CN114410493A

CN114410493A - 在重组宿主中生产甜菊醇糖苷

Info

Publication number: CN114410493A
Application number: CN202111648207.6A
Authority: CN
Inventors: 韦罗尼克·杜尚; 迈克尔·达尔埃格德·米克尔森; 艾本·默勒-汉森
Original assignee: Evolva AG
Current assignee: Evolva Holding SA
Priority date: 2014-08-11
Filing date: 2015-08-07
Publication date: 2022-04-29
Also published as: MX2017001859A; CN106572688A; CN106572688B; KR20170041209A; AU2015303294A1; BR112017002783A2; EP3179869A1; US20200024630A1; US20170218418A1; SG10201901007PA; CA2957331A1; JP2017528125A; US11168343B2; US20220127655A1; WO2016023844A1; US10421983B2; SG11201700651RA

Abstract

本发明涉及在重组宿主中生产甜菊醇糖苷。本发明涉及用于生产甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体的重组微生物和方法。

Description

在重组宿主中生产甜菊醇糖苷

本申请是申请号为201580039715.0的中国专利申请的分案申请，原申请是2015年8月7日提交的PCT国际申请PCT/EP2015/068314于2017年2月10日进入中国国家阶段的申请。

技术领域

本公开内容一般地涉及通过重组宿主(例如重组微生物)的甜菊醇糖苷(steviolglycoside)例如莱鲍迪苷(rebaudioside)A(RebA)，莱鲍迪苷B(RebB)，莱鲍迪苷D(RebD)和莱鲍迪苷M(RebM)的重组生产及其分离方法。特别地，本公开内容涉及对重组宿主中的转运系统的修饰，以使这些甜菊醇糖苷的生产和/或使这些甜菊醇糖苷向培养基中的转运增加。

背景技术

甜味剂作为最常用于食品、饮料或糖果业的成分是公知的。甜味剂既可以在生产过程中加入最终食品，也可以在适当稀释的情况下作为佐餐甜味剂(tabletop sweeter)或者作为烘培中糖的家用替代品单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(例如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)和人工甜味剂(例如阿斯巴甜、糖精和三氯半乳蔗糖(sucralose))。甜菊提取物(stevia extract)是可从多年生灌木甜菊(Steviarebaudiana)中分离和提取的天然甜味剂。甜菊在南美洲和亚洲被普遍种植用于商业生产甜菊提取物。各种程度纯化的甜菊提取物在商业中用作食品中的高甜度甜味剂，以及在共混物中或单独地作为佐餐甜味剂。

图1中显示了几种甜菊醇糖苷的化学结构，包括二萜甜菊醇和多种甜菊醇糖苷。甜菊植物的提取物通常包含有助于甜味的莱鲍迪苷和其他甜菊醇糖苷，尽管每种甜菊醇糖苷的量通常在不同的生产批次之间不同。

由于从甜菊植物中回收和纯化甜菊醇糖苷已被证明是劳动密集型的和低效的，因此仍然需要可以高产率生产所需甜菊醇糖苷(如RebD和RebM)的重组生产系统。

发明内容

与上述背景相反，本发明提供了优于现有技术的某些优点和进步。

特别地，本发明提供了能够合成甜菊醇糖苷的重组宿主，其包含编码转运蛋白(transporter)多肽的基因和/或编码调节至少一种转运蛋白基因表达的转录因子多肽的基因；其中编码所述转运蛋白多肽的基因和/或编码所述调节至少一种转运蛋白基因表达的转录因子多肽的基因之表达被修饰，并且所述重组宿主将至少一部分所述合成的甜菊醇糖苷从所述宿主转运到培养基中。

在本文公开的重组宿主的一些方面中，所述编码转运蛋白多肽的基因是内源基因。

在本文公开的重组宿主的一些方面中，所述转运蛋白多肽包括ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白、主要促进子超家族(major facilitator superfamily，MFS)转运蛋白、氨基酸/生长素通透酶(amino acid/auxin permease，AAAP)家族转运蛋白、ATP酶转运蛋白、硫酸盐通透酶(sulfate perm ease，SulP)家族转运蛋白、溶酶体胱氨酸转运蛋白(lysosomal cystine transporter，LCT)家族转运蛋白、Ca2+：阳离子反向转运蛋白(Ca2+：cation antiporter，CaCA)家族转运蛋白、氨基酸-多胺-有机阳离子(amino acid-polyamine-organocation，APC)超家族转运蛋白、多药/寡糖基脂质/多糖(multidrug/oligosaccharidyl-lipid/polysaccharide，MOP)转运蛋白、ZRT/IRT样蛋白(ZRT/IRT-likeprotein，ZIP)金属转运蛋白家族转运蛋白、线粒体蛋白移位酶(mitochondrial proteintranslocase，MPT)家族转运蛋白、电压门控离子通道(voltage-gated ion channel，VIC)家族转运蛋白、单价阳离子：质子反向转运蛋白-2(cation：proton antiporter-2，CPA2)家族转运蛋白、推定的跨膜氨基酸外排转运蛋白ThrE家族、寡肽转运蛋白(oligopeptidetransporter，OPT)家族转运蛋白、K⁺转运蛋白(K⁺ transporter，Trk)家族转运蛋白、胆汁酸：Na同向转运体(bile acid：Na symporter，BASS)家族转运蛋白、药物/代谢物转运蛋白(drug/metabolite transporter，DMT)超家族转运蛋白、线粒体运载体(mitochondrialcarrier，MC)家族转运蛋白、生长素外排运载体(auxin efflux carrier，AEC)家族转运蛋白、氨通道转运蛋白(ammonia channel transporter，Amt)家族转运蛋白、金属离子(Mn2+-铁)转运蛋白(metal ion(Mn²⁺-iron)transporter，Nramp)家族转运蛋白、瞬时受体电位Ca² ⁺通道(transient receptor potential Ca²⁺ channel，TRP-CC)家族转运蛋白、耐砷-3(arsenical resistance-3，ACR3)家族转运蛋白、核碱基：阳离子同向转运体-1(nucleobase：cation symporter-1，NCS1)家族转运蛋白、无机磷酸转运蛋白(inorganicphosphate transporter，PiT)家族转运蛋白、亚砷酸-亚锑酸盐(arsenite-antimonite，ArsAB)外排家族转运蛋白、转运蛋白IISP家族、甘油摄取(glycerol uptake，GUP)家族转运蛋白、金属离子转运(metal ion transport，MIT)家族转运蛋白、铜转运(coppertransport，Ctr)家族转运蛋白或阳离子扩散促进子(cation diffusion facilitator，CDF)家族转运蛋白。

在本文公开的重组宿主的一些方面中，修饰的表达包括：

(a)过表达所述编码转运蛋白多肽的基因和/或所述编码转录因子多肽的基因；或

(b)缺失所述编码转运蛋白多肽的基因和/或所述编码转录因子多肽的基因。

在本文公开的重组宿主的一些方面中，所述编码转运蛋白多肽的基因和/或所述编码转录因子多肽的基因具有提高的活性。

在本文公开的重组宿主的一些方面中，所述编码转运蛋白多肽基因中的一个或更多个和/或所述编码转录因子多肽的基因中的一个或更多个过表达。

在本文公开的重组宿主的一些方面中，所述转运蛋白多肽和/或转录多肽包含：SEQ ID NO：14中所示的YAL067C，SEQ ID NO：15中所示的YBL089W，SEQ ID NO：16中所示的YBL099W，SEQ ID NO：86中所示的YBR008C，SEQ ID NO：87中所示的YBR021W，SEQ ID NO：88中所示的YBR043C，SEQ ID NO：13中所示的YBR180W，SEQ ID NO：17中所示的YBR241C，SEQID NO：89中所示的YBR287W，SEQ ID NO：18中所示的YBR294W，SEQ ID NO：90中所示的YBR295W，SEQ ID NO：91中所示的YBR296C，SEQ ID NO：92中所示的YCL038C，SEQ ID NO：19中所示的YCL069W，SEQ ID NO：93中所示的YCR011C，SEQ ID NO：20中所示的YCR028C，SEQID NO：21中所示的YCR075C，SEQ ID NO：94中所示的YDL054C，SEQ ID NO：95中所示的YDL100C，SEQ ID NO：22中所示的YDL128W，SEQ ID NO：23中所示的YDL185W，SEQ ID NO：24中所示的YDL194W，SEQ ID NO：25中所示的YDL210W，SEQ ID NO：96中所示的YDL245C，SEQID NO：97中所示的YDL247W，SEQ ID NO：98中所示的YDR011W，SEQ ID NO：26中所示的YDR061W，SEQ ID NO：27中所示的YDR093W，SEQ ID NO：99中所示的YDR292C，SEQ ID NO：28中所示的YDR338C，SEQ ID NO：29中所示的YDR406W，SEQ ID NO：100中所示的YDR497C，SEQID NO：30中所示的YDR536W，SEQ ID NO：101中所示的YEL006W，SEQ ID NO：102中所示的YEL027W，SEQ ID NO：31中所示的YEL031W，SEQ ID NO：103中所示的YEL065W，SEQ ID NO：104中所示的YER019C-A，SEQ ID NO：105中所示的YER053C，SEQ ID NO：106中所示的YER119C，SEQ ID NO：32中所示的YER166W，SEQ ID NO：33中所示的YFL011W，SEQ ID NO：107中所示的YFL028C，SEQ ID NO：108中所示的YFR045W，SEQ ID NO：34中所示的YGL006W，SEQID NO：35中所示的YGL013C，SEQ ID NO：109中所示的YGL084C，SEQ ID NO：110中所示的YGL104C，SEQ ID NO：111中所示的YGL114W，SEQ ID NO：112中所示的YGL167C，SEQ ID NO：36中所示的YGL255W，SEQ ID NO：37中所示的YGR125W，SEQ ID NO：38中所示的YGR181W，SEQID NO：39中所示的YGR217W，SEQ ID NO：40中所示的YGR224W，SEQ ID NO：113中所示的YGR257C，SEQ ID NO：41中所示的YGR281W，SEQ ID NO：42中所示的YHL016C，SEQ ID NO：114中所示的YHL035C，SEQ ID NO：115中所示的YHL036W，SEQ ID NO：116中所示的YHR002W，SEQID NO：117中所示的YHR096C，SEQ ID NO：118中所示的YIL006W，SEQ ID NO：43中所示的YIL088C，SEQ ID NO：119中所示的YIL120W，SEQ ID NO：120中所示的YIL121W，SEQ ID NO：121中所示的YIL166C，SEQ ID NO：44中所示的YJL093C，SEQ ID NO：45中所示的YJL094C，SEQ ID NO：46中所示的YJL108C，SEQ ID NO：122中所示的YJL133W，SEQ ID NO：47中所示的YJL212C，SEQ ID NO：123中所示的YJL219W，SEQ ID NO：48中所示的YJR106W，SEQ ID NO：49中所示的YJR160C，SEQ ID NO：124中所示的YKL016C，SEQ ID NO：125中所示的YKL050C，SEQID NO：50中所示的YKL064W，SEQ ID NO：126中所示的YKL120W，SEQ ID NO：127中所示的YKL146W，SEQ ID NO：128中所示的YKL209C，SEQ ID NO：129中所示的YKR039W，SEQ ID NO：51中所示的YKR050W，SEQ ID NO：52中所示的YKR105C，SEQ ID NO：53中所示的YKR106W，SEQID NO：130中所示的YLR411W，SEQ ID NO：54中所示的YLR447C，SEQ ID NO：131中所示的YML038C，SEQ ID NO：55中所示的YML116W，SEQ ID NO：56中所示的YMR034C，SEQ ID NO：57中所示的YMR056C，SEQ ID NO：132中所示的YMR166C，SEQ ID NO：58中所示的YMR253C，SEQID NO：133中所示的YMR279C，SEQ ID NO：134中所示的YNL003C，SEQ ID NO：59中所示的YNL065W，SEQ ID NO：60中所示的YNL070W，SEQ ID NO：61中所示的YNL083W，SEQ ID NO：62中所示的YNL095C，SEQ ID NO：63中所示的YNL121C，SEQ ID NO：64中所示的YNL142W，SEQID NO：135中所示的YNL268W，SEQ ID NO：136中所示的YNR055C，SEQ ID NO：65中所示的YOL020W，SEQ ID NO：66中所示的YOL075C，SEQ ID NO：67中所示的YOL077W-A，SEQ ID NO：68中所示的YOL122C，SEQ ID NO：137中所示的YOL158C，SEQ ID NO：69中所示的YOR079C，SEQ ID NO：70中所示的YOR087W，SEQ ID NO：71中所示的YOR092W，SEQ ID NO：138中所示的YOR100C，SEQ ID NO：72中所示的YOR130C，SEQ ID NO：139中所示的YOR153W，SEQ ID NO：73中所示的YOR222W，SEQ ID NO：140中所示的YOR271C，SEQ ID NO：141中所示的YOR273C，SEQID NO：74中所示的YOR291W，SEQ ID NO：75中所示的YOR306C，SEQ ID NO：142中所示的YOR307C，SEQ ID NO：76中所示的YOR316C，SEQ ID NO：143中所示的YOR332W，SEQ ID NO：77中所示的YOR334W，SEQ ID NO：144中所示的YOR348C，SEQ ID NO：145中所示的YPL036W，SEQID NO：78中所示的YPL078C，SEQ ID NO：79中所示的YPL270W，SEQ ID NO：80中所示的YPL274W，SEQ ID NO：81中所示的YPR003C，SEQ ID NO：82中所示的YPR011C，SEQ ID NO：83中所示的YPR058W，SEQ ID NO：84中所示的YPR128C，或SEQ ID NO：85中所示的YPR201W。

在本文公开的重组宿主的一些方面中，以下序列得到过表达：SEQ ID NO：88中所示的YBR043C，SEQ ID NO：95中所示的YDL100C，SEQ ID NO：94中所示的YDL054C，SEQ IDNO：22中所示的YDL128W，SEQ ID NO：146中所示的YDL198C，SEQ ID NO：26中所示的YDR061W，SEQ ID NO：30中所示的YDR536W，SEQ ID NO：102中所示的YEL027W，SEQ ID NO：147中所示的YFL054C，SEQ ID NO：112中所示的YGL167C，SEQ ID NO：38中所示的YGR181W，SEQ ID NO：42中所示的YHL016C，SEQ ID NO：121中所示的YIL166C，SEQ ID NO：44中所示的YJL093C，SEQ ID NO：48中所示的YJR106W，SEQ ID NO：126中所示的YKL120W，SEQ ID NO：127中所示的YKL146W，SEQ ID NO：129中所示的YKR039W，SEQ ID NO：56中所示的YMR034C，SEQ ID NO：132中所示的YMR166C，SEQ ID NO：68中所示的YOL122C，SEQ ID NO：69中所示的YOR079C，SEQ ID NO：79中所示的YPL270W，和/或SEQ ID NO：82中所示的YPR011C。

在一些方面中，所述重组宿主还包含：

(a)编码蔗糖转运蛋白和蔗糖合酶的一种或更多种基因；

(b)编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphatesynthase，GGPPS)多肽的基因；

(c)编码E型-柯巴基二磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase，CDPS)多肽的基因；

(d)编码贝壳杉烯合酶(kaurene synthase，KS)多肽的基因；

(e)编码贝壳杉烯氧化酶(kaurene oxidase，KO)多肽的基因；

(f)编码甜菊醇合酶(steviol synthase，KAH)多肽的基因；

(g)编码细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase，CPR)多肽的基因；

(h)编码UGT85C2多肽的基因；

(i)编码UGT76G1多肽的基因；

(k)编码UGT91D2功能同源物的基因；和/或

(1)编码EUGT11多肽的基因；

其中所述基因的至少一个是重组基因；并且

其中所述宿主能够生产RebA、RebB、RebD和/或RebM中的一种或更多种。

在本文公开的重组宿主的一些方面中，所述基因中的至少一个被密码子优化以用于在宿主中表达。

在本文公开的重组宿主的一些方面中，所述基因中的至少一个被密码子优化以用于在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达。

在本文公开的重组宿主的一些方面中，

(a)所述GGPPS多肽包含与SEQ ID NO：149中所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(b)所述CDPS多肽包含与SEQ ID NO：150中所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(c)所述KO多肽包含与SEQ ID NO：152中所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(d)所述KS多肽包含与SEQ ID NO：151中所示的氨基酸序列具有至少40％同一性的多肽；

(e)所述KAH多肽包含与SEQ ID NO：154中所示的氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽；

(f)所述CPR多肽包含与SEQ ID NO：153中所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽和/或与SEQ ID NO：155中所示的氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽；

(g)所述UGT85C2多肽包含与SEQ ID NO：156中所示的氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；

(h)所述UGT76G1多肽包含与SEQ ID NO：158中所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽；

(i)所述UGT74G1多肽包含与SEQ ID NO：157中所示的氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；

(j)所述UGT91D2功能同源物包含与SEQ ID NO：159中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的UGT91D2e-b多肽；和

(k)所述EUGT11多肽包含与SEQ ID NO：148中所示的氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽。

在一些方面中，本文公开的所述重组宿主包含以下微生物：植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌细胞。

在一些方面中，所述细菌细胞包含埃希氏菌属(Escherichia)细菌细胞，乳杆菌属(Lactobacillus)细菌细胞，乳球菌属(Lactococcus)细菌细胞，棒状杆菌属(Cornebacterium)细菌细胞，醋杆菌属(Acetobacter)细菌细胞，不动杆菌属(Acinetobacter)细菌细胞或假单胞菌属(Pseudomonas)细菌细胞。

在一些方面中，所述真菌细胞是酵母细胞。

在一些方面中，所述酵母细胞是来自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、产朊假丝酵母(Cyberlindnerajadinii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、多形汉逊酵母(Hansen ula polymorpha)、博伊丁念珠菌(Candida boidinii)、Arxula adeninivorans、红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)或白色念珠菌(Candida albicans)物种的细胞。

在一些方面中，所述酵母细胞是酵母菌(Saccharomycete)。

在一些方面中，所述酵母细胞是来自酿酒酵母物种的细胞。

本发明还提供了生产甜菊醇糖苷的方法，其包括：

(a)在表达本文所公开的重组宿主所包含的基因的条件下，在培养基中培养本文所公开的重组宿主，

其中所述甜菊醇糖苷由所述宿主合成；以及

(b)任选地分离所述甜菊醇糖苷。

在本文公开的所述方法的一些方面中，所述甜菊醇糖苷是RebA、RebB、RebD和/或RebM，并且其中：

(a)RebA能够在表达UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和UGT91D2的本文所公开的重组宿主中合成；

(b)RebB能够在表达UGT85C2、UGT76G1和UGT91D2的本文所公开的重组宿主中合成；

(c)RebD能够在表达UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1以及UGT91D2和/或EUGT11的本文所公开的重组宿主中合成；和

(d)RebM能够在表达UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和UGT91D2和/或EUGT11的本文所公开的重组宿主中合成。

