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CN111132686A - 治疗自身免疫性疾病和过敏的方法和试剂 - Google Patents

治疗自身免疫性疾病和过敏的方法和试剂 Download PDF

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CN111132686A CN201880057516.6A CN201880057516A CN111132686A CN 111132686 A CN111132686 A CN 111132686A CN 201880057516 A CN201880057516 A CN 201880057516A CN 111132686 A CN111132686 A CN 111132686A
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Abstract

本发明披露了诱导免疫耐受的组合物和修饰抗原以治疗疾病例如自身免疫疾病和变态反应的方法。所述组合物和相关方法包含APC可呈递抗原和提供对抗原特异的致耐受性免疫应答的免疫抑制剂。该组合物可以是含有抗原和免疫抑制剂的颗粒。该组合物也可以是含有抗原和免疫抑制剂的线性聚合物。

Description

治疗自身免疫性疾病和过敏的方法和试剂
相关申请的交叉引用
本申请声明对于2017年7月7日提交的美国临时专利申请62/529,476享有优先权,并且是2017年10月3日提交的美国申请15/723,173的部分继续申请。之前申请的整个信息披露被认为是即时申请信息披露的一部分，而在此引用。
发明背景
技术领域
本发明涉及用于药物应用的蛋白质，肽和抗原修饰以及用于治疗诸如自身免疫疾病和过敏的疾病的试剂。本发明公开了治疗自身免疫疾病和过敏的方法。
背景信息
免疫反应是保护免受潜在致病微生物所必需的。然而不希望的免疫激活可能导致有害过程，导致自身组织的损伤或破坏。例如，在自身免疫疾病中发生不期望的免疫激活，其中抗体和/或T淋巴细胞与自身抗原反应而损害身体组织。在过敏反应中也是这种情况，其特征在于对某些环境问题的过度免疫反应并且可能导致导致组织破坏的炎症反应。这也是移植器官排斥的原因，其由宿主中存在的识别供体同种异体抗原或异种抗原的同种异体反应性T细胞介导。免疫耐受是对通常发生免疫应答的抗原的获得性特异性免疫应答缺乏。通常，为了诱导耐受，必须暴露于耐受性抗原，这导致某些淋巴细胞的死亡或功能性失活。该过程通常为对自身抗原的耐受性或自身耐受性。免疫抑制剂可用于预防或减少不希望的免疫反应，例如用于治疗患有自身免疫疾病或同种异体移植的患者。产生对不希望的免疫应答相关的免疫抑制的常规策略是基于广谱免疫抑制药物。另外，为了维持免疫抑制，免疫抑制药物治疗通常是终身使用。不幸的是，广谱免疫抑制剂的使用与严重副作用的风险相关，例如肿瘤，感染，肾毒性和代谢紊乱。因此，新的免疫抑制剂疗法将是有益的。
附图说明
图1显示了抗原-药物缀合物的一般结构的例子。
图2显示了抗原-α-gal缀合物的一般结构的例子。
图3显示了用于SLE治疗的抗原-α-gal缀合物的实例
图4显示了抗原-药物缀合物的3种不同形式的实例。
图5显示了用于治疗自身免疫疾病或过敏或诱导免疫耐受的富含抗原-唾液酸的聚合物缀合物的实例。
图6显示了包含抗原和唾液酸/siglec配体的缀合物的实例。
图7显示了诱导免疫耐受和治疗自身免疫疾病或过敏反应的基于微球的试剂结构的示意性实例。
图8显示了使用与抗原，siglec配体和其他免疫抑制剂缀合的聚合物载体的不同形式；siglec配体和其他免疫抑制剂与抗原结合。
图9显示了用于系统性红斑狼疮治疗的siglec配体-抗原缀合物的实例。
图10显示了多种抗原和免疫抑制剂以接头连接以形成线性聚合物的的示意图。
图11显示了与包封有免疫抑制剂的纳米或微粒结合的含抗原的聚合物的示例性方案。
图12显示了含有接头以形成线性聚合物的多种抗原的示例性方案。
图13显示了缀合至聚合物载体主链的多种抗原的示例性方案。
图14显示了与纳米或微粒结合的含抗原的聚合物的示例性方案。
图15显示了将另外的T/B调节细胞刺激性分子/细胞因子包被到pMHC-NP/MP的示例性方案。
图16示出了多个pMHC被缀合至聚合物或在聚合物中表达而不是被涂覆在颗粒上的示例性方案。
发明描述和优选实施方案
在一个方面，本发明公开了透皮药物递送系统，例如透皮贴剂，其用于治疗选自自身免疫疾病，过敏反应和抗药物抗体的病症，其包含引起所述病症的抗原和免疫抑制剂。抗原可以是B细胞抗原，MHC-肽复合物形式的T细胞抗原，或可以与MHC结合形成MHC-肽复合物的T细胞抗原的抗原肽(或其衍生物)。免疫抑制剂的实例选自雷帕霉素，福吉霉素和甲氨蝶呤。本发明还公开了通过向受试者施用皮肤上的所述透皮药物递送系统来治疗受试者的自身免疫疾病或过敏或抑制其抗药物抗体产生或诱导抗原特异性免疫耐受的方法。
