CN102459605A

CN102459605A - Hmo合成

Info

Publication number: CN102459605A
Application number: CN2009801597553A
Authority: CN
Inventors: 斯特凡·詹内怀恩; 埃里克·休夫纳; 朱莉娅·帕考特
Original assignee: Jennewein Biotechnologie GmbH
Current assignee: Chr Hansen HMO GmbH
Priority date: 2009-06-08
Filing date: 2009-06-08
Publication date: 2012-05-16
Also published as: EP2440661B1; BRPI0924899B8; CN106978382A; EP2440661A1; MY182355A; AU2009347610A1; BRPI0924899A2; DK2440661T3; US8652808B2; SG176651A1; US9512433B2; JP5580408B2; MX2011013231A; JP2012529274A; NZ597129A; RU2011153792A; US20120135467A1; AU2009347610B2; ES2660698T3; PL2440661T3

Abstract

本发明涉及在培养基中稳定培养的细胞，所述细胞适应于制备寡糖，转化所述细胞使其包含至少一个编码参与寡糖合成的酶的核酸序列。此外，转化所述细胞使其包含至少一个编码糖流出转运蛋白家族的蛋白、其功能同源物或衍生物的核酸序列。此外，本发明涉及用于制备寡糖的方法，所述方法涉及以上细胞。

Description

HMO合成

本发明涉及稳定地培养于培养基中的适应于制备寡糖的细胞，转化所述细胞使其包含至少一个编码参与寡糖合成的酶的核酸序列。

例如从Dumon等(2001)已知这种细胞。

长时间来已知人母乳，除乳糖外，还包含被称为人乳寡糖(HMO)的寡糖的复杂混合物。就组成和量而言此人母乳的寡糖部分是独特的。与其他哺乳动物形成对比，人母乳包含7～12g/L的寡糖浓度，其比在大多数其他哺乳动物中高10～100倍(Boehm和Stahl，2007，Kunz等，2000，Newburg和Neubauer，1995)。

现在，属于HMO的超过80种化合物已经在结构上被表征。通常，与在人体中发现的其他寡糖不同，HMO的特征在于，在还原末端的乳糖结构部分，和在非还原末端的岩藻糖和/或唾液酸。

区分有两种基本类型：I型结构的寡糖具有与GlcNAc进行α1，4-连接的岩藻糖，而II型结构的寡糖显示GlcNAc或葡萄糖的α1，3位岩藻糖基化；任何一种类型可以包含与半乳糖进行α1，2-连接的岩藻糖。最重要的寡糖是2′-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖。

这些结构与上皮细胞表面复合糖的表位、Lewis组织-血型抗原诸如Lewis x(Le^x)(Gal(β1-4)[Fuc-(α1-3)]GlcNAc(β1))密切相关(Newburg，2001)。HMO与上皮表位的结构同源性解释了防御细菌性病原体的性质。

例如，通过使病原体与HMO而非与人黏膜表面聚糖结合能够显著减小致病大肠杆菌(Escherichia coli)(Cravioto等，1991)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)(Coppa等，2006)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(Andersson等，1986)或空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(Ruiz-Palacios等，2003)的毒力，并且与毒素如大肠杆菌(E.coli)的热稳定肠毒素的结合也是如此(Crane等，1994)。

除了所提及的在肠道中的局部作用，HMO通过进入全身循环，还能够在婴儿中诱发全身作用(Gnoth等，2001)。HMO对蛋白-碳水化合物相互作用，例如选择蛋白-白细胞结合的影响能够调节免疫反应并且减小炎性反应(Bode，2006，Kunz和Rudloff，2006)。

为降低新生儿获得感染的频率并且，因此，以及婴儿死亡率，当然非常需要广泛地给婴儿提供包括HMO的营养物。这在其中普遍并且广泛实行母乳喂养的社会中可能是容易实现的。但是一般都不是这样。

存在若干医学原因，比如可能的传染性疾病的母婴传播，所述原因在特定情况下反对母乳喂养。在很多非洲国家，例如，母乳喂养可能是在婴儿期期间感染HIV的主要原因。

同样地，文化情况可能导致拒绝母乳喂养，如在主要工业国家像，例如，美国就是这样。

由于HMO在天然源诸如其他哺乳动物的乳汁中只能以低浓度存在，所以从天然源提取寡糖不适于满足对HMO的需要。

寡糖的化学合成是费力的并且需要多个保护和脱保护步骤(Kretzschmar和Stahl，1998)，因此通常相对昂贵并且具有低的回收率。

因此，利用生物技术工程生物体发酵制备寡糖对于大规模的HMO合成是有前途的可选解决方案。

在过去的十年中，若干合成HMO的成功尝试已被发表，所述尝试使用重组大肠杆菌发酵或使用体外酶转化。这些尝试主要集中在合成属于HMO或与HMO十分相似的岩藻糖基化的化合物。

例如，若干出版物描述了以下各项的合成：Lewis结构乳-N-新岩藻戊糖(lacto-N-neofucopentaose)、乳-N-新二岩藻己糖(lacto-N-neodifucohexaose)和乳-N-新二岩藻辛糖(lacto-N-neodifucooctaose)，以及2′-和3-岩藻糖基乳糖(fucosyllactose)(Albermann等，2001，Dumon等，2006，Dumon等，2001，Dumon等，2004，Koizumi等，2000)。在这些情况中，离析物像例如乳糖的酶岩藻糖基化通过岩藻糖基转移酶(FucTs)来进行。

报道岩藻糖基化的化合物制备的多数出版物就此描述了源自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的FucTs的使用。一般，人FucTs也能够用于此目的。然而，当在细菌细胞中超表达时，来源于细菌的FucTs一般较少地倾向于产生诸如错折叠和不溶性的问题。

