sítios de ligação antigênicos foram bloqueados em solução de PBS-1% BSA-0,1% Tween 20 a 37°C por 20 minutos. Em seguida, as seções foram enxaguadas em PBS e incubadas a 37°C por 20 minutos com diluição 1:50 de anticorpos

I

q.í primários (Escherichia coli Serotyping Laboratory, Canadá) de acordo com o sorotipo de cepa específico. Após enxaguar em PSB, as seções foram incubadas a 37°C com diluição 1:200 de anticorpo secundário conjugado anticoelho FITC de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, USA) por 20 minutos. As seções foram finalmente contratingidas com Evarfs Blue® 0,2% (Fisher Scientific Company, USA). As seções montadas foram examinadas com um microscópio Leitz Diaplan® equipado com epifluorescência.

Microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Seções do íleo delgado, ceco ou colo (3 mm x 3 mm) foram fixadas por 2 horas em temperatura ambiente em glutaraldeído (2,5% (v/v), então enxaguadas em tampão cacodilato (cacodilato 0,1 M, pH 7,3) por 1,5 hora com mudanças regulares. Em seguida, os tecidos foram pós-fixados por 1 hora em temperatura ambiente em tetróxido de ósmio a 2% (OSO₄), então enxaguados em água por 1,5 hora com mudanças regulares, desidratados em séries de etanol medidas, e finalmente embebidos em resina Spurr (Marivac, Nova Scotia, Canadá). Seções finas foram montadas em grades de cobre, tingidas com acetato de uranila e citrato de chumbo, e examinadas quanto a lesões de AE com um microscópio eletrônico de transmissão Philips 420® a 80 kV (Philips Eletronics, Países Baixos).

Infecção de porquinho e desafios de anticorpo in vivo. 22 porquinhos recém-nascidos de um rebanho convencional foram usados para avaliar os efeitos de anticorpos anti-eaeM sobre a aderência bacteriana in vivo. 12 porquinhos foram privados do colostro antes da infecção com cepa de porco 1390, enquanto que os outros 10 porquinhos foram alimentados com colostro antes da infecção com a cepa EHEC 85-170. Todos os porquinhos foram mantidos em gaiolas e alimentados com leite evaporado durante o experimento. Os porquinhos do Grupo 1 (1390) foram infectados com 1 x 10¹° CFU de cepa EPEC 1390 em 2 ml de caldo de TSB por 2 dias, e receberam duas vezes por dia gemas de ovo de galinhas imunizadas com sonificado de cepa PREp15 como um controle positivo de aderência (n=6), ou gemas de ovo de galinhas imunizadas com proteína de fusão EaeM (n=6). Os porquinhos do Grupo 2 (85-170 infecções) foram infectados com 1 x 10¹°

A.J $

CFU de 85-170 cepas EHEC em 2 ml de caldo de TSB por 2 dias, e receberam três vezes por dia gemas de ovo liofilizadas reconstituídas em leite de galinhas imunizadas com um sonificado da cepa PREp4 com um controle positivo de aderência (n=5), ou gemas de ovo liofilizadas reconstituídas em leite de galinhas imunizadas com a proteína de fusão EaeM (n=5). Os porquinhos foram monitorados diariamente quanto a quaisquer sinais clínicos de diarréia e sofreram necrópsia 48 horas após infecção inicial. Os porquinhos foram tranqüilizados com cloridrato de cetamina, então eutanizados com uma overdose de solução de pentobarbital.

Resultados e Discussão

a) Produção de proteínas de fusão

Tem sido ciaramente demonstrado na literatura que a intimina (Eae) e as proteínas secretadas Tir (receptor de intimina deslocado), EspA, EspD e EspB são fatores de virulência desempenhando um papel importante na patogênese de várias infecções por AEEC e poderíam elicitar uma resposta de anticorpo. Além disso, os inventores encontraram uma nova proteína chamada Paa (para Ligação e Eliminação Porcino associada) que está também envolvida em adesão de AEEC a células hospedeiro (vide seção d). Esses fatores de virulência diferentes foram então considerados como bons candidatos para imunidade protetora e/ou como marcadores em teste de diagnóstico. Também, foi considerado que seria importante produzir uma proteína de fusão usando apenas a extremidade C terminal da intimina (carbóx de Eae) que está envolvida no reconhecimento do receptor. Desse modo, sete (7) proteínas de fusão foram produzidas correspondendo às proteínas listadas no vetor de expressão pQE30 que se liga em estrutura a uma lacuna His6 na extremidade terminal N das proteínas. Pares de iniciador específicos para cada um dos fatores de virulência foram escolhidos para amplificar através de PCR as proteínas integralmente (Eae, EspA, EspB, EspD, Paa, Tir) ou uma parte delas (carbóxi de Eae) de DNA genômico de E. coli enteropatogênica de cepa 1390 de porco. As proteínas de fusão foram detectadas através de análise Western blot revelada com anticorpos anti-histidina e com anticorpos especificamente direcionados contra cada um