另一方面，本发明公开了一种治疗选自自身免疫疾病，过敏变态反应和抗药物抗体的病症或抑制抗药物抗体的产生或诱导抗原特异性免疫耐受的缀合物,呈线性聚合物形式或颗粒形式,其包含引起该病症的抗原，第一免疫抑制剂和可任选的第二免疫抑制剂。抗原可以是B细胞抗原，MHC-肽复合物形式的T细胞抗原或可以与MHC结合的抗原肽(或其衍生物)。第一种免疫抑制剂选自siglec配体，例如唾液酸或聚唾液酸。第二免疫抑制剂的实例选自雷帕霉素，福吉霉素和甲氨蝶呤,以及PD-L1。本发明还公开了通过向受试者施用所述缀合物(例如皮下或静脉内注射)来治疗受试者的自身免疫疾病或过敏或抑制其抗药物抗体产生或诱导抗原特异性免疫耐受的方法。
发明人先前的美国专利申请15/723,173公开了抗原-药物缀合物，其用于治疗自身免疫疾病和过敏变态反应或抑制抗药物抗体的产生或诱导抗原特异性免疫耐受,具有如图1所示的一般结构。
针对DNA的自身抗体是系统性红斑狼疮(SLE)中的关键致病因子，临床上使用DNA包被的亲和柱从患者血液中去除这些抗体(血液净化)作为有效的SLE治疗。抗原-药物缀合物可用于SLE治疗。DNA-连接子-Mrtansine(利用药物Abetimus采用的DNA序列，从药物Kadcyla采用的连接子/毒素，连接子可以针对B/T细胞进行优化)是用于SLE治疗的ADC的实例。使用的DNA序列是用GTGTGTGTGTGTGTGTGTGT(SEQ ID NO：1)和CACACACACACACACACACA(SEQ ID NO：2)形成的复合物。单链DNA抗原也可用于灭活对单链DNA特异的自身抗体生成细胞。它将选择性地灭活产生针对DNA的自身抗体的特异性B细胞克隆，从来源治疗疾病。它可以通过固相合成轻松制备。可以将其静脉内注射给患有SLE的患者进行治疗。将进行伴随测试以增加功效。在第一剂量ADC给药之前，将患者用血液净化处理以除去抗DNA抗体，以获得更好的治疗指数。
代替以前描述的表位(抗原)-毒素缀和物，也可以使用表位(抗原)-αgal(例如半乳糖-α-1,3-半乳糖)缀和物，其利用内源性抗αgal抗体使B细胞克隆或T细胞克隆失活，该克隆可以选择性地与表位(抗原)结合。可以从美国专利申请US 12/450,384和其他出版物中得到αgal引用实例。
表位(抗原)-alpha gal缀合物设计具有下结构式：α半乳糖基-(任选的连接子)-表位(抗原)，其将允许对表位(抗原)特异的T细胞/B细胞与内源性抗Gal抗体结合并且因此，由于结合的抗体而被消除/失活。示例结构如图2所示。
例如，抗原可以是由自身免疫B细胞/T细胞识别的胰岛素或胰岛素片段，或由糖尿病患者中的自身免疫T细胞识别的胰岛肽或β细胞的自身抗原(例如描述于ClinImmunol.2004 Oct；113(1):29-37和Proc Natl Acad Sci U S A.2003 Jul 8；100(14):8384–8388)。该缀合物将选择性地使引起糖尿病的自身免疫B细胞/T细胞失活。对于T细胞抗原，它可以是MHC-肽复合物形式，其中肽可任选地与MHC共价连接。
T细胞通过其TCR受体识别T细胞抗原。T细胞抗原通常是MHC-表位结合复合物的形式。表位通常是由抗原呈递细胞(APC)处理的肽(有时是其他分子，例如碳水化合物)。在本发明的一些实施方案中，T细胞的抗原优选是形成的MHC-表位复合物或其片段/衍生物/模拟物，其对TCR的特异性亲和力高于单独的表位。它可以是单体形式或低聚物(二聚体，三聚体，四聚体，五聚体或甚至更高程度的寡聚体和多聚体)形式，例如目前用于研究的MHC四聚体或dextramer。例如，HLA-A2insB10-18四聚体(描述于doi：10.1073/pnas.0508621102)可以与细胞灭活剂与任选的连接子缀合，通过灭活自身免疫T细胞来治疗1型糖尿病。表位(例如肽)可以与MHC共价缀合，以通过众所周知的出版物中公开的众所周知的方法增加其稳定性。类似地，本发明中用于B细胞的抗原也可以是寡聚体或聚合物形式。然而，用于使B细胞失活的抗原可以不需要MHC成分。
可以选择性灭活产生针对DNA的自身抗体的B细胞的示例性试剂如图3所示，该药物可用于治疗狼疮。患者可以每周静脉注射500mg～1g的所述缀合物。注射治疗其狼疮，直到症状消失。
载体系统可用于本发明以构建缀合物。例如，可以使用脂质体或微粒或纳米颗粒作为载体。抗原固定在脂质体或颗粒的表面上，效应分子(例如αgal，鼠李糖，免疫抑制细胞因子，tregitope肽，毒素，Si RNA或mi RNA或其类似物，免疫抑制剂，反义分子)可以是包封在脂质体或颗粒的内部或共固定在脂质体或颗粒的表面上。载体也可以是直链或支链聚合物，例如葡聚糖。抗原和效应分子都与聚合物结合。
包覆有自身抗原或针对同一疾病的不同自身抗原组合的固相颗粒(因为有时患者会有对一组不同的自身抗原具有特异性的T细胞/B细胞)可用于治疗其相应的自身抗原免疫疾病。特定的自身免疫疾病有时会涉及多种自身抗原(例如GAD65，胰岛素，前胰岛素等对于1型糖尿病患者，因此固相颗粒可以是不同固相颗粒的混合物，每种颗粒包覆有不同的自身抗原用于这种疾病；或者固相颗粒包覆有与疾病有关的不同自身抗原的混合物。然而，已知有时可以使用单一抗原来诱导针对一组特定抗原的免疫耐受，因此可能不需要不同抗原的混合物。可以对患者进行ELISA测试以鉴定所涉及的抗原，并使用该信息选择合适的固相吸附剂进行治疗。