此外，多数公布的用于合成岩藻糖基化的化合物的系统依赖大肠杆菌的内源GDP-岩藻糖库，所述库通常用于合成包含岩藻糖的外泌多糖可拉酸(colonic acid)(Grant等，1970)。在这些情况中，GDP-岩藻糖的可用性当然是瓶颈，其限制了合成效率。

最近，本发明的发明人已经描述了利用Fkp酶的新的整细胞制备方法(Parkot等，2008)，此专利申请的全部内容通过引用结合于此。

Fkp(Coyne等，2005)，来源自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，是具有双重功能的酶，其拥有岩藻糖激酶和L-岩藻糖-1-P-鸟苷酸转移酶两种活性。因此，外源供给的岩藻糖首先被磷酸化然后被核苷酸激活从而形成重要的前体分子GDP-岩藻糖。基于Fkp的L-岩藻糖补救途径已经被成功地用于合成岩藻糖基化的寡糖(Parkot等，2008)。

虽然，在如此的生化合成的水平上，已经发展出重要策略，但是已知的用于体内寡糖合成的方法都具有一定的不足，其抑制，至多，寡糖的大规模制备。

在细胞中高速制备寡糖的实际难点一方面是细胞内大量富集制备的寡糖和核苷酸副产品，而另一方面是制备的寡糖的提取。

由于细胞内富集，所述合成反应的产物会逐渐形成对合成酶的产物抑制作用。因此在某一点，所述合成变得无效率的慢。此外，所述产物可能达到细胞毒性浓度以驱使细胞裂解或至少代谢受阻。在任何情况中，寡糖的连续细胞内制备是不可能的。

此外，能够预期过量的寡糖累积将最终导致细胞裂解和细胞死亡。此细胞裂解或之后进行的用于从所述细胞提取合成的寡糖的细胞裂解将产生目标寡糖和细胞组分(代谢产物、碎片)的复杂混合物。从此复杂混合物中纯化目标寡糖成本昂贵并且因此对于大多数寡糖来说是不经济的。

在这些条件下，生物技术寡糖制备是低效并且难以控制的，尤其因为已知的生物技术寡糖制备使用分批培养来进行，从经济角度，这种分批培养是很不令人满意的。

考虑到以上，本发明的目标是以这样的方式改进生物技术制备寡糖的方法以致所述制备变得容易和更可控，并且寡糖的产量总的来说得到提高。

根据本发明，此目标和其他目标通过提供最初提到的类型的细胞来实现，此外转化所述细胞使其包含至少一个编码糖流出转运蛋白家族(sugarefflux transporter family)蛋白、其功能同系物或衍生物的核酸序列。

本发明的目标因此完全实现。

根据本发明，理解寡糖是单糖的短的聚合物，其包含至少2个糖亚基。所述寡糖可以是亚基的支链或形成亚基的直链。此外，所述寡糖的糖亚基的特征可以是许多化学修饰。因此，根据本发明的寡糖可以包含一个或多个非糖结构部分。

根据本发明，核酸序列描述遗传密码，其由核酸聚合物像例如脱氧核糖核酸聚合物或核糖核酸聚合物代表。遗传密码因此可以包括包含蛋白形成信息的编码序列，或非编码区域，所述非编码区域包括例如启动子区域、用于结合调节或辅助化合物的区域、间隔区和影响所述核酸聚合物自身的二级或三级结构和/或参与其加工的结构序列。

根据本发明，“转化...以使其包含”涉及向细胞中插入至少一个另外的核酸序列的任何方法，其后所述核酸序列作为质粒出现在所述细胞中或被整合到所述细胞的染色体中。已知的转化方法包括例如化学转化或电穿孔。通过将至少一个另外的核酸序列的染色体整合，即使在没有选择剂的情况下，通常能够获得稳定的基因转移。为了该目的，可以用病毒或噬菌体感染所述细胞。备选地，可以应用使用例如基于病毒或转座子的系统的同源和非同源重组的其他方式。

对于生物技术应用，从细胞输出较大的寡糖是复杂的问题。这是主要的情况，因为只鉴定出了很少的涉及这种运输的细胞机制。从细胞输出寡糖很少发生的原因在于寡糖合成消耗大量的细胞资源。因此这些化合物的损失对于细胞来说通常是不利的。

此外，寡糖输出的大部分已知机制涉及寡糖的化学修饰，例如通过使它们与脂质-结构部分相连(Alaimo等，2006)。从而，寡糖不仅以膜运载，这抑制它们释放到培养基中，而且与脂质-结构部分化学连接，这降低了它们在水性介质中的溶解度。因此，这样的机制几乎不适于在大规模制备寡糖中使用。

由Liu和同事首先描述(Liu等，1999a)的大肠杆菌的糖流出转运蛋白(SET)家族包括蛋白SetA、SetB和SetC。转运蛋白的同源物(氨基酸同一性＞50％)主要在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中被发现(Liu等，1999a)。

除葡萄糖和乳糖外，SET输出蛋白(exporter protein)显示出对以下物质的底物特异性：特定单糖和二糖以及，例如，诱导物分子异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和有毒的糖类似物o-硝基苯基-β-D-硫代半乳糖苷(ONPG)(Liu等，1999b)。然而生化研究显示，例如，SetA对较大的或较庞大的分子诸如庚糖或三糖显示非常低至零转运活性。

由于以上原因，不能预期SET家族的输出蛋白将丝毫适于转运寡糖。

然而，本发明人已经发现，令人惊奇地，SET输出蛋白的超表达导致非常有效的寡糖输出。

此外，SET蛋白已经显示输出乳糖(所述合成反应的离析物之一)。因此预期，在经修饰的细胞中获得的寡糖的合成将非常低效并且缓慢地进行，这归因于离析物持续地从所述细胞中排出。

