CN102449529A - 用于紫外线扫描规划的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于定位安置在固体载体上的一个或多个大致上圆形的组织样本的方法。该方法包括以下步骤：传送预选波长的光到组织样本上，其中该光诱导该组织样本自发荧光；使用该自发荧光的光来识别该组织样本的中心位点；使用x、y坐标系使该固体载体上的该组织样本的中心位点的坐标相关；和映射该固体载体上的该组织样本的坐标以区分包含组织样本的区域与该固体载体上的空白区域。在第二方面中，本发明提供用于定位安置在固体载体上的一个或多个大致上圆形的组织样本的装置。

Description

用于紫外线扫描规划的方法和装置

背景技术

在制备的组织样本用于显微分析的医学成像中，需要首先定位固体载体上的组织。为了最有效地使组织切片(tissue section)成像，系统必须首先确切地知道组织位于该固体载体上什么地方。在最简单的描述中，系统必须查看整个固体载体并且识别那部分是组织、哪部分是玻璃、标签和碎片。然后将组织位点转换到区域包络线。然后在显微镜载物台的位置空间中映射该区域的坐标。这允许对显微镜运动编程以覆盖该固体载体的适当区域，并且避免浪费没有组织存在的区域。该技术通常称为扫描规划。

尽管在分析期间直接提取关于组织位点的信息可是优选的，标准基准的使用由于载玻片到载玻片和操作员到操作员的变化性而成问题。基于组织的扫描规划通常是优选的，因为它允许更可重复和可靠的规划同时避免要求特殊的载玻片或特定的安装技术。

对于扫描规划的典型方法牵涉在相对低的放大率(例如1.25x)进行完整固体载体的粗扫描以便定位组织，该组织被数字化并且重构以在更详细的分析之前向用户提供样本的放大图像。

目前的方法通常依靠颜色或纹理来区分组织与固体载体。这些方法存在若干潜在问题，因为它们可能在载玻片上碰到墨水或杂散标记以及在一些载玻片的边缘上的基准交叉影线。在用荧光染料标记组织的情况下，图像采集时间通常是慢的；存在可能性是染色的组织样本可在成像过程完成之前经历光漂白。此外，当用荧光染料对组织染色时，通常染料必定会局部化在组织的特定亚区并且不完全覆盖组织，这使得难以准确区分组织和非组织，这一点当使用例如在明视场成像中可见的苏木精和曙红(H&E)等其他染料时是可能的。因此，荧光染料必需其他检测方法。最终，目前的方法典型地没有很好地对未染色组织切片起作用，因为薄的组织切片在可见光中基本上是透明的并且因此没有提供足够的信号信息来准确处理。

发明内容

在第一方面中，本发明提供用于定位安置在固体载体上的一个或多个大致上圆形的组织样本的方法。该方法牵涉以下步骤：传送预选波长的光到组织样本上，其中该光诱导该组织样本自发荧光；使用该自发荧光的光来识别该组织样本的中心位点；使用x、y坐标系使在该固体载体上的该组织样本的中心位点的坐标相关；并且映射该固体载体上的该组织样本的坐标以区分包含组织样本的区域与固体载体上的空白区域。

在第二方面中，本发明提供用于定位安置在固体载体上的一个或多个大致上圆形的组织样本的装置。该装置包括：成像显微镜，其具有至少一个物镜以在不同的放大率采集图像和载物台以将样本托在固体载体上；激发源以照射载物台上的样本；连接到该显微镜以采集样本图像并且使样本图像数字化的数字图像装置；与该数字图像装置通信能够存储数字化的样本图像的存储装置；和与该存储装置通信并且能够将数字图像分类以及能够基于相关因子产生一个或多个匹配滤波器(match filter)的处理器。