当固相颗粒(例如10um-2mm的微粒或50nm-10um的颗粒)包覆有MHC-表位(例如肽)复合物(可以是单体或低聚物或聚合物形式，该复合物可以是共价的也可以是非共价的),它可以用于使T细胞针对这种自身抗原(MHC-表位复合体，例如HLA-A2insB10-18)失活。
除了αgal之外，还可以使用其他分子/肽/蛋白质与特定抗原缀合，以选择性地灭活结合特异性抗原并与特定抗原反应的特定B细胞克隆或T细胞克隆。由此产生的试剂具有以下一般结构：
细胞灭活分子–任选的连接子-抗原
该试剂以治疗有效量和以治疗上可接受的制剂可以给予具有自身免疫疾病或过敏症患者的患者(例如，通过静脉内注射)由于所述抗原以治疗所述自身免疫疾病或过敏症,或抑制抗药物抗体的产生或诱导抗原特异性免疫耐受。当抗原是治疗药物(例如重组蛋白)或其表位时，可以将其给予患者(例如通过静脉内注射)以抑制/防止患者的抗药物抗体(ADA)的产生。它可用于诱导抗原特异性免疫耐受。细胞灭活分子的实例包括对免疫细胞的亲和配体(例如抗体或其片段，适体)或它们的组合(例如那些在用于癌症治疗中使用的双特异性抗体和triomab)，诸如针对例如CD3的T淋巴细胞抗原的抗体，或抗CD3和CD28的双特异性抗体(或具有的Fc的triomab)，或与针对CD3的抗体或它的片段和B7的融合蛋白，已经具有体内的免疫反应性的抗原(例如alpha-gal，L-鼠李糖)，B7，超级抗原(例如葡萄球菌肠毒素A，SEA)，细胞因子(例如免疫细胞灭活细胞因子)和那些由本发明和先前专利申请以及参考文献中描述的。例如，L-鼠李糖可以通过糖苷键与PEG3连接，PEG3同时也与自身抗原缀合。
当抗细胞毒性免疫细胞激活受体如T细胞的CD3或NK细胞的CD16的抗体或其片段与抗原缀合时，它会募集/激活细胞毒性免疫细胞如T细胞或NK细胞，从而可以抑制/杀死可与抗原结合的靶B/T细胞(优选的靶T细胞的抗原是由其TCR识别的MHC-肽复合物)；这类似于目前用于杀死癌细胞的双特异性抗体，其不同之处是在缀合物中使用自身抗原而不是抗癌细胞的抗体)。
例如，在一个实例中，针对NK细胞的CD16A的抗体或Fab(该序列可以从Affimed的TnadAb AFM13获得采用)通过其半胱氨酸与图1中所示的针对SLE的连接子-抗原缀合以形成硫醇-马来酰亚胺方式连接。在抗体药物缀合物中广泛使用的连接和缀合方案是本领域技术人员熟知的。该抗原-抗CD16A抗体缀合物可用于治疗SLE。一旦注射给患者(例如，每周200mg～1000mg，每周一次)，它将与DNA抗原特异性B细胞结合并吸引NK细胞杀死它，因此抑制针对DNA抗原的自身抗体产生。或者，可以使用针对CD3的抗体或Fab代替针对CD16的抗体或Fab以制备缀合物。得到的缀合物可以吸引细胞毒性T细胞杀死抗原特异性B细胞以治疗相应的自身免疫疾病。
任选地，还可以将另外的亲和配体引入缀合物中以增加对B或T细胞的亲和力和特异性。例如，抗CD20抗体也可以通过连接子掺入缀合物中以增加针对B细胞的靶向，这是一种类似于三特异性抗体的方案。
除共刺激分子B7.1外，其他共刺激分子也可用作细胞灭活分子，例如选自其他B7家族成员的那些，包括B7.2(CD86)，B7-H1(PD-L1)，B7-H2(B7RP-1或ICOS-L或B7h或GL-50)，B7-H3(B7RP-2)，B7-H4(B7x或B7S1)，B7-DC(PD-L2)等，以及它们的具有与天然和人造变体超过70％同一性的氨基酸序列的蛋白质。共刺激分子B7.1(CD80)或其他共刺激分子的作用是刺激机体的免疫反应。此外，除了B7家族成员外，其他分子也可以刺激T细胞，也可以用作本发明的细胞灭活分子。专利申请CN102391377A(CN201110338886)中描述的方案可以容易地用于本发明。例如，CN102391377A中融合蛋白的细胞因子可以用自身抗原替换，以产生本申请的缀合物，以灭活抗原特异性B细胞和/或T细胞。
B7是在活化的抗原呈递细胞(APC)上发现的一种外周膜蛋白，当与T细胞上的CD28或CD152(CTLA-4)表面蛋白配对时，可产生共刺激信号或共抑制信号以增强或者降低APC和T细胞之间的MHC-TCR信号的活性。某些B7蛋白可以增强T细胞的活性(例如B7.1，B7.2)，其中一些可以抑制B/T细胞的活性(B7.DC/PD-L2，B7.H1/PD-L1)。当T细胞激活B7与抗原偶联缀合时，它将募集/激活其他T细胞或细胞毒性免疫细胞以抑制/杀死(类似于目前的双特异性抗体杀死癌细胞，不同之处是使用自身抗原代替癌细胞抗体)可以与抗原结合的靶B/T细胞(优选靶T细胞的抗原是由其TCR识别的MHC-肽复合物)。当B/T细胞抑制B7用于缀合物时，它将与靶B/T细胞上的相应受体结合，以杀死/灭活可与抗原结合的靶B/T细胞。
像B7一样，其他可以激活免疫细胞上的抑制性免疫检查点受体的配体，如A2AR，B7-H3，B7-H4，BTL，IDO，KIR，LAG3，PD-1，TIM-3和VISTA，或可阻断免疫细胞如CD27，CD47,CD28，CD40，CD122，CD137，OX40，GITR，CD52和ICOS上的活化检查点分子的配体(例如抗体或其片段)，也可用作细胞灭活分子。例如，细胞灭活分子可以是PD-L1或其衍生物/片段或模拟物或其他结合PD-1以防止B或T细胞活化配体，PD-L2或其衍生物/片段或模拟物或其他结合PD-1以防止B或T细胞活化的配体等。