相反，本发明人已经能够首次显示，纵使SET输出蛋白超表达，在经修饰的细胞中获得的寡糖的合成也具有高的生产率。

通常，优选地，所述细胞选自由以下各项组成的组：细菌、真菌、动物和植物细胞。因此特别优选地，所述细胞是大肠杆菌细胞。

由此优势是大肠杆菌细胞提供高的代谢活性和高的繁殖率。此外，大肠杆菌是一种得到最好表征的用于分子生物学和生物技术用途的生物体。本领域中已知的用于转化和培养细菌的众多技术尤其适用于大肠杆菌。此外，在市场上可以买到具有多种遗传背景的大肠杆菌菌株。

此外，优选地，所述酶选自包含以下各项的组：糖基转移酶、Leloir类糖基转移酶、非Leloir糖基转移酶、唾液酸转移酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺转移酶、N-乙酰半乳糖胺转移酶。

根据一个实施方案，所述酶是岩藻糖基转移酶。

此外，优选地，所述糖流出转运蛋白是SetA或其衍生物。

在此情况中的优势是，在输出蛋白的SET家族的经生化表征的成员中，SetA以具有最广的底物特异性为特征。因此，使用SetA能够至少潜在地输出并因此制备最广泛多样的寡糖。

同样优选地，进一步转化所述细胞使其包含至少一个编码推动或促进寡糖合成所需离析物的输入的蛋白的核酸序列。

因此，有优势的是，细胞内的离析物浓度增加。在正常条件下，离析物诸如岩藻糖或乳糖的输入受限于相应输入蛋白(importer protein)的可用性。然而，在适应于大规模合成寡糖的细胞的情况中，离析物的输入，其依赖于输入蛋白的内源水平，可能不足以连续地给所述合成反应提供离析物。可以通过超表达各自的输入蛋白来解决此问题。

在此情况中相关的输入蛋白主要是单糖或二糖的输入蛋白诸如乳糖输入蛋白，例如大肠杆菌β-半乳糖苷通透酶(LacY)或岩藻糖输入蛋白，例如大肠杆菌岩藻糖通透酶(FucP)，但是也可以包括核苷酸和其他离析物的输入蛋白。

尤其优选地，转化所述细胞使其包含至少一个编码选自由以下各项组成的组的蛋白的核酸序列：乳糖转运蛋白、岩藻糖转运蛋白、唾液酸转运蛋白、半乳糖转运蛋白、甘露糖转运蛋白、N-乙酰葡糖胺转运蛋白、N-乙酰半乳糖胺转运蛋白、ABC转运蛋白、核苷酸激活糖的转运蛋白以及核碱基(Nucleobase)、核苷或核苷酸的转运蛋白。

就此而论，核苷酸激活糖可以是，但不限于：GDP-岩藻糖、CMP-唾液酸、UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖、GDP-甘露糖、UDP-葡糖胺或UDP-半乳糖胺。

此外，术语核碱基是指鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷是指鸟苷、胞苷、腺苷、胸苷和尿苷，而核苷酸可以是鸟苷、胞苷、腺苷、胸苷或尿苷的单磷酸、二磷酸或三磷酸酯。

此外，优选地，进一步转化所述细胞使其包含至少一个核酸序列，所述核酸序列编码选自由以下各项组成的组的蛋白：核苷酸基转移酶、鸟苷酸转移酶、尿苷酰基转移酶(uridylyltransferase)、Fkp、L-岩藻糖激酶、岩藻糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶、CMP-唾液酸合成酶、半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、甘露糖激酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶、GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖还原酶、葡糖胺激酶、葡糖胺-磷酸乙酰转移酶、N-乙酰-葡糖胺-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向异构酶、UDP-N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶。

就此而论，术语核苷酸基转移酶通常涉及能够将核苷酸转移到糖磷酸(phosphosugar)上的酶，不管它是天然存在的糖还是非天然的糖。

由此优势是，如在通过引用包含于此的Parkot等，2008中所同样描述的，细胞内核苷酸激活糖像GDP-岩藻糖的库可以得到补充。因此，使寡糖合成更有效。

此外，通常优选地，合成寡糖所涉及和/或需要的所选择的单糖、二糖或寡糖的细胞分解代谢通路至少部分失活。

此处，优势在于总的合成效率能够增加的事实。这是因为更少的指定用于寡糖合成的离析物被细胞的内源代谢所消耗的情形。

在以下描述的实施方案中，例如，使用乳糖降解缺陷型细胞。这能够通过使由lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶失活来获得。此遗传修饰防止细胞内的乳糖裂解为可快速代谢的单糖葡萄糖和半乳糖。因此，作为随后的糖基化/岩藻糖基化反应的受体分子，乳糖以较高的浓度存在。

在备选实施方案中，用于寡糖合成的细胞是，只是或除上述lαcZ缺陷型外还是，L-岩藻糖降解缺陷型的。这可以通过使fucA基因失活来获得，所述fucA基因编码岩藻糖降解通路的关键的分解代谢酶岩藻糖(fuculose)-1-磷酸醛缩酶(FucA)。

