CN102459314A - Ttk肽及包含它们的疫苗 - Google Patents

Abstract

本文中描述了针对癌症的肽疫苗。特别地，提供了自TTK基因衍生的引发CTL的表位肽。还提供了抗原呈递细胞和分离的靶向这样的肽的CTL，以及用于诱导抗原呈递细胞或CTL的方法。本发明进一步提供了含有自TTK衍生的肽或编码这样的肽的多核苷酸作为活性组分的药物组合物。另外，本发明提供了使用本发明的自TTK衍生的肽、编码这样的肽的多核苷酸、或呈递这样的肽的抗原呈递细胞、或药物组合物来治疗和/或预防(即防范)癌症(肿瘤)、和/或防止其手术后复发的方法、以及诱导CTL的方法、用于诱导抗肿瘤免疫的方法。

Description

TTK肽及包含它们的疫苗

技术领域

优先权

本申请要求2009年5月11日提交的美国临时申请No.61/216,017的权益，通过述及将其全部内容收入本文。

本发明涉及生物科学领域，更具体的说是癌症治疗领域。特别地，本发明涉及作为癌症疫苗极其有效的新肽及用于治疗和预防肿瘤的药物。

背景技术

已经证明，CD8阳性CTL可识别在主要组织相容性复合物(MHC)I类分子上找到的肿瘤相关抗原(TAA)所衍生的表位肽，然后杀死肿瘤细胞。从TAA的第一个例子——黑素瘤抗原(MAGE)家族被发现起，人们主要通过免疫学手段已经发现了许多其它TAA(NPL 1/Boon T，Int J Cancer 1993 May 8，54(2)：177-80；NPL 2/Boon T & van der Bruggen P，J Exp Med 1996 Mar 1，183(3)：725-9)。这些TAA中的一些目前正在作为免疫治疗靶标接受临床开发。

能够诱导强力且特异性的抗肿瘤免疫应答的新TAA的鉴定保证了进一步开发，而且针对各种类型癌症的肽疫苗接种策略的临床调查正在进行中(NPL 3/Harris CC，J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16，88(20)：1442-55；NPL4/Butterfield LH et al.，Cancer Res 1999 Jul 1，59(13)：3134-42；NPL 5/VissersJL et al.，Cancer Res 1999 Nov 1，59(21)：5554-9；NPL 6/van der Burg SH et al.，J Immunol 1996 May 1，156(9)：3308-14；NPL 7/Tanaka F et al.，Cancer Res1997 Oct 15，57(20)：4465-8；NPL 8/Fujie T et al.，Int J Cancer 1999 Jan 18，80(2)：169-72；NPL 9/Kikuchi M et al.，Int J Cancer 1999 May 5，81(3)：459-66；NPL 10/Oiso M et al.，Int J Cancer 1999 May 5，81(3)：387-94)。不幸的是，许多当前癌症疫苗试验只显示出低客观应答率(NPL 11/Belli F et al.，J ClinOncol 2002 Oct 15，20(20)：4169-80；NPL 12/Coulie PG et al.，Immunol Rev2002 Oct，188：33-42；NPL 13/Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004 Sep，10(9)：909-15)。因而，仍然需要用作免疫治疗靶的新TAA。

为此，使用基因组范围的cDNA微阵列经由基因表达谱分析鉴定了在小细胞肺癌(SCLC)(PTL 1/WO2007/013665)和食管癌(PTL 2/WO2007/013671)中上调的多种基因。人们已经对这些基因进行了大量的研究，希望从中鉴定优秀候选物作为免疫治疗靶。为了在免疫疗法中特异性靶向癌细胞，优选的TAA应当主要由癌细胞表达，而正常健康组织具有有限的表达或没有表达。

优选作为免疫疗法靶标的TAA是癌细胞增殖和存活不可缺少的TAA。此类TAA可最大程度地减小广为记载的、可归于因治疗驱动的免疫选择而发生的TAA删除、突变、或下调癌细胞免疫逃避的风险。

使用含有23,040种基因的基因组范围cDNA微阵列来测定基因表达谱，TTK蛋白激酶(TTK)鉴定为在肺癌中上调的基因之一(NPL3/Kikuchi at al.，IntJ Oncol.2006 Apr；28(4)：799-805)。在超过80％的具有肺癌和食管癌的患者中，TTK的表达在肿瘤细胞中特异性上调。同时，TTK在除睾丸外的任何其它正常生命器官中不表达。总之，这些事实提示TTK可作为癌症免疫疗法靶标用于具有TTK上调的肿瘤的患者。先前已经公开了自TTK衍生的具有针对外源表达TTK和HLA-A*0201的靶细胞的特异性CTL诱导能力的肽(参见WO2008/102557(PTL3)，其结果复制于本文中图4)。

引用表

专利文献

[PTL 1]WO2007/013665

[PTL 2]WO2007/013671

[PTL 3]WO2008/102557

非专利文献

[NPL 1]Boon T，Int J Cancer 1993 May 8，54(2)：177-80

[NPL 2]Boon T & van der Bruggen P，J Exp Med 1996 Mar 1，183(3)：725-9

[NPL3]Kikuchi at al.，Int J Oncol.2006 Apr；28(4)：799-805

发明内容

本发明至少部分地基于可充当免疫治疗靶标的新肽的发现。由于TAA有时被免疫系统察觉为“自身”并因此往往没有先天免疫原性，合适的靶标的发现是极为重要的。如上所述，TTK(典型氨基酸序列和基因序列分别显示于但不限于SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：39，而且典型基因序列还可得自例如GenBank登录号NM_003318)已经被鉴定为在癌症中，包括但不限于肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性髓细胞性白血病(CML)、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)、软组织肿瘤和睾丸肿瘤中上调。因此，本发明聚焦于TTK作为癌症/肿瘤免疫疗法靶标的候选者。

本发明进一步涉及TTK的基因产物的拥有诱导对TTK特异性的CTL的能力的特定表位肽的鉴定。如下文详细讨论的，使用自TTK衍生的HLA-A*0201结合候选肽刺激从健康供体获得的外周血单个核细胞(PBMC)。然后建立了具有针对经每一种候选肽冲激的HLA-A2阳性靶细胞的特异性细胞毒性的CTL系。在那些CTL系中，用具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肽诱导的CTL系显示针对表达HLA-A*0201和TTK的细胞的显著的有力的特异性细胞毒性。这些结果证明，这些肽(尤其是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肽)是能诱导针对表达TTK的细胞的强力且特异性的免疫应答的HLA-A2限制表位肽。另外，结果指明，TTK具有强免疫原性，而且它的表位是癌症/肿瘤免疫疗法的有效靶标。

因而，本发明的一个目标是提供分离的能与HLA抗原结合的肽，特别是那些包括TTK的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：40)或其免疫学活性片段的。这些肽预期具有CTL诱导能力且可用于离体诱导CTL或给受试者施用以诱导针对癌症的免疫应答，诸如肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。优选的肽是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肽。

本发明的肽涵盖替换、删除和/或添加了1个、2个或更多个氨基酸的肽，只要所得经过修饰的肽保留原始的CTL诱导能力。

本发明还提供了分离的编码本发明的任何肽的多核苷酸。这些多核苷酸与本发明的肽类似，可用于诱导或制备具有CTL诱导能力的APC或可给受试者施用以诱导针对癌症的免疫应答。

当对受试者施用时，本发明的肽优选呈递在APC的表面上，从而诱导靶向相应肽的CTL。因此，本发明的一个目标是提供用于诱导CTL的作用剂或组合物，所述作用剂或组合物包含一种或多种本发明肽或编码所述肽的多核苷酸。本发明进一步涵盖包含一种或多种本发明肽或编码所述肽的多核苷酸的药物作用剂或组合物，所述作用剂或组合物配制用于治疗和/或预防癌症，以及预防其手术后复发，所述癌症包括但不限于肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。作为本发明的肽或多核苷酸的替代或补充，本发明的药物作用剂或组合物可包括呈递任何本发明肽的APC或外来体作为活性组分。

本发明的肽和多核苷酸能诱导在其表面上呈递HLA抗原与本发明肽的复合物的PAC，这例如通过使源自受试者的APC接触本发明肽，或将编码本发明肽的多核苷酸导入APC来实现。此类APC具有针对靶肽的高的CTL诱导能力，因此可用于癌症免疫疗法。因此，本发明涵盖用于诱导具有CTL诱导能力的APC的方法及通过此类方法获得的APC。

本发明还提供用于诱导CTL的方法，其包括共培养CD8阳性细胞与在其表面上呈递一种或多种本发明肽的复合物的APC或外来体的步骤，或导入包括编码能与本发明肽结合的T细胞受体(TCR)亚单位多肽的多核苷酸的步骤。通过此类方法获得的CTL可用于治疗和预防癌症，所述癌症的例子包括但不限于肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。因此，本发明涵盖通过本发明方法获得的CTL。

本发明的另一个目标是提供用于在有需要的受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法，所述方法包括对受试者施用包括TTK多肽或其免疫学活性片段、编码TTK多肽的多核苷酸、及呈递TTK多肽的外来体或APC的作用剂或组合物。

本发明的适用性延伸至任何多种涉及或源自TTK过表达的疾病，诸如癌症，例示性癌症包括但不限于肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。

具体而言，本发明提供了下述[1]至[21]：

[1]一种分离的肽，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

[2]一种具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力的分离的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中替换、删除、或添加了1个、2个、或几个氨基酸，

[3][2]的分离的肽，其中该肽具有下列特征之一或二者：

(a)自N端起的第二个氨基酸是选自下组的氨基酸，或被修饰成选自下组的氨基酸：亮氨酸和甲硫氨酸；和

(b)C端氨基酸是选自下组的氨基酸，或被修饰成选自下组的氨基酸：缬氨酸和亮氨酸，

[4][1]至[3]任一项的分离的肽，其中所述肽是九肽，

[5]一种分离的多核苷酸，其编码[1]至[4]任一项的肽，

[6]一种用于诱导CTL的作用剂，其中该作用剂包含一种或多种[1]至[4]任一项的肽或者一种或多种[5]的多核苷酸，

[7]一种用于治疗和/或预防癌症和/或防止其手术后复发的药物作用剂，其中该作用剂包含一种或多种[1]至[4]任一项的肽或者一种或多种[5]的多核苷酸，

[8][7]的药物作用剂，其配制为用于对HLA抗原为HLA-A2的受试者施用，

[9][8]的药物作用剂，其中所述HLA-A2为HLA-A*0201，

[10][7]或[8]的药物作用剂，其中该药剂配制为用于癌症治疗，

[11]一种用于诱导具有CTL诱导能力的抗原呈递细胞(APC)的方法，其包括选自下组的步骤：

(a)在体外、离体或在体内使APC接触[1]至[4]任一项的肽；和

(b)将编码[1]至[4]任一项的肽的多核苷酸导入APC。

[12]一种用于诱导CTL的方法，其包括选自下组的步骤：

(a)将CD8阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原与[1]至[4]任一项的肽的复合物的APC共培养；

(b)将CD8阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原与[1]至[4]任一项的肽的复合物的外来体共培养；和

(c)将包含编码能够结合[1]至[4]任一项的肽的T细胞受体(TCR)亚单位多肽的多核苷酸的基因导入T细胞，

[13]一种分离的APC，其在其表面上呈递HLA抗原与[1]至[4]任一项的肽的复合物，

[14][13]的APC，其是通过[11]的方法诱导的，

[15]一种分离的CTL，其靶向[1]至[4]任一项的肽，

[16][15]的CTL，其是通过[12]的方法诱导的，

[17]一种在受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法，其中该方法包括对该受试者施用包含一种或多种[1]至[4]任一项的肽、一种或多种其免疫学活性片段、或一种或多种编码该肽或该片段的多核苷酸的作用剂，

[18]一种抗体或其片段，其针对[1]至[4]任一项的肽。

[19]一种载体，其包含编码[1]至[4]任一项的肽的核苷酸序列。

[20]一种宿主细胞，其经过[19]的载体转化或转染。及

[21]一种诊断试剂盒，其包含[1]至[4]任一项的肽、[5]的核苷酸序列或[18]的抗体。

要理解，前面的发明概述和下面的详述都是关于例示性实施方案，而非限制本发明或本发明的其它备选实施方案。

在阅读下面的详细描述连同附图和实施例后，本发明在上文之外的其它目的和特征会变得更加显而易见。然而应当理解，上面的发明概述和下面的详细描述都是例示性的实施方案，而非限制本发明或本发明的其它备选实施方案。具体而言，虽然本文中参照多个具体实施方案描述了本发明，但是应理解所述描述是例示本发明而不构成本发明的限制。本领域技术人员可想到各种修改和应用，而不偏离如所附权利要求描述的本发明精神和范围。类似地，根据此概述和下文描述的某些实施方案很容易想到本发明的其它目的、特征、好处和优点，它们对于本领域技术人员会是显而易见的。根据上文连同所附实施例、数据、图及自它们得出的所有合理推论，单独地或与并入本文的参考文献一起考虑，容易想到这样的目的、特征、好处和优点。

附图简述

本领域技术人员在考虑了下文的附图简要说明及对本发明及其优选实施方案的详细说明后将清楚地得知本发明的各个方面和应用。

[图1]图1包括一系列照片，(a)至(j)，描绘对用TTK衍生的肽诱导的CTL进行的IFN-γELISPOT测定的结果。下述孔号中的CTL显示与对照相比强的IFN-γ生成：用TTK-A02-9-462(SEQ ID NO：1)刺激的1号和4号孔(a)，用TTK-A02-9-630(SEQ ID NO：2)刺激的7号孔(b)，用TTK-A02-9-593(SEQ IDNO：3)刺激的5号孔(c)，用TTK-A02-9-719(SEQ ID NO：6)刺激的4号、5号、6号和7号孔(d)，用TTK-A02-9-142(SEQ ID NO：15)刺激的5号和7号孔(e)，用TTK-A02-9-146(SEQ ID NO：19)刺激的7号孔(f)，用TTK-A02-9-564(SEQ IDNO：20)刺激的5号、7号和8号孔(g)，用TTK-A02-10-462(SEQ ID NO：22)刺激的1号、2号和5号孔(h)，用TTK-A02-10-542(SEQ ID NO：34)刺激的2号孔(i)，及用TTK-A02-10-661(SEQ ID NO：35)刺激的2号孔(j)。扩增用矩形框标示的孔中的细胞以建立CTL系。在图中，″+″指示针对经适宜肽冲激的靶细胞的IFN-γ生成，而″-″指示针对未经任何肽冲激的靶细胞的IFN-γ生成。