当靶细胞是B细胞时，也可以使用BCR抗原-TCR抗原缀合物。可以在这些功能组之间添加可选的链接子。在缀合物中，B细胞抗原与靶B细胞结合，T细胞抗原(MHC-抗原肽复合物，其可以共价连接在一起)与效应T细胞结合。B细胞和T细胞的抗原可以不同。原理是募集现有的效应T细胞以杀死/灭活靶B细胞。T细胞抗原也可以是能够与MHC结合形成MHC-肽复合物或其衍生物的肽，而不是完整的MHC-肽复合物型T细胞抗原，在这种情况下，肽将由APC处理然后在体内形成MHC-肽复合物。
本发明还公开了通过将抗原和免疫抑制剂/药物的组合作为物理混合物或作为合成缀合物或作为纳米/微粒或脂质体应用于需要的对象/患者来治疗自身免疫疾病和过敏,或抑制抗药物抗体的产生或诱导抗原特异性免疫耐受,的方法和试剂。术语纳米/微米颗粒是指颗粒在纳米或微米范围内的尺寸(直径)。例如，纳米/微米颗粒的尺寸范围可以为50nm～100um。示例性免疫抑制药物的列表可以在维基百科的“免疫抑制药物”文章页面中找到。适用于本申请的免疫抑制剂/药物(免疫抑制剂)包括但不限于他汀类；mTOR抑制剂，如雷帕霉素或雷帕霉素类似物；TGF-β信号传导因子；TGF-β受体激动剂；TLR(Toll likereceptor)抑制剂；模式识别受体抑制剂；NOD样受体(NLR)抑制剂；RIG-I样受体抑制剂；NOD2抑制剂；组蛋白去乙酰化酶抑制剂，如曲古抑菌素A；糖皮质激素；线粒体功能的抑制剂，如鱼藤酮；P38抑制剂；NF-κβ抑制剂，如6Bio，地塞米松，TCPA-1，IKK VII；腺苷受体激动剂；前列腺素E2激动剂(PGE2)，如米索前列醇；磷酸二酯酶抑制剂，如磷酸二酯酶4抑制剂(PDE4)，如咯利普兰；蛋白酶体抑制剂；激酶抑制剂；G蛋白偶联受体激动剂；G蛋白偶联受体拮抗剂；糖皮质激素；维甲酸；细胞因子抑制剂；细胞因子受体抑制剂；细胞因子受体激活剂；过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂；过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂；组蛋白去乙酰化酶抑制剂；钙调神经磷酸酶抑制剂；磷酸酶抑制剂；PI3 KB抑制剂，如TGX-221；自噬抑制剂，如3-甲基腺嘌呤；芳烃受体抑制剂；蛋白酶体抑制剂I(PSI)；和氧化的ATP，如P2X受体阻滞剂。免疫抑制剂还包括IDO，维生素D3，环孢菌素，如环孢菌素A，芳烃受体抑制剂，白藜芦醇，硫唑嘌呤(Aza)，6-巯基嘌呤(6-MP)，6-硫鸟嘌呤(6-TG)，FK506，sanglifehrin A，沙美特罗，霉酚酸酯(MMF)，阿司匹林和其他COX抑制剂，尼氟酸，雌三醇和雷公藤内酯，siglec配体如唾液酸及其衍生物包括聚唾液酸唾液酸-脂质结合物。在实施方案中，免疫抑制剂可包含本文提供的任何药剂。免疫抑制剂可以是直接对APC提供免疫抑制(例如致耐受)作用的化合物，或者它可以是间接提供免疫抑制(例如致耐受)作用的化合物(即，在给药后通过某种方式被处理后)。因此，免疫抑制剂包括本文提供的任何化合物的前药形式。
免疫抑制剂还包括血红素氧合酶-1(HO-1)诱导剂，例如钴原卟啉(CoPP)，含有三价铁离子的原卟啉IX(血红素B)和氯化物配体(Hemin)，血红素，铁原卟啉或血红素降解产物，以及PCT/EP2015/074819中描述的那些。Siglecs(唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素)配体如唾液酸或其衍生物也是可用于本发明的另一类免疫抑制剂。PD-L1也是可用于本发明的另一类免疫抑制剂。PD-L1可有效抑制细胞毒性T细胞。也可以使用可以与PD-1结合的PD-L1的片段或模拟物或衍生物。其他可与抑制性检查点受体结合的抑制性配体(如A2AR，BTLA，CTLA-4，CD47,KIR，LAG3，TIM-3，VISTA等)如B7-H3，B7-H4也可用于代替PD-L1。可以促进T/B reg扩增的分子(例如可以刺激T/B reg扩增的细胞因子，例如IL-2和TGF-β)也是另一种类型的免疫抑制剂。不同的免疫抑制剂可以作为混合物使用，并且可以在本发明中组合使用。
免疫抑制剂可以是对APC直接提供免疫抑制(例如，致耐受性)作用的化合物，或者可以是间接(即在给药后以某种方式加工后)提供免疫抑制(例如，致耐受性)作用的化合物。因此，免疫抑制剂包括本文提供的任何化合物的前药形式。
免疫抑制剂还包括编码本文中披露的肽，多肽或蛋白质的核酸，其导致免疫抑制(例如致耐受性)免疫应答。因此，在实施方案中，免疫抑制剂是编码导致免疫抑制(例如致耐受性)免疫应答的肽，多肽或蛋白质的核酸。核酸可以与合成纳米载体偶联。核酸可以是DNA或RNA，例如mRNA。在实施方案中，本发明的组合物包含本文提供的任何核酸的互补物，例如全长互补物，或简并(由于遗传密码的简并性)。在实施方案中，核酸是表达载体，其可以在转染到细胞系中时转录。在实施方案中，表达载体可包含质粒，逆转录病毒或腺病毒等。可以使用标准分子生物学方法分离或合成核酸，例如通过使用聚合酶链反应产生核酸片段，然后将其纯化并克隆到表达载体中。