在本文公开的所述方法的一些方面中，编码以下序列的基因过表达：SEQ ID NO：88中所示的YBR043C，SEQ ID NO：95中所示的YDL100C，SEQ ID NO：94中所示的YDL054C，SEQID NO：22中所示的YDL128W，SEQ ID NO：146中所示的YDL198C，SEQ ID NO：26中所示的YDR061W，SEQ ID NO：30中所示的YDR536W，SEQ ID NO：102中所示的YEL027W，SEQ ID NO：147中所示的YFL054C，SEQ ID NO：112中所示的YGL167C，SEQ ID NO：38中所示的YGR181W，SEQ ID NO：42中所示的YHL016C，SEQ ID NO：121中所示的YIL166C，SEQ ID NO：44中所示的YJL093C，SEQ ID NO：48中所示的YJR106W，SEQ ID NO：126中所示的YKL120W，SEQ ID NO：127中所示的YKL146W，SEQ ID NO：129中所示的YKR039W，SEQ ID NO：56中所示的YMR034C，SEQ ID NO：132中所示的YMR166C，SEQ ID NO：68中所示的YOL122C，SEQ ID NO：69中所示的YOR079C，SEQ ID NO：79中所示的YPL270W，和/或SEQ ID NO：82中所示的YPR011C。

在本文公开的所述方法的一些方面中，所述甜菊醇糖苷以约500mg/L至约10,000mg/L的浓度生产。

本发明还提供了使甜菊醇糖苷的生产或向培养基中的转运增加的方法，其包括：

(a)在表达本文所公开的宿主所包含的基因的条件下，在培养基中培养本文所公开的重组宿主，

其中所述甜菊醇糖苷由所述宿主合成；以及

(b)任选地分离所述甜菊醇糖苷。

在本文公开的所述方法的一些方面中，所述甜菊醇糖苷是RebA、RebB、RebD和/或RebM。

本发明还提供了增加重组宿主中甜菊醇或甜菊醇糖苷生产的方法，其包括修饰以下基因的表达：编码转运蛋白多肽的基因和/或编码调节至少一种转运蛋白基因表达的转录的基因，其中所述宿主能够将所生产的至少一部分甜菊醇或甜菊醇糖苷从所述宿主转运到培养基中。

从下面结合所附权利要求的本发明的详细描述中，将更全面地理解本发明的这些和其他特征和优点。注意，权利要求的范围由其中的陈述来限定，而不是由本说明书中阐述的特征和优点的具体讨论来限定。

附图说明

图1示出了多种甜菊醇糖苷的化学结构和合成途径。

图2是与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，过表达转运蛋白基因YGR181W(SEQ IDNO：38)或YDR061W(SEQ ID NO：26)的甜菊醇糖苷生产菌株上清液中RebA、RebB、RebD或RebM的量的柱状图。参见实施例4。

图3A和图3B是与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，YGR181W(SEQ ID NO：38)或YDR061W(SEQ ID NO：26)过表达菌株的上清液(图3A)或总培养物(图3B)中RebA、RebD或RebM的量(mg/L)的柱状图。参见实施例4。

在基因组上整合转运蛋白基因的产甜菊醇糖苷的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株中，13-SMG的水平在图4A示出(总水平和上清液水平；μM/OD₆₀₀)，RebA的水平在图4B示出(总水平和上清液水平；μM/OD₆₀₀)，RebB的水平在图4C示出(总水平和上清液水平；μM/OD₆₀₀)，RebD的水平在图4D示出(总水平和上清液水平；μM/OD₆₀₀)，且RebM的水平图4E示出(总水平和上清液水平；μM/OD₆₀₀)。图4A-4E的基因组上整合的转运蛋白基因是YBR043C(SEQ ID NO：88)、YEL027W(SEQ ID NO：102)、YJL093C(SEQ ID NO：44)、YJR106W(SEQ ID NO：48)、YMR166C(SEQ ID NO：132)、YIL166C(SEQ ID NO：121)、YKL120W(SEQ ID NO：126)、YDL054C(SEQ ID NO：94)、YDL128W(SEQ ID NO：22)、YDR536W(SEQ ID NO：30)、YGL167C(SEQ ID NO：112)、YKL146W(SEQ ID NO：127)、YKR039W(SEQ ID NO：129)、YOL122C(SEQ ID NO：68)和YPR011C(SEQ ID NO：82)。参见实施例6。

图5A示出了通过USER克隆系统过表达以下序列的甜菊醇糖苷生产菌株的RebA、RebB、RebD和RebM(以μM/OD₆₀₀计)的上清液水平：YMR166C(SEQ ID NO：132)、YEL027W(SEQID NO：102)、YKL120W(SEQ ID NO：126)、YIL166C(SEQ ID NO：121)、YJR106W(SEQ ID NO：48)、YJL093C(SEQ ID NO：44)和YBR043C(SEQ ID NO：88)。图5B示出了通过USER克隆系统过表达以下序列的甜菊醇糖苷生产菌株的RebA、RebB、RebD和RebM(以μM/OD₆₀₀计)的总水平：YMR166C(SEQ ID NO：132)、YEL027W(SEQ ID NO：102)、YKL120W(SEQ ID NO：126)、YIL166C(SEQ ID NO：121)、YJR106W(SEQ ID NO：48)、YJL093C(SEQ ID NO：44)和YBR043C(SEQ IDNO：88)。

具体实施方式

出于所有目的，本文中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体明确地并入本文。

在详细描述本发明之前，将定义若干术语。除非上下文明确的另有指示，本文使用的未用量词限定的名词包括复数指示物。例如，提到“核酸”意指一个/种或更多个/种核酸。

应注意，术语如“优选”、“一般”和“通常”在本文中并不是用于限制要求保护的发明的范围，或暗示某些特征对于要求保护的发明的结构或功能是关键的、必要的或甚至是重要的。相反，这些术语仅旨在突出可被用在或不被用在本发明的特定实施方案中的替选的或额外的特征。

为了描述和限定本发明的目的，应注意术语“基本上”在本文中用于表示可归因于任何定量比较、值、测量或其他表述的固有的不确定程度。术语“基本上”在本文中也用于表示在不导致所讨论主题的基本功能改变的情况下，定量表达可不同于所述参考的程度。

可使用本领域技术人员公知的方法来构建根据本发明的遗传表达构建体和重组细胞。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、体内重组技术和聚合酶链式反应(PCR)技术。参见，例如描述于如下文献中的技术：Green&Sambrook，2012，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，第四版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；Ausubel等，1989，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associates andWiley Interscience，New York，和PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Innis等，1990，Academic Press，San Diego，CA)。

本文中使用的术语“多核苷酸”、“核苷酸”“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指包括DNA、RNA、其衍生物或其组合的核酸。

如本文所用，术语“微生物”、“微生物宿主”、“微生物宿主细胞”、“宿主细胞”、“重组宿主”、“重组微生物宿主”和“重组宿主细胞”可以互换使用。如本文所用，术语“重组宿主”意指这样的宿主，其基因组已经增强(augment)至少一个DNA序列。这样的DNA序列包括但不限于非天然存在的基因、通常不转录成RNA或翻译成蛋白质(“表达的”)的DNA序列和期望引入非重组宿主中的其他基因或DNA序列。应当理解，通常通过稳定引入一个或更多个重组基因来增强本文所述的重组宿主的基因组。一般而言，引入的DNA最初不是作为DNA接受者的宿主中所固有的，而是在本公开内容的范围内从给定宿主中分离DNA片段，并随后将该DNA的一个或更多个另外的拷贝引入同一宿主中，例如用来提高基因产物的产量或改变基因的表达模式。在一些情况下，引入的DNA将通过例如同源重组或定点诱变来修饰或甚至替代内源基因或DNA序列。合适的重组宿主包括微生物。

如本文所使用的，术语“重组基因”是指引入接受者宿主的基因或DNA序列，不管相同或相似的基因或DNA序列是否可能已经存在于这样的宿主中。在本上下文中，“引入”或“增加”在本领域中已知是指人工(by the hand of man)引入或增加。因此，重组基因可以是来自另一物种的DNA序列，或者可以是源自或存在于相同物种但已通过重组方法并入宿主以形成重组宿主的DNA序列。应当理解，引入宿主的重组基因可以与正常存在于被转化宿主中的DNA序列相同，并且被引入以提供所述DNA的一个或更多个另外的拷贝，从而允许该DNA基因产物的过表达或经修饰表达。所述重组基因特别地由cDNA编码。

如本文所用，术语“改造的生物合成途径”是指在如本文所述的重组宿主中发生并且不天然发生于宿主中的生物合成途径。

如本文所用，术语“内源”基因是指源自特定生物体、组织或细胞并在其中产生或合成的基因。在一些实施方案中，内源基因是酵母转运蛋白。在一些实施方案中，转运蛋白对酿酒酵母，包括但不限于酿酒酵母菌株S288C是内源的。在一些实施方案中，内源酵母转运蛋白基因过表达。如本文所用，术语“过表达”用于指生物体中基因以高于野生型生物体中基因表达水平的水平表达。参见例如Prelich，2012，Genetics 190：841-54。在一些实施方案中，使内源酵母转运蛋白基因缺失。参见例如，Giaever&Nislow，2014，Genetics 197(2)：451-65。如本文所用，术语“缺失”、“缺失的”，“敲除”和“敲除的”可互换使用，指已被操作变得不再在生物体中表达的内源基因，所述生物体包括但不限于酿酒酵母。在一些实施方案中，缺失/敲除的基因是转运蛋白基因或调节转运蛋白基因表达的转录因子基因。

如本文所用，术语“异源序列”和“异源编码序列”用于描述来自除重组宿主.之外的物种的序列。在一些实施方案中，重组宿主是酿酒酵母细胞，异源序列来自酿酒酵母以外的生物体。异源编码序列例如可以来自原核微生物、真核微生物、植物、动物、昆虫或不同于表达异源序列的重组宿主的真菌。在一些实施方案中，编码序列对宿主是天然的序列。

“可选择标志物”可以是补充宿主细胞营养缺陷型、提供抗生素抗性或导致颜色改变的任何数量的基因之一。然后使用本领域公知的方法(参见下文)将基因置换载体的线性化DNA片段引入细胞。可以基于选择标志物来确定线性片段整合到基因组中和基因的破坏，并且可以通过例如PCR或Southern印迹分析来验证。在将其用于选择之后，可以通过例如Cre-LoxP系统从宿主细胞的基因组中除去可选择性标志物(参见例如Gossen等，2002，Ann.Rev.Genetics 36：153-173和U.S.2006/0014264)。或者，可以以包括待破坏的基因之一部分的方式构建基因置换载体，其中所述部分缺乏任何内源基因启动子序列并且不编码所述基因的编码序列，或编码所述基因的无活性片段。

如本文所用的术语“变体”和“突变体”用于描述与特定蛋白质的野生型序列相比在一个或更多个氨基酸处已经被修饰的蛋白质序列。

如本文所用的术语“无活性片段”是编码活性小于例如从基因的全长编码序列所产生之蛋白质的约10％(例如小于约9％，小于约8％，小于约7％，小于约6％，小于约5％，小于约4％，小于约3％，小于约2％，小于约1％，或0％)的蛋白质的基因片段。这样的基因部分以这样的方式插入载体中，使得没有已知的启动子序列有效地连接到基因序列，但是终止密码子和转录终止序列有效地连接至基因序列的所述部分。该载体随后可以在基因序列的所述部分中线性化并转化到细胞中。然后通过单一同源重组，将该线性化载体整合到基因的内源对应物中，使其失活。

如本文所用的术语“甜菊醇糖苷”指莱鲍迪苷A(RebA)(CAS#58543-16-1)、莱鲍迪苷B(Rebb)(CAS#58543-17-2)、莱鲍迪苷C(RebC)(CAS#63550-99-2)、莱鲍迪苷D(RebD)(CAS#63279-13-0)、莱鲍迪苷E(RebE)(CAS#63279-14-1)、莱鲍迪苷F(RebF)(CAS#438045-89-7)、莱鲍迪苷M(RebM)(CAS#1220616-44-3)、甜茶苷(Rubusoside)(CAS#63849-39-4)、杜尔可苷(Dulcoside)A(CAS#64432-06-0)、莱鲍迪苷I(RebI)(MassBank记录号：FU000332)、莱鲍迪苷Q(RebQ)、1，2-甜菊苷(Stevioside)(CAS#57817-89-7)、1，3-甜菊苷(RebG)、1，2-二糖苷(MassBank记录号：FU000299)、1，3-二糖苷、甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、三-葡糖基化甜菊醇糖苷、四-糖基化甜菊醇糖苷、五-葡糖基化甜菊醇糖苷、六-葡糖基化甜菊醇糖苷、七-葡糖基化甜菊醇糖苷、二-葡糖基化异贝壳杉烯酸(di-glucosylated kaurenoic acid)、三-葡糖基化异贝壳杉烯酸、二-糖基化异贝壳杉烯醇(di-glucosylated kaurenol)、三-葡糖基化异贝壳杉烯醇，及其异构体。

重组甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株描述于WO 2011/153378，WO 2013/022989，WO2014/122227和WO 2014/122328，其各自通过引用整体并入本文。也参见实施例2。在重组宿主中，通过全细胞生物转化并且体外生产甜菊醇糖苷的方法也描述于WO 2011/153378，WO2013/022989，WO 2014/122227和WO 2014/122328中。

在一些实施方案中，通过在重组宿主中参与甜菊醇糖苷生物合成途径的一种或更多种酶的表达，在体内生产甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。例如，表达一种或更多种以下基因的甜菊醇生产重组宿主可以在体内产生甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体：编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因，编码内部-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因，编码贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因，编码贝壳杉烯氧化酶多肽(KO)的基因，编码甜菊醇合酶(KAH)多肽的基因，编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因，和编码UGT多肽的基因。参见实施例2。

在一些实施方案中，重组宿主包含编码UGT85C2多肽的核酸，编码UGT76G1多肽的核酸，编码UGT74G1多肽的核酸，编码UGT91D2多肽的核酸，和/或编码EUGT11多肽的核酸。技术人员将理解，这些基因的表达可能是产生特定甜菊醇糖苷所必需的，但是这些基因中的一个或更多个可以是宿主内源的，条件是这些基因中的至少一个(在一些实施方案中，全部)是引入所述微生物的重组基因。在一个具体实施方案中，生产甜菊醇的重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1或UGT91D2多肽的外源核酸。在另一个具体实施方案中，生产甜菊醇的重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和UGT91D2多肽的外源核酸。在另一个具体实施方案中，生产甜菊醇的重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和EUGT11多肽的外源核酸。在另一个具体实施方案中，生产甜菊醇的重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1、UGT91D2(尤其包括91D2e、91D2m、91D2e-b及其功能同源物)和EUGT11多肽的外源核酸。参见实施例2。

在某些实施方案中，甜菊醇糖苷是RebA、RebB、RebD和/或RebM。RebA可以在表达UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和UGT91D2的生产甜菊醇的重组微生物中合成。RebB可以在表达UGT85C2、UGT76G1和UGT91D2的生产甜菊醇的重组微生物中合成。RebD可以在表达UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1以及UGT91D2和/或EUGT11的生产甜菊醇的重组微生物中合成。RebM可以在表达UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1以及UGT91D2和/或EUGT11的生产甜菊醇的重组微生物中合成(参见图1，实施例2)。

在一些实施方案中，通过使甜菊醇糖苷前体与参与甜菊醇糖苷途径的一种或更多种酶在体外接触而生产甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。例如，使甜菊醇与UGT多肽接触可以导致体外生产甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，通过使上游甜菊醇糖苷前体与参与甜菊醇糖苷途径的一种或更多种酶体外接触生产甜菊醇糖苷前体。例如，使E型-异贝壳杉烯酸(ent-kaurenoic acid)与KAH酶接触可以导致体外生产甜菊醇。

在一些实施方案中，通过全细胞生物转化生产甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体。为了发生全细胞生物转化，使表达参与甜菊醇糖苷途径的一种或更多种酶的宿主细胞摄取并修饰细胞中的甜菊醇糖苷前体；在体内修饰后，甜菊醇糖苷保留在细胞中和/或分泌到培养基中。例如，表达编码UGT多肽之基因的宿主细胞可以摄取甜菊醇并在细胞中糖基化甜菊醇；在体内糖基化后，甜菊醇糖苷可以分泌到培养基中。在一些实施方案中，使细胞透化以摄取待修饰的底物或分泌经修饰的产物。

在一些实施方案中，在体内、体外或通过全细胞生物转化生产的甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体组合物包含比特别是来自甜叶菊植物的甜叶菊提取物更少的污染物。污染物包括有助于异味的植物来源的化合物。潜在污染物包括颜料、脂质、蛋白质、酚类、糖类、脂肪醇和其他倍半萜、劳丹烷二萜(labdane diterpene)、单萜、癸酸、8，11，14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八烷醇、豆固醇、β谷固醇、α-和β-香树素(amyrin)、羽扇豆醇、β香树素乙酸酯、五环三萜类、centauredin、槲皮素(quercitin)、表-α-杜松醇(epi-alpha-cadinol)、丁香烯(carophyllene)和衍生物、β-蒎烯、β-谷固醇和赤霉素。

如本文所用，术语“可检测的量”、“可检测浓度”、“可测量的量”和“可测量的浓度”是指以AUC、μM/OD₆₀₀、mg/L、μM或mM测量的甜菊醇糖苷水平。可以通过本领域技术人员通常可获得的技术检测和/或分析甜菊醇糖苷产量(即总的、上清液和/或细胞内甜菊醇糖苷水平)，例如但不限于：液相色谱-质谱法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)、薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)、高效液相色谱法(high-performanceliquid chromatography，HPLC)、紫外-可见光谱/分光光度法(ultraviolet-visiblespectroscopy/spectrophotometry，UV-Vis)、质谱法(mass spectrometry，MS)和核磁共振光谱法(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)。

如本文所使用的，术语“或”和“和/或”用于描述多种成分的组合或彼此排除。例如，“x、y和/或z”可以单独指“x”，单独指“y”，单独指“z”，“x、y和z”，“(x和y)或z”，“x或(y和z)”或“x或y或z”。在一些实施方案中，“和/或”用于指重组细胞包含的外源核酸，其中重组细胞包含选自一组的一种或更多种外源核酸。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体的生产。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷的生产，其中生产一种或更多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷的生产，其中通过以下步骤中的一个或更多个生产一种或更多种甜菊醇糖苷：培养重组微生物，在重组微生物中合成一种或更多种甜菊醇糖苷，和/或分离一种或更多种甜菊醇糖苷。

转运蛋白和转录因子表达

本文描述了可用于有效生产甜菊醇糖苷组合物的试剂和方法。在重组宿主中修饰参与将甜菊醇糖苷转运到培养基中的转运系统可以允许在重组宿主中更有效地生产甜菊醇糖苷。

如本文所述，对细胞转运具有修饰的重组细胞能够生产甜菊醇。本文描述的重组宿主可以生产甜菊醇并且已经改变至少一种内源转运蛋白基因的表达。本文所述的重组宿主可以生产甜菊醇并且已经改变转录因子的表达，所述转录因子调节至少一种内源性转运蛋白基因表达。改变内源转运蛋白基因的表达可用于增加甜菊醇的生产和/或甜菊醇分泌到培养基中。

