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CN102317303A - 用于肿瘤或感染性疾病的免疫预防或免疫治疗的多肽-核酸偶联物 - Google Patents

用于肿瘤或感染性疾病的免疫预防或免疫治疗的多肽-核酸偶联物 Download PDF

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R·拉威
S·李
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Abstract

本发明公开了通过使用抗体/肽-核酸偶联物的性质诱导免疫介导的交叉激活并引导靶向细胞中死亡信号的组合物。该偶联物能够同时激活多种死亡信号机制。本发明还公开了利用本发明的偶联物作为免疫治疗方式用于治疗或预防感染性疾病，肿瘤性疾病或其它疾病的方法。

Description

用于肿瘤或感染性疾病的免疫预防或免疫治疗的多肽-核酸偶联物
技术领域
本发明一般性地涉及免疫刺激治疗方式(immunostimulatory therapeuticmodalities)，并且更具体地涉及用于预防或治疗肿瘤疾病、感染性疾病和/或其它疾病的抗体/肽-核酸偶联物(antibody/peptide-nucleic acid conjugate)。
背景技术
免疫系统为人体提供了识别并防卫自身以抵抗被识别为外源或潜在有害的微生物和物质的手段。针对感染性生物体的预防性接种在保护人群免于感染方面已具有很大的益处。但是，对于多种流行感染性疾病和持续感染仍需要有效的免疫预防和免疫治疗。虽然使用单克隆抗体的癌症被动免疫治疗以及T细胞被动转移来攻击肿瘤细胞已显示出临床效应，但进行主动治疗性接种来诱导这些免疫效应器并建立针对肿瘤细胞的免疫记忆的目标仍具有挑战性。已鉴定出几种肿瘤特异性抗原以及肿瘤相关抗原，然而这些抗原通常具有较弱的免疫原性，并且肿瘤采用不同机制来产生使其避免免疫攻击的致耐受环境。克服这种免疫耐受以及激活高水平的抗体和/或T细胞应答的策略是有效的癌症免疫治疗的关键。
树突细胞(dendritic cells，DCs)是特化的抗原呈递细胞(APCs)，其在初次免疫应答的启动和调节中发挥主要作用。(i)抗原吸收和呈递：DCs通过吞噬、内吞和胞饮作用来捕获病原体(细菌、病毒)、死细胞或垂死细胞、蛋白和免疫复合物。它们具有用于抗原吸收的一组细胞表面受体，它们也可在信号传导和细胞-细胞相互作用中发挥作用(表1)。DCs将捕获的蛋白加工成肽，其被装载至I类和II类主要组织相容性复合物(MHC I和II)分子上，并且这些肽-MHC复合物被转运至细胞表面，以便被抗原-特异性CD8+T细胞(通过MHC I)和CD4+T细胞(通过MHC II)识别。在DC胞质溶胶中内源合成的抗原通常通过蛋白酶体-介导的途径被加工至内质网并装载至MHC I上，而从细胞外环境外源获得的抗原通常在内体/溶酶体中降解并装载至MHC II上。一个可选的途径——被连接至特异性的DCs抗原吸收受体(表2)，也能够使DC将外源抗原加工至MHC I上(交叉-呈递)。交叉-呈递使得DCs产生对外源抗原例如肿瘤细胞、病原体-感染的细胞和免疫复合物的CD8+以及CD4+T细胞应答。(ii)DCs成熟-TLR的作用：DCs的成熟是终末分化的过程，其将DC从特化的抗原捕获细胞转变成可刺激T细胞的细胞。通过病原体-衍生组分的识别或通过与炎症或组织损伤相关的内源宿主分子(称为“危险信号”)来诱导DC成熟。这些成熟信号与表达在DC上的受体连接，所述受体引发细胞内信号途径。由不同的感染微生物(细菌、真菌、原生动物、病毒)表达的病原体-相关分子模式(PAMP)和由损伤的宿主组织释放的分子(损伤相关分子模式/警报素(alarmins))的识别是由模式识别受体(PRR)——例如在DCs上表达的Toll-样受体(TLR)家族的成员——介导的。TLR是I型膜糖蛋白。在人类中，存在10种已知的功能性TLR，其具有特异的表达模式、亚细胞定位和对不同分子的识别能力。在人类中，骨髓DCs表达TLR1-5、7和/或8，而浆细胞样DCs表达TLR1、7和9。虽然一些TLRs在细胞表面起作用(TLR1、2、4、5、6、10)，但是TLR3、7、8和9在细胞内区室(主要是内体和内质网)中表达并且配体结合结构域对囊泡腔取样。病原体-编码的TLR配体的TLR识别分为三大类结构上相似的分子：脂质和脂肽(TLR2/TLR1；TLR2/TLR6；TLR4)、蛋白(TLR5)以及核酸(TLR3、7、8和9)。在识别免疫刺激核酸的TLR中，TLR3连接ds RNA，TLR7/8连接ss RNA以及TLR9连接DNA。除微生物配体之外，已对大多数TLR鉴定出内源性配体(mRNA用于TLR3，ss RNA免疫复合物用于TLR7/8和DNA免疫复合物用于TLR9)。也已对大多数TLRs描述了合成的配体，包括免疫刺激核酸序列(INAS)，其可激活TLR3、7、8(ds RNA，ss RNA)以及TLR9(含有未甲基化的CpG基序的寡脱氧核苷酸)(表3)。TLR的配体结合引起不同衔接蛋白的募集，引起细胞-类型特异的信号通路和应答的激活。但是，在DCs/APCs亚型之间TLR表达的不同模式(人PDC而不是MDC表达TLR9并对DNA产生应答；PDC和MDC对ss RNA产生不同应答)以及在不同解剖位点APC细胞分布的不同可产生对不同TLR配体(天然或合成的)或不同途径施用相同配体的不同应答。响应于TLR激动剂或其它刺激(细胞因子、免疫复合物、粘附分子)的DCs成熟伴随降低的吞噬细胞功能、向淋巴组织的移动以及增强的激活T细胞的能力。DCs的成熟增强它们形成MHC I和II分子的能力，诱导交叉-呈递，增加涉及T细胞激活所需的免疫突触的粘附分子和共刺激分子(CD40、CD80、CD86)的表达，诱导引导T细胞分化成CD4+T辅助型(TH1)或CD8+细胞毒性淋巴细胞(CTL)的细胞因子(IFN-γ、IFN-α、IL-12)以及募集单核细胞、DCs和T细胞至局部环境的化学因子的分泌。成熟的DCs还变得能够迁移至淋巴结的T细胞区。除了初始化(priming)抗原-特异性T细胞免疫应答的能力之外，DCs还参与与NK细胞的复杂双向交谈(crosstalk)以促进病原体和肿瘤的免疫监督和排除。激活的DCs还诱导B细胞增殖、同种型转换和浆细胞分化以产生抗体。由于DCs在先天和获得性免疫应答的协同激活中发挥至关重要的作用，因此刺激DC-介导的抗原-特异性T细胞和NK细胞活化的策略可不仅控制先天免疫系统的直接抗肿瘤或抗病原体作用，而且促进长效获得性肿瘤-特异性或病原体-特异性免疫应答的产生。
在次级淋巴组织中，当抗原-呈递细胞将抗原呈递至“初始化”T细胞时，经典免疫应答被启动，引起T细胞活化、增殖和分化为效应T淋巴细胞和记忆细胞。T细胞应答的性质取决于DC上抗原的浓度，T细胞受体对相应pMHC的亲和性以及DC成熟的状态。未成熟的DCs利用活化-诱导的抗原-特异性T细胞的细胞死亡来中断起始增殖，并还可通过调节T细胞的诱导来诱导耐受。但是，成熟DCs的刺激产生T细胞长期存活并分化为记忆和效应细胞，同时抑制自然发生的Tr细胞。在暴露于抗原，例如那些由感染产生的抗原后，幼稚T细胞可分化为具有不同功能的TH1和TH2细胞或分化为TH3细胞、Tr1细胞、TH17细胞或调节T细胞(Tregs)。CD4+T辅助(TH)细胞对免疫应答和记忆的诱导和维持是至关重要的。该作用通过TH细胞和DCs之间的配体/受体相互作用——例如通过在DCs上表达的CD40的CD40L连接——而介导。在初始化时间，TH细胞辅助对于CD8+T细胞的初始化和再次扩增以及对B细胞提供辅助用于抗体生产是非常需要的。一旦CD8+记忆T细胞被诱导，则其不再依赖于持续的抗原-特异性TH支持。由于自体肿瘤抗原通常不能够诱导显著的TH应答，因此针对肿瘤细胞的内源性CD8+效应T细胞应答被减弱。肿瘤也可通过抗原或MHC表达的丧失或免疫抑制机制——例如TGF-的分泌——来逃避免疫。除干扰免疫应答的传入臂之外，肿瘤细胞还可包括遗传异常或增强的生长因子受体-介导的存活通路，其降低它们对响应于由细胞毒性T细胞产生的传出死亡信号传导通路的凋亡的易感性。
发明内容
本发明描述了多功能靶向免疫偶联物部分，其能够有效产生针对肿瘤或病原体的先天和获得性免疫应答。这些免疫偶联物能够同时满足用于配置针对靶向肿瘤或病原体的有效的抗体和/或细胞介导的免疫应答的多个关键需求：(i)诱导或增加抗原呈递细胞(APC)/树突细胞(DC)对肿瘤或病原体抗原(一个或更多个)或抗原决定簇(一个或更多个)的吸收和交叉-呈递；(ii)促进树突细胞(DCs)在靶细胞环境中的成熟；(iii)提供CD4+T细胞辅助以产生CD8+T细胞记忆和针对肿瘤或病原体的抗体；(iv)使靶向肿瘤细胞对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和T-细胞介导的死亡敏感。进一步，本发明可用于肿瘤性疾病、感染性疾病和其它疾病的靶向免疫治疗或免疫预防。
大体上，本发明的组合物和方法涉及治疗或诊断化合物，其包括可结合靶分子或细胞组分的靶向部分以及增强针对所期望的抗原或细胞的免疫应答的一个或更多个活性剂。如本文进一步所述，靶向部分对癌症或肿瘤、正常细胞(例如树突细胞或角质形成细胞)或感染因子或病原体的分子或组分具有特异性。另外，活性剂包括核酸、肽、多肽、脂肽或其组合。
在本发明的第一方面，本发明的产品和方法涉及组合物，其包括靶向部分(T)和一个、两个、三个或更多个活性剂(A)。
在一个实施方式中，本发明的组合物包括偶联至活性剂的靶向部分。在另一个实施方式中，组合物包括靶向部分和至少两个活性剂，所述活性剂包括非编码核酸分子或编码核酸分子和肽或多肽或脂肽。在进一步的实施方式中，至少两个活性剂包括非编码核酸分子以及编码核酸分子(例如质粒或小环)。在还进一步的实施方式中，至少两个活性剂包括非编码或编码核酸分子、以及抗原肽或多肽。为简化说明，本发明的组合物可以由下式涵盖：T-A1或T-A1-A2，其中T＝靶向部分；A1是核酸分子或肽或多肽或脂肽；以及A2是核酸分子或肽或多肽或脂肽。另外，核酸分子可以是编码或非编码序列，如本文进一步所述。在进一步的实施方式中，A1可以被偶联(直接地或间接地)到包括核酸分子、肽、多肽或脂肽在内的另外的组分。可选地，在进一步的实施方式中，活性剂是用于核酸分子的包装和/或递送的组分。
如本文所用，“一个靶向部分”(或更多个靶向部分)是指具有定位于存在于正常细胞/组织和/或癌症细胞/肿瘤上的靶分子或其它分子并与之结合的能力的一个或更多个分子。换言之，包括这种靶向部分的本发明组合物可结合至靶细胞或分子(直接地或间接地)。预期与生物活性剂一起使用的本发明的靶向部分包括抗体、多肽、肽、适配子(aptamer)、其它配体或其任何组合，其可结合靶细胞或分子的组分。
如本文所公开的，核酸分子包括如下的一个或更多个：双链DNA(ds DNA)、单链DNA(ssDNA)、多链DNA、双链RNA(ds RNA)、单链RNA(ssRNA)、多链RNA、DNA-RNA杂交物(单链或多链)、肽核酸(PNA)、PNA-DNA杂交物(单链或多链)、PNA-RNA杂交物(单链或多链)、锁定核酸(LNA)、LNA-DNA杂交物(单链或多链)、LNA-RNA杂交物(单链或多链)。在一个实施方式中，核酸分子编码一个或更多个产物(例如，核酸如RNA、肽、多肽、融合肽)。在一个实施方式中，核酸分子包括一个或更多个可激活免疫细胞的免疫刺激核酸序列(INAS)。
在一个实施方式中，本发明的组合物包括一个或更多个靶向部分(T)，其结合靶分子或癌症或肿瘤的组分(肿瘤-靶向部分)。靶向分子可以是肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的组分。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分例如抗体和核酸分子的偶联物，其中所述核酸分子编码一个或更多个产物(例如，核酸如RNA、肽、多肽、融合肽)并能够刺激免疫应答。在一个实施方式中，核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序。在另一个实施方式中，核酸分子编码一个或更多个刺激免疫应答的产物。在一个相关实施方式中，核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序，并编码一个或更多个刺激免疫应答的产物。
在一个相关实施方式中，肿瘤-靶向偶联物的核酸分子编码一个或更多个抗原或抗原决定簇，其可被加工并呈递以便被T细胞和/或B细胞识别。编码的抗原决定簇包括下列每一个中的一个或更多个：CD4+T细胞表位、CD8+T细胞表位、B细胞表位。在一个实施方式中，核酸分子编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇。例如，核酸编码源自破伤风毒素的序列以提供CD4+T-细胞辅助[例如，破伤风衍生的TH激活序列：片段C(FrC)、FrC结构域DOM1或混杂MHC II类-结合肽p30]。在一个相关实施方式中，核酸编码一个或更多个抗原或抗原决定簇，所述抗原或抗原决定簇源自微生物疫苗或其它非自身来源(例如，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素、绿色荧光蛋白、植物病毒外壳蛋白)。
在一个相关实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分如抗体，一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)，和/或编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的核酸分子的偶联物。在一个相关实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向部分和一个或更多个PAMP。在另一个相关实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向部分和编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的一个或更多个核酸分子。在另一个相关实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向部分、一个或更多个PAMP、和编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的一个或更多个核酸分子。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分如抗体，一个或更多个损伤相关分子模式(DAMP)或警报素，和编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的一个或更多个核酸分子的偶联物。在一个相关实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向部分和一个或更多个DAMP/警报素。在另一个相关实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向部分和编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的一个或更多个核酸分子。在另一个相关实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向部分、一个或更多个DAMP/警报素、和编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的一个或更多个核酸分子。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分如抗体和编码如下的一个或更多个的一个或更多个核酸分子的偶联物：(i)源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)，(ii)一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)，(iii)一个或更多个损伤相关分子模式(DAMP)/警报素，(iv)一个或更多个免疫刺激分子，包括募集、结合、激活、成熟和/或增殖抗原呈递细胞或树突细胞或其它免疫细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)的分子以及对抗免疫抑制的分子(例如，DC吸收受体的配体/抗体、免疫刺激细胞因子、化学因子、共刺激分子、生长因子)。在一个相关实施方式中，核酸分子另外编码一个或更多个肿瘤抗原/抗原决定簇或含肿瘤抗原的融合蛋白。一方面，肿瘤抗原的融合配偶体(partner)促进DC的抗原吸收、免疫识别和/或免疫活化。在另一个实例中，融合配偶体包括靶向DC吸收受体的分子。在另一个实例中，融合配偶体是源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的抗原或抗原决定簇。在另一个实例中，融合配偶体是警报素。在一个相关实施方式中，本文所述的靶向部分-核酸偶联物(一个或更多个)进一步包括一个或更多个PAMP和/或一个或更多个DAMP/警报素。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分如抗体、和编码一个或更多个RNA分子的一个或更多个核酸分子的偶联物，所述RNA分子可干扰一个或更多个靶细胞基因的表达[例如，短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)]。在另一个实施方式中，偶联物的核酸分子编码一个或更多个免疫刺激RNA分子。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分如抗体和一个或更多个核酸分子的偶联物，所述核酸分子编码诱导靶细胞死亡的分子。
在本文所述的每个靶向部分-核酸偶联物中，核酸分子编码在转录启动子控制下的一个或更多个感兴趣的基因，所述转录启动子在所期望的细胞中具有功能活性。在一个实施方式中，组织或肿瘤细胞选择性启动子用于在所期望的细胞类型中的靶向表达。
在一个实施方式中，本文所述的每个肿瘤靶向部分-核酸偶联物与用于包装和/或递送核酸分子或偶联物的一个或更多个组分连接。例如，这些分子包括阳离子肽、细胞透化肽、DC靶向肽、核酸结合分子、核定位肽、阳离子脂质体、亲脂性部分、纳米颗粒。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分如抗体、一个或更多个核酸分子、以及一个或更多个肽/多肽/脂肽的偶联物。在一个实施方式中，核酸分子并入一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序，和/或编码一个或更多个刺激免疫应答的产物，如本文所述(注：0017)。在各种相关实施方式中，肽/多肽/脂肽包括如下的一个或更多个：(i)源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(例如CD4+T细胞表位)，(ii)警报素，(iii)DC结合分子(例如，DC吸收受体的配体)。一方面，本文所述偶联物的肽/多肽可以互相融合/连接和/或融合/连接至核酸结合肽或细胞透化肽[例如阳离子肽、鱼精蛋白、HIV-tat、富含精氨酸-或组氨酸的序列、LL-37)。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分如抗体或适配子以及如下的一个或更多个的偶联物：(a)一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)，(b)下列肽/多肽/脂肽中的一个或更多个：(i)源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(例如CD4+T细胞表位)、(ii)警报素、(iii)DC结合分子(例如DC吸收受体的配体)。一方面，本文所述偶联物的肽/多肽可以互相融合/连接和/或融合/连接至核酸结合肽
[例如阳离子肽、鱼精蛋白、HIV-tat、富含精氨酸-或组氨酸的序列、LL-37)。一方面，偶联物包括免疫刺激核酸。
在一个实施方式中，本发明包括靶向部分如抗体和核酸分子的偶联物，所述核酸分子是适配子。在一个实施方式中，抗体和核酸适配子结合至相同细胞类型或不同细胞类型上的不同靶标。在一个实施方式中，偶联物包括靶向肿瘤细胞表面受体(EGFR)的抗体和靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)的适配子，从而靶向前列腺癌细胞中的两种蛋白。在一个实施方式中，核酸分子包括适配子和如下的一个或更多个：(i)PAMP或其它免疫刺激核酸、(ii)编码一个或更多个刺激免疫应答的产物的DNA，如本文所述(注：0017)。
在一个实施方式中，本发明的组合物包括一个或更多个靶向部分(T)，其结合靶分子或正常细胞或组织的组分，例如皮肤中的角质形成细胞(组织-靶向部分)。在一个实施方式中，靶向部分结合角质形成细胞上的细胞表面分子或受体，例如表皮生长因子受体(EGFR)。
在一个实施方式中，本发明包括组织-靶向部分如EGFR的抗体以及核酸分子的偶联物，其中所述核酸分子编码一个或更多个产物(例如，核酸例如RNA、肽、多肽、融合肽)并能够刺激免疫应答。在一个实施方式中，核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序。在另一个实施方式中，核酸分子编码一个或更多个刺激免疫应答的产物。在一个相关实施方式中，核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序，并编码一个或更多个刺激免疫应答的产物。
在一个实施方式中，本发明包括组织-靶向部分如EGFR的抗体以及核酸分子的偶联物，其中所述核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)并编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)。
在一个实施方式中，本发明包括组织-靶向部分如EGFR的抗体、一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)和核酸分子的偶联物，所述核酸分子编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分如EGFR的抗体、一个或更多个损伤相关分子模式(DAMP)或警报素、以及核酸分子的偶联物，所述核酸分子编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)。
在一个实施方式中，本发明包括组织-靶向部分如EGFR的抗体、编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)以及不编码或编码如下一个或更多个的一个或更多个核酸分子的偶联物：(i)一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)，(ii)一个或更多个损伤相关分子模式(DAMP)/警报素，(iii)一个或更多个免疫刺激分子，包括募集、结合、激活、成熟和/或增殖抗原呈递细胞或树突细胞或其它免疫细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)的分子以及对抗免疫抑制的分子(例如，DC吸收受体的配体/抗体、免疫刺激细胞因子、化学因子、共刺激分子、生长因子)。在一个相关实施方式中，核酸分子编码一个或更多个病原体抗原/抗原决定簇——作为融合蛋白。一方面，抗原的融合配偶体促进DC的抗原吸收、免疫识别和/或免疫活化。另一方面，融合配偶体包括靶向DC吸收受体的分子。另一方面，融合配偶体是警报素。在一个相关实施方式中，本文所述的靶向部分-核酸偶联物(一个或更多个)进一步包括一个或更多个PAMP和/或一个或更多个DAMP/警报素。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分如EGFR的抗体、编码一个或更多个肿瘤抗原/抗原决定簇和编码如下一个或更多个的一个或更多个的核酸分子的偶联物：(i)源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(例如，CD4+T细胞表位)，(ii)一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)，(ii)一个或更多个损伤相关分子模式(DAMP)/警报素，(iii)一个或更多个免疫刺激分子，包括募集、结合、激活、成熟和/或增殖抗原呈递细胞或树突细胞或其它免疫细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)的分子以及对抗免疫抑制的分子(例如，DC吸收受体的配体/抗体、免疫刺激细胞因子、化学因子、共刺激分子、生长因子)。在一个相关实施方式中，核酸分子编码一个或更多个含肿瘤抗原的融合蛋白。一方面，肿瘤抗原的融合配偶体促进DC的抗原吸收、免疫识别和/或免疫活化。在另一个实例中，融合配偶体包括靶向DC吸收受体的分子。在另一个实例中，融合配偶体是源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的抗原或抗原决定簇(CD4+T细胞表位)。在另一个实例中，融合配偶体是警报素。在一个相关实施方式中，本文所述的靶向部分-核酸偶联物(一个或更多个)进一步包括一个或更多个PAMP和/或一个或更多个DAMP/警报素。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分如EGFR的抗体、一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)和/或警报素、和包括如下的一个或更多个的抗原肽/多肽的偶联物：(i)源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇，(ii)一个或更多个肿瘤抗原或抗原决定簇。在偶联物的一方面，肿瘤或病原体-衍生的抗原或抗原决定簇与警报素(例如LL 37)连接或融合。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分如EGFR的抗体、一个或更多个核酸分子和一个或更多个肽/多肽的偶联物。在一个实施方式中，核酸分子并入一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序，和/或编码一个或更多个刺激抗原-特异性免疫应答的产物，如本文所述(注：0030、0031)。在偶联物的各种实施方式中，肽/多肽包括如下的一个或更多个：(i)一个或更多个病原体和/或肿瘤抗原或抗原决定簇，(ii)警报素，(iii)DC结合分子(例如DC吸收受体的配体)。一方面，本文所述偶联物的肽/多肽可以互相融合/连接和/或与核酸结合肽(例如阳离子肽、鱼精蛋白、HIV-tat、富含精氨酸-或组氨酸的序列、LL-37、核定位肽)融合/连接。
在一个实施方式中，本发明的组合物包括一个或更多个靶向部分(T)，其结合正常免疫细胞或组织例如抗原呈递细胞或树突细胞的靶分子或组分(APC/DC-靶向部分)。在一个实施方式中，靶向部分结合树突细胞吸收受体，例如DEC-205。
在一个实施方式中，本发明包括偶联物，其包括抗体或靶向抗原呈递细胞(APC)/树突细胞(DC)——例如DC吸收受体——的其它部分，以及编码感兴趣基因的核酸分子。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分和核酸分子的偶联物，其中所述核酸分子编码一个或更多个产物(例如，核酸如RNA、肽、多肽、融合肽)并能够刺激免疫应答。在一个实施方式中，核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序。在另一个实施方式中，核酸分子编码一个或更多个刺激免疫应答的产物。在一个相关实施方式中，核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序，并编码一个或更多个刺激免疫应答的产物。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分如DEC-205的抗体、和一个或更多个核酸分子的偶联物，其中所述核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)并编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)。在一个相关实施方式中，本文所述的靶向部分-核酸偶联物(一个或更多个)进一步包括一个或更多个PAMP和/或一个或更多个DAMP/警报素。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分，一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)，和编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的一个或更多个核酸分子的偶联物。在一个相关实施方式中，本文所述的靶向部分-核酸偶联物(一个或更多个)进一步包括一个或更多个DAMP/警报素。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分，一个或更多个损伤相关分子模式(DAMP)或警报素，和编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的一个或更多个核酸分子的偶联物。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分，以及编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)和编码一个或更多个免疫刺激分子的一个或更多个核酸分子的偶联物，所述免疫刺激分子例如：募集、结合、激活、成熟和/或增殖抗原呈递细胞或树突细胞或其它免疫细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)的分子以及对抗免疫抑制的分子(例如，免疫刺激细胞因子、化学因子、共刺激分子、生长因子)。在一个相关实施方式中，核酸分子编码一个或更多个病原体抗原/抗原决定簇——作为融合蛋白。在一个相关实施方式中，本文所述的靶向部分-核酸偶联物(一个或更多个)进一步包括一个或更多个PAMP和/或一个或更多个DAMP/警报素。一方面，偶联物进一步包括一个或更多个肽，所述肽包括一个或更多个病原体-衍生的抗原或抗原决定簇。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分以及编码一个或更多个肿瘤抗原和编码如下的一个或更多个的一个或更多个核酸分子：(i)源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(例如CD4+T细胞表位)，(ii)一个或更多个免疫刺激分子，例如募集、结合、激活、成熟和/或增殖抗原呈递细胞或树突细胞或其它免疫细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)的分子以及对抗免疫抑制的分子(例如，免疫刺激细胞因子、化学因子、共刺激分子、生长因子)。在一个相关实施方式中，核酸分子编码一个或更多个肿瘤抗原——作为与源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的抗原或抗原决定簇(CD4+T细胞表位)的融合蛋白。在另一个实例中，融合配偶体是警报素。在一个相关实施方式中，本文所述的靶向部分-核酸偶联物(一个或更多个)进一步包括一个或更多个PAMP和/或一个或更多个DAMP/警报素。一方面，偶联物进一步包括一个或更多个肽，所述肽包括一个或更多个病原体-衍生的或肿瘤的抗原或抗原决定簇。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分、一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)和/或一个或更多个警报素、和一个或更多个抗原肽的偶联物，所述抗原肽包括一个或更多个肿瘤抗原和/或源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)。在一个实施方式中，抗原肽与靶向部分融合至或并入靶向部分中。另一方面，抗原肽与警报素(例如LL-37)融合。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分、一个或更多个核酸分子、和一个或更多个抗原肽的偶联物，其中所述核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)并且所述抗原肽包括肿瘤抗原和/或源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)。在一个实施方式中，抗原肽与靶向部分融合至或并入靶向部分中。在偶联物的一个相关实施方式中，抗原肽与核酸结合肽(例如阳离子肽、NLS、Tat、鱼精蛋白、His6、Arg9、LL-37)融合。另一方面，抗原肽与靶向DC吸收受体的肽基序融合。一方面，抗原肽与靶向部分融合至或并入靶向部分中。另一方面，抗原肽与警报素融合。
在一个实施方式中，本发明包括偶联物或融合蛋白，其并入DC靶向肽、抗原肽和核酸结合肽(警报素，例如LL-37)，其中所述蛋白共价或非共价连接于核酸分子(编码或非编码)。一方面，核酸分子包括一个或更多个PAMP。另一方面，核酸分子进一步编码如下的一个或更多个：(i)源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个肿瘤抗原或抗原决定簇，(ii)一个或更多个免疫刺激分子，例如募集、结合、激活、成熟和/或增殖抗原呈递细胞或树突细胞或其它免疫细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)的分子以及对抗免疫抑制的分子(例如，免疫刺激细胞因子、化学因子、共刺激分子、生长因子)。
在一个实施方式中，本发明包括偶联物，其包括融合抗原肽/蛋白和抗体的免疫复合物，其中所述融合肽/蛋白并入抗原肽以及结合所述抗体的特异性标记肽。在偶联物的一方面，免疫复合物中的融合肽/蛋白进一步包括核酸结合肽(例如阳离子肽、鱼精蛋白、HIV-tat、富含精氨酸-或组氨酸的序列、LL-37、核定位肽)。在偶联物的另一方面，免疫复合物中的融合肽进一步包括警报素(例如LL-37)。在偶联物的另一方面，免疫复合物中的融合肽进一步并入结合DC吸收受体的肽。在另一个实施方式中，偶联物包括与抗体或融合肽抗原连接的免疫刺激核酸分子，其中所述核酸分子包括一个或更多个PAMP。另一方面，核酸分子进一步编码如下的一个或更多个：(i)源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个肿瘤抗原或抗原决定簇，(ii)一个或更多个免疫刺激分子。
对根据本发明示例性方法和组合物进行详述。
附图说明
图1显示核苷酸(DNA/RNA)-结合(偶联)的抗体。
图2显示核苷酸(DNA/RNA)-结合的肿瘤靶向肽。
图3显示核酸-抗体偶联物的一种或更多种作用机制(INAS＝免疫刺激核酸序列)。
图4显示DNA或RNA(INAS)共价结合至抗体/多肽/肽的方法。
步骤1.使用碳二亚胺交联剂EDC将寡核苷酸的3’-磷酸基(例如CpG DNA)与抗体的胺基结合；
步骤2.EDC激活的寡核苷酸与咪唑相互作用，以形成用于结合的活性中间体；
步骤3.活性核苷酸中间体与靶向抗体(例如抗EGFR或抗HER2)形成共价键；
步骤4.通过10kD截留柱以及PBS洗涤来去除咪唑与未结合的核苷酸残基。
图5显示表明DNA-或RNA-结合的抗EGFR抗体和抗HER2抗体的免疫印迹。
抗人EGFR抗体-DNA偶联物(DNA＝SEQ ID：1)
抗人HER2抗体-DNA偶联物(DNA＝SEQ ID：1)
抗EGFR抗体-RNA偶联物(EGFR抗体-SVM274)
图6是免疫印迹，其表明抗EGFR抗体(EGFR Ab)或DNA结合的抗EGFR抗体(EGFR Ab-DNA SEQ ID NO：1或EGFR Ab-DNA SEQ ID NO：2)对EGFR磷酸化(Tyr 1068)的抑制。
图7是FACS分析图，其表明树突细胞通过DNA结合的抗EGFR抗体(EGFRAb-DNA SEQ ID NO：1)而不是EGFR抗体的成熟。
图8显示柱状图，其表明DNA结合的抗体对PBMCs中干扰素-γ(IFN-γ)和Apo2L/TRAIL表达的影响。图A)显示通过ELISA对用抗EGFR抗体(抗EGFRAb)5μg/ml、抗人HER2抗体(抗-HER2Ab)5μg/ml、DNA(ODN-SEQ ID NO：1)5μg/ml、抗EGFR Ab-DNA 5μg/ml、抗HER2Ab-DNA 5μg/ml处理或未处理(对照)的PBMCs的上清液中IFN-γ的定量(pg/ml)。图B)显示通过ELISA对用抗EGFR抗体(抗EGFR Ab)5μg/ml、抗人HER2抗体(抗HER2Ab)5μg/ml、DNA(ODN-SEQID NO：1)5μg/ml、抗EGFR Ab-DNA 5μg/ml、抗HER2Ab-DNA 5μg/ml处理或未处理(对照)的PBMCs的上清液中Apo2L/TRAIL的定量(pg/ml)。
图9是在用EGFR抗体-DNA偶联物(EGFR Ab-DNA SEQ ID NO：1)而不用EGFR抗体(对照)处理后，CD56+PBMCs扩增的流式细胞术分析图。
图10显示了表格，其表明在用EGFR抗体-核苷酸偶联物(EGFR-DNA或EGFR-RNA)处理后的PBMCs中，MHC分子(DR；II类)的增加表达。
图11显示了表格，其表明响应于EGFR抗体-DNA偶联物(EGFR Ab-DNA SEQID NO：1或EGFR Ab-DNA SEQ ID NO：2)处理在表达EGFR的肿瘤细胞(MDA-MB468)中、以及响应于HER2抗体-DNA偶联物(HER2 Ab-DNA SEQ IDNO：1或HER2Ab-DNA SEQ ID NO：2)处理在表达HER2/neu的肿瘤细胞(SKBr-3)中，Apo2L/TRAIL的诱导。
图12显示显微照片，其表明响应于EGFR抗体-DNA偶联物(EGFR Ab-DNASEQ ID NO：1或EGFR Ab-DNA SEQ ID NO：2)处理，表达EGFR的人结肠癌细胞(HT29细胞)的直接死亡的诱导(细胞超融合)。
图13显示细胞培养板，其表明响应于EGFR抗体-DNA偶联物(EGFR Ab-DNASEQ ID NO：1)而不是EGFR抗体或未偶联的核酸(DNA SEQ ID NO：1)处理，表达EGFR的人结肠癌细胞(HT29细胞)直接死亡的诱导(集落形成丧失)。
图14显示显微照片，其表明响应于EGFR抗体-DNA偶联物(EGFR Ab-DNASEQ ID NO：1)处理，表达EGFR的人乳腺癌细胞(MCF-7或MDA-MB468细胞)直接死亡的诱导。
图15显示细胞培养板，其表明响应于EGFR抗体-DNA偶联物[EGFRAb-DNA 1(SEQ ID NO：1)或EGFR Ab-DNA 2(SEQ ID NO：2)]而不是EGFR抗体或未偶联的核酸(DNA SEQ ID NO：1或DNA SEQ ID NO：2)处理，表达EGFR的人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)直接死亡的诱导(集落形成丧失)。
图16显示显微照片，其表明响应于HER2抗体-DNA偶联物[HER2Ab-DNA 1(SEQ ID NO：1)或HER2Ab-DNA 2(SEQ ID NO：2)处理，表达HER2/neu的人乳腺癌细胞(MCF-7和SKBr-3细胞)直接死亡的诱导(细胞超融合)。对四个超融合的合并(coalescent)细胞体的分析表明非存活的细胞(用台盼蓝染色)和散布的细胞碎片。
图17显示显微照片，其表明响应于Neu抗体-DNA偶联物[Neu Ab-DNA 1(SEQ ID NO：1)或Neu Ab-DNA 2(SEQ ID NO：2)处理，表达Neu的鼠乳腺癌细胞直接死亡的诱导(细胞超融合)。
图18显示表明抗EGFR抗体或抗EGFR抗体-DNA偶联物(EGFR Ab-DNASEQ ID NO：1)对HT-29肿瘤细胞死亡的诱导作为PBMC：肿瘤细胞比的函数(A)或作为时间的函数(B)的图。
图19显示与单独用EGFR抗体、单独用DNA(DNA SEQ ID NO：1)或用未偶联的抗体和核酸的组合处理相比，在施用DNA偶联的抗EGFR抗体(EGFRAb-DNA SEQ ID NO：1)后，对表达EGFR的HT-29肿瘤生长的抑制。
图20显示了图，其表明与单独用Neu抗体或单独用DNA(DNA SEQ ID NO：1)处理相比，响应于Neu抗体-DNA偶联物[Neu Ab-DNA SEQ ID NO：1]处理，在FVB小鼠中同源Neu+肿瘤的生长抑制和体积减小。
图21A和21B是显示响应于DNA偶联的抗neu抗体的肿瘤内或全身给药，在(neu-N)-转基因小鼠中肿瘤生长的抑制的图：(A)未处理对照小鼠的肿瘤体积。(B)Neu抗体-DNA偶联物-处理的小鼠[Neu Ab-DNA SEQ ID NO：1]的肿瘤体积。
图22图示组氨酸(His)-标记的炭疽芽孢杆菌(Bacillus Anthracis)保护抗原(PA)与寡核苷酸的结合。
图23图示寡核苷酸与质粒之间的三螺旋形成。
图24图示通过抗EGFR抗体-HIV Tat肽复合物的质粒递送和基因表达。
通过引用并入
本说明书中提及的所有的出版物和专利申请在本文中通过引用而并入，其程度如同具体并单独地指出每个单独的出版物或专利申请通过引用而并入。
具体实施方式
在描述本发明组合物、方法以及方法学之前，应该理解，本发明不限于所述的具体组合物、方法和实验条件，因为这些组合物、方法和条件可以变化。也应该理解，本文所用的术语只是出于描述具体实施方式的目的，并非意图是限制性的，因为本发明的范围将仅在所附权利要求书中限制。
如在本说明书和所述权利要求书中所用，单数形式的“一/一个(a)”、“一/一个(an)”和“该/所述(the)”包括复数指代物，除非上下文有明确不同的表示。因此，举例来说，对“一个核酸”的指代包括一个或更多个核酸，和/或本文所述类型的组合物，其在本领域技术人员阅读本公开内容等之后将变得显而易见。
如本文所用，“免疫效应细胞”包括T细胞、NK细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞(DC)。
如本文所用，“肿瘤靶向肽”包括含有少于100个氨基酸的聚合物，其中所述聚合物特异性地与肿瘤细胞的细胞组分、肿瘤血管和/或肿瘤微环境的组分结合。
如本文所用，“瘤/肿瘤(neoplasm)”——包括其语法变化——表示组织的新的生长和异常生长，这可能是良性的或癌性的。在一个相关的方面，瘤表示肿瘤疾病或病症，包括但不限于各种癌症。举例来说，这样的癌症可以包括前列腺癌、胰腺癌、胆癌、直肠癌、黑素瘤、肉瘤、肝癌、肾癌、肺癌、睾丸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、头颈癌、黑素瘤、白血病、淋巴癌等。
如本文所用，“对象(subject)”——包括其语法变化——表示人或脊椎动物，包括狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、猴、大鼠和小鼠。
如本文所用，“偶联/结合(conjugation)”——包括其语法变化——表示外源DNA或RNA与靶-特异抗体和/或肽和/或肿瘤靶向部分的直接或间接连接(linking)、偶连(coupling)、联结(binding)等，所述连接、偶连、联结或是化学地、静电地、非共价地或是通过其它技术进行。例如，目前公开的分离的抗体-核酸偶联物或肽-核酸偶联物将落在这个定义中。