在一些实施方案中，本文提供的免疫抑制剂与合成纳米载体偶联。在优选的实施方案中，免疫抑制剂是除构成合成纳米或微米载体结构的材料之外的元素。例如，在一个实施方案中，其中合成纳米或微米载体由一种或多种聚合物组成，免疫抑制剂是另外并与一种或多种聚合物偶联的化合物。作为另一个实例，在一个实施方案中，其中合成纳米或微米载体由一种或多种脂质组成，免疫抑制剂再次另外并与一种或多种脂质偶联。在实施方案中，例如合成纳米或微米载体的材料也导致免疫抑制(例如，致耐受)效应的情况下，免疫抑制剂是除合成纳米或微米载体的材料之外存在的元素，其导致免疫抑制(例如，致耐受)效应。
其他示例性免疫抑制剂包括但不限于小分子药物，天然产物，抗体(例如，抗CD20，CD3，CD4的抗体)，基于生物制剂的药物，基于碳水化合物的药物，纳米颗粒，脂质体，RNAi，反义核酸，适体，甲氨蝶呤，NSAIDs，芬戈莫德，那他珠单抗，阿仑单抗，抗CD16，抗CD3；他克莫司(FK506)等。其他免疫抑制剂是本领域技术人员已知的，并且本发明不限于此。另外适用的免疫抑制剂可以在专利和专利申请US 13/880,778，US 14/934,135，CA 2910579，US13/084,662，US14/269,048，US8652487和Selecta Biosciences提交的其他专利申请中找到。
另外的免疫抑制剂可在Selecta Biosciences提交的专利WO2012054920A2，专利WO2016073799A1，WO2012149393 A3，专利WO2014179771A1，PCT/US2012/035405，专利US20110262491，专利US8652487和其他专利申请中找到。Selecta的出版物公开了合成的纳米载体方法和相关组合物，其中包括B细胞和/或MHC II类限制性表位和免疫抑制剂，以产生耐受性免疫应答。在他们的公开中，抗原/表位偶联至纳米载体，并且免疫抑制剂偶联至纳米载体。
另一种方法和组合物是使用具有非共价吸附的抗原/表位并封装在其中的免疫抑制剂的纳米/微粒。纳米/微粒可以由可生物降解的材料例如PLGA制成。可以将这类纳米/微粒(例如直径为
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的颗粒)作为注射或吸入的药物给予患者或局部应用以诱导免疫耐受。免疫抑制剂的封装是本领域技术人员众所周知的，并且可以容易地从相关出版物中采用。纳米/微粒表面可以具有带电荷的基团，例如氨基或羧基，以增加抗原/表位与其表面的结合；它还可以具有疏水表面，以通过疏水相互作用使抗原/表位结合。或它们的组合。通过使用表面改性或使用含胺或羧基的分子来制备纳米/微粒，可以将带电基团引入表面。抗原/表位也可以与脂质分子例如脂肪酸或胆固醇缀合以增加其与纳米/微粒的结合。抗原/表位在纳米/微粒表面的吸附可以通过将抗原/表位与纳米/微粒一起孵育(例如在水溶液缓冲液(如1xPBS)中4度过夜放置)，然后去除未结合的抗原/表位(例如用水性缓冲液洗涤纳米/微粒数次，类似于ELISA板涂覆程序)。在一个实例中，根据文献制备了包封有10重量％雷帕霉素的
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尺寸的PLGA纳米颗粒。接下来，将PLGA纳米颗粒与OVA(10mg/mL)在4℃下混合过夜，以产生OVA(卵清蛋白)包被的颗粒。用PBS洗涤颗粒3次以除去未结合的OVA。在另一个例子中，雷帕霉素以50mg/ml溶解在DMSO中。将总量为50μL的雷帕霉素添加到溶解于二氯甲烷的1mLPLGA(5mg/ml)中。接下来，使用超声波将混合物与0.4ml5％OVA溶液均化10分钟。将o/w乳液添加到2.1mL的5％w/v的PVA溶液中，以在室温下4小时蒸发有机溶剂。在3500g离心20分钟后，获得包含雷帕霉素的OVA涂覆的纳米颗粒。可以执行额外的洗涤步骤以获得不含游离OVA的颗粒。可以使用出版物中描述的类似方案(例如，来自Selecta Bio的那些)，将该OVA包被的颗粒给予需要者以诱导OVA免疫耐受。OVA可以被其他抗原/表位分子替代以诱导相应的免疫耐受。在另一个样品中，可以将亲脂性羧酸或亲脂性胺或阴离子去污剂或阳离子去污剂(例如脂肪酸，如辛酸，月桂酸；或阳离子脂质，如DOTMA，DOTAP，胆固醇胺)添加到PLGA中，以制备具有表面电荷的PLGA颗粒。在一实施例中，雷帕霉素以50mg/ml溶于10％月桂酸的DMSO中。将总共50μL雷帕霉素/月桂酸加到溶解在二氯甲烷中的1ml PLGA(5mg/ml PLGA)中。接下来，使用超声将混合物与0.1毫升2％辛酸溶液均化10分钟。在室温下蒸发o/w乳剂4小时以除去有机溶剂。将所得的PLGA颗粒用PBS洗涤3次，然后与OVA一起温育以制备结合了OVA的颗粒。
此外，抗原/表位除了被结合或吸附到其表面之外，还可以被封装在纳米/微粒内。抗原/表位包囊的制备方法是本领域技术人员众所周知的，并且可以容易地从相关出版物中采用，例如，美国专利5,886,019,其使用了双乳化水/油/水系统。