当然，还有从酶抑制剂到稳定转染的RNAi构建体的其他可用技术，可以使用所述技术以使分解代谢通路至少部分失活。

在本发明的范围内，通常优选地，所述寡糖包含至少三个亚基和/或以具有至少大约480g/mol的分子量为特征。

所有主要的重要的HMO的分子量在此阈值之上。

本发明进一步涉及用于制备寡糖的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供根据本发明的细胞，

b)在允许制备所述寡糖的条件下在培养基中培养所述细胞，

c)从所述培养基中提取所述寡糖。

在本发明的范围内，允许的条件被理解为是涉及物理或化学参数包括但不限于温度、pH、压力、渗透压和产物/离析物浓度的条件。

在具体的实施方案中，所述允许的条件可以包括30+/-20℃的温度范围、7+/-3的pH范围。

上述方法具有的优势是：寡糖能够直接从所述培养基中提取，而已知方法需要裂解所述细胞以及随后从得到的裂解液中提取寡糖。

就此而论，优选地，使用连续流式生物反应器来进行步骤b)。

优势在于，使用连续流式生物反应器，能够容易地提高制备的寡糖量。这是因为所述合成以相对高的水平连续发生的情形。

同样优选地，步骤b)中的培养基包含一种或多种选自由以下各项组成的组的物质：支持细胞生长和繁殖的基础补充剂、选择剂、基因活性的效应物以及合成寡糖所需要的离析物。

支持细胞生长和繁殖的典型补充剂是从现有技术广为人知的并且在例如Sambrook和Russel，2001中得到描述。这种基础补充剂解决培养的细胞的一般营养需要，其包含例如蛋白、碳水化合物、脂质和矿物质。

同样地，选择剂像抗生素是从现有技术例如Sambrook和Russel，2001广为人知的。可以使用这样的药剂以便使遗传修饰的细胞的培养免受竞争性生物体诸如真菌或细菌的持续污染。此外，例如在细菌群落中，可以使用选择剂以便稳定包含在质粒上的遗传信息。

可以使用基因活性的效应物以在细胞内选择性地诱导或抑制某些基因或基因的组的活性。这样的效应物在从简单的化学化合物诸如异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)到更复杂的化合物像激素的范围内。这样的基因活性的效应物是从现有技术例如从Sambrook和Russel，2001广为人知。

此外，优选地，所述离析物选自由以下各项组成的组：阿拉伯糖、苏糖、赤藓糖、核糖、核酮糖、木糖、葡萄糖、D-2-脱氧-2-氨基-葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、葡糖胺、果糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、山梨糖、岩藻糖、N-乙酰神经氨酸、糖苷、非天然糖、核碱基、核苷、核苷酸和其任何可能的二聚体或聚合物。

通常优选地，所述寡糖包含至少三个亚基和/或以具有至少大约480g/mol的分子量为特征。

根据本发明的实施方案，由上述方法制备的寡糖是岩藻糖基乳糖，在此情况中优势在于岩藻糖基乳糖是存在于HMO中的最主要的化合物中的一种。

进一步的优势从对实施方案和附图的描述得出。

不言而喻地，以上提及的特征和仍要在以下说明的特征不仅能够用于分别指定的组合，还能够用于其他组合或其自身，而不离开本发明的范围。

本发明的若干实施方案图示于附图中并且在随后的描述中得到更详细说明。在附图中：

图1显示在根据本发明修饰的革兰氏阴性细菌细胞中寡糖合成和转运的综述示意图；

图2显示在细菌培养物的细胞潮湿团块和上清液中3-岩藻糖基乳糖的测量结果，其比较不同的基因型；以及

图3显示在关于不同基因型的细菌培养物中合成的3-岩藻糖基乳糖的量之间的比较。

实施例1：在革兰氏阴性细菌细胞内的寡糖合成和转运

图1显示革兰氏阴性细菌细胞10的截面。根据本发明的革兰氏阴性细菌细胞10包括外膜11、质膜12、定位于所述外膜11和所述质膜12之间的周质间隙13、以及被所述质膜12包围在内的细胞溶胶14。所述外膜包括孔蛋白，通过所述孔蛋白水溶性化合物能够从培养基16进入周质间隙13并且反之亦然。

根据本发明的一个实施方案，所述质膜包括起第一离析物-转运蛋白17作用的FucP、起第二离析物转运蛋白18作用的LacY、和起产物输出蛋白作用的SetA。

此外，起核苷酸基转移酶20作用的Fkp和起糖基转移酶21作用的FutAco包含在细胞溶胶14中。

根据此实施方案，当将作为第一离析物22的岩藻糖和作为第二离析物23的乳糖提供给培养基16时，他们通过孔蛋白15进入周质间隙13。然后，第一离析物22由第一离析物转运蛋白17转运到细胞溶胶14中。在细胞溶胶中，第一离析物22由核苷酸基转移酶20修饰，产生核苷酸基化的第一离析物24，即GDP-岩藻糖。

第二离析物23由第二离析物输入蛋白15输入到细胞溶胶14中。

然后糖基转移酶21催化核苷酸基化的第一离析物，即GDP-岩藻糖和第二离析物，即乳糖之间的反应，产生寡糖25，3-岩藻糖基乳糖，和GDP(未显示)。

之后，寡糖25由产物输出蛋白19(SetA)从细胞溶胶14输出到周质间隙13中并且能够经由孔蛋白15离开周质间隙13，并进入培养基16。

实施例2：材料和方法

2.1表达质粒的构建和大肠杆菌菌株的开发

使用大肠杆菌JM109(DE3)(Promega；www.promega.com)作为用于开发大肠杆菌生产菌株的初始宿主菌株。用于克隆步骤的所有寡核苷酸引物列表于表1中。构建质粒pACYC-lαcY和pACYC-lαcF-setA如下：使用引物lacY NcoI正向/lacY EcoRI反向和setA NdeI正向/setA XhoI反向从大肠杆菌TOP10(Invitrogen；www.invitrogen.com)的基因组DNA扩增基因lacY(相应于GenBank登录号ACB02461)(GenBank；www.ncbi.nlm.nih.gov)和setA(相应于GenBank登录号YP_025293)(GenBank)。使PCR产物进行使用指定的酶的限制性消化，并与相应消化的表达载体pACYCDuet-1(Novagen；www.merckbiosciences.co.uk)连接。