“免疫刺激核酸序列”(INAS)是指为病原体相关性分子模式(PAMP)或能激活免疫细胞的其它基序的核酸分子，包括但不限于：双链DNA(ds DNA)、单链DNA(ssDNA)、CpG DNA(CpG)、单纯疱疹病毒(HSV)DNA、双链RNA(dsRNA)和单链RNA(ssRNA)。在一个相关的方面，INAS可为编码或非编码序列。作为说明性实例，INAS可为DNA(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)或RNA(见下文)。
术语“治疗有效量”表示会引起组织、系统、动物或人的生物或医疗反应的对象化合物的量，所述反应是研究者、兽医、医师或其它临床医生所追求的。
术语“组合物”，如本文所用，意欲包括含有指定量的指定成分的产品，以及由指定量的指定成分组合而直接或间接产生的任何产品。“药学上可接受的”表示载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其它成分相容，而对其接受者无害。
术语“施用(administration of)”和/或“施用(administering a)”化合物应该被理解为表示为需要治疗的个体提供治疗有效量的本发明的化合物。施用可以是肿瘤内或全身(静脉内)施用。另外，与用病原体抗原疫苗(例如破伤风类毒素)对接受者接种组合。另外，与消耗或失活调节T细胞(例如环磷酰胺)或骨髓抑制细胞(例如吉西他滨)的药剂组合。在进一步的实例中，离体处理免疫细胞和肿瘤细胞用于产生肿瘤反应性或病原体抗原反应性免疫细胞——用于过继细胞免疫治疗。施用可以是皮内或皮下。另外，施用可以是与消耗或失活调节T细胞(环磷酰胺)或骨髓抑制细胞(例如吉西他滨)的一个或更多个另外的治疗剂联合。本文鉴定的本发明的药物组合物用于肠胃外、外部、口服、经鼻(或以另外方式吸入)、直肠或局部施用，例如通过气溶胶或透皮施用，用于本文所述的一个或更多个病状/适应症(例如，癌症、病原体感染因子、其相关病症)的预防和/或治疗性处理。药物组合物可以以多种单位剂量形式施用，这取决于施用方法。合适的单位剂量形式包括但不限于：粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂(lozenges)、栓剂、贴剂、鼻腔喷雾、注射剂、可植入缓释制剂、脂质复合物等。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。相似或等同于本文所述方法和材料的任何方法和材料都可以用在本发明的实践或测试中，因为会被理解的是，修饰和变化包括在本公开的精神和范围内。
大体上，本发明的组合物和方法涉及治疗或诊断化合物，其包括对靶细胞具有特异性的靶向部分和增强针对靶细胞的免疫应答的活性剂。如本文进一步所述，靶向部分对癌症或肿瘤、感染因子或正常细胞的分子或组分具有特异性。另外，活性剂包括核酸、肽或其组合。
在本发明的第一方面，本发明的产品和方法涉及组合物，其包括靶向部分和一个、两个、三个或更多个活性剂。
在一个实施方式中，本发明的组合物包括偶联至活性剂的靶向部分。在另一个实施方式中，组合物包括靶向部分和至少两个活性剂，所述活性剂包括非编码或编码的核酸分子和肽或多肽。在进一步的实施方式中，至少两个活性剂包括非编码核酸分子以及编码核酸分子(例如，质粒或小环)。在还进一步的实施方式中，至少两个活性剂包括非编码或编码核酸分子、和抗原肽或多肽。为简化说明，本发明的组合物可以由下式涵盖：T-A1或T-A1-A2，其中T＝靶向部分；A1是核酸分子或肽或多肽或脂肽；以及A2是核酸分子或肽或多肽或脂肽。另外，核酸分子可以是编码或非编码序列，如本文进一步所述。在进一步的实施方式中，A1可以偶联(直接地或间接地)至包括核酸分子、肽、多肽或脂肽的另外的组分。可选地，在进一步的实施方式中，活性剂是用于核酸分子的包装和/或递送的组分。
例如，在本发明的一些实施方式中，T＝靶向肿瘤细胞、正常细胞或感染因子的组分的适配子、肽或抗体，A1＝免疫刺激非编码核酸分子；以及A2＝肽或多肽，其对对象(例如，被施用组合物的动物)具有抗原性。在另一个实施方式中，本发明的组合物包括T-A1。
靶向部分
靶向部分(例如，抗体)促进偶联的生物活性剂(例如核酸)向靶细胞的递送(例如，经由结合靶细胞受体的抗体的受体-介导的内吞作用)。
例如，靶向部分促进生物活性剂(例如INAS)和免疫原性凋亡物质经由其Fc和Fc受体(免疫细胞上)之间的相互作用从抗体-结合肿瘤靶到免疫细胞的递送；这促进经由内吞作用的核酸内化以及内体模式识别受体(例如Toll-样受体)的激活。
例如，免疫刺激DNA偶联的或RNA-偶联的抗体/肽的引入激活靶向细胞(例如，肿瘤细胞)中的死亡信号传导(图3)。虽然不被理论束缚，并与遗传毒性化学治疗剂的作用相反，DNA偶联的或RNA-偶联的抗体/肽的使用能够在靶向细胞中激活死亡信号传导而不对正常组织产生相应作用，正常组织不表达靶向分子或与肿瘤细胞相比表达明显降低水平的所述分子。
在本发明的一方面，靶向部分-生物活性剂偶联物发挥诱导免疫应答的作用——生物活性剂序列除外。在各种实施方式中，本发明的偶联物能够促进靶细胞的死亡，而同时诱导先天和获得性免疫系统的直接或间接激活。例如，INAS-抗体偶联物的细胞内识别发挥下列作用：激活靶细胞的细胞因子/共刺激分子/警报素/损伤-相关分子模式(内源危险信号)产生、促进直接和免疫-介导的靶细胞死亡、促进抗原呈递细胞对凋亡细胞(携带核酸)的吸收、以及激活免疫系统以产生针对交叉呈递的肿瘤抗原的抗肿瘤反应(图3)。在凋亡的肿瘤细胞被巨噬细胞和树突细胞吞噬后，这些抗体-核酸免疫复合物可激活内体TLR-介导的或TLR非依赖性免疫应答。这可诱导定向于源自抗体-结合的凋亡肿瘤细胞的抗原的自免疫反应。
如本文所用，“靶向部分”(或更多个部分)是指具有定位存在于对象的正常细胞/组织和/或癌细胞/肿瘤上的分子并与之结合的能力的一个或更多个分子。换言之，包括这种靶向部分的本发明组合物与配体(直接地或间接地)结合，所述配体存在于细胞上。另外，靶向部分是指具有定位存在于正常细胞/组织和/或癌细胞/肿瘤上的靶分子或其它分子并与之结合的能力的一个或更多个分子。换言之，包括这种靶向部分的本发明组合物可与靶向细胞或分子(直接地或间接地)结合。预期与生物活性剂使用的本发明的靶向部分包括抗体、多肽、肽、适配子、其它配体或其任何组合，它们可结合靶细胞或分子的组分。
在一个实施方式中，在施用给对象后，靶向部分结合肿瘤细胞(一个或更多个)或可结合在肿瘤细胞(一个或更多个)的附近(例如，肿瘤血管或肿瘤微环境)。靶向部分可结合至癌细胞表面上的受体或配体或可结合至癌细胞的细胞内靶——只要该靶能够接近该分子。对细胞内癌细胞靶的可接近性可在具有受损质膜的癌细胞中发生，例如经历凋亡、坏死等的细胞。一些癌症靶向分子可结合不具有受损质膜的细胞的细胞内部分。
在本发明的另一方面，对非癌细胞或组织具有特异性的靶向部分被选择。例如，靶向部分可以对正常存在于特定细胞或组织上的分子具有特异性。另外，在一些实施方式中，相同的分子可以存在于正常和癌细胞上。各种细胞组分和分子是已知的。例如，如果靶向部分对EGFR具有特异性，那么产生的本发明偶联物可靶向表达EGFR的癌细胞以及表达EGFR的正常皮肤表皮细胞。因此，在一些实施方式中，本发明的偶联物可通过两种分开的机制起作用(靶向癌和非癌细胞)，如本文进一步讨论的。在还进一步的实施方式中，本发明的偶联物包括对感染因子的组分或分子具有特异性的靶向部分。
在本文公开的本发明的各种方面中，本发明的偶联物包括靶向部分，其可结合/靶向细胞组分，例如肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原、支原体抗原、真菌抗原、朊病毒抗原、来自寄生虫的抗原。如本文所用，细胞组分、抗原或分子可各自用于指靶向部分的所期望的靶。例如，在各种实施方式中，靶向部分是组分特异性的或结合组分，所述组分包括但不限于：表皮生长因子受体(EGFR、ErbB-1、HER1)、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、EGFR配体家族；胰岛素样生长因子受体(IGFR)家族、IGF-结合蛋白(IGFBPs)、IGFR配体家族；血小板衍生生长因子受体(PDGFR)家族、PDGFR配体家族；成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、FGFR配体家族、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族、VEGF家族；HGF受体家族；TRK受体家族；肝配蛋白(EPH)受体家族；AXL受体家族；白细胞酪氨酸激酶(LTK)受体家族；TIE受体家族、血管生成素1，2；受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)受体家族；盘菌素结构域受体(DDR)家族；RET受体家族；KLG受体家族；RYK受体家族；MuSK受体家族；转化生长因子α(TGF-α)受体、TGF-β；细胞因子受体、I类(血细胞生成素家族)和II类(干扰素/IL-10家族)受体、肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族(TNFRSF)、死亡受体家族；睾丸癌(CT)抗原、谱系特异性抗原、分化抗原、α-辅肌动蛋白-4、ARTC1、断裂点簇区-Abelson(Bcr-abl)融合产物、B-RAF、胱天蛋白酶-5(CASP-5)、胱天蛋白酶-8(CASP-8)、β-联蛋白(CTNNB1)、细胞分裂周期27(CDC27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、CDKN2A、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD-2、延伸因子2(ELF2)、Ets变体基因6/急性骨髓性白血病1基因ETS(ETC6-AML1)融合蛋白、纤连蛋白(FN)、GPNMB、低密度脂受体/GDP-L岩藻糖；β-D半乳糖2-α-L岩藻糖基转移酶(LDLR/FUT)融合蛋白、HLA-A2、HLA-A2基因中α2结构域的α螺旋的残基170上精氨酸替换为异亮氨酸(HLA-A*201-R170I)、HLA-A11、突变的热休克蛋白70-2(HSP70-2M)、KIAA0205、MART2、黑素瘤遍在突变的1、2、3(MUM-1、2、3)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、新-PAP、I类肌球蛋白、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras(KRAS2)、N-ras(NRAS)、HRAS、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、丙糖磷酸异构酶、BAGE、BAGE-1、BAGE-2，3，4，5、GAGE-1，2，3，4，5，6，7，8、GnT-V(异常N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V、MGAT5)、HERV-K-MEL、KK-LC、KM-HN-1、LAGE、LAGE-1、黑素瘤上CTL-识别的抗原(CAMEL)、MAGE-A1(MAGE-1)、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-3、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、粘蛋白1(MUC1)、MART-1/Melan A(MLANA)、gp100、gp100/Pmel17(SILV)、酪氨酸酶(TYR)、TRP-1、HAGE、NA-88、NY-ESO-1、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-1，2，3，4、TRP2-INT2、癌胚抗原(CEA)、激肽释放酶4、乳腺球蛋白-A、OA-1、前列腺特异性抗原(PSA)、TRP-1/gp75、TRP-2、脂肪分化相关蛋白(adipophilin)、黑素瘤2中不存在的干扰素可诱导蛋白(AIM-2)、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白D1、上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)、EphA3、成纤维细胞生长因子-5(FGF-5)、糖蛋白250(gp250)、EGFR(ERBB1)、HER-2/neu(ERBB2)、白细胞介素13受体α2链(IL13Rα2)、IL-6受体、肠羧酯酶(iCE)、甲胎蛋白(AFP)、M-CSF、mdm-2、MUC1、p53(TP53)、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RNF43、RU2AS、SOX10、STEAP1、存活蛋白(BIRC5)、人端粒酶反转录酶(hTERT)、端粒酶、维耳姆斯瘤基因(WT1)、SYCP1、BRDT、SPANX、XAGE、ADAM2、PAGE-5、LIP1、CTAGE-1、CSAGE、MMA1、CAGE、BORIS、HOM-TES-85、AF15q14、HCA661、LDHC、MORC、SGY-1、SPO11、TPX1、NY-SAR-35、FTHL17、NXF2、TDRD1、TEX15、FATE、TPTE、免疫球蛋白独特型、本斯-琼斯蛋白、雌激素受体(ER)、雄激素受体(AR)、CD40、CD30、CD20、CD19、CD33、癌抗原72-4(CA72-4)、癌抗原15-3(CA15-3)、癌抗原27-29(CA27-29)、癌抗原125(CA125)、癌抗原19-9(CA19-9)、β-人绒毛膜促性腺激素、β-2微球蛋白、鳞状细胞癌抗原、神经元特异性烯醇化酶、热休克蛋白gp96、GM2、沙格司亭、CTLA-4、707丙氨酸脯氨酸(707-AP)、T4细胞识别的腺癌抗原(ART-4)、癌胚抗原肽-1(CAP-1)、钙激活的氯通道-2(CLCA-2)、亲环蛋白B(Cyp-B)、人印戒瘤-2(HST-2)、人乳头瘤病毒(HPV)蛋白(HPV-E6、HPV-E7、主要或次要衣壳抗原、其它)、EB病毒(EBV)蛋白(EBV潜伏膜蛋白-LMP1、LMP2；其它)、乙型或丙型肝炎病毒蛋白和HIV蛋白。偶联物可进一步包括前述物质——作为肽/多肽和/或编码它们。
如本文所述，在各种实施方式中，本发明的化合物包括结合感染因子的组分(例如抗原)的靶向部分，其中这种化合物与生物活性剂偶联，以及其中这种化合物诱导对象的免疫刺激反应(直接地/间接地)。通常，这种感染因子可以是任何病原体，其不受任何限制地包括细菌、酵母、真菌、病毒、真核寄生虫等。在各种实施方式中，本发明的化合物包括靶向部分，所述靶向部分定向于病原体/感染因子上存在的组分，所述病原体/感染因子包括但不限于：逆转录病毒科(Retroviridae)(例如人免疫缺陷病毒，例如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III)；以及其它分离体，例如HIV-LP)；小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒(polio viruses)、甲型肝炎病毒(hepatitis A virus)；肠道病毒(enteroviruses)，人柯萨奇病毒(human Coxsackie viruses)、鼻病毒(rhinoviruses)、埃可病毒(echoviruses))；杯状病毒科(Calciviridae)(例如，引起肠胃炎的毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒(equine encephalitis viruses)、风疹病毒(rubellaviruses))；黄病毒科(Flaviridae)(例如登革热病毒(dengue viruses)、脑炎病毒(encephalitis viruses)、黄热病病毒(yellow fever viruses))；冠状病毒科(Coronoviridae)(例如冠状病毒(coronaviruses))；弹状病毒科(Rhabdoviradae)(例如水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis viruses)、狂犬病病毒(rabies viruses))；丝状病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒(ebola viruses))；副黏液病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒(parainfluenza viruses)、腮腺炎病毒(mumps virus)、麻疹病毒(measlesvirus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus))；正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒(influenza viruses))；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如汉坦病毒(Hantaan viruses)、bunga病毒、静脉病毒(phleboviruses)和Nairo病毒)；砂粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒(hemorrhagic fever viruses))；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如呼肠孤病毒(reoviruses)、环状病毒(orbiviurses)和轮状病毒(rotaviruses))；Bimaviridae；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙肝病毒(Hepatitis B virus))；细小病毒科(Parvovirida)(细小病毒(parvoviruses))；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头状瘤病毒(papilloma viruses)、多瘤病毒(polyoma viruses))；腺病毒科(Adenoviridae)(大部分腺病毒(adenoviruses))；疱疹病毒科(Herpesviridae)(1型和2型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(varicellazoster virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)(CMV)、疱疹病毒(herpes virus))；劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)(RSV)，禽类白血病病毒(avian leukemia virus)(ALV)和禽类成髓细胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus)(AMV))和C-型B组(包括猫白血病病毒(feline leukemia virus)(FeLV)，长臂猿白血病病毒(gibbon ape leukemiavirus)(GALV)，脾坏死病毒(spleen necrosis virus)(SNV)，网状内皮组织增殖病毒(reticuloendotheliosis virus)(RV)和猿猴肉瘤病毒(simian sarcoma virus)(SSV))，D-型逆转录病毒(retroviruses)——包括梅-帕猴病毒(Mason-Pfizer monkey virus)(MPMV)和1型猴逆转录病毒(SRV-1)，复合逆转录病毒——包括慢病毒(lentiviruses)、T细胞白血病病毒和泡沫病毒(foamy viruses)亚群，慢病毒——包括HIV-1、HIV-2、SIV、维斯纳病毒(Visna virus)、猫免疫缺陷病毒(FIV)和马传染性贫血病毒(EIAV)、猴T细胞白血病病毒(STLV)和牛白血病病毒(BLV)，泡沫病毒——包括人泡沫病毒(HFV)、猿泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)，痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒(variola viruses)，牛痘病毒(vaccinia viruses)，痘病毒(pox viruses))；以及虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如非洲猪瘟病毒(African swine fever virus))，以及未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原，丁型肝炎的病原(被认为是乙肝病毒的缺陷卫星型)，非甲非乙型肝炎的病原(1类＝内部传播；2类＝肠胃外传播(即丙肝)；诺沃克及相关病毒(Norwalk and related viruses)和星状病毒(astroviruses))，分枝杆菌(Mycobacterium)(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，牛分枝杆菌(M.bovis)，鸟胞内分枝杆菌(M.avium-intracellulare)，麻风分枝杆菌(M.leprae))，肺炎球菌(Pneumococcus)，链球菌(Streptococcus)，葡萄球菌(Staphylcococcus)，白喉(Diphtheria)，李斯特菌(Listeria)，丹毒丝菌(Erysipelothrix)，炭疽(Anthrax)，破伤风(Tetanus)，梭状芽胞杆菌(Clostridium)，混合厌氧菌(Mixed Anaerobes)，淋球菌(Neisseria)，沙门氏菌(Salmonella)，志贺氏菌(Shigella)，嗜血杆菌(Hemophilus)，大肠杆菌(Escherichia coli)，克雷伯菌(Klebsiella)，肠杆菌(Enterobacter)，沙雷氏菌(Serratia)，假单胞菌(Pseudomonas)，博代氏菌(Bordatella)，土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)，耶尔森氏菌(Yersinia)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，巴尔通体(Bartonella)，军团菌(Legionella)，螺旋体(Spirochaetes)(密螺旋体(Treponema)，钩端螺旋体(Leptospira)，包柔螺旋体(Borrelia))，真菌(Fungi)，放线菌(Actinomyces)，立克次体(Rickettsia)，支原体(Mycoplasma)，衣原体(Chlamydia)，原生动物(Protozoa)(包括内阿米巴(Entamoeba)，疟原虫(Plasmodium)，利什曼原虫(Leishmania)，锥虫(Trypanosoma)，弓形体(Toxoplasma)，肺囊虫(Pneumocystis)，巴贝虫(Babasia)，贾第虫(Giardia)，隐孢子虫(Cryptosporidium)，毛滴虫(Trichomonas))，蠕虫(Helminths)(毛线虫(Trichinella)，吴策线虫(Wucheraria)，盘尾虫(Onchocerca)，血吸虫(Schistosoma)，线虫(Nematodes)，绦虫(Cestodes)，吸虫(Trematodes))。可以作为本发明组合物的靶的抗原的另外实例是已知的，例如美国申请号2007/0066554中公开的那些。在本发明的进一步方面，偶联物可包括如本文所述的抗原或细胞组分，但除了靶向部分和免疫刺激核酸分子之外。如本文进一步如下所述，本发明的组合物可包括靶向部分、免疫刺激核酸或编码感兴趣的多肽或肽的核酸、以及与感染因子相关的肽或多肽(抗原)。偶联物可进一步包括前述物质——作为肽/多肽和/或编码它们。另外，对于DNA接种，编码序列在肿瘤细胞以及DCs中递送和表达以提供增强的免疫应答。
上述和以下列列举中的每一个是说明性的，并不意欲进行限制。
在各种实施方式中，本发明的化合物包括如本文所述的对感染因子的靶向部分，以及为免疫刺激核酸或蛋白分子的生物活性剂。在进一步的实施方式中，这种免疫刺激生物活性剂包括对应于SEQ ID NO：56至228的一个或更多个核酸或蛋白分子。另外，该序列可以包括在偶联物中，以便在肿瘤细胞或DC中表达多肽来增强免疫应答。在还进一步的实施方式中，本发明的化合物(例如偶联物)包括两个或更多个相同或不同的生物活性剂。
靶向部分可以对各种类型感染因子特定的具体抗原具有特异性。例如，流感病毒属于正黏液病毒科家族正黏液病毒属。ssRNA包被的病毒具有螺旋状对称。包被的颗粒直径为80-120nm。RNA与核蛋白(NP)紧密相连形成螺旋状结构。基因组被分割，具有8个RNA片段(流感C为7个)。存在4个基本抗原：红细胞凝集素(H)、神经氨酸苷酶(N)、核蛋白(NP)和基质(M)蛋白。NP是类型-特异性抗原，其以3种形式A、B和C出现，其提供人和非人流感病毒分类的基础。基质蛋白(M蛋白)包围核壳体并占颗粒质量的35-45％。另外，2个表面糖蛋白以杆状突起见于表面上。红血球凝集素(H)由2个亚基H1和H2组成。红血球凝集素介导病毒附着至细胞受体。神经氨酸苷酶分子以较少量存在于被膜中。甲型流感病毒(influenza Avirus)的红血球凝集素和神经氨酸苷酶抗原的抗原差异提供它们分类为亚型的基础。例如，A/Hong Kong/1/68(H3N2)表示在1968年从患者分离的甲型流感病毒并具有H3N2亚型，以及特异性靶向组分。偶联物可进一步包括前述物质——作为肽/多肽和/或编码它们。另外，对于DNA接种，编码序列在肿瘤细胞以及DCs中递送和表达以提供增强的免疫应答。
因此，在各种实施方式中，本发明的化合物包括靶向部分和生物活性剂，其诱导靶向感染因子的免疫应答。例如，靶向部分可以对任何HxNy——其中x是1-9并且y是1-16——或其xy的任何组合的甲型流感病毒具有特异性。例如，在一个实施方式中，本发明的化合物包括靶向部分，其结合抗原或包括抗原例如甲型流感H1N5亚型的融合肽。
在一个实施方式中，对感染因子组分具有特异性的靶向部分识别表位。如本文所用，术语“表位”是指在动物中，优选地在哺乳动物中和更优选地在人中具有抗原或免疫原性活性的多肽的部分。“免疫原性表位”如本文所用，被定义为多肽的部分，其在动物中引起抗体反应或诱导T-细胞反应，如本领域已知的任何方法测定的(参见，例如，Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：39984002(1983))。术语“抗原表位”如本文所用，被定义为抗体可免疫特异地结合它的抗原的蛋白部分，如本领域熟知的任何方法所测定的。免疫特异性结合排除非特异性结合，但不一定排除与其它抗原的交叉反应性。抗原表位不必具有免疫原性。抗原表位也可以是T-细胞表位，在这种情况下它们可以在MHC分子的情况下被T-细胞受体免疫特异性地结合。表位可包括3个氨基酸，所述氨基酸的空间构象对于该表位是独特的。通常，表位由至少约5个这种氨基酸组成，以及更通常地，由至少约8-10个这种氨基酸组成。如果表位是有机分子，它可以如硝基苯基一样小。
本发明偶联物的靶向部分可以对与感染因子相关的已知抗原具有特异性。参见<fda.gov/cber/products/testkits.htm>(列出可利用商业可用的抗体/分析的各种抗原，包括HIV、HBV、HTLV)。另外，靶组分的另外实例公开于美国专利号申请公开20070172881(真菌)；20070166319(HPV)；20060252132(流感变体)；20060115497(分枝杆菌)；美国专利号5,378,805(HTLV)；20060099219(HPV)；20070154883(风疹)；7,060,283(EB病毒)；7,232,566(HIV)；7,205,101(HIV)；以及6,878,816(包柔螺旋体)。偶联物可进一步包括前述物质——作为肽/多肽和/或编码它们。另外，对于DNA接种，编码序列在肿瘤细胞以及DCs中递送和表达以提供增强的免疫应答。
A.抗体
在一个实施方式中，本发明的组合物包括靶向部分，其是与生物活性剂(例如，免疫应答诱导核酸分子，编码所期望的肽或多肽的核酸分子，肽和抗原)相连的(例如偶联的)多肽。在某些实施方式中，抗体与两个、三个或四个相同类型或不同类型的生物活性剂连接。例如，在一些实施方式中，本发明的组合物包括偶联至非编码免疫刺激核酸分子以及免疫刺激肽、多肽或PNA的靶向部分。
在一些实施方式中，本发明的组合物包括偶联至标记(例如组氨酸标记)的靶向部分。在另一个实施方式中，组合物包括靶向部分、核酸分子和标记(例如，生物素/抗生物素蛋白)。在进一步的实施方式中，抗体可结合包括抗原肽或多肽的融合蛋白上的标记。
在一个实施方式中，偶联物的多肽分子是免疫球蛋白。如本文所用，术语“免疫球蛋白”包括天然或人工的单价或多价的抗体，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)片段、Fab表达文库产生的片段、抗-独特型(抗Id)抗体(包括例如，对本发明抗体的抗Id抗体)和上述任意的表位-结合片段。术语“抗体”，如本文所用，是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有与抗原免疫特异性结合的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任意类型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
通过它的抗体靶向部分，本发明的偶联物会结合肿瘤细胞的细胞组分、肿瘤血管或肿瘤微环境，从而经由存活信号的抑制(例如，生长因子或细胞因子或激素受体拮抗剂)、死亡信号的激活和/或免疫-介导的细胞毒性——例如通过抗体依赖性细胞毒性——来促进靶向细胞的凋亡。这种偶联物可通过几种机制发挥作用来阻止、减少或消除肿瘤细胞，例如促进偶联的INAS递送至肿瘤靶，例如通过结合靶细胞受体的抗体的受体-介导的内吞作用；促进INAS和免疫原性凋亡物质经由其Fc和Fc受体(免疫细胞上)之间的相互作用从抗体-结合肿瘤靶到免疫细胞的递送；这促进了经由内吞作用的INAS的内化以及内体模式识别受体(例如Toll-样受体)的激活；或这种偶联物可经由其Fc和Fc受体(免疫细胞上)之间的相互作用和经由偶联的INAS来募集、结合和/或激活免疫细胞(例如NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、T细胞、B细胞)。而且，在一些情况下，一个或更多个上述通路可在施用本发明的一个或更多个偶联物后起作用。
本发明的抗体包括抗体片段，其包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fvs(scFvs)、单链抗体、二硫化物连接的Fvs(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗原结合的抗体片段——包括单链抗体——可以包含单独的可变区(一个或更多个)或与下列的整体或部分联合可变区(一个或更多个)：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明中也包括抗原结合片段，其也包含可变区(一个或更多个)与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。本发明中也包括Fc片段、抗原-Fc融合蛋白和Fc-靶向部分偶联物或融合产物(Fc-肽、Fc-适配子)。本发明的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟和哺乳动物。一方面，抗体为人、鼠科动物(如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的抗体。而且，这些抗体可为动物抗体的人源化形式。本发明所述的抗体可为单特异性的、双特异性的、三特异性的，或具有更大的多特异性。
本发明的抗体可以通过本领域已知的任何适合方法产生。针对感兴趣抗原的多克隆抗体可以通过本领域熟知的各种方法产生。例如，本发明的多肽可以施用给多种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以诱导含有抗原特异的多克隆抗体的血清的产生。取决于宿主物种，各种佐剂可用于增强免疫应答，包括但不限于：弗氏佐剂(Freund’s)(完全或不完全)，诸如氢氧化铝的矿物凝胶，表面活性物质如溶血卵磷脂，普卢兰尼克多元醇(Pluronic Polyols)、聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔血蓝蛋白，二硝基酚，和潜在有用的人佐剂，如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。这些佐剂也在本领域内被熟知。而且，抗体和抗体样结合蛋白可通过噬菌体展示制备。另外，抗体可以在植物中产生，如本领域所知。
单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术制备，包括杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合的使用。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术产生，所述技术包括本领域已知的和例如在Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，(冷泉港实验室出版社，第二版，1988)；Hammerling等，Monoclonal Antibodies andT-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)中教导的那些技术。如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指的是从单个克隆衍生的抗体，包括任何真核的、原核的或噬菌体克隆，而不是其产生的方法。
单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个抗原位点。另外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性之外，单克隆抗体还在下列方面具有优势：它们可被合成而不被其它抗体污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从实质上均一的抗体群获得的，并不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可用杂交瘤方法制备，其首先在Kohler等(1975)Nature256：495中描述，或可用重组DNA方法制备(参见，美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等(1991)Nature，352：624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222：581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库分离。
本文中单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而该链(一个或更多个)的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体以及这些抗体的片段的相应序列相同或同源，只要它们显示所期望的生物活性(美国专利号4,816,567；以及Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855)。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长化”(“primatized”)抗体，其包括源自非人灵长类(例如旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原-结合序列和人恒定区序列。
已使用各种方法来产生单克隆抗体(MAbs)。杂交瘤技术是指产生单一类型抗体的克隆细胞系，其使用各种物种的细胞，包括小鼠(鼠)、仓鼠、大鼠和人。另一种制备MAbs的方法使用包括重组DNA技术的遗传工程。这些技术制备的单克隆抗体包括嵌合抗体和人源化抗体等等。嵌合抗体将来自多于一种类型的物种的DNA编码区组合。例如，嵌合抗体可从小鼠获得可变区和从人获得恒定区。人源化抗体主要来自人，尽管它含有非人部分。与嵌合抗体类似，人源化抗体可含有完整的人恒定区。但是与嵌合抗体不同，可变区可以部分源自人。人源化抗体的非人合成部分通常来自鼠抗体中的CDRs。在任何情况下，这些区域对使得抗体识别并结合至特异性抗原都是至关重要的。尽管可用于诊断和短期治疗，但是鼠抗体不可长期施用给人类而不增加有害免疫原性反应的风险。该反应——称为人抗小鼠抗体(HAMA)，发生在人免疫系统将鼠抗体作为异物识别并攻击它时。HAMA反应可导致中毒性休克或甚至死亡。嵌合和人源化抗体通过最小化施用抗体的非人部分来减少HAMA反应的可能性。另外，嵌合和人源化抗体可具有激活次级(secondary)人免疫应答、例如抗体依赖性细胞毒性的另外的益处。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如包括其抗原-结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；Fc片段或Fc-融合产物；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段(一个或更多个)形成的多特异性抗体。
“完整”(“intact”)抗体是包括抗原-结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2以及CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体或任何其它修饰的Fc(例如糖基化或其它工程化的Fc)。
完整抗体可具有一个或更多个“效应子功能(effector functions)”，其指那些可归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区或任何其它修饰的Fc区)的生物活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。
取决于它们重链恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可以分为不同“类”。完整抗体有五种主要类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，以及这些中的几类可以进一步分为“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应不同类抗体的重链恒定结构域分别称为α、Δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。
在各种实施方式中，抗体/靶向部分募集、结合和/或激活免疫细胞(例如NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞)，这经由Fc(抗体中)和Fc受体(免疫细胞上)之间的相互作用和经由抗体/肽/配体或其它靶向部分的偶联的INAS而产生。可并入至本发明的组合物和方法的抗体的实例包括但不限于抗体，例如西妥昔单抗(表皮生长因子受体EGFR的嵌合单克隆抗体)、帕尼单抗(抗EGFR)、尼妥珠单抗(抗EGFR)、B8、利妥昔单抗(嵌合鼠/人抗CD2O MAb)；赫赛汀、曲妥珠单抗(抗Her2hMAb)；Panorex(17-1A)(鼠单克隆抗体)；Panorex(17-1A)(嵌合鼠单克隆抗体)；IDEC-Y2B8(鼠，抗CD2O MAb)；BEC2(抗独特型MAb，模拟GD表位)(用BCG)；Oncolym(Lym-1单克隆抗体)；SMART MI95 Ab，人源化13′I LYM-1(Oncolym)，Ovarex(B43.13，抗独特型小鼠MAb)；MDX-210(人源化抗HER-2双特异性抗体)；3622W94 MAb——其结合腺癌上的泛癌抗原EGP40(17-1A)；抗VEGF，RhuMAb(Avastin；抑制血管生成)；赛尼哌(Zenapax)(SMART抗Tac(IL-2受体)；SMART MI95Ab，人源化Ab，人源化)；MDX-210(人源化抗HER-2双特异性抗体)；MDX-447(人源化抗EGF受体双特异性抗体)；NovoMAb-G2(泛癌特异性Ab)；TNT(组蛋白抗原的嵌合MAb)；TNT(组蛋白抗原的嵌合MAb)；Gliomab-H(单克隆人源化Abs)；GNI-250Mab；EMD-72000(嵌合-EGF拮抗剂)；LymphoCide(人源化LL2抗体)；以及MDX-260双特异性、靶向GD-2，ANA Ab，SMART lDlO Ab，SMART ABL 364Ab或ImmuRAIT-CEA。如前列举所示，制备特定靶表位的抗体是常规的。
A.适配子
在本发明的一方面，靶向部分是连接免疫刺激序列的适配子分子。例如，在一些实施方式中，适配子包括发挥靶向部分功能的核酸，其连接至或进一步包括一个或更多个免疫刺激核酸。在各种实施方式中，本发明的组合物包括适配子，其对肿瘤细胞、肿瘤血管和/或肿瘤微环境上的分子具有特异性。另外，这种组合物包括生物活性剂(例如，核酸或肽)。但是，应清楚的是，除了靶向模块(序列)外，适配子本身可包括生物活性序列，其中所述生物活性序列可诱导对靶细胞的免疫应答。换言之，这种适配子分子是本发明的双用途组分。在一些实施方式中，本发明的组合物包括适配子与抗体的偶联物，其中所述适配子和抗体对结合具有特异性以便分开肿瘤细胞、肿瘤血管、肿瘤微环境和/或免疫细胞上的分子。
术语“适配子”包括DNA、RNA或肽，其基于对特定分子的特异结合性质进行选择。例如，可以选择适配子(一个或更多个)用于结合肿瘤细胞、肿瘤血管、肿瘤微环境、和/或免疫细胞上的特定基因或基因产物，如本文公开的，其中通过本领域已知的和本领域普通技术人员熟悉的方法进行选择。然后，可以将所述适配子(一个或更多个)施用至对象以调控或调节免疫应答。
已描述了一些对特定蛋白、DNA、氨基酸和核苷酸具有亲和性的适配子(例如，K.Y.Wang等人，Biochemistry 32：1899-1904(1993)；Pitner等人，美国专利号5,691,145；Gold等人，Ann.Rev.Biochem.64：763-797(1995)；Szostak等人，美国专利号5,631,146)。高亲和性和高特异性结合适配子已得自组合文库(上文，Gold等)。适配子可具有高亲和性，具有微摩尔至亚纳摩尔范围的平衡解离常数——取决于使用的选择。适配子还可显示高选择性，例如，显示出7-甲基g和g之间(Haller和Sarnow，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：8521-8526(1997))或D和L-色氨酸之间(上文，Gold等)一千倍的分辨力。
根据本发明的还另一方面，提供如上定义的化合物或适配子在制备产品和/或药物中的应用，所述产品用于疾病或状况的诊断、检测和/或成像，所述药物用于疾病或状况的预防和/或治疗，所述疾病或状况选自：免疫疾病、炎症疾病、感染性疾病和瘤性疾病/癌症，所述瘤性疾病/癌症包括但不限于头颈癌、呼吸消化道癌、胃肠癌、食道癌、胃/胃部癌(stomach/gastric cancers)、胰腺癌、肝-胆/肝癌、结肠直肠癌、肛门癌、小肠癌、泌尿生殖癌、泌尿科癌、肾/肾脏癌、输尿管癌、睾丸癌、尿道/阴茎癌、妇科癌、卵巢/输卵管癌、腹膜癌、子宫/子宫内膜癌、宫颈/阴道/外阴癌、妊娠滋养层细胞疾病、前列腺癌、骨癌、肉瘤(软组织/骨)、肺癌、间皮瘤、纵膈癌、乳腺癌、中枢神经系统癌、脑癌、黑素瘤、血液系统恶性病、白血病、淋巴瘤(何杰金氏病和非何杰金氏淋巴瘤)、浆细胞瘤、骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、内分泌肿瘤、皮肤癌、黑素瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、胰腺内分泌腺癌、类癌瘤、多发性内分泌腺瘤、AIDS相关恶性肿瘤、未知原发部位癌和各种儿童期癌症。