附图说明

当下列详细说明参照附图(其中类似的符号在整个附图中表示类似的部件)阅读时，本发明的这些和其他特征、方面和优势将变得更好理解，其中：

图1是体现本发明的图像采集和分析的多步骤方法的示意图。

图2是基于本发明的实施例示出使用屏蔽滤波器在x、y方向采集图像的组织微阵列的示意图示。

图3是能够定位固体载体上的组织样本的自动化系统的图示。

具体实施方式

下列详细说明是示范性的并且不意在限制本申请的发明和本发明的使用。此外，意图不在于，本发明被本发明的前述背景或附图的下列详细说明中提出的任何理论限制。

根据一个实施例，描述其中使用自发荧光来确定大致上圆形的组织样本在固体载体上的位点的方法。在一个实施例中，该方法包括使用引起自发荧光的近UV光来照射组织样本。自发荧光指当组织或组织样本内的内源性化合物在缺乏对任何外源性荧光化合物管理和束缚下暴露于光子的外源时在由这些内源性化合物发射的光子的能量和幅度，这不同于遵循这样的荧光化合物的管理和束缚并且暴露于光子的外源时发射的辐射。该光子能量典型地在UV或可见光范围中。

使用标准照相透镜来获得经历自发荧光的组织样本的宏观图像(macro-image)以便在单个图像中捕捉整个固体载体，其包括任何识别标记。这些识别标记大体上指固体载体上的指示物，例如安置在固体载体的边缘或角落处的交叉影线标记。

固体载体可包括，但不限于显微镜载玻片、组织微阵列载玻片或微量滴定板。在任何荧光标记之前照射样本。一旦获得组织图像，其就被处理以识别组织样本在固体载体上的位点。

图1图示可采用以采集用于在本发明的某些实施例中使用的图像的示范性技术。图1示出图像采集和分析的多步骤方法的示意图，其包括：传送预选波长的光到固体载体上的组织样本上，其中该光诱导该组织样本自发荧光；使用该自发荧光的光来识别该组织样本的中心位点；使这些中心位点与该组织样本的先前存在的模板相关以创建第二数字图像，其对该数字图像的每个区指定像素值；创建二维坐标系；以及使用这些像素值映射固体载体上的该组织样本的坐标以区分包含组织样本的区域与固体载体上的空白区域。

在第一步骤中，方法包括使用引起自发荧光的近UV光来照射固体载体上的大致上圆形的组织样本。在一个实施例中，标准汞卤化物灯可用作光源。大致上圆形指其中从沿着组织样本的外边界的点到样本内的质心点的距离是具有类似的长度，造成被认为是圆形图案的组织样本。该质心点对应于组织样本的中心位点。这样的圆形图案在1998年10月的美国Proc.Natl.Acad.Sci.的卷95、页12783-12786中描述。

大致上圆形的组织样本可包括例如包含在组织微阵列(TMA)上的组织样本、活检组织样本或生物样本等任何组织物质。组织样本可用例如福尔马林等组织防腐剂来冷冻或固定或另外处理。组织样本可染色或未染色以便提高在可见光中的对比度。在一些实施例中，组织样本可以是整个细胞、细胞成分、细胞离心涂片(cytospin)或细胞涂片。组织样本可包括可具有相似功能的从生物对象的组织获得的相似细胞的集合。在一些实施例中，组织样本可包括从人体组织获得的相似细胞的集合。人体组织的适合的示例包括，但不限于：(1)上皮；(2)结缔组织，其包括血管、骨骼和软骨；(3)肌肉组织；和(4)神经组织。组织样本的源可以是从新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样本或活检或抽吸物获得的固体组织；血液或任何血液成分；例如脑脊髓液、羊水、腹腔液或间质液等体液；或在任何时间来自怀孕或对象发育中的细胞。在一些实施例中，组织样本可包括原或培养的细胞或细胞系。

在一些实施例中，组织样本包括来自健康或患病组织的组织切片(例如，来自结肠、乳腺组织、前列腺的组织切片)。组织样本可包括组织切片的单部分或片，例如从组织切片切割的组织的薄片或细胞。在一些实施例中，组织样本的相同切片可在形态和分子两者上分析。