如本文所述，对细胞转运具有修饰的重组细胞能够生产至少一种甜菊醇糖苷，其包括但不限于RebA、RebB、RebD和/或RebM。本文所述的重组宿主可以生产至少一种甜菊醇糖苷，例如RebA、RebB、RebD和/或RebM，并且已经改变至少一种内源转运蛋白基因的表达。本文所述的重组宿主可以生产至少一种甜菊醇糖苷，例如RebA、RebB、RebD和/或RebM，并且已经改变转录因子的表达，所述转录因子调节至少一种内源转运蛋白基因表达。本文所述的重组宿主可以生产至少一种甜菊醇糖苷，例如RebA、RebB、RebD和/或RebM，并且已经改变多个内源转运蛋白基因和/或调节多个内源转运蛋白基因之表达的多个转录因子基因的表达。改变内源转运蛋白基因和/或调节至少一种转运蛋白基因表达的转录因子之表达可用于增加甜菊醇糖苷的生产和/或甜菊醇糖苷分泌到培养基中。

本文公开的重组宿主可以包括一个或更多个生物合成基因，例如：编码蔗糖转运蛋白和蔗糖合酶的一种或更多种基因；编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因；编码内部-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因；编码贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因；编码贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽的基因；编码甜菊醇合酶(KAH)多肽的基因；编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因；编码UGT85C2多肽的基因；编码UGT76G1多肽的基因；编码UGT74G1多肽的基因；编码UGT91D2功能同源物的基因；和/或编码EUGT11多肽的基因；其中这些基因中的一个或更多个的表达导致生产甜菊醇糖苷，例如RebA、RebB、RebD和/或RebM。

如本文所使用的术语“甜菊醇糖苷的转运”、“甜菊醇糖苷转运”、“甜菊醇糖苷的分泌”和“甜菊醇糖苷分泌”可以互换使用。

如本文所用，术语“转运蛋白”(也称为膜转运蛋白)是指参与小分子、大分子(例如碳水化合物)和离子穿过生物膜的运动的膜蛋白。转运蛋白跨越它们定位在其中的膜并且它们跨越膜来转运物质。转运蛋白可以帮助物质从细胞内空间向培养基的运动(即转运或分泌)。已知转运蛋白用作被动运输系统，携带分子向其较低的浓度梯度移动，或作为主动运输系统，使用能量携带分子克服其浓度梯度向较高浓度梯度移动。主动运输通过这样的运载体介导，其将转运直接与源自ATP分子水解之能量的使用相偶联；或通过这样的载质介导，其利用预先建立的电化学离子梯度来驱动营养分子和共转运离子的共转运。后一类包括分别在相同或相反方向携带离子作为被运输底物的同向转运体和反向转运蛋白。

转运蛋白已根据转运蛋白分类数据库中的多种标准进行分类(在万维网tcdsb.org中)。参见，Saier Jr.等，Nucl.Acids Res.，42(1)：D251-258(2014)。其非限制性实例包括被认为在活生物体中普遍存在的多药耐药性(Multiple Drug Resistance，MDR)质膜转运蛋白家族。MDR转运蛋白超家族可以根据将底物从膜的一侧转运到另一侧的操作模式进一步细分。转运蛋白可以响应于化学渗透离子梯度或通过主动运输来实现物质跨膜移动。ATP结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)是跨膜蛋白，其利用三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，ATP)水解的能量来进行多种底物的跨膜移动。它们可以运输多种底物穿过质膜和细胞内膜，包括代谢产物、脂质和固醇以及药物。内源ABC转运蛋白基因的具体非限制性实例包括PDR5、YDR061W、PDR15、SNQ2、YOR1、YOL075C、MDL2、ADP1、CAF16、VMR1和STE6(或其功能同源物)。在一些方面中，ABC转运蛋白转运甜菊醇糖苷。

基于促进转运的化学渗透梯度的性质将第二组MDR进一步细分。Saier，Jr.等，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.1：257-279(1999)。在一些方面，MDR转运蛋白转运甜菊醇糖苷。

另一个转运蛋白家族，主要促进子超家族(MFS)转运蛋白是可响应于质子梯度转运小溶质的单体多肽。MFS转运蛋白家族有时被称为单向转运蛋白-同向转运体-反向转运蛋白(uniporter-symporter-antiporter)家族。MFS转运蛋白尤其在糖摄取和药物外排系统(drug efflux system)中起作用。MFS转运蛋白通常包含保守的MFS特异性基序。内源MFS转运蛋白基因的非限制性实例包括DTR1、SEO1、YBR241C、VBA3、FEN2、SNF3、STL1、HXT10、AZR1、MPH3、VBA5、GEX2、SNQ1、AQR1、MCH1、MCH5、ATG22、HXT15、MPH2、ITR1、SIT1、VPS73、HXT5、QDR1、QDR2、QDR3、SOA1、HXT9、YMR279C、YIL166C、HOL1、ENB1、TPO4和FLR1(或其功能类似物)。在一些方面，MFS转运蛋白转运甜菊醇糖苷。

其他转运蛋白家族包括SMR(小多药耐药性，small multidrug resistant)家族，RND(抗性-结瘤-细胞分裂，Resistance-Nodulation-Cell Division)家族和MATE(多药和毒性化合物排出，multidrug and toxic compound extrusion)家族。SMR家族成员是以四个α螺旋跨膜链为特征的整体膜蛋白，其在细菌中赋予对宽范围的抗菌剂、亲脂性季铵化合物(quaternary ammonium compound，QAC)的抗性和氨基糖苷抗性。参见Bay和Turner，2009，BMC Evol Biol.，9：140。在一些方面，SMR转运蛋白转运甜菊醇糖苷。

MATE家族成员包含12个跨膜(transmembrane，TM)结构域。已经在原核生物、酵母(如酿酒酵母和粟酒裂殖酵母)和植物中鉴定到MATE家族的成员。参见Diener等，2001，Plant Cell.13(7)：1625-8。MATE家族成员是钠或质子反向转运蛋白。在一些方面中，MATE转运蛋白转运甜菊醇糖苷。

另外的转运蛋白家族包括氨基酸/生长素通透酶(AAAP)家族(例如YKL 146W/AVT3、YBL089W/AVT5、YER119C/AVT6和YIL088C/AVT7)、ATP酶家族(例如YBL099W/ATP1、YDL185W/VMA1、YLR447C/VMA6、YOL077W/ATP19、YPL078C/ATP4、YEL027W/VMA3、YKL016C/ATP7和YOR332W/VMA4)、硫酸盐通透酶(SulP)家族(例如YBR294W/SUL1、YGR125W和YPR003C)、溶酶体胱氨酸转运蛋白(LCT)家族(例如YCR075C/ERS1)、Ca2+：阳离子反向转运蛋白(CaCA)家族(例如YDL128W/VCX1和YJR106W/ECM27)、氨基酸-多胺-有机阳离子(APC)超家族(例如YDL210W/UGA4、YOL020W/TAT2、YPL274W/SAM3、YNL268W/LYP1、YHL036W/MUP3、YKR039W/GAP1和YOR348C/PUT4)、多药/寡糖基脂质/多糖(MOP)(例如YDR338C)、ZRT/IRT样蛋白(ZIP)金属转运蛋白家族(例如YGL225W/ZRT1和YOR079C/ATX2)、线粒体蛋白移位酶(MPT)家族(例如YGR181W/TIM13、YNL070W/TOM7、YNL121C/TOM70)、电压门控离子通道(VIC)家族(例如YGR217W/CCH1和YJL093C/TOK1)、单价阳离子：质子反向转运蛋白-2(CPA2)家族(例如YJL094C/KHA1)、推定的跨膜氨基酸外排转运蛋白ThrE家族(例如YJL108C/PRM10)、寡肽转运蛋白(OPT)家族(例如YJL212C/OPT1和YGL114W)、K⁺转运蛋白(Trk)家族(例如TKR050W/TRK2)、胆汁酸：Na同向转运体(BASS)家族(例如YMR034C)、药物/代谢物转运蛋白(DMT)超家族(例如YMR253C、YML038C/YMD8和YOR307C/SLY41)、线粒体运载体(MC)家族(例如YMR056C/AAC1、YNL083W/SAL1、YOR130C/ORT1、YOR222W/ODC2、YPR011C、YPR058W/YMC1、YPR128C/ANT1、YEL006W/YEA6、YER053C/PIC2、YFR045W、YGR257C/MTM1、YHR002W/LEU5、YIL006W/YIA6、YJL133W/MRS3、YKL120W/OAC1、YMR166C、YNL003C/PET8和YOR100C/CRC1)、生长素外排运载体(AEC)家族(例如YNL095C、YOR092W/ECM3和YBR287W)、氨通道转运蛋白(Amt)家族(例如YNL142W/MEP2)、金属离子(Mn²⁺-铁)转运蛋白(Nramp)家族(例如YOL122C/SMF1)、瞬时受体电位Ca²⁺通道(TRP-CC)家族(例如YOR087W/YVC1)、耐砷-3(ACR3)家族(例如YPR201W/ARR3)、核碱基：阳离子同向转运体-1(NCS1)家族(例如YBR021W/FUR4)、无机磷酸转运蛋白(PiT)家族(例如YBR296C/PHO89)、亚砷酸-亚锑酸盐(ArsAB)外排家族(例如YDL100C/GET3)、转运蛋白IISP家族、甘油摄取(GUP)家族(例如YGL084C/GUP1)、金属离子转运(MIT)家族(例如YKL064W/MNR2、YKL050C和YOR334W/MRS2)、铜转运(Ctr)家族(例如YLR411W/CTR3)或阳离子扩散促进子(CDF)家族(例如YOR316C/COT1)。这些转运蛋白家族中的任何一个的特定成员包括在所公开发明的范围内，其程度为，在能够生产甜菊醇糖苷的细胞中，其表达的改变增加所述甜菊醇糖苷从细胞的生产；示例性成员在上面以及表5、6和14中公开。

如本文所用，术语“转录因子”是指调节基因表达的DNA结合蛋白。优选地，转录因子调节至少一种转运蛋白基因的表达。

本文公开了用于鉴定影响甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷途径中间体之生产或转运的基因的方法。这样的方法可包括失活至少一种内源转运蛋白基因或修饰至少一种转运蛋白基因的表达。通常，制备突变体微生物文库，文库中的每个突变体具有不同的内源转运蛋白基因失活。使基因失活并确定其在微生物中之效果的方法是本领域普通技术人员已知的；在WO2014/122328中公开了另外的方法，其公开内容通过引用整体并入本文。在合成甜菊醇或甜菊醇糖苷的条件下，在培养基中培养包含一种或更多种甜菊醇糖苷途径基因的突变体微生物，并且如本文所述测量(例如，使用LC-MS)由所述微生物生产的总的、上清液和/或细胞内甜菊醇糖苷的量。

本公开内容涉及重组宿主细胞，其中内源转运蛋白或转录因子基因的表达被修饰。在一些实施方案中，转运蛋白或转录因子基因相对酿酒酵母是内源的，所述酿酒酵母包括但不限于酿酒酵母菌株S288C。在一些实施方案中，内源转运蛋白或转录因子的表达可以通过用不同的启动子代替内源启动子来修饰，所述不同的启动子导致转运蛋白的表达增加(例如表达增加至少5％，如表达增加至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％、100％、200％或更多)。例如，内源启动子可以用导致转运蛋白表达增加的组成型或诱导型启动子替换。同源重组可用于以导致转运蛋白表达增加的不同启动子替代内源基因的启动子。在另一些实施方案中，可以使用同源重组将诱导型或组成型启动子和内源转运蛋白或转录因子整合到基因组的另一基因座中。在另一些实施方案中，可以使用具有启动子的外源质粒将转运蛋白或转录因子基因导入微生物中，所述启动子导致微生物中的转运蛋白或转录因子的过表达。在另一个实施方案中，外源质粒还可以包含转运蛋白或转录因子基因的多个拷贝。在另一个实施方案中，可以使用针对重组微生物的天然机制(例如热休克、应激、重金属或抗生素暴露)诱导内源转运蛋白或转录因子过表达。在另一个实施方案中，内源基因产物的活性被增强或增加(例如，通过突变)。在另一个实施方案中，内源酵母转运蛋白或转录因子基因的同源或直系同源基因过表达。

在某些其他实施方案中，靶基因在重组微生物中的经修饰表达包括过表达转运蛋白基因和/或参与所述转运蛋白基因表达的转录因子基因。在另一些实施方案中，在所述重组微生物中过表达多个内源转运蛋白基因或转录因子基因。

转录因子表达的修饰可用于增加转运蛋白表达。例如，酵母转录因子PDR1调节编码ABC转运蛋白PDR5、SNQ2和YOR1之基因的表达。因此，在一些实施方案中，可以用导致转录因子表达增加的不同启动子替换内源PDR1基因座的启动子，这可以增加内源转运蛋白的产量。

在一些实施方案中，转运蛋白基因或转录因子基因为(使用各自的Uniprot排序基因座名称(Uniprot Ordered Locus Name))：YAL067C、YBL089W、YBL099W、YBR008C、YBR021W、YBR043C、YBR180W、YBR241C、YBR287W、YBR294W、YBR295W、YBR296C、YCL038C、YCL069W、YCR011C、YCR028C、YCR075C、YDL054C、YDL100C、YDL128W、YDL185W、YDL194W、YDL210W、YDL245C、YDL247W、YDR011W、YDR061W、YDR093W、YDR292C、YDR338C、YDR406W、YDR497C、YDR536W、YEL006W、YEL027W、YEL031W、YEL065W、YER019C-A、YER053C、YER119C、YER166W、YFL011W、YFL028C、YFR045W、YGL006W、YGL013C、YGL084C、YGL104C、YGL114W、YGL167C、YGL255W、YGR125W、YGR181W、YGR217W、YGR224W、YGR257C、YGR281W、YHL016C、YHL035C、YHL036W、YHR002W、YHR096C、YIL006W、YIL088C、YIL120W、YIL121W、YIL166C、YJL093C、YJL094C、YJL108C、YJL133W、YJL212C、YJL219W、YJR106W、YJR160C、YKL016C、YKL050C、YKL064W、YKL120W、YKL146W、YKL209C、YKR039W、YKR050W、YKR105C、YKR106W、YLR411W、YLR447C、YML038C、YML116W、YMR034C、YMR056C、YMR166C、YMR253C、YMR279C、YNL003C、YNL065W、YNL070W、YNL083W、YNL095C、YNL121C、YNL142W、YNL268W、YNR055C、YOL020W、YOL075C、YOL077W-A、YOL122C、YOL158C、YOR079C、YOR087W、YOR092W、YOR100C、YOR130C、YOR153W、YOR222W、YOR271C、YOR273C、YOR291W、YOR306C、YOR307C、YOR316C、YOR332W、YOR334W、YOR348C、YPL036W、YPL078C、YPL270W、YPL274W、YPR003C、YPR011C、YPR058W、YPR128C和/或YPR201W。每个排序基因座的SEQ ID NO、Uniprot登录号和基因名称可以在表5、6和14中找到。在一些实施方案中，上述转运蛋白基因和转录因子基因调节甜菊醇糖苷的分泌。

在一些实施方案中，在甜菊醇糖苷生产菌株中缺失YDL128W(SEQ ID NO：22)、YDL194W(SEQ ID NO：24)、YDL210W(SEQ ID NO：25)、YDR536W(SEQ ID NO：30)、YFL011W(SEQID NO：33)、YGL006W(SEQ ID NO：34)、YGL013C(SEQ ID NO：35)、YGL255W(SEQ ID NO：36)、YGR181W(SEQ ID NO：38)、YGR217W(SEQ ID NO：39)、YHL016C(SEQ ID NO：42)、YIL088C(SEQID NO：43)、YJL094C(SEQ ID NO：45)、YJR106W(SEQ ID NO：48)、YKR050W(SEQ ID NO：51)、YNL065W(SEQ ID NO：59)、YNL083W(SEQ ID NO：61)、YNL121C(SEQ ID NO：63)、YNL142W(SEQID NO：64)、YOR291W(SEQ ID NO：74)、YOR306C(SEQ ID NO：75)、YOR334W(SEQ ID NO：77)、YPL270W(SEQ ID NO：79)、YPR011C(SEQ ID NO：82)、YPR128C(SEQ ID NO：84)导致分泌到培养基中的RebD的可测量的减少，表明各自均在RebD分泌中起作用。参见实施例3和表7-10。

在一些实施方案中，在甜菊醇糖苷生产菌株中缺失YBR180W(SEQ ID NO：13)、YAL067C(SEQ ID NO：14)、YBR241C(SEQ ID NO：17)、YCL069W(SEQ ID NO：19)、YCR075C(SEQID NO：21)、YDL128W(SEQ ID NO：22)、YDL194W(SEQ ID NO：24)、YDR093W(SEQ ID NO：27)、YDR338C(SEQ ID NO：28)、YDR406W(SEQ ID NO：29)、YER166W(SEQ ID NO：32)、YFL011W(SEQID NO：33)、YGL006W(SEQ ID NO：34)、YGL013C(SEQ ID NO：35)、YGL255W(SEQ ID NO：36)、YGR217W(SEQ ID NO：39)、YHL016C(SEQ ID NO：42)、YJL094C(SEQ ID NO：45)、YJL212C(SEQID NO：47)、YJR106W(SEQ ID NO：48)、YJR160C(SEQ ID NO：49)、YKR050W(SEQ ID NO：51)、YKR106W(SEQ ID NO：53)、YML116W(SEQ ID NO：55)、YMR034C(SEQ ID NO：56)、YMR056C(SEQID NO：57)、YMR253C(SEQ ID NO：58)、YNL070W(SEQ ID NO：60)、YNL083W(SEQ ID NO：61)、YNL095C(SEQ ID NO：62)、YNL121C(SEQ ID NO：63)、YOL075C(SEQ ID NO：66)、YOL122C(SEQID NO：68)、YOR087W(SEQ ID NO：70)、YOR222W(SEQ ID NO：73)、YOR291W(SEQ ID NO：74)、YOR306C(SEQ ID NO：75)、YPL274W(SEQ ID NO：80)、YPR003C(SEQ ID NO：81)、YPR011C(SEQID NO：82)或YPR201W(SEQ ID NO：85)导致RebM的可测量的减少，表明各自均在RebM分泌中起作用。参见实施例3和表7-10。

在一些实施方案中，YGR181W(SEQ ID NO：38)或YDR061W(SEQ ID NO：26)的过表达将RebD和RebM向培养基中的转运提高约2倍(在YGR181W(SEQ ID NO：38)和YDR061W(SEQ IDNO：26)过表达菌株中约400-500mg/L的上清液RebD和RebM，相比于在对照甜菊醇糖苷生产菌株中约250mg/L的上清液RebD和RebM)。参见实施例4、图2和图3A-3B。

在一些实施方案中，表11的转运蛋白的过表达将RebA、RebB、RebD和/或RebM的分泌增加至少20％。在一些实施方案中，表12的转运蛋白的过表达将RebA、RebB、RebD和/或RebM的产量增加至少40％。参见实施例5。