根据本发明的另一方面，提供用于预防、治疗、诊断、检测和/或成像疾病或状况的试剂盒，所述疾病或状况选自免疫疾病、炎症疾病、感染性疾病和瘤性疾病/癌症，所述试剂盒包括本发明的化合物、适配子或组合物。
因此，对于本发明的各种实施方式，基于靶向的特定分子来选择一个或更多个适配子(例如，靶向EGFR或其它癌症标记的适配子)。体外选择的标准方法是已知的，例如selex实验，其在Science 249(4968)505-510(1990)和Nature(London)，346(6287)818-822(1990)中描述，可以全部遵循或使用本领域已知的修改和改进。例如，根据厂商说明书将靶序列的片段结合至hi trap柱(nhs激活)(选择柱，由Pharmacia biotech提供)。该柱与具有伯氨基的化合物，例如多肽的末端氨基形成共价键。将DNA模板库(文库)添加至层析柱并使其与靶肽在室温相互作用大约1小时。洗涤柱以去除任何未结合的适配子，并用洗脱缓冲液(3M硫氰酸钠)洗脱结合的适配子。然后用nap-10柱(由Pharmacia biotech提供)使洗脱样品脱盐，最后在eppendorf中的灭菌水中洗脱。然后将这些冷冻干燥并将聚合酶链反应(“pcr”)试剂添加至干燥的寡核苷酸来制备它们用于pcr，其进行99个循环，退火温度为56℃。pcr方法后，将从该扩增产生的DNA添加至层析柱并用于下一轮选择。这些连续轮的选择和扩增进行10次。获得的终产物为大约100μl的pcr产物。
选择和扩增10轮后，克隆该库以筛选对所期望的靶分子(例如，EGFR)具有亲和性的DNA分子(ta topo克隆试剂盒，Invitrogen，UK)。使用通常的pcr方案确定各个克隆的特性，退火温度为48℃，使用m13引物进行35个循环并在2.5％琼脂糖凝胶上成像。然后，使阳性克隆在存在氨苄青霉素下在lb培养基中生长，并使用标准质粒DNA分离试剂盒(Quiagen，UK)分离。使用标准ird-800放射性方法(sequitherm excel ii，epicentre technologies，Madison，USA)对库进一步测序。
如此地，选择这种对靶分子(例如癌症标记，例如EGFR)具有特异性的适配子。如前所述，在适配子的鉴定中，这种靶可以与支持物结合。例如，将靶肽固定在层析柱中功能化的琼脂糖珠上。因此，结合适配子保留在柱中，而未结合的或弱结合的适配子被洗掉。然后，可去除强结合适配子用于PCR扩增。柱选择/扩增步骤可以被重复，以便辨别出最强结合的适配子(一个或更多个)。应理解的是，在每个连续循环中会存在不同群的适配子，并且最初存在大的群。整个过程可以重复，例如，十轮连续选择和扩增，以通过竞争性结合来实现亲和性成熟。产生的最终适配子(一个或更多个)可以被克隆并序列，并鉴定出具有高亲和性和特异性的成功的适配子(一个或更多个)。可使用其它数量的选择/扩增循环。
本发明的强结合适配子可以以大量的方式的使用。例如，它们可以用于其中发生靶分子的表达的疾病或状况的治疗和/或预防。它们还可以用于这些疾病和状况的诊断或检测，例如，通过体外或体内方法或测试。具体地，本发明的适配子可以用于将其它药剂导向靶附近。因此，适配子可以与杀伤或损伤细胞和/或在体外或体内可检测以定位靶浓度的试剂结合。在各种实施方式中，靶向肿瘤/癌细胞或肿瘤血管或肿瘤微环境的组分的适配子与一个或更多个免疫刺激序列偶联。在其它实施方式中，肿瘤靶向的适配子本身包括一个或更多个免疫刺激核酸序列(免疫刺激适配子)。一方面，免疫刺激适配子可以与抗体偶联，其中所述适配子和/或抗体可结合肿瘤细胞/肿瘤血管/肿瘤微环境或免疫细胞(例如巨噬细胞或树突细胞或其它)的不同组分。这可允许肿瘤细胞不同组分的双特异性或多特异性靶向，同时激活针对于靶细胞的免疫应答。
例如，甲硫氨酸臂或卟啉上的羧基可用作靶向适配子的附着点。该基团允许使用肽偶联方法学将复合物经由适配子上的氨基连接。这样，可以产生携带用于肿瘤治疗的治疗部分的适配子(例如，携带免疫刺激序列或放射性同位素等)。这种偶联方法学具有吸引力，原因在于它们在温和条件下进行并使得多个复合物负载至单一适配子上。以这种方式，可以在肿瘤位点获得一个或更多个治疗部分的较高局部浓度。上述用于标记方法的卟啉配体可商业获得或使用已建立的方法合成，例如tetrahedron，1997，53，6755-6790中描述的。
因此，在各种实施方式中，适配子可以连接于标记部分。例如，取决于使用的标记，适配子复合物的标记可以使用一系列物理技术例如吸收光谱、质谱、和在荧光标记例如罗丹明和荧光素存在的情况下通过荧光光谱、和对MRI活性标记通过弛豫时间(relaxometry)来验证。
可以使用标准肽偶联方案进行适配子标记。例如，将0.01mmol(0.004g)的化合物11或0.01mmol(0.009g)卟啉溶解于0.5cm.sup.3水和0.5cm.sup.3dmf中。将0.002g edci添加至溶液，将其在室温搅拌15分钟。添加1cm3水中的1当量的适配子，并使反应进行1小时。将样品应用到凝胶过滤柱上(nap-10)并用12cm.sup.3PBS(磷酸盐缓冲液)洗脱偶联物。收集1cm3的级分并将含有偶联物的级分合并。
可以制备放射标记适配子用于靶向目的。为了评估适配子作为治疗或诊断剂的效力，当配体离开发生器时，配体将加载放射性核素，然后偶联至适配子和立即施用。可选地，配体可以首先偶联至适配子，然后仅在施用前加载放射性核素。每次施用后和在治疗过程中在γ-照相机下监测会提供适配子作为诊断和治疗剂的效力的证据。
应理解的是，本发明的方法学不限于DNA适配子。其还适用于其它类型的寡核苷酸，例如RNA、吡喃糖基RNA(pRNA)和包括修饰部分例如非天然碱基或修饰的天然碱基的寡核苷酸。因此，在一些实施方式中，适配子分子由DNA、RNA、pRNA连同治疗部分组成。
在本发明的另一方面，适配子提供多价功能化的适配子分子，其可以被连接至一个或更多个治疗部分和/或一个或更多个标记部分。功能化的适配子可具有一个附着配体，但是，可能将多个配体附着至适配子和/或将多个适配子附着至配体。包括五个配体和四个适配子的单位示意性地显示如下：使用在3′和5′端都具有修饰的氨基修饰的适配子。例如，四个适配子识别单位可以包括在内，其经由肽键并附着至dota的四个羧基，其使用标准肽偶联反应，将过量适配子作为起始原料(.gtoreq.适配子与dota为4∶1)以允许偶联至所有可用的偶联位点。然后，将Mag3(或任何其它配体，例如配体9或其它商用配体)偶联至适配子的另一末端，产生四个适配子的复合物，其有效携带5个配体，所述配体加载有靶向和/或治疗部分(例如，免疫刺激核酸、抗体、免疫刺激分子、细胞毒剂和/或放射性核素)。
多价方法增加可被递送至细胞靶的治疗作用的量或耐久性。另外，这种方法还可增加适配子-治疗部分分子的稳定性(例如，对核酸酶的抗性)并增加适配子的半寿期，使其在机体内保持活性。另外，多价增加适配子治疗剂的大小。例如，通过将四个适配子连接在一起，使分子在大小上有效地增加(总计约40kda，而不是每个单独单位的10kda)，因此限制其从系统中的清除并提供循环中额外的有用时间。这种修饰的适配子的循环时间可以是几个小时，其匹配或超过相关放射性核素的半寿期。
如应从上述说明书中证实的，本发明的适配子或其变体可以连接至另一个化合物用于各种用途，例如治疗或诊断。通过例如离子或共价键或通过其它方式例如氢键，适配子可以连接至配体，例如那些本文公开的配体。因此，适配子可将配体引导至靶。配体优选地直接连接至配体。更具体地，适配子可以结合于配体而不使用肽束缚。适配子可以通过侧链部分例如氨基或羟基结合于配体或其它试剂。几个其它试剂可以附着至相同的适配子，以及几个适配子可以附着至相同试剂。适配子可连接于配体例如mag2(巯基乙酰双甘油)、mag3(巯基乙酰三甘油)、hynic(肼基烟酸)、n.sub.4-螯合剂、肼基-型螯合剂以及含硫氢的螯合剂。具体地，dota和相关的1，4，7，10-四氮杂环十二烷(cyclen)衍生的配体适于功能化的适配子。另外，适配子可连接于荧光或磷光基团以及MRI试剂。实例包括荧光素、罗丹明、生物素、蓝色素、吖啶、异羟洋地黄毒苷配基-11-dutp(digoxigenin-11-dutp)和镧系元素。
C.肽
在本发明的一些方面，用于递送生物活性剂的靶向部分是肽。例如，INAS可以偶联至肽，所述肽可与癌症或肿瘤细胞的组分结合。因此，本发明的这种偶联物包括肽靶向部分，其结合肿瘤细胞的细胞组分、肿瘤血管和/或肿瘤微环境的组分。在一些实施方式中，靶向部分肽可以是整联蛋白的拮抗剂或激动剂。包括α和β亚基的整联蛋白包括多种类型，其包括：
Figure GPA00001077157300281
Figure GPA00001077157300282
Figure GPA00001077157300283
等。
在一个实施方式中，靶向部分是
Figure GPA00001077157300284
整联蛋白
Figure GPA00001077157300285
在多种细胞上表达并已显示介导几个生物相关过程，包括破骨细胞对骨基质的粘附、血管平滑肌细胞的迁移和血管生成。整联蛋白的合适的靶向分子包括RGD肽或肽模拟物以及非RGD肽或肽模拟物(参见例如，美国专利号5,767,071和5,780,426)，其用于其它整联蛋白例如
Figure GPA00001077157300286
(VLA-4)、
Figure GPA00001077157300287
(参见例如，美国专利号6,365,619；Chang等人，Bioorganic & Medicinal Chem Lett，12：159-163(2002)；Lin等人，Bioorganic &Medicinal Chem Lett，12：133-136(2002))等。
在本发明的具体实施方式中，靶向部分肽可以衍生自噬菌体展示或其它来源并包括但不限于：αvβ1整联蛋白(CRRETAWAC(SEQ ID NO：5))、αvβ3整联蛋白(CDCRGDCFC(SEQ ID NO：6)/RGD-4C；RGDWXE(SEQ ID NO：7))、αvβ5整联蛋白(TRGDTF(SEQ ID NO：8))、αvβ6(RGDLxxL(SEQ ID NO：9)或xxDLxxL(SEQ IDNO：10))、αIIβ3(SRGDM(SEQ ID NO：11))、αvβ5的膜联蛋白V模拟物(VVISYSMPD(SEQ ID NO：12))、E-选择蛋白(IELLQAR(SEQ ID NO：13))、内皮细胞线粒体(CNGRC-GG-(KLAKLAK)2(SEQ ID NO：14))、肝配蛋白-A2和肝配蛋白-A4(CVSNPRWKC(SEQ ID NO：15)、CHVLWSTRC(SEQ ID NO：16))、纤连蛋白(CWDDGWLC(SEQ ID NO：17))、ICAM-I或血管假性血友病因子(von Willebrandfactor)(CPCFLLGCC(SEQ ID NO：18)/LLG-4C)、核纤层蛋白-1(DFKLFAVY(SEQID NO：19))、P-选择蛋白(EWVDV(SEQ ID NO：20))、MMP-9：整联蛋白复合物(D/E)(D/E)(G/L)W(SEQ ID NO：21)、MMP-9和MMP-2(明胶酶)(CTTHWGFTLC(SEQ ID NO：22))、内皮上的I类钙粘着蛋白(N-Ac-CHAVC-NH2)、VEGFNxxEIExYxxWxxxxxY的Flt-1区域(SEQ ID NO：23)、VEGF的KDR区域(HTMYYHHYQHHL(SEQ ID NO：24)、ATWLPPR(SEQ ID NO：25)、VEGF受体(WHSDMEWWYLLG(SEQ ID NO：26))、RRKRRR(SEQ ID NO：27)、氨基肽酶N/CD13(NGR)、NG2蛋白多糖(TAASGVRSMH(SEQ ID NO：28)、LTLRWVGLMS(SEQ ID NO：29))、肾上腺衍生肽(LMLPRAD(SEQ ID NO：30))、脂肪组织衍生肽(CKGGRAKDC SEQ ID NO：31))、脑衍生肽(SRl)、脑内皮衍生肽(CLSSRLDAC(SEQ ID NO：32))、神经胶质瘤细胞衍生肽(VGLPEHTQ(SEQ ID NO：33))、神经母细胞瘤衍生肽(VPWMEPAYQRFL(SEQ ID NO：34))、骨髓衍生肽(GGG、GFS、LWS)、乳腺癌(HER2/neu衍生肽(LTVxPWx(SEQ ID NO：35)、LTVxPWY(SEQ IDNO：36)、HER2Ab/曲妥珠单抗模拟表位-LLGPYELWELSH(SEQ ID NO：37))、结肠衍生肽(RPMC(SEQ ID NO：38))、肠衍生肽(YSGKWGW(SEQ ID NO：39))、头颈鳞状细胞癌衍生肽(TSPLNIHNGQKL(SEQ ID NO：40))、肺血管衍生肽(CGFELETC(SEQ ID NO：41))、冠状动脉内皮衍生肽(NSVRDL(G/S)(SEQ IDNO：42)、NSVSSx(S/A)(SEQ ID NO：43))、淋巴管衍生肽(CGNKRTRGC(SEQ IDNO：44)/Lyp-1)、多器官衍生肽(GVL、EGRx(SEQ ID NO：45)、xFG(G/V)(SEQ IDNO：46))、胰岛衍生肽(CVSSNPRWKC(SEQ ID NO：47)、CHVLWSTRC(SEQ IDNO：48))、胰腺衍生肽(SWCEPGWCR(SEQ ID NO：49))、前列腺衍生肽(AGG、DPRATPGS(SEQ ID NO：50)、SMSIARL(SEQ ID NO：51)、CGRRAGGSC(SEQ IDNO：52)、GVL)、视网膜衍生肽(RDV、CSCFRDVCC(SEQ ID NO：53))、致畸因子配体衍生肽(TPKTSVT(SEQ ID NO：54))和子宫衍生肽(GLSGGRS(SEQ IDNO：55))。
一方面，αvβ3肽可以在涉及αvβ3-配体相互作用的区域具有αvβ3的天然配体或αvβ3自身的序列特征。一方面，αvβ3肽含有RGD三肽以及在含RGD区域中与天然配体在序列上相对应。
一方面，含有RGD的肽具有与αvβ3的天然配体的含RGD区域的氨基酸残基序列对应的序列，所述αvβ3的配体如纤维蛋白原、玻连蛋白、血管假性血友病因子、层粘连蛋白、血小板反应蛋白及类似配体。这些αvβ3配体的序列是熟知的。因此，αvβ3肽可以由任意的天然配体衍生。
另一方面，当与其它整联蛋白比较时，αvβ3肽优选地抑制αvβ3与其天然配体(一种或多种)的结合。对αvβ3具有选择性的αvβ3肽的识别可以在典型的结合抑制试验如ELISA试验中容易地辨别。
本发明的肽典型地包含不多于约100个氨基酸残基，优选地不多于约60个残基，更优选地不多于约30个残基。本发明的肽可以是线性的或环状的。
应该理解，对象肽不需要与αvβ3天然配体的氨基酸残基序列相同。示例性序列包括：CDCRGDCFC(SEQ ID NO：3)和GGCDGRCG(SEQ ID NO：4)。
本发明的肽包括其氨基酸残基序列在本文显示的肽的任意类似物、片段或化学衍生物。因此，本发明的肽可以接受各种变化、置换、插入和缺失，其中这些改变在其应用方面提供某些优势。就此而言，本发明的αvβ3肽对应于所述肽的序列，而非与其相同，其中做出了一种或更多种改变并且其在一种或更多种试验中保持发挥αvβ3肽功能的能力。
术语“类似物”包括具有与本文具体显示的序列基本相同的氨基酸残基序列的任何肽，其中一个或更多个残基被功能相似的残基保守取代，并且其如本文所述显示αvβ3活性。保守取代的例子包括：一个非极性(疏水的)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个非极性残基；一个极性(亲水的)残基取代另一个极性残基，如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、甘氨酸和丝氨酸之间；一个碱性残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代另一个碱性残基；或一个酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸取代另一个酸性残基。
术语“片段”是指任何这样的对象多肽，其氨基酸残基序列比本文公开了氨基酸残基序列的多肽短。
如本文所用，“肿瘤靶向肽”包括含有少于100个氨基酸的聚合物，其中所述聚合物特异性地与肿瘤细胞的细胞组分、肿瘤血管和/或肿瘤微环境的组分结合。
本发明的肽可以通过多肽领域技术人员已知的任意技术合成，包括重组DNA技术。由于纯度、抗原特异性、不含不期望的副产品、易于生产等原因，合成化学技术如固相Merrifield型合成是优选的。许多可用技术的极好的总结可以在以下文献中找到：Steward等，″Solid Phase Peptide Synthesis″，W.H.Freeman Co.，SanFrancisco，1969；Bodanszky，等，″Peptide Synthesis″，John Wiley & Sons，第二版，1976；J.Meienhofer，″Hormonal Proteins and Peptides″，Vol.2，p.46，Academic Press(New York)，1983；Merrifield，Adv.Enzymol.，32：221-96，1969；Fields等，Int.J.Peptide Protein Res.，35：161-214，1990；和美国专利号4,244,946——固相肽合成，和Schroder等，″The Peptides″，Vol.1，Academic Press(New York)，1965——经典溶液合成。用在这些合成中的适当保护基团在上述文献和J.F.W.McOmie，″Protective Groups in Organic Chemistry″，Plenum Press，New York，1973中描述。
II.活性剂
如本文所用，本发明的组合物包括对存在于靶细胞上的分子具有特异性的靶向部分，其偶联至治疗剂。更具体地，这种治疗剂是生物活性剂，其诱导针对靶细胞的免疫应答。因此，在一些实施方式中，本发明的组合物的使用方法包括预防或治疗癌症，例如防止肿瘤细胞增殖、消除或减少肿瘤细胞和/或肿瘤生长。在进一步的实施方式中，本发明的组合物的使用方法包括预防或治疗与感染因子相关的疾病。
b.核酸分子
如本文所公开的，核酸分子包括如下的一个或更多个：双链DNA(ds DNA)，单链DNA(ssDNA)，多链DNA，双链RNA(ds RNA)，单链RNA(ssRNA)，多链RNA，DNA-RNA杂交物(单链或多链)，肽核酸(PNA)，PNA-DNA杂交物(单链或多链)，PNA-RNA杂交物(单链或多链)，锁定核酸(LNA)，LNA-DNA杂交物(单链或多链)，LNA-RNA杂交物(单链或多链)。在一个实施方式中，核酸分子编码一个或更多个产物(例如，核酸如RNA、肽、多肽、融合肽)。在一个实施方式中，核酸分子包括一个或更多个免疫刺激核酸序列(INAS)，其可激活免疫细胞。
1.免疫刺激核酸分子
在一些实施方式中，治疗剂是免疫刺激DNA偶联的或RNA偶联的抗体或其它靶向部分，其同时激活免疫系统、将免疫效应细胞募集至靶向细胞并使肿瘤细胞对免疫学细胞毒性敏感(例如，通过同时阻断生长因子介导的信号传导)。免疫效应细胞与直接DNA-或RNA-诱导的死亡信号传导合作以诱导肿瘤细胞的凋亡。此外，例如，由凋亡的肿瘤细胞释放的肿瘤抗原被树突细胞(DCs)呈递，以产生持久的适应性抗肿瘤免疫应答。因此，可以实现细胞内死亡信号传导的选择性激活和靶向肿瘤细胞的免疫学消除，而对正常细胞没有毒性。
一方面，治疗剂是核苷酸-偶联的抗体或核苷酸-偶联的靶向部分，其经由不依赖于它们的免疫刺激作用的机制来诱导靶向肿瘤细胞的直接死亡。用DNA偶联的抗EGFR抗体处理表达EGFR的癌细胞或用DNA偶联的抗HER2/neu抗体处理表达HER2/neu的癌细胞在不存在PBMCs的情况下导致直接靶受体特异性死亡。响应于核苷酸偶联抗体处理的靶细胞的失调的细胞-细胞融合导致具有有限生命周期和受损复制能力的合生(杂交或多核的)细胞(coalesced cell)的形成。响应于用未偶联的亲代抗体(抗EGFR抗体或抗HER2/neu抗体)或游离DNA处理，没有观察到靶细胞死亡的这种新形式(细胞超融合(hyperfusion))。诱导直接细胞死亡的抗体-偶联的核苷酸序列的实例(*表示硫代磷酸酯键，其余是磷酸二酯键)：5’G*G*GGACGACGTCGTG-G*G*G*G*G*G 3’(SEQ ID NO：1)；5’G*G*GGGAGCATGCTGG*G*G*G*G*G 3’(SEQ ID NO：2)。细胞超融合可通过检验细胞存活/增殖的方法观察到，这些方法包括但不限于相差显微镜、台盼蓝排除、结晶紫染色、合生细胞体的检测和/或多核细胞体形成的检测。
一方面，DNA偶联的或RNA偶联的多肽/肽或肿瘤-靶向部分同时激活肿瘤细胞环境中的抗肿瘤免疫应答并抑制肿瘤血管生成。在相关的方面，靶向肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的多肽/肽帮助将免疫刺激DNA/RNA递送至肿瘤，还抑制肿瘤血管生成。
在一个实施方式中，靶向部分连接于核酸序列，包括病原体-相关分子模式(PAMP)或直接地或间接地诱导免疫细胞活化、成熟、增殖和/或存活的其它序列。这种免疫细胞包括但不限于树突细胞、T淋巴细胞、天然杀伤细胞、B淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。另外，这种核酸序列可激活先天或获得性免疫，例如：通过内体表达的受体的连接，包括Toll-样受体(TLR-)和核苷酸-结合寡聚化结构域(NOD)-基因家族的成员；和/或通过TLR-非依赖性免疫细胞刺激，包括被视黄酸-可诱导蛋白I(RIG-I)和MDA-5检测；和/或通过靶细胞反应，例如内源免疫刺激分子的表达或释放，包括警报素、细胞因子、化学因子、共刺激分子；和/或通过来自损伤的或垂死的靶细胞的免疫危险信号。在各种实施方式中，偶联至靶向部分的生物活性剂是TLR——包括但不限于TLR3、TLR7/8和TLR9——的激动剂。
在本发明的各种实施方式中，一个或更多个靶向部分偶联至一个或更多个包括核酸分子的生物活性剂。例如，活性剂可以是一个或更多个免疫刺激核酸序列(INAS)。在一个实施方式中，一个或更多个核酸序列可包括病原体-相关分子模式(PAMP)或直接诱导和/或促进Toll-样受体(TLR)-依赖性或TLR-非依赖性的免疫细胞活化、增殖和/或存活的其它序列。在另一个实施方式中，活性剂可包括稳定的/被稳定的核酸序列(一个或更多个)，其经由对免于溶酶体降解的未消化的核苷酸的细胞应答而诱导免疫细胞的活化/增殖/存活。在另一个实施方式中，核酸序列可包括被识别为危险信号或损伤-相关分子模式(DAMP)的结构或序列，其引发诱导或促进免疫细胞活化、增殖和/或存活的细胞应答。还在另一个实施方式中，这种核酸序列是编码或非编码序列，其促进靶细胞死亡(激活死亡信号应答和/或抑制存活基因表达)以及由来自应激的、损伤的或垂死/凋亡的靶细胞的免疫刺激分子引发的再次免疫激活。在另一个实施方式中，核酸分子由于其二级结构发挥免疫刺激分子的功能。
如基于全部公开所证实的，INAS可以选自下列：ssDNA、ds DNA、反义DNA、寡脱氧核苷酸、ds RNA、ss RNA、siRNA、shRNA、miRNA、寡核糖核苷酸、核酶、质粒、DNA/RNA杂交物或适配子。
在各种实施方式中，本发明的组合物包括本文所述的靶向部分，其偶联至一个或更多个核酸序列，所述核酸序列包括病原体-相关分子模式(PAMP)或其它序列，所述其它序列诱导和/或促进Toll-样受体(TLR)-依赖性或TLR-非依赖性的免疫细胞的活化、增殖和/或存活。
病原体相关分子模式(PAMPs)是来自病原体或损伤的宿主细胞的基序，例如核酸，其经由包括Toll-样受体(TLR-)和核苷酸-结合寡聚化结构域(NOD)-基因家族的成员的受体被免疫系统识别。核酸序列[双链(ds)RNA、单链(ss)RNA、ds DNA和ss DNA]激活先天或获得性免疫系统，其通过巨噬细胞、单核细胞、树突细胞和其它抗原-呈递细胞(APCs)中表达的特定TLRs对它们的识别/衔接而进行。在巨噬细胞和树突细胞中，识别核酸的TLRs在内体中表达。它们包括TLR3、TLR7/8和TLR9，它们分别识别ds RNA、ss RNA和DNA。核酸配体向细胞内内体的有效转运(例如，经由抗体-介导的受体-介导的内吞作用)诱导TLR-激活和免疫刺激。
在各种实施方式中，本发明的组合物包括本文所述的靶向部分，其偶联至TLR激动剂。TLRs被微生物来源释放的天然发生分子、基于微生物产物的分子的合成分子、与天然发生配体不具有明显结构关联的小分子以及宿主来源的内源配体激活。
在一个实施方式中，偶联至靶向部分的生物活性剂(例如对EGFR具有特异性的抗体)是INAS，其可以是包括PAMP或TLR激动剂的任何序列。INAS可包括具有能够引发TLR激活(TLR激动剂)和/或刺激免疫应答的结构或化学的任何核酸序列。TLRs包括任何TLR，包括但不限于TLR1至TLR11。INAS可包括任何DNA或RNA，其具有当经由与靶向部分的偶联被引入到巨噬细胞、单核细胞和/或树突细胞中时能够TLR-活化和/或免疫刺激的序列或结构。核酸与抗体的偶联促进它们内体递送至免疫细胞(经由抗体-介导的Fc受体-介导的内吞)，并增加它们激活免疫系统的能力。值得注意的是，当经由抗体-偶联引入到巨噬细胞或树突细胞中时，不严格符合特定或规范的免疫刺激基序的DNA或RNA序列也被使得能够进行TLR-活化和/或免疫刺激。
在一些实施方式中，携带INAS、PAMP或TLR激动剂(例如细菌或病毒)的弱化的或失活的(活的或被杀灭的)免疫刺激病原体经由表达或偶联至肿瘤靶向部分(例如抗体、肽、适配子)被靶向至肿瘤。
在各种实施方式中，预期用于本发明的组合物和方法的INAS是源自细菌或病毒病原体的基因组核酸序列(DNA或RNA)。在另一个实施方式中，INAS是合成的DNA或RNA“模拟物”(例如，衍生物和类似物)，其相应于病原体或生物基因组的部分。示例性非限制性序列包括细菌DNA或RNA(例如，弱化的分支杆菌卡介苗DNA；炭疽芽孢杆菌；布氏杆菌(Brucella)；沙门氏菌；志贺氏杆菌)和病毒DNA或RNA(例如，黄病毒科、副黏液病毒科、正黏液病毒科、弹状病毒科、单纯疱疹病毒1型或2型DNA；呼肠孤病毒ds RNA；流感病毒ss RNA；禽流感病毒；诺罗病毒(Norovirus)；HIV-1ss RNA；HIV gag mRNA)。
在各种实施方式中，预期用于本发明的组合物和方法的这些活性剂(INAS或TLR激动剂)包括但不限于TLR3、TLR7、TLR8的激动剂，其可以是双链RNA(dsRNA)、单链(ss)RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(sh RNA)的形式。这些激动剂可以是不同序列和长度的天然或合成的RNA，其可激活TLR3、TLR7和/或TLR8并激活树突细胞(DCs)和/或其它免疫细胞。
在各种实施方式中，INAS(体外转录RNA或化学合成的寡核糖核苷酸)的免疫刺激活性可以通过一个或更多个下列说明而增加：缺乏甲基化的核苷(包括5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、N7-甲基鸟苷、5-甲基尿苷、2’-O-甲基化的核苷)；缺乏U残基的修饰(包括2-硫尿苷或假尿苷)；缺乏3’聚(A)尾；缺乏5’末端帽结构；存在5’三磷酸部分；最小长度为19个碱基的序列；或对核酸酶的抗性(例如，硫代磷酸酯核苷酸间键合)。示例性非限制序列包括例如：5’pUGGAUCCGGCUUUGAGAUCUU(SEQ ID NO：[[]])；5’ppGGGAGACAGGGGUGUCCGCCAUUUCCAGGUU(SEQ ID NO：)；或5’pppGGGAGACAGGCUAUAACUCACAUAAUGUAUU(SEQ ID NO：)。
在进一步的实施方式中，这些活性剂(INAS或TLR激动剂)是TLR3激动剂，包括但不限于dsRNA，聚肌胞苷酸(聚I:C)；长ds RNA(＞30碱基)；siRNA双链体。
还在其它实施方式中，这些活性剂(INAS或TLR激动剂)是TLR7或TLR8激动剂，其包括但不限于：单链(ss)RNAs；双链(ds)RNAs；短干扰RNA(siRNA)；短发夹RNA(sh RNA)；具有免疫刺激序列/基序的RNA。
在各种其它实施方式中，偶联至靶向部分的生物活性剂(一个或更多个)包括但不限于具有位于siRNA双链体或ds RNA或ss RNA或shRNA的任意链上的5’-UGUGU-3’或5’-UGU-3’基序(一个或更多个)的合成RNAs。示例性序列包括但不限于下列RNAs：5’-CUACACAAAUCAGCGAUUU(SEQ ID NO：)；3’-GAUGUGUUUAGUCGCUAAA(SEQ ID NO：[[]])；5’-UUGAUGUGUU UAGUCGCUA(SEQ ID NO：)；3’-AACUACACAAAUCAGCGAU(SEQ ID NO：)；5’-GAUUAUGUCCGGUUAUGUA(SEQ ID NO：)；3’-CUAAUACAG GCCAAUACAU(SEQ ID NO：)；5’-AUGUAUUGGCCUGUAUUAG(SEQ ID NO：)；3’-UACAUAACCGGACAUAAUC(SEQ ID NO：)；5’-GGUCGGAAUCGAAGGUUUA(SEQ ID NO：)；3’-CCAGCCUUAGCUUCCAAAU(SEQ ID NO：)；5’-GGUCGGAGCUAAAGGUUUA(SEQ ID NO：)；3’-CCAGCCUCGAUUUCCAAAU(SEQ ID NO：)；5’-CAGCUUU GUGUGAGCGUAU(SEQ ID NO：)；3’-GUCGAAACACACUCGCAUA(SEQ ID NO：)。
在各种其它实施方式中，偶联至靶向部分的生物活性剂(一个或更多个)包括但不限于具有位于siRNA双链体或单链RNA或短发夹(sh)RNA的任意链上的5’-GUCCUUCAA-3’基序(一个或更多个)的合成RNAs。在一些实施方式中，这种活性剂具有的RNA的最小长度＝19个碱基并且是TLR9非依赖性的。这些活性剂的示例性序列包括：5’-AGCUUAACCU GUCCUUCAAdTdT-3’(SEQ ID NO：)；5’-UUGAAGGACAGGUUA AGCUdTdT-3’(SEQ ID NO：[[]])；5’-ACCUGUCCUUCAAUUACCAdTdT-3’(SEQ ID NO：)；5’-UGGUAAUUGAAGGACAGGUdTdT-3’(SEQ ID NO：)；5’-AAAAAAAACUGUCCUUCAA(SEQID NO：)；5’-AAAAAAAAAUGUCCUUCAA(SEQ ID NO：)；5’-AAAAAAAAAAGUCCUUCAA(SEQ ID NO：)；5’-UGUCCUUCAAUGUCCUUCAA(SEQ ID NO：)；5’-AGCUUAACCUGUCCUUCAA(SEQ ID NO：)；或5’-AGCUUAACCUGUCCUUCAACUACACAAAUUGAAGGACAGGUUAAGCU(SEQ ID NO：)。
在进一步的实施方式中，这些活性剂是GU-或U-富集的序列。这些活性剂的示例性序列包括但不限于：(G+U)-富集的单链RNA(GU二核苷酸)；聚(U)-富集的ssRNA 5’-UUUUUUUUUUUUUUUUUU(SEQ ID NO：[[]])；
在进一步的实施方式中，这些活性剂是：咪唑喹啉(例如咪喹莫特，瑞喹莫德)；鸟苷核苷酸和类似物(例如罗唑利宾；7-硫代-8-氧-鸟苷；7-脱氮鸟苷；7-烯丙基-8-氧鸟苷)。
在进一步的实施方式中，这些活性剂是RNA序列——具有重复元件、简单重复和邻接重复或一个碱基(腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷酸或黄苷酸)的连续，例如聚(A)、聚(C)、聚(G)、聚(U)、聚(X)、聚(I)。
在本发明的其它实施方式中，生物活性剂是TLR9激动剂，例如单链DNA(ssDNA)或双链DNA(ds DNA)、细菌DNA、病毒DNA或质粒DNA。在一个实例中，这种激动剂包括1型单纯疱疹病毒DNA。
在其它实施方式中，这种TLR9激动剂活性剂是具有CpG的寡脱氧核苷酸(即“CpG DNA”或含有胞苷随后是鸟苷并由磷酸酯键连接的DNA)，例如具有CpG基序的寡脱氧核苷酶[TCGTT或TCGTA或TCGACGX或TCGATCG](甲基化的或未甲基化的)。这种免疫刺激核酸序列的实例包括CpG A：硫代磷酸(*)混合骨架；单一CpG基序(六聚体嘌呤-嘧啶-CG-嘌呤-嘧啶)；CpG侧翼区形成回文结构(自我互补的碱基，其具有形成茎环结构的潜能)；在3’端的聚G尾(可相互作用而形成ODN簇)。(例如，G*G*TGCATCGATGCAG*G*G*G*G*G (SEQ ID NO：[[]]))；CpG B：硫代磷酸骨架；多个CpG基序；TCG(例如，TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT(SEQ ID NO：))；CpG C：硫代磷酸骨架；多个CpG基序；在5’端的TCG二聚体；嵌入中心回文结构的CpG基序(例如，TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(SEQ IDNO：[[]]))；其它CpG化合物：5’-TCGXCGX和5’-TCGXTCG(X＝任意核苷酸)。
在其它实施方式中，这些活性剂以具有游离5’末端的多个拷贝存在，具有硫代磷酸骨架，存在或不存在亲水间隔区(例如，5’TCGACGT(分支的，具有间隔区)；或5’TCGATCG(分支的，具有间隔区))。
在一个实施方式中，本发明提供免疫刺激核酸序列，其含有下式表示的CpG基序：
5’N1X1CGX2N23’
其中至少一个核苷酸分隔连续的CpGs；X1是腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶；X2是胞嘧啶或胸腺嘧啶；N是任何核苷酸，并且N1+N2是约0-26个碱基，限制条件为N1和N2不含有CCGG四聚体或多于一个CCG或CGG三聚体；以及核酸序列的长度为约8-30个碱基。
在另一个实施方式中，本发明提供分离的免疫刺激核酸序列，其含有下式表示的CpG基序：
5’N1X1X2CGX3X4N23’
其中至少一个核苷酸分隔连续的CpGs；X1X2包括GpT、GpG、GpA、ApT和ApA；X3X4包括TpT或CpT；N是任何核苷酸，并且N1+N2是约0-26个碱基，限制条件为N1和N2不含有CCGG四聚体或多于一个CCG或CGG三聚体；以及核酸序列的长度为约8-30个碱基。
在相关的方面，本发明的免疫刺激核酸序列包括X1X2，其选自GpT、GpG、GpA和ApA；以及X3X4，其选自TpT、CpT和GpT。为了促进吸收入细胞，含有CpG的免疫刺激核酸分子的长度可以在8至30个碱基范围内。但是，如果存在足够的免疫刺激基序，任何大小的核酸(甚至几个kb长)都是具有免疫刺激性的，原因在于这种较大的核酸在细胞中被降解为寡核苷酸。另一方面，合成的寡核苷酸不包括在或接近5′和/或3′末端的CGG四聚体或多于一个CCG或CGG三聚体，和/或共有的促有丝分裂CpG基序不是回文结构。延长的免疫刺激可以使用稳定的寡核苷酸获得，其中所述寡核苷酸包含磷酸骨架修饰。例如，所述修饰是硫代磷酸或二硫代磷酸修饰。更具体地，所述磷酸骨架修饰发生在核酸的5’端，例如，核酸5’端的最初两个核苷酸。进一步，所述磷酸骨架修饰可发生在核酸的3’端，例如，核酸3’端的最后五个核苷酸。
一方面，当CpG DNA是寡核苷酸时，CpG DNA的大小在8至30个碱基之间的范围。可选地，CpG二核苷酸可以在质粒中大规模产生，在施用至对象后，其被降解为寡核苷酸。另一方面，核酸分子对B细胞、单核细胞和/或天然杀伤细胞应答(例如细胞因子、增殖、裂解或其它反应)具有相对高的刺激指数。
示例性CpG DNA序列：5’G*G*GGACGACGTCGTGG*G*G*G*G*G 3’(SEQ ID NO：1)-硫代磷酸(*)混合骨架。
在一些实施方式中，本发明的偶联物具有免疫刺激核酸序列(INAS)，其包括具有未甲基化的CpG基序的RNA(CpG RNA)，例如具有硫代磷酸(PS)骨架、未甲基化的CpG基序和3’聚G尾(例如，CpG ORN)的寡核糖核苷酸。这种序列可发挥功能直接激活单核细胞以产生IL-12和间接刺激NK细胞以产生IFN-。示例性CpG ORN序列包括，5’-GGUGCAUCGAUGCAGGGGGG(SEQ ID NO：[[]])；5’-GGUGCUUCGUUGCAGGGGGG(SEQ ID NO：)；5’-GGUGCUUCGAUGCAGGGGGG(SEQ ID NO：)；或5’-GGUGCUACGUUGCAGGGGGG(SEQ ID NO：)。
在一些实施方式中，本发明的偶联物具有生物活性剂，其包括不含有未甲基化的CpG的合成的寡脱氧核苷酸。这种免疫刺激核酸序列的实例包括下列：缺乏规范的CpG基序(GC倒位或甲基化的胞苷)的ss DNA还可激活TLR-9(经由受体-介导的内吞在内体转运之后)；自互补的聚核苷酸，聚(dG、dC)；具有低含量非甲基化CpG序列的DNA；以及具有硫代磷酸(PS*)骨架的非CpG ODN(PS-ODN)。值得注意的是，缺乏CpG基序的PS-ODN可以以CpG-非依赖性方式诱导单核细胞分化成表达高水平的CD83、CD86、CD40和HLA-DR以及低水平的CD14的DC表型，并且分泌CCL3和CCL4β-化学因子。例如，在一些实施方式中，这种TLR9激动剂是T*G*C*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T(SEQ IDNO：[[]])或T*C*C*T*C*C*T*T*T*T*G*T*C*C*T*T*T*T*G*T*C*C*T*T(SEQ ID NO：)。
在一些实施方式中，本发明的偶联物具有生物活性剂，其包括具有免疫刺激基序-PyN(T/A)(T/C/G)(T/C/G)(T/G)GT的寡脱氧核糖核苷酸，其中，Py＝C/T；N＝任意脱氧核糖核苷酸；括号中至少两个位置是Ts；至少20或更多个核苷酸；单链；侧翼序列-5’XX基序XXXX-3。示例性序列包括但不限于5’-TCATCATTTTGT CATTTTGTCATT(SEQ ID NO：[[]])；5’-TCATTATTTTGTTATTTTGTCATT(SEQ ID NO：)；5’-TCATCCTTTTGT CCTTTTGTCATT(SEQ IDNO：)；5’-TCATCTTTTTGT CTTTTTGTCATT(SEQ ID NO：)；5’-TCATCAATTTGT CAATTTGTCATT(SEQ ID NO：)；5’-TCATCATCTTGT CATCTTGTCATT(SEQ IDNO：)；5’-TCATCATGTTGT CATGTTGTCATT(SEQ ID NO：)；5’-TCATCATTCTGT  CATTCTGTCATT(SEQ ID NO：)；5’-TCATCATTGTGT CATTGTGTCATT(SEQ ID NO：)；5’-TCATCATTTGGT CATTTGGTCATT(SEQ IDNO：)；5’-TCATTTTTTTGT TTTTTTGTCATT(SEQ ID NO：)；5’-TCATTGTTTTGT TGTTTTGTCATT(SEQ ID NO：)；5’-TCATTCTTTTGT TCTTTTGTCATT(SEQ IDNO：)。
在一些实施方式中，本发明的偶联物包括核酸序列，所述序列经由视黄酸-可诱导蛋白1(RIG-1)和MDA-5诱导TLR非依赖性免疫刺激。病原体-衍生的核酸的检测涉及两种胞质螺旋酶：视黄酸-可诱导蛋白1(RIG-1)和MDA-5，其对有效的抗病毒防御是必要的。RIG-1识别一组特异的RNA病毒(黄病毒科、副黏液病毒科、正黏液病毒科和弹状病毒科)，而MDA-5负责防御另一组RNA病毒(小核糖核酸病毒科)。区别病毒RNA与被病毒感染的细胞的细胞质中的丰富的自身RNA的结构基础涉及病毒聚合酶产生的RNA的5′-三磷酸末端的(RIG-1)-介导的检测。5′-三磷酸RNA的检测被都是在真核生物转录后RNA加工过程中发生的5′-三磷酸末端的加帽或RNA的核苷修饰而消除。从负链RNA病毒制备的基因组RNA和从病毒-感染细胞(但不来自未感染的细胞)制备的RNA可引发有效的干扰素-α-反应。另外，RIG-1对三磷酸RNA的识别诱导DCs、单核细胞、其它真核细胞中的干扰素反应。这样，该反应不限于免疫细胞。
因此，在各种实施方式中，INAS可包括这样的RNA序列，其具有被RIG-1识别的分子标记(molecular signature)：未加帽的5′-三磷酸RNA(现称为3pRNA)；缺乏5’末端帽结构(7-甲基鸟苷帽)；以及缺乏尿苷修饰(假尿苷或2-硫尿苷或2’-O-甲基化的UTP)。
在其它实施方式中，本发明的偶联物包括编码病毒聚合酶的核酸(DNA或RNA)疫苗(在细胞溶胶中产生未加帽的5′-三磷酸)，例如，但不限于下列：黄病毒科家族正链RNA病毒；分段的NSV(VSV，Flu)；未分段的NSV，包括副黏液病毒和弹状病毒(Rhabdoviruses)。
在其它实施方式中，本发明的偶联物包括最小长度为19个碱基的RNA(5’-三磷酸)(其中不要求具体序列基序并可以是单链或双链)，例如下列体外转录RNA的实例：5’-pppAGCUUAACCUGUCCUUCAA-3’(SEQ ID NO：)；
5’-pppGGGGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU-3’(SEQ ID NO：[[]])；
5’-pppGGGGAUGAACUUCAGGGUCAGCUU-3’(SEQ ID NO：)；
5’-pppGGGGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU-3’
3’-UUCGACUGGGACUUCAAGUAGGGGppp-5’(SEQ ID NO：)。
还在进一步的实施方式中，本发明的偶联物包括经由胞质表达的T7RNA聚合酶的体外转录的三磷酸RNA；体外-产生的病毒基因组序列dsRNA片段(例如，新城疫病毒)；RNA病毒的基因组RNA或从RNA病毒体外产生的RNA(例如，黄病毒科、副黏液病毒科、正黏液病毒科和弹状病毒科)。
还在进一步的实施方式中，本发明的偶联物包括INAS，其可以是长双链RNA、短ds RNA(例如siRNA)或具有平末端的短ds RNA。
还在进一步的实施方式中，INAS可包括具有被MDA-5识别的分子标记的RNA序列，例如长双链RNA或聚(I:C)。
在各种实施方式中，生物活性剂(一个或更多个)是稳定化的核酸序列(一个或更多个)，其经由对免于溶酶体降解的未消化核苷酸的细胞应答来诱导免疫细胞的活化/增殖/存活。
巨噬细胞吞噬在程序性细胞死亡过程中产生的凋亡的垂死细胞并由溶酶体DNase消化DNA。在巨噬细胞和树突细胞中免于溶酶体降解的内源DNA引发Toll-样受体非依赖性基因诱导程序，其导致I型干扰素和激活先天免疫系统的其它细胞因子/化学因子的产生。将内源DNA-免疫球蛋白复合物引入至巨噬细胞或树突细胞激活免疫细胞并引发不依赖于已知TLRs或TLR信号分子(TLR9、TLR3、TLR1-2、TLR5-8；MyD88，TRIF衔接子)的自身免疫。具有DNase缺乏或在凋亡细胞清除方面的缺陷的小鼠或人发生自身免疫。针对与含有核酸-大分子的凋亡碎片相关的自身抗原的交叉-反应性可驱动全身的自身免疫。
肿瘤靶向抗体与INAS的偶联可诱导针对于肿瘤细胞的自身免疫应答，其通过诱导肿瘤细胞的凋亡、增强由巨噬细胞/树突细胞(经由Fc-FcR相互作用)进行的结合的凋亡小体的吸收/内化以及促进免疫细胞激活(经由核酸酶抗性INAS和/或来自损伤的/垂死的/凋亡的肿瘤细胞的未消化的核酸)而进行。