σ dos fatores de virulência. No entanto, a proteína His-Paa foi apenas detectada em baixa quantidade. Uma vez que Paa é prevista ser instável através do programa EXPASY, uma fusão com o terminal C estável e da Paa (carbóxi de Paa) foi realizada.

Todas as proteínas de fusão foram então produzidas em uma escala grande e purificadas em uma coluna de afinidade de níquel em quantidades suficientes para imunização de galinhas e para uso como antígenos em ELISA. As proteínas purificadas carbóxi de His-Eae, His-Eae, His-EspA, His-EspB, His-EspD, His-Paa e His-Tir foram obtidas.

b) Produção e purificação dos anticorpos da gema do ovo

A imunização de galinhas e a técnica de purificação de anticorpo foram realizadas a partir de técnicas modificadas conforme descrito em Materiais e Métodos. Análise SDS-PAGE demonstrou produção de IgY logo nos 28 dias após imunização inicial com proteínas carbóxi de His-Eae, His-Eae, His-EspA, His-EspB, His-EspD, His-Paa e His-Tir.

c) Sensibilidade e especificidade dos anticorpos da gema do ovo contra cada uma das proteínas

Análise Western blot mostrou que IgY purificado reconhecia as proteínas de fusão homólogas. O título do IgY específico para cada proteína foi então medido através de ELISA usando proteínas purificadas homólogas como o antígeno. As condições de teste ELISA foram determinadas para cada antígeno e os resultados mostraram um título alto (>1/25000) para cada IgY específico após 42 dias. A capacidade de cada anticorpo em detectar o antígeno nativo correspondente na cepa homóloga 1390 e em cepas de AEEC de espécies de animais diferentes foi também examinada. No entanto, parecia que essas condições de teste e/ou apresentação de antígeno não favoreceram a detecção através de ELISA de alguns fatores de virulência tal como Eae e Paa em bactérias do tipo selvagem.

d) Capacidade de anticorpos específicos em prevenir o desenvolvimento de lesões de A/E in vitro no modelo de cultura de órgão de íleo de porco » Elaboração do modelo

A primeira etapa deste trabalho foi determinar as condições de

cultura de explante que permitiríam a aderência de AEEC às células epttelíais do íleo e do ceco de porquinhos desmamados. Condições diferentes foram testadas e uma técnica rápida para análise microscópica de seções de tecido através de microscopia de luz e confirmação através de microscopia de elétron foi estabelecida (vide Materiais e Métodos). Uma aderência maior e mais coerente da cepa 1390 foi observada em explantes de íleo de porquinhos recém-nascidos do que em explantes de porquinhos desmamados. Então, o modelo de explante de porco recém-nascido foi usado em experimentos subsequentes.

Os inventores demonstraram que as cepas de AEEC originárias de coelho, porco, cachorro, bovino e ser humano (incluindo EHEC e EPEC não-0157), e produzindo Eae do subtipo α, β, õ ou ε, induziram lesões de A/E igualmente bem em explantes de íleo de porco recém-nascido (Figura 1). Mais especificamente, a figura 1 mostra a porcentagem média de vilos intactos mostrando aderência bacteriana sobre seções de explante de íleo. As cepas de várias espécies animais e de ser humano mostram uma aderência percentual similar, quando comparadas com a cepa de AEEC 1390 de porco homóloga, exceto aquelas do sorotipo O157:H7 (EC505, 43888, STJ348, 85-170, 43895, STJ854 e STJ919 no gráfico). Todas as cepas, exceto a O157:H7 são significantemente diferentes da cepa mutante eae ICC170 (controle negativo). Esses dados validam o modelo da requerente para o estudo da expressão de fenótipo de ligação e eliminação para ambas cepas homólogas e heterólogas, exceto para aquelas pertencentes ao sorotipo Ο157.Ή7. Os resultados são apresentados como a média ± desvio padrão da média.