在一些实施方案中，将转运蛋白基因整合到甜菊醇糖苷生产宿主的基因组中。在一些实施方案中，整合的转运蛋白是YBR043C(SEQ ID NO：88)、YEL027W(SEQ ID NO：102)、YJL093C(SEQ ID NO：44)、YJR106W(SEQ ID NO：48)、YMR166C(SEQ ID NO：132)、YIL166C(SEQ ID NO：121)、YKL120W(SEQ ID NO：126)、YDL054C(SEQ ID NO：94)、YDL128W(SEQ IDNO：22)、YDR536W(SEQ ID NO：30)、YGL167C(SEQ ID NO：112)、YKL146W(SEQ ID NO：127)、YKR039W(SEQ ID NO：129)、YOL122C(SEQ ID NO：68)或YPR011C(SEQ ID NO：82)。在一些实施方案中，整合YBR043C(SEQ ID NO：88)、YEL027W(SEQ ID NO：102)、YJL093C(SEQ ID NO：44)、YJR106W(SEQ ID NO：48)、YKL120W(SEQ ID NO：126)或YMR166C(SEQ ID NO：132)提高13-SMG的分泌和/或总产量。在一些实施方案中，整合YBR043C(SEQ ID NO：88)、YEL027W(SEQ ID NO：102)或YMR166C(SEQ ID NO：132)提高RebA的分泌和/或总产量。在一些实施方案中，整合YBR043C(SEQ ID NO：88)、YEL027W(SEQ ID NO：102)或YMR166C(SEQ ID NO：132)提高RebB的分泌和/或总产量。在一些实施方案中，整合SEQ ID NO：88的YBR043C、SEQ IDNO：102的YEL027W、SEQ ID NO：44的YJL093C、SEQ ID NO：48的YJR106W和SEQ ID NO：132的YMR166C提高RebD的分泌和/或总产量，以及整合SEQ ID NO：88的YBR043C、SEQ ID NO：102的YEL027W、YIL166C(SEQ ID NO：121)、SEQ ID NO：44的YJL093C、SEQ ID NO：48的YJR106W和SEQ ID NO：132的YMR166C提高RebM的分泌和/或总产量，如通过与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比上清液中RebD和RebM水平的增加所测量的。参见实施例6。

在一些实施方案中，与不过表达YJL093C或YBR043C的生产甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株相比，过表达YJL093C(SEQ ID NO：44)或YBR043C(SEQ ID NO：88)的生产甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株生产更高水平的RebD+RebM。参见实施例7。

在一些实施方案中，被敲除的转运蛋白还可具有转运较大分子量甜菊醇糖苷的特异性(例如，RebD以及敲除SEQ ID NO：38的YGR181W或SEQ ID NO：74的YOR291W)，并因此可用于在需要将RebD转运到培养基中的菌株中过表达。通过通路UGT的表达来适当平衡糖基化活性速率，使得较小分子量的甜菊醇糖苷在被转移到培养基中之前被进一步糖基化。例如，与UGT74G1和UGT85C2酶相比，UGT76G1和UGT91D2e和/或EUGT11的更高表达水平可以防止更容易转运的甜菊醇单葡糖苷的积累。如果UGT活性水平比转运速率更高(因此糖基化速率更快)，则将生产更大量的较大分子量的甜菊醇糖苷。

甜菊醇和甜菊醇糖苷生物合成核酸

编码本文所述的多肽的重组基因包含所述多肽的编码序列，该序列与适合表达所述多肽之一个或更多个调控区按照有义方向有效连接。因为许多微生物能够由多顺反子mRNA表达多种基因产物，因此如果期望的话，可以在这些微生物的单一调控区的控制下表达多个多肽。当调控区和编码序列被定位成使得调控区能够有效地调节所述序列的转录或翻译时，认为该编码序列和调控区有效连接。通常来说，对于单顺反子基因，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点位于调控区下游1到约50个核苷酸之间。

在许多情况下，本文所述的多肽之编码序列是在重组宿主以外的物种中鉴定到的，即编码序列是异源核酸。因此，如果重组宿主是微生物，则编码序列可以来自其它原核或真核微生物、植物或动物。然而在一些情况下，编码序列是宿主先天具有的且被重新引入该生物体的序列。天然序列(native sequence)与天然存在的序列(naturally occurringsequence)的区别通常在于存在与外源核酸连接的非天然序列，例如例如位于重组核酸构建体中天然序列侧翼的非天然调节序列。此外，稳定转化的外源核酸通常整合到发现天然序列的位置之外的位置。“调控区”是指含有影响转录或翻译的起始和速率、以及转录或翻译产物的稳定性和/或移动性之核苷酸序列的核酸。调控区包括但不限于，启动子序列、增强子序列、反应元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5’和3’非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列、内含子、及其组合。调控区通常包含至少一个核心(基本)启动子。调控区还可以包含至少一个控制元件，例如增强子序列、上游元件或者上游激活区(upstream activation region，UAR)。通过将调控区与编码序列定位成使得调控区有效地调节序列的转录或翻译来使得调控区与编码序列有效连接。例如，为了有效连接编码序列和启动子序列，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点通常定位于启动子下游的1到约50个核苷酸之间。但调控区也可能被定位在翻译起始位点上游多达约5000个核苷酸或者转录起始位点上游约2000核苷酸的位置。

对要包含的调控区的选择取决于几个因素，包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、期望的表达水平，以及在某些培养阶段期间优先表达。对于本领域技术人员而言，通过相对编码序列适当选择和定位调控区来调整编码序列的表达是常规问题。应理解可能存在多于一个调控区，例如内含子、增强子、上游激活区、转录终止子和诱导型元件。

可以将一个或更多个基因以“模块(modules)”组合在重组核酸构建体中，可用于甜菊醇和/或甜菊醇糖苷生产的一个独立方面。以模块组合多个基因，特别是多顺反子模块，便于在多种物种中使用所述模块。例如，可以以多顺反子模块组合甜菊醇生物合成基因簇或者UGT基因簇，从而使得在插入合适的调控区后，可以将模块引入众多的物种中。作为另一个实例，可以将UGT基因簇组合，以使得每个UGT编码序列有效连接独立的调控区从而形成UGT模块。这样的模块可以用在那些必须或者期望单顺反子表达的物种中。除了对甜菊醇或甜菊醇糖苷生产有用的基因以外，重组构建体通常还含有复制起点和使构建体保持在合适的物种中的一个或更多个可选择标志物。

应理解，由于遗传密码的简并性，许多核酸可以编码特定多肽，即对于许多氨基酸，有多于一个核苷酸三联体充当该氨基酸的密码子。因此，使用针对宿主(例如，微生物)的合适密码子偏向性表格，可以将给定多肽的编码序列中的密码子进行修饰，从而获得在所述特定宿主中的最佳表达。作为经分离的核酸，这些经修饰的序列可以作为经纯化分子存在，也可以整合到载体或病毒中用于构建重组核酸构建体的模块。

在一些情况下，期望抑制内源多肽的一种或更多种功能，以将代谢中间体转向甜菊醇或甜菊醇糖苷生物合成。例如，可能期望下调菌株中固醇的合成，以例如通过下调角鲨烯环氧酶来进一步增加甜菊醇或甜菊醇糖苷的产量。作为另一个实例，可能需要抑制某些内源基因产物(例如，从次级代谢物中除去葡萄糖部分的糖基水解酶或如本文所讨论的磷酸酶)的降解功能。作为另一个实例，可以激活参与甜菊醇糖苷转运的膜转运蛋白的表达，使得甜菊醇糖苷的转运增加。这种调节可以是有益的，因为在微生物培养期间可以将甜菊醇糖苷的转运增加期望的时间段，从而增加收获时糖苷产物的产量。在这种情况下，可以在转化入菌株的重组构建体中包括过表达所述多肽或基因产物的核酸。或者，可使用诱变来生成期望增加或增强其功能的基因的突变体。

重组宿主

重组宿主可用于表达生产甜菊醇糖苷的多肽，其包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和藻类细胞。许多原核生物和真核生物也适合用于构建本文所述的重组微生物，例如革兰氏阴性细菌、酵母和真菌。首先分析选择用作甜菊醇糖苷生产菌株的物种和菌株，以确定哪些生产基因对于菌株是内源的，哪些基因不存在。对于其内源对应物不存在于菌株中的基因，其有利地装配在一个或更多个重组构建体中，然后将其转化入菌株以提供丧失的功能。

通常，使重组微生物在发酵罐中在限定的温度下生长期望的一段时间。本发明提供的经构建和经遗传改造的微生物可以使用常规发酵方法培养，尤其包括恒化器、分批、补料分批培养、半连续发酵如吸取和填充、连续灌注发酵和连续灌注细胞培养。根据该方法中使用的特定微生物，也可以存在和表达其他重组基因，例如异戊烯基生物合成基因和萜合酶和环化酶基因。可以通过从培养基中提取样品以根据公开的方法进行分析来确定底物和中间体(例如，异戊烯基二磷酸、二磷酸二甲基烯丙酯、GGPP、贝壳杉烯和异贝壳杉烯酸)的水平。

本方法中使用的碳源包括可以被重组宿主细胞代谢以促进生长和/或甜菊醇糖苷生产的任何分子。合适的碳源的实例包括但不限于蔗糖(例如，如在糖蜜中发现的)、果糖、木糖、乙醇、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其他含葡萄糖的聚合物。例如在使用酵母作为宿主的实施方案中，碳源如蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甘油和葡萄糖是合适的。碳源可以在整个培养期间提供给宿主生物体，或者替选地，生物体可以在另一种能量源(例如蛋白质)的存在下生长一段时间，然后仅在补料分批阶段期间提供碳源。

在重组微生物在培养物中已经生长期望的时间后，然后可以使用本领域已知的多种技术从培养物中回收甜菊醇和/或一种或更多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，可以加入透化剂以帮助原料进入宿主和产物离开。例如，可以将培养的微生物的粗裂解物离心以获得上清液。然后可将所得上清液施加到色谱柱例如C-18柱上，并用水洗涤以除去亲水性化合物，随后用溶剂如甲醇洗脱目标化合物。然后可以通过制备型HPLC进一步纯化化合物。也参见，WO 2009/140394。

应当理解，本文所讨论的多种基因和模块可以存在于两个或更多个重组宿主中，而不是单个宿主中。当使用多种重组宿主时，它们可以在混合培养物中生长以生产甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。

或者，两种或更多种宿主各自可在单独的培养基中生长，并且可以将第一培养基的产物例如甜菊醇引入第二培养基中以转化为随后的中间体或最终产物例如RebA。然后回收由第二或最终宿主生产的产物。还将理解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养源并利用除发酵罐之外的系统来培养重组宿主。

示例性的原核和真核物种在下文更详细地描述。然而，应当理解，其他物种也是合适的。例如，合适的物种可以是这样的属，例如伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、念珠菌属(Candida)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假囊酵母属(Eremothecium)、埃希菌属(Escherichia)、镰孢菌(Fusarium)/赤霉属(Gibberella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyce)、硫磺菌属(Laetiporus)、香菇属(Lentinus)、红发夫酵母属(Phaffia)、平革菌属(Phanerochaete)、毕赤酵母属(Pichia)、藓属(Physcomitrella)、红酵母属(Rhodoturula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、痂圆孢属(Sphaceloma)、红发夫酵母属(Xanthophyllomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)。来自这些属的示例性物种包括虎皮香菇(Lentinus tigrinus)、硫磺菌(Laeitporussulphureus)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)、小立碗藓(Physcomitrellapatens)、粘红酵母(Rhodoturula glutinis)、胶红酵母(Rhodoturula mucilaginosa)、红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)、红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)/腾仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、白色念珠菌和解脂耶氏酵母。

在一些实施方案中，微生物可以是原核生物例如大肠杆菌(Escherichia coli)。

在一些实施方案中，微生物可以是子囊菌(Ascomycete)，例如腾仓赤霉、乳酸克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、黑曲霉、解脂耶氏酵母、棉阿舒囊霉、或酿酒酵母。

在一些实施方案中，微生物可以是藻类细胞、例如三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)、杜氏盐藻(Dunaliella salina)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、小球藻(Chlorella sp.)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、马尾藻(Sargassum)、海带(Laminaria japonica)、almeriensis栅藻(Scenedesmus almeriensis)物种。

在一些实施方案中，微生物可以是蓝细菌细胞，例如三孢布拉氏霉菌、杜氏盐藻、雨生红球藻、小球藻、裙带菜、马尾藻、海带、almeriensis栅藻。

酵母属

酵母是合成生物学中广泛使用的经典生物体，并且可以用作重组微生物平台。例如，存在可用于酿酒酵母的突变体、质粒、代谢的详细计算机模型和其他信息的文库，允许各种模块的合理设计以提高产物产量。用于制备重组微生物的方法是已知的。

曲霉属

曲霉属物种(例如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)和酱油曲霉(A.sojae))是食品生产中广泛使用的微生物，并且还可用作重组微生物平台。构巢曲霉(A.nidulans)、烟曲霉(A.fumigatus)、米曲霉、棒曲霉(A.clavatus)、黄曲霉(A.flavus)、黑曲霉和土曲霉(A.terreus)的基因组核苷酸序列是均是可获得的，从而允许合理设计和修饰内源途径以提高通量和提高产物产率。已经开发了用于曲霉属的代谢模型，以及转录组学研究和蛋白组学研究。黑曲霉被培养用于工业化生产多种食品成分，例如柠檬酸和葡糖酸，并且因此例如黑曲霉的物种通常适用于生产甜菊醇糖苷。

大肠杆菌

大肠杆菌，合成生物学中另一种广泛使用的平台生物体，也可以用作重组微生物平台。与酵母相似，大肠杆菌拥有可供使用的突变体文库、质粒、代谢的详细计算机模型以及其他信息，从而允许合理设计多种模块以提高产物的产率。可使用与上文针对酵母属所述的那些类似的方法来制备重组大肠杆菌微生物。

伞菌属、赤霉属和平革菌属

伞菌属、赤霉属和平革菌属是可用的，因为已知它们在培养物中生产大量类异戊二烯。因此用于大量生产甜菊醇糖苷的萜前体已由内源基因产生。因此，可将包含甜菊醇糖苷生物合成多肽的重组基因的模块引入来自这些属的物种中，而无需引入甲羟戊酸或MEP途径基因。

Arxula adeninivorans(Blastobotrys adeninivorans)

Arxula adeninivorans是具有独特生化特征的二态酵母(其在高至42℃的温度下生长为类似于面包酵母的出芽酵母，高于该阈值时，其以丝状形式生长)。其可在多种底物上生长，并且可同化硝酸盐。其已成功地应用于产生可以生产天然塑料的菌株或者应用于开发用于环境样品中之雌激素的生物传感器。

解脂耶氏酵母

解脂耶氏酵母是二态酵母(参见Arxula adeninivorans)并且属于半子囊菌科(family Hemiascomycetes)。解脂耶氏酵母的整个基因组是已知的。耶氏酵母属物种是需氧的并且被认为是非致病性的。耶氏酵母在使用疏水性底物(例如烷烃、脂肪酸、油)方面是高效的，并且可以在糖上生长。它具有很高的工业应用潜力，是一种产油微生物。解脂耶氏酵母可以将脂质含量累积到其干细胞重量的约40％，并且是用于脂质累积和再活化的模式生物体。参见例如Nicaud，2012，Yeast 29(10)：409-18；Beopoulos等，2009，Biohimie 91(6)：692-6；Bankar等，2009，Appl Microbiol Biotechnol.84(5)：847-65。

红酵母属(Rhodotorula sp.)

红酵母是单细胞的、含色素的酵母。产油的红酵母，粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)已经显示从粗甘油生产脂质和类胡萝卜素(Saenge等，2011，ProcessBiochemistry 46(1)：210-8)。圆红冬孢酵母(Rhodotorula toruloides)菌株已经显示为用于改善生物质和脂质生产力的高效补料分批发酵系统(Li等，2007，Enzyme andMicrobial Technology 41：312-7)

圆红冬孢酵母

圆红冬孢酵母是产油酵母，并且可用于工程化脂质生产途径(参见例如Zhu等，2013，Nature Commun.3：1112；Ageitos等，2011，Applied Microbiology andBiotechnology 90(4)：1219-27)。

博伊丁念珠菌

博伊丁念珠菌是甲基营养型酵母(其可在甲醇上生长)。与其他的甲基营养型物种(例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和巴斯德毕赤酵母)类似，博伊丁念珠菌为生产异源蛋白质提供优异的平台。已报道了分泌型外来蛋白的多克级范围的产率。最近，计算方法IPRO预测了在实验上将博伊丁念珠菌木糖还原酶的辅因子特异性从NADPH转化至NADH的突变。参见例如Mattanovich等，2012，Methods Mol Biol.824：329-58；Khoury等，2009，Protein Sci.18(10)：2125-38。

多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母，Pichia angusta)

多形汉逊酵母是甲基营养型酵母(参见，博伊丁念珠菌)。其还可在多种其他底物上生长；其耐热并且可以同化硝酸盐(另参见乳酸克鲁维酵母)。多形汉逊酵母已被应用于生产乙型肝炎疫苗、胰岛素和用于治疗丙型肝炎的干扰素α-2a，还用于一系列技术酶。参见例如Xu等，2014，Virol Sin.29(6)：403-9。

乳酸克鲁维酵母

乳酸克鲁维酵母是常规地应用于生产克非尔(kefir)的酵母。其可在数种糖上生长，最重要的是可在存在于乳和乳清中的乳糖上生长。乳酸克鲁维酵母已被成功地应用于生产凝乳酶(通常存在于牛的胃中的一种酶)等以生产奶酪。生产以40,000L的规模在发酵罐中进行。参见例如van Ooyen等，2006，FEMS Yeast Res.6(3)：381-92。

巴斯德毕赤酵母

巴斯德毕赤酵母是甲基营养型酵母(参见博伊丁念珠菌和多形汉逊酵母)。巴斯德毕赤酵母为外来蛋白质的生产提供有效的平台。平台元件可作为试剂盒获得并且在世界范围内在学术界中被用于生产蛋白质。已将菌株改造成可生产复杂的人N-多糖(酵母多糖与在人中发现的那些类似但不相同)。参见例如Piirainen等，2014，N Biotechnol.31(6)：532-7。

小立碗藓属(Physcomitrella spp.)