在一些实施方式中，本发明的偶联物包括INAS，其可以是任何稳定/稳定化的核酸序列(ss DNA、ds DNA、ss RNA)，所述核酸序列可模拟由凋亡的DNA进行的TLR依赖性或TLR非依赖性免疫细胞激活。例如，这些生物活性剂可包括：源自凋亡小体中的含有核酸的大分子(核小体)的免疫刺激核酸序列；响应于细胞不良应激和DNA损伤产生的免疫刺激核酸序列；当作为与抗体的偶联物或作为免疫复合物(例如DNA-免疫球蛋白)被引入至巨噬细胞或树突细胞时可激活免疫细胞的核酸序列；被识别为天然危险信号的稳定/稳定化的核酸序列，其引发激活免疫系统的细胞应答。
在一些实施方式中，小核糖核蛋白颗粒(snRNPs)中与凋亡小体相关的ss RNA序列被用作生物活性剂。
这些活性剂的示例性序列包括但不限于：U snRNA序列(或衍生物)：5’-GGACUGCGUUCGCGCUUUCC-3’(SEQ ID NO：[[]])；5’-GGCUUAUCCAUUGCACUCCGGA-3’(SEQ ID NO：)；5’-ACGAAGGUGGUUUUCCCAG-3’(SEQ ID NO：)；5’-UUUGUGGUAGUGGGGGACUG-3’(SEQ ID NO：)；5’-GUAGUGUUUGUGGGGGACUG-3’(SEQ ID NO：)；5’-GUAGUGGGGGACUGUUUGUG-3’(SEQ ID NO：)；5’-GGACUGCGUUGUGGCUUUCC-3’(SEQ ID NO：)；5’-GAUACUUACCUG-3’(SEQ ID NO：)；5’-AAUUUGUGG-3’(SEQ ID NO：)；5’-AAUUUUUGA-3’(SEQ ID NO：)；符合下式的核酸序列：5’-RAUxGR-3’(R＝嘌呤G/A；x＝3-6)。这些活性剂的进一步示例性序列包括但不限于Ro核糖核蛋白(RoRNPs)中的RNA序列，包括hY1-5RNA序列(或衍生物)：5’-GACUAGCUUGCUGUUU-3’(SEQ ID NO：)；5’-GACUAGCCUUU-3’(SEQ IDNO：)。
在另一个实施方式中，核酸序列可包括被识别为危险信号或损伤-相关分子模式(DAMP)的结构或序列，其引发诱导或促进免疫细胞活化、增殖和/或存活的细胞应答。
INAS与结合靶细胞上的分子的靶向部分(抗体、配体、肽、其它)的偶联能够将INAS引入到靶细胞中(经由受体-介导的内吞、电穿孔、其它机制)。INAS可包括被识别为危险信号或DAMP的核酸序列，其引发次级激活免疫系统的靶细胞应答。细胞内核苷酸(INAS)作为危险信号或DAMP的识别诱导免疫细胞激活，其经由靶细胞中的细胞因子/化学因子/共刺激分子(例如干扰素、NKG2D配体)的上调和/或释放、应激的/损伤的/垂死的靶细胞的免疫刺激细胞内蛋白/内源分子(例如，警报素)的上调和/或释放、和/或巨噬细胞/树突细胞对来自垂死或死亡(凋亡的)靶细胞(具有不可降解的INAS)的免疫刺激物质的次级吸收而进行。
在各种实施方式中，本发明的组合物包括靶向部分以及单链(ss)DNA和双链(ds)DNA或RNA(INAS)，所述DNA或RNA引起下列一个或更多个细胞反应的激活：真核细胞中的DNA损伤或应激反应[例如，经由运动失调性毛细血管扩张症突变体(ATM)激酶、Chk2、p53和DNA-磷脂酰肌醇3激酶(PK)的活化]，包括抑制靶细胞增殖(经由细胞周期检验点的活化)和/或诱导靶细胞凋亡(经由内在死亡信号的活化)；TLR依赖性或TLR非依赖性的I型干扰素、其它细胞因子/化学因子/共刺激分子(例如NKG2D配体)的产生和/或释放，其经由转录因子和激酶(例如视黄酸诱导基因1、IKK、TBK1、IRFs、NF-B、p53、Chk2)活化进行；由应激的/损伤的/垂死靶细胞进行的免疫刺激细胞内蛋白/内源分子(例如PAMPs、DAMPs、警报素)的上调和/或释放。
另外，本发明的偶联物的施用可诱导靶细胞(肿瘤细胞或肿瘤微环境中的细胞)的应激反应，其引起免疫细胞的成熟、活化、增殖和/或存活[例如经由配体、细胞因子、化学因子和/或免疫细胞的共刺激信号和/或内源危险信号的增加的表达和/或释放]。例如，在一些实施方式中，施用引起警报素——防卫素、cathelicidins、高速泳动族蛋白盒1(HMGB1)、S100蛋白、肝细胞瘤衍生生长因子(HDGF)、嗜曙红细胞衍生神经毒素(EDN)、热休克蛋白、IL-1α、尿酸、半乳凝集素、胸腺素、核仁素、膜联蛋白、任何疏水蛋白部分(Hyppo)或其它防御效应子——的释放。
免疫系统对被感知为与危险情况例如感染相关的抗原作出反应。危险信号通过刺激树突细胞成熟发挥作用，以使它们可呈递外源抗原并刺激T淋巴细胞。例如，经由一组识别病原体-相关分子模式(PAMPs)的受体，多细胞动物检测病原体。也已发现垂死的哺乳动物细胞释放危险信号(危险相关分子模式)，其促进对与受损细胞相关的抗原的免疫应答。经由垂死/死亡细胞释放的细胞内蛋白/内源分子(称为“警报素”)的受体-介导的检测，组织/细胞损伤被识别。警报素代表一群结构多样的多功能宿主蛋白，其在病原体激发和/或细胞死亡后被快速释放、能够募集并激活抗原-呈递细胞。这些有效的免疫刺激物——包括防卫素、cathelicidins、嗜曙红细胞衍生神经毒素和高速泳动族蛋白盒1——发挥激活先天和获得性免疫系统的预警信号的作用。警报素包括发出免疫应答信号/激活免疫应答的细胞内组分。
警报素可结合TLRs、IL-1R、RAGE或其它受体。先天和获得性免疫性的效应细胞可经由非经典途径分泌警报素并在它们被PAMPs或其它警报素激活时通常如此。因此，内源警报素和外源PAMPs传达类似信息并引发类似反应；它们可以被认为是较大组的亚群：损伤-相关分子模式(DAMPs)。PAMPs和警报素可协同加强免疫细胞的激活。另外的警报素是如下进一步公开所知的(下文，在肽之下)。
在各种实施方式中，本发明的偶联物包括靶向部分，所述靶向部分被偶联至被识别为危险信号或DAMP的一个或更多个稳定/稳定化核酸序列，所述危险信号或DAMP引发导致免疫细胞活化的靶细胞应答。示例性序列包括ss DNA(不需要CpG序列；TLR非依赖性)：5’-AAG AGG TGG TGG AGG AGG TGG TGG AGGAGG TGG AGG-3’(SEQ ID NO：)；5’-TTG AAT TCC TAG TTT CCC AGA TACAGT-3’；5’-TCG GTA ACG GG-3’(SEQ ID NO：)；5’-TTA GGG TTA GGG TTAGGG-3’(SEQ ID NO：)；5’-CGTTA-3’(SEQ ID NO：)；5’-GCCACTGC-3’(SEQ ID NO：)；5’-GCAGTGGC-3’(SEQ ID NO：)。
在进一步的实施方式中，这些活性剂包括人端粒DNA序列-(TTAGGG)n重复；聚G基序；双链B-形DNA(TLR非依赖性；不需要CpG序列)；线性化的质粒DNA；具有大缺口的环状DNA；单链环状噬菌粒、ds RNA或ss RNA。
与细胞损伤/应激相关的内源危险信号的上调和/或释放促进DC募集、抗原吸收、成熟和抗原呈递和抗肿瘤T细胞的共刺激/引发。因此，在本发明的各种实施方式中，一个或更多个靶向部分被偶联至一个或更多个生物活性剂，所述生物活性剂包括INAS和另外的活性剂例如DAMPs和/或警报素。
还在另一个实施方式中，本发明的偶联物包括靶向部分，其被偶联至例如编码或非编码核酸序列(一个或更多个)的活性剂，所述活性剂促进由来自应激的、损伤的或垂死/凋亡的靶细胞的免疫刺激分子引发的靶细胞死亡和次级免疫活化。
例如，这些活性剂包括：稳定/稳定化的编码或非编码核酸序列，所述核酸序列激活死亡信号传导反应，所述反应产生由免疫原性凋亡物质引发的凋亡和次级免疫活化；稳定/稳定化的编码或非编码核酸序列，其经由免疫原性凋亡物质引发的对存活基因表达的抑制和次级免疫活化而促进靶细胞死亡(凋亡)，。
在本发明的另一方面，核酸可形成二级结构。这些二级结构通常分为螺旋(邻接碱基对)和各种环(被螺旋围绕的未配对核苷酸)。茎环结构——其中碱基配对的螺旋终止在短未配对环中——是极为常见的，并且是更大结构基序的构建块(building block)，所述更大结构基序例如三叶草结构，其为四螺旋连接。内部环(在较长配对螺旋中短串的未配对碱基)和凸起(螺旋的一条链具有“额外的”插入碱基而在对应链不具有配对部分的区)也是常见的。
例如，茎环分子内碱基配对是可发生在核酸分子内的模式。该结构也称为发夹或发夹环，其发生在当同一分子的两个区域——通常是核苷酸序列中的回文结构——碱基配对以形成终止在未配对环中的双螺旋时。
茎环结构的形成取决于产生的螺旋和环区的稳定性。因此，第一个先决条件是存在可自我返折以形成配对双螺旋的序列。该螺旋的稳定性是由它的长度、它含有的错配或凸起的数量(少量是可以容忍的，尤其是在长螺旋中)以及配对区的碱基组成决定的。鸟嘌呤和胞嘧啶之间的配对具有三个氢键，与仅具有两个氢键的腺嘌呤-胸腺嘧啶配对相比更加稳定。碱基堆积相互作用——其将碱基芳环的π轨道以有利的方向排列——可促进螺旋形成。
环的稳定性还影响茎环结构的形成。小于三个碱基长的“环”在空间上是不可能的并且不能形成。示例性环长度可以是约4-8个碱基长。
例如，回文DNA序列
---CCTGCXXXXXXXGCAGG---
可形成下列发夹结构
    ---C G---
       C G
       T A
       G C
       C G
       X X
      X   X
       X X
        X
已观察到自然发生的二级结构例如基因外重复回文(REP)序列刺激免疫系统。Magnusson等The Journal of Immunology，2007，179：31-35。术语“REP序列”包括重复并且回文的序列，其具有21和65个碱基之间的长度。已在一些细菌基因组的基因外空间检测到REP序列，其组成＞0.5％的全部基因外空间。这些序列存在于许多革兰氏阴性细菌中并在DNA生理学和基因组可塑性中发挥重要作用。强免疫刺激ODNs——其包括基序，例如REPs——可以用于本发明，原因在于它们具有合适的长度并且是回文的。REPs回文性使人想象它们会采用的可能的茎环二级结构。DNA二级或三级结构可赋予REPs较高稳定性和DNase抗性。另外，REPs具有作为细菌免疫识别靶的两个另外的有利特征：丰度和保守性。ODNs——其包括来自革兰氏阴性人病原体例如大肠杆菌、伤寒沙门菌(S.enterica typhi)、脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)和绿脓杆菌(P.aeruginosa)的REPs——产生先天免疫系统刺激，其由TLR9受体介导。Magnusson等The Journal of Immunology，2007，179：31-35。通过TLR9的检测被认为通过REPs可能采用的稳定的茎环二级结构而促进。DNA三级结构——甚至在变性条件下也是稳定的——还可刺激IFN-α释放。
在各种实施方式中，本发明的靶向部分-生物活性剂偶联物包括核酸分子，所述核酸分子依赖它的二级结构发挥免疫刺激分子的功能。在一个实施方式中，具有天然磷酸二酯骨架的dsODNs可以用于模拟二级结构，例如在REPs中所见的。因此，双链磷酸二酯寡核苷酸——具有来自细菌，例如大肠杆菌、伤寒沙门菌、脑膜炎奈瑟球菌和绿脓杆菌的代表性REPs的序列——可以用于激活促炎性细胞因子例如IFN-α的产生。在另一个实施方式中，可以使用具有合成骨架的dsODNS。还在另一个实施方式中，可以使用ssODNs，其形成二级和三级免疫刺激结构。在各种这些实施方式中，靶向部分是对存在于肿瘤细胞上的组分具有特异性的抗体。在其它各种这些实施方式中，靶向部分是对存在于病原体(例如，细菌或病毒)上的组分具有特异性的抗体。
如基于全部本公开内容会证实的，一个或更多个靶向部分被偶联至一个或更多个生物活性剂，所述生物活性剂包括一个或更多个核酸分子/序列。在各种实施方式中，活性剂包括诱导免疫细胞(例如树突细胞、T淋巴细胞、天然杀伤细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞)活化、增殖和/或存活的一个或更多个核酸序列(称为：免疫刺激核酸序列＝INAS)。INAS可包括下列任一种：病原体-相关分子模式(PAMP)或其它序列/结构，其直接诱导TLR依赖性或TLR非依赖性免疫细胞活化/增殖/存活；和/或稳定或稳定化的核酸序列/结构，其经由对免于溶酶体降解的未消化核苷酸的细胞应答而诱导免疫细胞活化/增殖/存活；被识别为引发激活免疫系统的细胞应答的天然危险信号或损伤-相关分子模式(DAMP)的核酸序列/结构；和/或编码或非编码核酸序列，其促进由来自应激的、损伤的或垂死/凋亡的靶细胞的免疫刺激分子引发的靶细胞死亡和次级免疫活化；和/或核酸分子，其依赖它的二级结构发挥免疫刺激分子的功能。
在另一个实施方式中，INAS可以偶联于抗体(或片段)、配体、肽、适配子或其它肿瘤靶向部分。可以通过任何方法——包括受体-介导的内吞或电穿孔——来促进偶联物向肿瘤靶或免疫细胞的进入。
在一个实施方式中，在针对相同或不同靶细胞组分的多个靶向部分的情况下，以及在一个或更多个相同或不同生物活性剂的情况下，本发明的偶联物是多价分子。因此，例如，在各种实施方式中，本发明通过利用不同组合生物活性剂，产生协同治疗效果。
在各种实施方式中，偶联至抗体或靶向部分的INAS可以是裸质粒DNA或诱导特定基因表达的编码免疫刺激核酸序列(DNA、RNA)。在一个实施方式中，编码核酸是小环。
因此，在一个实施方式中，施用包括至少靶向部分以及编码感兴趣基因的核酸分子的组合物，使得能够进行靶细胞类型的靶向(即，其靶向部分对特定细胞类型(例如，肿瘤细胞或其它细胞)具有特异性)，感兴趣基因的表达以及针对靶细胞的免疫应答的同时激活(抗体-介导的质粒内吞作用和经由细胞内环状非复制附加体的基因靶向表达：抗体-介导的非病毒基因免疫治疗)。
在各种实施方式中，针对靶细胞组分(例如针对于HER2、EGFR、其它)的抗体或靶向部分偶联于质粒载体，所述质粒载体选自：裸质粒DNA；表达自我复制RNA载体的质粒复制子(基于复制酶的核酸-DNA或RNA，例如α病毒复制子或辛德比斯病毒(Sindbis virus)复制子)；编码病毒RNA聚合酶的质粒；或质粒，其编码感兴趣的基因例如靶/肿瘤抗原(DNA疫苗)、免疫刺激分子(细胞因子、共刺激分子或其它免疫刺激分子例如内源危险信号，例如警报素、TLR激动剂)、膜结合Fc片段或Fc受体(FcR)(例如CD32a)或促进靶细胞死亡的分子(例如死亡受体-TRAIL-受体，Fas；死亡配体-TRAIL，FasL)。在各种实施方式中，这种肿瘤-靶向抗体或靶向部分可以被设计为靶向本文公开的任何靶细胞组分(例如HER2、EGFR等)。
在一些实施方式中，偶联于抗体或靶向部分的INAS可以是抑制特定基因表达的免疫刺激核酸(siRNA或反义或shRNA)。这可允许肿瘤细胞两个组分的双特异性靶向，同时激活针对靶细胞的免疫应答。在一个实施方式中，针对靶细胞组分(例如HER2)的抗体偶联于沉默存活基因的siRNA或沉默存活基因的核酶。在进一步的实施方式中，这种肿瘤-靶向抗体偶联于沉默免疫抑制分子(例如，吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO))表达的siRNA或核酶。
一方面，偶联于抗体的INAS可以是免疫刺激适配子(RNA或DNA)，所述适配子也可结合肿瘤细胞/肿瘤血管/肿瘤微环境或免疫细胞(例如，巨噬细胞或树突细胞或其它)的组分。这可允许肿瘤细胞两个组分的双特异性靶向，同时激活针对靶细胞的免疫应答。
因此，在各种实施方式中，肿瘤-靶向抗体偶联于靶向另一个肿瘤抗原或受体(例如雌激素受体；EGFR，本文公开的任何组分)的INAS适配子；肿瘤-靶向抗体偶联于靶向树突细胞(DC)受体的INAS适配子；肿瘤-靶向抗体偶联于靶向死亡受体(例如，TRAIL-受体或CD95/Fas)的INAS适配子；或针对死亡受体的肿瘤-靶向抗体偶联于靶向肿瘤抗原或受体(例如，HER-2)的INAS适配子；还在另一个实施方式中，INAS偶联于雌激素受体(ER)结合分子(例如它莫西芬(tamoxifen))。
在本文公开的任何上述实施方式和以下实施方式中，肿瘤-靶向抗体可以被设计为靶向肿瘤抗原或肿瘤相关抗原(即，本文所述的细胞组分，例如HER2、EGFR等)。
在另一个实施方式中，INAS偶联于抗体，所述抗体结合一个或更多个肿瘤抗原/表位或来自病原体的抗原。包括抗原(一个或更多个)和抗体-INAS的免疫复合物可用于产生针对特定肿瘤抗原或病原体衍生抗原的免疫应答。
在另一个实施方式中，INAS偶联于针对免疫细胞(DC或其它)组分的抗体。该INAS-抗体偶联物可以次级偶联于一个或更多个肿瘤抗原/表位或来自病原体的抗原。抗原-抗体-INAS免疫复合物可用于产生针对特定肿瘤抗原或病原体衍生抗原的免疫应答。例如，活性剂可包括INAS和偶联于针对DC抗原吸收受体的抗体的抗原。
在另一个实施方式中，INAS和抗原偶联于靶向免疫细胞抗原或受体(例如，针对CD40、CD28等)的抗体。
在进一步的实施方式中，INAS偶联于针对免疫细胞抗原或受体(例如，CD40，T细胞抗原，例如CD3、CD4等)的抗体。这种INAS的实例包括沉默特定分子例如GATA-3、IDO等的表达的siRNA。
在一些实施方式中，INAS偶联于Fc蛋白或抗原-Fc融合蛋白，其中所述抗原是肿瘤抗原或病原体-衍生的表位。INAS-Fc偶联物或INAS-抗原-Fc偶联物可用于产生针对特定肿瘤抗原或病原体-衍生抗原的免疫应答。
在另一个实施方式中，双特异性抗体结合特定肿瘤抗原(抗肿瘤抗体)以及免疫刺激核酸(INAS-DNA或RNA)(抗INAS抗体)。这些含有核酸的免疫复合物(结合至INAS和凋亡的细胞)在被巨噬细胞和树突细胞吞噬后，可激活内体TLR-介导的或TLR非依赖性的免疫应答。这可诱导针对源自抗体-结合的凋亡肿瘤细胞的抗原(患者-特异性肿瘤DNA疫苗)的自身免疫应答。
在另一个实施方式中，免疫刺激核酸序列(INAS)偶联于双特异性抗体，所述抗体结合特定肿瘤抗原以及被该抗体结合后激活死亡信号传导的死亡受体。双特异性抗体诱导靶向肿瘤细胞的凋亡，并且凋亡的细胞(含有结合至INAS的免疫复合物)在被巨噬细胞和树突细胞吞噬后可激活内体TLR-介导的或TLR非依赖性的免疫应答。这可诱导针对源自抗体-结合的凋亡肿瘤细胞的抗原(患者-特异性肿瘤DNA疫苗)的自身免疫应答。
在另一个实施方式中，免疫刺激核酸序列(INAS)偶联于双特异性抗体，所述抗体结合特定肿瘤抗原以及免疫细胞，例如树突细胞。双特异性抗体诱导靶向肿瘤细胞的凋亡，并且凋亡的细胞(含有结合至INAS的免疫复合物)在被巨噬细胞和树突细胞吞噬后可激活内体TLR-介导的或TLR非依赖性的免疫应答。这可诱导针对源自抗体-结合的凋亡肿瘤细胞的抗原(患者-特异性肿瘤DNA疫苗)的自身免疫应答。
在另一个实施方式中，本发明的偶联物(例如抗体-INAS或靶向部分-INAS偶联物)被设计为能够进行双病原体-相关分子模式的组合检测，例如，dsRNA和DNA，以模拟明确的病毒识别，产生可用于肿瘤接种或免疫治疗的增强的先天免疫应答。在一个实施方式中，偶联物包括编码病毒RNA聚合酶或RNA复制子的质粒CpG DNA。在另一个实施方式中，偶联物包括与DNA-RNA杂交物INAS(DNA+RNA)偶联的抗体。
在另一个实施方式中，本发明的偶联物(例如靶向部分-INAS或抗体-INAS偶联物)还可以次级偶联/连接至另一个INAS(DNA或RNA)或INAS非依赖性免疫刺激分子，例如另一个PAMP、损伤-相关分子模式(DAMP)、Toll-样受体配体、TLR非依赖性免疫刺激配体或免疫刺激危险信号，包括但不限于下列：TLR配体：(自然发生的、合成的类似物或完全合成的小分子)；TLR1(例如三酰基脂肽)；TLR2(例如脂蛋白/脂肽、肽聚糖、脂磷壁酸、脂阿拉伯甘露聚糖、非典型脂多糖、二-和三酰基脂肽、HSP70)；TLR3(INAS，例如ds RNA、聚肌胞苷酸，其它激动剂)；TLR4[例如脂多糖、紫杉醇、HSP60(肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae))，LPS/类脂A模拟物，例如单磷酰基类脂A、合成的类脂A、E5564、Ribi529、透明质酸寡糖、透明质烷(HA))；TLR5(例如细菌鞭毛蛋白、不连续的13-氨基酸肽；TLR6(例如二酰基脂肽)；TLR7(INAS，例如ss RNA、寡核苷酸、罗唑利宾、瑞喹莫德、咪喹莫特，其它激动剂)；TLR8(INAS，例如ssRNA，其它激动剂)；TLR9(INAS，例如细菌或病毒DNA、CpG寡脱氧核苷酸、非CpG DNA，其它激动剂)；免疫刺激危险信号，其包括但不限于警报素，例如防卫素、cathelicidins、高速泳动族蛋白蛋白盒1(HMGB1)、S100蛋白、肝细胞瘤衍生生长因子(HDGF)、嗜曙红细胞衍生神经毒素(EDN)、热休克蛋白(包括hsp70、hsp90、gp96eHsp例如Hsp72、其它)、IL-1、尿酸、半乳凝集素、胸腺素、核仁素、膜联蛋白或任何疏水蛋白部分(Hyppo)。
在各种实施方式中，INAS可以是DNA或RNA或DNA/RNA杂交物序列，其源自任何下列种类：病原体-衍生的核酸，其包括免疫刺激病原体/生物体(弱化的或存活的或被杀灭的)；源自病原体/生物体的基因组DNA或RNA序列；相应于病原体或生物体基因组的部分的合成的DNA或RNA“模拟物”(例如，衍生物和类似物)。
(1)2.编码感兴趣基因的核酸
在本发明的另一方面，提供的组合物和方法包括偶联至编码一个或更多个感兴趣多肽的线性或环状核酸分子的靶向部分。因此，在一些实施方式中，核酸分子表达(即转录和/或翻译)感兴趣的基因。这种编码核酸分子的实例包括但不限于病毒载体、质粒、小环、线性和环状dsDNA。在一个实施方式中，本发明的组合物包括本文所述的偶联至活性剂的靶向部分，所述活性剂是编码感兴趣的肽或多肽的核酸分子。以该方式编码和表达的多肽包括本文公开的和本领域已知的肿瘤和感染因子抗原，其会增强或刺激对象的免疫应答。因此，靶向部分靶向特定细胞或组织并有效地递送编码所期望的具有免疫刺激的产物的核酸分子。
可以使用这种机制来提供针对特定疾病或感染因子的接种，以及提供增强或增加免疫应答的方法。表达载体是广泛使用并已知的，并且可以适用于本发明的组合物和方法。实例在美国专利号7,049,098、6,143,530、7,384,744、7,279,568、7,262,014、6,977,296和6,692,750；以及美国专利申请公开号2008/0145376、2006/0281703、2006/0211117、2004/0214329和2004/0209836中提供。
质粒。在各种实施方式中，可以通过几种类型的DNA构建体介导接种。例如，在一个实施方式中，本发明的偶联物包括完全环状质粒DNAs以递送感兴趣的基因。这些环状双链DNA构建体源自细菌，并且不但含有感兴趣的基因连同哺乳动物特异性启动子和终止子，而且含有在细菌细胞中复制和维持所需的元件(包括复制起点和抗生素抗性盒)。这种表达载的实例是已知的并可应用于本发明内容。
小环。如本文所述，在一个实施方式中，本发明的偶联物包括DNA小环，其可用于编码并表达所期望的感兴趣的基因。小环在改进感兴趣基因的表达以及DNA疫苗整体安全性的努力中显现出来。小环由质粒DNA重组形成，所述重组形成两部分——小环和小质粒。重组后，小环仅含有DNA疫苗的基本元件，即，哺乳动物特异性启动子、感兴趣的基因和终止子。小环还可含有其它序列，例如重组位点，但可被设置为含有尽可能小的DNA。小质粒含有所有其它质粒复制、维持和细菌衍生序列，它们在DNA疫苗中通常是不必要或不需要的。小环疫苗的一个实例是Chen等(Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result inpersistent and high-level transgene expression in vivo，Molecular Therapy 8(3)，2003；Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmidbacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo.HumanGene Therapy(16)p 126-131，2005)中的小环疫苗。该小环系统具有四个关键组分。前两个由ΦC31重组酶的DNA编码序列和它的识别序列(在构建体中重复两次)组成。在细菌中产生的过程中，ΦC31的表达被诱导并引起亲本质粒重组至小环(含有DNA疫苗部分)和小质粒。另外的两个关键组分由序列特异性限制性核酸内切酶I-SceI的DNA编码序列和在质粒骨架中编码的它的识别序列组成。重组后，小质粒被I-SceI切割并线性化，并降被内源细菌核酸内切酶降解。然后通过标准质粒纯化方法纯化小环。
还在另一个实施方式中，本发明的偶联物包括编码感兴趣基因的线性DNA构建体。在这些构建体中，使用聚合酶链反应(PCR)来扩增编码DNA疫苗的构建体(即启动子、抗原、终止子)。扩增的构建体通常被工程化为对细胞核酸酶具有抗性来防止在体内使用时降解。例如，Johansson等(PCR-generated linear DNA fragmentsutilized as a hantavirus DNA vaccine，Vaccine 20p.3379-3388，2002)使用硫代磷酸-修饰的PCR引物来扩增它们的DNA疫苗构建体，以防止接种时核酸外切酶降解。
还在另一个实施方式中，本发明的偶联物包括最低要求的、免疫学确定的基因表达(minimalistic，immunologically defined gene expression，MIDGE)。MIDGE是最小尺寸的基因转移单位，其含有表达盒，包括启动子、基因和RNA-稳定序列，两侧为两个短发夹寡核苷酸序列。产生的载体是小的、线性、共价闭合的哑铃形分子。不编码所期望基因的DNA被减少至最小。
在进一步实施方式中，偶联物包括得两个不同核酸分子杂交的核酸修饰。例如，dsDNA(环状质粒/小环或线性DNA)被修饰为并入核苷酸序列，所述核苷酸序列以位点特异性方式与寡核苷酸杂交并结合。因此，如果靶向部分偶联至寡核苷酸，该寡核苷酸可以进而连接至表达载体(例如，dsDNA)。在一个可选的实施方式中，如果本发明的靶向部分偶联至表达载体，该表达载体可以进而连接至寡核苷酸。在任意情况下，寡核苷酸可以基于其作为PAMP、DAMP、TLR激动剂或警报素的性质被预先-选择。
a)表达调节序列
在进一步的实施方式中，所期望的感兴趣基因的表达由核酸分子引起，所述核酸分子包括“启动子”，启动子是控制序列，其为在该处控制转录起始和速率的核酸序列区域。它可含有遗传元件，调节蛋白和分子可在所述遗传元件处结合，例如RNA聚合酶和其它转录因子。术语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在控制下”和“在转录控制下”意思是启动子相对于核酸序列(即ORF)处于正确的功能定位和/或方向以控制那个序列的转录起始和/或表达。启动子可以与“增强子”联合使用或可以不如此，增强子是指涉及核酸序列转录激活的顺式作用调节序列。
通过在重组或异源启动子控制下设置编码核酸片段，会获得某些优势，所述重组或异源启动子是指在它的天然环境中通常地不与核酸序列相关的启动子。重组或异源增强子还指在它的天然环境中通常地不与核酸序列相关的增强子。这种启动子或增强子可包括其它基因的启动子或增强子，和从任何其它原核、病毒或真核细胞分离的启动子或增强子，和非“自然发生的”启动子或增强子——即，含有不同转录调节区的不同元件和/或改变表达的突变。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列外，还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术包括PCR.TM.产生与本文公开的组合物有关的序列(参见美国专利号4,683,202，美国专利号5,928,906，每个通过引用并入本文)。另外，可预期的是，在非核细胞器例如线粒体、叶绿体等等中指导序列转录和/或表达的控制序列也可以使用。但是，在某些实施方式中，启动子可以是天然地与基因或序列相关的启动子，如可以通过分离位于编码片段和/或外显子的上游的5′非编码序列而获得。这种启动子可以称为“内源的”。类似地，增强子可以是天然地与核酸序列相关的增强子，其位于该序列的下游或上游。
自然地，采用有效地指导DNA片段在选择用于表达的细胞器、细胞、组织和生物中表达的启动子和/或增强子将是重要的。分子生物学领域技术人员通常知晓用于蛋白表达的启动子、增强子和细胞类型组合的使用，例如，参见Sambrook等(1989)，其通过引用并入本文。使用的启动子可以是组成型、组织-特异型、诱导型和/或可用于在合适的状况下指导引入的DNA片段的高水平表达。在各种实施方式中，人巨细胞病毒(CMV)即时早期基因启动子、SV40早期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列、β-肌动蛋白、大鼠胰岛素启动子以及3-磷酸甘油醛脱氢酶可用于获得感兴趣的编码序列的高水平表达。如果表达水平对于给定目的是足够的，那么，使用本领域已知的其它病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子来获得感兴趣的编码序列的表达也是预期的。通过利用具有熟知性质的启动子，转染或转化之后感兴趣蛋白的表达水平和模式可被最优化。
选择响应于具体生理或合成信号被调节的启动子可允许基因产物的可诱导表达。一个会有用的熟知的可诱导系统是Tet-Off.TM.或Tet-On.TM.系统(Clontech，Palo Alto，Calif.)，其最初由Gossen和Bujard开发(Gossen和Bujard，1992；Gossen等人，1995)。该系统还可允许高水平基因表达响应于四环素或四环素衍生物例如强力霉素被调节。在Tet-On.TM.系统中，在存在强力霉素的情况下基因表达被开启；而在Tet-Off.TM.系统中，在缺乏强力霉素的情况下基因表达被开启。这些系统基于源自大肠杆菌的四环素抗性操纵子的两个调控元件。四环素操纵子序列被四环素阻抑物结合和四环素阻抑蛋白结合。感兴趣的基因被克隆至启动子后的表达元件中，所述启动子中存在四环素-反应元件。第二质粒含有称为四环素-控制反式激活蛋白的调控元件，其在Tet-Off.TM.系统中由来自单纯疱疹病毒的VP16结构域和野生型四环素阻抑物组成。因此，在缺乏强力霉素的情况下，转录是组成型开启的。在Tet-On.TM.系统中，四环素阻抑物不是野生型的，并在存在强力霉素的情况下激活转录。对于基因治疗载体生产，Tet-Off.TM.系统将是优选的，以使产生细胞在存在四环素或强力霉素的情况下会生长并防止可能的毒性转基因的表达，但当载体被引入至患者时，基因表达将是组成型开启的。
在一些情况下，期望的是在基因治疗载体中调节转基因的表达。例如，取决于所期望的表达水平，使用具有不同活性强度的不同病毒启动子。在哺乳动物细胞中，通常使用CMV即时早期启动子来提供强的转录活化。当期望降低的转基因表达水平时，也使用了具有较差效力的CMV启动子的修饰形式。当期望转基因在造血细胞中表达时，通常使用逆转录病毒启动子，例如来自MLV或MMTV的LTRs。根据期望的作用使用的其它病毒启动子包括SV40、RSV LTR、HIV-1和HIV-2LTR，腺病毒启动子，例如来自E1A、E2A或MLP区，AAV LTR，HSV-TK和禽肉瘤病毒。类似的组织特异性启动子用于在特定组织或细胞中引起转录，以降低对非靶向组织的可能毒性或不期望的作用。例如，启动子例如PSA相关启动子或前列腺-特异性腺体激肽释放酶。
在某些情况中，期望的是在施用基因治疗载体后的特定时间激活转录。这是使用这样的启动子进行的，例如激素或细胞因子可调节的那些启动子。可以使用的细胞因子和炎性蛋白反应启动子包括K和T激肽原(Kageyama等人，1987)、c-fos、TNF-α、C-反应蛋白(Arcone等人，1988)、结合珠蛋白(Oliviero等人，1987)、血清淀粉样蛋白A2、C/EBP α、IL-1、IL-6(Poli和Cortese，1989)、补体C3(Wilson等人，1990)、IL-8、α-1酸性糖蛋白(Prowse和Baumann，1988)、α-1抗胰蛋白酶、脂蛋白脂酶(Zechner等人，1988)、血管紧张肽原(Ron等人，1991)、纤维蛋白原、c-jun(可由佛波酯、TNF-α、UV辐射、视黄酸和过氧化氢诱导)、胶原酶(可由佛波酯和视黄酸诱导)、金属硫蛋白(重金属和糖皮质激素诱导)、溶基质蛋白酶(可由佛波酯、白细胞介素-1和EGF诱导)、α-2巨球蛋白和α-1抗胰凝乳蛋白酶。
i.增强子
增强子是增加启动子转录的遗传元件，其位于同一DNA分子的远位置。增强子的组成与启动子非常类似。即，它们由许多单独的元件组成，每个元件结合一个或更多个转录蛋白。增强子和启动子之间的基本区别是操作性(operational)。增强子区作为整体必须能够在一定距离刺激转录；这不必适用于启动子区或其组件。另一方面，启动子必须具有在特定位点并以特定方向指导RNA合成的起始的一个或更多个元件，而增强子缺乏这些特异性。启动子和增强子通常是重叠并相邻的，通常看起来具有非常类似的模块结构。
任何启动子/增强子组合(按照真核启动子数据库EPDB)都可用于驱动基因表达。如果合适的细菌聚合酶作为递送复合物的部分或作为另外的遗传表达构建体的形式被提供，那么真核细胞可支持某些细菌启动子引起的胞质转录。
c).聚腺苷酸化信号
当使用cDNA插入物时，通常期望包括聚腺苷酸化信号以引起基因转录物的适当聚腺苷酸化。不认为聚腺苷酸化信号的性质对本发明的成功实践是至关重要的，并且使用任何这种序列，例如人或牛生长激素和SV40聚腺苷酸化信号。也预期作为表达盒的元件的是终止子。这些元件可发挥增强信息水平并最小化从该盒至其它序列的通读的作用。
d)起始信号和内部核糖体结合位点
特定的起始信号对于编码序列的有效翻译也可被需要。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域技术人员将容易地能够确定这一点并提供必要的信号。熟知的是，起始密码子必须符合所期望的编码序列的阅读框的读框以确保全部插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。表达效率可以通过包含合适的转录增强子元件而增强。
在本发明的某些实施方式中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5′甲基化帽依赖性翻译的核糖体-扫描模型并在内部位点起始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已描述来自小核糖核酸病毒科的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Samow，1991)。IRES元件可以连接于异源可读框。多个可读框可以被一起转录，每个可读框被IRES分开，产生多顺反子信息。由于IRES元件，每个可读框可接近核糖体进行有效翻译。使用单一启动子/增强子来转录单一信息，多个基因可以被有效地表达(参见美国专利号5,925,565和5,935,819，每个通过引用并入本文)。
启动子可以是异源或内源的。例如，多核苷酸启动子序列选自组成型启动子(即猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子、人免疫缺陷病毒长末端重复启动子、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、禽白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、人肌动蛋白(action)启动子、人肌球蛋白启动子、人血红蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1-α启动子以及人肌肉肌酸启动子)，诱导型启动子(即金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子以及四环素启动子)以及组织特异性启动子(即树突细胞(即CD11c)、PSA相关启动子或前列腺-特异性腺体激肽释放酶)。可以并入本发明的组合物和方法的各种启动子元件的另外的实例是已知的，例如各种调节序列数据库中公开的那些启动子：组织特异性启动子数据库(Tissue Specific PromoterDatabase)，可从tiprod.cbi.pku.edu.cn：8080/index.html获得；真核启动子数据库(Eukaryotic Promoter Databse)，可从http://www.epd.isb-sib.ch/获得；直向同源启动子数据库(Database of Orthologous Promoters)http://doop.abc.hu。
这些启动子可以基于本发明的组合物被递送的靶细胞或组织来选择，以提供所期望的基因产物的表达。另外，在靶向中选择性的另一个水平包括利用对所期望的细胞或组织类型具有选择性的靶向部分。例如，在这种实施方式中，组合物包括对细胞类型具有特异性的靶向部分，以及进一步包括编码所期望抗原的核酸分子，并且其表达是在对细胞-类型具有特异性的启动子的控制下。
在另一可选的实施方式中，组合物包括两个不同靶向部分，其中一个是细胞-类型特异性的和另一个是疾病特异性的(例如，靶向肿瘤抗原或与感染因子相关的抗原)。因此，这种组合物的通式可表示为T1-T2-A1-A2或其变化，其中T1＝靶向部分1和T2＝靶向部分2。另外，这种组合物可包括一个或更多个非编码免疫刺激核酸分子、一个或更多个抗原肽和一个或更多个编码抗原多肽或共刺激多肽的核酸分子。
B.肽-共刺激
如本文所述，在各种实施方式中，本发明的组合物包括具有免疫刺激性的核酸分子。在本发明的另一方面，本发明的组合物包括多肽或编码刺激对象免疫应答的多肽的核酸。
先天免疫系统使用一组种系(germline)-编码的受体来识别微生物中存在的保守的分子模式。这些分子模式发生在微生物的某些组分中，包括：脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸、磷脂酰胆碱、细菌-特异性蛋白——包括脂蛋白、细菌DNAs、病毒单链和双链RNAs、未甲基化的CpG-DNAs、甘露聚糖以及各种其它细菌和真菌细胞壁组分。这些分子模式还可发生在其它分子例如植物生物碱中。这些先天免疫识别的靶被称为病原体相关分子模式(PAMPs)，原因在于它们由微生物产生而不由感染的宿主生物产生(Janeway等人，1989；Medzhitov等人，1997)。
识别PAMPs的先天免疫系统的受体被称为模式识别受体(PRRs)(Janeway等人，1989；Medzhitov等人，1997)。这些受体在结构上不同并属于几个不同的蛋白家族。这些受体中的一些直接识别PAMPs(例如，CD14、DEC205、胶原凝素)，而其它(例如，补体受体)识别由PAMP识别产生的产物。这些受体家族的成员通常分为三种类型：1)在血浆(plasma)中循环的体液受体；2)在免疫-细胞表面表达的内吞受体，以及3)可以在细胞表面或细胞内表达的信号受体(Medzhitov等人，1997；Fearon等人，1996)。
细胞PRRs表达在先天免疫系统的效应细胞上，包括在获得性免疫中发挥专职抗原-呈递细胞(APC)功能的细胞。这种效应细胞包括但不限于巨噬细胞、树突细胞、B淋巴细胞和表面上皮。该表达方式使得PRRs直接诱导先天效应机制，以及也通过诱导一组内源信号例如炎性细胞因子和化学因子的表达来警告宿主生物体感染因子的存在，如下所述。后一种功能允许效应子作用的有效移动来抵抗入侵物。
树突细胞(DCs)的主要功能是在外周组织中获得抗原，传送至次级淋巴组织和将抗原呈递给免疫系统的效应T细胞(Banchereau等人，2000；Banchereau等人，1998)。由于DCs在免疫应答中发挥重要作用，它们经历成熟变化，使得它们对每个环境执行合适的功能(Termeer，C.C.等人，2000)。在DC成熟过程中，抗原吸收能力丧失，I类和II类主要组织相容性复合物(MHC)分子的表面密度增加10-100倍，并且CD40、共刺激和粘附分子表达也大大增加(Lanzavecchia，A.等人，2000)。另外，其它遗传变化使得DCs定位于引流淋巴结的T细胞-富集的副皮质并表达T-细胞化学因子，所述化学因子吸引幼稚和记忆T细胞以及初始化抗原-特异性幼稚TH0细胞(Adema，G.J.等人，1997)。在这一阶段期间，成熟的DCs经由它们的MHC II分子递呈抗原至CD4+T辅助细胞，诱导T细胞CD40配体(CD40L)的上调，其进而结合DC的CD40受体。这种DC:T细胞相互作用诱导另外的DC分子的快速表达，所述另外的DC分子对有效的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的起始是至关重要的，包括MHC I和II分子、粘附分子、共刺激分子(例如B7.1、B7.2)、细胞因子(例如IL-12)和抗凋亡蛋白(例如，Bcl-2)的进一步上调(Anderson，D.M.等人，1997；Caux，C.等人，1997；Ohshima，Y.等人，1997；Sallusto，F.等人，1998)。CD8+T细胞离开淋巴结，重新进入循环和定位于炎症原始位点以破坏病原体或恶性细胞。
影响DCs功能的一个关键参数是CD40受体，其发挥DCs“打开开关”(“onswitch”)的作用(Bennett，S.R.等人，1998；Clark，S.R.等人，2000；Fernandez，N.C.等人，1999；Ridge，J.P.等人，1998；Schoenberger，S.P.等人，1998)。CD40是NF受体超家族的48-kDa跨膜成员(Mcwhirter，S.M.等人，1999)。CD40-CD40L相互作用诱导CD40三聚化，这对起始涉及TNF受体相关因子(TRAFs)的信号级联反应是必要的(Ni，C.Z.等人，2000；Pullen，S.S.等人，1999)。CD40使用这些信号分子来激活DCs中的几个转录因子，包括NF.κB、AP-1、STAT3和p38MAPK(McWhirter，S.M.等人，1999)。
共刺激多肽包括激活NFκB通路、Akt通路和/或p38通路的任何分子或多肽。DC激活系统基于利用融合于配体-结合结构域(即小分子结合结构域)的重组信号分子，其中所述共刺激多肽用配体激活和/或调节而产生寡聚化(即脂类-可透过、有机的、二聚化药物)。其它可以用于共刺激多肽交联或寡聚化的系统包括抗体、天然配体和/或人工交叉反应或合成的配体。还进一步，预期的其它二聚化系统包括香豆霉素/DNA促旋酶B系统。
可以用于本发明的共刺激多肽包括那些激活NFκB和其它可变信号级联反应，例如p38通路和/或Akt通路的共刺激多肽。这种共刺激多肽包括但不限于；模式识别受体、C-反应蛋白受体(即Nod1、Nod2、PtX3-R)、TNF受体(即CD40、RANK/TRANCE-R、OX40、4-1BB)和HSP受体(Lox-1和CD-91)。
如本文所用，PRRs包括但不限于内吞模式-识别受体(即甘露糖受体，清除受体(即Mac-1、LRP、肽聚糖、磷壁酸(techoic acids)、毒素、CD11c/CR4))；外部信号模式-识别受体(Toll-样受体(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11)，肽聚糖识别蛋白(PGRPs结合细菌肽聚糖和CD14)；以及内部信号模式-识别受体(即NOD-受体1和2)。
还在进一步的实施方式中，本发明的组合物包括靶向部分和编码一个或更多个共刺激多肽的至少一个核酸序列。共刺激多肽(一个或更多个)可以附加于抗原多肽或替代抗原多肽而表达。例如，在一个实施方式中，免疫偶联物包括靶向部分、免疫刺激核酸(例如PAMP)以及编码一个或更多个(例如，两个或三个)共刺激多肽的可表达核酸。在另外的实施方式中，免疫偶联物包括抗原肽或多肽、或编码抗原肽或多肽的另外的核酸分子。
共刺激多肽包括但不限于模式识别受体，C-反应蛋白受体(即Nod1、Nod2、PtX3-R)，TNF受体(即CD40、RANK/TRANCE-R、OX40、4-1BB)和HSP受体(Lox-1和CD-91)。更具体地，共刺激多肽是CD40胞质结构域。