通过限制性消化、琼脂糖凝胶电泳以及使用引物pACYCduetUP1、DuetDOWN-1-引物、DuetUP2-引物和T7-终止子-引物的测序来检验所得的质粒的基因的正确插入(数据未显示)。所用的质粒pCOLA-fkp-fucP和pET-futAco以前已经被构建(Parkot等，2008)。为获得菌株JM00、JM01和JM02，通过电穿孔将质粒的不同组合引入大肠杆菌JM109(DE3)(Dower等，1988)。所有的质粒和细菌菌株列表于表2中。

2.2大肠杆菌中岩藻糖-分解代谢的失活：

为防止外部提供的岩藻糖的降解，使编码关键分解代谢酶L-岩藻糖-1-磷酸醛缩酶的fucA基因从大肠杆菌JM109(DE3)的染色体中缺失。用于诱变过程的所有寡核苷酸引物列表于表1。为构建fucA缺失型突变体，应用Datsenko和Wanner的方法(Datsenko和Wanner，2000)，其使用引物fucA-敲除-f和fucA-敲除-r。通过PCR，使用位于染色体插入位点旁侧的引物fucA-对照-f和fucA-对照-r来确认fucA的正确缺失，并且通过将所述细菌涂板于M9基本琼脂(minimal agar)上来证实岩藻糖-阴性表型(Sambrook和Russell，2001)，所述M9基本琼脂补充岩藻糖作为唯一碳源(数据未显示)。

表1 此研究中使用的引物

*下划线的是限制性核酸内切酶的识别位点。

表2 此研究中使用的细菌菌株和质粒

Ap^R，抗氨苄青霉素的；Km^R，抗卡那霉素的；Cm^R，抗氯霉素的。

2.3培养条件和细胞提取物的制备

从过夜培养物中按1∶100将大肠杆菌菌株接种到100mL矿物培养基中(Samain等，1999)，所述矿物培养基包含7.0g L^-1 NH₄H₂PO₄、7.0g L^-1K₂HPO₄、1.0g L^-1 MgSO₄x7H₂O、0.5g L^-1柠檬酸、2.0g L^-1 KOH、0.0045g L^-1硫胺·HCl和7.5mL L^-1痕量矿物溶液。痕量矿物储液包含70mM次氮基三乙酸酯(pH 6.5)、7.5g L^-1柠檬酸铁、1.3g L^-1 MnCl₂x4H₂O、0.21g L^-1 CoCl₂x6H₂O、0.13g L^-1 CuCl₂x2H₂O、0.25g L^-1 H₃BO₃、1.2g L^-1ZnSO₄x7H₂O和0.15g L^-1 Na₂MoO₄x2H₂O。所述培养基补充有0.1％葡萄糖和1％甘油作为碳源，并且补充有100μg mL^-1氨苄青霉素、50μg mL^-1卡那霉素和/或20μg mL^-1氯霉素，随后在提供优质通风的37℃旋转摇床中温育。

当所述培养物达到约1.0的光密度值(OD_600nm)时，以0.5mM的浓度添加诱导物异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)，并且在28℃在连续振荡下过夜温育所述培养物。在大约16个小时后，添加40mM L-岩藻糖和20mM乳糖。然后继续在28℃在连续振荡下温育所述培养物。

在若干时间点，收集20mL所述培养物的样品，并且通过离心捕获细胞。分离培养物上清液并且立即通过高效阴离子交换层析(HPAEC)分析或存储于-20℃。用PBS洗涤细胞沉淀(pellet)(Sambrook和Russell，2001)，并将其重悬在5倍所述沉淀重量的蒸馏水中，并且通过煮沸10min来将其裂解。为获得细胞内级分，通过离心分离细胞碎片并且将清澈的细胞裂解液存储于-20℃或立即通过HPAEC分析。

2.4SDS-PAGE

通过SDS-PAGE来检验异源蛋白的表达(Sambrook和Russell，2001)(数据未显示)。在1xSDS凝胶上样缓冲液中制备蛋白提取物，并且用考马斯亮蓝来给聚丙烯酰胺凝胶染色。

2.5通过高效阴离子交换层析-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)检测寡糖

通过使用Decade II脉冲安培检测器(PAD)(Antec Leyden；www.antec-leyden.nl)和连接到HPLC系统(Shimadzu；www.shimadzu.eu)的CarboPac PA20柱(Dionex；www.dionex.com)的高效阴离子交换层析(HPAEC)来分析样品。所述检测器灵敏度设为50μA，且应用脉冲电压是0.05-V。

用10mM氢氧化钠以0.4mL min^-1的流速洗脱单糖、二糖和寡糖。在用10mM NaOH等度洗脱30min后，用200mM NaOH洗涤柱20min以获得恒定的保留时间，此后用10mM NaOH重建20min。对所有分析的样品，将20μL 1∶2 dH₂O稀释的溶液用于HPAEC分析。经由HPAEC-PAD的分析显示在所用的HPLC柱上的保留时间关于L-岩藻糖标准物是大约3.5min，关于乳糖标准物是大约15min，而关于3-岩藻糖基乳糖标准物是大约11-12min(数据未显示)。作为碳源添加到所述培养基中的物质甘油和葡萄糖的标准物被记录为分别具有大约1.5min和7-8min的保留时间。

实施例3：3-岩藻糖基乳糖的制备以及由重组大肠杆菌依赖于SetA分泌到培养基中

本实验的目标是研究SetA介导的细胞内3-岩藻糖基乳糖的输出。将大肠杆菌菌株JM01和JM02(见表2)用于发酵实验。都表达酶Fkp和FutAco(1，3-岩藻糖基转移酶)以及转运蛋白FucP和LacY的菌株JM01和JM02，区别仅在于SetA转运蛋白的表达。JM01不过度产生SetA，而JM02过度产生SetA。