组织样本可永久或暂时地粘附在固体载体上以便允许在制备和成像过程中对它分析、转移和使其移动。固体载体可包括载玻片、微量滴定板、盘、皮氏培养皿、凝胶板或卡盒(block cassette)。固体载体可由玻璃、塑料或其他材料制成。

组织样本还可以是组织微阵列(TMA)的一部分。如此，组织样本是包含在试验井(test well)(其设置在单个微阵列载玻片上)内的多个样本中的一个。试验井的数量以及因此单个载玻片上的个体组织样本的数量取决于阵列设计而变化。例如，TMA可设计使得每个个体组织样本包括圆形试验井，其直径0.6mm、间隔0.7-0.8mm，这导致每个组织样本的表面积为0.282mm²。

在第二步骤中，自发荧光的光用于捕捉样本的数字图像。在一些实施例中，在低放大率下使用标准照相透镜在单个图像中捕捉固体载体上的组织样本的完整图像，这可是可取的。在一些备选实施例中，可只捕捉固体载体的一部分。单个图像还可包括固体载体上的识别标记，例如粘胶标签或交叉影线标记。

可在样本的任何荧光标记发生前照射样本。例如DAPI等非荧光染料和指示物可在图像捕捉过程之前施加于样本，假设染料不干扰样本的自发荧光。图像捕捉过程可包括使用照相机，其包括处理器和镜头。该处理器配置成从镜头接收光从而引起数字图像。

在第三步骤中，处理来自照相机的组织样本的数字图像以便将数字图像与模板图像(其包含组织样本的大小和形状的简化表示)比较。在组织样本是组织微阵列的一部分的情况下，模板图像代表设置在试验井中的每个个体组织样本的数量和位点。

在一个实施例中，比较数字图像与模板图像。将实际组织图像与模板图像比较的过程提供二维像素图像作为输出，该二维像素图像可按比例绘制并且记录，并且其包括组织样本的中心位点。比较的过程可牵涉在空间域中在数字图像和模板图像之间使用零均值交叉关联、归一化功率谱密度(PSD)交叉相关或其的组合。

如果组织样本是由试验井组成的TMA，因而发生的二维比较像素图像可产生位于每个TMA试验井的中心处的亮点。该亮点中心位点可转换成由显微镜载玻片定义的坐标空间中的二维网格。该二维网格可以是笛卡尔坐标系，其中两个轴互相成直角而定义平面(xy平面)。

如在图1中进一步示出的，在一个实施例中，在第四步骤中比较过程产生双色匹配滤波器图像，其对应于固体载体上的组织样本的像素大小。双色匹配滤波器是设计成代表物体(其待识别或从另一个数字图像中待提取)的理想化样式(在空间或谱坐标中)的二维数字构成。在其中组织样本是由试验井组成的TMA的一部分的情况下，匹配滤波器可用于处理TMA图像，创建每个组织样本的宏观图像。

双色匹配滤波器可以是在黑色背景上的白色图像，其中该白色图像在像素中的大小对应于在组织样本的像素中的大小。在某些实施例中，组织样本的宏观图像使用零均值交叉相关创建，其中组织样本的数字图像的空间像素值基于强度而记分并且转换成谱域图像。适合的谱域变换包括傅里叶变换、小波变换、离散傅里叶变换、离散余弦变换、归一化功率谱密度计算或相似的系列代表。

在某些实施例中，例如快速傅里叶变换(FFT)等图像变换功能在匹配滤波器和试验样本图像两者上进行。可生成新的图像，其中基于对匹配滤波器图像的最佳适配分析对每个像素指定强度值。