因此，在本发明的各种实施方式中，组合物包括靶向部分和至少一个共刺激多肽或编码共刺激多肽的核酸分子。这种共刺激多肽分子能够通过上调树突细胞表达抗原呈递分子来扩增T-细胞-介导的反应。在本发明中预期的共刺激蛋白包括例如，但不限于：肿瘤坏死因子(TNF)家族的成员(即CD40、RANK/TRANCE-R、OX40、4-1B)，Toll-样受体，C-反应蛋白受体，模式识别受体和HSP受体。在一个实施方式中，本发明的组合物包括表达这些共刺激多肽的胞质结构域的核酸分子。来自各种共刺激多肽之一的胞质结构域，包括其突变体——其中识别序列涉及与胞质结构域相关的起始转录——是已知的，或对这种序列具有反应性的基因是已知的。可以用于本文的本发明内容中的共刺激多肽的另外的实例是本领域已知的，例如，公开在美国专利号7,404,950；6,891,030；6,803,192；以及7,074,590和美国专利申请号2007/0172947；20060269566和2005/0084913中。
C.抗微生物肽(警报素)
在另一个实施方式中，本发明的偶联物连接至或包括编码一个或更多个抗微生物肽的序列。根据本发明的抗微生物肽是能够杀伤微生物或抑制它的生长的肽。本发明抗微生物肽的抗微生物活性包括但不限于抗细菌、抗病毒或抗真菌活性。抗微生物肽包括各种肽，例如最初从植物和动物中分离的肽。在动物中，抗微生物肽通常由包括嗜中性粒细胞和上皮细胞的各种细胞表达。在包括人的哺乳动物中，抗微生物肽通常见于舌、气管和肠上部的表面。自然发生的抗微生物肽通常为含有少于100个氨基酸的两性分子。许多这些肽通常具有净正电荷(即阳离子)并且大部分形成螺旋状结构。
在一个实施方式中，根据本发明的抗微生物肽包括约2至约100个氨基酸，约5至约50个或约7至约20个氨基酸。在一个优选的实施方式中，靶向肽具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的长度。
在另一个实施方式中，抗微生物肽具有抗微生物活性，其最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)为不大于约40μM，不大于约30μM，不大于20μM或不大于10μM。
在另一个实施方式中，抗微生物肽包括一个或更多个抗微生物肽，其包括但不限于：alexomycin、雄抗菌肽、蜜蜂抗菌肽、细菌素、β-折叠细菌素、牛白细胞抗菌肽、buforin、cathelicidin、α-螺旋clavanin、杀菌肽、十二肽、防卫素、β-防卫素、α-防卫素、gaegurin、histatin、indolicidin、爪蟾抗菌肽、蜂毒肽、乳链菌肽、novispirin G10、protegrin、ranalexin、鲎抗菌肽及其衍生物。
在这些已知抗微生物肽中，鲎抗菌肽已知具有抗真菌和抗细菌活性。雄抗菌肽、蜜蜂抗菌肽、牛白细胞抗菌肽、clavanin、十二肽、防卫素、和indolicidin是具有抗细菌活性的抗微生物肽。Buforin、乳链菌肽和杀菌肽已证明对大肠杆菌、痢疾志贺杆菌(Shigella disenteriae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeroginosa)具有抗微生物作用。爪蟾抗菌肽和ranalexin肽已证明对相同生物具有抗微生物作用，另外对白色念珠菌(Candida albicans)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、克鲁斯氏念珠菌(Candida krusei)和幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)具有这种作用。爪蟾抗菌肽还证明对单纯疱疹病毒具有抗微生物作用。Alexomycin肽已证明对空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)具有抗微生物作用，而防卫素和β-折叠防卫素肽已显示对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoneae)具有抗微生物作用。Histatin肽及其衍生物是另一类抗微生物肽，其针对包括链球菌突变体的多种生物具有抗真菌和抗细菌活性(MacKay，B.J.等人，Infect.Immun.44：695-701(1984)；Xu等人，J.Dent.Res.69：239(1990))。
在一个实施方式中，本发明的抗微生物肽含有来自一类Histadine肽及其衍生物的一个或更多个抗微生物肽。另外的实例在美国专利申请公开号US20080170991中提供。
在另一个实施方式中，本发明的抗微生物肽含有来自一类protegrins及其衍生物的一个或更多个抗微生物肽。例如，本发明的抗微生物肽含有protegrin PG-1。
Protegrin肽在美国专利号5,693,486、5,708,145、5,804,558、5,994,306和6,159,936中描述，所有专利通过引用并入本文。
根据本发明的抗微生物肽可以用本领域技术人员已知的任何合适的方法单独产生或与靶向肽以及连接体肽组合产生。例如，抗微生物肽可以经由合成仪化学合成或使用表达系统例如细菌、酵母或真核细胞表达系统重组制备。在化学合成中，抗微生物肽可以通过L-氨基酸对映异构体或D-氨基酸对映异构体制备。
在一个实施方式中，本发明的偶联物包括抗微生物肽LL-37-cathelicidin-衍生的抗微生物肽：警报素。
抗微生物肽在多细胞生物针对于微生物入侵的先天宿主防御中发挥重要作用。抗微生物肽的共同特征是采用两亲构象的能力，其中疏水和阳离子氨基酸簇在分子的不连续部分中进行空间组装。防卫素和cathelicidins是哺乳动物中抗微生物肽的两个主要家族。Cathelicidins由高度保守的N-末端微生物肽前体结构域以及更多样的抗微生物C端组成。LL-37——具有两个N-末端亮氨酸的37个氨基酸的肽——是唯一已知的人抗微生物肽前体相关的抗微生物肽。LL-37的前体hCAP-18和它的小鼠同系物CRAMP主要在骨髓细胞中表达但还在非骨髓组织中广泛表达，包括附睾、精子细胞和大量器官的上皮细胞。重要地，LL-37的表达在感染性或炎性刺激时在角质形成细胞和上皮细胞中在其它位点诱导。LL-37诱导细菌细胞裂解、中和细菌内毒素并对白细胞具有化学吸引作用。LL-37代表警报素和能够激活树突细胞的TLR激动剂。LL-37保护质粒DNA免于血清核酸酶降解并有效地将DNA靶向至哺乳动物细胞的核区室。LL-37·DNA复合体经由内吞作用进入哺乳动物细胞，所述内吞作用涉及非内陷的(noncaveolar)脂筏结构域以及细胞表面蛋白聚糖。
抗体-DNA偶联物和LL37的复合物的制备：LL-37肽(LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-C-酰胺)被合成，并且肽序列由反相高压液相色谱和质谱证实。为了形成LL-37-DNA复合物，通过倒置将DNA(10μg/ml)和LL-37(5-100μg/ml)混合并在室温温育30分钟。可选地，LL-37可以共价偶联至抗体或作为融合蛋白并入抗体/靶向配体。
在一些实施方式中，偶联物包括富含组氨酸的两亲抗微生物肽。含有可变数量组氨酸残基的合成的阳离子两亲肽也可以与本发明的抗体-DNA偶联物复合。转染效率取决于肽中组氨酸残基的数量和定位以及发生平面内至跨膜转换(thein-plane to transmembrane transition)的pH。内体酸化也是要求的。这些肽甚至在与DNA复合时也维持高水平的抗菌活性。实例包括富含丙氨酸和亮氨酸残基以及多数赖氨酸和组氨酸残基的两亲肽。但是，在肽两个末端的赖氨酸辅助DNA浓缩，组氨酸残基有助于DNA的内体逃脱(11)。肽序列的实例包括：KKALLALALHHLAHLALHLALALKKAKKALLALALHHLAHLAHHLALALKKA或KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA-NH2。
形成肽-DNA复合物的说明性方法为将肽(4-6μg/1μg DNA)和DNA(各自稀释在100μl的150mM NaCl中)混合并在室温温育20分钟。可选地，肽可以共价偶联至抗体或作为融合蛋白并入抗体/靶向配体。
用于本发明内容的其它肽包括多元抗微生物肽，例如结合DNA和破坏膜稳定性的多功能肽。另外，这种肽包括多元“膜-穿透肽”：HIV-1反式激活蛋白(Tat)-YGRKKRRQRRRPPQC；果蝇触角足蛋白-RQIKIWFQNRRMKWKK；单纯疱疹VP22或聚赖氨酸。这些肽经由PG-依赖性和非网格蛋白-介导的内吞作用介导DNA内化。
在进一步实施方式中，肽包括抗微生物肽例如KALA、ppTG20和Vpr52-96。KALA和ppTG20组合成DNA结合所需的带正电的赖氨酸或精氨酸延伸以及源自基因融合肽GALA和JTS-1的两亲膜-失稳定结构域。这些转染的肽具有强的α-螺旋构象倾向，其将赖氨酸或精氨酸定位在螺旋的一个表面上。
还在进一步的实施方式中，本发明的偶联物连接于硫酸鱼精蛋白。例如，抗体-DNA偶联物连接于鱼精蛋白的核酸结合蛋白或片段(氨基酸8-29)，其使精子DNA成核。可选地，肽可以共价偶联至抗体或作为融合蛋白并入抗体/靶向配体。另外，其它聚阳离子(例如，聚乙烯亚胺(PEI))或阳离子脂质体(例如，DOTAP)是本领域已知的并可用于本发明偶联物的内容中。
在还进一步实施方式中，本发明的偶联物包括描述的这些肽以及PAMP(例如TLR激动剂-说明书中所列)或DAMP(例如警报素-说明书中所列)(例如，连接于如本文所述的抗体-DNA偶联物)。
D.透化肽(Permeabilizing Peptides)
在一些实施方式中，组合物(偶联物)包括一个或更多个透化肽。使用常规偶联方法和本文公开的方法，这种肽可以偶联至本发明的偶联物。蛋白或核酸穿过细胞膜的有效转移是细胞生物学中的主要问题之一。为了将选择蛋白的功能结构域从完整细胞的外部递送到内部，需要载体。细胞可通透肽——也称为蛋白转导结构域(PTDs)，是具有可自由穿过细胞膜的小肽结构域的载体。已鉴定了几个PTDs可使得融合蛋白在称为蛋白转导的过程中有效地穿过细胞膜。研究已表明，源自HIV TAT蛋白的TAT肽具有将肽或蛋白转导至各种细胞中的能力。PTDs已用于抗癌策略中，例如，细胞可通透的Bcl-2结合肽cpm1285在小鼠中显示减慢人髓细胞性白血病生长的活性。细胞可通透的磷酸肽——例如FGFR730pY，其模拟含特定SH2结构域蛋白的受体结合位点——是用于癌症研究和细胞信号传导机制研究的可能工具。
可以并入本发明的组合物和方法的肽的实例包括但不限于：(Arg)9，TAMRA-标记的，(Arg)9FAM-标记的，[Cys58]105Y，细胞穿透肽，1-抗胰蛋白酶(358-374)105Y，α1-抗胰蛋白酶(359-374)，氨基肽酶N配体(CD13)，NGR肽，氨基肽酶N配体(CD13)，NGR肽，触角足前导肽(CT)，触角足肽、酸，触角足肽、酰氨，抗-βγ(MPS-磷转导蛋白-样蛋白C端)，抗-βγ(MPS-磷转导蛋白-样蛋白C端)，生物素-TAT(47-57)，Buforin，嵌合狂犬病病毒糖蛋白片段(RVG-9R)，Cys(Npys)触角足肽、酰胺，Cys(Npys)-(Arg)9，Cys(Npys)-(D-Arg)9，Cys(Npys)-TAT(47-57)，Cys(Npys)-TAT(47-57)、FAM-标记的，Cys-TAT(47-57)，FITC-LC-触角足肽，FITC-LC-MTS，FITC-LC-TAT(47-57)，脂类膜转座肽，脂类膜转座肽、D-异构体，肥大脱粒肽，肥大脱粒肽X，MEK1衍生肽抑制剂1，MEK1衍生肽抑制剂1、膜-可通透序列，MPS，MPG，HIV相关的，MPS-Gαi2，MPS-Gαi3，Myristol，NGR肽1、2、3、4，核定位信号肽，Pep-1：Chariot(肽和蛋白的非共价递送)，狂犬病病毒基质蛋白片段(RV-MAT)，硬脂酰-MEK-1衍生肽抑制剂1，酰胺，SynB1，TAT(47-57)，TAT(47-57)GGG-Cys(Npys)，TAT(47-57)、FAM-标记的，TAT(47-57)、TAMRA-标记的，TAT(47-57)-Lys(TAMRA)，Tat(48-57)，Tat-C(48-57)，Tat-NR2Bct，TAT-NSF222融合肽，TAT-NSF222scr融合多肽、合成的，TAT-NSF700融合肽，TAT-NSF700scr，TAT-NSF81scr融合多肽、合成的，透皮肽或Transportan。另外，这些肽可用于核酸结合。
III.组合物
A.肿瘤靶向组合物
在本发明的另一方面，提供可进行本文所述的疾病状况的预防或治疗的组合物和方法。在一个实施方式中，本发明的组合物提供用于动物接种的手段。
在一个实施方式中，本发明的组合物包括一个或更多个靶向部分(T)，其结合靶分子或癌症或肿瘤的组分(肿瘤-靶向部分)。靶向分子可以是肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的组分。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分例如抗体以及核酸分子的偶联物，其中所述核酸分子编码一个或更多个产物(例如，核酸例如RNA、肽、多肽、融合肽)并能够刺激免疫应答。在一个实施方式中，核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序。在另一个实施方式中，核酸分子编码一个或更多个刺激免疫应答的产物。在一个相关实施方式中，核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序，并编码一个或更多个刺激免疫应答的产物。
在一个相关实施方式中，肿瘤-靶向偶联物的核酸分子编码一个或更多个抗原或抗原决定簇，其可被加工并呈递以便由T细胞和/或B细胞识别。编码的抗原决定簇包括下列每一个中的一个或更多个：CD4+T细胞表位、CD8+T细胞表位、B细胞表位。在一个实施方式中，核酸分子编码一个或更多个源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的抗原或抗原决定簇。例如，核酸编码源自破伤风毒素的序列以提供CD4+T-细胞辅助[例如，源自破伤风的TH激活序列：片段C(FrC)、FrC结构域DOM1或混杂MHC II类-结合肽p30]。在一个相关实施方式中，核酸编码源自微生物疫苗或其它非自身来源(例如，绿脓杆菌外毒素、绿色荧光蛋白、植物病毒外壳蛋白)的一个或更多个抗原或抗原决定簇。
在一个相关实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分——例如抗体，一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)，和/或编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的核酸分子的偶联物。在一个相关实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向部分和一个或更多个PAMP。在另一个相关实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向部分和编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的一个或更多个核酸分子。在另一个相关实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向部分，一个或更多个PAMP，和编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的一个或更多个核酸分子。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分——例如抗体，一个或更多个损伤相关分子模式(DAMP)或警报素，以及编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的一个或更多个核酸分子的偶联物。在一个相关实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向部分以及一个或更多个DAMP/警报素。在另一个相关实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向部分以及编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的一个或更多个核酸分子。在另一个相关实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向部分，一个或更多个DAMP/警报素，以及编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的一个或更多个核酸分子。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分——例如抗体、和编码如下一个或更多个的一个或更多个核酸分子的偶联物：(i)源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)，(ii)一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)，(iii)一个或更多个损伤相关分子模式(DAMP)/警报素，(iv)一个或更多个免疫刺激分子，包括募集、结合、激活、成熟和/或增殖抗原呈递细胞或树突细胞或其它免疫细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)的分子以及对抗免疫抑制的分子(例如，DC吸收受体的配体/抗体、免疫刺激细胞因子、化学因子、共刺激分子、生长因子)。在一个相关实施方式中，核酸分子另外编码一个或更多个肿瘤抗原/抗原决定簇或含肿瘤抗原的融合蛋白。一方面，肿瘤抗原的融合配偶体促进DC的抗原吸收、免疫识别和/或免疫活化。在另一个实例中，融合配偶体包括靶向DC吸收受体的分子。在另一个实例中，融合配偶体是源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的抗原或抗原决定簇。在另一个实例中，融合配偶体是警报素。在一个相关实施方式中，本文所述的靶向部分-核酸偶联物(一个或更多个)进一步包括一个或更多个PAMP和/或一个或更多个DAMP/警报素。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分例如抗体、以及编码一个或更多个RNA分子的一个或更多个核酸分子的偶联物，所述RNA分子可干扰一个或更多个靶细胞基因的表达[例如，短干扰RNA(siRNA)，短发夹RNA(shRNA)]。在另一个实施方式中，偶联物的核酸分子编码一个或更多个免疫刺激RNA分子。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分例如抗体、和编码诱导靶细胞死亡的分子的一个或更多个核酸分子的偶联物。
在本文所述的每个靶向部分-核酸偶联物中，核酸分子编码在转录启动子控制下的一个或更多个感兴趣的基因，所述转录启动子在所期望的细胞中具有功能活性。在一个实施方式中，组织或肿瘤细胞选择性启动子用于在所期望的细胞类型中的靶向表达。
在一个实施方式中，本文所述的每个肿瘤靶向部分-核酸偶联物被连接于用于包装和/或递送核酸分子或偶联物的一个或更多个组分。例如，这些分子包括阳离子肽、细胞透化肽、DC靶向肽、核酸结合分子、核定位肽、阳离子脂质体、亲脂性部分、纳米颗粒。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分例如抗体、一个或更多个核酸分子、以及一个或更多个肽/多肽/脂肽的偶联物。在一个实施方式中，核酸分子并入一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序，和/或编码一个或更多个刺激免疫应答的产物，如本文所述(注：0017)。在各种相关实施方式中，肽/多肽/脂肽(一个或更多个)包括如下的一个或更多个：(i)源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(例如CD4+T细胞表位)，(ii)警报素，(iii)DC结合分子(例如DC吸收受体的配体)。一方面，本文所述偶联物的肽/多肽可以互相融合/连接和/或融合/连接至核酸结合肽或细胞透化肽[例如阳离子肽、鱼精蛋白、HIV-tat、精氨酸-或组氨酸-富含序列、LL-37)。
在一个实施方式中，本发明包括肿瘤-靶向部分例如抗体或适配子、以及如下的一个或更多个的偶联物：(a)一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)，(b)一个或更多个下列肽/多肽/脂肽：(i)源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(例如CD4+T细胞表位)，(ii)警报素，(iii)DC结合分子(例如DC吸收受体的配体)。一方面，本文所述偶联物的肽/多肽可以互相融合/连接和/或融合/连接至核酸结合肽
[例如阳离子肽、鱼精蛋白、HIV-tat、精氨酸-或组氨酸-富含序列、LL-37)。一方面，偶联物包括免疫刺激核酸。
在一个实施方式中，本发明包括靶向部分例如抗体以及核酸分子的偶联物，所述核酸分子是适配子。在一个实施方式中，抗体和核酸适配子结合至相同细胞类型或不同细胞类型上的不同靶。在一个实施方式中，偶联物包括靶向肿瘤细胞表面受体(EGFR)的抗体和靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)的适配子，从而靶向前列腺癌细胞中的两种蛋白。在一个实施方式中，核酸分子包括适配子和如下的一个或更多个：(i)PAMP或其它免疫刺激核酸，(ii)编码一个或更多个刺激免疫应答的产物的DNA，如本文所述。
虽然不意图受限于任何一种作用机制，但是本发明的偶联物可以操作的一种机制如下。(1)抗体-DNA偶联物结合靶向分子，例如肿瘤细胞上的细胞表面抗原或受体。(2)偶联物与肿瘤细胞的结合导致受体-介导的内吞作用并促进核酸分子的细胞进入。(3)细胞进入使得能够进行由核酸分子编码的感兴趣基因的启动子-驱动表达；以及(4)在靶向肿瘤细胞中指定的感兴趣基因的表达引发下列作用：(a)一个或更多个编码的病原体或病原体-衍生抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的表达；(b)在主要组织相容性复合物(MHC)分子的背景中，病原体抗原衍生表位在肿瘤细胞(以及DCs)中的呈递，用于被T细胞(CD4+或CD8+)或B细胞识别；(c)识别病原体抗原衍生的B细胞表位的抗体结合和促进呈递这些表位的肿瘤细胞的抗体性依赖细胞毒性(经由Fc-Fc受体相互作用)；这些抗体可经由在前暴露于病原体抗原疫苗而预先存在于接受者中，或在偶联物施用后产生；(d)识别病原体抗原衍生的T细胞表位的T细胞提供呈递这些表位的肿瘤细胞的CD4+T细胞辅助(对DCs和CD8+T细胞)和CD8+T-细胞介导的细胞毒性；这些T细胞可经由在前暴露于病原体抗原疫苗而预先存在，或在偶联物施用后产生或经由离体激活/增殖的抗原-反应性T细胞的过继转移被递送。
另外，在MHC分子的背景中，树突细胞(DCs)对抗体包被的肿瘤细胞(调理的细胞)的吞噬促进病原体衍生和肿瘤相关抗原的交叉呈递(经由Fc-Fc受体相互作用)。另外，抗原呈递细胞(DCs)通过(a)病原体相关分子模式(在偶联物的核酸分子中)、(b)损伤相关分子模式(由垂死肿瘤细胞产生的内源警报素)、(c)识别病原体衍生CD4+T细胞表位的CD4+T辅助细胞而激活。因此，识别交叉呈递的病原体抗原或肿瘤抗原衍生表位的CD4+T辅助(TH)细胞和CD8+T细胞的激活导致抗原扩展。另外，激活的T细胞诱导表达病原体衍生T细胞表位的肿瘤细胞以及表达内源肿瘤抗原表位的肿瘤细胞的细胞毒性。
另外，下列种类的编码的免疫刺激分子的表达可增强识别肿瘤细胞上的病原体抗原表位或肿瘤抗原表位的DCs和/或T细胞的募集、增殖、存活和/或激活：(1)免疫刺激细胞因子(例如干扰素、IL-12、IL-15、GM-CSF)；(2)T细胞共刺激分子；(3)DC募集或激活分子(PAMPs、DAMPs、警报素)。
而且，诱导靶向肿瘤细胞死亡的下列种类的编码分子的表达与免疫刺激DAMPs的产生可增强识别肿瘤细胞上的病原体抗原表位或肿瘤抗原表位的DCs和/或T细胞的募集、增殖、存活和/或激活：(1)沉默感兴趣存活基因的si RNA；(2)直接杀细胞的或死亡信号传导蛋白；以及(3)由自杀基因编码的蛋白。
在一个实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向抗体和编码病原体抗原衍生基因的DNA质粒/小环。例如，抗体靶向肿瘤细胞上的人表皮生长因子受体细胞表面受体(抗EGFR)；或抗体靶向肿瘤细胞上的人HER2/neu受体细胞表面受体(抗HER2/neu)。
在另一个实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向适配子和编码病原体抗原衍生基因的DNA质粒/小环。例如，靶向肿瘤细胞上的细胞表面分子(前列腺特异性膜抗原(PSMA)的适配子(PSMA RNA适配子)。
在另一个实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向肽和编码病原体抗原衍生基因的DNA小环。这种肿瘤靶向肽的实例是已知的并且在本文公开(例如，RGD肽)。
DNA疫苗设计和原理：CD4+T辅助(TH)细胞对于免疫应答的诱导和维持是至关重要的。TH细胞是CD8+T细胞的初始化和次级扩增以及对B细胞提供辅助用于抗体产生所需的。由于自体肿瘤抗原不能诱导显著的TH反应，本发明的肿瘤靶向DNA偶联物疫苗并入编码的病原体衍生序列，例如，来自破伤风毒素或绿脓杆菌外毒素，以使来自存在的抗微生物所有组成成分的TH细胞可辅助进行CD8+T细胞和/或B细胞应答，所述CD8+T细胞和/或B细胞应答针对源自免疫偶联物-靶向肿瘤细胞的肿瘤抗原和/或在相同质粒或小环中共编码的/融合的抗原。DNA疫苗还可通过并入其它非自身抗原例如绿色荧光蛋白、植物病毒外壳蛋白或免疫靶向分子(单独的或与肿瘤抗原共表达或作为融合配偶体)而提供T-细胞辅助。
并入病原体衍生序列的DNA疫苗与肿瘤靶向部分的偶联导致这些抗原决定簇在靶向肿瘤细胞中的表达，以及抗原物质(病原体-衍生和内源性肿瘤细胞/抗原)向已吞噬靶向肿瘤细胞的APCs的间接转移(交叉呈递)。一定比例的抗体-DNA疫苗还可被APCs直接地吸收并呈递(经由抗体Fc与APC FcR上Fc受体的相互作用)。这种病原体-和肿瘤-衍生抗原的交叉呈递和直接呈递可提供有效的T-细胞辅助并引起下列免疫应答：(1)病原体抗原-和肿瘤抗原-特异性抗体的诱导：本发明的抗体-DNA偶联物使得能够在靶向肿瘤细胞中表达病原体抗原(例如破伤风毒素衍生片段C-FrC)以及由DCs交叉呈递FrC和肿瘤抗原(来自凋亡的肿瘤细胞和/或疫苗中共编码的/融合的肿瘤抗原)。由DC刺激的(FrC)-特异性TH细胞能够初始化和加强B细胞产生针对于FrC肽或肿瘤细胞抗原的抗体(经由CD40-CD40配体相互作用和细胞因子的产生)。肿瘤细胞中FrC抗原决定簇的表达还使得它们易感于抗FrC抗体或抗肿瘤抗体引起的ADCC，从而加强由DC进行的这些抗原的交叉呈递，所述DC已吞噬调理的或凋亡的肿瘤细胞；(2)肿瘤-反应性细胞毒性T细胞的诱导：编码微生物抗原或其它非自身抗原的抗体DNA疫苗可用于起始并扩增针对一系列另外的弱肿瘤抗原的CD8+T淋巴细胞(CTL)免疫应答。(FrC)-特异性TH细胞允许DCs将FrC和肿瘤抗原交叉呈递以初始化和加强针对弱肿瘤抗原的CD8+T细胞应答。由于免疫显性病原体衍生肽可限制对亚显性肿瘤衍生表位的反应，由DNA疫苗编码的病原体衍生抗原可以被最小化至含有提供CD4+T细胞辅助所需的表位(例如FrC的单一结构域-DOM1，或混杂的MHC II类结合肽，例如破伤风毒素p30)。
这些免疫应答由本发明免疫偶联物的能力而促进和加强，以便借助如下的一个或更多个同时激活DC：(1)并入偶联物中的PAMPs(例如免疫刺激核酸)；(2)包括在偶联物中的损伤相关分子模式(DAMPs)(例如警报素，例如LL-37cathelicidin)；(3)经由编码基因表达或响应于细胞应激和损伤产生的内源性PAMPs或DAMPs；(4)经由编码基因表达或在肿瘤细胞中环境中作为激活免疫应答的旁观者效应产生的其它内源性免疫刺激分子。
而且，诱导靶向肿瘤细胞死亡的下列种类的编码分子的表达以及免疫刺激性DAMPs的产生可增强识别肿瘤细胞上的病原体抗原-或肿瘤抗原表位的DCs和/或T细胞的募集、增殖、存活和/或激活：(1)沉默感兴趣存活基因的si RNA；(2)直接杀伤细胞的或死亡信号传导蛋白；以及(3)由自杀基因编码的蛋白。
在一个实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向抗体和编码病原体抗原衍生基因的DNA质粒/小环。例如，抗体靶向肿瘤细胞上的人表皮生长因子受体细胞表面受体(抗EGFR)；或抗体靶向肿瘤细胞上的人HER2/neu受体细胞表面受体(抗HER2/neu)。
在另一个实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向适配子和编码病原体抗原衍生基因的DNA质粒/小环。例如，表现肿瘤细胞上的细胞表面分子(前列腺特异性膜抗原(PSMA)的适配子(PSMA RNA适配子)。
在另一个实施方式中，偶联物包括肿瘤靶向肽和编码病原体抗原衍生基因的DNA小环。这种肿瘤靶向肽的实例是已知的并且在本文公开(例如，RGD肽)。
下列提供用于产生肿瘤靶向部分-DNA疫苗偶联物的例证性方法：(1)编码病原体-衍生基因的DNA小环疫苗(a)编码炭疽芽孢杆菌保护性抗原(ProtectiveAntige，PA)的DNA小环；(b)对炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)的DNA序列进行密码子优化，用于在哺乳动物细胞中有效表达(DNA 2.0)；(c)破伤风梭菌(ClostridiumTetani)(破伤风)毒素衍生基因片段(例如破伤风毒素片段C-FrC或DOM1)的DNA小环。例如，对破伤风梭菌(破伤风)毒素衍生基因片段(破伤风片段C或DOM1)的DNA序列进行密码子优化，用于在哺乳动物细胞中有效表达(DNA 2.0)。
DNA疫苗设计和原理：CD4+T辅助(TH)细胞对于免疫应答的诱导和维持是至关重要的。TH细胞是CD8+T细胞初始化和次级扩增以及提供辅助给B细胞用于抗体产生所需的。由于自体肿瘤抗原不能诱导显著的TH反应，本发明的肿瘤靶向DNA偶联物疫苗并入编码的病原体-衍生序列，例如来自破伤风毒素或绿脓杆菌外毒素，以使来自存在的抗微生物所有组成成分的TH细胞可辅助进行CD8+T细胞和/或B细胞应答，所述CD8+T细胞和/或B细胞应答针对源自免疫偶联物靶向肿瘤细胞的肿瘤抗原和/或在相同质粒或小环中共编码的/融合的抗原。DNA疫苗还可通过并入其它非自身抗原例如绿色荧光蛋白、植物病毒外壳蛋白或免疫靶向分子(单独的或与肿瘤抗原共表达或作为融合配偶体)提供T-细胞辅助。
并入病原体衍生序列的DNA疫苗与肿瘤靶向部分的偶联导致这些抗原决定簇在靶向肿瘤细胞中的表达，以及抗原物质(病原体-衍生和内源性肿瘤细胞/抗原)向已吞噬靶向肿瘤细胞的APCs的间接转移(交叉呈递)。一定比例的抗体-DNA疫苗还可被APCs直接地吸收并呈递(经由抗体Fc与APC FcR上Fc受体的相互作用)。这种病原体-和肿瘤-衍生抗原的交叉呈递和直接呈递可提供有效的T-细胞辅助并引起下列免疫应答：(1)病原体抗原-和肿瘤抗原-特异性抗体的诱导：本发明的抗体-DNA偶联物使得能够在靶向肿瘤细胞中表达病原体抗原(例如破伤风毒素衍生片段C-FrC)以及由DCs交叉呈递FrC和肿瘤抗原(来自凋亡的肿瘤细胞和/或疫苗中共编码的/融合的肿瘤抗原)。由DC刺激的(FrC)-特异性TH细胞能够初始化和加强B细胞产生针对于FrC肽或肿瘤细胞抗原的抗体(经由CD40-CD40配体相互作用和细胞因子的产生)。肿瘤细胞中FrC抗原决定簇的表达还使得它们易感于抗FrC抗体或抗肿瘤抗体引起的ADCC，从而加强由DC进行的这些抗原的交叉呈递，所述DC已吞噬调理的或凋亡的肿瘤细胞；(2)肿瘤-反应性细胞毒性T细胞的诱导；编码微生物抗原或其它非自身抗原的抗体DNA疫苗可用于起始并扩增针对一系列另外的弱肿瘤抗原的CD8+T淋巴细胞(CTL)免疫应答。(FrC)-特异性TH细胞允许DCs将FrC和肿瘤抗原交叉呈递以初始化和加强针对弱肿瘤抗原的CD8+T细胞应答。由于免疫显性病原体衍生肽可限制对亚显性肿瘤衍生表位的反应，由DNA疫苗编码的病原体衍生抗原可以被最小化至含有提供CD4+T细胞辅助所需的表位(例如FrC的单一结构域-DOM1，或混杂的MHC II类结合肽，例如破伤风毒素p30)。
这些免疫应答由本发明免疫偶联物的能力而促进和加强，以便借助如下的一个或更多个同时激活DC：(1)并入偶联物中的PAMPs(例如免疫刺激核酸)；(2)包括在偶联物中的损伤相关分子模式(DAMPs)(例如警报素，例如LL-37cathelicidin)；(3)经由编码基因表达或响应于细胞应激和损伤产生的内源性PAMPs或DAMPs；(4)经由编码基因表达或在肿瘤细胞中环境中作为激活免疫应答的旁观者效应产生的其它内源性免疫刺激分子。
在一个实施方式中，DNA质粒/小环疫苗的制剂用于本发明的偶联物中。特定的密码子优化的病原体衍生DNA序列(PA或破伤风片段C/DOM1)以及在GeneGrip质粒系列上发现的重复结合位点1和2处的DNA序列被克隆到中间体哺乳动物表达载体中，所述载体含有CMVie启动子和SV40终止子载体。在序列确认后，使用含有SpeI(5’端)或ApaI(3’端)限制核酸内切酶位点特异性尾的PCR引物，对全部表达盒(CMV启动子、抗原、SV40、寡核苷酸结合基序)进行PCR扩增。然后用SpeI和ApaI消化PCR产物并连接至p2ΦC31小环载体的SpeI和ApaI位点。然后将构建体p2ΦC31-PA转化到大肠杆菌NM522细胞中和测试重组能力。培养含有该质粒的大肠杆菌，然后通过添加阿拉伯糖(0.25％终浓度)诱导重组。在诱导前(0时间点)和诱导后(60和120分钟)采取培养物等分试样并进行小量制备质粒分离。产生的质粒制备物进行电泳以确定亲本质粒是否已重组至小质粒和小环。如在凝胶上存在小环条带所测定，重组是成功的。还存在骨架质粒条带(小质粒)，但它的亮度随时间降低(表明I-SceI酶切割质粒骨架并且其正被细胞核酸内切酶降解)。
DNA小环疫苗与肿瘤靶向部分的偶联。特异性DNA疫苗与本发明所述肿瘤靶向部分的偶联提供抗肿瘤效力的多因子改进：(1)提供DNA疫苗向肿瘤细胞的靶向递送、保持和受体-介导的内化。编码的病原体-衍生抗原在肿瘤细胞中的表达允许病原体抗原反应性抗体调理肿瘤细胞，从而增加ADCC和DCs进行的Fc介导的病原体-和内源肿瘤抗原的交叉呈递；(2)抗体-DNA偶联物包被的肿瘤细胞增强已吞噬肿瘤细胞的DCs的激活——经由偶联物-衍生的外源和细胞-衍生的内源免疫刺激PAMPs和DAMPs，从而促进针对肿瘤细胞的CD4+T辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞的激活。DC-NK细胞交谈进一步放大抗体-偶联物包被的肿瘤细胞的ADCC和补体介导的裂解；(3)经由抗体/受体-介导的内吞作用将偶联物的免疫刺激分子(免疫刺激核酸、PAMPs)细胞内递送到肿瘤细胞中导致细胞应答，其引起MHC分子上调和肿瘤-衍生抗原的呈递，以便由B和T细胞进行肿瘤细胞识别；(4)靶向肿瘤生长因子受体的抗体偶联物阻碍受体介导的肿瘤细胞存活和生长信号，从而提高对CTL-介导的细胞毒性的易感性；以及(5)抗体-DNA疫苗能够将结合偶联物的凋亡肿瘤细胞交叉呈递至DCs，从而诱导记忆T细胞针对一系列内源性肿瘤-衍生抗原的旁观者刺激(抗原扩展)。这对递送或表达特定选择的肿瘤肽的DNA疫苗是优选的，其效力可以通过逃避不表达选择的抗原的变体肿瘤细胞而受到限制。
上述内容对肿瘤靶向抗体和小环DNA疫苗的偶联物的形成是说明性的并不是限制性方法，其中两个部分以序列、位点和方向特异性方式直接地偶联，受控制数量的质粒/小环DNA拷贝连接于每个抗体，从而允许维持抗体的关键功能性质以及DNA疫苗的肿瘤靶向表达。特异性肿瘤靶向抗体的选择以及编码的病原体抗原基因在DNA小环中的组成被设计为优化偶联物的协同功能组分用于抗肿瘤治疗。本发明具有的另一个关键功能是编码的病原体抗原决定簇在靶向肿瘤细胞和肿瘤环境中的表达，以及由该功能引发的特异性免疫应答。这些特征将本发明的特异性肿瘤抗体-DNA疫苗偶联物与其它DNA疫苗和递送平台例如粒子-介导的递送、基因枪、病毒或细菌载体或电穿孔区别开来。
在合成抗体-质粒/小环DNA偶联物的一个方法中，线性ss寡核苷酸[LNA/DNA ODNs，含有(CT)n或(GA)n重复基序，与双链质粒或小环DNA中相应的ds DNA序列互补]与超螺旋、双链小环DNA结合。
  LNA ODN(5’-NH2-GAGG-CTCTCTCTCTCTC-3’)
  具有免疫刺激CpG DNA硫代磷酸骨架的杂交物LNA-DNA：
  5’tccatgacgttcctgacgttt CTCTCTCTCTCTC-GGAG-NH2-3’
  5’cggcggataaccgcgagcggttattcgccctacgg CTCTCTCTCTCTC-GGAG-NH2-3’
  (重复基因外回文-REP序列；绿脓杆菌)
  5’gggggacgatcgtcggggg CTCTCTCTCTCTC-GGAG-NH2-3’
  (A类CpG ODN)
例如，在10mM磷酸盐缓冲液，1mM EDTA，pH 5.8中在37℃将小环DNA与LNA ODN或具有CpG DNA硫代磷酸骨架的杂交物LNA-DNA ODN温育16小时，最大值为ODN对质粒中的ODN-结合位点摩尔过量4-至40倍。在一端含有胺反应性NHS酯以及在另一端含有巯基反应性马来酰亚胺基的异双功能试剂用于产生抗体-DNA偶联物，如所述(参考Bioconjugate techniques，Hermanson，G.T.，Academic Press，1996，456-527页)。
抗体-质粒/小环偶联物可并入所述的阳离子肽，例如警报素LL-37，其可促进保护DNA免于核酸酶、促进细胞进入和/或增强DC活化。
靶向部分-DNA疫苗偶联物的作用的分析可以如下进行：(1)靶肿瘤细胞中(例如EGFR+或HER2+细胞)受体-介导的内吞作用；(2)靶肿瘤细胞中感兴趣基因的表达——由MHC分子呈递的病原体抗原衍生表位(B或T细胞抗原决定簇)；(3)APC/DC对调理的肿瘤细胞的吞噬：TL激动剂PAMPs对DCs的激活；病原体抗原CD4+T细胞和B细胞表位的呈递；以及肿瘤相关抗原的交叉呈递；(4)病原体抗原-反应性CD4+T辅助细胞的激活；辅助DCs交叉呈递的肿瘤抗原；辅助B细胞用于产生病原体抗原-反应性抗体；以及辅助病原体抗原或肿瘤-反应性CD8+T细胞的激活和存活；(5)肿瘤细胞的细胞溶解：ADCC(病原体抗原-反应性抗体)；CD8+T-细胞介导的细胞毒性(病原体抗原-反应性T细胞)；以及CD8+T细胞介导的细胞毒性(肿瘤抗原反应性CD8+T细胞-经由抗原扩展)。
B.皮肤靶向组合物
在一个实施方式中，本发明的组合物包括一个或更多个靶向部分(T)，其结合靶分子或正常细胞或组织的组分，例如皮肤中的角质形成细胞(组织-靶向部分)。在一个实施方式中，靶向部分结合角质形成细胞上的细胞表面分子或受体，例如表皮生长因子受体(EGFR)。
在一个实施方式中，本发明包括组织-靶向部分——例如EGFR的抗体、以及核酸分子的偶联物，其中所述核酸分子编码一个或更多个产物(例如，核酸例如RNA、肽、多肽、融合肽)并能够刺激免疫应答。在一个实施方式中，核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序。在另一个实施方式中，核酸分子编码一个或更多个刺激免疫应答的产物。在一个相关实施方式中，核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序，并编码一个或更多个刺激免疫应答的产物。
在一个实施方式中，本发明包括组织-靶向部分——例如EGFR的抗体、以及核酸分子的偶联物，其中所述核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)并编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)。
在一个实施方式中，本发明包括组织-靶向部分——例如EGFR的抗体、一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)和核酸分子的偶联物，所述核酸分子编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)。
在一个实施方式中，本发明包括组织-靶向部分——例如EGFR的抗体、一个或更多个损伤相关分子模式(DAMP)或警报素、以及核酸分子的偶联物，所述核酸分子编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)。
在一个实施方式中，本发明包括组织-靶向部分——例如EGFR的抗体，编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)和不编码或编码下列一个或更多个的一个或更多个核酸分子的偶联物：(i)一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)，(ii)一个或更多个损伤相关分子模式(DAMP)/警报素，(iii)一个或更多个免疫刺激分子，包括募集、结合、激活、成熟和/或增殖抗原呈递细胞或树突细胞或其它免疫细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)的分子以及对抗免疫抑制的分子(例如，DC吸收受体的配体/抗体、免疫刺激细胞因子、化学因子、共刺激分子、生长因子)。在一个相关实施方式中，核酸分子编码一个或更多个病原体抗原/抗原决定簇——作为融合蛋白。一方面，抗原的融合配偶体促进DC的抗原吸收、免疫识别和/或免疫活化。另一方面，融合配偶体包括靶向DC吸收受体的分子。另一方面，融合配偶体是警报素。在一个相关实施方式中，本文所述的靶向部分-核酸偶联物(一个或更多个)进一步包括一个或更多个PAMP和/或一个或更多个DAMP/警报素。
在一个实施方式中，本发明包括组织-靶向部分——例如EGFR的抗体，编码一个或更多个肿瘤抗原/抗原决定簇和编码下列一个或更多个的一个或更多个核酸分子的偶联物：(i)源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(例如CD4+T细胞表位)，(ii)一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)，(ii)一个或更多个损伤相关分子模式(DAMP)/警报素，(iii)一个或更多个免疫刺激分子，包括募集、结合、激活、成熟和/或增殖抗原呈递细胞或树突细胞或其它免疫细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)的分子以及对抗免疫抑制的分子(例如，DC吸收受体的配体/抗体、免疫刺激细胞因子、化学因子、共刺激分子、生长因子)。在一个相关实施方式中，核酸分子编码一个或更多个含肿瘤抗原的融合蛋白。一方面，肿瘤抗原的融合配偶体促进DC的抗原吸收、免疫识别和/或免疫活化。在另一个实例中，融合配偶体包括靶向DC吸收受体的分子。在另一个实例中，融合配偶体是源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的抗原或抗原决定簇(CD4+T细胞表位)。在另一个实例中，融合配偶体是警报素。在一个相关实施方式中，本文所述的靶向部分-核酸偶联物(一个或更多个)进一步包括一个或更多个PAMP和/或一个或更多个DAMP/警报素。
在一个实施方式中，本发明包括组织-靶向部分——例如EGFR的抗体，一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)和/或警报素，以及包括下列一个或更多个的抗原肽/多肽的偶联物：(i)源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇，(ii)一个或更多个肿瘤抗原或抗原决定簇。在偶联物的一方面，肿瘤或病原体-衍生的抗原或抗原决定簇连接或融合至警报素(例如LL 37)。