美国专利申请20130287729 A1公开了抗原特异性，诱导耐受性的微粒及其用途。它公开了用于靶向特定的呈递抗原的免疫细胞并诱导抗原特异性免疫耐受的微粒(尺寸为0.5μm-10.0μm)，其中所述微粒包含抗原和治疗剂，其中所述治疗剂是免疫调节剂，或免疫抑制致耐受剂或募集特定抗原呈递免疫细胞的试剂，其中微粒的表面包含靶向特定抗原呈递免疫细胞的配体，并且微粒由可生物降解的材料制成。该方法和组合物的进一步改进是使用尺寸为
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的纳米/微粒，优选由可生物降解的材料制成。在一些实施方案中，纳米/微粒的表面用抗体的Fc部分,或完全抗体包被，其Fc部分面向外部。这将与FcR结合以促进APC吸收。在其他实施方案中，纳米/微粒的表面不需要具有靶向抗原呈递免疫细胞的配体。在一些实施方案中，它可以在其表面上包被有抗原/表位。纳米/微粒的内部包含在本申请中列出的免疫抑制剂和任选的抗原/表位，例如,通过封装。该制备方法是本领域技术人员众所周知的，并且可以容易地从相关出版物中采用。
美国专利申请20160338953 A1公开了基于脂质体的免疫疗法。其发明提供了包封自身抗原的脂质体，其中脂质体的大小为500至15000nm，脂质体膜包含的磷脂酰丝氨酸(PS)的量相对于总膜脂质体组合物为10至40重量％。还提供了包含治疗有效量的所述脂质体的药物或兽医学组合物。此外，它提供了如上所定义的脂质体和药物或兽用组合物，其用作药物，特别是用于治疗自身免疫性疾病。最后，它提供了如上所定义的脂质体和药物或兽用组合物，用于恢复患有自身免疫疾病的患者对自身的耐受性。
本发明则公开了诱导抗原特异性免疫耐受的脂质体及其用途。脂质体封装在内部了本申请中列出的免疫抑制剂(以及任选的抗原/表位分子)。任选地，脂质体的表面还可被抗原/表位包被。它可以作为注射或吸入剂的形式给予患者，或局部应用以诱导免疫耐受。用于脂质体的脂质可以包括但不限于膜重量的10％至40％的磷脂酰丝氨酸。它还可以使用非磷脂酰丝氨酸脂质制备脂膜。抗原/表位也可以与脂质型分子例如脂肪酸或磷脂或胆固醇衍生物缀合，以使其可以插入脂质体膜。合适的脂质体的大小可以在
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之间。制备方法及其使用方案是本领域技术人员众所周知的，并且可以容易地从相关出版物中采用，例如US20160338953中的那些。适用于本发明制备脂质体的脂质分子的实例包括但不限于磷脂甘油脂，甘油磷脂，鞘脂，神经酰胺，甘油磷酸乙醇胺，固醇或类固醇。这些脂质分子也可用于制备抗原/表位-脂质缀合物。也可以使用膜锚定肽-抗原/表位缀合物代替抗原/表位-脂质缀合物。
另外，也可以将可促进T/B reg扩增的其他分子(例如IL-2和/或TGF-β和PD-L1)包覆和/或缀合和/或包封在脂质体或纳米/微粒内。
本发明公开了通过将抗原和免疫抑制剂的混合物局部施用于需要的对象/患者来治疗自身免疫疾病和过敏的方法和试剂。当抗原是药物(例如蛋白质药物)或其表位时，它还可用于抑制抗药物抗体的产生。它会诱导抗原的免疫耐受。适用于本申请的制剂的实例包括固体形式，例如粉末，凝胶，洗剂，软膏，溶液，喷雾剂，栓剂，锭剂，片剂和贴剂，其可局部施用于皮肤或粘膜。术语局部药物递送包括除注射之外的药物递送途径。它包括将药物应用于皮肤或粘膜。它包括鼻内给药，直肠给药，舌下给药和口腔粘膜给药。免疫抑制剂可以是活性药物形式，前药形式，微粒或纳米粒子形式或脂质体形式。抗原可以是B细胞抗原/表位或T细胞抗原/表位(例如MHC-肽复合物或其缀合物；或是可以与MHC结合的肽抗原)或它们的组合。该组合可以是B细胞抗原/表位与T细胞抗原/表位的组合；或几种不同B细胞抗原/表位和/或靶向相同疾病或不同疾病的几种不同T细胞抗原/表位的组合。使用非肽-MHC复合物形式的但是可与MHC结合然后在体内形成MHC-肽复合物(T细胞抗原)的肽抗原(T细胞表位)，可以减小其大小和分子量，因此改善了透皮递送。它们的例子可以在当前的申请和相关出版物和专利申请中找到。
在一些实施方案中，该方法是使用含有抗原/过敏原和免疫抑制药物(上文列出的药物，例如雷帕霉素或福吉霉素或甲氨蝶呤或唾液酸或其衍生物或高亲和力siglec配体或它们的组合)的贴剂。唾液酸可以是游离唾液酸或唾液酸酯，唾液酸-脂质偶联物。例如，可以使用唾液酸的-COOH与胆固醇的-OH将唾液酸与胆固醇缀合以形成酯键。该缀合物将具有更好的透皮和细胞膜渗透能力。脂肪酸也可以与唾液酸的-OH偶联以形成缀合物。这些结合物在透皮递送后将作为免疫抑制药物起作用。高亲和力Siglec配体的实例可以在美国专利US8357671中找到。
抗原和免疫抑制药物的透皮或透黏膜递送将通过皮肤或黏膜中的DC细胞诱导免疫耐受。可以剥去皮肤上的角质层，以增加药物输送或使用微针系统。这对于食物过敏和自身免疫疾病治疗来说将是一种比注射更方便的策略。皮肤可以是完整的或可以剥离以去除角质层以增加药物递送。微针系统也可用于皮肤。微针系统中的微针可以由生物可降解材料制成，例如应用PLGA包封抗原和免疫抑制剂。或者，也可以使用包封抗原和免疫抑制剂的生物可降解植入物。如果植入物是大颗粒，则植入物的尺寸可以大于10um直径，优选>100um。例如，用含有3mg雷帕霉素和1mg麦醇溶蛋白的PLGA制成的2mm(长度)×0.3mm(直径)的棒可用作皮下的植入物以治疗麸质过敏。也可以使用其他植入物形式，例如来自Intarcia的Medici药物递送系统或Nanoprecision Medical的NanoPortal Capsule，只要它们可以同时递送抗原和免疫抑制剂。