知道TMA试验井的尺寸和数量，操作员可确定全部捕捉TMA所需要的图像捕捉或视场的数量，并且，在如在图1中示出的第五步骤中，可创建扫描规划，其对于来自每个图像捕捉中的捕捉给出坐标系列。例如，将需要2×2个图像捕捉集的组织阵列当计算四个图像捕捉中的每个的坐标时以中心点作为参考。假定(x，y)是TMA的中心并且w是一个捕捉的宽度，输出坐标将是(x-w/2，y-w/2)、(x+w/2，y-w/2)、(x+w/2，y+w/2)和(x-w/2，y+w/2)。TMA坐标空间中的网格可用于使阵列成像用于定性或定量分析。

图2是示出使用基于笛卡尔坐标系的扫描规划的x-y方向的图像采集的组织微阵列的示意图示，其中x和y是定义x、y平面的两个互相垂直的有向直线。

在一个实施例中，可通过首先确定阈值以区分足以强到成为TMA试验井中心的亮点与不是中心的那些亮点而产生扫描规划。起始于最大强度的点，算法可用于迭代挑选区域并且将其指定为单个试验井的中心点。环绕该中心点的区域(其对应于试验井的预测直径)被遮光。对接近亮点的区域遮光的目的是防止对单个点选择若干“中心”。然后挑选次最高像素强度的区域并且重复该过程直到对于亮点分析整个显微镜载玻片为止。

基于关于来自显微镜的图像捕捉的大小以及亮点的大小与数量的输入，算法对于每个预测的TMA试验井输出坐标。对这些坐标排序，这创建扫描规划使得载物台移动最小化。例如，该扫描规划可从位于TMA左边的底部上的试验井开始(当你俯视载玻片时)，并且来回蜿蜒穿过成行的试验井、向着TMA载玻片的顶部工作。对于每个试验井，相似的迂回图案用于节省运动。

如在图2中示出的，显微镜载物台可基于笛卡尔坐标系(x，y平面)移动以允许TMA30的扫描成像从左底部32上的试验井开始并且在迂回图案36中来回移动穿过这些行、向着TMA34的顶部工作。图像采集基于如由实线表示的扫描规划而发生。

如在图3中示出的，自动化系统10可用于实施本文描述的方法。如图示的，该系统10可包括成像显微镜12和激发源14、数字图像装置16、用于至少暂时存储一个或多个图像的存储装置18和将图像分类并且基于相关因子产生一个或多个匹配滤波器的处理器20。

成像显微镜12可具有至少一个物镜13以在不同的放大率采集图像以及载物台15以托住安装在固体载体上的组织样本17。该载物台用于将要观察的样本安置在该固体载体上的特定位点处。激发源14包括用于使用近UV光来照射该固体载体上的该组织样本从而引起自发荧光的光源。

数字图像装置16可由数字照相机(未示出)组成以在自发荧光期间采集组织样本的图像。图像装置16优选地能够自动对焦并且然后在整个处理中根据需要维持和跟踪焦点特征。

存储装置18可包括，但不必限于与处理器20关联的任何适合的硬驱动存储器，例如ROM(只读存储器)、RAM(随机存取存储器)或DRAM(动态随机存取存储器)，或任何适合的盘驱动存储装置，例如DVD或CD，或zip驱动器或存储器卡等。存储装置可远离处理器20设置并且仍可通过任何适合的连接装置或通信网络访问，这些连接装置或通信网络包括但不限于：局域网、电缆网、卫星网络和因特网，无论是硬连线或无线均可。处理器20可以是CPU(中央处理单元)并且可包括微处理器、微控制器和数字信号处理器(DSP)。

系统10可进一步包括用于显示一个或多个图像的显示装置22和用于传送数字信息的传送装置(未示出)。该显示装置22可包括能够显示数字图像的任何适合的装置，例如但不限于包含LCD或CRT的装置。该传送装置可包括用于在通信网络(其包括但不限于硬连线或无线数字通信系统)上传送数字信息的任何适合的部件。