在另一个实施方式中，本发明包括靶向皮肤细胞表面受体(例如EGFR)的抗体或其它部分，一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)，以及并入编码一个或更多个病原体或病原体-衍生抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的基因的核酸分子的偶联物。例如，本发明的偶联物包括靶向部分+任何PAMP+编码病原体抗原的质粒/小环DNA。
在另一个实施方式中，偶联物包括靶向皮肤细胞表面受体(例如EGFR)的抗体或其它部分，一个或更多个损伤相关分子模式(DAMP)或警报素，以及并入编码一个或更多个病原体或病原体-衍生抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的基因的核酸分子。例如，偶联物包括靶向部分+任何DAMP/警报素+编码病原体抗原的质粒/小环DNA。
还在另一个实施方式中，偶联物包括靶向皮肤细胞表面受体(例如EGFR)的抗体或其它部分，以及并入编码下列一个或更多个的基因的核酸分子：病原体或病原体-衍生抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)，病原体相关分子模式(PAMP)，损伤相关分子模式(DAMPs)，警报素。例如，偶联物包括靶向部分+编码病原体或病原体-衍生抗原或抗原决定簇的DNA；或偶联物包括靶向部分+编码病原体或病原体-衍生抗原或抗原决定簇和一个或更多个PAMP、DAMP、警报素的DNA。
在另一个实施方式中，偶联物包括靶向皮肤细胞表面受体(例如EGFR)的抗体或其它部分，并入编码一个或更多个肿瘤抗原以及下列一个或更多个的基因的核酸分子：病原体或病原体-衍生抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)，病原体相关分子模式(PAMP)，损伤相关分子模式(DAMPs)，警报素。例如，偶联物包括靶向部分+编码肿瘤抗原+病原体或病原体-衍生抗原或抗原决定簇、DAMP、警报素的DNA。
在一个实施方式中，本发明包括偶联物，其包括靶向皮肤细胞表面受体(例如EGFR)的抗体或其它部分以及核酸分子，其中所述核酸分子并入一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)以及编码一个或更多个病原体或病原体-衍生抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的基因。
还在另一个实施方式中，本发明包括靶向皮肤细胞表面受体(例如EGFR)的抗体或其它部分、一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)/警报素、和并入编码一个或更多个病原体或病原体-衍生或肿瘤抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的基因的核酸分子的偶联物。例如，偶联物包括靶向部分+任意PAMP/警报素+编码肿瘤抗原的质粒/小环DNA；或偶联物包括靶向部分+任意PAMP/警报素+编码肿瘤抗原和病原体抗原的质粒/小环DNA。
虽然不意图受限于任何一种作用机制，下列是本发明偶联物的一种作用模式：(a)EGFR受体-介导的小环/质粒DNA与靶皮肤细胞(角质形成细胞)的结合以及DNA在皮肤中的保持/固定；(b)角质形成细胞中受体-介导的内吞作用和在靶中小环编码的感兴趣基因的表达-例如，由MHC分子呈递的疟原虫表位(CSP-1抗原衍生的B或T细胞抗原决定簇)；(c)皮肤中由APC/DC进行的偶联物-调理的角质形成细胞的吞噬(朗格汉斯细胞)：(i)抗体Fc-DC Fc受体相互作用-介导的DNA编码的病原体抗原或肿瘤抗原表位(T细胞和B细胞表位)的呈递-间接抗原交叉呈递；(ii)小环吸收-APC中感兴趣基因的表达(T细胞和B细胞表位)-直接呈递；(iii)TLR激动剂、PAMPs、DAMPs、警报素(偶联物-衍生的和内源的)进行的DCs的激活；(iv)识别病原体抗原或肿瘤抗原衍生表位(例如多个CSP-1表位)的抗原-反应性T细胞和B细胞的激活。
在一个实施方式中，偶联物包括EGFR-靶向部分以及编码病原体抗原衍生基因的DNA质粒/小环。在另一个实施方式中，偶联物包括靶向角质形成细胞上的人表皮生长因子受体的抗体(抗EGFR Ab：例如西妥昔单抗、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、帕尼单抗(panitumumab))以及编码病原体抗原衍生基因的DNA小环。还在进一步的实施方式中，偶联物包括靶向角质形成细胞上的人表皮生长因子受体的适配子(抗EGFR DNA或RNA适配子)以及编码病原体抗原衍生基因的DNA小环。另外，靶向部分可以是EGFR-靶向肽和编码病原体抗原衍生基因的DNA小环。
本文提供DNA质粒和小环编码的病原体抗原衍生基因的实例。在一个实施方式中，编码的抗原是疟原虫(疟疾抗原)的环子孢子蛋白(CSP-1)。在进一步的实施方式中，这种偶联物可以被施用以提供利用疟疾CSP-p28构建体的DNA接种。疟疾环子孢子蛋白(CSP)是子孢子的主要表面蛋白并已显示赋予疟疾的保护小鼠模型。Bergmann-Leitner等((C3d-defined complement receptor-binding peptide p28conjugated to circumsporozoite protein provides protection against Plasmodium berghei.Vaccine 25(45)，2007)表明，编码CSP与三个拷贝的C3d补体受体结合肽p28的DNA疫苗诱导小鼠模型中对伯氏疟原虫(P.berghei)感染激发的保护。该疫苗直接偶联于EGFR抗体以形成本文包含的偶联物。这样，该类型的偶联物靶向角质形成细胞，且编码的抗原-p28融合蛋白可靶向DC吸收受体。
在进一步的实施方式中，编码的抗原是疟原虫的裂殖子抗原；炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)；结核分枝杆菌抗原；志贺氏杆菌IpaB和IpaC；流感病毒抗原或其组合。病原体抗原的扩充列举是本领域已知，并且这些抗原可容易地用于本发明的内容。
在本发明的另一方面，是EGFR-靶向部分以及编码一个或更多个肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的DNA质粒/小环的偶联物。
在一个实施方式中，偶联物包括靶向角质形成细胞上的人表皮生长因子受体的抗体(抗EGFR Ab：例如西妥昔单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗)以及编码肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的DNA小环。在进一步的实施方式中，靶向部分可为本文公开的任何变化(例如适配子，肽)。
肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的扩充列举是本领域已知的，并且这些抗原可用于本发明的内容。这些抗原的一些非限制实例包括癌症-睾丸抗原，例如MAGE-1、BAGE、GAGE-1、NY-ESO-1；谱系特异性抗原：例如黑素细胞抗原(酪氨酸酶、MART-1、gp100)；肿瘤-特异性改变的基因产物(扩增的、异常表达的、过表达的或突变的基因、剪切变体、基因融合产物)：例如，HER2/neu、p53、Ras基因-KRAS2、HRAS、NRAS、粘蛋白-1、β联蛋白、MUM1、CDK4、BCR-ABL融合产物，存活素(surviving)、TERT、CEA、AFP、N-乙酰葡糖胺转移酶V；免疫球蛋白独特型B-细胞恶性肿瘤；病毒癌抗原；例如人乳头瘤病毒HPV E6和E7抗原，EBV LMP1和LMP2，及其它。在一个进一步的实施方式中，一个或更多个肿瘤抗原可以在DNA小环下游或作为病原体-衍生抗原决定簇(例如破伤风FrC或DOM1)的融合配偶体编码，以提供CD4+T细胞辅助(如上文肿瘤靶向偶联物所述)。
制备这种偶联物的说明性方法如下：使用小环分离的常规技术，分离编码炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)的DNA质粒/小环；使用密码子优化，对炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)的DNA序列进行优化，用于在哺乳动物细胞中有效表达(DNA2.0)。在另一个实施方式中，DNA质粒/小环编码环子孢子蛋白(CSP-1)并且也进行密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达。另外，可以使用本领域已知和本文公开的组织/细胞-特异性启动子调节表达。
DNA疫苗设计和原理：并入病原体-或肿瘤抗原衍生序列的DNA疫苗与EGFR靶向部分的偶联导致在靶向角质形成细胞中这些抗原决定簇的表达以及抗原物质(病原体或肿瘤抗原衍生抗原)向已吞噬靶向角质形成细胞的APCs的间接转移(交叉呈递；经由抗体Fc与APC FcR上Fc受体相互作用而促进)。一定比例的抗体-DNA疫苗还可以由APCs直接吸收和表达。病原体-或肿瘤-衍生抗原的这种交叉呈递和直接呈递可提供有效的T-细胞辅助并引起下列免疫应答：
病原体抗原-和肿瘤抗原-特异性抗体的诱导：本发明的抗体-DNA偶联物能够使得病原体抗原在靶向角质形成细胞中表达以及由DCs进行病原体或肿瘤抗原的交叉呈递(来自吞噬的调理的角质形成细胞和/或疫苗中共编码的/融合的抗原)。抗体-DNA偶联物增强呈递这些抗原的DCs的激活，其经由偶联物-衍生的外源和细胞-衍生的内源免疫刺激PAMPs和DAMPs进行，从而促进抗原反应性CD4+T辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞的激活。由DC刺激的病原体抗原-特异性TH细胞能够初始化和加强B细胞以产生针对交叉呈递抗原的抗体(经由CD40-CD40配体相互作用和细胞因子产生)。
病原体抗原或肿瘤-反应性细胞毒性T细胞的诱导：编码微生物抗原或其它非自身抗原的抗体DNA疫苗可用于起始并放大针对一系列在其它情况下弱的肿瘤抗原的CD8+T淋巴细胞(CTL)免疫应答。例如，破伤风FrC-特异性TH细胞允许DCs交叉呈递FrC和肿瘤抗原，以初始化和加强针对于弱肿瘤抗原的CD8+T细胞应答。由于免疫显性病原体衍生肽可限制对亚显性肿瘤衍生表位的反应，由抗肿瘤DNA疫苗共编码的病原体衍生抗原可以被最小化，以便含有提供CD4+T细胞辅助所需的表位(例如，FrC的单一结构域-DOM1，或混杂MHC II类结合肽，例如破伤风毒素p30)。
DNA质粒/小环疫苗的配制：特定的密码子优化的病原体衍生DNA序列(编码PA或CSP的DNA小环，具有或不具有三个拷贝的C3d补体受体区p28)以及在GeneGrip质粒系列上发现的重复结合位点1和2的DNA序列被克隆到中间体哺乳动物表达载体中，所述载体含有CMVie启动子和SV40终止子载体。在序列确认后，使用含有SpeI(5’端)或ApaI(3’端)限制核酸内切酶位点特异性尾的PCR引物，对全部表达盒(CMV启动子、抗原、SV40、寡核苷酸结合基序)进行PCR扩增。然后用SpeI和ApaI消化PCR产物并连接至p2ΦC31小环载体的SpeI和ApaI位点。然后将构建体p2ΦC31-PA转化至大肠杆菌NM522细胞中和测试重组能力。使含有该质粒的大肠杆菌生长，然后通过添加阿拉伯糖(0.25％终浓度)来诱导重组。在诱导前(0时间点)和诱导后(60和120分钟)采取培养物的等分试样并进行小量制备质粒分离。产生的质粒制备物进行电泳，以确定亲本质粒是否已重组至小质粒和小环。如在凝胶上存在小环条带所测定的，重组是成功的。还存在骨架质粒条带(小质粒)，但它的亮度随时间降低(表明I-SceI酶切割质粒骨架并且其正被细胞核酸内切酶降解)。
DNA质粒/小环疫苗与EGFR靶向部分的偶联。本发明所述的DNA疫苗/EGFR-靶向部分偶联物提供免疫效力的多因子改进：(1)能够进行DNA疫苗向角质形成细胞的靶向递送、保持和受体-介导的内化，和编码的病原体-或肿瘤-衍生抗原在角质形成细胞中的表达；(2)偶联物调理的角质形成细胞的吞噬促进由DCs进行的Fc-介导的病原体-和肿瘤抗原的交叉呈递，以及偶联物编码的基因在DCs中的直接表达和呈递；(3)抗体-DNA偶联物包被的肿瘤细胞增强经由偶联物-衍生的外源和细胞-衍生的内源免疫刺激PAMPs和DAMPs的DCs活化，从而促进针对呈递抗原反应的CD4+T辅助细胞和B细胞和CD8+细胞毒性T细胞的激活。
在一个实施方式中，本发明的偶联物包括寡核苷酸，其用于将偶联物结合至小环。这种寡核苷酸可包括线性ss寡核苷酸[LNA/DNA ODNs，含有(CT)n或(GA)n重复基序，与双链质粒或小环DNA中的相应ds DNA序列互补]结合于超螺旋的、双链小环DNA。这种寡核苷酸的实例包括但不限于：LNA ODN(5’-NH2-GAGG-CTCTCTCTCTCTC-3’)；杂交物LNA-DNA ODN，具有CpG DNA硫代磷酸骨架：5’tccatgacgttcctgacgttt CTCTCTCTCTCTC -GGAG-NH2-3’；5’cggcggataaccgcgagcggttattcgccctacgg CTCTCTCTCTCTC-GGAG-NH2-3’(重复基因外回文-REP序列；绿脓杆菌)；或5’gggggacgatcgtcggggg CTCTCTCTCTCTC-GGAG-NH2-3’(A类CpG ODN)。
例如，在10mM磷酸盐缓冲液，1mM EDTA，pH5.8中在37℃将小环DNA与LNA ODN或具有CpG DNA硫代磷酸骨架的杂交物LNA-DNA ODN温育16小时，ODN对质粒中的ODN-结合位点摩尔过量最大4-至40倍。在一端含有胺反应性NHS酯以及在另一端含有巯基反应性马来酰亚胺基的异双功能试剂用于产生抗体-DNA偶联物，如所述(参考Bioconjugate techniques，Hermanson，G.T.，AcademicPress，1996，456-527页)。
在进一步的实施方式中，抗体-质粒/小环偶联物可并入所述的阳离子肽，例如警报素LL-37，其可促进保护DNA免于核酸酶，促进细胞进入和/或增强DC活化。
靶向部分-DNA疫苗偶联物的作用可分析如下：(a)靶细胞(例如角质形成细胞)中EGFR-介导的内吞作用；(b)角质形成细胞中感兴趣基因的表达-由MHC分子呈递的病原体抗原衍生的或肿瘤抗原表位(B或T细胞抗原决定簇)；(c)由APC/DC进行的调理的角质形成细胞的吞噬：(i)由偶联物-衍生PAMPs、DAMPs进行的DCs的激活；(ii)病原体抗原CD4+T细胞和B细胞表位的呈递；(iii)肿瘤相关抗原的交叉呈递；(d)病原体抗原-反应性CD4+T辅助细胞的激活；(i)提供辅助给DCs来交叉呈递肿瘤抗原；(ii)提供辅助给B细胞用于产生of病原体抗原-反应性抗体；(iii)提供辅助用于病原体抗原或肿瘤-反应性CD8+T细胞的激活和存活。
C.APC/DC靶向组合物
在一个实施方式中，本发明包括组织靶向部分例如EGFR的抗体、一个或更多个核酸分子、和一个或更多个肽/多肽的偶联物。在一个实施方式中，核酸分子并入一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序，和/或编码一个或更多个刺激抗原-特异性免疫应答的产物，如本文所述(注：0030，0031)。在偶联物的各种实施方式中，肽/多肽包括下列一个或更多个：(i)一个或更多个病原体和/或肿瘤抗原或抗原决定簇，(ii)警报素，(iii)DC结合分子(例如DC吸收受体的配体)。一方面，本文所述偶联物的肽/多肽可以互相融合/连接和/或融合/连接至核酸结合肽(例如，阳离子肽、鱼精蛋白、HIV-tat、精氨酸-或组氨酸-富含序列、LL-37、核定位肽)。
在一个实施方式中，本发明的组合物包括一个或更多个靶向部分(T)，其结合正常免疫细胞或组织例如抗原呈递细胞或树突细胞的靶分子或组分(APC/DC-靶向部分)。在一个实施方式中，靶向部分结合树突细胞吸收受体，例如DEC-205。
在一个实施方式中，本发明包括偶联物，其包括靶向抗原呈递细胞(APC)/树突细胞(DC)的抗体或其它部分，例如DC吸收受体；以及编码感兴趣的基因的核酸分子。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分以及核酸分子的偶联物，其中所述核酸分子编码一个或更多个产物(例如，核酸例如RNA、肽、多肽、融合肽)并能够刺激免疫应答。在一个实施方式中，核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序。在另一个实施方式中，核酸分子编码一个或更多个刺激免疫应答的产物。在一个相关实施方式中，核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)或其它免疫刺激基序，并编码一个或更多个刺激免疫应答的产物。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分例如DEC-205的抗体、以及一个或更多个核酸分子的偶联物，其中所述核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)并编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)。在一个相关实施方式中，本文所述的靶向部分-核酸偶联物(一个或更多个)进一步包括一个或更多个PAMP和/或一个或更多个DAMP/警报素。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分，一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)，和编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的一个或更多个核酸分子的偶联物。在一个相关实施方式中，本文所述的靶向部分-核酸偶联物(一个或更多个)进一步包括一个或更多个DAMP/警报素。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分，一个或更多个损伤相关分子模式(DAMP)或警报素，和编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)的一个或更多个核酸分子的偶联物。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分和一个或更多个核酸分子的偶联物，所述核酸分子编码源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)并编码一个或更多个免疫刺激分子，例如募集、结合、激活、成熟和/或增殖抗原呈递细胞或树突细胞或其它免疫细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)的分子以及对抗免疫抑制的分子(例如免疫刺激细胞因子、化学因子、共刺激分子、生长因子)。在一个相关实施方式中，核酸分子编码一个或更多个病原体抗原/抗原决定簇——作为融合蛋白。在一个相关实施方式中，本文所述的靶向部分-核酸偶联物(一个或更多个)进一步包括一个或更多个PAMP和/或一个或更多个DAMP/警报素。一方面，偶联物进一步包括一个或更多个肽，所述肽包括一个或更多个病原体-衍生抗原或抗原决定簇。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分和一个或更多个核酸分子的偶联物，所述核酸分子编码一个或更多个肿瘤抗原和编码下列一个或更多个：(i)源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(例如CD4+T细胞表位)，(ii)一个或更多个免疫刺激分子，例如募集、结合、激活、成熟和/或增殖抗原呈递细胞或树突细胞或其它免疫细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)的分子以及对抗免疫抑制的分子(例如免疫刺激细胞因子、化学因子、共刺激分子、生长因子)。在一个相关实施方式中，核酸分子编码一个或更多个肿瘤抗原——作为与源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的抗原或抗原决定簇(CD4+T细胞表位)的融合蛋白。在另一个实例中，融合配偶体是警报素。在一个相关实施方式中，本文所述的靶向部分-核酸偶联物(一个或更多个)进一步包括一个或更多个PAMP和/或一个或更多个DAMP/警报素。一方面，偶联物进一步包括一个或更多个肽，所述肽包括一个或更多个病原体-衍生的或肿瘤的抗原或抗原决定簇。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分、一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)和/或一个或更多个警报素、和一个或更多个抗原肽的偶联物，所述抗原肽包括一个或更多个肿瘤抗原和/或源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的一个或更多个抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)。在一个实施方式中，抗原肽与靶向部分融合或并入其中。另一方面，抗原肽与警报素(例如LL-37)融合。
在一个实施方式中，本发明包括APC/DC-靶向部分、一个或更多个核酸分子和一个或更多个抗原肽的偶联物，其中所述核酸分子包括一个或更多个病原体相关分子模式(PAMP)并且抗原肽包括肿瘤抗原和/或源自一个或更多个病原体、微生物或病毒的抗原或抗原决定簇(T或B细胞表位)。在一个实施方式中，抗原肽与靶向部分融合或并入其中。在偶联物的一个相关实施方式中，抗原肽与核酸结合肽(例如阳离子肽、NLS、Tat、鱼精蛋白、His6、Arg9、LL-37)融合。另一方面，抗原肽与靶向DC吸收受体的肽基序融合。一方面，抗原肽与靶向部分融合或并入其中。另一方面，抗原肽与警报素融合。
涉及DCs的作用机制的一个非限制实例如下。树突细胞具有一系列吸收受体，用于通过吸收性内吞有效并特异地捕获抗原。DCs加工捕获的抗原并主要将它们作为肽-主要组织相容性复合物(MHC)分子复合物呈递，以引起T细胞的特异性激活。该过程要求DCs响应于环境刺激——例如通过模式相关分子模式(PAMPs)的识别、或内源刺激——例如警报素而激活和成熟。本发明的偶联物使得抗原基因表达(用于抗原呈递)和DC活化/成熟(通过偶联的或编码的PAMPs/DAMPs)能够同时发生，从而增强体内或离体激活抗原特异性免疫细胞的能力。
因此，偶联物是具有下列作用机制的多功能分子：(a)树突细胞中DC受体-介导的吸收/内吞作用；(b)DC中感兴趣基因的表达——由MHC分子呈递的肿瘤或病原体表位或融合产物(抗原衍生的B或T细胞抗原决定簇)；(c)T或B细胞表位的呈递和APC/DC的同时激活：(i)由编码的或连接的PAMPs、DAMPs/警报素进行的TLRs激活；(ii)T细胞和B细胞表位的呈递；以及(iii)识别抗原表位的抗原-反应性T细胞和B细胞的激活。
在各种实施方式中，DC靶向部分可包括靶向DC吸收受体的抗体、适配子、肽或配体，所述受体例如下列：C-类凝集素样受体：DC-SIGN(树突细胞-特异性ICAM-3-结合非整联蛋白)，MMR(MRC1)(巨噬细胞甘露糖受体)，DEC-205(LY75)(由抗DEC-205抗体连接)，BDCA-2(血液树突细胞抗原)(C型凝集素超家族CLECSF11)，Langerin或Dectin-1；Fc受体：(由免疫复合物和调理的细胞连接)，FcgRI(CD32)，FcgRII(CD64)；整联蛋白：(由凋亡的细胞和调理的抗原连接)，aVb5，aMb2(CD11b/CD18，补体受体3-CR3)，或aXb2(CD11c/CD18，补体受体4-CR4)；清除受体：(由凋亡的细胞和热休克蛋白(hsp)-肽复合物连接)，CD36，LOX-1低密度脂蛋白、氧化的，受体-1(OLR1)；或CD91，水通道蛋白。例如，经由DEC-205、Fcg受体、aVb5整联蛋白、CD36、LOX-1和CD91的抗原吸收均已与交叉呈递相关。
DC靶向部分是已知的并且可用于本发明的内容。在一个实施方式中，DC靶向部分是抗DEC205：DEC-205(NLDC-145)，其为DCs中高水平表达的内吞受体。
可以使用常规技术制备抗体。DC靶向肽(例如p28)。C3d-限定的补体受体-结合肽p28用于制备本发明的DNA-抗体偶联物。
用于偶联物合成的DNA疫苗可包括线性或环状质粒、小环DNA或MIDGE。由DNA疫苗编码的具体基因选自下列：DNA质粒或小环编码的病原体抗原衍生基因；来自疟原虫(疟疾抗原)的环子孢子蛋白(CSP-1)或裂殖子蛋白：寄生虫；炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)：革兰氏阳性细菌；结核分枝杆菌抗原：分枝杆菌；志贺氏杆菌IpaB和IpaC：革兰氏阴性细菌；流感病毒抗原：病毒。
DNA质粒或小环编码的肿瘤抗原和肿瘤相关抗原(在说明书中的完整列举)；癌症-睾丸抗原，例如MAGE-1、BAGE、GAGE-1、NY-ESO-1；谱系特异性抗原：例如黑素细胞抗原(酪氨酸酶、MART-1、gp100)；肿瘤-特异性改变的基因产物(扩增的、异常表达的、过表达的或突变的基因，剪切变体，基因融合产物)：例如，HER2/neu、p53、Ras基因-KRAS2、HRAS、NRAS、粘蛋白-1、β联蛋白、MUM1、CDK4、BCR-ABL融合产物、存活素(surviving)、TERT、CEA、AFP、N-乙酰葡糖胺转移酶V；免疫球蛋白独特型，在B-细胞恶性肿瘤中；病毒癌抗原，例如人乳头瘤病毒HPV E6和E7抗原，EBV LMP1和LMP2。在进一步的实施方式中，肿瘤抗原可以在DNA小环下游或作为病原体-衍生抗原决定簇的融合配偶体(例如破伤风FrC或DOM1)编码，以提供CD4+T细胞辅助(如上文肿瘤靶向偶联物所述)。
在另一个实施方式中，公开了鉴定核酸偶联物的方法，所述核酸偶联物诱导免疫细胞活化/成熟和靶细胞死亡，所述方法包括：在体外将一个或更多个细胞与测试核酸偶联物接触，所述核酸偶联物含有特异地结合肿瘤细胞的细胞组分、肿瘤血管和/或肿瘤微环境的组分的抗体或肽或靶向部分，其中所述抗体或肽或靶向部分与包括一个或更多个免疫刺激核酸序列(INAS)的核酸偶联，并且其中一个或更多个所述核酸序列包括病原体-相关分子模式(PAMP)或可激活免疫细胞的其它基序；以及在存在或缺乏免疫细胞的情况下测定所述一个或更多个细胞中的标记或表型改变的诱导，其中在测试抗体/肽-核酸偶联物存在的情况下测定的诱导或改变表示免疫细胞活化/成熟、靶细胞信号传导的调节和靶细胞死亡。
另一方面，抗体-核酸偶联物进一步与抗原偶联，所述抗原源自感染性微生物或病原性微生物，包括病毒、细菌、分枝杆菌、螺旋菌、真菌、立克次体、支原体、衣原体、原生动物和后生动物寄生虫或蠕虫。
IV.方法
在本发明的各种方面中，本发明的组合物被施用至需要的对象以预防或治疗疾病状况。在各种实施方式中，本发明的组合物基于其靶向部分和活性剂进行选择。如上文所述，基于要治疗或预防的具体疾病使用式T-A1-A2或其变化。
例如，如果疾病状况是胰腺癌，则免疫偶联物被选择，以便包括对肿瘤抗原和/或胰腺细胞组分具有选择性的靶向部分，一个或更多个免疫刺激核酸分子(例如，PAMP、DAMP、警报素以及可选地抗原多肽。在另一个实例中，免疫偶联物可进一步包括核酸分子(例如，偶联于靶向部分的小环)，所述核酸分子编码抗原多肽、共刺激多肽或这两者。
在各种实施方式中，构成偶联物的核酸序列可以是稳定/稳定化的(以抵抗核酸酶或溶酶体降解)，以便促进由免疫系统进行的它们的递送和识别。
“稳定”或“稳定化的核酸分子”将意味着对体内降解(例如，经由外切或内切核酸酶)具有相对抗性的核酸分子。稳定可以是长度或二级结构的作用。对于较短的免疫刺激核酸分子，二级结构可稳定并增加它们的作用。例如，如果核酸分子的3’端与上游区有自互补性，以使它可返折并形成一种茎环结构，那么核酸分子变得稳定并因此显示更多活性。
一方面，本发明的稳定化核酸分子具有修饰的骨架。为了用于免疫刺激，稳定化核酸分子可包括硫代磷酸(即，核酸分子的至少一个磷酸氧被硫取代)或二硫代磷酸修饰的核酸分子。更具体地，所述磷酸骨架修饰发生在核酸的5’端，例如，核酸5’端的最初两个核苷酸。进一步，所述磷酸骨架修饰可发生在核酸的3’端，例如，核酸3’端的最后五个核苷酸。除了稳定核酸分子外，如本文进一步报道，硫代磷酸-修饰的核酸分子(包括二硫代磷酸-修饰的)也可增加核酸分子免疫刺激的程度。
其它的稳定化核酸分子包括：非离子DNA类似物，例如烷基-和芳基-磷酸酯(其中带电的磷酸氧被烷基或芳基取代)、磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中带电的氧部分是烷基化的。在一端或两端含有二醇，例如四乙二醇或六乙二醇的核酸分子也已显示实质上对核酸酶降解具有抗性。一方面，核酸分子含有肽键(即肽核酸：PNAs)。
可与本发明的组合物和方法一起使用的体内稳定核酸的另外的方法是已知的，例如美国专利号：7,223,741；7,220,549；6,239,116；6,379,930；6,406,705；6,218,371；6,429,199；6,55,206；6,271,206；美国专利申请公开号：20070161590；20070135372；20070078104；20070065467；20070037767；20060240093；20060211639；20060172966；20060008910以及20050191342中公开的。
偶联
在本发明的各种实施方式中，本发明的组合物中包括的一个或更多个组分经由共价或非共价连接被偶联在一起。将核酸分子偶联至其它核酸分子、核酸分子偶联至肽或多肽、以及肽/多肽偶联至其它肽/多肽的各种常规方法是本领域已知的。非共价偶联可以通过氢键、离子相互作用、范德华相互作用和疏水键进行。
另外，采用多种化学方法进行活性剂共价偶联的各种方法是已知的。这些试剂可包括靶向部分例如抗体、多肽和核酸，以及引导活性剂到选择的靶细胞的其它物质。例如，活性剂已偶联于各种微粒载体和已被包覆到脂质体、胶束和纳米颗粒中，在其中它们被保护而免于血清降解。
例如，质粒/小环结合的-寡核苷酸(3’或5’端)的偶联可以对靶向部分例如抗体进行。一端含有胺反应性NHS酯以及另一端含有巯基反应性马来酰亚胺基的异双功能试剂用于产生抗体-DN偶联物。具有这些官能团的交联剂可用于合成偶联物(例如SMCC或硫代-SMCC)。这使得DNA或抗体经由胺反应性NHS酯端激活，产生马来酰亚胺-激活的中间体。在与待偶联的第二分子混合之前，将中间体种类(intermediate species)从过量交联剂和反应副产物中纯化。该方法的多步骤性质限制偶联蛋白的多聚化并提供对交联程度和位点的控制。在涉及由SMCC进行的DNA激活和随后与抗体分子偶联的方案中，制备抗体用于与DNA上的马来酰亚胺基偶联，其通过经由下列选择引入巯基基团而进行：(a)IgG结构铰链区的二硫化物残基可以用2-巯基乙胺或二硫苏糖醇(DTT)还原以暴露游离巯基基团；(b)硫醇化试剂可用于将完整抗体修饰为含有巯基基团(例如SATA和Traut’s试剂；2-亚氨基四氢噻吩(iminothiolane))(参考Bioconjugate techniques，Hermanson，G.T.，Academic Press，1996，456-527页)。
用NHS酯-马来酰亚胺交联剂激活DNA：用硫代-SMCC处理具有携带末端胺的寡核苷酸DNA的三螺旋以产生马来酰亚胺-DNA，然后通过柱层析将其从过量交联剂中纯化。马来酰亚胺激活的DN可立即用于偶联抗体或冷冻干燥以备后用。
在另一个实例中，马来酰亚胺-激活的DNA偶联于还原的或硫醇化的抗体：在EDTA存在的情况下用MEA或DTT还原抗体，以防止金属催化作用对巯基的再氧化。还原的IgG通过柱层析纯化。对于抗体硫醇化，将抗体与硫醇化剂(例如2-亚氨基四氢噻吩或SATA)(10-50倍摩尔过量于抗体)在37℃反应30分钟或在室温反应1小时。用柱层析纯化硫醇化的抗体。还原的或硫醇化的抗体部分与马来酰亚胺-激活的DNA以期望的DNA-抗体比例(例如4∶1至15∶1摩尔比)混合并在37℃温育30-60分钟或在室温温育2h或在4℃过夜。通过亲和性层析将偶联物从未偶联的DNA中纯化，如所述。将偶联物冷冻、冻干或过滤灭菌并保存在4℃。其它方法在本领域中提供：(参考Bioconjugate techniques，Hermanson，G.T.，Academic Press，1996，456-527页)。
在另外的实施方式中，本发明的偶联物包括使用辅助分子连接产生的偶联物制剂，所述辅助分子保护DNA免于核酸酶降解和促进细胞进入。
在一些实施方式中，靶向部分——例如，完整抗体、抗体片段(例如Fab等)、单链抗体——直接地或通过连接体化学偶联至免疫刺激分子(例如，核酸和/或肽/多肽)。连接体可以是短的延伸物(例如，3至15、至25个氨基酸或核酸碱基)。可用于本发明的内容的连接体的实例在美国专利号申请公开号2007/0003514中公开。
在一个实施方式中，本发明的靶向部分交联至一个或更多个组分。例如，一个抗体可以偶联至抗生物素蛋白，以及另一个抗体可以偶联至生物素。这种抗体可以例如将免疫系统细胞靶向于不需要的细胞(参见例如US 4,676,980)。合适的肽交联剂和技术是本领域熟知的并且这些试剂和技术的实例在例如US 4,676,980中公开。
另外，化学偶联分子的方法是本领域普通技术人员熟知的。将免疫刺激分子结合至抗体的方法会根据试剂的化学结构而变化。多肽通常含有多种官能团；例如，羧酸(COOH)或游离胺(--NH2)基，其可用于与效应分子上合适的官能团反应来结合效应子。
另外，靶向部分可以通过共价偶联至聚合物而被化学修饰，以便例如增加它们的循环半寿期。示例性聚合物和将它们结合至肽的方法在例如US 4,766,106、US 4,179,337、US 4,495,285和US 4,609,546中说明。另外的说明性聚合物包括聚氧乙烯化多元醇和聚乙二醇(PEG)(例如，PEG，其具有约1,000至约40,000之间的分子量，例如约2000至约20,000之间，例如，约3,000-12,000)。靶向部分还可以与任何合适类型的化学基团偶联，例如甲基或乙基或碳水化合物基团。这些和其它合适的偶联基团可用于改进靶向部分例如抗体或其功能片段的生物特征，例如，增加血清半寿期、可溶性和/或组织结合。
抗体衍生物可以这样产生：将蛋白或其它试剂/部分/化合物与(a)抗体或其亚基(例如，抗CD38抗体H链、L链或其抗CD38特异性/选择性片段)的N-端侧或C-端侧、合适的取代基或侧链、或(b)抗体中的糖链(参见例如Antibody EngineeringHandbook，edited by Osamu Kanemitsu，published by Chijin Shokan(1994))化学偶联。在合适时，衍生物还可以通过内部残基或糖处偶联产生。
抗体还可以用检测剂衍生化，检测剂例如荧光化合物，包括荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、镧系无机发光材料等。合适的荧光标记的另外实例包括125Eu标记、异硫氰酸酯标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、邻苯二甲醛(o-phthaldehyde)标记、荧光胺标记等。化学发光标记的实例包括鲁米那标记、异鲁米那标记、芳香吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、萤光素标记、萤光素酶标记、水母发光蛋白标记等。
在一个实施方式中，抗体衍生物包括偶联的核酸或核酸相关分子。如本文提供，核酸分子可以是编码核酸、非编码核酸、或编码和非编码核酸序列的组合。在一个实施方式中，非编码序列是在其中或其本身具有免疫刺激性的。
可选地，抗体和/或免疫刺激组分(一个或更多个)可以被衍生以暴露或连接另外的反应性官能团。衍生可涉及多个连接体分子中的任意的连接，例如从PierceChemical Company，Rockford Ill可得的那些。另外，用于本发明内容的合适的交联剂包括异双功能的、具有由合适的间隔分开的两个不同的反应性基团的交联剂(例如，间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能交联剂(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。这种连接体也可从Pierce Chemical Company得到。
如本文所用，“连接体”是用于将抗体连接至包括核酸分子和/或多肽或肽的免疫刺激组分(一个或更多个)的分子。连接体通常能够与抗体和免疫刺激活性剂形成共价键。合适的连接体是本领域普通技术人员熟知的，并且包括但不限于直链或支链碳连接体、杂环碳连接体或肽连接体。当抗体和免疫刺激分子是多肽时，连接体可以通过它们的侧基连接至组分氨基酸(例如，通过二硫键连接至半胱氨酸)。但是，在一个实施方式中，连接体将被连接至末端氨基酸的α碳氨基和羧基基团。
在一些实施方式中，连接体可提供一个或更多个切割位点。因此，本发明的偶联物可包括可切割的或不可切割的连接体。对于本发明，可生物切割的连接被限定为特定化学部分或基团的类型，其可用于组合物中来共价结合或交联组分，例如本文所述的核酸、嵌入剂、活性剂、靶向部分、两亲分子和聚合物。V.R.Sinha等，Europ.J Pharmaceutical Sci.18，3-18(2003)和其中的参考文献公开了用于口服递送的一些合适的实例。可生物切割的连接或键可根据它们的结构和功能来区分。
可切割的肽连接。可生物切割的连接的另一个优选类型是长度为2至100个残基的可生物切割的肽或多肽，优选地长度为3至20个残基。这些限定为某些天然或合成的多肽，所述多肽含有被特定的酶例如组织蛋白酶切割的某些氨基酸序列(即，通常是疏水的)，所述组织蛋白酶主要在细胞内发现(细胞内酶)。使用左侧氨基或“N”端和右侧羧基或“C”端起始的惯例，一些实例为：任何肽，其含有配对的氨基酸Phe-Leu、Leu-Phe或Phe-Phe，例如Gly-Phe-Leu-Gly(GFLG)和其它组合。优选的实例包括亮氨酸脑啡肽衍生物和任何组织蛋白酶可切割的肽连接序列——其由J.J.Peterson，et al，in Bioconj.Chem.，Vol.10，553-557，(1999)和其中的参考文献公开，并且在美国专利申请序列号10/923,112中公开，它们通过引用并入本文——和其它序列。
可生物切割的连接的另一个优选类型是任何“受阻的”或“被保护的”二硫键，其在空间上抑制硫醇盐离子或其它切割机制的攻击。这种被保护的二硫键的实例(但不限于)在偶联剂中发现：S-4-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基苄基硫代硫酸酯(SMBT)和4-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶二硫)甲苯(SMPT)。另一个可用的抵抗还原的偶联剂是SPDB，由Worrell等人，Anticancer Drug Design 1：179-188(1986)公开。还包括某些芳基二硫硫代亚氨酸酯(aryldithio thioimidates)，其邻近二硫化物用甲基或苯基取代，其包括乙基S-乙酰基3-巯基丁酸硫代亚氨酸酯(ethyl S-acetyl3-mercaptobutyrothioimidate，M-AMPT)和3-(4-羧基酰氨基苯基二硫代)丙酸硫代亚氨酸酯(3-(4-carboxyamido phenyldithio)proprionthioimidate，CDPT)，由S.Arpicco等人，Bioconj.Chem.8(3)：327-337(1997)公开。
用于将各种化合物结合至蛋白例如抗体的许多方法和连接体分子是已知的(参见，例如欧洲专利申请号188,256；美国专利号4,671,958、4,659,839、4,414,148、4,699,784、4,680,338、4,569,789以及4,589,071；以及Borlinghaus等(1987)CancerRes.47：4071-4075)。
双功能连接体或三功能连接体——其具有与嵌合部分的每个组分上的基团具有反应性的一个官能团——可用于形成所期望的免疫偶联物。可选地，在某些实施方式中，衍生可涉及抗体的化学治疗，例如，用高碘酸对糖蛋白抗体的糖部分进行乙二醇切割以产生游离醛基。抗体上的游离醛基可以与例如结合多肽的连接体上的游离胺基或肼基反应(参见，例如美国专利号4,671,958)。多肽例如抗体或抗体片段上产生游离巯基的方法也是已知的(参见，例如美国专利号4,659,839)。
在另一个实施方式中，偶联是在双链核酸分子和单链核酸之间。在可选的实施方式中，单链或双链可以偶联至靶向部分。在一个实施方式中，靶向部分连接至核酸分子，所述核酸分子偶联(例如，被结合)至另一个核酸分子以形成三链体核酸分子。另外，三链体核酸分子自身可进一步与双链或单链核酸相互作用，即形成四链体(quadraplex)和四链体核酸分子。在一个实施方式中，形成三链体，其中DNA的三个链取决于Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对形成复合体。三链体分子可以以高亲和性并特异性结合靶区。如何制备和使用三链体形成分子以结合多种不同靶分子的代表性实例可见于下列美国专利的非限制列举：US 5,176,996、US5,645,985、US 5,650,316、US 5,683,874、US 5,693,773、US 5,834,185、US 5,869,246、US 5,874,566和US 5,962,426。
在一个实施方式中，本发明的组合物包括核酸分子，其具有免疫刺激性并与编码一个或更多个肿瘤抗原的核酸分子形成三链体。在进一步的实施方式中，编码一个或更多个肿瘤抗原的核酸进一步编码或可选地编码与病原体相关的一个或更多个抗原。还在另一个实施方式中，编码这种多肽的核酸是小环DNA。小环表达载体是已知的并可用于本发明的内容中，其包括美国专利US 6,143,530、US6,825,012和US 7,018,833所公开的。
还在另一个方法中，抗体与活性剂(例如，核酸分子)的偶联通过光亲和性引起。抗体含有一个或更多个光亲和性位点，其提供光亲和性化合物与抗体的选择性位点特异性结合。具体地，已发现抗体包括一个或更多个位点，所述位点对嘌呤、叠氮-嘌呤和其它类似杂环有机化合物、尤其是ATP-或GTP-类似物具有高亲和性。另外，其它光亲和性结合位点可进一步被鉴定，例如，通过抗体与不含嘌呤的光亲和性化合物的反应，所述不含嘌呤的光亲和性化合物例如嘧啶衍生物，如dUTP的光活性类似物，包括5-叠氮-2′-脱氧尿苷5′-三磷酸(5-N.sub.3dUTP)。
嘌呤或叠氮嘌呤核苷酸亲和性位点在下文将称为“嘌呤环结合”结构域或位点或简单地称为“PRB”结构域或位点。在本发明人发现光亲和性化合物，尤其是嘌呤或叠氮嘌呤光亲和性化合物通过在温和的生理状况下发生的光激活的化学反应易于结合抗体和抗体片段后，抗体分子上的PRB位点被发现。具体地，抗体包括一个或更多个PRB位点，所述位点显示对嘌呤和叠氮嘌呤光亲和性类似物如此高的亲和性，以至抗体与嘌呤和叠氮嘌呤光亲和性类似物在温和的生理状况下反应，以及更具体地，在仅一个2-5分钟光裂解后就导致几乎100％的光结合。
如美国专利5,693,764所述，光亲和性提供核苷酸或核苷光亲和性化合物——优选地为含有嘌呤、叠氮嘌呤或类似杂环碱基的光亲和性类似物，以及更优选地ATP-或GTP-类似物光亲和性化合物——有效光插入到抗体分子中，其不引起抗原结合的实质损失。
用于将核苷酸光亲和性类似物连接至蛋白的合适方法描述于例如：Potter&Haley，Meth.，Enzymol.，91：613-633，(1983)；Owens & Haley，J.Biol.Chem.，259：14843-148 48，(1987)；Atherton等，Biol.of Reprod.，32：155-171，(1985)；Khatoon等，Ann.of Neurology，26：210-219，(1989)；King等，J.Biol.Chem.，269：10210-10218，(1989)；Dholakia等，J.Biol.Chem.，264：20638-20642，(1989)；Campbell等，Proc.Natl.Acad.Sci.，87：1243-1246，(1990)；以及Kim等，J.Biol.Chem.，265：3636-3641，(1990)中，这些参考通过引用全部并入本文。