DBV Technologies和其他小组(例如，用于气过敏原和食物过敏的描述于DOI：10.1007/s40521-013-0003-8，Epicutaneous Immunotherapy for Aeroallergen andFood Allergy中的那些)正在使用含有过敏原的皮肤贴剂通过诱导对抗原(过敏原)的耐受性来治疗过敏变态反应。这类表面局部贴剂或其他制剂可以很容易地转用于当前发明应用。例如，那些局部应用的制剂，例如US 15/135,914，US6676961，US15/111,204，US8932562B2，US15/184,933A1和US8202533B2中描述的贴剂，以及那些商业来源的贴剂(例如
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Milk和
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Peanut)，可以通过在其中添加额外的免疫抑制药物(例如0.1mg～20mg雷帕霉素或福吉霉素，或1mg～100mg甲氨蝶呤，或其衍生物或前药)而转用于本发明。除了贴剂含有免疫抑制剂外，其给药方法可以与现有技术基本相同。可以将附加的透皮促进剂(例如DMSO，氮酮，脂肪酸，透明质酸等，这类物质以及它们的合适量可以在出版物中容易地找到)添加到贴剂中或在施用贴剂之前施用于皮肤。可加入透皮促进剂的实例包括DMSO(例如10-300mg/贴剂)，azone(例如总药物重量的1％～10％)，表面活性剂，脂肪酸(例如1％～10％油酸)。皮肤也可以通过去角质处理或其他方式去除角质层以增强透皮递送。在一个实例中，贴剂含有500ug-10mg麸质蛋白(例如Sigma#G5004，小麦麸质蛋白)和0.1mg～10mg雷帕霉素或1mg～50mg甲氨蝶呤.例如,抗原例如麸质蛋白和免疫抑制剂如雷帕霉素和/或甲氨蝶呤可以是粉末形式，可以简单地物理混合在一起,也可以共同溶解，然后干燥，然后放入贴片中。在另一个实例中，贴剂含有5mg麸质蛋白(例如Sigma#G5004，小麦麸质蛋白)和5mg雷帕霉素或50mg甲氨蝶呤和任选另外的30mg氮酮。在另一个实例中，贴剂含有5mg麸质蛋白(例如Sigma#G5004，小麦麸质蛋白)和100mg唾液酸或唾液酸-胆固醇缀合物或10mg甲氨蝶呤。这可用于诱导麸质蛋白耐受,治疗麸质不耐症。麸质蛋白(谷蛋白)可以用麦醇溶蛋白代替。在实施方案中，贴剂可以每天施用共1-5周。在另一个实例中，抗原是花生抗原ara h2 200ug和2mg雷帕霉素一起在贴剂中以治疗花生过敏。在一个实施例中，将花生抗原ara h2 200ug，2mg雷帕霉素和50mg蔗糖溶解在水中，然后冻干，然后置于贴剂中。在一个实施例中，将花生抗原ara h2 200ug，2mg雷帕霉素，50mg SDS和50mg蔗糖溶解在水中，然后冻干，然后置于贴剂中。在一个实施例中，将花生抗原ara h2 200ug，2mg雷帕霉素，100mg DMSO和50mg蔗糖溶解在水中，然后冻干，然后置于贴剂中。在另一个实例中，抗原是前面图中用于治疗狼疮的双链DNA(1mg～10mg)，药物是3mg雷帕霉素或福吉霉素或替西罗莫司。在另一个实例中，鼻喷雾剂含有1mg麸质蛋白(例如来自Sigma#G5004，小麦麸质蛋白)和1mg雷帕霉素或10mg甲氨蝶呤，采用相应合适的喷雾剂形式。在另一个实例中，舌下含片含有50mg麸质蛋白(例如来自Sigma#G5004，小麦麸质蛋白)和1mg雷帕霉素或20mg甲氨蝶呤。在另一个实例中，凝胶剂为在每1ml凝胶中含有50mg麸质蛋白(例如来自Sigma#G5004，小麦麸质蛋白)和2mg雷帕霉素或20mg甲氨蝶呤。免疫抑制药物或免疫抑制药物与抗原的组合可以是粉末或凝胶或半液体形式或脂质体形式(例如直径100nm～5μm)或纳米/微米颗粒(例如100nm～1um)或与树枝状聚合物或线性聚合物缀合(例如通过酯键偶联至聚丙烯酸或聚唾液酸以形成分子量＝5，000～500，000道尔顿的基于聚合物的前药)。
其它药学上可接受量的抗原和免疫抑制剂也可以用于贴剂中，只要它可以产生令人满意的生物学或治疗(例如免疫耐受)效果，这可以通过用众所周知的方案和方法筛选和测试来实验确定。
抗原可以是B细胞抗原/表位或T细胞抗原/表位(例如MHC-肽复合物或缀合物；或可以与MHC结合的肽抗原)或其组合。它们的示例可以在当前申请以及相关的出版物和专利申请中找到。
抗原和免疫抑制药物透皮递送后被皮肤中抗原呈递细胞APC吞噬吸收，诱导/激活致耐受性树突细胞和Treg/Breg，抑制B细胞活化/抗体产生，生发中心形成和抗原特异性超敏反应，导致长期的抗原特异性免疫耐受。