小立碗藓苔藓(Physcomitrella mosse)在悬浮培养物中生长时具有与酵母或其他真菌培养物相似的特征。该属可用于生产可能难以在其他类型的细胞中生产的植物次级代谢物。

甜菊醇糖苷组合物

甜菊醇糖苷在不同的食品系统中不一定具有等同的性能。因此，期望其具有将合成引导至所选择的甜菊醇糖苷组合物的能力。本文描述的重组宿主可以生产选择性富集特定甜菊醇糖苷(例如RebD)并具有一致的味道特性的组合物。因此，本文所述的重组宿主可以促进这样的组合物的生产，所述组合物被调整以满足给定食品所需的甜味特性，并且每批之间具有每种甜菊醇糖苷的一致比例。本文所述的宿主不产生在甜菊提取物中发现的不期望的植物副产物。因此，由本文所述的重组宿主产生的甜菊醇糖苷组合物与源自甜叶菊植物的组合物是不同的。

生产的单一甜菊醇糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的量可以为约1mg/L至约2,800mg/L，例如，约1至约10mg/L，约3至约10mg/L，约5至约20mg/L，约10至约50mg/L，约10至约100mg/L，约25至约500mg/L，约100至约1,500mg/L，或约200至约1,000mg/L，至少约1,000mg/L，至少约1,200mg/L，至少约至少1,400mg/L，至少约1,600mg/L，至少约1,800mg/L，或至少约2,800mg/L。在一些方面中，单一甜菊醇糖苷的量可以超过2,800mg/L。所生产的甜菊醇糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的组合的量可以为约1mg/L至约6,000mg/L，例如约200至约1,500，至少约2,000mg/L，至少约3,000mg/L，至少约4,000mg/L，至少约5,000mg/L，或至少约6,000mg/L。在一些方面中，甜菊醇糖苷的组合的量可以超过6,000mg/L。一般来说，更长的培养时间将导致更大量的产品。因此，重组微生物可以培养1天至7天，1天至5天，3天至5天，约3天，约4天或约5天。

应当理解，本文所讨论的多种基因和模块可以存在于两种或更多种重组微生物中，而不是单一微生物中。当使用多种重组微生物时，它们可以在混合培养物中生长以生产甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。例如，第一微生物可以包含用于生产甜菊醇的一种或更多种生物合成基因和在第一组内源转运蛋白中的无效突变，而第二微生物包含甜菊醇糖苷生物合成基因和第二组内源转运蛋白中的无效突变。然后回收由第二或最终微生物生产的产物。还将理解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养源并利用除发酵罐之外的系统来培养重组微生物。

或者，两种或更多种微生物各自可在单独的培养基中生长，并且第一培养基的产物例如甜菊醇可以被引入第二培养基中以转化为随后的中间体，或转化为最终产品例如RebA。然后回收由第二或最终微生物生产的产物。微生物可以在内源转运蛋白中具有相同或不同的突变组。还将理解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养源并利用除发酵罐之外的系统来培养重组微生物。

甜菊醇糖苷在不同的食品系统中不一定具有等同的性能。因此，期望其具有将合成引导至所选择的甜菊醇糖苷组合物的能力。本文描述的重组宿主可以生产选择性富集特定甜菊醇糖苷(例如RebD)并具有一致的味道特征的组合物。因此，本文所述的重组微生物可以促进这样的组合物的生产，所述组合物被调整以满足给定食品所需的甜味特征，并且每批之间具有每种甜菊醇糖苷的一致比例。本文所述的微生物不产生在甜菊提取物中发现的不期望的植物副产物。因此，由本文所述的重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物与源自甜叶菊植物的组合物是不同的。

通过本文公开的方法获得的甜菊醇糖苷和组合物可用于制备食品、膳食补充剂和甜味剂组合物。参见例如WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328，其各自通过引用整体并入本文。

例如，基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷例如RebM或RebD可以包含在食品中，例如冰淇淋、碳酸饮料、果汁、酸奶、烘焙食品、口香糖、硬糖和软糖和调味汁(sauce)。基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷也可以包含在非食品产品例如药品、医药产品、膳食补充剂和营养补充剂中。基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷也可以包含在用于农业工业和伴侣动物工业的动物饲料产品中。或者，可以通过分别培养重组微生物来制备甜菊醇和/或甜菊醇糖苷的混合物，每种重组微生物生产特定的甜菊醇或甜菊醇糖苷，从每种微生物中回收基本上纯的形式的甜菊醇或甜菊醇糖苷，然后合并这些化合物以获得包含所需比例的每种化合物的混合物。与目前的甜菊产品相比，本文所述的重组微生物允许获得更精确和一致的混合物。例如，本文描述的重组微生物可以表达特异性转运特定莱鲍迪苷至培养基中的转运蛋白。当转运蛋白特异性针对特定的莱鲍迪苷时，它将富集发酵液中该化合物的浓度，防止其进一步反应成不同的化合物，并通过选择性地将这种莱鲍迪苷转运到发酵液中，它将使得更容易从其他莱鲍迪苷中回收，并因此使该方法更有效。

在另一替代方案中，可将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷与其他甜味剂一起并入食品中，所述其他甜味剂例如糖精、右旋糖、蔗糖、果糖、赤藓糖醇、阿斯巴甜、三氯蔗糖、莫纳甜(monatin)或乙酰磺胺酸钾。甜菊醇或甜菊醇糖苷相对于其他甜味剂的重量比可以根据需要改变以在最终食品中达到令人满意的味道。参见例如，U.S.2007/0128311。在一些实施方案中，甜菊醇或甜菊醇糖苷可以与风味剂(例如柑橘)一起提供，以作为风味调节剂。

由本文所述的重组微生物所生产的组合物可以并入食品中。例如，取决于甜菊醇糖苷和食品的类型，由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以基于干重以约20mg甜菊醇糖苷/kg食品至约1800mg甜菊醇糖苷/kg食品的量并入食品中。例如，由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入甜点、冷的糖食(例如冰淇淋)、乳制品(例如酸奶)或饮料(例如碳酸饮料)中，以使得食品基于干重具有最多500mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入烘焙食品(例如饼干)中，以使得食品基于干重具有最多300mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入到调味汁(例如巧克力糖浆)或蔬菜产品(例如腌菜)中，以使得食品基于干重具有最多1000mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以掺入面包中以使得食品基于干重具有最多160mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物、植物或植物细胞生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入硬糖或软糖中，以使得食品基于干重具有最多1600mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物、植物或植物细胞生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入加工的水果产品(例如果汁、水果馅、果酱和果冻)中，以使得食品基于干重具有最多1000mg甜菊醇糖苷/kg食品。

例如，这样的甜菊醇糖苷组合物可具有90-99％的RebA和不可检测量的甜叶菊植物衍生的污染物，并基于干重以25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg并入食品中。

这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebB的组合物，其具有大于3％的RebB并被并入食品中，以使得产物中RebB的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebB的组合物具有不可检测量的源自甜叶菊植物的污染物。

这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebD的组合物，其具有大于3％的RebB并被并入食品中，以使得产物中RebD的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebD的组合物具有不可检测量的源自甜叶菊植物的污染物。

这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebE的组合物，其具有大于3％的RebE并被并入食品中，以使得产物中RebE的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebE的组合物具有不可检测量的源自甜叶菊植物的污染物。

这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebM的组合物，其具有大于3％的RebM并被并入食品中，以使得产物中RebM的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebM的组合物具有不可检测量的源自甜叶菊植物的污染物。

在一些实施方案中，将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷并入到佐餐甜味剂或“杯对杯(“cup-for-cup”)”产品中。这样的产品通常用本领域技术人员已知的一种或更多种填充剂例如麦芽糖糊精稀释至适当的甜味水平。富含RebA、RebB、RebD、RebE或RebM的甜菊醇糖苷组合物可包装在小袋中，例如，以基于干重的10,000至30,000mg甜菊醇糖苷/kg产品用于佐餐使用。

将在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例

以下实施例说明本发明的具体实施方案及其多种用途。它们仅出于说明的目的而列出，并且不被认为是限制本发明。

实施例1.LC-MS分析方法

本文描述的LC-MS方法取向为在混合物(即培养基)存在下分离、一般检测和潜在鉴定特定质量的化学品(即甜菊醇糖苷)。在(A)

3000-TSQ(Thermo FisherScientific)；(B)1290Infitity-6130SQ(Agilent)；或(C)Acquity-XevoTQD(Waters)系统上进行LC-MS分析。下面描述用于每个系统的具体方法。

方法A：除非另有说明，使用配有waters ACQUITY

BEH shield RP18柱(2.1×50mm，1.7μm颗粒，

孔径)的

3000UPLC系统(Dionex)进行LC-MS分析，所述柱连接到具有加热电喷雾离子(HESI)源的TSQ

Access(ThermoFisher Scientific)三重四极杆质谱仪。使用洗脱液B(含0.1％甲酸的MeCN)和洗脱液A(含0.1％甲酸的水)的流动相，通过逐渐增加梯度来进行洗脱，所述梯度为：0.0至4.0分钟25％增加至47％B；4.0至5.0分钟47％增加至100％B；5.0至6.5分钟保持100％B再平衡。流量为0.4mL/分钟，柱温度为35℃。采用SIM(单离子监测，Single Ion Monitoring)用下述m/z迹线来检测甜菊醇糖苷。

表1.甜菊醇糖苷的MS分析信息

通过与用来源于LGC Standards的可信标准品所获得的校准曲线进行比较来定量甜菊醇糖苷的水平。例如，通常使用0.5至100μM RebA的标准溶液来构建校准曲线。

方法B：在配有waters ACQUITY

BEH shield RP18柱(2.1×50mm，1.7μm颗粒，

孔径，Waters)的Agilent系统1290Infinity上进行第二分析方法，所述柱连接到具有APCI离子源的6130单四极杆质量检测器(Agilent)。使用洗脱液B(含0.1％甲酸的MeCN)和洗脱液A(含0.1％甲酸的水)的流动相，通过逐渐增加梯度来进行洗脱，所述梯度为：0.0至4.0分钟25％增加至47％B；4.0至5.0分钟47％增加至100％B；5.0至6.5分钟保持100％B再平衡。流量为0.6mL/分钟，柱温度为50℃。采用SIM(单离子监测)用下述m/z迹线来检测甜菊醇糖苷。

表2.甜菊醇糖苷的MS分析信息

通过与用来源于LGC Standards的可信标准品所获得的校准曲线进行比较来定量甜菊醇糖苷的水平。例如，通常使用0.3至25μM RebA的标准溶液来构建校准曲线。

方法C：所使用的第三种分析方法是使用带有Waters ACQUITY

BEH C18柱(2.1×50mm，1.7μm颗粒，

孔径)的Waters ACQUITY UPLC(Waters Corporation，Milford，MA)进行LC-MS分析，所述柱偶连到具有电喷雾电离(ESI)的处于负模式的WatersACQUITY TQD三重四极杆质谱仪。通过两个流动相A(含0.1％甲酸的水)和B(含0.1％甲酸的MeCN)的逐渐增加的梯度来实现化合物分离，所述梯度为：0.3至2.0分钟20％增加至50％B；在2.01分钟时增加至100％B，保持100％B经0.6分钟并再平衡另外0.6分钟。流量为0.6mL/分钟，柱温度为55℃。使用SIM(单离子监测)监测RebD(m/z 1127.5)、RebM(m/z 1289.5)、莱鲍迪苷A(m/z 965.4)和RebB(m/z 803.4)，并通过与可信标准品比较进行定量。

实施例2.构建甜菊醇糖苷生产酵母菌株

如WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328中所述构建生产甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株，其各自通过引用整体并入本文。例如，包含以下基因的酵母菌株生产甜菊醇糖苷：编码聚球藻属(Synechococcus sp.)GGPPS多肽的重组基因(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：149)；编码截短的玉蜀黍(Zea mays)的CDPS多肽的重组基因(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：150)；编码拟南芥(A.thaliana)KS多肽的重组基因(SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：151)；编码重组的甜叶菊(S.rebaudiana)KO1多肽的重组基因(SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：152)；编码拟南芥ATR2多肽的重组基因(SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：153)；编码稻(O.sativa)EUGT11多肽的重组基因(SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：148)；编码SrKAHe1多肽的重组基因(SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：154)；编码甜叶菊CPR8多肽的重组基因(SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：155)；编码甜叶菊UGT85C2多肽的重组基因(SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：156)；编码甜叶菊UGT74G1多肽的重组基因(SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：157)；编码甜叶菊UGT76G1多肽的重组基因(SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：158)；和编码甜叶菊UGT91D2变体(或功能同源物)，UGT91D2e-b多肽的重组基因(SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：159)。如在从全细胞和培养混合物(总产物)中经DMSO提取总甜菊醇糖苷之后通过LC-MS(方法C)分析，在30℃，在深孔板中以400rpm振荡，在1mL SC(Synthetic Complete，合成完全)培养基中生长5天后，菌株生产了18-21μg/mL或1-1.5μg/mL/OD₆₀₀的RebM。参见表3。

表3.在代表性酿酒酵母菌株中的甜菊醇糖苷生产，所述菌株包含编码GGPPS、截短的CDPS、KS、KO、ATR2、EUGT11、SrKAHe1、CPR8、UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1和EUGT11多肽的基因

分析包含第一菌株的基因的额外拷贝的第二菌株的甜菊醇糖苷生产。第二菌株生产RebD和RebM作为主要甜菊醇糖苷，但是水平比第一菌株更高。

如在从全细胞和培养混合物(总产物)中经DMSO提取总甜菊醇糖苷之后通过LC-MS(方法C)分析，在30℃，在深孔板中以400rpm振荡，在1mL SC培养基中生长5天后，第二菌株生产了60-80μg/mL或4-6μg/mL/OD₆₀₀的RebM。由第二菌株生产的RebA、RebB、RebD和RebM示于表4中。

表4.在酿酒酵母菌株中的甜菊醇糖苷生产，所述菌株包含编码GGPPS、截短的CDPS、KS、KO、ATR2、EUGT11、SrKAHe1、CPR8、UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1和EUGT11多肽的基因的额外拷贝。

实施例3.酵母内源转运基因和转运相关基因的敲除

来自实施例2和类似菌株的深孔研究的观察结果表明，上清液中RebA、RebB、RebD或RebM的级分(fraction)随时间而变化，并且已确定该效应不是细胞裂解的结果。为了确定多种转运蛋白对酿酒酵母中甜菊醇糖苷分泌的影响，通过以下获得用于同源重组的缺失盒：设计在开放阅读框(ORF)上游和下游约200bp处退火的引物，然后从酿酒酵母缺失集合中扩增ORF特异性缺失盒。所选择的候选基因包括鉴定为与转运相关或包含跨膜结构域而无论亚细胞定位的ORF。在所得菌落中，通过菌落PCR确认在正确基因座处存在缺失盒。将每个缺失的最多6个克隆作为冷库储存物(freezer stock)冷冻。将用于分析的所有样品从冷库储存物中开始并在SC培养基中培养5天(30℃，400rpm振荡)，然后收获并提取用于LC-MS的样品。分析样品中缺乏细胞的培养液(上清液)以及全细胞和培养混合物(总产物)中RebA、RebB、RebD和RebM的存在。

将总的和上清液RebA、RebB、RebD和RebM的浓度与对照甜菊醇糖苷生产菌株中的水平进行比较。通过将特定甜菊醇糖苷的值除以对照菌株的相应值，将每个样品中RebA、RebB、RebD和RebM的量相对于对照菌株归一化，从而计算相对于对照菌株的百分比，其中1等于100％。与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，“理想候选物”在不降低RebA、RebB、RebD和/或RebM总产量的情况下，将显示上清液中RebA、RebB、RebD和/或RebM水平的降低。

在甜菊醇糖苷生产菌株(例如实施例2中所述的菌株)中测试酵母基因敲除对较高分子量甜菊醇糖苷转运到培养基中的作用。通过同源重组进行对每个特异性转运蛋白基因的破坏。在1mL SC培养基中在30℃和400rpm下生长5天后，收获细胞。将50μL等分试样的培养物与等体积的100％DMSO混合，涡旋，并加热至80℃持续10分钟。然后将悬浮液离心以除去细胞碎片。通过LC-MS分析作为“总”样品的60μL混合物。然后将剩余的培养物离心以沉淀细胞。从上清液(即培养基)中取出50μL的等分试样，并与等体积的100％DMSO混合。将悬浮液加热至80℃持续10分钟并离心。通过LC-MS分析作为“上清液”样品的60μL混合物。如实施例1所述，通过LC-MS(方法C)测量较高分子量甜菊醇糖苷(包括RebA、RebB、RebD、RebM)的量。

数据证明在甜菊醇糖苷生产菌株中单一内源酵母转运蛋白基因的破坏导致培养基上清液中多种甜菊醇糖苷水平的降低，如通过转运到上清液中的经归一化量所评估的(参见表5-10)。表5-10包含在甜菊醇糖苷生产菌株中敲除的转运相关基因的列表。更具体地，表5包含按排序基因座名称汇编的基因列表，发现所述基因影响甜菊醇糖苷生产菌株中的甜菊醇糖苷分泌，并因此鉴定为在甜菊醇糖苷分泌中具有作用。当敲除指定的基因时，观察到在单独的上清液中或在上清液/总产量的比例中，RebA、RebB、RebD和/或RebM减少超过40％。这大致相当于从对照甜菊醇糖苷生产菌株的平均值减掉大于2个标准差(值1等于对照菌株的100％，而值0.5表示降低50％)。

表6包含按排序基因座名称汇编的基因列表，发现所述基因影响甜菊醇糖苷生产菌株中的甜菊醇糖苷分泌，并因此鉴定为在甜菊醇糖苷分泌中具有作用。当敲除时，这些基因导致在单独的上清液中或在上清液/总产量的比例中的平均值降低20-40％。这大致相当于从对照菌株的平均值减掉大约1至2个标准差(值1等于对照菌株的100％，而值0.5表示降低50％)。

表5A.与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，Reb A、RebB、RebD或RebM水平降低超过40％的转运相关基因。

表5B.与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，Reb A、RebB、RebD或RebM水平降低超过40％的转运相关基因续表。

表6A.与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，Reb A、RebB、RebD或RebM水平降低20-40％的转运相关基因。

表6B.与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，Reb A、RebB、RebD或RebM水平降低20-40％的转运相关基因续表。

基于对所测量的每种甜菊醇糖苷的两个选择标准(即，两种归一化表达的方法)，从数据中选择甜菊醇糖苷输出蛋白候选物。

转运蛋白选择标准1对应于基于上清液中可用的高分子量甜菊醇糖苷(RebA、RebB、RebD或RebM)水平以及所述甜菊醇糖苷的总产量的选择。两个值均对相应的甜菊醇糖苷生产对照菌株的值进行归一化。将对照水平设定为1，并将相应的甜菊醇糖苷水平计算为对照的百分比。对于目的排序基因座名称(即基因)，上清液中可用的甜菊醇糖苷应低于0.6(低于对照的60％)或0.8-0.6(对照的80-60％)。为了避免假阳性或对一般减少产量的转运蛋白的偏向，该计算具有另外的要求，即总产量必须与对照相似。在目前的计算中，当对照设置为1时，则产量设置为在对照的0.85至1.15之间。在这一点上，甜菊醇糖苷生产水平不影响结果。表7显示了满足选择标准的每个候选物的上清液/总量比例。