有效地结合核苷酸或核苷光亲和性化合物的任何抗体或含抗体组合物都在本发明范围内。通过实例的方式，这包括多克隆和单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、来自不同物种(例如小鼠、山羊、兔、人、大鼠、牛等)的抗体、抗独特型抗体、不同同种型的抗体(IgG、IgM、IgE、IgA等)、以及其片段及衍生物(例如，(Fab)2片段)。
作为实例，包括在质粒和小环DNA中的核苷酸序列可以根据下列说明产生：
能够与寡核苷酸杂交并结合的ds DNA序列
具体序列优选地与用于形成三螺旋的寡核苷酸完全互补
序列在不影响启动子-指导的感兴趣基因表达的位点并入
序列可以是长度为3-50个碱基对；优选地＞10个碱基对
实例性序列可优选地为同型嘌呤(Pu)-同型嘧啶(Py)ds DNA：
质粒中重复序列的区域，基于(CT)n，在相对链上具有互补重复序列(GA)n。例如：5’CTCTCTCTCTCTCTC 3’(SEQ ID NO：_)
1)3’GAGAGAGAGAGAGAG 5’(SEQ ID NO：_)
2)质粒中重复序列的区域，基于(CCTT)n，具有互补链(GGAA)n。例如：5’CCTTCCTTCCTTCC 3’(SEQ ID NO：_)
(2)3’GGAAGGAAGGAAGG 3’(SEQ ID NO：_)
质粒中重复序列的区域，基于(CTT)n，具有互补链(GAA)n。
例如：5’CTT CTT CTT CTT CTT CTT  3’(SEQ ID NO：_)
a.3’GAA GAA GAA GAA GAA GAA 5’(SEQ IDNO：_)
质粒中重复序列的区域，基于(CCT)n，具有互补链(GGA)n。
例如：5’CCT CCT CCT CCT CCT CCT  3’(SEQ ID NO：_)
b.3’GGA GGA  GGA GGA  GGA GGA  5’(SEQ ID NO：_)
任意其它同型嘌呤-同型嘧啶序列。
例如5’TCT CCT CCT TT 3’(SEQ ID NO：_)
3’AGA GGA GGA AA 5’(SEQ ID NO：_)
在一些实施方式中，鸟嘌呤-富含DNAs可组装以形成四链结构，其基于G-四集体(quartet)(1-4)四方平面排列的堆积。G-四集体由四个鸟嘌呤组成，它们通过Hoogsteen型碱基配对连接。一价阳离子在G-四集体之间的中央腔中被选择性地结合，并且这些结构被钾特异性地稳定；钠产生较不稳定的复合物，而锂抑制组装(5，6)。G-四元体(G-quadruplexes)可以通过四个DNA链的分子内结合(5，7，8)、通过含有两个G-束(G-tracts)(9，10)的序列的二聚化或通过含有至少四个G-束(11-15)的一个链的分子内折叠形成。具体地，端粒序列由高度重复的G-富含序列组成，例如人和其它高等生物中的(GGGTTA)n，四膜虫中的(GGGGTT)n和尖毛虫(Oxytrichia)中的(GGGGTTTT)n。四元体也已涉及在一些癌基因的控制区中，特别是c-myc(16，17)、免疫球蛋白转换区(3)、成视网膜细胞瘤易感性基因(18)、FMR-1基因(19)、鸡β-球蛋白基因(20)和胰岛素基因(21)。另外，已知几个合成的适配子基于G-四元体平台，包括靶向HIV-整合酶(22)和凝血酶(12)的那些。通过形成非Watson-Crick鸟嘌呤-鸟嘌呤碱基配对的分子内结构，含有G-四集体的分子可自我结合。这些结构在低于40℃、中等离子强度和中性pH下形成并具有类似发夹双链体的行为。之前已显示，末端(3’端或5’端)T的添加稳定四元体结构(37)，这是由另外的碱基堆积引起的作用，其具有可能地与末端G-四集体的某些配对(38)。
例如，形成的序列可以是：5’TGGGGT 3’
(1)3’TGGGGT 5’
在一个实施方式中，以质粒或小环DNA提供并入指定核苷酸序列的方法(包括靶细胞活性启动子序列、感兴趣基因和寡核苷酸结合序列)，如下。首先将感兴趣基因的DNA序列进行密码子优化，用于在哺乳动物细胞中有效表达(DNA 2.0)。将所选择的序列(靶细胞特异性启动子、感兴趣基因、寡核苷酸结合基序)克隆至中间体哺乳动物表达载体中，所述载体含有CMVie启动子和SV40终止子载体。[例如质粒pGL3 Basic(Promega)，具有驱动基因表达的CMV即时早期启动子]。在序列确认后，使用含有SpeI(5’端)或ApaI(3’端)限制核酸内切酶位点特异性尾的PCR引物，对全部表达盒(启动子、感兴趣基因、SV40终止子、寡核苷酸结合基序)进行PCR扩增。然后用SpeI和ApaI消化PCR产物并连接至p2ΦC31小环载体的SpeI和ApaI位点。然后将构建体p2ΦC31-Gene转化至大肠杆菌NM522细胞中和测试重组能力。培养含有该质粒的大肠杆菌，然后通过添加阿拉伯糖(0.25％终浓度)诱导重组。在诱导前(0时间点)和诱导后(60和120分钟)采取培养物的等分试样并进行小量制备质粒分离。对产生的质粒制备物进行电泳，以确定亲本质粒是否已重组至小质粒和小环。在凝胶上存在小环条带确定为成功重组。骨架质粒条带(小质粒)的亮度随时间降低表明质粒骨架被I-SceI酶切割并且被细胞核酸内切酶降解。
使用Qiagen MaxiPrep方法或通过Qiagen Endofree Plasmid Maxi Kit制备质粒DNA并以1mg/ml重悬于TE(10mM Tris±HCl，1mM EDTA)pH 8.0中。琼脂糖凝胶电泳表明质粒为＞95％超螺旋的。
分子方法和克隆技术，例如用限制酶消化、凝胶电泳、大肠杆菌转化(类型-甲基化)、核酸沉淀、核酸杂交等等，在文献中描述(Maniatis等人，T，E.F.Fritsch和J.Sambrook，1989.Molecular cloning：a laboratory manual，second edition.ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York；Ausubel F.M.，R.Brent，R.E.Kinston，D.D.Moore，J.A.Smith，J.G.Seidman和K.Struhl.1987.Current protocols inmolecular biology 1987-1988.John Willey和Sons，New York)。
在一些实施方式中，质粒能够位点特异性地结合寡核苷酸，例如DNA、LNA、PNA。基于pGeneGrip系列的质粒表达萤光素酶(gWiz)或绿色荧光蛋白(GFP；pGGGFP)[GTS；Zelphati等(8)]。在质粒gWiz和pGGGFP的转录终止子中，能够进行位点特异性结合而不干扰基因表达的是GeneGrip位点1，它是质粒中重复序列的区域，基于(CT)n，在相对链上具有互补重复序列(GA)n。位点2，其位于巨细胞病毒(CMV)启动子5’端，基于(CCTT)n，具有互补链(GGAA)n，并且仅在质粒pGG2XGFP和pGG2XEMPTY中发现，所述质粒另外地含有位点1[GTS Catalogue2002；Zephati等(8)]。质粒pGG2XEMPTY通过删除GFP基因而衍生自pGG2XGFP。为了构建质粒pGG2XEMPTY，用NheI和BamHI消化pGG2XGFP并凝胶纯化剩余的5.1kb质粒片段，用Klenow DNA聚合酶处理并通过连接重环化(33)。
可以使用常规方法产生寡核苷酸。例如，合成线性单链寡核苷酸用于与质粒/小环DNA杂交。在一些实施方式中，寡核苷酸是线性链的DNA、RNA、LNA、PNA或杂交物(DNA-LNA、DNA-PNA、RNA-LNA、RNA-PNA等等)，其包括结合(并且是优选地互补)于双链质粒或小环DNA分子中的核苷酸序列的特异性序列。
另外，经由基于Hoogsteen碱基对通过杂交形成三螺旋，寡核苷酸序列可结合至质粒或小环DNA。Hoogsteen碱基配对对于含有假异胞嘧啶残基而不是胞嘧啶残基的PNAs是更强的，其能够在高pH＞5±6进行Hoogsteen碱基配对，而含有胞嘧啶的PNAs仅在低pH＜5±6结合(30)。某些氨基酸的添加提高“双”PNAs结合至DNA的稳定性。
可选地，寡核苷酸可经由基于Watson-Crick的链入侵和链置换来结合质粒/小环DNA。例如，LNA ODNs是超螺旋质粒DNA的链置换剂。在它的同源结合位点结合质粒DNA的序列特异性LNA ODN引起未结合的DNA链的链置换。添加几个带正电的氨基酸的“双”PNA ODNs也是极好的链置换剂。
另外，这种核酸分子可形成四元体。例如，寡核苷酸可包括鸟嘌呤-富含核苷酸，所述核苷酸可组装形成基于G-四集体四方平面排列的堆积的四链结构。
寡核苷酸可含有下列碱基：胸腺嘧啶(T)——与A形成碱基对和/或与ds DNA的AT双联体形成三联体；胞嘧啶或质子化的胞嘧啶(C+)——与G形成碱基对和/或与ds DNA的GC双联体形成三联体；腺嘌呤(A)——与T形成碱基对和/或与dsDNA的AT双联体形成三联体；鸟嘌呤(G)——与C形成碱基对和/或与ds DNA的GC双联体形成三联体；尿嘧啶(U)——与A形成碱基对和/或与ds DNA的AT双联体形成三联体。
在进一步的实施方式中，寡核苷酸可以由未修饰的天然碱基或化学修饰的碱基组成以增加它对核酸酶的抗性和/或提高对它的互补ds DNA的亲和性：核酸酶抗性——骨架修饰(甲基膦酸、硫代磷酸、磷酸酰胺等)；2’O甲基修饰；和/或提高与质粒/小环中互补ds DNA的结合——例如，胞嘧啶甲基化(以在中性pH形成稳定的三螺旋)。
在一些实施方式中，寡核苷酸的长度可以为3-50个之间的碱基，并且杂交区优选地大于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基。
在一个实施方式中，“杂交”寡核苷酸可由杂交区(DNA、LNA、PNA)和增加功能性(连接臂，用于结合靶向部分；免疫刺激序列，例如CpG基序；另外的结合基序；能够环化的序列等等)的任何长度的延伸(DNA、RNA、LNA、PNA)组成。例如，LNA(杂交基序)延伸至硫代磷酸CpG ODN。利用LNA将PTO CpG ODNs结合于编码抗原的质粒可产生免疫辅助作用而不抑制高水平抗原表达。而且，连接臂可以是具有不干扰与质粒/小环DNA杂交的碱基的任何序列，并且能够在优选的距离将质粒/小环偶联至抗体(例如，连接体可含有3-20个嘌呤碱基；GAGG)。
在另一个实施方式中，寡核苷酸可符合扣锁寡核苷酸而用于双链体DNA，其基于序列特异的三螺旋形成。寡核苷酸可以通过在寡嘌呤-寡嘧啶序列结合到DNA大沟中经由三螺旋形成来围绕双链DNA环化。在通过三螺旋形成而序列特异性识别双链DNA靶后，形成三链体的寡核苷酸末端可以通过T4DNA连接酶的作用连接，从而产生连接至含有靶序列的质粒的环状DNA分子。已进行双链DNA序列的标记而不对该序列进行任何化学或酶促修饰。这些“扣锁”寡核苷酸提供了将非共价标记以不可逆方式连接至超螺旋质粒或其它双链DNAs的工具。[参考Padlockoligonucleotides for duplex DNA based on sequence-specific triple helix formation.Escude，C.，T Garestier，C Helene.Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.96，pp.10603-10607，1999年9月，Biochemistry]。
可以通过任何已知技术合成寡核苷酸(核酸合成仪，亚磷酰胺化学)。在一些实施方式中，寡核苷酸可以用3’和/或5’修饰(胺、硫醇、羧基、磷酸基等等)官能化，以能够经由二硫化物、硫醚、酯、酰胺或胺连接与靶向部分/抗体(携带二硫化物、马来酰亚胺、胺、羧基、酯、环氧化物或醛)共价偶联。还可以进行寡核苷酸的任何其它官能化，用于根据标准方法经由已知的双官能偶联剂与靶向部分/抗体偶联。
寡核苷酸的实例序列(相对应于并入质粒/小环ds DNA中的互补DNA)：
(i)与质粒中重复序列区互补，基于(CT)n，在相对链上具有互补重复序列
(GA)n。
例如，寡核苷酸＝5’CTCTCTCTCTCTCTC 3’
质粒/小环DNA；5’CTCTCTCTCTCTCTC 3’
i)3’GAGAGAGAGAGAGAG 5’
(ii)与质粒中重复序列区互补，基于(CCTT)n，具有互补链(GGAA)n。
例如，寡核苷酸＝5’CCTTCCTTCCTTCC 3’
质粒/小环DNA；5’CCTTCCTTCCTTCC 3’
2)3’GGAAGGAAGGAAGG 3’
(iii)与质粒中重复序列区互补，基于(CTT)n，具有互补链(GAA)n。
例如，寡核苷酸＝5’CTT CTT CTT CTT CTT CTT  3’
质粒/小环DNA；5’CTT CTT CTT CTT CTT CTT  3’
a)3’GAA GAA GAA GAA GAA GAA 5’
(iv)与质粒中重复序列区互补，基于(CCT)n，具有互补链(GGA)n。
例如，寡核苷酸＝5’CCT CCT CCT CCT CCT CCT 3’
质粒/小环DNA；5’CCT CCT CCT CCT CCT CCT 3’
b)3’GGA GGA GGA GGA GGA GGA 5’
(v)与任何其它同型嘌呤-同型嘧啶序列互补。
例如，寡核苷酸＝5’TCT CCT CCT TT 3’
质粒/小环DNA：5’TCT CCT CCT TT 3’
3’AGA GGA GGA AA 5’
(vi)鸟嘌呤-富含核苷酸，其可组装形成四链结构，其基于G-四集体的四方平面排列的堆积。
例如，寡核苷酸＝5’TGGGGT 3’
ii.3’TGGGGT 5’
质粒/小环DNA：5’TGGGGT 3’
1)3’TGGGGT 5’
在一些实施方式中，寡核苷酸是ss RNA寡核苷酸(相对应于并入质粒/小环dsDNA中的互补ds DNA)。示例性序列如下：
i.5’CUCUCUCUCUCUCUC 3’
ii.5’CCUUCCUUCCUUCC 3’
iii.5’CUU CUU CUU CUU CUU CUU  3’
iv.5’CCU CCU CCU CCU CCU CCU  3’
v.5’UCU CCU CCU UU 3’
vi.5’UGGGGU 3’
LNA和PNA寡核苷酸的实例序列(存在于GeneGrip质粒系列上的ODN-结合位点)；基于在重复结合位点1和2的DNA序列的LNA和PNA ODNs，在GeneGrip质粒系列上发现(GTS)。含有(CT)n或(GA)n重复基序的PNA/LNA ODNs被设计为结合至GeneGrip位点1；含有(CCTT)n和(GGAA)n的ODNs被设计为结合至GeneGrip位点2。
Figure GPA00001077157300851
Figure GPA00001077157300861
[参考：Use of locked nucleic acid oligonucleotides to add functionality to plasmidDNA.Kirsten M.L.Hertoghs，Jonathan H.Ellis and Ian R.Catchpole.Nucleic AcidsResearch，2003，Vol.31，No.205817-5830]
在一些实施方式中，本发明的偶联物包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包含扣锁寡核苷酸。用于围绕ds DNA环化的扣锁寡核苷酸的实例序列：寡核苷酸(A)，其含有中央三螺旋形成序列，由两个Tn连接体连接，其可形成10个碱基对的序列，每个碱基对具有20-mer寡核苷酸(B)。寡核苷酸(A)的总长度应能够通过形成15个碱基三联体三螺旋而结合至双链体靶并且通过形成20-bp双螺旋而结合至20-mer模板(寡核苷酸B)。将磷酸基团添加至该寡核苷酸的5’末端，如酶促环化所需的。
....3’-CTCCCCTCCCCTCCC-5’......
....5’-GAGGGGAGGGGAGGG-3’......
Figure GPA00001077157300862
GCTCGGATCC-3’ODN A  5’CGTACGGTCG
ODN B  3’CGAGCCTAGG GCATGCCAGC 5’
因此，本文公开的任何寡核苷酸都可用于将线性寡核苷酸与双链质粒或小环DNA中的互补核苷酸序列杂交。寡核苷酸与质粒或小环DNA结合的说明性方法可包括下列说明：(i)在10mM磷酸盐缓冲液，1mM EDTA，pH5.8中在37℃将质粒与PNA/LNA ODNs温育16小时，ODN对质粒中的ODN-结合位点最大为4-至40倍摩尔过量；(ii)对于DNA±LNA ODNs结合至质粒，将ODNs在80℃预先加热10分钟然后置于冰中，以破坏可能影响质粒结合的DNA和ODN中LNA碱基之间的任何自我互补相互作用。在4mM DNA ODN下，在10mM磷酸钠pH7.1，1mM EDTA中在37℃进行45分钟，来进行DNA ODNs与质粒DNA±LNA复合物的任何另外的结合；(iii)三螺旋形成的退火方法：(a)在含有0.2M乙酸钠和0.1M氯化钠的缓冲液中，将DNA寡核苷酸添加至含有互补ds DN核苷酸序列的质粒/小环；在20℃将混合物温育30分钟。(b)在含有150mM NaCl的50mM乙酸钠pH5.0中制备双链体DNA和三链体形成寡核苷酸的三链体。(c)对于三螺旋形成，在各种数量的双链靶存在的情况下，将寡核苷酸(100fmol)在10ml的50mM TrisHCl，pH7.5，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，25mg/ml BSA中温育。将样品加热至75℃，然后缓慢冷却至45℃。通过乙醇沉淀和离心回收含有质粒/小环和寡核苷酸的三螺旋。
另外，为了显示结合的ODN，通过不含溴化乙锭(EtBr)的琼脂糖±TAE凝胶电泳分析2.5mg的质粒DNA。高百分比(2％)凝胶用于质粒结合的ODN和游离的ODN的最大分离。使用MicroSpin Sephacryl S400HR柱，通过凝胶排阻层析将任何未结合的ODNs从质粒和质粒-结合的ODN分离。
另外，限制酶分析还可以如下进行：LNA或PNA ODN在37℃过夜结合后，进行2.5mg质粒DNA的限制酶消化。用BsaI和SphI消化质粒gWiz，并用NdeI消化质粒pGG2XGFP。然后在不含EtBr的2％琼脂糖±TAE凝胶上分析样品。
通过LNA或PNA对质粒DNA的结合确认链置换：DNA测序反应：通过基于“大染色”(“big dye”)PCR的热循环测序使用荧光双脱氧终止子方法进行标准dsDNA测序，在PE-Biosystems Prism 3700毛细管测序仪上运行并在ABI 3700DNA分析仪上显示。为了从LNA或PNA ODNs对质粒DNA的结合鉴定链置换，基于已建立的表明PNA或LNA ODN链置换的方法进行ssDNA测序分析。
设计最适DNA测序引物(RevGG2B，22mer 100％DNA-5’(Cy5)ggaaggaagttaggaaggaagg-3’)并通过标准“大染色”测序由覆盖pGG2XGFP中GeneGrip位点2重复区的高质量测序来验证。将25mg等分试样的质粒pGG2XGFP(0.024mM)与ODN LNA(低浓度：0.5mM)结合并去除未结合的LNAODN。然后，将具有或不具有结合的LNA的质粒pGG2XGFP用于修饰的ssDNA测序方法，其中使用带有Cy5-标记的RevGG2B DNA引物和T7DNA聚合酶的自动阅读测序试剂盒(AutoRead Sequencing Kit(Amersham Pharmacia Biotech))。模板质粒DNA的剂量在1至3mg变化并将退火温度降低至37或42℃，但退火时间延长至30分钟以便在不会破坏质粒双链性质的条件下，最大程度地将DNA测序引物与任何置换的ssDNA区序列特异性结合。然后，在Visible Genetics DNA测序仪上进行测序反应，并使用Chromas软件修饰。使用区域的已知DNA序列，用肉眼来鉴别从与LNA结合的质粒获得的DNA序列[参考：Use of locked nucleicacid oligonucleotides to add functionality to plasmid DNA.Kirsten M.L.Hertoghs，Jonathan H.Ellis and Ian R.Catchpole.Nucleic Acids Research，2003，Vol.31，No.205817-5830]。
在一些实施方式中，将寡核苷酸围绕质粒/小环进行环化。为了环化结合质粒的寡核苷酸，通过添加模板寡核苷酸(1pmol)和40个单位的T4DNA连接酶并在45℃温育1小时，在缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，25mg/ml BSA)中进行连接反应。在65℃作用15分钟使连接酶热失活。[参考Padlock oligonucleotides for duplex DNA based on sequence-specific triple helixformation.Escude，C.，T Garestier，C Helene.Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.96，pp.10603-10607，September 1999，Biochemistry]
偶联核酸和多肽/肽的上述方法仅是说明性而不是限制性的。
本发明的方法可通常用于连接INAS与多种氨基酸聚合物，包括肽和抗体。生物活性剂与靶向部分(例如肽、抗体，适配子)的偶联可以通过任何常规方法完成，包括：共价或非共价偶联、化学偶联、物理偶联、经由连接体偶联(例如鱼精蛋白、生物素-抗生物素蛋白结合等)。另外，在一些实施方式中，本发明的组合物包括核酸分子，其中所述组合物与聚阳离子(例如鱼精蛋白)或常规使用的其它试剂结合，以浓缩或包装核酸分子从而递送到细胞中。
偶联的示例性方法公开并显示于图4。
用于偶联或结合本发明组合物两个或更多个组分的另外的方法是常规的并且包括使用三链体或四链体核酸链形成，这些方法包括但不限于，通过激活剂的加入来激活肽或抗体上的羧酸部分。激活剂包括HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯)；HBTU(O-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯)；TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯)；TFFH(N，N′，N″，N″-四甲基脲-2-氟-六氟磷酸酯)；BOP(苯并三唑-1-基氧三(二甲氨基)磷六氟磷酸酯)；PyBOP(苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷基-磷六氟磷酸酯)；EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢-喹啉)；DCC(二环己基碳二亚胺)；DIPCDI(二异丙基碳二亚胺)；HOBt(1-羟基苯并三唑)；N-羟基琥珀酰亚胺；MSNT(1-(均三甲苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑)；芳基磺酰卤，如三异丙基苯磺酰氯。优选的激活剂是碳二亚胺。一方面，激活剂是1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和/或1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)-碳二亚胺(CDC)。
在技术人员已知的足以促进激活的羧酸部分与亲核部分反应的条件下，如上文所述的激活的羧酸部分与INAS上的亲核部分反应。在适当的条件下，保持相对低的pH值，即pH值小于约6.5。在传统的方法中(即较高pH水平)，认为激活的羧酸和/或激活剂迅速水解，降低偶联反应的效力。
本发明的生物活性剂可以通过常规方法偶联至本发明的靶向部分。例如，对于本发明的免疫刺激核酸分子(INAS)，INAS可以通过多种方式——包括但不限于偶联(连接)——与肽或多肽结合。多核苷酸部分可以与涉及共价和/或非共价相互作用的偶联物的肽或多肽部分结合。通常，INAS和肽或多肽以这种方式连接：使偶联物被肿瘤或靶向细胞增强或促进地吸收。
在INAS的3′或5′端或在INAS内部位置的适合修饰的碱基处，可进行肽或多肽和INAS之间的连接。如果肽或多肽含有合适的反应性基团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯)，其可直接地与胞嘧啶残基的N4氨基反应。取决于INAS中胞嘧啶残基的数量和定位，可实现在一个或更多个残基的特定偶联。
本发明的方法可用于制备多种偶联物。一方面，本发明的偶联物包括但不限于DNA-抗体偶联物、DNA-肽偶联物、RNA-抗体偶联物和RNA-肽偶联物。
偶联反应后，偶联物可以通过本领域技术人员熟悉的多种方法分离。举例来说，可以将反应混合物应用到柱色谱系统并通过大小排阻分离。另外，偶联物(例如靶向部分-INAS偶联物)对肿瘤靶或免疫细胞的进入可以通过任何方法，包括受体-介导的内吞或电穿孔来促进。
B.筛选
本发明的另一方面涉及筛选生物活性剂以测定这种测试试剂是否具有免疫刺激性的方法。通常地，这种筛选方法提供测定哪种试剂具有免疫刺激性以及这种试剂具有的免疫刺激性在何种水平的方法。这种试剂可以是任何核酸分子、肽或多肽，其偶联至如本文所述的本发明的靶向部分(例如抗体、适配子、肽)。在本发明的各种实施方式中，靶向部分以及生物活性剂可以通过任何常规方法直接地结合、偶联或经由可以是肽或核酸连接体的连接体偶联。
例如，可以在测试剂施用之前/之后筛选标记以测定DNA损伤或细胞应激。例如，可发生DNA双链断裂并可以进行分析。细胞通过进行一系列的应答对DSBs产生反应，包括DNA修复机制的激活和检验点事件的引发，所述引发的主要功能是停止或减缓细胞周期进程直到DNA损伤已去除(Shiloh，Y.Nature ReviewsCancer 3，155-68(2003)，Nyberg，K.A.等Annu Rev Genet 36，617-56(2002)，Khanna&Jackson Nat.Genet 27 247-254(2001))。
例如，可以对细胞进行ATM或ATR激酶增加活性的分析。用IR处理人细胞引起DNA损伤转导子蛋白激酶ATM和ATR的快速激活。然后这些激酶磷酸化并激活一系列下游靶，包括效应子蛋白激酶CHK1和CHK2，以及检验点调控子蛋白53BP1和MDC1。另外，ATM和ATR在Ser-139磷酸化组蛋白变体H2AX；该反应可以在IR暴露的片刻内检测并且最终延伸到DNA损伤位点侧翼的染色质的大结构域。这种进化上的保守反应可被少至一个DNA DSB引发(Chen，H.T.等Science 290，1962-1964(2000))并且可被广泛识别为该类型损伤的体内产生的特异和明确的标记。然后组蛋白H2AX的磷酸化促进一系列检验点和DNA修复因子募集至DNA损伤位点，包括53BP1、MDC1、MRE11/RAD50/NBS1复合物以及结构维持染色体1(SMCl)蛋白的磷酸化形式。在DNA DSBs位点的这些中心(foci)的形成是检验点反应的特征(Goldberg，M.等Nature 421，952-6(2003))。上述仅是可在使用本发明的化合物和方法分析一个或更多个生物活性剂的方法中被筛选的各种标记的一个实例。
例如，在筛选测试剂从而作用于细胞(例如，凋亡诱导剂)的方法中，可分析检验点反应多肽(例如，用于表达/蛋白活性的免疫化学或PCR)。在响应于DNA损伤、尤其是双链断裂而介导细胞周期检验点激活中，这种多肽是具有活性的，即，该多肽是DNA损伤检验点反应通路的组分。合适的多肽包括ATM、ATR、ATRIP、CHK1、CHK2、BRCA1、NBS1、RAD50、MRE11、CDC25C、14-3-3σ、CDK2/细胞周期蛋白E、CDK2/细胞周期蛋白B153BP1、MDC1、组蛋白变体H2AX、SMC1、RAD17、RAD1、RAD9、HUS1和MRC1。如本文所述，DNA损伤检验点反应包括ATM和ATR依赖性信号传导通路。
DNA损伤检验点通路多肽的磷酸化可以表示它的激活状态。因此，活性还可通过测定DNA损伤检验点通路多肽的磷酸化来测定。被磷酸化激活的DNA损伤检验点通路多肽包括ATRIP、CHK1、CHK2、BRCA1、NBS1、RAD50、MRE11、CDC25C、14-3-3σ、CDK2/细胞周期蛋白E、CDK2/细胞周期蛋白B153BP1、MDC1、组蛋白变体H2AX、SMC1、RAD17、RAD1、RAD9、HUS1和MRC1。
人和酵母中DNA损伤检验点通路的各种组分的核酸和蛋白序列可获自GenBank数据库，具有下列登录号：人ATM(核酸编码序列(CDS)：W82828，蛋白序列：AAB65827，人CHK1(CDS：AF016582，蛋白：AAC51736)，人CHK2(CDS：NM.sub.--007194，蛋白：096017)，NBS1(CDS：AF3169124，蛋白：BAA28616)，人RAD50(CDS：5032016，蛋白：NP.sub.--005723)，MRE11(CDS：U37359，蛋白：AAC78721)，BRCA1(CDS：U14680，蛋白：A58881)，ATR (CDS：NM.sub.--001184，蛋白：NP.sub.--001175)，ATRIP(CDS：AF451323，蛋白：AAL38042.1)，CDC25C(CDS：NM.sub.--001790，蛋白：NP001781.1)，53BP1(CDS：NM.sub.--005657，蛋白：NP.sub.--005648)，MDC1(CDS：NM.sub.--014641蛋白：NP.sub.--055456)，组蛋白变体H2AX(CDS：NM.sub.--002105，蛋白：NP.sub.--002096)，SMC 1(CDS：NM.sub.--006306，蛋白：NP.sub.--006297)，RAD17(CDS：NM.sub.--133338，蛋白：NP.sub.--579916)，RAD1(CDS：NM.sub.--002853，蛋白：NP.sub.--002844)，RAD9(CDS：NM.sub.--004584，蛋白：NP.sub.--004575)，HUS1(CDS：NM.sub.--148959，蛋白：NP.sub.--683762)和MRC1(CDS：NM.sub.--002438，蛋白：NP.sub.--002429)。
另外，本发明的筛选方法可包括分析免疫刺激化合物的活性。例如，免疫刺激活性可产生于树突细胞对干扰素、IL-12、NKG2D配体、IL-15和IL-2的刺激。这引起NK细胞的刺激以产生IFN-γ并诱导CD4+Th1细胞的发育。然后，诱导的Th1细胞产生IFN-γ和IL-2。然后IL-2增强Th1细胞的进一步增殖以及抗原(例如肿瘤和病原体)特异性CD8+T细胞的分化。IL-2和IFN还刺激先天免疫系统的NK细胞的细胞溶解活性。
在本文所述分析方法的其它实施方式中，通过分析免疫细胞与一个或更多个测试化合物接触的反应来测定细胞或动物中的免疫刺激反应。因此，可以分析促炎或免疫刺激因子。例如，已知IL-12是1型免疫性(Th1应答)的主要调控子。它诱导天然杀伤(NK)细胞以产生IFN-γ作为先天免疫应答的一部分并促进CD4+Th1细胞和产生IFNγ的细胞毒性CD8+细胞的扩增。因此，它增加肿瘤的T-细胞入侵以及肿瘤细胞对T-细胞入侵的易感性。
因此，例如，如果测试化合物使用本发明的方法进行分析并被确定为细胞因子分泌的刺激物，则其被确定为免疫刺激性的。特别优选的是诱导、增强、激活或刺激一个或更多个细胞因子(例如，Th1细胞因子，例如IFN、IL-12和/或IL-2，任选地连同一个或更多个其它细胞因子)的体外释放的化合物。测试化合物的这种免疫调节活性在某些医学应用中是特别重要的。例如，IFNs和IL-12的增加产生可克服在癌细胞免疫逃避中观察到的先天免疫和细胞免疫的抑制。
另外，显示的细胞因子刺激可以整体或部分地依赖于共刺激剂的存在。这种共刺激剂可包括，例如，刺激先天免疫系统的试剂，包括Toll-样受体(TLR)配体。
在本发明的各种实施方式中，筛选用于免疫刺激活性的测试剂的方法包括将细胞与本发明的偶联物(包括多价偶联物)接触以测定是否是生物活性剂。在这些实施方式的任意一种中，生物活性剂被施用于细胞并且得到的读出提供关于测试剂(例如，核酸分子、肽、多肽)是否导致细胞应激(例如，DNA损伤)、凋亡、物理应激、细胞超融合或细胞应激相关标记的增加表达的信息。
在另一个实施方式中，通过测试偶联物上存在的标记(例如，荧光或放射性同位素标记)提供读出，其中所述读出提供关于测试偶联物是否被靶细胞(例如，免疫细胞例如树突细胞、巨噬细胞)吸收、测试剂是否诱导免疫细胞活性(例如，NK活性，共刺激受体表达；免疫细胞结合，例如通过CD40、B7家族、CD86/CD83、MHC表达、细胞因子释放、促炎性反应等)的信息。这种用于免疫活性的标记是已知的，并且可以使用常规技术例如ELISA、免疫化学来测量(参见例如CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(Coligan，John E.等，eds.1999)。还参见，美国专利公开号20070155814、20070135372或20070134261。
例如，细胞(例如，树突细胞、肿瘤细胞)可以在培养中与包括靶向部分的化合物接触，所述靶向部分特异地结合存在于这种细胞上的组分。所述化合物还包括一个或更多个测试剂(例如，核酸或肽)和一个或更多个可检测标签(例如，荧光或放射标记)。细胞可以在显微镜下检测以测定在细胞中是否观察到被标签的标记(例如吸收)，从而测定测试剂是否能够穿过细胞膜(例如，内吞)。
在其它实施方式中，一个或更多个测试剂被施用给非人动物，以测定免疫刺激作用。例如，使用常规技术植入小鼠侧腹的肿瘤可由测试偶联物靶向(例如，用对肿瘤细胞抗原具有特异性的抗体)，以及在通过尾静脉全身施用测试偶联物或通过注射到肿瘤中直接施用测试偶联物之前可允许接受肿瘤。然后，可以评价用于免疫激活的标记以测定测试剂是否诱导免疫应答。取决于表达的标记，本发明的筛选方法可用于测定测试剂是否是PAMP、DAMP(例如，LL37)、警报素诱导剂、Toll-样受体(TLR)-非依赖性方式；TLR依赖性激活剂(例如，TLR3、7、8或9)；激活死亡信号传导或抑制存活基因表达的试剂；或通过产生细胞应激/损伤间接地诱导免疫应答的试剂。
测试剂可以是任何核酸分子，包括质粒、ODN、RNA、DNA、ssRNA、ssDNA、dsDNA、RNA-DNA杂交物、PNA、肽或多肽。在各种实施方式中，可以施用包括一个或更多个测试剂的多价化合物，其中这种化合物还包括结合特定靶细胞的本发明的靶向部分(例如，体外或体内)。例如，在本发明多价偶联物的情况下，可以筛选不同测试剂的两个或更多个组合以测定是否观察到协同作用。另外，两个或更多个化合物——每个包括对相同(或不同)细胞组分的靶向部分——可用于本发明的筛选或治疗方法。还在进一步的实施方式中，两个或更多个化合物——每个包括相同或不同的靶向部分——包括相同或不同的测试剂。例如，第一化合物包括靶向部分a，而第二化合物包括靶向部分b，且第一化合物包括测试剂x并且第二化合物包括测试剂y。换言之，靶向部分和测试剂的各种组合中的多个测试剂可用于本发明的筛选或治疗方法。
当然，在进一步的实施方式中，测试偶联物可以连同一个或更多个药物化合物被筛选，以测定这种偶联物与一个或更多个这种化合物的组合在诱导免疫刺激反应、从而减少或消除肿瘤细胞生长或增殖中的协同作用。如上所述，当标记(marker)用于“标签(tag)”测试偶联物时，可以测定和/或测量向细胞中的进入。
在各种实施方式中，与免疫刺激相关的标记的测量可以通过常规扩增(例如，PCR，RT-PCR)进行。各种可购得的试剂可用于RT-PCR，例如One-Step RT-PCR试剂，包括Qiagen One-Step RT-PCR试剂盒和Applied Biosytems TaqMan One-StepRT-PCR Master Mix Reagents试剂盒。这些试剂可用于测定在对照细胞/动物相对于与本文所述一个或更多个测试化合物接触的细胞/动物中，与免疫应答相关的标记基因的表达水平的调控。
另外，在一些实施方式中，测试剂可以是质粒复制子(例如，能够表达核酸序列编码的肽/蛋白)。因此，这种质粒可以表达可检测和/或可计量的“标签的”蛋白。
可以偶联至本发明化合物并用于本发明的细胞培养或体内方法的可检测标签(也称为标记)包括但不限于包括：发色团、电化学部分、酶、放射性部分、磷光基团、荧光部分、化学发光部分或量子点，或更具体地，放射标记、荧光团-标记、量子点-标记、发色团-标记、酶-标记、亲和性配体-标记、电磁自旋标记、重原子标记、探针——标记有纳米颗粒光散射标记或其它纳米颗粒、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、TRITC、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy-7、德克萨斯红(Texas Red)、Phar-Red、别藻蓝蛋白(APC)、表位标记例如FLAG或HA表位，以及酶标记例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、I2-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶，和半抗原偶联物例如异羟洋地黄毒苷配基或二硝基苯基，或结合对的成员——其能够形成复合物，例如链霉抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗体复合物，其包括例如兔IgG和抗兔IgG；荧光团例如伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、绿色荧光蛋白、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、芪、荧光黄(luciferyellow)、Cascade Blue、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白、荧光镧系复合物例如包括铕和铽的复合物、Cy3、Cy5、分子信标(molecular beacons)及其荧光衍生物，发光物质例如鲁米诺；光散射或等离子共振物质例如金或银粒子或量子点；或放射性物质包括14C、123I、124I、125I、131I、Tc99m、35S或3H嵌入染料，例如菲啶和吖啶(例如，溴化乙啶、碘化丙啶、碘化己啶、二氢乙啶、乙啶同型二聚体-1和-2、乙啶单叠氮和ACMA)；一些小沟结合剂，例如吲哚和咪唑(例如，Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580和DAPI)；以及各种核酸染料例如吖啶橙(还能够嵌入)、7-AAD、放线菌素D、LDS751和羟芪脒(hydroxystilbamidine)；花青染料例如SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOXOrange、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR Gold、SYBRGreen I、SYBR Green II、SYBR DX，SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45(蓝)，SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(绿)，SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙)，SYTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(红)。参见例如，Principles of Fluorescence Spectroscopy，Joseph R.Lakowicz(Editor)，Plenum Pub Corp，2nd edition(July 1999)以及the Molecular ProbesHandbook，Richard P.Hoagland，第6版；也参见美国专利号6,207,392。
在一个实施方式中，公开了鉴定本发明偶联物的方法，所述偶联物诱导细胞死亡、细胞成熟和/或NKG2D配体依赖性信号传导，所述方法包括：体外将一个或更多个细胞与含有与肿瘤细胞的细胞组分、肿瘤血管和/或肿瘤微环境的组分特异结合的抗体或含有RGD基序或CDGRC基序的整联蛋白衍生肽的测试偶联物接触，其中所述抗体或肽与含有一个或更多个免疫刺激核酸序列的核酸偶联，并且其中一个或更多个核酸序列包括病原体相关性分子模式(PAMP)；以及确定在免疫细胞存在或不存在的情况下所述一个或更多个细胞中标记物的诱导或表型变化，其中在一个或更多个细胞中在存在测试核酸偶联物的情况下确定的诱导或变化表示细胞死亡信号传导、细胞成熟和/或NKG2D配体依赖性信号传导。例如，如果接触引起(a)细胞在不存在免疫细胞的情况下融合，其中所述细胞为肿瘤细胞，(b)在PBMC细胞和肿瘤细胞混合物中的肿瘤细胞裂解，及(c)一个或更多个标记物表达的诱导——所述标记物包括但不限于CD86、IFN-γ和/或Apo2L/TRAIL，其中所述细胞为PBMC或树突细胞(DC)，那么，所述测试偶联物与细胞死亡信号传导、细胞成熟和/或NKG2D配体依赖性信号传导的诱导相关联。
表达的标记物的诱导可通过细胞分选完成。而且，细胞从非胎儿动物的骨髓获得，包括但不限于人细胞。胎儿细胞也可以使用。
细胞分选可通过分选细胞领域中已知的任何方法进行，包括通过荧光激活细胞分选法(FACS)和磁珠细胞分选法(MACS)的分选。为了通过MACS分选细胞，用磁珠标记细胞并使细胞穿过顺磁分离柱。该分离柱被置于强的永磁体内，由此在柱内创建磁场。磁标记的细胞被捕获在柱内；细胞不穿过。随后从柱中洗脱捕获的细胞。
在一个实施方式中，抗体-核酸偶联物被公开，其包括特异结合于肿瘤细胞的细胞组分、肿瘤血管和/或肿瘤微环境组分的抗体。肿瘤微环境可以包含上皮细胞、基底膜、成纤维细胞、基质细胞和/或成肌纤维细胞，它们包围肿瘤。在进一步的相关方面，包围肿瘤的这种细胞可以表达功能性CLIC4。而且，偶联物具有至少1nM到20nM的结合亲和力，包括这些偶联物在结合肿瘤细胞的细胞组分后，激发肿瘤细胞间的体外细胞超融合。
C.治疗
通常地，本发明的组合物和方法涉及预防或治疗癌症或感染性疾病。在本发明的各种方面，本发明的组合物——其包括偶联至一个或更多个生物活性剂的一个或更多个靶向部分——被施用给细胞以防止、减少或消除肿瘤。在本发明的其它方面，本发明的组合物——其包括偶联至一个或更多个生物活性剂的一个或更多个靶向部分——被施用给细胞以防止、减少或消除感染因子引起的疾病或状况。在一些实施方式中，本发明的组合物单独施用或与其它治疗组合施用，以便治疗患有本文所述的瘤性疾病或感染性疾病的对象。
例如，在各种实施方式中，特异地靶向这些细胞组分的抗体或其功能片段、多肽(例如抗体)、适配子或配体被施用以防止或治疗癌症，其中这种组合物包括靶向部分以及本发明的一个或更多个生物活性组分。