[图2a-d]图2a-d包括一系列线图，(a)至(d)，描绘IFN-γ ELISA测定法的结果，证明用TTK-A02-9-462(SEQ ID NO：1)(a)、TTK-A02-9-630(SEQ IDNO：2)(b)、TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)(c)、和TTK-A02-9-719(SEQ IDNO：6)(d)刺激的CTL系的IFN-γ生成。结果证明了通过用某些TTK肽刺激而建立的CTL系及自CTL系建立的CTL克隆显示与对照相比强的IFN-γ生成。在图中，″+″指示针对经适宜肽冲激的靶细胞的IFN-γ生成，而″-″指示针对未经任何肽冲激的靶细胞的IFN-γ生成。

[图2e-g]图2e-g包括一系列线图，(e)至(g)，描绘IFN-γ ELISA测定法的结果，证明用TTK-A02-9-142(SEQ ID NO：15)(e)和TTK-A02-10-462(SEQ IDNO：22)(f)刺激的CTL系的IFN-γ生成及自用TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)刺激的CTL系建立(通过用相同肽刺激)的CTL克隆的IFN-γ生成(g)。结果证明了通过用某些肽刺激而建立的CTL系及自CTL系建立的CTL克隆显示与对照相比强的IFN-γ生成。在图中，″+″指示针对经适宜肽冲激的靶细胞的IFN-γ生成，而″-″指示针对未经任何肽冲激的靶细胞的IFN-γ生成。

[图3]图3包括一系列线图，(a)至(c)，描绘针对外源表达TTK和HLA-A*0201的靶细胞和HLA-A2阳性且过表达TTK的肿瘤细胞的特异性CTL活性。制备用HLA-A*0201和全长TTK基因转染的COS7细胞作为靶细胞，同时制备用HLA-A*0201或用全长TTK基因转染的COS7细胞作为对照，(a)和(b)。还有，制备HLA-A2阳性且过表达TTK的肿瘤细胞系H1650作为靶细胞，同时制备HLA-A2阴性且过表达TTK的肿瘤细胞系PC-3和TE-1作为对照，(c)。用TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)建立的CTL系(a)及自CTL系建立的CTL克隆(b)显示针对用TTK和HLA-A*0201二者转染的COS7细胞的特异性CTL活性(黑色菱形)。另一方面，没有检测到显著的针对表达HLA-A*0201(三角形)或TTK(圆形)任一的靶细胞的特异性CTL活性。CTL克隆还显示针对肿瘤细胞系(HLA-A2⁺，TTK⁺)：H1650细胞的特异性CTL活性(c)(黑色框)。另一方面，没有检测到显著的针对靶细胞(HLA-A2^-，TTK⁺)的特异性CTL活性(三角形：PC-3，圆圈：TE-1)。

[图4]图4包括一组线图，描绘自TTK衍生的肽针对外源表达TTK和HLA-A*0201的靶细胞的特异性CTL诱导活性(Endo测定结果)。这样的图对应于申请人的WO2008/102557中所列图8b、c、d和e。

实施方案的描述

现在描述优选的方法、装置、和材料，不过在实施或检验本发明的实施方案时可使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本发明材料和方法之前，要理解本发明不限于特定大小、形状、尺度、材料、方法、规程等，因为它们可因循例行实验和/或优化而变化。还要理解，所述描述中使用的术语只是出于描述特定样式或实施方案的目的，而非意图限制本发明的范围，本发明的范围只会由所附权利要求来限制。

通过提述明确地将本说明书中提到的所有出版物、专利或专利申请完整收入本文。然而，本文中无一处可解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类公开文本。

I.定义

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的普遍理解相同的含义。然而，若有冲突，以本说明书(包括定义)为准。

如本文中使用的，词语“一个/种”、“该”、和“所述”意味着“至少一个/种”，除非另有明确说明。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基可以是经过修饰的残基或非天然存在型残基(诸如相应的天然存在型氨基酸的人工化学模拟物)的氨基酸聚合物，以及天然存在型氨基酸聚合物。

如本文中使用的，术语“氨基酸”指天然存在型和合成型氨基酸，以及与天然存在型氨基酸相似地发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸。天然存在型氨基酸指由遗传密码编码的氨基酸，以及在细胞中在翻译后被修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、和O-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”指与天然存在型氨基酸具有相同的基础化学结构(α碳与氢、羧基、氨基、和R基团结合)但具有一个或多个经过修饰的R基团或经过修饰的主链的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。短语“氨基酸模拟物”指与具有与一般氨基酸不同的结构但发挥与一般氨基酸相似的功能的化学化合物。

氨基酸在本文中可以通过它们公知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指称。

术语“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，而且除非另有明确说明，与氨基酸类似，通过它们普遍接受的单字母代码来指称。

如本文中使用的，术语“组合物”意图涵盖包括规定量的规定组分的产物，以及任何作为所述规定量的规定组分的组合的直接或间接结果的产物。所述术语在涉及“药物组合物”时意图涵盖包括活性组分和构成载体的任何惰性组分的产物，以及作为任何两种或更多种组分的组合、复合或聚集、或一种或多种组分的解离、或一种或多种组分的其它类型反应或相互作用的直接或间接结果的产物。因而，在本发明的背景中，短语“药物组合物”涵盖任何通过混合本发明的化合物和药学或生理学可接受载体而制备的组合物。如本文中使用的，短语“药学可接受载体”或“生理学可接受载体”表示药学或生理学可接受的材料、组合物、物质或媒介，包括但不限于自一个器官或身体部分至另一个器官或身体部分携带或运输活性组分涉及的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。

除非另有定义，术语“癌症”指过表达TTK基因的癌症或肿瘤，它的实例包括但不限于肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。

除非另有定义，术语“细胞毒性T淋巴细胞”、“细胞毒性T细胞”和“CTL”在本文中可互换使用，而且除非另有明确说明，指能够识别非自身细胞(例如肿瘤/癌细胞、病毒感染的细胞)并诱导此类细胞死亡的T淋巴细胞亚群。

除非另有定义，如本文中使用的，术语“HLA-A2”代表性指诸如HLA-A*0201和HLA-A*0206等亚型。

除非另有定义，如本文中使用的，术语“试剂盒”用于指试剂和其它材料的组合。本文中考虑，试剂盒可包括微阵列、芯片、标志物、等等。术语“试剂盒”并非意图限于试剂和/或材料的特定组合。

以本发明的方法和组合物可用于癌症“治疗”的语境为限，当治疗导致临床效益，诸如受试者中TTK基因表达的减少、或癌症的尺寸、患病率(prevalence)、或转移潜力的降低，认为该治疗是“有效”的。当预防性地应用治疗时，“有效”是指其延迟或防止癌症形成，或者预防或缓解癌症的临床症状。有效性结合特定肿瘤类型的任何公知的诊断或治疗方法来加以确定。

就本发明的方法和组合物可用于癌症“预防”和“防范”的背景而言，所述术语在本文中可互换使用，指降低来自疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。预防和防范可发生于“一级、二级和三级预防水平”。一级预防和防范避免疾病的发生，而二级和三级预防和防范水平涵盖旨在预防和防范疾病进展和症状出现以及降低已建立的疾病的负面影响的活动，这通过恢复功能和减轻疾病相关并发症来实现。或者，预防和防范可包括广泛的预防疗法，它们旨在减轻特定病症的严重性，例如降低肿瘤的增殖和转移。

在本发明的语境中，治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发包括任何下述步骤，诸如手术清除癌细胞、抑制癌性细胞生长、肿瘤衰退或消退、诱导癌症减退和遏制癌症发生、肿瘤消退、及降低或抑制转移。癌症的有效治疗和/或预防降低患癌个体的死亡率并改善其预后，降低血液中肿瘤标志物的水平，及减轻伴随癌症的可检测症状。例如，症状的减轻或改善构成有效治疗和/或预防包括10％、20％、30％或更多降低，或病情稳定。

在本发明的语境中，术语“抗体”指能与指定的蛋白或其肽特异性反应的免疫球蛋白及其片段。抗体可以包括人抗体、灵长源化(primatized)抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、与其它蛋白或放射性标记物融合的抗体、和抗体片段。另外，在本文中，抗体以最广义使用，而且具体涵盖完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。“抗体”指示所有类别(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的普遍理解相同的含义。

II.肽

为了证明衍生自TTK的肽发挥被CTL所识别的抗原的功能，对衍生自TTK(SEQ ID NO：40)的肽进行了分析以确定它们是否为HLA-A2限制性的抗原表位，HLA-A2是经常遇到的HLA等位基因(Date Y et al.，Tissue Antigens47：93-101，1996；Kondo A et al.，J Immunol 155：4307-12，1995；Kubo RT et al.，J Immunol 152：3913-24，1994)。

基于它们对HLA-A2的结合亲和力，鉴定了衍生自TTK的HLA-A2结合肽的候选者。用这些肽冲激(加载)的树突细胞(DC)体外刺激T细胞后，使用下述每个肽，成功地建立了CTL：TTK-A02-9-462(SEQ ID NO：1)，TTK-A02-9-630(SEQ ID NO：2)，TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)，TTK-A02-9-719(SEQ ID NO：6)，和TTK-A02-10-462(SEQ ID NO：22)。

这些建立的CTL针对经相应肽冲激的靶细胞显示强且特异性的CTL活性。本文中的这些结果证明TTK是被CTL识别的抗原，且测试的肽是TTK的受HLA-A2限制的表位肽。

另外，用TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)建立的CTL显示比之前报告更加有力的针对表达HLA-A*0201和TTK的靶细胞的特异性CTL活性。这些结果证明TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)是用于诱导有力的针对过表达TTK的细胞的特异性CTL活性的合适肽。

由于TTK基因在癌细胞和组织(包括但不限于肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤的那些))中过表达但在大多数正常器官中不表达，它是良好的癌症免疫治疗靶标。因此，本发明提供对应于来自TTK的被CTL识别的表位的九肽(由九个氨基酸残基组成的肽)和十肽(由十个氨基酸残基组成的肽)。或者，本发明提供分离的结合HLA抗原且诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的肽，其中所述肽由SEQ ID NO：40的氨基酸序列组成或者是它的免疫学活性片段。本发明的九肽和十肽的特别优选的例子包括具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肽。

一般而言，目前可以通过例如互联网获得的软件程序，如Parker KC et al.，J Immunol 1994 Jan 1，152(1)：163-75及Nielsen M et al.，Protein Sci 2003；12：1007-17描述的那些，可以用来在计算机上计算不同肽与HLA抗原之间的结合亲和力。与HLA抗原的结合亲和力可以按照例如Parker KC et al.，JImmunol 1994 Jan 1，152(1)：163-75，Kuzushima K et al.，Blood 2001，98(6)：1872-81，Larsen MV et al.BMC Bioinformatics.2007 Oct 31；8：424，Buus S etal.Tissue Antigens.，62：378-84，2003，Nielsen M et al.，Protein Sci 2003；12：1007-17，及Nielsen M et al.PLoS ONE 2007；2：e796(总结于例如LafuenteEM et al.，Current Pharmaceutical Design，2009，15，3209-3220)中描述的那样进行测定。用于测定结合亲和力的方法在例如Journal of ImmunologicalMethods，1995，185：181-190；及Protein Science，2000，9：1838-1846中有描述。因此，可使用此类软件程序来选择与HLA抗原具有高结合亲和力的自TTK衍生的片段。因此，本发明涵盖由根据这些已知程序可与HLA抗原结合的TTK衍生的任何片段构成的肽。另外，这些肽可以包括由全长TTK组成的肽。

本发明的九肽和十肽的侧翼可以具有额外的氨基酸残基，只要所得的肽保持其CTL诱导能力即可。所述额外的氨基酸序列可以由任何种类的氨基酸构成，只要它们不损害原来的肽的CTL诱导能力。因此，本发明涵盖具有对HLA抗原的结合亲和力的肽，包括自TTK衍生的肽。这样的肽例如少于约40个氨基酸，经常少于约20个氨基酸，且通常少于约15个氨基酸。

一般而言，肽中一个、两个、或更多个氨基酸的修饰不会影响肽的功能，而且在有些情况下甚至会增强原始蛋白质的期望功能。事实上，已知有经过修饰的肽(即由与原始参照序列相比其中修饰(即替换、删除、添加或插入)一个、两个或数个氨基酸残基的氨基酸序列构成的肽)保留原始肽的生物学活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1984，81：5662-6；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 1982，10：6487-500；Dalbadie-McFarland et al.，Proc NatlAcad Sci USA 1982，79：6409-13)。因此，在一个实施方案中，本发明的肽既具有CTL诱导能力，又具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列中添加、删除、和/或替换一个、两个或甚至更多个氨基酸而得到的氨基酸序列。

本领域技术人员会认可，改变氨基酸序列中的单个氨基酸或少数百分比氨基酸的个别添加、删除或替换往往会导致原始氨基酸侧链的特性得以保留。因此，它们经常称作“保守替换”或“保守修饰”，其中对蛋白质的改变导致具有与原始蛋白质类似的功能的修饰蛋白质。提供功能上相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。期望保留的氨基酸侧链特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下面的共同官能团或特征的侧链：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；含碱侧链(R，K，H)；和含芳香族侧链(H，F，Y，W)。另外，下面的八组各自含有本领域公认互为保守替换的氨基酸：

1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins 1984)。

此类保守修饰肽也被视为本发明的肽。然而，本发明的肽不限于此，可包括非保守修饰，只要所得的修饰肽保留原始肽的CTL诱导能力。另外，经过修饰的肽不应排除TTK的多态变体、种间同源物、和等位基因中的可诱导CTL的肽。