转运蛋白选择标准2对应于基于上清液中高分子量甜菊醇糖苷(RebA、RebB、RebD或RebM)相对于所述甜菊醇糖苷总产量之比例的选择。将上清液与总产量的比例(supernatant-to-total-production ratio)相对于相应的甜菊醇糖苷生产菌株对照的比例归一化。将对照水平设定为1，并将相应的甜菊醇糖苷比例计算为对照的百分比。对于目的排序基因座名称(即基因)，给定甜菊醇糖苷的上清液与总产量的比例应当低于0.6(低于对照的60％)或0.8-0.6(对照的80-60％)。为了避免假阳性或对一般减少产量的转运蛋白的偏向，该计算具有另外的要求，即总产量必须与对照相似。在目前的计算中，当对照设置为1时，则产量设置为在对照的0.85至1.15之间。在这一点上，甜菊醇糖苷生产水平不影响结果。表8显示了满足选择标准的每个候选物的上清液/总量比例。

数据证明，如通过转运到上清液中的经归一化量所评价的，在甜菊醇糖苷生产菌株中单个内源酵母转运蛋白基因的破坏导致培养基上清液中多种甜菊醇糖苷水平的降低(参见表5-10)，因此被鉴定为在甜菊醇糖苷分泌中具有作用。

例如，在甜菊醇糖苷生产菌株中缺失YDL128W(SEQ ID NO：22)，YDL194W(SEQ IDNO：24)，YDL210W(SEQ ID NO：25)，YFL011W(SEQ ID NO：33)，YGL006W(SEQ ID NO：34)，YGL013C(SEQ ID NO：35)，YGL255W(SEQ ID NO：36)，YGR181W(SEQ ID NO：38)，YGR217W(SEQID NO：39)，YIL088C(SEQ ID NO：43)，YJL094C(SEQ ID NO：45)，YJR106W(SEQ ID NO：48)，YNL065W(SEQ ID NO：59)，YNL083W(SEQ ID NO：61)，YNL121C(SEQ ID NO：63)，YNL142W(SEQID NO：64)，YOR306C(SEQ ID NO：75)或YPR011C(SEQ ID NO：82)导致分泌到培养基中的RebD的可检测的减少，表明各自均在RebD分泌中起作用。这由转运蛋白选择标准1和2证实(参见表7和8，RebD列)。

此外，例如，在甜菊醇糖苷生产菌株中缺失YBR180W(SEQ ID NO：13)，YBR241C(SEQID NO：17)，YCL069W(SEQ ID NO：19)，YCR075C(SEQ ID NO：21)，YDL128W(SEQ ID NO：22)，YDL194W(SEQ ID NO：24)，YDR093W(SEQ ID NO：27)，YDR338C(SEQ ID NO：28)，YER166W(SEQID NO：32)，YFL011W(SEQ ID NO：33)，YGL006W(SEQ ID NO：34)，YGL013C(SEQ ID NO：35)，YGL255W(SEQ ID NO：36)，YGR217W(SEQ ID NO：39)，YJL094C(SEQ ID NO：45)，YJR106W(SEQID NO：48)，YJR160C(SEQ ID NO：49)，YKR106W(SEQ ID NO：53)，YML116W(SEQ ID NO：55)，YMR056C(SEQ ID NO：57)，YNL070W(SEQ ID NO：60)，YNL083W(SEQ ID NO：61)，YNL095C(SEQID NO：62)，YNL121C(SEQ ID NO：63)，YOR087W(SEQ ID NO：70)，YOR291W(SEQ ID NO：74)，YOR306C(SEQ ID NO：75)，YPL274W(SEQ ID NO：80)或YPR011C(SEQ ID NO：82)导致RebM的可检测的降低，表明各自均在RebM分泌中起作用。这由转运蛋白选择标准1和2证实(参见表7和8，RebM列)。

表7表示在甜菊醇糖苷生产菌株中缺失了每种基因(按排序基因座名称)的上清液/总产量的计算比例，其对于包含编码GGPPS、截短的CDPS、KS、KO、ATR2、EUGT11、SrKAHe1、CPR8、UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1和EUGT11多肽之基因的甜菊醇糖苷生产菌株归一化。小于0.6的上清液或上清液/总量的比例表示在单独的上清液中或在上清液/总产量的比例中RebA、RebB、RebD或RebM下降超过40％，其相当于从对照甜菊醇糖苷生产菌株的平均值减掉超过2个标准差，并且表明该基因在甜菊醇糖苷转运中具有作用(表7)。0.6至0.8的上清液或上清液/总量的比例表示在单独的上清液中或在上清液/总产量的比例中RebA、RebB、RebD或RebM下降40-20％，其相当于从对照甜菊醇糖苷生产菌株的平均值减掉大约1至2个标准差，并且表明该基因在甜菊醇糖苷转运和/或生产中具有作用(表8)。与甜菊醇糖苷生产菌株相比，每种甜菊醇糖苷的总产量在0.85和1.15之间。表8显示了满足选择标准的每个候选物的上清液/总量的比例。

表7.与包含编码GGPPS、截短的CDPS、KS、KO、ATR2、EUGT11、SrKAHe1、CPR8、UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1和EUGT11多肽之基因的对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，RebA、RebB、RebD或RebM减少超过40％的转运相关基因。

表8.与包含编码GGPPS、截短的CDPS、KS、KO、ATR2、EUGT11、SrKAHe1、CPR8、UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1和EUGT11多肽之基因的对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，RebA、RebB、RebD或RebM减少20-40％的转运相关基因。

还在包含编码GGPPS、截短的CDPS、KS、KO、ATR2、EUGT11、SrKAHe1、CPR8、UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1和EUGT11多肽之基因的额外拷贝的甜菊醇糖苷生产菌株中测试了酵母基因敲除对较高分子量甜菊醇糖苷转运到培养基(即上清液)中的作用，其描述于实施例2中。数据表明，在甜菊醇糖苷生产菌株中单一内源酵母转运蛋白基因的破坏导致培养基上清液中多种甜菊醇糖苷水平的降低，如通过归一化的转运量或通过上清液与总产量的比例所评价(参见表9和10，RebD列)。例如，在甜菊醇糖苷生产菌株中缺失YDR536W(SEQ ID NO：30)，YHL016C(SEQ ID NO：42)，YKR050W(SEQ ID NO：51)，YOR291W(SEQ ID NO：74)，YOR334W(SEQID NO：77)，YPL270W(SEQ ID NO：79)，YPR058W(SEQ ID NO：83)，或YPR128C(SEQ ID NO：84)导致转运到上清液中的RebD的可检测的减少，表明它们在RebD分泌中起作用。这由转运蛋白选择标准1和2证实(参见表9和10，RebD列)。

另外，例如缺失YAL067C(SEQ ID NO：14)，YDR406W(SEQ ID NO：29)，YHL016C(SEQID NO：42)，YJL212C(SEQ ID NO：47)，YKR050W(SEQ ID NO：51)，YMR034C(SEQ ID NO：56)，YMR253C(SEQ ID NO：58)，YOL075C(SEQ ID NO：66)，YOL122C(SEQ ID NO：68)，YOR222W(SEQID NO：73)，YPR003C(SEQ ID NO：81)或YPR201W(SEQ ID NO：85)导致转运到上清液中的RebM的可检测的减少，表明它们在RebM分泌中起作用。这通过转运蛋白选择标准1和2证实(参见表9和10，RebM列)。

表9表示在甜菊醇糖苷生产菌株中缺失的每个基因(按排序基因座名称)的上清液/总产量的计算比例，其对于包含编码GGPPS、截短的CDPS、KS、KO、ATR2、EUGT11、SrKAHe1、CPR8、UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1和EUGT11多肽之基因的额外拷贝的甜菊醇糖苷生产菌株进行归一化。小于0.6的上清液或上清液/总量的比例表示在单独的上清液中或在上清液/总产量的比例中RebA、RebB、RebD或RebM降低超过40％，其相当于从对照甜菊醇糖苷生产菌株的平均值减掉大于2个标准差，并表明该基因在甜菊醇糖苷转运和/或生产中具有作用(表9)。0.6至0.8的上清液或上清液/总量的比例表示在单独的上清液中或在上清液/总产量的比例中RebA、RebB、RebD或RebM降低40-20％，其相当于从对照菌株的平均值减掉大约1至2个标准差，并表明该基因在甜菊醇糖苷转运和/或生产中具有作用，并表明该基因在甜菊醇糖苷转运和/或生产中具有作用(表10)。与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，每种甜菊醇糖苷的总产量在0.85和1.15之间。表10显示了满足选择标准的每种候选物的上清液/总量比例。

表9.与包含编码GGPPS、截短的CDPS、KS、KO、ATR2、EUGT11、SrKAHe1、CPR8、UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1和EUGT11多肽之基因的额外拷贝的对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，RebA、RebB、RebD或RebM减少超过40％的转运相关基因。

表10.与包含编码GGPPS、截短的CDPS、KS、KO、ATR2、EUGT11、SrKAHe1、CPR8、UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1和EUGT11多肽之基因的额外拷贝的对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，RebA、RebB、RebD或RebM减少20-40％的转运相关基因。

YDL210W(SEQ ID NO：25)和YPL270W(SEQ ID NO：79)的敲除导致在包含编码GGPPS、截短的CDPS、KS、KO、ATR2、EUGT11、SrKAHe1、CPR8、UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1和EUGT11多肽之基因的对照甜菊醇糖苷生产菌株和包含编码GGPPS、截短的CDPS、KS、KO、ATR2、EUGT11、SrKAHe1、CPR8、UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1和EUGT11多肽之基因的额外拷贝的甜菊醇糖苷生产菌株中RebD分泌降低。同样的，YJL212C(SEQ ID NO：47)和YOL122C(SEQID NO：68)的敲除导致在这两种菌株中RebM转运降低。

实施例4.通过在RebD/M生产菌株中过表达确认酵母内源转运基因的敲除

使用基于质粒的表达和整合盒二者进行来自实施例3的初始候选转运蛋白的亚组的过表达。首先，进行深孔微量滴定板培养实验。使用质粒在RebD/M生产菌株中过表达两个转运基因以确认敲除实验的结果。过表达YGR181W(SEQ ID NO：38)，其是TIM复合物，插入线粒体内膜蛋白的辅助蛋白；以及过表达YDR061W(SEQ ID NO：26)，其是ABC样转运蛋白。图2中所示的数据证明，用深孔板中的YGR181W(SEQ ID NO：38)和YDR061W(SEQ ID NO：26)的基于质粒的过表达表型证实了基于敲除研究的表型。

接下来，在另外的甜菊醇糖苷生产菌株中进行发酵罐中的表型确认，所述菌株通过染色体XII上的YGR181W(SEQ ID NO：38)或YDR061W(SEQ ID NO：26)的整合来表征。在30℃下使甜菊醇糖苷生产菌株在限定培养基上在葡萄糖受限条件下在补料分批发酵中生长约5天，并使用LC-MS(方法B，实施例1)测量RebA、RebB、RebD和RebM的水平。图3A-3B中所示的图表显示了在新的整合构建体的培养基中转运的RebD和RebM大约增加2倍，并且RebA和RebB转运几乎没有变化。YGR181W(SEQ ID NO：38)或YDR061W(SEQ ID NO：26)的过表达导致RebD和RebM向培养基中转运的提高(约2倍)(在YGR181W(SEQ ID NO：38)和YDR061W(SEQ IDNO：26)过表达菌株中约400-500mg/L的上清液RebD和RebM，相对于对照甜菊醇糖苷生产菌株中约250mg/L的上清液RebD和RebM)。参见图3A。转运的RebD相比于总RebD的比例从对照菌株中的0.158增加至在候选基因过表达时的0.21-0.25。RebM向培养基中的转运也同时改善。参见图3B。

实施例5.所选酵母内源转运基因的过表达

使用具有表11中所示的转运蛋白基因的组成型启动子的质粒在甜菊醇糖苷生产菌株(如实施例2所述)中的过表达导致RebA、RebB、RebD和/或RebM的分泌增加超过20％。使用实施例3中描述的标准2分析结果。另外，表12中所示的转运蛋白基因的过表达导致RebA、RebB、RebD和/或RebM产量提高超过40％。表11显示了满足选择标准的每个候选物的上清液/总量比例。

表11.与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，RebA、RebB、RebD或RebM分泌增加超过20％的转运相关基因。

表12.与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，RebA、RebB、RebD或RebM产量增加超过40％的转运相关基因。

实施例6.转运蛋白基因的基因组整合

通过PCR从S288C背景中扩增所选择的用于整合到生产RebD/M的酿酒酵母菌株(参见实施例2)之基因组中的转运蛋白基因DNA，并使用USER克隆系统克隆到具有用于整合位点的同源区和用于过表达的PGK1启动子的质粒中。参见例如，Nour-Eldi等，2010，MethodsMol Biol.643：185-200。使用限制酶从质粒中切出包含同源区域和转运蛋白的USER克隆构建体，并通过标准LiAc方法将线性片段DNA整合到生产菌株的接受RebD/M的基因组中。在添加生长培养基后从聚合物释放葡萄糖的平板中测试基因组上整合的转运蛋白。使用在3天内释放20g/L葡萄糖的聚合物来模拟发酵期间的进料特征。通过LC-MS(参见实施例1)测量甜菊醇糖苷水平，并在Perkin Elmer 2104 Multilabel读数器上测量OD₆₀₀。YBR043C(SEQID NO：88)、YEL027W(SEQ ID NO：102)、YJL093C(SEQ ID NO：44)、YJR106W(SEQ ID NO：48)、YKL120W(SEQ ID NO：126)和YMR166C(SEQ ID NO：132)表现出13-SG分泌提高。(图4A)。YBR043C(SEQ ID NO：88)、YEL027W(SEQ ID NO：102)和YMR166C(SEQ ID NO：132)表现出RebA分泌提高(图4B)。YBR043C(SEQ ID NO：88)、YEL027W(SEQ ID NO：102)和YMR166C(SEQID NO：132)表现出RebB分泌提高(图4C)。SEQ ID NO：88的YBR043C、SEQ ID NO：102的YEL027W、SEQ ID NO：44的YJL093C、SEQ ID NO：48的YJR106W和SEQ ID NO：132的YMR166C表现出RebD产量提高，并且SEQ ID NO：88的YBR043C、SEQ ID NO：102的YEL027W、YIL166C(SEQID NO：121)、SEQ ID NO：44的YJL093C、SEQ ID NO：48的YJR106W和SEQ ID NO：132的YMR166C表现出RebM产量提高，如通过与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比上清液中RebD和RebM水平的增加所测量。参见图4D和4E。具有URA标志物的对照也显示在图4A-4E中。

图5A显示通过USER克隆系统过表达YMR166C(SEQ ID NO：132)、YEL027W(SEQ IDNO：102)、YKL120W(SEQ ID NO：126)、YJR106W(SEQ ID NO：48)、YJL093C(SEQ ID NO：44)和YBR043C(SEQ ID NO：88)的另外的甜菊醇糖苷生产菌株的RebA、RebB、RebD和RebM的上清液水平。图5A-5B的菌株包含：编码聚球藻属GGPPS多肽的重组基因(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：149)；编码截短的玉蜀黍(Zea mays)的CDPS多肽的重组基因(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：150)；编码拟南芥KS多肽的重组基因(SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：151)；编码重组的甜叶菊KO1多肽的重组基因(SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：152)；编码KO多肽的重组基因(SEQ ID NO：XX，SEQ ID NO：XX)；编码拟南芥ATR2多肽的重组基因(SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：153)；编码稻EUGT11多肽的重组基因(SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：148)；编码SrKAHe1多肽的重组基因(SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：154)；编码甜叶菊CPR8多肽的重组基因(SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：155)；编码甜叶菊UGT85C2多肽的重组基因(SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：156)；编码甜叶菊UGT74G1多肽的重组基因(SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：157)；编码甜叶菊UGT76G1多肽的重组基因(SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：158)；和编码甜叶菊UGT91D2变体(或功能同源物)，UGT91D2e-b多肽的重组基因(SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：159)。图5B显示通过USER克隆系统过表达YMR166C(SEQ ID NO：132)、YEL027W(SEQ ID NO：102)、YKL120W(SEQ ID NO：126)、YIL166C(SEQ ID NO：132)、YJR106W(SEQ ID NO：48)、YJL093C(SEQ ID NO：44)和YBR043C(SEQ ID NO：88)的上述甜菊醇糖苷生产菌株的RebA、RebB、RebD和RebM的总水平。

实施例7.通过过表达YJL093C或YBR043C的生产甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株的发酵生产RebD和RebM

在实施例3中所述的甜菊醇糖苷生产菌株中单独过表达YJL093C(SEQ ID NO：44)和YBR043C(SEQ ID NO：88)。通过发酵(补料分批，基本培养基，葡萄糖限制)培养菌株约130小时。通过LC-MS测量RebD和RebM的产量。如表13中所示，与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，过表达YJL093C或YBR043C的菌株生产更高水平的RebD和RebD+RebM。

表13.过表达YJL093C和YBR043C的酿酒酵母菌株中RebD和RebM的产量。

表14.本文中公开的序列。

SEQ ID NO：1

聚球藻属GGPPS(GenBank ABC98596.1)

SEQ ID NO：2

玉蜀黍截短的CDPS

SEQ ID NO：3

拟南芥(Arabidopsis thaliana)KS(与GenBank AEE36246.1相似)

SEQ ID NO：4

甜叶菊KO1(密码子优化的)

SEQ ID NO：5

拟南芥ATR2(密码子优化的)

SEQ ID NO：6

甜叶菊KAHe1(密码子优化的)

SEQ ID NO：7

甜叶菊CPR8

SEQ ID NO：8

甜叶菊UGT85C2(密码子优化的)

SEQ ID NO：9

甜叶菊UGT74G1(GenBank AAR06920.1)

SEQ ID NO：10

甜叶菊UGT76G1(密码子优化的)

SEQ ID NO：11

甜叶菊UGT91D2e-b(密码子优化的)

SEQ ID NO：12

编码EUGT11的稻(Oryza sativa)序列(密码子优化的)

SEQ ID NO：13

YBR180W

＞sp|P38125|DTR1_YEAST二酪氨酸转运蛋白1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝DTR1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：14

YAL067C

＞sp|P39709|SEO1_YEAST可能的转运蛋白SEO1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝SEO1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：15

YBLD89W

＞sp|P38176|AVT5_YEAST液泡氨基酸转运蛋白5 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝AVT5 PE＝3 SV＝2

SEQ ID NO：16

YBL099W

＞sp|P07251|ATPA_YEAST ATP合酶亚基α，线粒体OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝ATP1 PE＝1 SV＝5

SEQ ID NO：17

YBR241C

＞sp|P38142|YB91_YEAST可能的代谢物转运蛋白YBR241C OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝YBR241C PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：18

YBR294W

＞sp|P38359|SUL1_YEAST硫酸盐通透酶1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝SUL1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：19

YCL069W

＞sp|P25594|VBA3_YEAST液泡碱性氨基酸转运蛋白3 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝VBA3 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：20

YCR028C

＞sp|P25621|FEN2_YEAST泛酸转运蛋白FEN2 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝FEN2 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：21

YCR075C

＞sp|P17261|ERS1_YEAST胱氨酸转运蛋白OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝ERS1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：22

YDL128W

＞sp|Q99385|VCX1_YEAST液泡钙离子转运蛋白OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝VCX1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：23