在实施例的一个中，系统可被包含作为自动化高吞吐量系统等分析装置(其能够在一个系统中使TMA染色和成像并且仍进一步分析图像)的组成部分。如此，在一个实施例中，系统能够使用各种光学系统(其包括自发荧光范围外的那些，例如明场成像)来照射样本并且捕捉数字图像。在再另一个实施例中，自动化系统可包括计算机可读介质，其可包括用于分析自发荧光的自动化技术的指令。

尽管本文仅图示和描述本发明的某些特征，本领域内技术人员将想到许多修改和改变。因此，要理解附上的权利要求意在涵盖所有这样的修改和改变，它们落入本发明的真正精神内。

Claims (22)

1.用于定位安置在固体载体上的大致上圆形的组织样本的方法，其包括：

传送预选波长的光到组织样本上，其中所述光诱导所述组织样本自发荧光；

使用所述自发荧光的光来识别所述组织样本的中心位点；

使用二维坐标系使所述固体载体上的所述组织样本的所述中心位点的坐标相关；和

映射所述固体载体上的所述组织样本的所述坐标以区分包含组织样本的区域与所述固体载体上的空白区域。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述识别步骤包括捕捉来自所述组织样本的所述自发荧光的光以创建所述组织样本的数字图像。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述相关步骤包括对来自所述组织样本的所述自发荧光的光的像素值记分。

4.如权利要求3所述的方法，其中像素值的所述记分包括将所述组织样本的所述数字图像的空间像素信息转换成谱域图像。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述谱域图像使用所述组织样本的所述数字图像的快速傅里叶变换而生成。

6.如权利要求3所述的方法，其中所述相关步骤进一步包括将所述组织样本的所述数字图像与所述固体载体的模板图像比较。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述固体载体的所述模板图像是谱域图像。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述固体载体的所述谱域图像使用阵列的空间图像的快速傅里叶变换而生成。

9.如权利要求6所述的方法，其中所述相关步骤包括：

将所述组织样本的所述数字图像的空间像素信息转换成谱域图像；

将所述固体载体的所述数字图像的所述空间像素信息转换成所述固体载体的谱域图像；

使用所述组织样本的谱域图像和所述固体载体的谱域图像的倍增因子创建复合谱域图像。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述倍增因子包括零均值交叉相关、归一化功率谱密度(PSD)交叉相关或其组合。

11.如权利要求9所述的方法，其进一步包括将所述复合谱域图像变换为空间域图像。

12.如权利要求11所述的方法，其进一步包括将所述空间域图像变换为由水平和垂直轴定义的二维坐标系。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述组织样本安装在组织微阵列上。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述组织微阵列包含超过一个组织样本。

15.如权利要求1所述的方法，其中扫描整个固体载体。

16.如权利要求1所述的方法，其中预选波长是365nm。

17.如权利要求1所述的方法，其进一步包括将荧光标签施加到所述组织样本并且使用在所述映射步骤中获得的所述组织样本的所述坐标来扫描所述组织样本。

18.一种用于定位安置在固体载体上的大致上圆形的组织样本的装置，其包括：

成像显微镜，其具有至少一个物镜以在不同的放大率采集图像，以及具有载物台以托住组织样本；

激发源，用于照射所述载物台上的所述组织样本；

连接到所述显微镜以采集所述组织样本的所述图像并且使所述组织样本的所述图像数字化的数字图像装置；

与所述数字图像装置通信而能够存储所述组织样本的数字化图像的存储装置；和

与所述存储装置通信并且能够将所述数字图像分类以及基于相关因子产生一个或多个匹配滤波器的处理器。

19.如权利要求18所述的装置，其进一步包括用于显示所述图像中的一个或多个的显示装置和用于传送数字信息到远程位点的传送装置中的至少一个。

20.如权利要求18所述的装置，其进一步包括控制器和机器可读介质，其包括指令，该指令当由所述控制器执行时使装置定位安置在固体载体上的大致上圆形的组织样本。

21.如权利要求18所述的装置，其中所述装置被包含作为分析装置的组成部分。

22.如权利要求21所述的装置，其中所述分析装置能够使组织微阵列染色和成像。

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