图2显示由HPAEC-PAD分析确定的在大肠杆菌培养物JM01和JM02的潮湿细胞团块和上清液中3-岩藻糖基乳糖的量。

为确定SetA超表达的效果，在诱导fkp、fucP、lacY、futAco和setA表达后7、24和32小时进行测量。

在所述图中，在大肠杆菌JM01(不超表达SetA)中测量的3-岩藻糖基乳糖的细胞外级分由柱I表示，而细胞内级分由柱II表示。在大肠杆菌JM02(超表达SetA)的情况中，3-岩藻糖基乳糖的细胞外级分由柱III表示而细胞内级分由柱IV表示。所有的值表示来自两次重复实验的平均值，误差柱表明各自的标准偏差。

这些测量显示不超表达SetA的菌株JM01在细胞溶胶级分中累积3-岩藻糖基乳糖。

相反，在超表达setA的菌株JM002的情形中的3-岩藻糖基乳糖的细胞内浓度低于检测水平。

此外，来自JM01-和JM02-培养物的上清液展示一定含量的3-岩藻糖基乳糖。因此，然而，在JM02培养物的上清液中发现的3-岩藻糖基乳糖的含量比在JM01培养物的上清液中发现的3-岩藻糖基乳糖的含量极大地增加。而在32h后，3-岩藻糖基乳糖在JM01的上清液中的浓度是大约21mg L^-1，而在JM02的情况中的3-岩藻糖基乳糖的浓度高于51mg L^-1。

在大肠杆菌JM01和JM02的培养物中的3-岩藻糖基乳糖的总量的比较绘制在图3中。

此处，在大肠杆菌JM01培养物中的3-岩藻糖基乳糖的总量由柱I表示而在大肠杆菌JM02培养物中的3-岩藻糖基乳糖的总量由柱II表示。再次，显示来自两次重复实验的平均值。

在32h的温育后，菌株JM02总共产生51.68mg L^-1的3-岩藻糖基乳糖，这比菌株JM01(32.99mg L^-1)多大约57％。

实施例4：讨论

HPAEC-PAD分析的实验结果显示，在不超表达SetA的菌株JM01和超表达SetA的菌株JM02之间存在合成和转运3-岩藻糖基乳糖的巨大差异。

首先，在JM02培养物的细胞潮湿团块中探测不到3-岩藻糖基乳糖，而在上清液中可以测量到高浓度的3-岩藻糖基乳糖。

这清楚地表明在大肠杆菌中超表达SetA引起3-岩藻糖基乳糖从细胞中十分有效地输出。

因此，本发明人已经表明，与从现有技术预期的相反，SetA能够有效地输出较大的寡糖，在本情况中，所述较大的寡糖以具有三个亚基和488g/mol的分子质量为特征。

相反，在JM01的潮湿细胞团块中，探测到相当大量的3-岩藻糖基乳糖，而在上清液中只存在相对很少的3-岩藻糖基乳糖。

此结果表明在不存在超表达的SetA时，3-岩藻糖基乳糖在细菌细胞的细胞溶胶内大量累积。在这些情况下在上清液中也探测到3-岩藻糖基乳糖的事实能够，根据现有知识，归因于由高的细胞内3-岩藻糖基乳糖浓度引起的增加的细菌细胞的溶解。

当比较在JM01-和JM02-培养物中的3-岩藻糖基乳糖的总量时，明显的是SetA的超表达不仅导致上清液中3-岩藻糖基乳糖浓度的增加，而且还提高了合成的3-岩藻糖基乳糖的总量(见图3)。

此总合成效率的增加可以归因于超表达SetA的细胞的更高的细胞生存能力，该生存能力将归因于产物细胞毒性的避免。备选地或此外，总合成效率的增加也可以归因于对合成酶的产物抑制作用的避免，而所述避免则归因于由超表达的SetA介导的产物输出。

因此，本发明人已经表明，SetA转运蛋白的超表达是提高寡糖合成产量的有效方式，其通过采用可培养的细胞的生物技术方法实现。此外，由于能够大部分避免对相关合成酶的产物抑制作用和合成产物的细胞毒性，所述制备变得容易并且更加可控。

参考文献列表

Alaimo，C，Catrein，I.，Morf，L.，Marolda，C.L.，Callewaert，N.，Valvano，M.A.，Feldman，M.F.& M.Aebi，(2006)Two distinct but interchangeablemechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides(翻转连接有脂质的寡糖的两个不同但可交换的机制).EMBO J(欧洲分子生物学组织杂志)25(5)：967-976.

Albermann，C.，W.Piepersberg & U.F.Wehmeier，(2001)Synthesis of themilk oligosaccharide 2′-fucosyllactose using recombinant bacterial enzymes(使用重组细菌酶合成乳寡糖2′-岩藻糖基乳糖).Carbohydr Res(碳水化合物研究)334：97-103.

Andersson，B.，O.Porras，L.A.Hanson，T.Lagergard & C.Svanborg-Eden，(1986)Inhibition of attachment of Streptococcus pneumoniae andHaemophilus influenzae by human milk and receptor oligosaccharides(人乳和受体寡糖抑制肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的附着).J Infect Dis(传染病杂志)153：232-237.

Bode，L.，(2006)Recent advances on structure，metabolism，and function ofhuman milk oligosaccharides(有关人乳寡糖的结构、代谢和功能的最新进展).J Nutr(营养学杂志)136：2127-2130.

Boehm，G.&B.Stahl，(2007)Oligosaccharides from milk(来自乳汁的寡糖).J Nutr(营养学杂志)137： 847S-849S.