Por outro lado, as cepas de AEEC O157:H7 produzindo Eae do subtipo γ aderiram a um grau muito menor ao epitélio do íleo. No entanto, a substituição da Eae do subtipo γ pela Eae do subtipo α em uma cepa O157;H7 resultou na indução de lesões de A/E a um grau similar àquele observado para a cepa de AEEC de porco homóloga (Figura 2). Mais especificamente, a Figura 2 mostra os efeitos de mudança de subtipo de intimina de gama para alfa na porcentagem média de vilos intactos mostrando aderência

I ι

I

ΟΟ bacteriana da cepa Ο157:Η7 humana 85-170 às seções de explante do íleo. A cepa mutante duplamente complementada PCVD-438 (intimina alfa da cepa EPEC E2348/69 humana) mostra aderência similar à da cepa 1390 de porco homóloga. PICC-55 é uma cepa mutante complementada do subtipo intimina-gama (similar à cepa selvagem 85-170). Esses dados confirmam o problema do subtipo intimina-gama em aderir ao modelo de explante de íleo. Os resultados são apresentados como a média ± o desvio padrão da média. Esses resultados também sugerem que a Eae do subtipo γ das cepas O157:H7 reconhece receptores em células epiteliais de íleo de porco pior do que a Eae dos outros subtipos conhecidos. Não obstante, esses resultados confirmam que os explantes de íleo de porco são um modelo apropriado para o exame do efeito de anticorpos específicos sobre a formação de lesões de A/E por AEEC de origem diferente.

• Bloqueio de lesões de A/E

A capacidade dos anticorpos específicos em prevenir o desenvolvimento de lesões de A/E ex vivo no modelo de cultura de explante de porco e in vivo no modelo de infecção de porco recém-nascido foi testada com a cepa 1390 de porco homóloga e cepas de AEEC heterólogas diferentes. Os resultados mostraram que os anticorpos específicos para o terminal maduro e carbóxi de Eae, Tir e Paa, no caso da cepa 1390 de porco homóloga, são capazes de bloquear significantemente o desenvolvimento de lesões de A/E em explantes de íleo, para a cepa homóloga 1390 (Figura 3). Mais especificamente, a Figura 3 mostra o efeito de anticorpos sobre a porcentagem média de vilos intactos mostrando a aderência quando infectados pela cepa 1390 de porco. 1390 anti-T(-) é um controle positivo para aderência. Os resultados mostram uma diminuição significante na aderência bacteriana (* no alto da coluna) com anti-EaeC, anti-EaeM, anti-Tir e anti-PaaM. Os resultados são apresentados como a média ± o desvio padrão da média. Um teste Kruskal-Wallis foi realizado com software comercialmente disponível, e comparações post hoc 2-em-2 foram feitas para avaliar diferenças entre os grupos; P < 0,0001 foi considerado como sendo significante.

Os resultados mostram que os anticorpos específicos para o

co terminal maduro e carbóxi de Eae, Tir e Paa, no caso de cepa 1390 de porco homóloga, são capazes de bloquear significantemente (* no alto da coluna) o desenvolvimento de lesões de A/E nos explantes de íleo para todas as cepas de AEEC testadas de bezerros (Figura 4), e ser humano, o último incluindo ambas cepa EHEC O157:H7 (Figuras 5 e 6) e EPEC (Figura 7). Os anticorpos anti-EspA, anti-EspB e anti-EspD não afetaram o desenvolvimento de lesões de A/E por nenhuma das cepas de AEEC testadas, com a exceção de uma cepa de EPEC humana, para a qual os anticorpos anti-EspA não bloquearam significantemente o desenvolvimento de lesões de A/E (Figura 7). Anticorpos anti-Paa não bloquearam o desenvolvimento de lesões de A/E devido à sua cepa de EPEC humana que produziu Eae mas não Paa. Desse modo, os anticorpos anti-Eae maduros, anti-Tir e anti-Paa, e possivelmente os anticorpos anti-EspA, foram considerados como candidatos potenciais para o bloqueio do desenvolvimento de lesões de A/E in vivo.