为了保持所需的CTL诱导能力，可以修饰(插入、添加和/或替换)少数(例如，1个、2个或数个)或小百分比的氨基酸。这里，术语“数个”意指5个或更少的氨基酸，如4个或3个或更少。要被修饰的氨基酸的百分比优选为20％以下，更优选15％以下，甚至更优选10％以下或1-5％。

当在癌症免疫疗法的语境中使用时，本发明的肽应呈递在细胞或外来体的表面上，优选作为与HLA抗原的复合物。因此，优选选择不仅诱导CTL而且还拥有对HLA抗原的高结合亲和力的肽。为此，可对本发明的肽通过替换、插入、和/或添加氨基酸残基进行修饰以产生具有改良结合亲和力的修饰肽。除了天然被展示的肽之外，由于已经知道通过结合HLA抗原而被展示的肽的序列规律(J Immunol 1994，152：3913；Immunogenetics 1995，41：178；JImmunol 1994，155：4307)，可将基于此类规律的修饰引入本发明的免疫原性肽。

例如，可能希望进行替换，将自N端起的第二个氨基酸替换为亮氨酸或甲硫氨酸，和/或将位于C端的氨基酸替换为缬氨酸或亮氨酸，以提高HLA-A2结合亲和力。因此，具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中自N端起第二个氨基酸被替换为亮氨酸或甲硫氨酸和/或其中C端被替换为缬氨酸或亮氨酸的肽涵盖在本发明之内。

不仅可以在肽的末端氨基酸处引入替换，而且可以在潜在的T细胞受体(TCR)识别位置处引入替换。数项研究证明了具有氨基酸替换的肽可具有等同于或好于原来的功能，例如CAP1、p53_(264-272)、Her-2/neu_(369-377)或gp100_(209-217)(Zaremba et al.Cancer Res.57，4570-4577，1997，T.K.Hoffmann et al.JImmunol.(2002)Feb 1；168(3)：1338-47.，S.O.Dionne et al.Cancer Immunolimmunother.(2003)52：199-206及S.O.Dionne et al.Cancer Immunology，Immunotherapy(2004)53，307-314)。

本发明还考虑向本发明肽的N和/或C端添加一个、两个或数个氨基酸。此类具有高HLA抗原结合亲和力且保留CTL诱导能力的修饰肽也包含在本发明之内。

然而，当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同时，可能诱导副作用，诸如自身免疫性病症或针对特定物质的变应性症状。因此，优选的是，利用可得的数据库实施同源性搜索，以避免肽的序列与另一种蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。当根据同源性搜索清楚了即使与目标肽相比差1个或2个氨基酸的肽亦不存在时，可以修饰目标肽以提高其与HLA抗原的结合亲和力，和/或提高其CTL诱导能力，而没有任何发生此类副作用的危险。

虽然预期如上所述的对HLA抗原具有高结合亲和力的肽是高度有效的，但还是对根据高结合亲和力的存在为指标选出的候选肽进一步检查了CTL诱导能力的存在。这里，短语“CTL诱导能力”指肽被呈递在抗原呈递细胞(APC)上时诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力。另外，“CTL诱导能力”包括肽诱导CTL活化、CTL增殖、促进CTL溶解靶细胞、和提高CTL IFN-γ生成的能力。

CTL诱导能力的确认如下来实现，诱导携带人MHC抗原的APC(例如B-淋巴细胞、巨噬细胞、和树突细胞(DC))，或者更具体地说，衍生自人外周血单核白细胞的DC，并且在用肽诱导后，与CD8阳性细胞混合，然后测量由CTL针对靶细胞生成和释放的IFN-γ。作为反应系统，可使用已经制成的表达人HLA抗原的转基因动物(例如BenMohamed L，Krishnan R，Longmate J，Auge C，Low L，Primus J，Diamond DJ，Hum Immunol 2000 Aug，61(8)：764-79，Related Articles，Books，Linkout Induction of CTL response by aminimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice：dependent onMHC(HLA)class II restricted T(H)response中描述的那些)。例如，可以用⁵¹Cr等放射性标记靶细胞，并且可以自靶细胞释放的放射性计算细胞毒性活性。或者，CTL诱导能力可以如下评估：测量在携带固定化肽的APC存在下由CTL生成和释放的IFN-γ，并使用抗IFN-γ单克隆抗体显现培养基上的抑制区。

作为如上所述检查肽的CTL诱导能力的结果，发现由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的九肽显示特别高的CTL诱导能力以及对HLA抗原的高亲和力。因此，例举此类肽为本发明的实施方案。

另外，同源性分析的结果显示了该肽与自任何其它已知人基因产物衍生的肽没有显著的同源性。因而，用于免疫疗法时发生未知的或不想要的免疫应答的可能性降低了。因此，也是根据这个方面，具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肽可用于在癌症患者中引发针对TTK的免疫力。因此，本发明的肽，优选具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肽。

除了上文所述修饰之外，也可将本发明的肽与其它肽连接，只要所得连接的肽保留原始肽的所需CTL诱导能力。合适的其它肽的例子包括：自TTK衍生的其它可诱导CTL的肽(例如具有选自SEQ ID NO：1、2、6、15和22的氨基酸序列的肽)或自其它TAA衍生的可诱导CTL的肽。合适的肽间接头是本领域公知的，例如AAY(P.M.Daftarian et al.，J Trans Med 2007，5：26)、AAA、NKRK(R.P.M.Sutmuller et al.，J Immunol.2000，165：7308-7315)或K(S.Ota et al.，Can Res.62，1471-1476，K.S.Kawamura et al.，J Immunol.2002，168：5709-5715)。

例如，还可基本上同时使用非TTK肿瘤相关抗原肽以提高经I类和/II类HLA的免疫应答。已经公认，癌细胞能表达超过一种肿瘤相关基因。因此，依照本发明确定特定受试者是否表达别的肿瘤相关基因，然后在TTK组合物或疫苗中包括自此类基因的表达产物衍生的I类HLA和/或II类HLA结合肽，这是本领域普通技术人员的例行实验的范围内的。

I类HLA和II类HLA结合肽是本领域普通技术人员知道的(例如参见Coulie，Stem Cells 13：393-403，1995)，而且可以以与本文公开类似的方式用于本发明。因此，本领域普通技术人员能容易地使用分子生物学的标准规程来制备包括一种或多种TTK肽和一种或多种非TTK肽的多肽或编码此类多肽的核酸。

上文连接肽在本文中称作“多表位”(polytope)，即两种或更多种可以以各种排列(例如串联、交叠)连接在一起的潜在免疫原性或免疫应答刺激性肽的组。该多表位(或编码该多表位的核酸)可以以标准免疫方案来施用于例如动物以测试该多表位在刺激、增强和/或引起免疫应答的有效性。

所述肽可直接地或使用侧翼序列连接在一起形成多表位，而且多表位作为疫苗的用途是本领域公知的(参见例如Thomson et al.，Proc.Natl.Acad.SciUSA 92(13)：5845-5849，1995；Gilbert et al.，Nature Biotechnol.15(12)：1280-1284，1997；Thomson et al.，J Immunol.157(2)：822-826，1996；Tarn et al.，J Exp.Med.171(1)：299-306，1990)。可制备含有不同表位数目和组合的多表位并测试CTL识别和提高免疫应答的功效。

也可将本发明的肽连接至其它物质，只要所得的连接的肽保留原始肽的所需CTL诱导能力。合适物质的例子包括例如：肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天然的和合成的聚合物、等。本发明肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化等，只要该修饰不破坏初始肽的生物学活性。可实施这些种类的修饰以赋予额外的功能(例如靶向功能和投递功能)或使多肽稳定。

例如，为了提高多肽的体内稳定性，本领域已知引入D-氨基酸、氨基酸模拟物或非天然氨基酸；此构思也可适用于本发明多肽。可以以多种方式测定多肽的稳定性。例如，可使用肽酶和各种生物学介质(诸如人血浆和血清)来测试稳定性(参见例如Verhoef et al.，Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986，11：291-302)。

此外，如上所述，在替换、删除和/或添加1个、2个或数个氨基酸残基的经修饰肽中，可筛选或选择出具有与原始肽相比相同或更高活性的修饰肽。因此，本发明还提供了用于筛选或选择具有与原始肽相比相同或更高活性的修饰肽的方法。一种例示性方法可包括下述步骤：

a：替换、删除或添加本发明肽中的至少一个氨基酸残基；

b：测定步骤(a)中生成的肽的活性；并

c：选择具有与原始肽相比相同或更高活性的肽。

在本文中，要测定的活性可包括MHC结合活性、APC或CTL诱导能力和细胞毒性活性。优选地，要测定的活性是CTL诱导能力，而且此类活性可使用“实施例”中描述的方法来测定。

在本文中，本发明的肽也可以记为“TTK肽”或“TTK多肽”。

III.TTK肽的制备

本发明的肽可使用公知技术来制备。例如，肽可以通过合成、使用重组DNA技术或化学合成来制备。本发明的肽可个别地合成，或合成为包括两个或更多个肽的较长多肽。然后可以分离，即纯化或分离所述肽，使得所述肽基本上不含其它天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段或任何其它化学物质。

本发明的肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化；只要此类修饰不破坏初始肽的生物学活性。其它修饰包括掺入D-氨基酸或其它氨基酸模拟物，其可用于例如延长肽的血清半衰期。

可以根据选定的氨基酸序列，借助化学合成来获得本发明的肽。可适用于合成的常规肽合成法的例子包括：

(i)Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；

(ii)The Proteins，Vol.2，Academic Press，New York，1976；

(iii)Peptide Synthesis(日文)，Maruzen Co.，1975；

(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis(日文)，Maruzen Co.，1985；

(v)Development of Pharmaceuticals(second volume)(in Japanese)，Vol.14(peptide synthesis)，Hirokawa，1991；

(vi)WO99/67288；和

(vii)Barany G.& Merrifield R.B.，Peptides Vol.2，″Solid Phase PeptideSynthesis″，Academic Press，New York，1980，100-118。

或者，可应用任何已知的遗传工程肽生产方法来获得本发明的肽(例如Morrison J，J Bacteriology 1977，132：349-51；Clark-Curtiss & Curtiss，Methodsin Enzymology(eds.Wu et al.)1983，101：347-62)。例如，首先，制备包含处于可表达形式(例如处于相当于启动子序列的调节序列下游)的编码目标肽的多核苷酸的合适载体，并转化入合适的宿主细胞。本发明也提供此类载体和宿主细胞。然后培养宿主细胞以生成感兴趣的肽。也可以采用体外翻译系统在体外生产肽。

IV.多核苷酸

本发明还提供编码任何上述本发明肽的多核苷酸。这些包括由天然存在型TTK基因(GenBank登录号NM_003318(SEQ ID NO：39))衍生的多核苷酸及具有它们的经过保守修饰的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短语“经过保守修饰的核苷酸序列”指编码相同或本质上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性，对于任何给定蛋白质都有极其多种功能上相同的核酸来编码它。例如，密码子GCA、GCC、GCG、和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子规定为丙氨酸的任何位置处，该密码子可改变成任何相应所述密码子，而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文中编码肽的每一种核酸序列也涵盖该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域普通技术人员会认识到，可以修饰核酸中的每一个密码子(AUG和TGG除外，AUG在正常情况下是甲硫氨酸的唯一密码子，而TGG在正常情况下是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。因而，每一种所公开的序列隐含涵盖了编码肽的核酸的每一种沉默变异。

本发明的多核苷酸可以由DNA、RNA、或其衍生物构成。如本领域公知的，DNA分子由碱基诸如天然存在碱基A、T、C、和G构成，而T在RNA中被U替换。技术人员会认识到多核苷酸中也可包括非天然存在碱基。

本发明的多核苷酸可编码多个本发明肽，包括本发明肽和其它表位肽，有或无居间氨基酸序列。例如，居间氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻译的肽的切割位点(例如酶识别序列)。另外，多核苷酸除编码本发明肽的编码序列以外还可包括任何额外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表达肽所需要的调节序列的重组多核苷酸，或者可以是具有标志基因等等的表达载体(质粒)。一般而言，此类重组多核苷酸可通过常规重组技术操作多核苷酸来制备，例如通过使用聚合酶和内切核酸酶。

重组和化学合成技术都可用来生成本发明的多核苷酸。例如，可以通过插入在转染入感受态细胞后能表达的适宜载体来生成多核苷酸。或者，可借助PCR技术或通过在合适宿主中的表达来扩增多核苷酸(参见例如Sambrooket al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)。或者，可使用固相技术来合成多核苷酸，如Beaucage SL &Iyer RP，Tetrahedron 1992，48：2223-311；Matthes et al.，EMBO J 1984，3：801-5中记载的。

V.外来体(exosomes)

本发明进一步提供了称作外来体的细胞内囊泡，这些外来体在它们的表面上呈递本发明肽与HLA抗原之间形成的复合体。外来体可以通过，例如在日本专利申请公表公报平11-510507和WO99/03499中详细描述的方法来制备，并可以用从治疗和/或预防所针对的患者获得的APC制备。本发明的外来体可以作为疫苗以与本发明的肽相似的方式进行接种。

复合体中包含的HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防的受试者的类型匹配。例如，在日本人群中，HLA-A2，特别是HLA-A*0201和HLA-A*0206，是普遍的，且因此可能适合于治疗日本人患者。使用在日本人和白种人中高表达的A24型或A2型有利于获得有效的结果，而且也可使用诸如A*0201和A*0206等亚型。典型的，在临床上，预先考察需要治疗的患者的HLA抗原类型，这样就能够合适地选择对此抗原具有高水平的结合亲和力、或者具有藉由抗原呈递的CTL诱导能力的肽。此外，为了获得具有高结合亲和力和CTL诱导能力二者的肽，可以在天然存在的TTK部分肽的氨基酸序列的基础上进行1个、2个或几个氨基酸的取代、插入、删除、和/或添加。

在本发明中，具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肽可优选用作要由外来体表达的肽，而且所述肽具有与HLA-A2诸如HLA-A*0201的高结合亲和力。如此，在优选的实施方案中，本发明的外来体在其表面上呈递具有SEQ IDNO：3的氨基酸序列的肽与HLA抗原之间形成的复合物。