Coppa，G.V.，L.Zampini，T.Galeazzi，B.Facinelli，L.Ferrante，R.Capretti &G.Orazio，(2006)Human milk oligosaccharides inhibit the adhesion to Caco-2cells of diarrea pathogens：Escherichia coli，Vibrio cholerae，and Salmonellafyris(人乳寡糖抑制痢疾病原体：大肠杆菌、霍乱弧菌和法里斯沙门氏菌粘附到Caco-2细胞).PediatrRes(儿科研究)59：377-382.

Coyne，M.J.，B.Reinap，M.M.Lee & L.E.Comstock，(2005)Humansymbionts use a host-like pathway for surface fucosylation(人共生生物使用与宿主相似的通路用于表面岩藻糖基化).Science(科学)307：1778-1781.Crane，J.K.，S.S.Azar，A.Stam & D.S.Newburg，(1994)Oligosaccharidesfrom human milk block binding and activity of the Escherichia coliheat-stable enterotoxin(STa)in T84 intestinal cells(来自人乳的寡糖阻断T84肠细胞中的大肠杆菌热稳定肠毒素(STa)的结合和活性).J Nutr(营养学杂志)124：2358-2364.

Cravioto，A.，A.Tello，H.Villafan，J.Ruiz，S.del Vedovo & J.R.Neeser，(1991)Inhibition of localized adhesion of enteropathogenic Escherichia colito HEp-2 cells by immunoglobulin and oligo saccharide fractions of humancolostrum and breast milk(人初乳和母乳的免疫球蛋白和寡糖级分抑制致肠病的大肠杆菌局部粘附到HEp-2细胞).J Infect Dis(传染病杂志)163：1247-1255.

Datsenko，K.A.，和B.L.Wanner.2000.One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products(使用PCR产物一步法失活大肠杆菌K-12中的染色体基因).Proc Natl Acad Sci U SA(美国国家科学院院报)97：6640-5.

Dower，W.J.，J.F.Miller，和C.W.Ragsdale.1988.High efficiencytransformation of E.coli by high voltage electroporation(通过高压电穿孔高效转化大肠杆菌).Nucleic Acids Res(核酸研究)16：6127-45.

Dumon，C，C.Bosso，J.P.Utille，A.Heyraud & E.Samain，(2006)Productionof Lewis x tetrasaccharides by metabolically engineered Escherichia coli(通过代谢工程大肠杆菌制备Lewis x四糖).Chembiochem(化学生物化学)7：359-365.

Dumon，C，B.Priem，S.L.Martin，A.Heyraud，C.Bosso & E.Samain，(2001)In vivo fucosylation of lacto-N-neotetraose and lacto-N-neohexaose byheterologous expression of Helicobacter pylori alpha-1，3 fucosyltransferase inengineered Escherichia coli(通过在工程大肠杆菌中异源表达幽门螺杆菌α-1，3岩藻糖基转移酶进行乳糖-N-新四糖和乳糖-N-新己糖的体内岩藻糖基化).Glycoconj J(复合糖杂志)18：465-474.

Dumon，C，E.Samain & B.Priem，(2004)Assessment of the two Helicobacterpylori alpha-1，3-fucosyltransferase ortholog genes for the large-scalesynthesis of LewisX human milk oligosaccharides by metabolicallyengineered Escherichia coli(评估用于通过代谢工程大肠杆菌大规模合成LewisX人乳寡糖的两个幽门螺杆菌α-1，3岩藻糖基转移酶直向同源基因).Biotechnol Prog (生物技术进展)20：412-419.

Gnoth，M.J.，S.Rudloff，C.Kunz & R.K.Kinne，(2001)Investigations of thein vitro transport of human milk oligosaccharides by a Caco-2 monolayerusing a novel high performance liquid chromatography-mass spectrometrytechnique(使用新型高效液相色谱-质谱技术研究由Caco-2单层进行的人乳寡糖的体外转运).J Biol Chem(生物化学杂志)276：34363-34370.

Grant，W.D.，I.W.Sutherland & J.F.Wilkimson，(1970)Control of colanicacid synthesis(可拉酸合成的控制).J Bacteriol(细菌学杂志)103：89-96.

Koizumi，S.，T.Endo，K.Tabata，H.Nagano，J.Ohnishi & A.Ozaki，(2000)Large-scale production of GDP-fucose and Lewis X by bacterial coupling(通过细菌偶联大规模制备GDP-岩藻糖和Lewis X).J Ind MicrobiolBiotechnol(工业微生物和生物技术杂志)25：213-217.

Kretzschmar，G.& W.Stahl，(1998)Large scale synthesis of linker-modifiedsialyl-Lewis(X)，Lewis(X)and N-acetyllactosamine(大规模合成连接体修饰的唾液酸基-Lewis(X)、Lewis(X)和N-乙酰基乳糖胺).Tetrahedron(四面体)54：6341-6358.

Kunz，C.& S.Rudloff，(2006)Health promoting aspects of milkoligosaccharides(乳寡糖的健康促进方面).Int Dairy J(国际乳品杂志)16：1341-1346.

Kunz，C.，S.Rudloff，W.Baier，N.Klein & S.Strobel，(2000)Oligosaccharides in human milk：structural，functional，and metabolic aspects(人乳中的寡糖：结构、功能和代谢方面).Annu Rev Nutr(营养学年鉴)20：699-722.

Liu，J.Y.，P.F.Miller，M.Gosink & E.R.Olson，(1999a)The identification ofa new family of sugar efflux pumps in Escherichia coli(大肠杆菌中糖流出泵新家族的鉴定).Mol Microbiol(分子微生物学)31：1845-1851.

Liu，J.Y.，P.F.Miller，J.Willard & E.R.Olson，(1999b)Functional andbiochemical characterization of Escherichia coli sugar efflux transporters(大肠杆菌糖流出转运蛋白的功能和生化性质).Journal of BiologicalChemistry(生物化学杂志)214：22977-22984.