根据本发明的还另一方面，提供了包括偶联至一个或更多个生物活性剂的一个或更多个靶向部分(如上定义)的化合物(偶联物)在制备用于诊断、检测和/或成像的产品和/或用于预防和/或治疗疾病或状况的药物中的用途。这种疾病或状况包括但不限于：免疫疾病、炎性疾病、感染性疾病和瘤性疾病/癌症，包括但不限于头颈癌、呼吸消化道癌、胃肠癌、食道癌、胃/胃部癌、胰腺癌、肝-胆/肝癌、结肠直肠癌、肛门癌、小肠癌、生殖-泌尿器官癌、泌尿道癌、肾/肾脏癌、膀胱癌、输尿管癌、睾丸癌、尿道/阴茎癌、妇科癌、卵巢/输卵管癌、腹膜癌、子宫/子宫内膜癌、宫颈/阴道/外阴癌、妊娠滋养层细胞疾病、前列腺癌、骨癌、肉瘤(软组织/骨)、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、间皮瘤、纵膈癌、乳腺癌、中枢神经系统癌、脑癌、黑素瘤、血液恶性病、白血病、淋巴瘤(何杰金氏病和非何杰金氏病)、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、浆细胞瘤、骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、内分泌肿瘤、皮肤癌、黑素瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺、胰腺内分泌癌、类癌瘤、多发性内分泌腺瘤综合征、AIDS相关恶性肿瘤、未知原发部位癌和各种儿童癌症。癌症可包括由肿瘤细胞组成的肿瘤。例如，肿瘤细胞可包括但不限于黑素瘤细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、睾丸癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、淋巴癌细胞、皮肤癌细胞、脑癌细胞、骨癌细胞或软组织癌细胞。
引起疾病的病原体和感染因子的实例是已知的以及本文公开的。
一方面，本发明的偶联物被单独使用或与其它抗癌剂组合使用，其它抗癌剂如化学治疗剂、离子辐射、激素治疗、细胞因子、免疫治疗、细胞治疗、疫苗、单克隆抗体、抗血管生成剂、靶向疗法(小分子药物)或生物疗法。例如，化学治疗剂包括但不限于抗肿瘤烷化剂，如氮芥(Mustard)(盐酸双氯乙基甲胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异磷酰胺、白消安)、亚硝基脲(BCNU/亚硝基脲氮芥、CCNU/环己亚硝脲、MeCCNU/甲环亚硝脲、福莫司汀、链脲霉素)、四嗪(氮烯唑胺、米托唑胺、替莫唑胺)、氮丙啶(三胺硫磷、丝裂霉素C、AZQ/地吖醌)、盐酸甲苄肼、六甲三聚氰胺、阿多来新；顺铂及其类似物、顺铂、卡铂、奥沙利铂；抗代谢物质、甲氨蝶呤、其它抗叶酸物、5-氟嘧啶(5-氟尿嘧啶/5-FU)、阿糖胞嘧啶、氮胞苷、吉西他滨、6-硫代嘌呤(6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤)、羟基脲；拓扑异构酶相互作用剂表鬼臼毒素(epipodophyllotoxins)(依托泊甙、替尼泊甙)、喜树碱类似物(盐酸托泊替康、伊立替康、9-氨基喜树碱)、蒽环类抗生素及相关化合物(盐酸阿霉素、脂质体阿霉素、盐酸柔红霉素、柔红霉素盐酸柠檬酸脂质体(daunorubicin HCl citrateliposomal)、表柔比星、伊达比星)、米托蒽醌、洛索蒽醌、放线菌素-D、安吖啶、吡唑并吖啶(pyrazoloacridine)；抗微管剂长春花生物碱(Vinca alkaloids)(长春地辛、长春新碱、长春碱、长春瑞滨)、紫杉烷(紫杉醇、多烯紫杉醇/多西他奇)、雌氮芥；氟达拉滨、2-氯脱氧腺苷、2′-脱氧助间型霉素、高三尖杉酯碱、苏拉明、争光霉素、L-天冬酰胺酶、去氧氟尿苷、卡培他滨、克拉屈滨、甲酰四氢叶酸、喷司他丁、类视黄醇(全反式维甲酸、13-顺式-维甲酸、9-顺式-维甲酸、异维甲酸、维甲酸)、帕米磷酸盐、酞胺哌啶酮、环孢霉素；激素疗法抗雌激素药(它莫西芬、托瑞米芬、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮)、芳香化酶抑制剂(氨鲁米特、来曲唑/弗隆、阿那曲唑/瑞宁得、依西美坦/阿诺新(exemestane/aromasin)、伏氯唑)、促性腺激素-释放激素类似物、抗雄激素药(氟他胺、卡地索)、氟氢甲睾酮(fluoxymeterone)、二乙基已烯雌酚、奥曲肽、醋酸亮丙瑞林、醋酸高舍瑞林；甾体和非甾体抗炎剂(地塞米松、泼尼松)；单克隆抗体，包括但不限于抗HER2/neu抗体(赫赛汀/曲妥珠单抗)、抗EGFR抗体(西妥昔单抗/爱必妥、ABX-EGF/帕尼单抗(panitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab))、抗CD20抗体(美罗华/利妥昔单抗、替伊莫单抗/泽娃灵(ibritumomab/Zevalin)、托西莫单抗/百克沙(tositumomab/Bexxar))、抗CD33抗体(吉妥单抗(gemtuzumab/MyloTarg))、阿仑单抗/坎帕斯(alemtuzumab/Campath)、贝伐单抗/阿瓦斯丁(bevacizumab/Avastin)；和小分子抑制剂。
一方面，本发明的偶联物与被设计为诱导肿瘤细胞死亡和/或抑制肿瘤生长的附加治疗组合，其包括但不限于化学治疗、辐射、死亡配体、抗体、冷冻治疗、射频消蚀、毒素、电穿孔、病毒基因治疗、非病毒基因治疗、质粒、疫苗、纳米颗粒、适配子、肽/肽模拟物、激素治疗、细胞因子、细菌治疗、其它癌症治疗。
一方面，本发明的偶联物与附加治疗组合使用，所述附加治疗被设计为破坏对肿瘤抗原/细胞的耐受和/或放大针对于肿瘤细胞的免疫应答和/或增加免疫-介导的肿瘤细胞死亡，例如：(a)用下列一个或更多个的同种异体或自体细胞治疗：同种异体或自体T细胞；同种异体或自体树突细胞(DCs)；同种异体或自体NK细胞；和/或(b)疫苗(例如，针对于肿瘤或病原体)；和/或(c)T调节/抑制细胞的耗竭或失活(经由抗体，例如抗CD25；化学治疗；极化调节，例如GATA3抑制；吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)抑制；TLR激动剂或其它方法)；和/或(d)增强免疫应答的细胞因子或共刺激分子或其它免疫刺激剂的递送或表达(flt-3配体、IL-12、GM-CSF、CD40L、B7-1、IL-2、TLR激动剂、警报素、PAMPs、DAMPs)；和/或(e)施用增强免疫应答的抗体(例如抗CTLA-4、抗41BB、抗CD28、抗CD40、抗B7家族)；和/或(f)施用针对于肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的抗体(例如靶向各种肿瘤-或肿瘤相关抗原或受体的抗体；偶联的抗体)；和/或(g)施用可修饰肿瘤基因表达或靶向细胞信号传导的任何试剂，其包括信号转导抑制剂(STI)、去甲基化剂(例如氮杂胞苷)、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)调节剂。
在本发明的一方面，一个或更多个活性剂(如上定义)在本文所述靶向治疗偶联物施用之前、之后或同时施用。在这种实施方式中，所述一个或更多个活性剂可增加肿瘤细胞死亡、抑制肿瘤生长和/或增强抗肿瘤免疫应答。
例如，在一个实施方式中，一个或更多个活性剂是吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)抑制剂。IDO抑制剂可以在酶促水平，例如阻碍活性位点或结合酶活性位点的小分子抑制剂。可选地，抑制剂可在基因表达水平上发挥作用，例如用反义、siRNA或核酶靶向以减少IDO活性。因此，在各种实施方式中，本发明的治疗剂(例如抗体-INAS偶联物)与任何IDO抑制剂一起施用，其中施用可以任何顺序相继进行或同时进行。
肝外酶吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)在针对中心代谢共因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生物合成的第一和限速步骤中催化色氨酸降解。IDO参与免疫功能，其中观察到IDO表达被干扰素-γ刺激，以及随后通过发现它在保护胎儿免于母体免疫中的生理意义而证实。IDO通常在肿瘤和引流淋巴结中增高，其在肿瘤微环境中抑制T细胞免疫性。在癌症中，IDO活性可辅助促进对肿瘤抗原的获得性耐受。在促进肿瘤生长的潜在炎性环境的背景下，通过产生对肿瘤抗原的外周耐受，IDO可破坏阻碍肿瘤细胞存活的免疫应答。在临床前研究中，IDO的小分子抑制剂损害该免疫抑制机制并强烈地调节多种经典化学治疗剂的效力，这支持IDO抑制剂作为治疗目标的临床开发。
IDO抑制剂1-甲基-色氨酸被开发用于临床试验。Hou等Cancer Res.2007J15；67(2)：792-801。如Hou等所示，1-甲基-色氨酸的D异构体特异地靶向IDO基因，原因在于在IDO基因破坏的小鼠(IDO-敲除小鼠)中，D-1-甲基-色氨酸的抗肿瘤作用完全丧失。因此，在各种实施方式中，D或L异构体，优选地D-1-甲基-色氨酸被施用，以产生IDO抑制并且在与本发明的治疗剂组合的情况下阻碍宿主-介导的免疫抑制和增强抗肿瘤免疫性。
另外，在其它实施方式中，组合施用可进一步包括靶向IDO活性的上游激活剂，以便通过消除IDO表达的激活来减少或消除IDO活性。例如，IDO是通过信号转导子以及转录1α(STAT1α)和干扰素调节因子(IRF)-1激活剂的干扰素(IFN)-γ-介导作用来诱导的。IDO的诱导还可以通过不依赖IFN-γ的机制介导，虽然诱导机制还未确定。因此，小分子抑制剂或靶向IDO表达上游激活子的击倒(knock-down)核酸提供用于增强本发明的组合物和方法的抗癌效果的另外的靶。在一个相关的方面，靶向部分与免疫刺激siRNA靶向IDO(INAS)的偶联物可用于增强抗肿瘤免疫性。
因此，本发明的组合物和方法可与一个或更多个其它活性剂组合使用，包括小分子抑制剂以及阻止IDO表达和/或活性的化合物。这些活性剂预期与本发明的治疗组合物和方法一起施用。这些活性剂和其使用方法是已知的，例如美国专利申请20070173524、20070105907、20070099844、20070077234、20060292618、20060110371、20050186289和20040294623中公开的。
根据本发明的还另一方面，提供包括偶联至一个或更多个生物活性剂的一个或更多个靶向部分(如上定义)的偶联物在制备用于诊断、检测和/或成像的产品和/或用于预防和/或治疗由感染引起的感染性疾病的药物中的用途，所述感染选自微生物感染、真菌感染、寄生虫感染、细菌感染和病毒感染。
本发明也提供了药物组合物，其包含至少一种能够以有效量治疗疾病的化合物和药物上可接受的载体(vehicle)或稀释剂。本发明的组合物可包含所述的其它治疗剂，并可以被配制，例如根据诸如药物配制领域熟知的那些技术，通过采用传统固态或液态载体或稀释剂以及适合期望给药方式的药物添加剂类型(如赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂等)进行配制。
用作生产的本发明制品组分的药物组合物可以以固体、溶液、乳剂、分散剂、胶束、脂质体等形式使用，其中产生的组合物含有一种或更多种上述化合物作为活性成分，其与适合经肠或肠胃外应用的有机或无机载体或赋形剂混合。用于用作本发明制品的组分的化合物可以与例如通常的无毒、药物可接受载体组合，用于片剂、丸剂、胶囊、栓剂、溶液、乳剂、悬液和任何其它适合使用的形式。可以使用的载体包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米淀粉、角蛋白、胶体二氧化硅、土豆淀粉、尿素、中等链长的甘油三酯、葡聚糖和适合用于生产固态、半固态或液态形式制备物的其它载体。此外，辅助剂、稳定剂、增稠剂和着色剂以及香料可以被使用。
本发明的药物组合物可以通过任意适合的方式给药，例如口服，如片剂、胶囊、颗粒或粉末的形式；舌下；经口/颊(buccally)；肠胃外，如通过皮下、皮内、静脉内、肌肉内或脑池内注射或输注技术(如，作为无菌可注射水性或非水性溶液或悬液)；经鼻，如通过吸入喷雾；外用，如乳膏剂或软膏剂的形式；或经直肠，如栓剂的形式；以含有无毒、药学上可接受载体或稀释剂的剂量单位制剂。例如，本化合物可以以适合迅速释放或延长释放的形式给药。迅速释放或延长释放可通过使用含有本发明化合物的合适的药物组合物来实现，或者，尤其在延长释放的情况下，通过使用诸如皮下植入物或渗透泵的设备来实现。本发明偶联物也可以通过脂质体给药。一方面，组合物可全身地、肿瘤内或肿瘤周围给药。
除了灵长类如人类之外，各种其它哺乳动物也可以根据本发明的方法治疗。例如，哺乳动物——包括但不限于母牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、大鼠或其它牛、羊、马、犬、猫、啮齿或鼠类物种——可以被治疗。然而，该方法也可以在其它物种如禽类(如鸡)中实施。
上述方法中被治疗的对象——其中细胞被靶向调控是期望的——是哺乳动物，包括但不限于母牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、大鼠或其它牛、羊、马、犬、猫、啮齿或鼠类物种，并且优选地是人类，所述哺乳动物是雄性或雌性的。
用来给予本发明化合物的药物组合物可以方便地以剂量单位形式提供，并且可以通过药物领域熟知的任何方法制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或更多种辅助成分的载体相关联的步骤。一般来说，药物组合物如下制备：使活性成分与液态载体或精细分割的固态载体或两者均匀且密切地关联，并随后在需要时使产品成型为期望的制剂。活性目的化合物以足以对疾病的过程或状况产生期望效果的量被包含在药物组合物中。
含有活性成分的药物组合物可以是适合口服使用的形式，如片剂、含片(troches)、锭剂(lozenges)、水性或油性悬液、可分散粉末或颗粒、乳剂、硬胶囊或软胶囊、或糖浆或酏剂。
意欲口服使用的组合物可根据药物组合物生产领域已知的任何方法制备，并且这样的组合物可以含有一种或更多种选自甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂的试剂，以便提供药学上精致且美味的制剂。片剂含有活性成分，其与适合生产片剂的无毒、药物上可接受的赋形剂混合。这些赋形剂可以是，例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；粘结剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以未包衣或它们可以通过已知技术进行包衣，以延迟胃肠道中的崩解和吸收，并由此提供在较长时间段内的持续作用。举例来说，时间延迟材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯可被采用。它们也可被包衣以形成用于控制释放的渗透性治疗片剂。
口服使用的制剂也可以作为硬明胶胶囊提供，其中活性成分与惰性固态稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合；或作为软明胶胶囊提供，其中活性成分与水或油介质，例如花生油、液态石蜡或橄榄油混合。
水性悬液含有活性成分，其与适合生产水性悬液的赋形剂混合。这样的赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟基-丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或烯化氧与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七乙烯氧十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯山梨糖醇单油酸酯。水性悬液也可以含有一种或更多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯；一种或更多种着色剂；一种或更多种矫味剂；以及一种或更多种甜味剂，如蔗糖或糖精。
油性悬液可通过将活性成分悬浮在植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，或在矿物油如液态石蜡中来配制。油性悬液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六醇。可以添加诸如上文所述的甜味剂及矫味剂，以提供可口的口服制剂。这些组合物可通过加入抗氧化剂诸如抗坏血酸来保存。
适合通过添加水来制备水性悬液的可分散粉末和颗粒提供了与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或更多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散或润湿剂以及悬浮剂由上文已经提到的那些示例。额外的赋形剂，例如甜味剂、矫味剂和着色剂也可以存在。
糖浆和酏剂可用甜味剂如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖配制。这样的制剂也可含有粘滑剂(demulcent)、防腐剂及矫味剂和着色剂。
药物组合物可以是无菌可注射水性或油性悬液的形式。该悬液可根据已知技术，使用上文已经提到的那些合适的分散或润湿剂以及悬浮剂配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒的、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬液，例如，是在1，3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受载体和溶剂是水、林格氏溶液(Ringer’s solution)和等张氯化钠溶液等。此外，无菌不挥发性油被常规用作溶剂或悬浮介质。出于这个目的，任何温和的不挥发性油都可以被采用，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸诸如油酸在注射液的制备中有用。
本发明的化合物也可以以用于直肠给药的栓剂形式给予。这些组合物可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合而制备，所述赋形剂在常温下为固态，但在直肠温度下为液态，并因此会在直肠中融化以释放药物。这些材料是可可脂和聚乙二醇。
对于外用，含有本发明化合物的软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、溶液或悬液等被采用(对于这种应用的目的，外部施用将包括漱口剂(mouthwash)和含漱剂(gargle))。
在细胞被靶向调控的对象的治疗中，适当的剂量水平将一般为每天每公斤患者体重约0.01到500mg，这可以单次剂量或多次剂量给药。优选地，剂量水平将为每天约0.1到约250mg/kg；更优选地，为每天约0.5到约100mg/kg。合适的剂量水平可以是每天约0.01到250mg/kg，每天约0.05到100mg/kg，或每天约0.1到50mg/kg。在该范围内，剂量可以是每天0.05到0.5、0.5到5或5到50mg/kg。对于口服给药，组合物优选地以含有1.0到1000毫克活性成分的片剂形式提供，特别地，含有1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克活性成分，用于待治疗患者的剂量的症状调整。化合物可以以每天1到4次的方案给药，优选地一天一次或两次。
但是，应该理解，用于任何特定患者的具体剂量水平和给药频率可以变化并将取决于各种因素，包括使用的具体化合物的活性、代谢稳定性和该化合物的作用时长、年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、给药方式和时间、排泄率、药物组合、特定病症的严重程度以及进行治疗的主体。
在一个实施方式中，从哺乳动物对象、优选人类提取血液等分试样，并且该血液等分试样用本发明的偶联物离体处理。偶联物的作用是调节包含在等分试样中的血液中免疫效应细胞的活性。修饰的等分试样随后通过适合接种的任何途径被重新导入对象体内。
一方面，公开了一种方法，包括从对象提取免疫细胞，将该细胞与偶联物离体接触，以及将该细胞重新导入对象。
一方面，等分试样的体积多达约400ml、从约0.1到约100ml、从约5到约15ml、从约8到约12ml、或约10ml，其连同抗凝剂(如2ml柠檬酸钠)。
一方面，对象进行疗程，这样的单个治疗包括移取血液等分试样、如上述处理它们以及将处理的等分试样重新给予对象。这样的疗程可包括每天给予处理的血液等分试样连续若干天，或可以包括在一段指定的时间内每天治疗的第一疗程、接着是间隔以及然后是一个或更多个每天治疗的附加疗程。
在一个相关的方面，对象被给予初始疗程，包括给予4到6等分试样的处理血液。在另一优选的实施方式中，对象被给予初始疗程，包括给予2到4等分试样的处理血液，任意一对连续的等分试样的给予或者在连续日进行、或者由1到21天的休息期间分开，在休息期间不给患者等分试样，将选定的一对连续等分试样分开的休息期为约3到15天。在另一相关的方面，初始疗程的给药方案包括总共三个等分试样，第一和第二个等分试样在连续日给予，在第二和第三等分试样给予之间提供11天的休息期。
在一个另外相关的方面，初始疗程后进行附加的疗程。举例来说，后续疗程在初始疗程结束后至少约3周时给予。一方面，对象接受第二疗程，包括在初始疗程结束后每30天给予一等份的处理血液，进行6个月的时间。
应该理解，连续疗程之间的间隔应该使得本发明治疗的有利效果得到保持，并且可以基于观察到的个体对象的反应来确定。
以下的实施例意欲示例而非限制本发明。
实施例
实施例1：偶联的抗体或肽的产生
核酸序列(DNA或RNA)与抗人EGFR抗体、抗人HER2抗体和抗鼠neu抗体的偶联：
抗体：
(1)抗人EGFR抗体(嵌合)
(2)抗人HER2/neu抗体
(3)抗鼠neu抗体
DNA序列：
(1)寡脱氧核苷酸(ODN)-(SEQ ID NO：1)
5’G*G*G GAC GAC GTC GTG G*G*G*G*G*G-3’磷酸盐
(*硫代磷酸键，其余是磷酸二酯键)
类型＝DNA-PS；尺寸＝21；ε1/(mMcm)＝208；
MW(g/mole)＝6842CpG A；类型＝CpG A；21.92μM
寡脱氧核苷酸(ODN)-(SEQ ID NO：2)
5’G*G*G GGA GCA TGC TGG*G*G*G*G*G-3’磷酸盐
(*硫代磷酸键，其余是磷酸二酯键)
类型＝DNA-PS；尺寸＝20；ε1/(mMcm)＝197.6；
MW(g/mole)＝6553；类型＝Non-CpG；18.34μM
质粒DNA
用DpnI+Hha将质粒DNA(空的质粒DNA载体)切为100bp至250bp之间的尺寸，在90摄氏度下变性并在酚+氯仿以及EtoH中纯化。将纯化的变性质粒DNA片段偶联至如下所述的抗体。
RNA序列：
(1)寡核糖核苷酸-(SEQ ID NO：)
5’磷酸盐GGG GAC GAC GUC GUG GGG GGG
(*硫代磷酸键-稳定的ss RNA)
siRNA
5’-UGUCCUUCAAUGUCCUUCAA-(SEQ ID NO：)
5’-AAUUGUGUAAUGUCCUUCAA-(SEQ ID NO：)
肿瘤-靶向肽序列：
i.-
CDCRGDCFC(RGD-4C肽)-(SEQ ID NO：3)；
(2)GGCDGRCG  -(SEQ ID NO：4)
CDGRC-(SEQ IDNO：5)
将500μl抗体肽溶液转移到eppendorf离心管中，向其中加入540μl的0.1M咪唑(即3M咪唑，在PBS中稀释为0.1M)。5mg的1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)与CpG DNA(ODN)在单独的管中混合，并立即与抗体咪唑或肽咪唑溶液混合(Ab∶ODN摩尔比＝1∶30.6)。
将管涡旋直到内容物溶解，并且将溶液短暂离心。离心后加入另外250μl的0.1M咪唑，产生的溶液在50℃温育2小时。
未反应的EDC、其副产物和咪唑通过
Figure GPA00001077157301021
过滤(MilliporeCorporation，Billerica，MA)除去。该样品随后用SDS-PAGE凝胶和质谱分析，以确定核苷酸与抗体和/或肽的偶联。进行蛋白分析以对抗体或肽的浓度进行定量。
核酸与抗体/靶向部分的偶联方法(图4)。
SDS-PAGE/免疫印迹显示，DNA-和RNA-偶联的单克隆抗体实际上被产生(图5)。
实施例2：DNA偶联的抗EGFR抗体对EGFR活性的抑制
在抗EGFR抗体或DNA偶联的抗EGFR抗体(抗EGFR Ab-DNA 1(SEQ IDNO：1)或抗EGFR Ab-DNA 2(SEQ ID NO：2)存在下，将HT-29结肠癌细胞在0.5％胎牛血清中培养，并随后在37℃用EGF(5ng/ml)刺激20分钟。接着，细胞用冰冷的含1mM原钒酸钠的PBS洗涤，细胞裂解物使用检测磷特异性EGFR(酪氨酸1068；细胞信号传导)的抗体进行蛋白质印迹分析。用抗EGFR抗体或DNA偶联的抗EGFR抗体处理HT-29细胞抑制EGFR的EGF-刺激的磷酸化(图6)。
实施例3：通过DNA/RNA偶联的抗EGFR抗体的树突细胞成熟
人单核细胞从骨髓单核细胞中分离，并在AIM5培养基(含10％人AB血清)和下列之一中培养6天：(1)以下细胞因子的组合：RANKL 1μg/ml+TNF-α20ng/ml+GM-CSF 800U/ml+IL-4500U/ml；(2)寡脱氧核苷酸SEQ ID NO：1(DNA)(5μg/ml)(不含细胞因子)；(3)DNA偶联的抗EGFR抗体(EGFR Ab-DNA)(5μg/ml)(不含细胞因子)。在第7天收集细胞并用针对MHC I类PE、MHC II类FITC和CD86-PE的抗体染色。树突细胞(DCs)的成熟通过对成熟标记CD86的增加的细胞表面表达进行流式细胞仪分析来评估。DNA偶联的抗EGFR抗体诱导CD86表达(即DCs的成熟)，这与响应于细胞因子混合物而观察到的情况类似(图7)。用抗EGFR Ab-DNA 2(SEQ ID NO：2)、抗EGFR Ab-质粒DNA和抗EGFR Ab-RNA偶联物获得类似结果。
实施例4：DNA偶联抗EGFR抗体或DNA偶联抗HER2抗体诱导人外周血 单核细胞(PRMCs)表达细胞因子[干扰素-γ(INF-γ)和Apo2L/TRIAL]
用抗人EGFR抗体(抗-EGFR Ab)5μg/ml、抗人HER2抗体(抗-HER2Ab)5μg/ml、寡脱氧核苷酸SEQ ID NO：1(DNA)5μg/ml、或DNA偶联抗体[抗EGFR抗体-DNA(抗EGFR Ab-DNA)或抗HER2抗体-DNA(抗HER2Ab-DNA)5μg/ml]处理人外周血单核细胞(PBMCs)。PBMCs上清液中细胞因子(INF-γ或Apo2L/TRAIL)的水平在24小时后通过ELISA评估(pg/ml)。用DNA(SEQ ID NO：1)或DNA偶联抗体对PBMCs的处理提高可溶性INF-γ或Apo2L/TRAIL在细胞上清液中的表达(图8)。用抗EGFR Ab-DNA 2(SEQ ID NO：2)获得类似结果。
实施例5：DNA偶联抗EGFR抗体对天然杀伤细胞的激活
将正常外周血单核细胞(PBMCs)(Johns Hopkins leucopheresis Unit)用DNA偶联抗EGFR抗体[抗EGFR Ab-DNA 1(SEQ ID NO：1)]或EGFR Ab(对照)(4μg/ml)处理3天或未处理。用抗CD56藻红蛋白(CD56PE)和抗CD8FITC(CD8FITC)标记细胞，然后通过流式细胞术分析。用EGFR Ab-DNA 1偶联物刺激后，PBMCs显示增加数量的CD56+细胞(图9)。
实施例6：DNA-或RNA-偶联抗EGFR抗体增加MHC表达
将正常外周血单核细胞(PBMCs)(Johns Hopkins leucopheresis Unit)用DNA偶联抗EGFR抗体[抗EGFR Ab-质粒DNA]或抗EGFR Ab-RNA(SEQ ID NO：)或EGFR Ab(对照)(4μg/ml)处理3天或未处理。用抗HLA类II(DR)标记细胞，并通过流式细胞术分析。用EGFR Ab-质粒DNA或EGFR Ab-RNA偶联物刺激后，PBMCs显示增加百分比的DR+细胞(图10)。
实施例7：响应于DNA偶联抗EGFR抗体或DNA偶联抗HER2抗体，在肿 瘤细胞中Apo2L/TRAIL的诱导
将表达EGFR的MDA-MB468细胞用EGFR抗体-DNA偶联物(EGFR Ab-DNASEQ ID NO：1或EGFR Ab-DNA SEQ ID NO：2)或EGFR Ab(对照)(5μg/ml)处理3天。将表达HER2的SKBr-3细胞用HER2抗体-DNA偶联物(HER2Ab-DNA SEQ IDNO：1或HER2Ab-DNA SEQ ID NO：2)或HER2Ab(对照)(5μg/ml)处理3天。在24、48和72小时后，通过定量PCR评估细胞中Apo2L/TRAIL的水平。在表达EGFR的肿瘤细胞(MDA-MB468)中响应于EGFR抗体-DNA偶联物(EGFR Ab-DNA SEQID NO：1或EGFR Ab-DNA SEQ ID NO：2)处理，以及在表达HER2/neu的肿瘤细胞(SKBr-3)中响应于HER2抗体-DNA偶联物(HER2Ab-DNA SEQ ID NO：1或HER2Ab-DNA SEQ ID NO：2)处理，Apo2L/TRAIL表达被诱导(图11)。
实施例8：DNA偶联抗体直接诱导靶向肿瘤细胞死亡的新形式——细胞超融 合——这在响应于未偶联抗体或任何已知类型抗癌剂中未观察到
表达EGFR的人直肠癌细胞(HT-29)在抗EGFR抗体(抗-EGFR Ab)或EGFR抗体-DNA偶联物(EGFR Ab-DNA SEQ ID NO：1或EGFR Ab-DNA SEQ ID NO：2)或游离寡脱氧核苷酸(DNA)(5μg/ml)存在下被铺板(5×104个细胞/ml)。细胞通过相差和缩时显微术(phase-contrast and time lapse microscopy)观察96小时。用任何一种DNA偶联抗EGFR抗体处理均诱导HT-29细胞融合并导致合生(杂交或多核)细胞的形成，其具有较短生命周期和受损的复制能力(超融合)，这对EGFR Ab或游离DNA未观察到(图12)。HT29细胞培养板表明，响应于EGFR抗体-DNA偶联物处理而不是EGFR抗体或未偶联核酸处理，诱导直接死亡(集落形成的丧失)(图13)。
将表达EGFR的人乳腺癌细胞(MCF-7或MDA-MB-468)在抗EGFR抗体(抗-EGFR Ab)(2-8μg/ml)或DNA偶联抗EGFR抗体(EGFR Ab-DNA SEQ ID NO：1或EGFR Ab-DNA SEQ ID NO：2)(2-4μg/ml)或游离寡脱氧核苷酸(DNA)(4μg/ml)存在的情况下铺板(5×104个细胞/ml)。用任何一种DNA偶联抗EGFR抗体处理均诱导乳腺癌细胞的超融合并形成合生的细胞体，其与用亲代(未偶联的)抗EGFR抗体处理的细胞比较生命周期较短和复制能力较差(图14)。细胞培养板表明，响应于任何一种EGFR抗体-DNA偶联物处理而不是EGFR抗体或未偶联核酸处理，诱导直接死亡(集落形成的丧失)(图15)。
将表达HER2/neu的人乳腺癌细胞(SKBr或MCF-7)在抗人HER2/neu抗体(抗-HER2/neu Ab)或DNA偶联抗HER2/neu抗体(抗HER2/neu Ab-DNA 1；SEQ IDNO：1或抗HER2/neu Ab-DNA 2；SEQ ID：2)(5μg/ml)存在的情况下铺板(5×104个细胞/ml)。细胞存活/增殖通过相差显微术评估。用任何一种DNA偶联抗HER2/neu抗体处理均诱导乳腺癌细胞的超融合，并形成生命周期较短和复制能力较差的合生细胞体，这在用亲代抗HER2/neu抗体处理的细胞中没有观察到(图16)。
将表达小鼠neu的乳腺癌细胞(NT2细胞)在抗neu抗体(抗-neu Ab)或DNA偶联抗neu抗体(抗neu Ab-DNA1；SEQ ID NO：1)(5μg/ml)存在的情况下铺板(5×104个细胞/ml)。细胞存活/增殖通过相差显微术和台盼蓝染料排除试验进行评估。DNA偶联抗neu抗体处理诱导表达小鼠neu的乳腺癌细胞(NT2)的超融合，并形成生命周期缩短的及复制能力减低的合生细胞体。而且，这样的超融合和细胞死亡不被未偶联抗体或DNA诱导(图17)。
实施例9：DNA偶联抗EGFR抗体诱导表达EGFR的肿瘤细胞的免疫细胞- 介导的裂解
HT-29直肠癌细胞用3H-胸苷(2.5μCi/ml)标记，胰蛋白酶消化，用PBS洗涤，并用EGFR-Ab或EGFR Ab-DNA 1(SEQ ID NO：1)或游离DNA(4μg/ml)处理，在96孔板中(5×103个细胞/孔)与PBMCs以不同的E∶T比例在37℃共培养4小时-72小时，一式三份。细胞被收集到滤纸上并通过特异性3H-胸苷释放百分数对细胞死亡/存活定量。与EGFR-Ab比较，用EGFR Ab-DNA处理导致HT-29细胞在4小时内更快速死亡(图18A)。与用EGFR-Ab或DNA处理HT-29细胞相反，用EGFR Ab-DNA培养HT-29细胞导致HT-29细胞在72小时内消除(PBMC：肿瘤细胞比例＝25)(图18B)。
实施例10：DNA偶联抗EGFR抗体抑制裸鼠中人EGFR + 结肠癌异种移植物 的生长
BALB/c裸鼠被皮下注射HT-29人结肠癌细胞(4×106)。肿瘤接种后5天，小鼠被施用抗EGFR抗体或DNA偶联抗EGFR抗体(EGFR Ab-DNA 1-SEQ ID NO：1)(20μg，肿瘤周围，每周两次，为期三周)，或不处理。对肿瘤尺寸和体积的分析显示施用EGFR Ab-DNA后肿瘤生长的显著抑制，所述抑制明显高于未偶联亲代抗EGFR抗体的抑制(图19A、19B)。与EGFR抗体的瞬时作用相反，响应于EGFRAb-DNA处理的肿瘤生长抑制持续大于12个月。
实施例11：DNA偶联抗neu抗体抑制同源FVB小鼠中Neu+肿瘤以及 HER2/neu转基因小鼠中自发肿瘤的生长
FVB小鼠被皮下注射NT2neu+乳腺癌细胞(4×106)。肿瘤接种后5天，小鼠被施用抗Neu抗体或DNA偶联抗Neu抗体(Neu Ab-DNA 1-SEQ ID NO：1)(20μg，肿瘤周围，每周两次，为期三周)或不处理。对肿瘤尺寸和体积的分析显示施用Neu Ab-DNA后肿瘤生长的显著抑制，所述抑制明显高于未偶联亲代抗Neu抗体或DNA的抑制(图20)。
患有自发乳腺癌的Neu(neu/N)-转基因小鼠被给予DNA偶联抗neu抗体(NeuAb-DNA 1-SEQ ID NO：1)(100μg，腹膜内，每周两次，为期两周；或50μg，肿瘤内，每周两次，为期两周)或不处理。对肿瘤尺寸和体积的分析显示施用DNA偶联抗neu抗体后肿瘤生长的显著抑制和肿瘤体积的减小(图21A和21B)。
尽管本发明已参照上述实施例进行描述，但应该理解，修改和变化包含在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅由所附的权利要求书限制。
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Claims (65)

1.分离的靶向部分-生物活性剂偶联物，其包括：
结合细胞组分或特定分子的靶向部分；
一个或更多个核酸分子；以及一个或更多个抗原肽或者一个或更多个多肽。
2.权利要求1所述的偶联物，其中所述靶向部分选自抗体、肽、适配子、配体及其组合。
3.权利要求1所述的偶联物，其中所述细胞组分是肿瘤抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤细胞表面分子。
4.权利要求1所述的偶联物，其中所述细胞组分是正常细胞上存在的细胞表面分子。
5.权利要求1所述的偶联物，其中所述细胞组分是免疫细胞上存在的分子。
6.权利要求1所述的偶联物，其中所述细胞组分是病原体或微生物的抗原或抗原决定簇。
7.权利要求1所述的偶联物，其中所述组分是包括抗原和标记的融合蛋白。
8.权利要求1所述的偶联物，其中所述核酸分子选自双链DNA(ds DNA)、单链DNA(ssDNA)、多链DNA、双链RNA(ds RNA)、单链RNA(ssRNA)、多链RNA、DNA-RNA杂交物(单链或多链)、肽核酸(PNA)、PNA-DNA杂交物(单链或多链)、PNA-RNA杂交物(单链或多链)、锁定核酸(LNA)、LNA-DNA杂交物(单链或多链)和LNA-RNA杂交物(单链或多链)。
9.权利要求1所述的偶联物，其中所述核酸分子包括在靶细胞中被转录和/或翻译的编码序列。
10.权利要求9所述的偶联物，其中所述编码序列是DNA质粒或源自质粒的DNA分子。
11.权利要求10所述的偶联物，其中所述核酸分子包括通过位点特异性重组从质粒产生的环状双链DNA分子，其包括可操作地连接至细胞特异性表达调控元件的感兴趣的基因，以及其中所述DNA分子不含有复制起点或任选地标记基因。
12.权利要求10或11所述的偶联物，其中所述DNA分子包括预定与寡核苷酸杂交的核苷酸序列。
13.权利要求12所述的偶联物，其中所述寡核苷酸被设置为与所述DNA分子形成多链核酸。
14.权利要求13所述的偶联物，其中所述寡核苷酸是线性单链或双链RNA。
15.权利要求13所述的偶联物，其中所述寡核苷酸是线性单链DNA或双链DNA肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、杂交DNA-LNA、DNA-PNA。
16.权利要求14或15所述的偶联物，其中所述靶向部分结合所述寡核苷酸，以及其中所述寡核苷酸进一步结合DNA分子。
17.权利要求14所述的偶联物，其中所述靶向部分是适配子分子。
18.权利要求17所述的偶联物，其中所述适配子进一步包括所述寡核苷酸。
19.分离的靶向部分-生物活性剂偶联物，其包括：结合细胞组分的靶向部分；以及核酸分子，其编码被设计为增强免疫应答的一个或更多个产物。
20.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述核酸分子包括能够刺激免疫应答的双链DNA。
21.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述核酸分子包括选自包括PAMP的组的一个或更多个免疫刺激分子。
22.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述核酸分子包括编码一个或更多个抗原决定簇的序列。
23.权利要求22所述的偶联物，其中所述抗原决定簇选自CD4+T细胞表位、CD8+T细胞表位、B细胞表位及其组合。
24.权利要求23所述的偶联物，其中所述抗原决定簇来自病原体或微生物。
25.权利要求24所述的偶联物，其中所述抗原决定簇源自破伤风毒素、白喉毒素、百日咳毒素、肝炎表面抗原或pDOM1。
26.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述核酸分子包括编码肿瘤抗原以及至少一个来自病原体或微生物的CD4+T细胞表位的双链DNA分子。
27.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述一个或更多个产物包括病原体相关分子模式(PAMP)、警报素和/或损伤相关分子模式(DAMP)。
28.权利要求27所述的偶联物，其中所述核酸分子进一步编码一个或更多个免疫刺激细胞因子。
29.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述核酸分子进一步编码一个或更多个共刺激多肽。
30.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述核酸分子进一步编码一个或更多个分子，所述分子募集、结合、成熟/增殖或激活抗原呈递细胞或树突细胞。
31.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述核酸分子编码一个或更多个免疫刺激RNA分子。
32.权利要求19所述的偶联物，其中所述核酸分子编码可干扰至少一个基因表达的一个或更多个RNA分子。
33.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述核酸分子编码诱导靶细胞死亡的分子。
34.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述核酸分子编码在转录启动子控制下的一个或更多个感兴趣的基因，所述转录启动子在靶细胞中具有功能活性。
35.权利要求1或19所述的偶联物，其进一步包括阳离子肽、阳离子脂质体、亲脂性部分或纳米颗粒。
36.权利要求1或19所述的偶联物，其进一步包括警报素。
37.权利要求1或19所述的偶联物，其进一步包括cathelicidin-衍生的LL37肽。
38.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述核酸分子是多链链核酸螺旋、DNA、RNA、DNA-RNA杂交物、PNA-DNA杂交物、LNA-DNA杂交物或LNA-RNA杂交物。
39.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述核酸分子是DNA、RNA、PNA或LNA。
40.权利要求1、19或27所述的偶联物，其中所述偶联物进一步连接于抗原或抗原决定簇。
41.权利要求40所述的偶联物，其中所述抗原或抗原决定簇与阳离子肽融合。
42.权利要求41所述的偶联物，其中所述阳离子肽选自LL37、His6和Arg9。
43.权利要求5、24或25所述的偶联物，其中所述靶向部分结合肿瘤细胞、肿瘤相关抗原或肿瘤血管。
44.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述靶向部分能够结合在正常皮肤或肌肉细胞上存在的分子。
45.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述靶向部分能够结合EGFR。
46.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述靶向部分能够结合抗原呈递细胞或树突细胞。
47.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述靶向部分能够结合DC抗原吸收受体。
48.权利要求47所述的偶联物，其中受体选自C型瘦蛋白-样受体、Fc受体、整联蛋白和清除受体。
49.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述受体选自DEC205、Fcγ受体、αVβ5、CD36、Lox1和CD91。
50.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述靶向部分能够结合肿瘤抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤细胞表面分子。
51.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述靶向部分能够结合阳离子肽。
52.权利要求40所述的偶联物，其中所述靶向部分连接至所述LL37、His6或Arg9。
53.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述核酸分子是线性DNA或小环DNA。
54.权利要求53所述的偶联物，其中所述DNA编码源自病原体或微生物的抗原决定簇。
55.权利要求51所述的偶联物，其进一步包括非编码核酸分子--包括DAMP、或警报素。
56.权利要求1、19或53所述的偶联物，其中所述核酸编码肿瘤抗原。
57.权利要求53所述的偶联物，其中所述抗原决定簇源自病原体。
58.权利要求53所述的偶联物，其中所述核酸进一步包括为PAMP的序列。
59.权利要求51所述的偶联物，其中所述小环编码融合蛋白，所述融合蛋白包括与源自病原体或微生物的抗原融合的肿瘤抗原。
61.权利要求1或19所述的偶联物，其中所述靶向部分包括能够结合EGFR。
62.用于治疗或预防肿瘤疾病的方法，其包括向需要的对象施用治疗有效量的权利要求1或19所述的偶联物。
63.用于治疗或预防需要的对象中的感染性疾病的方法，其包括向需要的对象施用治疗有效量的权利要求1或19所述的偶联物。
64.用于免疫细胞离体激活的方法，其包括将免疫细胞与权利要求1或19的组合物接触。
65.权利要求64所述的方法，其进一步包括向需要的对象施用治疗有效量的所述免疫细胞。
66.治疗肿瘤的方法，其包括联合相应的微生物疫苗施用权利要求1或19的组合物，其中所述偶联物包括来自所述微生物的抗原决定簇。
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