VI.抗原呈递细胞(APC)

本发明还提供在其表面上呈递HLA抗原与本发明肽形成的复合物的分离的抗原呈递细胞(APC)。APC可衍生自要进行治疗和/或预防的患者，而且可作为疫苗以它们自身或与其它药物(包括本发明的肽、外来体、或CTL)组合来施用。

APC不限于特定种类的细胞，包括树突细胞(DC)、Langerhans细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞，已知它们在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原，从而被淋巴细胞识别。由于DC是APC中具有最强CTL诱导活性的代表性APC，DC可以用作本发明的APC。

例如，可通过自外周血单核细胞诱导DC，然后在体外、离体或在体内用本发明的肽接触(刺激)它们来获得本发明的APC。当对受试者施用本发明的肽时，在受试者的身体中诱导出呈递本发明肽的APC。因此，本发明的APC可通过将本发明的肽施用于受试者后自受试者收集APC来获得。或者，本发明的APC可通过使自受试者收集的APC接触本发明的肽来获得。

可以将本发明的APC以它们自身或与其它药物(包括本发明的肽、外来体或CTL)组合施用于受试者以在受试者中诱导针对癌症的免疫应答。例如，离体施用可包括下述步骤：

a：自第一受试者收集APC；

b：使肽接触步骤a的APC；并

c：对第二受试者施用步骤b的APC。

第一受试者和第二受试者可以是同一个体，或者可以是不同个体。或者，依照本发明，提供了本发明的肽制造用于诱导抗原呈递细胞的药物组合物的用途。另外，本发明提供了制造用于诱导抗原呈递细胞的药物组合物的方法或工艺。另外，本发明还提供了本发明的肽，用于诱导抗原呈递细胞。通过步骤b获得的APC可作为疫苗用来治疗和/或预防癌症，包括但不限于肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。

依照本发明的一个方面，APC具有高水平的CTL诱导能力。在术语“高水平的CTL诱导能力”中，高水平是相对于未与肽接触或与不能诱导CTL的肽接触的APC的该水平而言的。这样的具有高水平CTL诱导能力的APC可通过上文所述方法以及下述方法来制备，该方法包括在体外将编码本发明肽的多核苷酸转移至APC的步骤。所导入的基因可以是DNA或RNA的形式。用于进行导入的方法的例子包括但不具体限于本领域中常规实施的各种方法，诸如可使用脂质体转染、电穿孔、或磷酸钙法。更具体的说，可以如Cancer Res1996，56：5672-7；J Immunol 1998，161：5607-13；J Exp Med 1996，184：465-72；国际公开文本No.2000-509281的已公开日文翻译中所述来实施。通过将基因转移入APC，基因在细胞中经历转录、翻译、等等，然后得到的蛋白质被MHC I类或II类加工，并经由呈递途径呈递给本发明的部分肽。

在优选的实施方案中，本发明的APC可以是那些在其表面上呈递HLA抗原与具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肽之间形成的复合物的。更优选地，APC携带HLA-A2抗原，诸如HLA-A*0201，且在其表面上呈递所述HLA-A2抗原与本发明肽(例如具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肽)形成的复合物。

VII.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)

被诱导的针对任一本发明肽的CTL可在体内加强靶向癌细胞的免疫应答，并且因此可以以与肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本发明提供由任一本发明肽特异性诱导或活化的、分离的CTL。

此类CTL可通过下述步骤来获得：(1)对受试者施用本发明的肽；或(2)在体外用本发明的肽接触(刺激)源自受试者的的APC和CD8阳性细胞、或外周血单核白细胞；或(3)在体外使CD8阳性细胞或外周血单个核白细胞接触在其表面上呈递HLA抗原与肽之间形成的复合物的APC或外来体；或(4)导入包括编码T细胞受体(TCR)亚单位的多核苷酸的基因，所述TCR亚单位能结合本发明的肽。上述APC或外来体可通过上文记载的方法来制备，而且(4)之方法的详情记载于下文“VIII.T细胞受体(TCR)”部分。

可以从要进行治疗和/或预防的患者获取本发明的CTL，而且可以将它们单独施用，或者与其它药物(包括本发明的肽或外来体)组合施用以调节效果。所得到的CTL特异性针对呈递本发明的肽例如与用于诱导的肽相同的肽的靶细胞起作用。靶细胞可以是内源表达TTK的细胞，诸如癌细胞，或被TTK基因转染的细胞；而且因肽的刺激而在细胞表面上呈递本发明肽的细胞也可充当活化CTL攻击的靶标。

VIII.T细胞受体(TCR)

本发明还提供包含编码能够形成T细胞受体(TCR)的亚单位的多肽的核酸的多核苷酸的组合物，及使用该组合物的方法。本发明的TCR亚基具有形成赋予T细胞针对呈现TTK的肿瘤细胞的特异性的TCR的能力。通过使用本领域已知的方法，可鉴定出编码构成用本发明的一种或多种肽诱导的CTL的TCR亚基α和β链的核酸(WO2007/032255及Morgan et al.，J Immunol，171，3288(2003))。例如，优选使用PCR方法来分析编码TCR亚基的核苷酸序列。用于分析的PCR引物可以是但不限于例如作为5′侧引物的5′-R引物(5′-gtctaccaggcattcgcttcat-3′)(SEQ ID NO：41)和作为3′侧引物的对TCR α链C区特异性的3-TRa-C引物(5′-tcagctggaccacagccgcagcgt-3′)(SEQ ID NO：42)、对TCR β链C1区特异性的3-TRb-C1引物(5′-tcagaaatcctttctcttgac-3′)(SEQ ID NO：43)或对TCR β链C2区特异性的3-TRbeta-C2引物(5′-ctagcctctggaatcctttctctt-3′)(SEQ ID NO：44)。衍生的TCR能以高亲合力结合展示TTK肽的靶细胞，且任选在体内和在体外介导有效的对呈现TTK肽的靶细胞的杀伤。

可以将编码TCR亚基的核酸掺入合适的载体，例如逆转录病毒载体。这些载体是本领域公知的。通常可将有用的核酸或含有它们的载体转移入T细胞，例如来自患者的T细胞。有利的是，本发明提供一种即配即用型(off-the-shelf)组合物，其容许快速修饰患者自己的T细胞(或其他哺乳动物的T细胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌细胞杀伤特性的修饰型T细胞。

特异性TCR是一种能够特异性识别本发明肽和HLA分子形成的复合物的受体，当TCR在T细胞的表面上呈现时，给予T细胞针对靶细胞的特异性活性。对上述复合物的特异性识别可通过任何已知方法来确认，其优选例子包括使用HLA分子和本发明肽的HLA多聚体染色分析，及ELISPOT测定法。通过实施ELISPOT测定法，能确认经编码TCR亚基的核酸转导的T细胞是否识别表达HLA分子和TTK的细胞，并胞内传输信号。还能通过本领域已知方法确认导入T细胞的TCR亚基是否能给予T细胞以细胞毒性活性。优选的方法包括例如使用HLA-A2阳性且过表达TTK的细胞的铬释放测定法。

此外，本发明提供通过用编码结合在本发明的肽与HLA-A2分子诸如HLA-A*0201之间形成的TCR亚基的核酸转导而制备的CTL。

经过转导的CTL在体内能够归巢(homing)到癌细胞，并且可以利用公知的培养方法体外扩增(例如Kawakami et al.，J Immunol.，142，3452-3461(1989))。可以利用本发明的CTL来形成免疫原性组合物，所述组合物可以用来在需要治疗或保护的患者中治疗和/或预防癌症(WO2006/031221)。

IX.药物作用剂或组合物

由于TTK表达在癌症(其例子包括但不限于肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤)中与正常组织相比特异性升高，本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸可用于治疗和/或预防癌症，和/或预防它们的手术后复发。因此，本发明提供用于治疗和/或预防它们的手术后复发的药物作用剂或组合物，所述作用剂或组合物包括一种或多种本发明的肽或多核苷酸作为活性组分。或者，可以在任何上述外来体或细胞诸如APC的表面上表达本发明的肽，以用作药物作用剂或组合物。另外，上述靶向任一本发明的肽的CTL也可用作本发明药物作用剂或组合物的活性组分。

本发明的药物作用剂和组合物也可用作疫苗。在本发明的语境中，短语“疫苗”(也称作“免疫原性组合物”)指具有在接种入动物后诱导抗肿瘤免疫力的功能的物质。

本发明的药物作用剂或组合物可用于在受试者或患者(包括人和任何其它哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、犬、绵羊、山羊、猪、牛、马、猴、狒狒、和黑猩猩，特别是商业上重要的动物或驯养的动物)中治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发。

在另一个实施方案中，本发明还提供选自下组的活性组分在制备用于治疗或预防癌症或肿瘤的药物作用剂或组合物中的用途：

(a)本发明的肽，

(b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，

(c)在其表面上呈递本发明肽的外来体或APC，和

(d)本发明的细胞毒性T细胞。

或者，本发明进一步提供用于治疗或预防癌症或肿瘤的选自下组的活性组分：

(a)本发明的肽，

(b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，

(c)在其表面上呈递本发明肽的外来体或APC，和

(d)本发明的细胞毒性T细胞。

或者，本发明进一步提供一种制备用于治疗或预防癌症或肿瘤的药物作用剂或组合物的方法或工艺，其中该方法或工艺包括配制药学或生理学可接受载体与选自下组的活性组分作为活性组分的步骤：

(a)本发明的肽，

(b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，

(c)在其表面上呈递本发明肽的外来体或APC，和

(d)本发明的细胞毒性T细胞。

在另一个实施方案中，本发明还提供一种制备用于治疗或预防癌症或肿瘤的药物作用剂或组合物的方法或工艺，其中该方法或工艺包括混合活性组分与药学或生理学可接受载体的步骤，其中所述活性组分选自下组：

(a)本发明的肽，

(b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，

(c)在其表面上呈递本发明肽的外来体或APC，和

(d)本发明的细胞毒性T细胞。

依照本发明，已经发现具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肽是HLA-A2限制性表位肽或能诱导强且特异性的免疫应答的候选者。因此，包括至少一种具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肽的本发明药物作用剂或组合物特别适合于对其HLA-A抗原为HLA-A2的受试者施用。这同样适用于含有编码任何这些肽的多核苷酸(即本发明的多核苷酸)的药物作用剂或组合物。

要用本发明的药物作用剂或组合物治疗的癌症不受限制，而且包括其中涉及(例如过表达)TTK的任何癌症，包括例如肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。

除上述活性组分之外，本发明的药物作用剂或组合物还可含有其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽、编码所述其它肽的其它多核苷酸、呈递所述其它肽的其它细胞等等。在本文中，其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽以癌症特异性抗原(例如已鉴定的TAA)为例，但是不限于此。

如果需要，本发明的药物作用剂或组合物可任选包括其它治疗性物质作为活性组分，只要该物质不抑制活性组分例如任何本发明肽的抗肿瘤效果。例如，配制剂可包括抗炎作用剂、镇痛剂、化疗剂、诸如此类。除了药物自身中的其它治疗性物质之外，本发明的药物还可以与一种或多种其它药理学作用剂顺序或同时施用。药物和药理学作用剂的量取决于例如所使用的药理学作用剂的类型、所治疗的疾病、及施用的时序安排和路径。

应当理解，除在本文中具体提及的组分之外，本发明的药物作用剂或组合物可包括与所讨论的配制剂类型相关的本领域常规的其它作用剂。

在本发明的一个实施方案中，本发明的药物作用剂或组合物可包括在制品和试剂盒中，该制品和试剂盒含有可用于治疗要治疗的疾病(例如癌症)的病理状况的材料。制品可包括任何本发明药物物质或组合物的容器及标签。合适的容器包括瓶、管形瓶、和试管。容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器上的标签应指明该物质或组合物用于治疗或预防一种或多种疾病状况。标签还可指明关于施用的指导等等。

除上文描述的容器之外，包括本发明药物作用剂或组合物的试剂盒还可任选进一步包括第二容器，其中装有药学可接受稀释剂。它可进一步包括从商业和用户立场看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器、和载有使用说明的包装插页。

如果期望的话，药物组合物可存在于药包或分配器装置中，该药包或分配器装置可装有一个或多个含有活性组分的单位剂型。例如，药包可包括金属或塑料箔，诸如泡罩包。药包或分配器装置可附有施用说明书。

(1)含有肽作为活性组分的药物作用剂或组合物

本发明的肽可以作为药物作用剂或组合物直接施用，或者如果必要，可以通过常规配制方法来配制。在后一种情况中，除了本发明的肽之外，还可以视情况包括通常用于药物的载体、赋形剂、等等，没有特别限制。此类载体的例子有灭菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液、等等。另外，药物作用剂或组合物可在必要时含有稳定剂、悬浮液、防腐剂、表面活性剂等等。本发明的药物作用剂或组合物可用于抗癌目的。

本发明的肽可作为组合来制备，其包括两种或更多种本发明的肽和其它表位肽(例如自其它TAA衍生的肽)，以在体内诱导CTL。肽组合可采取鸡尾酒的形式，或者可使用标准技术彼此缀合。例如，可以将肽化学连接或表达成为单一融合多肽序列，其可具有一个或几个氨基酸作为接头(例如赖氨酸接头：K.S.Kawamura et al.J.Immunol.2002，168：5709-5715)。组合中的各个肽可以是相同的或不同的。通过施用本发明的肽，肽被HLA抗原以高密度呈递在APC上，然后诱导出与所展示的肽与HLA抗原之间形成的复合物特异性起反应的CTL。或者，自受试者取出APC(例如DC)，然后用本发明的肽刺激以获得在其细胞表面上呈递本发明肽的APC。将这些APC再施用于受试者以在受试者中诱导CTL，结果能提高针对肿瘤相关内皮的攻击性。