Mais especificamente, a Figura 4 mostra o efeito de anticorpos sobre a porcentagem média de vilos intactos mostrando aderência quando infectados pela cepa bovina B00-H854. B00-H854 representa a cepa sozinha, enquanto que B00-H854 anti-T(-) é um controle positivo para aderência. Os resultados mostram uma diminuição significante na aderência bacteriana (* no alto da coluna) com anti-EaeC, anti-EaeM e anti-Tir, e, a um grau menor, com anti-PaaM. Os resultados são apresentados como a média ± o desvio padrão da média. Um teste Kruskal-Wallis foi realizado com software comercialmente disponível, e comparações post hoc 2-em-2 foram feitas para avaliar a diferença entre os grupos; PP < 0,0001 foi considerado como sendo significante.

A Figura 5 mostra o efeito de anticorpos sobre a porcentagem média de vilos intactos mostrando aderência quando infectados pela cepa STJ348 EHEC Ο157Ή7. STJ348 representa a cepa sozinha, enquanto que STJ348 anti-T(-) é um controle positivo para aderência, e ICC-170 é uma cepa mutante eae usada como um controle negativo. Os resultados mostram uma diminuição significante na aderência bacteriana (* no alto da coluna) com anti-Tir, anti-EaeM, e, em um menor grau, com anti-PaaC e anti-EaeC.

Os resultados são representados como a média ± o desvio padrão da média.

Um teste Kruskal-Wallis foi realizado com software comercialmente disponível, e comparações post hoc 2-em-2 foram feitas para avaliar a diferença entre os grupos; PP < 0,0001 foi considerado como sendo significante.

A Figura 6 mostra o efeito de anticorpos sobre a porcentagem média de vilos intactos mostrando aderência quando infectados pela cepa 85-170 EHEC O157:H7. 85-170 representa a cepa sozinha, enquanto que 85-170 anti-T(-) é um controle positivo para aderência, e ICC-170 é uma cepa mutante eae usada como um controle negativo. Os resultados mostram uma diminuição significante na aderência bacteriana (* no alto da coluna) com, anti-EaeM, anti-Tir, e, em um menor grau, com anti-EaeC e anti-PaaC. Os resultados são representados como a média ± o desvio padrão da média. Um teste Kruskal-Wallis foi realizado com software comercialmente disponível, e comparações post hoc 2-em-2 foram feitas para avaliar a diferença entre os grupos; PP < 0,0001 foi considerado como sendo significante.

Além disso, a Figura 7 mostra o efeito de anticorpos sobre a porcentagem média de vilos intactos mostrando aderência quando infectados pela cepa E2348/69 EPEC. E2348/69 representa a cepa sozinha, enquanto que E2348/69 anti-T(-) é um controle positivo para aderência. Os re20 sultados mostram uma diminuição significante na aderência bacteriana (* no alto da coluna) com anti-EspA, anti-EaeC, anti-Tir, e, anti-EaeM. Os resultados são representados como a média ± o desvio padrão da média. Um teste Kruskal-Wailis foi realizado com software comercial mente disponível, e comparações post hoc 2-em-2 foram feitas para avaliar a diferença entre os gru25 pos; PP < 0,0001 foi considerado como sendo significante.

e) Habilidade de anticorpos de gema de ovo apropriados em prevenir o desenvolvimento de colonização intestinal e diarréia in vivo em modelos de infecção experimental de porcos recém-nascidos e desmamados

Uma vez que experimentos de desafio in vivo em porcos são caros e consomem tempo, os inventores decidiram focar na avaliação de um efeito dos anticorpos anti-Eae sobre o desenvolvimento de lesões de A/E in vivo. Usando o modelo de porquinho recém-nascido privado de colostro, foi demonstrado que a administração oral dos anticorpos de gema de ovo antiEae purificados significantemente inibiu o desenvolvimento de lesões de A/E no ceco e colo de porquinhos desafiados com a cepa AEEC de porco homóloga (Figuras 8A e 8B). Mais especificamente, a Figura 8A mostra efeitos de anticorpo no ceco, enquanto que a Figura 8B mostra efeitos de anticorpo no colo. Resultados aníi-T-(-) são de porquinhos (n=6) que receberam gemas de ovo de galinhas não-imunizadas, e representam um controle positivo para aderência, enquanto que anti-EaeM representa porquinhos (n=6) que receberam gemas de ovo contendo anticorpos anti-EaeM direcionados con10 tra intimina madura. Os resultados mostram uma diminuição significante na aderência bacteriana com anti-EaeM, quando comparado com anti-T(-). Os resultados são apresentados como a média ± o desvio padrão da média. Análise estatística está ainda em progresso.