YDL185W

＞sp|P17255|VATA_YEAST V型质子ATP酶催化亚基A OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝VMA1 PE＝1 SV＝3

SEQ ID NO：24

YDL194W

＞sp|P10870|SNF3_YEAST高亲和力葡萄糖转运蛋白SNF3 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝SNF3 PE＝1 SV＝3

SEQ ID NO：25

YDL210W

＞sp|P32837|UGA4_YEAST GABA特异性通透酶OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝UGA4 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：26

YDR061W

＞sp|Q12298|YD061_YEAST未表征的ABC转运蛋白ATP结合蛋白YDR061W OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝YDR061W PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：27

YDR093W

＞sp|Q12675|ATC4_YEAST磷脂转运ATP酶DNF2 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝DNF2 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：28

YDR338C

＞sp|Q05497|YD338_YEAST未表征的转运蛋白YDR338C OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝YDR338C PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：29

YDR406W

＞sp|Q04182|PDR15_YEAST ATP依赖性通透酶PDR15 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝PDR15 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：30

YDR536W

＞sp|P39932|STL1_YEAST糖转运蛋白STL1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝STL1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：31

YEL031W

＞sp|P39986|ATC6_YEAST锰转运ATP酶1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝SPF1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：32

YER166W

＞sp|P32660|ATC5_YEAST磷脂转运ATP酶DNF1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝DNF1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：33

YFL011W

＞sp|P43581|HXT10_YEAST己糖转运蛋白HXT10 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝HXT10 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：34

YGL006W

＞sp|P38929|ATC2_YEAST钙转运ATP酶2 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝PMC1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：35

YGL013C

＞sp|P12383|PDR1_YEAST转录因子PDR1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝PDR1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：36

YGL255W

＞sp|P32804|ZRT1_YEAST锌调节转运蛋白1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝ZRT1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：37

YGR125W

＞sp|P53273|YG35_YEAST未表征的液泡膜蛋白YGR125W OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝YGR125W PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：38

YGR181W

＞sp|P53299|TIM13_YEAST线粒体输入内膜移位酶亚基TIM13 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝TIM13 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：39

YGR217W

＞sp|P50077|CCH1_YEAST钙通道蛋白CCH1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝CCH1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：40

YGR224W

＞sp|P50080|AZR1_YEAST吡咯抗性蛋白1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝AZR1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：41

YGR281W

＞sp|P53049|YOR1_YEAST寡霉素抗性ATP依赖性通透酶YOR1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝YOR1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：42

YHL016C

＞sp|P33413|DUR3_YEAST尿素主动转运蛋白OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝DUR3 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：43

YIL088C

＞sp|P40501|AVT7_YEAST液泡氨基酸转运蛋白7 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝AVT7 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：44

YJL093C

＞sp|P40310|TOK1_YEAST外向整流钾通道TOK1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝TOK1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：45

YJL094C

＞sp|P40309|KHA1_YEAST K(+)/H(+)反向转运蛋白1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝KHA1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：46

YJL108C

＞sp|P42946|PRM10_YEAST信息素调节的膜蛋白10 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝PRM10 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：47

YJL212C

＞sp|P40897|OPT1_YEAST寡肽转运蛋白1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝OPT1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：48

YJR106W

＞sp|P47144|ECM27_YEAST蛋白ECM27 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝ECM27 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：49

YJR160C

＞sp|P0CE00|MPH3_YEAST α葡糖苷通透酶MPH3 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝MPH3 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：50

YKL064W

＞sp|P35724|MNR2_YEAST锰抗性蛋白MNR2 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝MNR2 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：51

YKR050W

＞sp|P28584|TRK2_YEAST低亲和力钾转运蛋白OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝TRK2 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：52

YKR105C

＞sp|P36172|VBA5_YEAST液泡碱性氨基酸转运蛋白5 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝VBA5 PE＝3 SV＝1

SEQ ID NO：53

YKR106W

＞sp|P36173|GEX2_YEAST谷胱甘肽交换蛋白(exchanger)2 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝GEX2 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：54

YLR447C

＞sp|P32366|VA0D_YEAST V型质子ATP酶亚基d OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝VMA6 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：55

YML116W

＞sp|P13090|ATR1_YEAST氨基三唑耐药蛋白OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝ATR1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：56

YMR034C

＞sp|Q05131|YMS4_YEAST未表征的膜蛋白YMR034C OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝YMR034C PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：57

YMR056C

＞sp|P04710|ADT1_YEAST ADP，ATP运载蛋白1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝AAC1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：58

YMR253C

＞sp|Q04835|YM87_YEAST未表征的膜蛋白YMR253C OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝YMR253C PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：59

YNL065W

＞sp|P53943|AQR1_YEAST可能的转运蛋白AQR1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝AQR1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：60

YNL070W

＞sp|P53507|TOM7_YEAST线粒体输入受体亚基TOM7 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝TOM7 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：61

YNL083W

＞sp|D6W196|CMC1_YEAST截短的非功能性钙结合线粒体运载体SAL1-1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝SAL1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：62

YNL095C

＞sp|P53932|YNJ5_YEAST未表征的转运蛋白YNL095C OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝YNL095C PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：63

YNL121C

＞sp|P07213|TOM70_YEAST线粒体输入受体亚基TOM70 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝TOM70 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：64

YNL142W

＞sp|P41948|MEP2_YEAST铵转运蛋白MEP2 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝MEP2 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：65

YOL020W

＞sp|P38967|TAT2_YEAST色氨酸通透酶OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝TAT2 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：66

YOL075C

＞sp|Q08234|YO075_YEAST未表征的ABC转运蛋白ATP结合蛋白/通透酶YOL075COS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝YOL075C PE＝1 SV＝3

SEQ ID NO：67

YOL077W-A

＞sp|P81451|ATP19_YEAST ATP合酶亚基K，线粒体OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝ATP19 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：68

YOL122C

＞sp|P38925|SMF1_YEAST锰转运蛋白SMF1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝SMF1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：69

YOR079C

＞sp|Q12067|ATX2_YEAST金属稳态因子ATX2 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝ATX2 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：70

YOR087W

＞sp|Q12324|YVC1_YEAST钙通道YVC1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝YVC1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：71

YOR092W

＞sp|Q99252|ECM3_YEAST蛋白ECM3 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝ECM3 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：72

YOR130C

＞sp|Q12375|ORT1_YEAST线粒体鸟氨酸转运蛋白1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝ORT1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：73

YOR222W

＞sp|Q99297|ODC2_YEAST线粒体2-氧代二羧酸盐运载体2 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝ODC2 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：74

YOR291W

＞sp|Q12697|YPK9_YEAST液泡阳离子转运ATP酶YPK9 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝YPK9 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：75

YOR306C

＞sp|Q08777|MCH5_YEAST核黄素转运蛋白MCH5 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝MCH5 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：76

YOR316C

＞sp|P32798|COT1_YEAST钴摄取蛋白COT1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝COT1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：77

YOR334W

＞sp|Q01926|MRS2_YEAST镁转运蛋白MRS2，线粒体OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝MRS2 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：78

YPL078C

＞sp|P05626|ATPF_YEAST ATP合酶亚基4，线粒体OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝ATP4 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：79

YPL270W

＞sp|P33311|MDL2_YEAST ATP依赖型通透酶MDL2，线粒体OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝MDL2 PE＝1 SV＝3

SEQ ID NO：80

YPL274W

＞sp|Q08986|SAM3_YEAST S-腺苷甲硫氨酸通透酶SAM3 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝SAM3 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：81

YPR003C

＞sp|P53394|SULX_YEAST推定的硫酸盐转运蛋白YPR003C OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝YPR003C PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：82

YPR011C

＞sp|Q12251|YP011_YEAST未表征的线粒体运载体YPR011C OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝YPR011C PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：83

YPR058W

＞sp|P32331|YMC1_YEAST运载蛋白YMC1，线粒体OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝YMC1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：84

YPR128C

＞sp|Q06497|ANT1_YEAST过氧化物酶体腺嘌呤核苷酸转运蛋白1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝ANT1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：85

YPR201W

＞sp|Q06598|ARR3_YEAST耐砷蛋白3 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝ARR3 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：86

YBR008C

＞sp|P38124|FLR1_YEAST氟康唑耐药蛋白1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝FLR1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：87

YBR021W

＞sp|P05316|FUR4_YEAST尿嘧啶通透酶OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝FUR4 PE＝3 SV＝2

SEQ ID NO：88

YBR043C

＞sp|P38227|QDR3_YEAST奎尼定耐药蛋白3 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝QDR3 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：89

YBR287W

＞sp|P38355|YB8B_YEAST未表征的转运蛋白YBR287W OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝YBR287W PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：90

YBR295W

＞sp|P38360|ATU1_YEAST P型阳离子转运ATP酶OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝PCA1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：91

YBR296C

＞sp|P38361|PHO89_YEAST磷酸通透酶PHO89 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝PHO89 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：92

YCL038C

＞sp|P25568|ATG22_YEAST自噬相关蛋白22 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝ATG22 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：93

YCR011C

＞sp|P25371|ADP1_YEAST可能的ATP依赖性通透酶OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝ADP1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：94

YDL054C

＞sp|Q07376|MCH1_YEAST可能的转运蛋白MCH1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝MCH1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：95

YDL100C

＞sp|Q12154|GET3_YEAST ATP酶GET3 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝GET3 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：96

YDL245C

＞sp|P54854|HXT15_YEAST己糖转运蛋白HXT15 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝HXT15 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：97

YDL247W

＞sp|P0CD99|MPH2_YEAST α葡糖苷通透酶MPH2 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝MPH2 PE＝2 SV＝1

SEQ ID NO：98

YDR011W

＞sp|P32568|SNQ2_YEAST蛋白SNQ2 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝SNQ2 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：99

YDR292C

＞sp|P32916|SRPR_YEAST信号识别颗粒受体亚基α同源物OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝SRP101 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：100

YDR497C

＞sp|P30605|ITR1_YEAST肌醇转运蛋白1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝ITR1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：101

YEL006W

＞sp|P39953|YEA6_YEAST线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转运蛋白2 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝YEA6 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：102

YEL027W

＞sp|P25515|VATL1_YEAST V型质子ATP酶亚基c OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝VMA3 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：103

YEL065W

＞sp|P39980|SIT1_YEAST铁载体铁转运蛋白1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝SIT1 PE＝3 SV＝1

SEQ ID NO：104

YER019C-A

＞sp|P52871|SC6B2_YEAST蛋白转运蛋白SBH2 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝SBH2 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：105

YER053C

＞sp|P40035|PIC2_YEAST线粒体磷酸运载蛋白2 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝PIC2 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：106

YER119C

＞sp|P40074|AVT6_YEAST液泡氨基酸转运蛋白6 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝AVT6 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：107

YFL028C

＞sp|P43569|CAF16_YEAST CCR4相关因子16 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝CAF16 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：108

YFR045W

＞sp|P43617|YFL5_YEAST未表征的线粒体运载体YFR045W OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝YFR045W PE＝1 SV＝3

SEQ ID NO：109

YGL084C

＞sp|P53154|GUP1_YEAST甘油摄取蛋白1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝GUP1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：110

YGL104C

＞sp|P53142|VPS73_YEAST液泡蛋白分选相关蛋白73 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝VPS73 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：111

YGL114W

＞sp|P53134|YGL4_YEAST推定的寡肽转运蛋白YGL114W OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝YGL114W PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：112

YGL167C

＞sp|P13586|ATC1_YEAST钙转运ATP酶1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝PMR1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：113

YGR257C

＞sp|P53320|MTM1_YEAST线粒体运载蛋白MTM1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝MTM1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：114

YHL035C

＞sp|P38735|VMR1_YEAST ABC转运蛋白ATP结合蛋白/通透酶VMR1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝VMR1 PE＝2 SV＝1

SEQ ID NO：115

YHL036W

＞sp|P38734|MUP3_YEAST低亲和性甲硫氨酸通透酶OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝MUP3 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：116

YHR002W

＞sp|P38702|LEU5_YEAST线粒体运载蛋白LEU5 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝LEU5 PE＝3 SV＝1

SEQ ID NO：117

YHR096C

＞sp|P38695|HXT5_YEAST可能的葡萄糖转运蛋白HXT5 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝HXT5 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：118

YIL006W

＞sp|P40556|YIA6_YEAST线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转运体1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝YIA6 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：119

YIL120W

＞sp|P40475|QDR1_YEAST奎尼定耐药蛋白1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝QDR1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：120

YIL121W

＞sp|P40474|QDR2_YEAST奎尼定耐药蛋白2 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝QDR2 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：121

YIL166C

＞sp|P40445|YIQ6_YEAST未表征的转运蛋白YIL166C OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝YIL166C PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：122

YJL133W

＞sp|P10566|MRS3_YEAST线粒体RNA剪接蛋白MRS3 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝MRS3 PE＝1 SV＝4

SEQ ID NO：123

YJL219W

＞sp|P40885|HXT9_YEAST己糖转运蛋白HXT9 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝HXT9 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：124

YKL016C

＞sp|P30902|ATP7_YEAST ATP合酶亚基d，线粒体OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝ATP7 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：125

YKL050C

＞sp|P35736|YKF0_YEAST未表征的蛋白质YKL050C OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝YKL050C PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：126

YKL120W

＞sp|P32332|OAC1_YEAST线粒体草酰乙酸盐/酯转运蛋白OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝OAC1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：127

YKL146W

＞sp|P36062|AVT3_YEAST液泡氨基酸转运蛋白3 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝AVT3 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：128

YKL209C

＞sp|P12866|STE6_YEAST α因子转运ATP酶OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝STE6 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：129

YKR039W

＞sp|P19145|GAP1_YEAST一般氨基酸通透酶GAP1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝GAP1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：130

YLR411W

＞sp|Q06686|CTR3_YEAST铜转运蛋白CTR3 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝CTR3 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：131

YML038C

＞sp|Q03697|YMD8_YEAST推定的核苷酸-糖转运蛋白YMD8 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝YMD8 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：132

YMR166C

＞sp|Q03829|YM39_YEAST未表征的线粒体运载体YMR166C OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝YMR166C PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：133

YMR279C

＞sp|Q03263|YM8M_YEAST未表征的转运蛋白YMR279C OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝YMR279C PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：134

YNL003C

＞sp|P38921|PET8_YEAST推定的线粒体运载蛋白PET8 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝PET8 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：135

YNL268W

＞sp|P32487|LYP1_YEAST赖氨酸特异性通透酶OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝LYP1 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：136

YNR055C

＞sp|P53389|HOL1_YEAST蛋白HOL1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝HOL1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：137

YOL158C

＞sp|Q08299|ENB1_YEAST铁载体铁转运蛋白ENB1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝ENB1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：138

YOR100C

＞sp|Q12289|CRC1_YEAST线粒体肉碱运载体OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝CRC1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：139

YOR153W

＞sp|P33302|PDR5_YEAST多种药物的多效ABC外排转运蛋白OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝PDR5 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：140

YOR271C

＞sp|Q12029|FSF1_YEAST可能的线粒体转运蛋白FSF1 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝FSF1 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：141

YOR273C

＞sp|Q12256|TPO4_YEAST多胺转运蛋白4 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝TP04 PE＝1 SV＝1

SEQ ID NO：142

YOR307C

＞sp|P22215|SLY41_YEAST未表征的转运蛋白SLY41 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝SLY41 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：143

YOR332W

＞sp|P22203|VATE_YEAST V型质子ATP酶亚基E OS＝酿酒酵母(菌株ATCC204508/S288c)GN＝VMA4 PE＝1 SV＝4

SEQ ID NO：144

YOR348C

＞sp|P15380|PUT4_YEAST脯氨酸特异性通透酶OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝PUT4 PE＝1 SV＝2

SEQ ID NO：145

YPL036W

＞sp|P19657|PMA2_YEAST血浆膜ATP酶2 OS＝酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)GN＝PMA2 PE＝1 SV＝3

SEQ ID NO：146

YDL198C

SEQ ID NO：147

YFL054C

SEQ ID NO：148

编码EUGT11的稻序列

SEQ ID NO：149

聚球藻属GGPPS

SEQ ID NO：150

玉蜀黍截短的CDPS

SEQ ID NO：151

拟南芥KS(与GenBank AEE36246.1相似)

SEQ ID NO：152

甜叶菊KO1

SEQ ID NO：153

拟南芥ATR2

SEQ ID NO：154

甜叶菊KAHe1

SEQ ID NO：155

甜叶菊CPR8

SEQ ID NO：156

甜叶菊UGT85C2

SEQ ID NO：157

甜叶菊UGT74G1(GenBank AAR06920.1)

SEQ ID NO：158

甜叶菊UGT76G1

SEQ ID NO：159

甜叶菊UGT91D2e-b

SEQ ID NO：160

SEQ ID NO：161

已经详细地并通过参考其具体实施方案描述了本发明，明显的是，在不脱离所附权利要求中限定的本发明的范围的情况下，修改和变化是可能的。更具体地，尽管本发明的一些方面在本文中被认为是特别有利的，但是预期本发明不必限于本发明的这些特定方面。

以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：

1.能够合成甜菊醇糖苷的重组宿主，其包含编码转运蛋白多肽的基因和/或编码调节至少一种转运蛋白基因表达的转录因子多肽的基因；

其中所述编码转运蛋白多肽的基因和/或所述编码调节至少一种转运蛋白基因表达的转录因子多肽的基因之表达被修饰，并且所述重组宿主将至少一部分合成的甜菊醇糖苷从所述宿主转运到培养基中。

2.项1所述的重组宿主，其中所述编码转运蛋白多肽的基因是内源基因。

3.项1或2中任一项所述的重组宿主，其中所述转运蛋白多肽包括ATP结合盒(ABC)转运蛋白、主要促进子超家族(MFS)转运蛋白、氨基酸/生长素通透酶(AAAP)家族转运蛋白、ATP酶转运蛋白、硫酸盐通透酶(SulP)家族转运蛋白、溶酶体胱氨酸转运蛋白(LCT)家族转运蛋白、Ca2+：阳离子反向转运蛋白(CaCA)家族转运蛋白、氨基酸-多胺-有机阳离子(APC)超家族转运蛋白、多药/寡糖基脂质/多糖(MOP)转运蛋白、ZRT/IRT样蛋白(ZIP)金属转运蛋白家族转运蛋白、线粒体蛋白移位酶(MPT)家族转运蛋白、电压门控离子通道(VIC)家族转运蛋白、单价阳离子：质子反向转运蛋白-2(CPA2)家族转运蛋白、推定的跨膜氨基酸外排转运蛋白ThrE家族、寡肽转运蛋白(OPT)家族转运蛋白、Kw转运蛋白(Trk)家族转运蛋白、胆汁酸：Na同向转运体(BASS)家族转运蛋白、药物/代谢物转运蛋白(DMT)超家族转运蛋白、线粒体运载体(MC)家族转运蛋白、生长素外排运载体(AEC)家族转运蛋白、氨通道转运蛋白(Amt)家族转运蛋白、金属离子(Mn²⁺-铁)转运蛋白(Nramp)家族转运蛋白、瞬时受体电位Ca² ⁺通道(TRP-CC)家族转运蛋白、耐砷-3(ACR3)家族转运蛋白、核碱基：阳离子同向转运体-1(NCS1)家族转运蛋白、无机磷酸转运蛋白(PiT)家族转运蛋白、亚砷酸-亚锑酸盐(ArsAB)外排家族转运蛋白、转运蛋白IISP家族、甘油摄取(GUP)家族转运蛋白、金属离子转运(MIT)家族转运蛋白、铜转运(Ctr)家族转运蛋白或阳离子扩散促进子(CDF)家族转运蛋白。