包括本发明肽作为活性组分、用于治疗和/或预防癌症的药物作用剂或组合物还可包括已知有效建立细胞免疫的佐剂。或者，药物组合物可以与其它活性组分一起施用，或者通过配制成颗粒来施用。佐剂指在与具有免疫学活性的蛋白质一起(或页序)施用时增强针对蛋白质的免疫应答的任何化合物、物质或组合物。本文中涵盖的佐剂包括文献中记载的那些(Clin Microbiol Rev1994，7：277-89)。合适佐剂的例子包括但不限于磷酸铝、氢氧化铝、明矾、霍乱毒素、沙门氏菌毒素、不完全弗氏佐剂(IFA)、完全弗氏佐剂(CFA)、ISCO基质、GM-CSF、CpG、O/W乳液、诸如此类。

另外，可方便地使用脂质体配制剂、其中肽结合至几微米直径的珠子的颗粒配制剂、和其中脂质结合至肽的配制剂。

在本发明的另一个实施方案中，本发明的肽也可以以药学可接受盐的形式施用。如本文中使用的，“药学可接受盐”指那些保留化合物的生物学效力和特性且通过与无机酸或碱诸如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等等反应而获得的盐。优选盐的例子包括与碱金属的盐、与金属的盐、与有机碱的盐、与有机酸的盐和与无机酸的盐。

在一些实施方案中，本发明的药物作用剂或组合物可进一步包括引发(prime)CTL的成分。已经将脂质鉴定为能够在体内引发针对病毒抗原的CTL的作用剂。例如，可将棕榈酸残基附着至赖氨酸残基的ε-和α-氨基，然后连接至本发明的肽。然后脂化肽可以在胶束或颗粒中直接施用，掺入脂质体，或在佐剂中乳化。作为脂质引发CTL应答的另一个例子，大肠杆菌(E.coli)脂蛋白，诸如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，当共价附着至适宜的肽时，可用来引发CTL(参见例如Deres et al.，Nature 1989，342：561-4)。

施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，及系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。本发明肽的剂量可以依照要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当加以调整，而且通常是0.001mg至1,000mg，例如0.001mg至1,000mg，例如0.1mg至10mg，而且可以每少数天施用一次至每少数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。

(2)含有多核苷酸作为活性组分的药物作用剂或组合物

本发明的药物作用剂或组合物也可包括处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸。在本文中，短语“处于可表达形式的”意味着多核苷酸在导入细胞时会在体内表达成能诱导抗肿瘤免疫力的多肽。在一个例示性的实施方案中，感兴趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表达所必需的调节元件。多核苷酸可具有为实现稳定插入靶细胞的基因组所需的配置(关于同源重组盒载体的描述参见例如Thomas KR & Capecchi MR，Cell 1987，51：503-12。还可参见例如Wolff et al.，Science 1990，247：1465-8；美国专利Nos.5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；和WO98/04720)。基于DNA的投递技术的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介导的)投递、阳离子脂质复合物、和颗粒介导的(“基因枪”)或压力介导的投递(参见例如美国专利No.5,922,687)。

本发明的肽还可用病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，诸如牛痘或禽痘。这种办法涉及使用例如牛痘病毒作为载体来表达编码肽的核苷酸序列。在导入宿主后，重组牛痘病毒表达表达免疫原性肽，并由此引发免疫应答。可用于免疫接种方案的牛痘载体和方法记载于例如美国专利No.4,722,848。另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG载体记载于Stoveret al.，Nature 1991，351：456-60。有很多种可用于治疗性施用或免疫接种的其它载体是显而易见的，例如腺病毒和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、去毒炭疽毒素载体、诸如此类。参见例如Shata et al.，Mol Med Today 2000，6：66-71；Shedlock et al.，J Leukoc Biol2000，68：793-806；Hipp et al.，In Vivo 2000，14：571-85。

将多核苷酸投递入患者可以是直接的，在该情况中患者直接暴露于携带多核苷酸的载体，或者是间接的，在该情况中首先在体外用感兴趣多核苷酸转化细胞，然后将细胞移植入患者。这两种办法分别称作体内和离体基因疗法。

关于基因疗法的方法的一般综述参见Goldspiel et al.，Clinical Pharmacy1993，12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy 1991，3：87-95；Tolstoshev，Ann RevPharmacol Toxicol 1993，33：573-96；Mulligan，Science 1993，260：926-32；Morgan & Anderson，Ann Rev Biochem 1993，62：191-217；Trends inBiotechnology 1993，11(5)：155-215。重组DNA技术领域普遍知道的也可用于本发明的方法记载于eds.Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY，1993；和Krieger，Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，NY，1990。

施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，而且可使用系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。可以依照要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当调整合适载体或经编码本发明肽的多核苷酸转化的细胞中的多核苷酸的剂量，而且通常是0.001mg至1000mg，例如0.001mg至1000mg，例如0.1mg至10mg，而且可以每数天施用一次至每数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。

X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法

本发明的肽和多核苷酸可用于制备或诱导APC和CTL。本发明的外来体和APC也可用于诱导CTL。肽、多核苷酸、外来体和APC可以与任何其它化合物组合使用，只要所述化合物不抑制它们的CTL诱导能力。因此，任何上述本发明药物作用剂或组合物均可用于诱导CTL，而且除它们之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于诱导APC，如下文讨论的。

(1)诱导抗原呈递细胞(APC)的方法

本发明提供了使用本发明的肽或多核苷酸来诱导具有高CTL诱导能力的APC的方法。

本发明的方法包括在体外、离体或在体内用本发明的肽接触APC的步骤。例如，离体或在体外用肽接触APC的方法可包括下述步骤：

a：自受试者收集APC；并

b：用肽接触步骤a的APC。

APC不限于特定种类的细胞，而且包括DC、Langerhans细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞，已知它们在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原，从而被淋巴细胞识别。优选地，由于DC是APC中具有最强CTL诱导能力的，可使用DC。任何本发明肽可以以它们自身或与其它肽一起使用。

另一方面，在将本发明肽施用于受试者时，APC在体内接触肽，因此在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APC。因此，本发明包括将本发明的肽施用于受试者。类似地，在将可表达形式的本发明多核苷酸施用于受试者时，本发明的肽在体内表达并与APC接触，因此在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APC。因此，本发明还可涵盖将本发明的多核苷酸施用于受试者。“可表达形式”描述于上文“IX.药物作用剂或组合物(2)含有多核苷酸作为活性组分的药物作用剂或组合物”部分。

本发明还可包括将本发明的多核苷酸导入APC以诱导具有CTL诱导能力的APC。例如，该方法可包括下述步骤：

a：自受试者收集APC；并

b：导入编码本发明肽的多核苷酸。

步骤b可如上文“VI.抗原呈递细胞”部分中所述来实施。

或者，本发明提供用于制备特异性诱导针对TTK的CTL活性的抗原呈递细胞(APC)的方法，其中该方法可包括下述步骤之一：

a：在体外、离体或在体内使APC接触本发明的肽；和

b：将编码本发明的肽的多核苷酸导入APC。

(2)诱导CTL的方法

本发明还提供了使用本发明的肽、多核苷酸、外来体或APC来诱导CTL的方法。

本发明还提供使用编码如下多肽的多核苷酸来诱导CTL的方法，所述多肽能够形成识别本发明的肽与HLA抗原的复合物的T细胞受体(TCR)亚单位。优选地，该用于诱导CTL的方法可包括至少一个选自下组的步骤：

a)使CD8阳性T细胞接触在其表面上呈递HLA抗原与本发明的肽的复合物的抗原呈递细胞和/或外来体；和

b)将编码如下多肽的多核苷酸导入CD8阳性细胞，所述多肽能够形成识别本发明的肽与HLA抗原的复合物的TCR亚单位。

当本发明的肽、多核苷酸、APC、或外来体被施用给受试者后，在受试者的身体中诱导出CTL，并增强靶向癌细胞的免疫应答的强度。因此，本发明的方法包括将本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体施用于受试者的步骤。

或者，也可通过离体或在体外使用它们来诱导CTL，并在诱导CTL后，可以将活化的CTL返还受试者。例如，该方法可包括下述步骤：

a：自受试者收集APC；

b：用肽接触步骤a的APC；并

c：将步骤b的APC与CD8阳性细胞共培养。

上文步骤c中要与CD8阳性细胞共培养的APC也可通过将包括本发明多核苷酸的基因转移入APC来制备，如上文“VI.抗原呈递细胞”部分所述，但是本发明不限于此，而且涵盖任何在其表面上有效呈递HLA抗原和本发明肽形成的复合物的APC。

作为此类APC的替代，也可使用在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽形成的复合物的外来体。即，本发明可包括共培养在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽形成的复合物的外来体的步骤。此类外来体可通过上文“V.外来体”部分中描述的方法来制备。

另外，可通过将包括编码能与本发明的肽结合的TCR亚单位的多核苷酸的基因导入CD8阳性细胞来诱导CTL。此类转导可如上文“VIII.T细胞受体(TCR)”部分中所述来实施。

另外，本发明提供了一种制造用于诱导CTL的药物物质或组合物的方法或工艺，其中该方法包括混合或配制本发明的肽与药学可接受载体的步骤。

(3)诱导免疫应答的方法

此外，本发明提供了诱导针对涉及TTK的疾病的免疫应答的方法。合适的疾病包括癌症，其例子包括但不限于肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。

本发明的方法可包括施用含有任何本发明肽或编码它们的多核苷酸的作用剂或组合物的步骤。本发明的方法还涵盖施用呈递任何本发明肽的外来体或APC。关于详情参见“IX.药物作用剂或组合物”项，特别是描述本发明的药物作用剂或组合物作为疫苗的用途的部分。另外，可用于诱导免疫应答的本发明方法的外来体和APC详细描述于上文“V.外来体”、“VI.抗原呈递细胞(APC)”、和“X.使用肽、外来体、APC和CTL”的(1)和(2)部分。

本发明还提供了一种制造用于诱导免疫应答的药物作用剂或组合物的方法或工艺，其中该方法可包括混合或配制本发明的肽与药学可接受载体的步骤。

或者，本发明的方法可包括施用包含下述的疫苗或药物作用剂或组合物的步骤：

(a)本发明的肽；

(b)处于可表达形式的编码本文中公开的此类肽的核酸；

(c)在其表面上呈递本发明肽的APC或外来体；或

(d)本发明的细胞毒性T细胞。

在本发明的语境中，过表达TTK的癌症可用这些活性组分来治疗。所述癌症的例子包括但不限于肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。因而，在施用包括所述活性组分的疫苗或药物作用剂或组合物之前，优选确认要治疗的细胞或组织中的TTK表达水平与同一器官的正常细胞相比增强了。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于在有需要的患者中治疗(过)表达TTK的癌症的方法，该方法可包括下述步骤：

i)测定自具有要治疗的癌症的受试者获得的细胞或组织中的TTK表达水平；

ii)将TTK表达水平与正常对照水平比较；并

iii)对具有与正常对照相比过表达TTK的癌症的受试者施用至少一种选自上文所述(a)至(d)的成分。

或者，本发明提供包括至少一种选自上文所述(a)至(d)的成分的疫苗或药物作用剂或组合物，其用于对具有过表达TTK的癌症的受试者施用。换言之，本发明进一步提供了用于鉴定要用本发明TTK多肽来治疗的受试者的方法，所述方法包括测定源自受试者的细胞或组织中的TTK表达水平的步骤，其中该水平与该基因的正常对照水平相比的升高指示该受试者可具有可用本发明TTK多肽来治疗的癌症。本发明的治疗癌症的方法将在下面更加详细的加以叙述。

任何源自受试者的细胞或组织可用于测定TTK表达水平，只要其包括目标的转录或翻译产物。合适样品的例子包括但不仅限于身体组织与体液，例如血液、痰与尿液。优选地，源自受试者的细胞或组织样品含有这样的细胞群体，该群体包括上皮细胞，较优选癌性上皮细胞或源自怀疑为癌性的组织的上皮细胞。进一步，如果必要，可从所得的身体组织与体液中纯化所述细胞，然后将其用为源自受试者的样品。

在本发明的语境下，从已知非癌性的生物学样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，若对照水平从癌性生物学样品确定，则它称作“癌性对照水平”。样品表达水平与对照水平间的差异，可以相对已知表达水平不会随着细胞的癌或非癌状态改变的对照核酸(例如管家基因)的表达水平加以标准化。示例对照基因包括，但不仅限于，β-肌动蛋白、甘油醛-3磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1。

需用本方法治疗的受试者优选为哺乳动物。例示性的哺乳动物包括但不仅限于例如人类、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马、和牛。

根据本发明，可测定在自受试者获得的细胞或组织中TTK的表达水平。表达水平可在转录(核酸)产物水平确定，使用本领域已知方法。举例而言，TTK的mRNA可通过杂交方法(例如，Northern杂交)使用探针定量。可在芯片、阵列等等上实施所述检测。对检测TTK的表达水平而言，可优选使用阵列。本领域技术人员可利用TTK的序列信息制备上述探针。举例而言，TTK的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物来标志，例如染料、荧光物质和同位素，且所述基因的表达水平可以作为所杂交的标记物的强度检测。

进一步，TTK基因(例如SEQ ID NO：39)的转录产物可通过基于扩增的检测方法(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物可基于所述基因的可得序列信息制备。

具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等条件或低严格条件下与TTK的mRNA杂交。如本文中所使用的，短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，而且在不同的环境下会不同。较长序列的特异杂交与较短序列相比在较高温度下观察到。一般地，严格条件的温度选择比特定序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低大约5℃。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡状态下有50％的与其靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm，平衡时50％的探针被占据。典型地，严格条件会是这样的：其中盐浓度小于大约1.0M钠离子，典型地大约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)，pH7.0-8.3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约30℃，用于较长的探针或引物是至少大约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定物质，例如甲酰胺，来实现。

或者，可以检测翻译产物以进行本发明的诊断。例如，可以确定TTK蛋白(例如SEQ ID NO：40)或其免疫学片段的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法，此类方法使用特异识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于检测，只要该片段或修饰抗体保留对TTK蛋白的结合能力即可。本发明也提供此类针对本发明肽的抗体及其片段。制备这些种类的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。