Uma vez que cepas AEEC O157:H7 são uma causa importante de problemas em seres humanos, foi decidido também focar na avaliação do efeito dos anticorpos anti-Eae sobre o desenvolvimento de lesões de A/E in vivo em um modelo de desafio de porco 0157:H7. Foi anteriormente mostrado que as cepas O157:H7 induzem lesões de A/E a um grau maior em porquinhos alimentados com colostro do que naqueles privados de colostro.

Usando um modelo de porco de 3 dias de vida alimentado com colostro, os inventores demonstraram que administração oral dos anticorpos de gema de ovo anti-Eae purificados também inibiu o desenvolvimento de lesões de A/E no ceco e colo de porquinhos desafiados com uma cepa AEEC O157:H7 (Figuras 9A e 9B). Mais especificamente, a Figura 9A mostra efeitos do anti25 corpo no ceco, enquanto que a Figura 9B mostra efeitos de anticorpo no colo. Os resultados anti-T(-) são de porquinhos (n—5) que receberam gemas de ovo liofilizadas de galinhas não-imunizadas, e representam um controle positivo para aderência, enquanto que anti-EaeM representa porquinhos (n=5) que receberam gemas de ovo liofilizadas contendo anticorpos anti30 EaeM direcionados contra intimina madura. Os resultados mostram uma diminuição na aderência bacteriana com anti-EaeM, quando comparado com anti-T(-). Os resultados são apresentados como a média ± o desvio padrão da média. Análise estatística está ainda em progresso.

Conclusão

Desse modo, os inventores mostraram, pela primeira vez, que anticorpos oral mente administrados específicos para proteína associada à virulência de AEEC, tal como a Eae de adesão, são capazes de inibir o desenvolvimento de lesões de A/E no animal vivo. Em adição, eles mostraram que anticorpos específicos para Eae do subtipo β e produzidos por uma AEEC de origem de porco são capazes de inibir o desenvolvimento de lesões de A/E devido a uma AEEC O157:H7 de origem humana que produz Eae do subtipo γ. Juntos, todos esses resultados ex vivo e in vivo mostram que os anticorpos específicos para Eae e Tir da AEEC de porco são úteis para a inibição do desenvolvimento de lesões de A/E devido a infecções por AEEC nas várias espécies animais e em seres humanos. Anticorpos específicos para Paa são úteis, pelo menos, para a inibição de desenvolvimento de lesões de A/E devido à AEEC homóloga à cepa usada para preparação dos anticorpos Paa.

Tabela 1. Sorogrupos e sorotipos de AEEC

EHEC de Humano
Sorogrupo	0157, 0111,026
Sorotipo	04.H-; 05.H-; O16.H6; O26.H11; O26.H21; O26.H32; O46.H31; O48.H21; O55.H7; 091.H10; 091.H21; O98.H-; 0111.H2; 0111.H8; O111.H-; O113.H21; O117.H14; O118.H12; O119.H6; O125.H-; 0126.H8; O128.H2; O145.H-; O157.H7; O157.H-; 0172.H-.
EPEC de Humano
Sorogrupo	026, 055, O111, 0119, 0125, 0126, 0127 e 0128
Sorotipo	O18a,c.H7; O20.H26; O20.H34; 025.H1; O26.H11; O26.H-; O44.H34; O55.H6; O55.H7; 055.H-; O86.H27; O86.H34; O86.H-; 091.H7; 091.H-; O111.H2; O111.H12; 0111.H-; O114.H10; Ο114.H32; Ο119.H6; 0119.H-; O125.H21; O125.H-; O126.H2; O126.H-; O127.H9; O127.H21; O127.H40; O127.H-; O128.H2; O128.H7; O128.H8; O128.H12; O128.H-; O142.H6; O158.H23.
EPEC de coelho
Coelho recém-nascido Sorogrupo	02, 08, 015, 0103, 0109
Coelho desmamado Sorogrupo	015, 020, 025, 0103, 0109, 0128, 0132
EPEC de porco
Sorogrupo	045.0103, 0108, NT
EPEC de qado
Sorogrupo	05, 026, 011, 0118

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Tabela 2: Cepas bacterianas e características