Newburg，D.S.，(2001)Bioactive components of human milk：evolution，efficiency，and protection(人乳的生物活性组分：进化、效率和保护).AdvExp Med Biol(实验医学与生物学进展)501：3-10.

Newburg，D.S.& S.H.Neubauer，(1995)Carbohydrates in milk(乳汁中的碳水化合物).在：Handbook of Milk Composition(乳汁组成手册).R.G.Jensen(编).San Diego，CA：Academic Press(学术出版社)，第273-349页.

Parkot，J.，E.Hüfner & S.Jennewein，(2008)Synthesis of fucosylatedcompounds(岩藻糖基化化合物的合成).European patent application(欧洲专利申请)EP08172267.

Ruiz-Palacios，G.M.，L.E.Cervantes，P.Ramos，B.Chavez-Munguia & D.S.Newburg，(2003)Campylobacter jejuni binds intestinal H(O)antigen(Fuc α1，2 Gal β1，4 GlcNAc)，and fucosyloligosaccharides of human milk inhibit itsbinding and infection(空肠弯曲杆菌结合肠H(O)抗原(Fuc α1，2 Gal β1，4GlcNAc)，以及人乳的岩藻糖基寡糖抑制其结合和感染).J Biol Chem(生物化学杂志)278：14112-14120.

Samain，E.，V.Chazalet & R.A.Geremia，(1999)Production of O-acetylatedand sulfated chitooligosaccharides by recombinant Escherichia coli strainharboring different combinations of nod genes(通过载有nod基因不同组合的重组大肠杆菌菌株制备O-乙酰化和硫酸化壳寡糖).J Biotechnol(生物技术杂志)72：33-47.

Sambrook，J.& D.W.Russell，(2001)Molecular cloning：a laboratory manual(分子克隆：实验手册).Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor，NY.

Claims

1.在培养基中稳定培养的细胞，所述细胞适应于制备寡糖，转化所述细胞使其包含至少一个编码参与寡糖合成的酶的核酸序列，

其特征在于

另外转化所述细胞使其包含至少一个编码糖流出转运蛋白家族的蛋白、其功能同源物或衍生物的核酸序列。

2.根据权利要求1的细胞，其特征在于所述细胞选自由细菌、真菌、动物和植物细胞组成的组。

3.根据权利要求2的细胞，其特征在于所述细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。

4.根据权利要求1至3中任一项的细胞，其特征在于所述酶选自包括以下各项的组：糖基转移酶、Leloir型糖基转移酶、非Leloir糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、半乳糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺转移酶、N-乙酰半乳糖胺转移酶。

5.根据权利要求4的细胞，其特征在于所述酶是岩藻糖基转移酶。

6.根据权利要求1至5中任一项的细胞，其特征在于所述糖流出转运蛋白是SetA或其衍生物。

7.根据权利要求1至6中任一项的细胞，其特征在于进一步转化所述细胞以使其包含至少一个编码推动或促进寡糖合成所需离析物的输入的蛋白的核酸序列。

8.根据权利要求7的细胞，其特征在于转化所述细胞以使其包含至少一个编码选自由以下各项组成的组的蛋白的核酸序列：乳糖转运蛋白、岩藻糖转运蛋白、唾液酸转运蛋白、半乳糖转运蛋白、甘露糖转运蛋白、N-乙酰葡糖胺转运蛋白、N-乙酰半乳糖胺转运蛋白、ABC-转运蛋白、核苷酸激活糖的转运蛋白和核碱基、核苷或核苷酸的转运蛋白。

9.根据权利要求1至8中任一项的细胞，其特征在于进一步转化所述细胞以使其包含至少一个编码选自由以下各项组成的组的蛋白的核酸序列：核苷酸基转移酶、鸟苷酸转移酶、尿苷酰基转移酶、Fkp、L-岩藻糖激酶、岩藻糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶、CMP-唾液酸合成酶、半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、甘露糖激酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶、GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖还原酶、葡糖胺激酶、葡糖胺-磷酸乙酰转移酶、N-乙酰-葡糖胺-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向异构酶、UDP-N-乙酰-葡糖胺2-差向异构酶。

10.根据权利要求1至9中任一项的细胞，其特征在于所述细胞包含关于所选的单糖、二糖或寡糖的分解代谢通路，所述分解代谢通路至少部分失活，所述单糖、二糖或寡糖参与所述寡糖合成和/或为所述寡糖合成所需。

11.根据权利要求1至10中任一项的细胞，其特征在于所述寡糖包含至少三个亚基和/或以具有至少大约480g/mol的分子量为特征。

12.用于制备寡糖的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供根据权利要求1至11中任一项的细胞，

b)在培养基中在允许制备所述寡糖的条件下培养所述细胞，

c)从所述培养基中提取所述寡糖。

13.根据权利要求12的方法，其特征在于使用连续流式生物反应器来进行步骤b)。

14.根据权利要求12或13的方法，其特征在于，在步骤b)中的培养基包含一种或多种选自由以下各项组成的组的物质：支持细胞生长和繁殖的基本补充剂、选择剂、寡糖合成所需的离析物、基因活性的效应物。

15.根据权利要求14的方法，其特征在于所述离析物选自由以下各项组成的组：阿拉伯糖、苏糖、赤藓糖、核糖、核酮糖、木糖、葡萄糖、D-2-脱氧-2-氨基-葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、葡糖胺、果糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、山梨糖、岩藻糖、N-乙酰神经氨酸、糖苷、非天然糖、核碱基、核苷、核苷酸和其任何可能的二聚体或聚合物。

16.根据权利要求12至15中任一项的方法，其特征在于所述寡糖包含至少三个亚基和/或以具有至少大约480g/mol的分子量为特征。

17.根据权利要求16的方法，其特征在于所述寡糖是岩藻糖基乳糖。