作为另一种基于其翻译产物来检测TTK基因表达水平的方法，可利用针对TTK蛋白的抗体通过免疫组织化学分析测量其染色的强度。意即，在此测量中，强染色表明所述蛋白质存在/水平增加，且同时表明TTK基因的高表达水平。

对于靶基因例如TTK基因在癌细胞中的表达水平而言，如果该水平较之靶基因的对照水平(例如在正常细胞中的水平)增加了例如10％、25％或50％，或增加到超过1.1倍、超过1.5倍、超过2.0倍、超过5.0倍、超过10.0倍或者更多的话，可以确定该水平是增加的。

对照水平可以与癌细胞同时确定，使用先前从疾病状态(癌性或非癌性)已知的受试者收集和保存的样品。另外，自具有要治疗的癌症的器官的非癌性区获得的正常细胞可用作正常对照。或者，对照水平可以借助统计方法，根据通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的TTK基因表达水平获得的结果加以确定。进一步，对照水平可以来源于先前测试过的细胞的表达模式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物学样品中TTK基因的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。优选地使用从来自与源自受试者的生物学样品组织类型相似的组织类型的参考样品确定的对照水平。而且，优选地，使用具有已知的疾病状态的群体中TTK基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值+/-2S.D.或平均值+/-3S.D.的范围可以用作标准值。

当TTK基因的表达水平相比正常对照水平有所提高或与癌性对照水平相似/等同，则受试者可诊断为具有要治疗的癌症。

本发明还提供了一种(i)诊断怀疑具有要治疗的癌症的受试者，和/或(ii)选择受试者进行癌症治疗的方法，该方法可包括下述步骤：

a)测定TTK在自怀疑具有要治疗的癌症的受试者获得的细胞或组织中的表达水平；

b)将TTK的表达水平与正常对照水平比较；

c)若TTK的表达水平与正常对照水平相比升高的话，将受试者诊断为具有要治疗的癌症；并

d)若在步骤c)中受试者被诊断为具有要治疗的癌症的话，选择受试者进行癌症治疗。

或者，此类方法可包括下述步骤：

a)测定TTK在自怀疑具有要治疗的癌症的受试者获得的细胞或组织中的表达水平；

b)将TTK的表达水平与癌性对照水平比较；

c)若TTK的表达水平与癌性对照水平相似或等同的话，将受试者诊断为具有要治疗的癌症；并

d)若在步骤c)中受试者被诊断为具有要治疗的癌症的话，选择受试者进行癌症治疗。

本发明还提供了用于诊断或确定患有或怀疑患有癌症的受试者是否能用本发明TTK多肽来治疗的诊断试剂盒，其亦可用于评价癌症预后和/或监测癌症疗法(特别是癌症免疫疗法)的功效或实用性。合适癌症的例示性例子包括但不限于肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。更特别地，所述试剂盒优选可包含至少一种在源自受试者的细胞中检测TTK基因表达的试剂，所述试剂选自下组：

(a)检测TTK基因的mRNA的试剂；

(b)检测TTK的蛋白质或其免疫学片段的试剂；和

(c)检测TTK的蛋白质的生物学活性的试剂。

适于检测TTK基因的mRNA的试剂的例子可包括特异性结合或鉴定TTKmRNA的核酸，诸如具有与TTK mRNA的一部分互补的序列的寡核苷酸。这些种类的寡核苷酸以对TTK mRNA特异性的引物和探针为例。可基于本领域众所周知的方法制备这些种类的寡核苷酸。如果需要，检测TTK mRNA的试剂可固定化在固体基质上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测TTKmRNA的试剂。

另一方面，适于检测TTK蛋白或其免疫学片段的试剂的例子可包括针对TTK蛋白或其免疫学片段的抗体。所述抗体可为单克隆的或多克隆的。进一步，所述抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)₂、Fv等等)均可用作所述试剂，只要所述片段或修饰抗体保留与TTK蛋白或其免疫学片段的结合能力。为检测蛋白制备这些种类的抗体的方法在本领域是众所周知的，且可在本发明中使用任何方法制备上述抗体及其等价物。进一步，所述抗体可用能产生信号的分子通过直接连接或间接标记技术进行标记。标记物与标记抗体以及检测抗体与其靶结合的方法在本领域是众所周知的，且本发明可使用任何标记物与方法。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测TTK蛋白质的试剂。

所述试剂盒可包含多于一种前述的试剂。所述试剂盒可进一步包括用于结合针对TTK基因的探针或针对TTK肽的抗体的固体基质和试剂，用于培养细胞的培养基和容器，阳性和阴性对照试剂，及用于检测针对TTK肽的抗体的二抗。举例而言，从没有癌症或罹患癌症的受试者获取的组织样品可用作有用的对照试剂。本发明的试剂盒可进一步包括其它从商业或用户角度而言期望的材料，包括缓冲液、稀释液、滤纸、针头、注射器、和带有使用说明的包装插页(例如，书面的、磁带、CD-ROM等等)。这些试剂之类的可与标签一起包含在容器中。合适的容器可包括瓶、管形瓶和试管。所述容器可从多种材料制得，诸如玻璃或塑料。

在本发明的一个实施方案中，当所述试剂是针对TTK mRNA的探针时，所述试剂可固定化于固体基质上，诸如多孔条，以形成至少一个检测位点。所述多孔条的测量或检测区域可包含多个位置，每个都包含核酸(探针)。测试条亦可包含阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点可位于与测试条不同的条上。任选地，不同的检测位点可包含不同量的固定化核酸，即，在第一个检测位点上量较大而在接下来的位点上量较小。在添加测试样品之后，展示可检测信号位点的数目提供了在样品中存在的TTK mRNA量的定量指征。所述检测位点可配置成任何合适可检测的形状，并通常是横跨测试条宽度的条状或点状。

本发明的试剂盒可进一步包括阳性对照样品或TTK标准样品。本发明的阳性对照样品可通过收集TTK阳性样品，随后测定其TTK水平来制备。或者，可将纯化的TTK蛋白或多核苷酸添加到不表达TTK的细胞中以形成阳性样品或TTK标准样品。在本发明中，纯化的TTK可以是重组蛋白。例如，阳性对照样品的TTK水平大于截留值。

在一个实施方案中，本发明进一步提供了一种诊断试剂盒，其包括能够特异性识别本发明抗体或其免疫原性片段的蛋白或其部分蛋白。

本文中涵盖的本发明的蛋白的部分肽和免疫原性片段的例子包括由本发明蛋白的氨基酸序列中的至少8个、优选15个、和更优选20个连续氨基酸构成的多肽。癌症可通过使用本发明的蛋白或肽(多肽)检测样品(例如血液、组织)中的抗体来诊断。上文描述了用于制备本发明肽或蛋白质的方法。

本发明用于诊断癌症的方法可通过如上所述测定抗TTK抗体量和相应对照样品中的量之间的差异来进行。若受试者的细胞或组织含有针对该基因的表达产物(TTK)的抗体和抗TTK抗体的量测定为大于截留值(与正常对照中的水平相比)的话，则该受试者怀疑患有癌症。

在另一个实施方案中，本发明的诊断试剂盒可包括本发明的肽及与它结合的HLA分子。使用抗原性肽和HLA分子检测抗原特异性CTL的合适方法早已确立(例如Altman JD et al.，Science.1996，274(5284)：94-6)。因此，本发明肽和HLA分子形成的复合物可用于检测方法来检测肿瘤抗原特异性CTL，由此使得较早检测癌症的复发和/或转移成为可能。进一步，它可用于选择适合应用包含本发明肽作为活性组分的药物的受试者或评估该药物的治疗效果。

特别地，依照已知方法(参见例如Altman JD et al.，Science.1996，274(5284)：94-6)，可制备放射性标记的HLA分子和本发明肽的寡聚物复合物，诸如四聚体。可使用该复合物来对源自怀疑患有癌症的受试者的外周血淋巴细胞中的抗原-肽特异性CTL定量。

本发明进一步提供了如本文所述使用肽表位来评估受试者的免疫学应答的方法或诊断试剂。在本发明的一个实施方案中，如本文所述的HLA限制肽可作为试剂用于评估或预测受试者的免疫应答。要评估的免疫应答可通过在体外或在体内使免疫原接触有免疫能力的细胞来诱导。在某些实施方案中，作为试剂采用的物质或组合物可以是能导致识别和结合肽表位的抗原特异性CTL的生成的组合物。无需将肽试剂用作免疫原。用于此类分析的测定系统包括相对较新的技术发展，诸如四聚体、胞内淋巴因子染色和干扰素释放测定法、或ELISPOT测定法。在一个优选的实施方案中，要用肽试剂接触的有免疫能力的细胞可以是抗原呈递细胞，包括树突细胞。

例如，本发明的肽可用于四聚体染色测定法，在暴露于肿瘤细胞抗原或免疫原后，对外周血单个核细胞评估抗原特异性CTL的存在。HLA四聚体复合物可用于直接显现抗原特异性CTL(参见例如Ogg et al.，Science 279：2103-2106，1998；和Altman et al，Science 174：94-96，1996)和测定抗原特异性CTL群体在外周血单个核细胞样品中的频率。使用本发明肽的四聚体试剂可如下所述来生成。

与HLA分子结合的肽在相应HLA重链和β2-微球蛋白存在下重折叠以生成三分子复合物。在该复合物中，重链的羧基末端在先前工程化到蛋白质中的位点处被生物素化。然后，将链霉亲合素添加至复合物以形成由三分子复合物和链霉亲合素组成的四聚体。借助荧光标记的链霉亲合素，四聚体能用于对抗原特异性细胞染色。然后可鉴定细胞，例如通过流式细胞术。此类分析可用于诊断或预后目的。通过该规程鉴定的细胞也可用于治疗目的。

本发明还提供了包括本发明肽的用于免疫回忆应答的试剂(参见例如Bertoni et al，J.Clin.Invest.100：503-513，1997和Penna et al.，J Exp.Med.174：1565-1570，1991)。例如，可使用特定肽对来自具有要治疗的癌症的个体的患者PBMC样品分析抗原特异性CTL的存在。对于含有单个核细胞的血液样品，可通过培养PBMC并用本发明的肽刺激该细胞来评估。适宜培养时段后，可对扩增的细胞群体分析例如CTL活性。

肽还可作为试剂用于评估疫苗的功效。可使用例如上文所述方法来分析自疫苗接种免疫原的患者获得的PBMC。测定患者的HLA型，并选择识别患者中存在的等位基因特异性分子的肽表位试剂进行分析。疫苗的免疫原性可通过PBMC样品中表位特异性CTL的存在来指示。本发明的肽还可用于制备抗体，使用本领域公知技术(参见例如CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY，Wiley/Greene，NY；和Antibodies A Laboratory Manual，Harlow and Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，所述抗体可作为试剂用于诊断、检测或监测癌症。此类抗体可包括识别HLA分子背景中的肽的抗体，即结合肽-MHC复合物的抗体。

本发明的肽和组合物还具有多种别的用途，本文中描述了其中一些。例如，本发明提供了一种用于诊断或检测以TTK免疫原性多肽表达为特征的病症的方法。这些方法涉及测定TTK HLA结合肽、或TTK HLA结合肽和I类HLA分子形成的复合物在生物学样品中的表达。肽或肽和I类HLA分子形成的复合物的表达可通过用针对肽或复合物的结合配偶测定来测定或检测。在一个优选的实施方案中，针对肽或复合物的结合配偶可以是识别和特异性结合肽的抗体。TTK在生物学样品诸如肿瘤活检中的表达也可使用TTK引物通过标准PCR扩增方案来测试。本文中呈现了肿瘤表达的一个例子，而且用于TTK扩增的例示性条件和引物的进一步公开内容可见于WO2003/27322。

优选的诊断方法涉及使自受试者分离的生物学样品接触对TTK HLA结合肽特异性的作用剂以检测TTK HLA结合肽在生物学样品中的存在。如本文中使用的，“接触”意味着放置生物学样品使其在适宜条件(例如浓度、温度、时间、离子强度)下足够接近试剂以容许试剂和生物学样品中存在的TTKHLA结合肽之间的特异性相互作用。一般地，试剂接触生物学样品的条件是本领域普通技术人员知道的促进生物学样品中分子与其关联物(例如蛋白质与其受体关联物、抗体与其蛋白质抗原关联物、核酸与其互补序列关联物)之间的特异性相互作用的条件。用于促进分子与其关联物之间的特异性相互作用的例示性条件记载于授权给Low等人的美国专利No.5,108,921。

本发明的诊断方法可以在体外和在体外任一或二者实施。因而，生物学样品在本发明中可位于体内或体外。例如，生物学样品可以是体内组织，而且可使用对TTK免疫原性多肽特异性的试剂来检测此类分子在组织中的存在。或者，可在体外收集或分离生物学样品(例如血液样品、肿瘤活检、组织提取物)。在一个特别优选的实施方案中，生物学样品可以是含有细胞的样品，更优选含有肿瘤细胞的样品，其是自要诊断或治疗的受试者收集的。

或者，诊断可使用容许通过对荧光素标记的HLA多聚体复合物染色而直接定量抗原特异性T细胞的方法来进行(例如Altman，J.D.et al.，1996，Science274：94；Altman，J.D.et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10330)。还提供了对胞内淋巴因子的染色和干扰素-γ释放测定法或ELISPOT测定法。多聚体染色、胞内淋巴因子染色和ELISPOT测定法都表现出比更常规的测定法灵敏至少10倍(Murali-Krishna，K.et al.，1998，Immunity 8：177；Lalvani，A.et al.，1997，J.Exp.Med.186：859；Dunbar，P.R.et al.，1998，Curr.Biol.8：413)。也可使用五聚体(例如US 2004-209295A)、Dextramers(例如WO 02/072631)、和Streptamers(例如Nature medicine 6.631-637(2002))。

XI.抗体

本发明进一步提供了与本发明的肽结合的抗体。优选的抗体特异性结合本发明的肽且不会结合(或会微弱结合)非本发明肽。或者，抗体结合本发明的肽及其同源物。针对本发明肽的抗体可用于癌症诊断和预后测定法、及成像方法。类似地，此类抗体可用于其它癌症的治疗、诊断、和/或预后，只要癌症患者中也表达或过表达TTK。此外，胞内表达的抗体(例如单链抗体)在治疗上可用于治疗涉及TTK表达的癌症，例子包括但不限于肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。