4.项1-3中任一项所述的重组宿主，其中修饰的表达包括：

5.项1-4中任一项所述的重组宿主，其中所述编码转运蛋白多肽的基因和/或所述编码转录因子多肽的基因具有提高的活性。

6.项1-5中任一项所述的重组宿主，其中所述编码转运蛋白多肽的基因中的一个或更多个和/或所述编码转录因子多肽的基因中的一个或更多个过表达。

7.项6所述的重组宿主，其中所述转运蛋白多肽和/或转录多肽包括：SEQ ID NO：14中所示的YAL067C，SEQ ID NO：15中所示的YBL089W，SEQ ID NO：16中所示的YBL099W，SEQID NO：86中所示的YBR008C，SEQ ID NO：87中所示的YBR021W，SEQ ID NO：88中所示的YBR043C，SEQ ID NO：13中所示的YBR180W，SEQ ID NO：17中所示的YBR241C，SEQ ID NO：89中所示的YBR287W，SEQ ID NO：18中所示的YBR294W，SEQ ID NO：90中所示的YBR295W，SEQID NO：91中所示的YBR296C，SEQ ID NO：92中所示的YCL038C，SEQ ID NO：19中所示的YCL069W，SEQ ID NO：93中所示的YCR011C，SEQ ID NO：20中所示的YCR028C，SEQ ID NO：21中所示的YCR075C，SEQ ID NO：94中所示的YDL054C，SEQ ID NO：95中所示的YDL100C，SEQID NO：22中所示的YDL128W，SEQ ID NO：23中所示的YDL185W，SEQ ID NO：24中所示的YDL194W，SEQ ID NO：25中所示的YDL210W，SEQ ID NO：96中所示的YDL245C，SEQ ID NO：97中所示的YDL247W，SEQ ID NO：98中所示的YDR011W，SEQ ID NO：26中所示的YDR061W，SEQID NO：27中所示的YDR093W，SEQ ID NO：99中所示的YDR292C，SEQ ID NO：28中所示的YDR338C，SEQ ID NO：29中所示的YDR406W，SEQ ID NO：100中所示的YDR497C，SEQ ID NO：30中所示的YDR536W，SEQ ID NO：101中所示的YEL006W，SEQ ID NO：102中所示的YEL027W，SEQID NO：31中所示的YEL031W，SEQ ID NO：103中所示的YEL065W，SEQ ID NO：104中所示的YER019C-A，SEQ ID NO：105中所示的YER053C，SEQ ID NO：106中所示的YER119C，SEQ IDNO：32中所示的YER166W，SEQ ID NO：33中所示的YFL011W，SEQ ID NO：107中所示的YFL028C，SEQ ID NO：108中所示的YFR045W，SEQ ID NO：34中所示的YGL006W，SEQ ID NO：35中所示的YGL013C，SEQ ID NO：109中所示的YGL084C，SEQ ID NO：110中所示的YGL104C，SEQID NO：111中所示的YGL114W，SEQ ID NO：112中所示的YGL167C，SEQ ID NO：36中所示的YGL255W，SEQ ID NO：37中所示的YGR125W，SEQ ID NO：38中所示的YGR181W，SEQ ID NO：39中所示的YGR217W，SEQ ID NO：40中所示的YGR224W，SEQ ID NO：113中所示的YGR257C，SEQID NO：41中所示的YGR281W，SEQ ID NO：42中所示的YHL016C，SEQ ID NO：114中所示的YHL035C，SEQ ID NO：115中所示的YHL036W，SEQ ID NO：116中所示的YHR002W，SEQ ID NO：117中所示的YHR096C，SEQ ID NO：118中所示的YIL006W，SEQ ID NO：43中所示的YIL088C，SEQ ID NO：119中所示的YIL120W，SEQ ID NO：120中所示的YIL121W，SEQ ID NO：121中所示的YIL166C，SEQ ID NO：44中所示的YJL093C，SEQ ID NO：45中所示的YJL094C，SEQ ID NO：46中所示的YJL108C，SEQ ID NO：122中所示的YJL133W，SEQ ID NO：47中所示的YJL212C，SEQ ID NO：123中所示的YJL219W，SEQ ID NO：48中所示的YJR106W，SEQ ID NO：49中所示的YJR160C，SEQ ID NO：124中所示的YKL016C，SEQ ID NO：125中所示的YKL050C，SEQ ID NO：50中所示的YKL064W，SEQ ID NO：126中所示的YKL120W，SEQ ID NO：127中所示的YKL146W，SEQ ID NO：128中所示的YKL209C，SEQ ID NO：129中所示的YKR039W，SEQ ID NO：51中所示的YKR050W，SEQ ID NO：52中所示的YKR105C，SEQ ID NO：53中所示的YKR106W，SEQ ID NO：130中所示的YLR411W，SEQ ID NO：54中所示的YLR447C，SEQ ID NO：131中所示的YML038C，SEQ ID NO：55中所示的YML116W，SEQ ID NO：56中所示的YMR034C，SEQ ID NO：57中所示的YMR056C，SEQ ID NO：132中所示的YMR166C，SEQ ID NO：58中所示的YMR253C，SEQ ID NO：133中所示的YMR279C，SEQ ID NO：134中所示的YNL003C，SEQ ID NO：59中所示的YNL065W，SEQ ID NO：60中所示的YNL070W，SEQ ID NO：61中所示的YNL083W，SEQ ID NO：62中所示的YNL095C，SEQ ID NO：63中所示的YNL121C，SEQ ID NO：64中所示的YNL142W，SEQ ID NO：135中所示的YNL268W，SEQ ID NO：136中所示的YNR055C，SEQ ID NO：65中所示的YOL020W，SEQID NO：66中所示的YOL075C，SEQ ID NO：67中所示的YOL077W-A，SEQ ID NO：68中所示的YOL122C，SEQ ID NO：137中所示的YOL158C，SEQ ID NO：69中所示的YOR079C，SEQ ID NO：70中所示的YOR087W，SEQ ID NO：71中所示的YOR092W，SEQ ID NO：138中所示的YOR100C，SEQID NO：72中所示的YOR130C，SEQ ID NO：139中所示的YOR153W，SEQ ID NO：73中所示的YOR222W，SEQ ID NO：140中所示的YOR271C，SEQ ID NO：141中所示的YOR273C，SEQ ID NO：74中所示的YOR291W，SEQ ID NO：75中所示的YOR306C，SEQ ID NO：142中所示的YOR307C，SEQ ID NO：76中所示的YOR316C，SEQ ID NO：143中所示的YOR332W，SEQ ID NO：77中所示的YOR334W，SEQ ID NO：144中所示的YOR348C，SEQ ID NO：145中所示的YPL036W，SEQ ID NO：78中所示的YPL078C，SEQ ID NO：79中所示的YPL270W，SEQ ID NO：80中所示的YPL274W，SEQID NO：81中所示的YPR003C，SEQ ID NO：82中所示的YPR011C，SEQ ID NO：83中所示的YPR058W，SEQ ID NO：84中所示的YPR128C，或SEQ ID NO：85中所示的YPR201W。

8.项1-7中任一项所述的重组宿主，其中以下序列得到过表达：SEQ ID NO：88中所示的YBR043C，SEQ ID NO：95中所示的YDL100C，SEQ ID NO：94中所示的YDL054C，SEQ IDNO：22中所示的YDL128W，SEQ ID NO：146中所示的YDL198C，SEQ ID NO：26中所示的YDR061W，SEQ ID NO：30中所示的YDR536W，SEQ ID NO：102中所示的YEL027W，SEQ ID NO：147中所示的YFL054C，SEQ ID NO：112中所示的YGL167C，SEQ ID NO：38中所示的YGR181W，SEQ ID NO：42中所示的YHL016C，SEQ ID NO：121中所示的YIL166C，SEQ ID NO：44中所示的YJL093C，SEQ ID NO：48中所示的YJR106W，SEQ ID NO：126中所示的YKL120W，SEQ ID NO：127中所示的YKL146W，SEQ ID NO：129中所示的YKR039W，SEQ ID NO：56中所示的YMR034C，SEQ ID NO：132中所示的YMR166C，SEQ ID NO：68中所示的YOL122C，SEQ ID NO：69中所示的YOR079C，SEQ ID NO：79中所示的YPL270W，和/或SEQ ID NO：82中所示的YPR011C。

9.项1-8中任一项所述的重组宿主，其还包含：

(a)编码蔗糖转运蛋白和蔗糖合酶的一种或更多种基因；

(b)编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因；

(c)编码E型-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因；

(d)编码贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因；

(e)编码贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽的基因；

(f)编码甜菊醇合酶(KAH)多肽的基因；

(g)编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因；

(h)编码UGT85C2多肽的基因；

(i)编码UGT76G1多肽的基因；

(j)编码UGT74G1多肽的基因；

(k)编码UGT91D2功能同源物的基因；和/或

(l)编码EUGT11多肽的基因；

其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且

10.项9所述的重组宿主，其中所述基因中的至少一个被密码子优化以用于在所述宿主中表达。

11.项10所述的重组宿主，其中所述基因中的至少一个被密码子优化以用于在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达。

12.项9所述的重组宿主，其中：

13.项1-12中任一项所述的重组宿主，其中所述重组宿主包含以下微生物：植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌细胞。

14.项13所述的重组宿主，其中所述细菌细胞包含埃希氏菌属(Escherichia)细菌细胞，乳杆菌属(Lactobacillus)细菌细胞，乳球菌属(Lactococcus)细菌细胞，棒状杆菌属(Cornebacterium)细菌细胞，醋杆菌属(Acetobacter)细菌细胞，不动杆菌属(Acinetobacter)细菌细胞或假单胞菌属(Pseudomonas)细菌细胞。

15.项13所述的重组宿主，其中所述真菌细胞是酵母细胞。

16.项15所述的重组宿主，其中所述酵母细胞是来自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、产朊假丝酵母(Cyberlindnerajadinii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、博伊丁念珠菌(Candida boidinii)、Arxula adeninivorans、红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)或白色念珠菌(Candida albicans)物种的细胞。

17.项16所述的重组宿主，其中所述酵母细胞是酵母菌(Saccharomycete)。

18.项17所述的重组宿主，其中所述酵母细胞是来自酿酒酵母物种的细胞。

19.生产甜菊醇糖苷的方法，其包括：

(a)在表达项1至18中任一项所讨论的基因的条件下，在培养基中培养项1-18中任一项所述的重组宿主，

其中所述甜菊醇糖苷由所述宿主合成；以及

(b)任选地分离所述甜菊醇糖苷。

20.项19所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷是RebA、RebB、RebD和/或RebM，并且其中：

(a)RebA能够在表达UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和UGT91D2的项1-18中任一项所述的重组宿主中合成；

(b)RebB能够在表达UGT85C2、UGT76G1和UGT91D2的项1-18中任一项所述的重组宿主中合成；

(c)RebD能够在表达UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1以及UGT91D2和/或EUGT11的项1-18中任一项所述的重组宿主中合成；和(d)RebM能够在表达UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1以及UGT91D2和/或EUGT11的项1-18中任一项所述的重组宿主中合成。

21.项19或20所述的方法，其中编码以下序列的基因过表达：SEQ ID NO：88中所示的YBR043C，SEQ ID NO：95中所示的YDL100C，SEQ ID NO：94中所示的YDL054C，SEQ ID NO：22中所示的YDL128W，SEQ ID NO：146中所示的YDL198C，SEQ ID NO：26中所示的YDR061W，SEQ ID NO：30中所示的YDR536W，SEQ ID NO：102中所示的YEL027W，SEQ ID NO：147中所示的YFL054C，SEQ ID NO：112中所示的YGL167C，SEQ ID NO：38中所示的YGR181W，SEQ ID NO：42中所示的YHL016C，SEQ ID NO：121中所示的YIL166C，SEQ ID NO：44中所示的YJL093C，SEQ ID NO：48中所示的YJR106W，SEQ ID NO：126中所示的YKL120W，SEQ ID NO：127中所示的YKL146W，SEQ ID NO：129中所示的YKR039W，SEQ ID NO：56中所示的YMR034C，SEQ ID NO：132中所示的YMR166C，SEQ ID NO：68中所示的YOL122C，SEQ ID NO：69中所示的YOR079C，SEQ ID NO：79中所示的YPL270W，和/或SEQ ID NO：82中所示的YPR011C。

22.项19-21中任一项所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷以约500mg/L至约10,000mg/L的浓度生产。

23.使甜菊醇糖苷的生产或向培养基中的转运增加的方法，其包括：

其中所述甜菊醇糖苷由所述宿主合成；以及

(b)任选地分离所述甜菊醇糖苷。

24.项23所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷是RebA、RebB、RebD和/或RebM。

Claims

1.能够在细胞培养物中生产甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞针对以下基因具有修饰的表达：至少一种编码转运蛋白多肽的内源转运蛋白基因和/或至少一种编码调节至少一种转运蛋白基因表达的转录因子多肽的内源转录因子基因；和/或表达至少一种异源转运蛋白基因；

其中至少一部分所述甜菊醇糖苷从所述重组宿主转运到细胞培养物中。

2.权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述转运蛋白多肽包括ATP结合盒(ABC)转运蛋白、主要促进子超家族(MFS)转运蛋白、氨基酸/生长素通透酶(AAAP)家族转运蛋白、ATP酶转运蛋白、硫酸盐通透酶(SulP)家族转运蛋白、溶酶体胱氨酸转运蛋白(LCT)家族转运蛋白、Ca2+：阳离子反向转运蛋白(CaCA)家族转运蛋白、氨基酸-多胺-有机阳离子(APC)超家族转运蛋白、多药/寡糖基脂质/多糖(MOP)转运蛋白、ZRT/IRT样蛋白(ZIP)金属转运蛋白家族转运蛋白、线粒体蛋白移位酶(MPT)家族转运蛋白、电压门控离子通道(VIC)家族转运蛋白、单价阳离子：质子反向转运蛋白-2(CPA2)家族转运蛋白、推定的跨膜氨基酸外排转运蛋白ThrE家族、寡肽转运蛋白(OPT)家族转运蛋白、K⁺转运蛋白(Trk)家族转运蛋白、胆汁酸：Na同向转运体(BASS)家族转运蛋白、药物/代谢物转运蛋白(DMT)超家族转运蛋白、线粒体运载体(MC)家族转运蛋白、生长素外排运载体(AEC)家族转运蛋白、氨通道转运蛋白(Amt)家族转运蛋白、金属离子(Mn²⁺-铁)转运蛋白(Nramp)家族转运蛋白、瞬时受体电位Ca²⁺通道(TRP-CC)家族转运蛋白、耐砷-3(ACR3)家族转运蛋白、核碱基：阳离子同向转运体-1(NCS1)家族转运蛋白、无机磷酸转运蛋白(PiT)家族转运蛋白、亚砷酸-亚锑酸盐(ArsAB)外排家族转运蛋白、转运蛋白IISP家族、甘油摄取(GUP)家族转运蛋白、金属离子转运(MIT)家族转运蛋白、铜转运(Ctr)家族转运蛋白或阳离子扩散促进子(CDF)家族转运蛋白。

3.权利要求1或2所述的重组宿主细胞，其中所述内源转运蛋白多肽和/或内源转录多肽包括与如下所示氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽：SEQ ID NO：13，SEQ IDNO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ IDNO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ IDNO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43，SEQ IDNO：44，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQ IDNO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：55，SEQ IDNO：56，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：61，SEQ IDNO：62，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：67，SEQ IDNO：68，SEQ ID NO：69，EQ ID NO：70，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：73，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：79，SEQ IDNO：80，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，SEQ IDNO：86，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ IDNO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：97，SEQ IDNO：98，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：106，SEQ ID SEQ ID NO：107，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：112，SEQ ID NO：113，SEQ IDNO：114，SEQ ID NO：115，SEQ ID NO：116，SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：118，SEQ ID NO：119，EQ ID NO：120，SEQ ID NO：121，SEQ ID NO：122，SEQ ID NO：123，SEQ ID NO：124，SEQ IDNO：125，SEQ ID NO：126，SEQ ID NO：127，SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：130，SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：133，SEQ ID NO：134，SEQ ID NO：135，SEQ IDNO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：141，SEQ ID NO：142，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：144，和/或SEQ ID NO：145。

4.在细胞培养物中生产甜菊醇糖苷的方法，其包括在细胞培养物中培养能够生产甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，

其中所述重组宿主细胞针对以下基因具有修饰的表达：至少一种编码转运蛋白多肽的内源转运蛋白基因和/或至少一种编码调节至少一种转运蛋白基因表达的转录因子多肽的内源转录因子基因；和/或表达至少一种异源转运蛋白基因；

其中在表达一种或更多种所述基因的条件下，至少一部分所述甜菊醇糖苷从所述重组宿主转运到细胞培养物中；

其中对所述至少一种内源转运蛋白基因、至少一种调节所述至少一种内源转运蛋白基因表达的内源转录因子基因，或二者进行表达；

其中培养包括诱导一种或更多种所述基因的表达，或者一种或更多种所述基因的组成型表达；以及

其中所述甜菊醇糖苷由所述重组宿主细胞生产。

5.使甜菊醇糖苷的生产或向细胞培养基中的转运增加的方法，其包括在细胞培养物中培养能够生产甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，

其中在表达一种或更多种所述基因的条件下，至少一部分所述甜菊醇糖苷从所述重组宿主转运到培养基中的细胞培养物中；

其中对所述至少一种编码转运蛋白多肽的内源转运蛋白基因、至少一种编码调节所述至少一种内源转运蛋白基因表达的转录因子多肽的内源转录因子基因，或二者进行表达；以及

其中培养包括诱导一种或更多种所述基因的表达，或者一种或更多种所述基因的组成型表达。

6.细胞培养物，其包含在细胞培养物中能够生产甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，

其中至少一部分所述甜菊醇糖苷从所述重组宿主转运到细胞培养物中；

所述细胞培养物还包含：

(a)由所述重组宿主细胞生产的甜菊醇糖苷；

(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰葡糖胺；以及

(c)包含微量金属、维生素、盐、YNB和/或氨基酸的补充营养剂；

其中所述甜菊醇糖苷以至少1mg/升细胞培养物的浓度存在。

7.甜菊醇糖苷，其通过权利要求1所述的重组宿主细胞或者权利要求4或5所述的方法生产。

8.甜味剂组合物，其包含权利要求7所述的甜菊醇糖苷。

9.食品，其包含权利要求8所述的甜味剂组合物。

10.饮料或饮料浓缩物，其包含权利要求8所述的甜味剂组合物。