Cepas bacterianas	Descrição e origem	Sorotipo	Características genéticas
P86-1390	EPEC de porco	045	eaejS+ espA + tir+, paa+
C89-4221	EPEC de cão	0112ab	eaea+, espA+,tir+,paa+
C86-4225	EPEC de cão	049	eaeõ+, espA+, tir+,paa+
RDEC-1	EPEC de coelho	015 : NM	eae/3+, espA+ tir+, paa+
E22	EPEC de coelho	0103Ή2	eae/3+, espA+, tir+,paa+
97-5899-175	EPEC de coelho	Não-tipifica- da	eaep+, espA+_} tir+,paa-
96-1744-174	EPEC e coelho	Tipificação não-especí- fica	ΘΘθβ+ espA+, tir+,paa+
97-1746-175	EPEC de coelho	055	eaea+ espA+, tir+, paa+
E2348/69	EPEC de ser humano EHEC	O127:H6	eaea+, espA+ tir+, paa-
STJ348	O157:H7	eaey+, espA+, tir+, paa+
EC505	EHEC	O157:H7	eaeyf espA+, tir+, paa+
STJ919	EHEC	O157:H7	eaeyf espA+, tir+,paa+
STJ854	EHEC	O157:H7	eaey+, espA+, tir+, paa+
43888	EHEC, negativo para genes vt	O157:H7	eaey+, espA+, tir+, paa+
43895	EHEC	O157:H7	eae?+, espA+, tir+ , paa+
85-170	EHEC isolado dos Estados Unidos, curado do fago codificando verotoxina	O157:H7	eaey+Avt- e$pA+, tir+, paa+
ICC-170	EHEC	O157:H7	Aeae-, Avt-, espA+, tir+, paa+
PCVD-438	EHEC	O157:H7	eaea+^c, Avt-, espA+, tír+, paa+
PICC-55	EHEC	O157:H7	eaey+^c, Avt-, espA+, tir+, paa+
BOO-H854	EPEC de bovino	045	eaee+, espA+, tir+, paa+
BOO-5999	EPEC de bovino	026	eae/3+, espA+, tir+ paa+
FH1299	EHEC não-0157	026	θ3Θβ+, espA+, tir+ paa+
FH894	EHEC não-0157	045	eaee+, espA+, tir+, paa+
FH303	EHEC não-0157	0103	eaes+, espA+, tir+, paa+

I

Tabela 3. Produtos de Primers e PCR

Genes	Sequência de iniciadores 5-3'	Amplicon tamanho (pb)
Eae carbóxi	F R	GGATCCGCAACAACCGATCAGAAT CTCGAGTTTTACACAAACAGGAAA	702
Eae maduro	F R	GGATCCAATGGTGAAAAT AAGCTTTTTTACACAAACAGG	2712
EspA	F R	GGATCCATGGATACATCAACTGCA CTCGAGTTTACCAAGGGATA	585
EspB	F R	GGATCCATGAATACTATTGATTAT CTCGAGACCAGCTAAGCGAACCGA	954
EspD	F R	GGATCCATGCTTAATGTAAATAGC CTCGAGAACTCGACCACTAACAAT	1152
Tir	F R	GAGCTCATGCCTATTGGTAAT AAGCTTAACGAAACGTGCGG	1626
Paa Carbóxi	F R	GGATCCCTTTATCTGCGAAAAA CTCGAGAGTGCCTTTCCTGG	488
Paa maduro	F R	GGATCCATGAGGAACATAA CTCGAGAGTGCCTTTCCTGG	765

Embora as modalidades preferidas da presente invenção tenham sido descritas em detalhes aqui e ilustradas nos desenhos acompanhantes, deve ser entendido que a invenção não é limitada a essas modali5 dades precisas e que várias mudanças e modificações podem ser realizadas nela sem se afastar do escopo ou espírito da presente invenção conforme definido nas reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de um anticorpo IgY imunologicamente específico para a proteína Paa associada à virulência de Escherichia coli de ligação e eliminação (AEEC) ;

caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para prevenir o desenvolvimento de lesões intestinais de ligação e eliminação (A/E) associadas com uma infecção por AEEC em um mamífero.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida composição é para administração oral.
3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito mamífero é selecionado do grupo consistindo em seres humanos, porcos, bovinos, ovinos, caprinos, coelhos, cachorros e gatos.
4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito mamífero é um humano.
5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a AEEC é selecionada do grupo consistindo em cepas de E. coli enteropatogênicas (EPEC) e cepas de E. coli (EHEC) entero-hemorrágicas.
6. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida composição é formulada sob a forma de uma composição farmacêutica.
7. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida composição é formulada sob a forma de uma composição nutracêutica.

Petição 870170057915, de 11/08/2017, pág. 11/11

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