本发明还提供了多种免疫学测定法，用于检测和/或定量TTK蛋白(SEQID NO：40)或其片段，包括具有选自SEQ ID NO：1、2、3、6、15和22的氨基酸序列的多肽。此类测定法可根据需要包括一种或多种能够识别和结合TTK蛋白或其片段的抗TTK抗体。在本发明的语境中，能与TTK多肽结合的抗TTK抗体优选识别由选自SEQ ID NO：1、2、3、6、15和22的氨基酸序列组成的多肽。抗体的结合特异性可用抑制测试来确认。即，当抗体与所分析的全长TTK多肽之间的结合在任何由选自SEQ ID NO：1、2、3、6、15和22的氨基酸序列组成的片段多肽存在下受到抑制时，显示了此抗体特异性结合该片段。在本发明的语境中，此类免疫学测定法以本领域公知的各种免疫学测定形式内实施，包括但不限于各种类型的放射免疫测定法、免疫层析技术、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶联免疫荧光测定法(ELIFA)、等等。

本发明的有关的免疫学的但非抗体的测定法也可包括T细胞免疫原性测定法(抑制性的或刺激性的)以及MHC结合测定法。另外，本发明涵盖能够检测表达TTK的癌症的免疫学成像方法，例子包括但不限于使用经标记本发明抗体的放射闪烁成像方法。此类测定法在临床上可用于表达TTK的癌症的检测、监测、和预后，例子包括但不限于肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。

本发明还提供了能与本发明的肽结合的抗体。本发明的抗体可以以任何形式使用，例如单克隆或多克隆抗体，而且可进一步包括通过用本发明的肽免疫动物诸如家兔而获得的抗血清、所有种类的多克隆和单克隆抗体、及通过遗传重组生成的人抗体和人源化抗体。

作为抗原用于获得抗体的本发明肽可衍生自任何动物物种，但优选源自哺乳动物，诸如人、小鼠或大鼠，更优选源自人。源自人的肽可以由本文所公开的核苷酸或氨基酸序列获得。

根据本发明，用作免疫抗原的肽可以是完整的蛋白质或蛋白质的部分肽。部分肽可以包含例如本发明肽的氨基(N)末端或羧基(C)末端片段。

在本文中，抗体定义为能与TTK肽的全长或片段起反应的蛋白质。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体能识别由选自SEQ ID NO：1、2、3、6、15和22的氨基酸序列组成的TTK的片段肽。用于合成寡肽的方法是本领域公知的。合成后，可任选在作为免疫原使用之前纯化肽。在本发明的语境中，寡肽(例如9或10聚物)可缀合或连接有载体以增强免疫原性。匙孔戚血蓝蛋白(KLH)作为载体是公知的。用于缀合KLH和肽的方法也是本领域公知的。

或者，可以将编码本发明肽或其片段的基因插入已知的表达载体，然后用该载体转化本文所述宿主细胞。可以通过任何标准方法从宿主细胞外部或内部回收所需肽或其片段，然后可将其用作抗原。或者，表达肽的完整细胞或其溶胞物或者化学合成的肽也可用作抗原。

可以用抗原免疫任何哺乳动物，但优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常，可使用啮齿目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或灵长目(Primate)的动物。啮齿科动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形科动物包括例如家兔。灵长科动物包括例如狭鼻猿(Catarrhini)(东半球猴(old worldmonkey))诸如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。

用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。腹膜内注射或皮下注射抗原是免疫哺乳动物的标准方法。更具体的说，可以在适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中稀释和悬浮抗原。如果需要，可将抗原悬浮液与适量的标准佐剂诸如弗氏(Freund)完全佐剂混合，制成乳状液，然后施用于哺乳动物。优选的是，其后每4-21天施用数次与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原。还可使用适宜的载体进行免疫。如上所述进行免疫后，可通过标准方法检验血清中所需抗体的量的增加。

可以如下制备针对本发明肽的多克隆抗体：从经过免疫的并检验了其血清中所需抗体增加的哺乳动物收集血液，并通过任何常规方法从血液中分离血清。多克隆抗体可包括含有多克隆抗体的血清，并且可以从所述血清中分离含有该多克隆抗体的级分。可以使用例如偶联有本发明肽的亲和柱从仅识别本发明肽的级分中制备免疫球蛋白G或M，并进一步使用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分。

为了制备单克隆抗体，从经过抗原免疫并如上所述检查出血清中所需抗体水平升高的哺乳动物收集免疫细胞，并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞可优选获自脾。其它要与上述免疫细胞融合的优选亲本细胞包括例如哺乳动物骨髓瘤细胞，更优选具有为了用药物选择融合细胞而获得的特性的骨髓瘤细胞。

根据已知的方法，例如Milstein等(Galfre和Milstein，Methods Enzymol 73：3-46(1981))的方法，可与将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞进行融合。

通过在标准选择培养基诸如HAT培养基(含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)中进行培养，可以选择出由细胞融合得到的杂交瘤。通常，细胞培养在HAT培养基中连续进行数天至数周，这段时间足以使除了所需杂交瘤之外的所有其它细胞(非融合的细胞)死亡。然后，可进行标准有限稀释(standardlimiting dilution)来筛选和克隆生成所需抗体的杂交瘤细胞。

除了上述用抗原免疫非人动物来制备杂交瘤的方法外，还可以在体外用肽、表达肽的细胞或其溶胞物免疫人淋巴细胞，诸如那些感染了EB病毒的人淋巴细胞。然后，使经过免疫的淋巴细胞与能够无限分裂的源自人的骨髓瘤细胞诸如U266融合，以产生期望的生成能够与所述肽结合的人抗体的杂交瘤(已公开但未审查的日本专利申请No.Sho 63-17688)。

随后将所得杂交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得单克隆抗体可通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联有本发明肽的亲和柱进行纯化。本发明的抗体不仅可用于纯化和检测本发明的肽，还可以用作本发明肽的激动剂和拮抗剂的候选物。

或者，可以通过癌基因使生成抗体的免疫细胞，诸如经过免疫的淋巴细胞永生化，并用于制备单克隆抗体。

如此获得的单克隆抗体也可以使用遗传工程技术来重组制备(参见例如Borrebaeck and Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies，由MacMillanPublishers LTD在英国出版(1990))。例如，可以从生成抗体的免疫细胞诸如杂交瘤或经过免疫的淋巴细胞克隆编码抗体的DNA，将该DNA插入合适的载体，并导入宿主细胞以制备重组抗体。本发明还提供了如上所述制备的重组抗体。

此外，本发明的抗体可以是抗体片段或经过修饰的抗体，只要它能结合一种或多种本发明的肽。例如，抗体片段可以是Fab、F(ab’)₂、Fv或将来自H链和L链的Fv片段通过合适的接头连接而成的单链Fv(scFv)(Huston et al.，Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83(1988))。更具体的说，可以通过用酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体来生成抗体片段。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体，并在合适的宿主细胞中表达(参见例如Co etal.，J Immunol 152：2968-76(1994)；Better and Horwitz，Methods Enzymol 178：476-96(1989)；Pluckthun and Skerra，Methods Enzymol 178：497-515(1989)；Lamoyi，Methods Enzymol 121：652-63(1986)；Rousseaux et al.，MethodsEnzymol 121：663-9(1986)；Bird and Walker，Trends Biotechnol 9：132-7(1991))。

抗体可以通过与多种分子诸如聚乙二醇(PEG)缀合来修饰。本发明提供了经过这样修饰的抗体。可通过化学修饰抗体来获得经过修饰的抗体。这些修饰方法是本领域常规的。

或者，可以以衍生自非人抗体的可变区与衍生自人抗体的恒定区之间的嵌合抗体或者包含衍生自非人抗体的互补决定区(CDR)、衍生自人抗体的框架区(FR)及恒定区的人源化抗体的形式来获得本发明的抗体。此类抗体可依照已知技术来制备。人源化可通过用啮齿类的CDR或CDR序列替换人抗体的相应序列来进行(参见例如Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988))。因而，此类人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上小于整个人可变域已被来自非人物种的相应序列所替换。

也可以使用除了人框架区和恒定区外还包含人可变区的完全人的抗体。此类抗体可使用本领域已知的多种技术来制备。例如，体外方法包括使用展示在噬菌体上的人抗体片段的重组文库(例如Hoogenboom & Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991))。类似的，可通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例如内源免疫球蛋白基因部分或完全灭活的小鼠，来生成人抗体。该方法记载于例如美国专利Nos.6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016。

可以将如上获得的抗体纯化至同质。例如，可依照用于一般蛋白质的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，可以通过适当选择和组合使用柱层析诸如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦来分出和分离抗体(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow和David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如HyperD、POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。

除亲和层析外的例示性层析包括例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析、等等(Strategies for Protein Purification和Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。可以通过液相层析来进行层析规程，诸如HPLC和FPLC。

例如，可使用吸光度测量、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)和/或免疫荧光来测量本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定化在板上，将本发明的肽施加到该板上，再施加含有所需抗体的样品，诸如生成抗体的细胞的培养物上清液或纯化的抗体。然后施加用酶(诸如碱性磷酸酶)标记的、识别第一抗体的第二抗体，并将板温育。接着，在洗涤后，向板中加入酶底物，诸如磷酸对硝基苯酯，并测量吸光度以评估样品的抗原结合活性。可以使用肽的片段，诸如C-末端或N-末端片段作为抗原来评估抗体的结合活性。可以使用BIAcore(Pharmacia)来评估本发明抗体的活性。

上述方法允许通过将本发明的抗体暴露于假定含有本发明肽的样品，并检测或测量由抗体与肽形成的免疫复合物，来检测或测量本发明的肽。

因为依照本发明的肽检测或测量方法可特异性的检测或测量肽，所以该方法可用于使用肽的各种实验。

XII.载体和宿主细胞

本发明还提供了导入有编码本发明肽的核苷酸的载体和宿主细胞。本发明的载体可用于在宿主细胞中维持本发明的核苷酸、尤其是DNA，用于表达本发明的肽，或者用于施用本发明的核苷酸以用于基因疗法。

当宿主细胞为大肠杆菌且在大肠杆菌(例如JM109、DH5α、HB101或XL1Blue)中大量扩增和生成载体时，载体应具有能在大肠杆菌中扩增的“(复制)起点”和用于选择经过转化的大肠杆菌的标志基因(例如通过药物诸如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等进行选择的药物抗性基因)。例如，可以使用M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，与上述载体一样，pGEM-T、pDIRECT和pT7也可以用于亚克隆和提取cDNA。当使用载体来生成本发明的蛋白质时，可使用表达载体。例如，要在大肠杆菌中表达的表达载体应具备上述在大肠杆菌中扩增的特征。当使用大肠杆菌诸如JM109、DH5α、HB101或XL1Blue作为宿主细胞时，载体应具有能在大肠杆菌中高效表达所需基因的启动子，例如lacZ启动子(Wardet al.，Nature 341：544-6(1989)；FASEB J 6：2422-7(1992))、araB启动子(Betteret al.，Science 240：1041-3(1988))、T7启动子等。在这方面，可以使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress系统”(Qiagen)、pEGFP和pET(在这种情况中，宿主优选为表达T7RNA聚合酶的BL21)来替代上述载体。另外，载体还可以包含用于多肽分泌的信号序列。指导肽分泌至大肠杆菌周质的例示性信号序列有pelB信号序列(Lei et al.，J Bacteriol 169：4379(1987))。用于将载体导入靶宿主细胞的手段包括例如氯化钙法和电穿孔法。

除了大肠杆菌外，还可以使用例如源自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17)：5322(1990))、pEF、pCDM8)、衍生自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、衍生自植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)、衍生自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、衍生自逆转录病毒的表达载体(例如pZIpneo)、衍生自酵母的表达载体(例如“毕赤酵母表达试剂盒”(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)及衍生自枯草芽孢杆菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)来生成本发明的多肽。

为了在动物细胞诸如CHO、COS或NIH3T3细胞中表达载体，载体应具有在所述细胞中进行表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan et al.，Nature 277：108(1979))、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima et al.，Nucleic Acids Res 18：5322(1990))、CMV启动子、等等，及优选用于选择转化子的标志基因(例如通过药物(例如新霉素、G418)进行选择的药物抗性基因)。具有这些特征的已知载体的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。

提供下面的实施例来例示本发明及帮助本领域普通技术人员来制备和使用本发明。实施例并非意图以任何方式限制本发明的范围。

实施例

材料和方法

细胞系

T2(HLA-A2)，人B淋巴母细胞样细胞系和COS7，非洲绿猴肾细胞系购自ATCC。HLA-A2阳性且TTK阳性的肿瘤细胞系H1650购自ATCC。HLA-A2阴性且TTK阳性的细胞系PC-3和TE-1分别购自JCRB细胞库和RIKEN细胞库。

自TTK衍生的肽的合成

基于针对HLA-A*0201分子的结合亲和力预测设计了自TTK衍生的9聚物和10聚物肽(SEQ ID NO：1至38)。由SIGMA(札幌，日本)或BiosynthesisInc.(Lewisville，TX)依照标准固相合成法合成了这些肽，并通过反相高效液相层析(HPLC)进行了纯化。分别通过分析型HPLC和质谱术分析测定了肽的纯度(＞90％)和身份。将肽以20mg/ml在二甲亚砜(DMSO)中溶解，并保存于-80℃。

体外CTL诱导

使用单核细胞衍生树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞(APC)来诱导针对人白细胞抗原(HLA)上呈递的肽的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。如别处(Nakahara S et al.，Cancer Res 2003 Jul 15，63(14)：4112-8)所述在体外生成DC。具体而言，将用Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液自正常志愿者(HLA-A*0201阳性)分离的外周血单个核细胞(PBMC)通过粘附至塑料组织培养皿(Becton Dickinson)来加以分离，以将它们作为单核细胞级分富集。在含有2％热灭活自体血清(AS)的AIM-V培养基(Invitrogen)中在1,000U/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(R&D System)和1,000U/ml白介素(IL)-4(R&DSystem)存在下培养富集了单核细胞的群体。培养7天后，将经细胞因子诱导的DC在AIM-V培养基中在3微克/mlβ2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一种合成肽于37℃冲激3小时。所生成的细胞表观上在它们的细胞表面上表达DC相关分子，诸如CD80、CD83、CD86和HLA II类(数据未显示)。然后将这些经肽冲激的DC用X辐照(20Gy)灭活，并以1∶20比例与用CD8阳性分离试剂盒(Dynal)通过正选择获得的自体CD8+ T细胞混合。在48孔板(Corning)中设立这些培养物；每个孔在0.5ml AIM-V/2％ AS培养基中含有1.5x 10⁴个经肽冲激的DC、3x 10⁵个CD8+ T细胞和10ng/ml IL-7(R&D System)。3天后，给这些培养物补充IL-2(CHIRON)至终浓度20IU/ml。在第7天和第14天，将T细胞用经肽冲激的自体DC进一步刺激。每次通过与上文所述相同的方式来制备DC。在第21天在第三轮肽刺激后测试针对经肽冲激的T2细胞的CTL(Tanaka H et al.，Br J Cancer 2001 Jan 5，84(1)：94-9；Umano Y et al.，Br JCancer 2001 Apr 20，84(8)：1052-7；Uchida N et al.，Clin Cancer Res 2004 Dec15，10(24)：8577-86；Suda T et al.，Cancer Sci 2006 May，97(5)：411-9；WatanabeT et al.，Cancer Sci 2005 Aug，96(8)：498-506)。

CTL扩增规程

使用与Riddell等人(Walter EA et al.，N Engl J Med 1995 Oct 19，333(16)：1038-44；Riddell SR et al.，Nat Med 1996 Feb，2(2)：216-23)记载的方法相似的方法在培养中扩增CTL。在40ng/ml抗CD3单克隆抗体(Pharmingen)存在下将总共5x 10⁴个CTL与丝裂霉素C灭活的两种人B-淋巴母细胞样细胞系在25mlAIM-V/5％AS培养基中悬浮经。启动培养后一天，向培养物添加120IU/mlIL-2。在第5天、第8天和第11天给培养物补加新鲜的含有30IU/ml IL-2的AIM-V/5％ AS培养基(Tanaka H et al.，Br J Cancer 2001 Jan 5，84(1)：94-9；Umano Y et al.，Br J Cancer 2001 Apr 20，84(8)：1052-7；Uchida N et al.，ClinCancer Res 2004 Dec 15，10(24)：8577-86；Suda T et al.，Cancer Sci 2006 May，97(5)：411-9；Watanabe T et al.，Cancer Sci 2005 Aug，96(8)：498-506)。

CTL克隆的建立

在96圆底微量滴定板(Nalge Nunc International)中进行稀释以获得0.3、1和3个CTL/孔。在总体积为150微升/孔的含5％AS的AIM-V培养基中，将CTL与1x 10⁴个细胞/孔的两种人B-淋巴母细胞样细胞系、30ng/ml的抗CD3抗体，和125U/ml的IL-2一起培养。10天后向培养基中加入50微升/孔的IL-2以达到终浓度125U/ml的IL-2。在第14天测试CTL活性，并使用如上所述的相同方法扩增CTL克隆(Uchida N et al.，Clin Cancer Res 2004 Dec 15，10(24)：8577-86；Suda T et al.，Cancer Sci 2006 May，97(5)：411-9；Watanabe T et al.，Cancer Sci2005 Aug，96(8)：498-506)。

特异性CTL活性

为了检查特异性CTL活性，实施了干扰素(IFN)-γ酶联免疫斑点(ELISPOT)测定法和IFN-γ酶联免疫吸附测定法(ELISA)。具体而言，制备经肽冲激的T2(1x 10⁴/孔)作为刺激细胞。使用48孔中培养的细胞作为应答细胞。依照制造商的规程实施IFN-γELISPOT测定法和IFN-γELISA测定法。

强迫表达靶基因和/或HLA-A02的细胞的建立

通过PCR来扩增编码靶基因可读框或HLA-A*0201的cDNA。将PCR扩增产物克隆入载体。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)依照制造商推荐的规程将质粒转染入COS7(靶基因和HLA-A*0201阴性的细胞系)。自转染起2天后，用Versene(Invitrogen)收获经转染细胞，并用作CTL活性测定法的靶细胞(5X10⁴个细胞/孔)。

结果

预测的来自TTK的HLA-A*0201限制肽的CTL诱导

依照“材料和方法”中描述的方案产生了针对那些自TTK衍生的肽的CTL。通过IFN-γ ELISPOT测定法来测定肽特异性CTL活性(图1a-j)。下面的孔号展现出与对照孔相比强的IFN-γ生成：用TTK-A02-9-462(SEQ ID NO：1)刺激的1号和4号孔(a)，用TTK-A02-9-630(SEQ ID NO：2)刺激的7号孔(b)，用TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)刺激的5号孔(c)，用TTK-A02-9-719(SEQID NO：6)刺激的4号、5号、6号和7号孔(d)，用TTK-A02-9-142(SEQ ID NO：15)刺激的5号和7号孔(e)，用TTK-A02-9-146(SEQ ID NO：19)刺激的7号孔(f)，用TTK-A02-9-564(SEQ ID NO：20)刺激的5号、7号和8号孔(g)，用TTK-A02-10-462(SEQ ID NO：22)刺激的1号、2号和5号孔(h)，用TTK-A02-10-542(SEQ ID NO：34)刺激的2号孔(i)，及用TTK-A02-10-661(SEQ ID NO：35)刺激的2号孔(j)。

针对TTK特异性肽的CTL系和克隆的建立

扩增用TTK-A02-9-462(SEQ ID NO：1)刺激的1号孔(a)、用TTK-A02-9-630(SEQ ID NO：2)刺激的7号孔(b)、用TTK-A02-9-593(SEQ IDNO：3)刺激的5号孔(c)、用TTK-A02-9-719(SEQ ID NO：6)刺激的5号孔(d)、用TTK-A02-9-142(SEQ ID NO：15)刺激的5号孔(e)及用TTK-A02-10-462(SEQ ID NO：22)刺激的2号孔(f)中通过IFN-γ ELISPOT测定法检测显示出肽特异性CTL活性的细胞，并如“材料和方法”中所述通过有限稀释建立CTL系。通过IFN-γ ELISA测定法测定那些CTL系的CTL活性(图2a-f)。与未经肽冲激的靶细胞相比，所有CTL系针对经相应肽冲激的靶细胞均展现出强的IFN-γ生成。

另外，如“材料和方法”中所述通过有限稀释自所述CTL系建立了CTL克隆，并通过IFN-γ ELISA测定法测定了所述CTL克隆针对经肽冲激的靶细胞的IFN-γ生成。确定了经TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)刺激的CTL克隆的强的IFN-γ生成(图2g)。

针对表达TTK和HLA-A*0201的靶细胞的特异性CTL活性

对针对每种肽产生的建成CTL系和克隆，检查其识别表达TTK和HLA-A*0201分子的靶细胞的能力。使用用相应肽产生的CTL系和克隆作为效应细胞，测试了针对用全长TTK和HLA-A*0201基因二者转染的COS7细胞(内源表达TTK和HLA-A*0201基因的靶细胞的特异性模型)的特异性CTL活性。制备了用全长TTK基因或HLA-A*0201转染的COS7细胞作为对照。在图3中，经TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)刺激的CTL系和CTL克隆针对表达TTK和HLA-A*0201二者的COS7细胞显示出强的CTL活性(a：系，b：克隆)。另一方面，没有检测到显著的针对对照的特异性CTL活性。用TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)建立的CTL克隆还显示针对内源表达TTK和HLA-A*0201二者的肿瘤细胞系：H1650细胞的特异性CTL活性(c)。另一方面，没有检测到显著的针对对照：TE1细胞和PC3细胞的特异性CTL活性。因此，这些数据清楚地证明TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)的肽被内源加工并与HLA-A*0201分子一起在靶细胞上表达。然后，此肽-HLA复合物并被CTL识别。这些结果指示TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)可适合作为癌症疫苗，用于具有表达TTK的肿瘤的患者。

对抗原肽的同源性分析

经TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)刺激的CTL显示出显著的且特异的CTL活性。这个结果可能是由于TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)的序列与其它已知可使人免疫系统致敏的分子衍生的肽同源。为了排除这种可能性，使用BLAST算法(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)使用这些肽序列作为检索项实施了同源性分析，没有发现具有显著同源性的序列。同源性分析的结果指示TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)的序列是独特的，因此，就我们所知，这些分子产生对一些无关分子的不期望的免疫学应答的可能性很小。

总之，鉴定了自TTK衍生的新型HLA-A02表位肽。另外，证明了利用TTK的表位肽的疫苗可用于癌症免疫疗法。

参考例

针对表达TTK和HLA-A*0201的靶细胞的特异性CTL活性 [WO2008/102557]

申请人的作为WO2008/102557公布的在先申请公开了自TTK衍生的肽针对外源表达TTK和HLA-A*0201的靶细胞的特异性CTL诱导活性(图4)。

对针对这些肽生成的建立CTL克隆检查它们识别表达TTK和HLA-A*0201的靶细胞的能力。使用用TTK-A2-9-462(SEQ ID NO：1)、TTK-A02-9-547(SEQ ID NO：5)、TTK-A2-9-719(SEQ ID NO：6)和TTK-A2-10-462(SEQ ID NO：22)生成的CTL克隆作为效应细胞，测试了针对经全长TTK基因和HLA-A*0201分子二者转染的COS7(这是关于内源表达TTK和HLA-A*0201的靶细胞的一种特异性模型)的特异性CTL活性。制备经全长TTK转染但未经全长HLA-A*0201转染的COS7、经HLA-A*0201转染但未经全长TTK转染的COS7(或替换为全长HIG2基因)及经HLA-A*0201转染且经不同的靶表位肽冲激的COS7作为对照。结果证明针对那些肽生成的CTL克隆具有针对经TTK和HLA-A*0201二者转染的COS7的特异性CTL活性(图4，对应于WO2008/102557中的图8b、c、d和e，通过述及完整收入本文)。

与那些肽相比，本发明中鉴定的TTK-A02-9-593(SEQ ID NO：3)拥有将IFN-γ生成提高1个或2个数量级的显著有效的活性(图3)。因此，本发明的肽似乎是治疗、预防、和/或防范癌症的一种有希望的靶标，所述癌症包括但不限于肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。

工业应用性

本发明提供了新的TAA，特别是自TTK衍生的新TAA，它们可诱导强而特异性的抗肿瘤免疫应答，并且可应用于广泛的癌症类型。这样的TAA可用作针对与TTK相关的疾病的肽疫苗，这样的疾病例如癌症，更具体地，肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位症、食管癌、胃癌、弥漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。

虽然本文中参照其具体实施方案详细地描述了本发明，但是要理解，上面的描述本质上是例示性的和解释性的，而且意图例示本发明及其优选实施方案。经由常规实验，本领域技术人员会容易地认识到，可以对本发明进行各种变化和修饰，而不偏离本发明的精神和范围，本发明的边界和范围由所附权利要求来限定。

Claims (21)

1.一种分离的肽，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

2.一种具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力的分离的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中替换、删除、或添加了1个、2个、或几个氨基酸。

3.权利要求2的分离的肽，其中该肽具有下列特征之一或二者：

(a)自N端起的第二个氨基酸是选自下组的氨基酸，或被修饰成选自下组的氨基酸：亮氨酸和甲硫氨酸；和

(b)C端氨基酸是选自下组的氨基酸，或被修饰成选自下组的氨基酸：缬氨酸和亮氨酸。

4.权利要求1至3任一项的分离的肽，其中所述肽是九肽。

5.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至4任一项的肽。

6.一种用于诱导CTL的作用剂，其中该作用剂包含一种或多种权利要求1至4任一项的肽或者一种或多种权利要求5的多核苷酸。

7.一种用于治疗和/或预防癌症和/或防止其手术后复发的药物作用剂，其中该作用剂包含一种或多种权利要求1至4任一项的肽或者一种或多种权利要求5的多核苷酸。

8.权利要求7的药物作用剂，其配制为用于对HLA抗原为HLA-A2的受试者施用。

9.权利要求8的药物作用剂，其中所述HLA-A2为HLA-A*0201。

10.权利要求7或8的药物作用剂，其中该作用剂配制为用于癌症治疗。

11.一种用于诱导具有CTL诱导能力的抗原呈递细胞(APC)的方法，其包括选自下组的步骤：

(a)在体外、离体或在体内使APC接触权利要求1至4任一项的肽；和

(b)将编码权利要求1至4任一项的肽的多核苷酸导入APC。

12.一种用于诱导CTL的方法，其包括选自下组的步骤：

(a)将CD8阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至4任一项的肽的复合物的APC共培养；

(b)将CD8阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至4任一项的肽的复合物的外来体共培养；和

(c)将包含编码能够结合权利要求1至4任一项的肽的T细胞受体(TCR)亚单位多肽的多核苷酸的基因导入T细胞。

13.一种分离的APC，其在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至4任一项的肽的复合物。

14.权利要求13的APC，其是通过权利要求11的方法诱导的。

15.一种分离的CTL，其靶向权利要求1至4任一项的肽。

16.权利要求15的CTL，其是通过权利要求12的方法诱导的。

17.一种在受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法，其中该方法包括对该受试者施用包含权利要求1至4任一项的一种或多种肽、一种或多种其免疫学活性片段、或一种或多种编码该肽或该片段的多核苷酸的作用剂。

18.一种抗体或其片段，其针对权利要求1至4任一项的肽。

19.一种载体，其包含编码权利要求1至4任一项的肽的核苷酸序列。

20.一种宿主细胞，其经过权利要求19的载体转化或转染。

21.一种诊断试剂盒，其包含权利要求1至4任一项的肽、权利要求5的核苷酸或权利要求18的抗体。

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