皮肤贴剂(也称为透皮贴剂)是含有药物的粘性贴剂或有可附着性的贴剂，其置于皮肤上以通过皮肤递送特定剂量的药物并进入血流。现在有各种各样的药物以透皮贴剂形式提供。
有几种主要类型的皮肤/透皮贴剂。单层药物于粘合剂中类型是该给药系统的粘合剂层也含有药物。在这种类型的贴剂中，粘合剂层不仅用于将各个层与整个系统一起粘附到皮肤上，而且还负责药物的释放。粘合剂层由临时衬里和背衬围绕。多层药物于粘合剂类型类似于单层系统；但是其多层系统是不同的，因为它增加了另一层药物于粘合剂中，通常由膜隔开(但并非在所有情况下)。其中一层用于立即释放药物，而另一层用于控制药物从贮存器中释放。该贴片还具有临时衬垫层和永久背衬。由此释放的药物取决于膜渗透性和药物分子的扩散。储库类型不同于单层和多层药物于粘合剂系统，储库透皮系统具有单独的药物层。药物层可以是液体或凝胶或粉末隔室，其含有通过粘合剂层分离的药物溶液或悬浮液或粉末。此贴剂也有后背层支持。在这种类型的系统中，释放速率为零级。基质型具有固体或半固体基质的药物层，其含有药物溶液或悬浮液或固体层，例如粉末或薄膜。该贴剂中的粘合剂层围绕药物层，部分覆盖它。在一些实施方案中，储库类型和基质类型可用于本发明。
在一个实例中，通过使用溶剂浇铸方法制备负载了抗原和免疫抑制剂的基质型透皮贴剂。使用总面积为50cm2的培养皿。将抗原和免疫抑制剂溶解在5mL水/甲醇(1：1)溶液中并混合直至获得澄清溶液。使用200mg聚乙二醇400作为增塑剂，并使用任选的100mg丙二醇或油酸或吐温80作为渗透促进剂，将100mg蔗糖与抗原/免疫抑制剂溶液一起加入。将得到的均匀溶液浇铸在培养皿上，培养皿用甘油润滑并冻干或在室温下干燥24小时。然后将干燥的贴剂置于用作背衬膜的醋酸纤维素膜上。在另一个实施例中，将称好重量的PVA(2.5％w/v)加入蒸馏水中，通过在60℃下持续搅拌和间歇加热几秒钟制成均匀溶液并倒入已经用铝箔在开口端周围包裹的玻璃模具中，并保持在60℃下干燥6小时，形成光滑，均匀和透明的背衬膜。背膜用作含有抗原和免疫抑制剂的基质的支持物。
在一些实施方案中，本发明方法中使用的皮肤贴剂装置优选包括背衬，所述背衬的周边适于与皮肤形成气密封闭的腔室。该背衬在腔室内的面向皮肤的一侧承载用于降低皮肤过敏反应性的组合物。优选地，背衬的周边具有粘合性并形成气密接合，以与皮肤形成密闭的腔室。
在一个具体实施方案中，过敏原和免疫抑制剂组合物通过静电和/或范德华力保持在背衬上。该实施方案特别适用于组合物过敏原为固体或干燥形式(例如颗粒)的情况，尽管它也可间接地用于过敏原为液体形式的情况。在本发明的上下文中，术语“静电力”通常表示涉及电荷的任何非共价力。术语范德瓦尔斯力表示在背衬表面和固体过敏原之间产生的非共价力，可以是三种类型：永久偶极子力，诱导偶极子力和伦敦范德华力。静电力和范德华力可以单独或一起起作用。在这方面，在优选实施例中，贴片装置包括静电背衬。如本文所用，表述“静电背衬”表示由能够累积静电荷和/或产生范德华力的材料制成的任何背衬，例如通过摩擦，加热或电离，以及保存这些电荷。静电背衬通常包括具有空间电荷的表面，其可以均匀地分散或不均匀地分散。取决于构成所述背衬的材料，以及用于产生电荷的方法，出现在背衬表面的一侧或另一侧上的电荷可以是正的或负的。在所有情况下，分布在背衬表面上的正电荷或负电荷在导电或非导电材料上引起吸引力，从而允许维持过敏原和免疫抑制剂。颗粒也可以被电离，从而在颗粒和背衬之间产生相同类型的静电吸引力。适于提供静电背衬的材料的实例是玻璃或选自包括纤维素塑料(CA，CP)，聚乙烯(PE)，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，聚氯乙烯(PVC)，聚丙烯，聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚丙烯酸类的聚合物的聚合物。特别是聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)和含氟聚合物(例如PTFE)。上述列表绝不是限制性的。
背衬的背面可以覆盖有签条，该签条可以在施用之前剥离。例如，当背衬至少部分半透明时，该签条使得可以将组合物过敏原储存在黑暗中。由于存在湿气导致的薄水膜，可以增强或降低表面和颗粒之间的力的强度。通常，贴剂制成并保存在干燥的地方。水分应足够低，以保持活性成分。可以调节水分率以获得最大的附着力。如上所述，在过敏原为干燥形式(例如颗粒形式)的情况下，使用静电背衬是特别有利的。此外，技术人员可以调节粒度以提高静电和/或范德华力的效率，以将颗粒保持在载体上。
在一个具体实施方案中，贴剂包含聚合物或金属或金属涂覆的聚合物背衬，并且组合物过敏原的颗粒基本上通过范德瓦尔斯力保持在背衬上。优选地，为了通过范德华力将颗粒保持在载体上，颗粒的平均尺寸小于60微米。在另一个实施方案中，通过背衬上的粘合剂涂层将过敏原保持在背衬上。背衬可以完全用粘合材料覆盖或仅部分覆盖。可以使用不同的闭合背衬，例如涂有铝的聚乙烯或PET薄膜，或具有粘合剂层(丙烯酸，硅树脂等)的PE，PVC或PET泡沫。用于本发明的贴剂装置的实例公开在专利申请US11/915,926或美国专利No.美国专利号7,635,488。
其他实例公开在美国专利申请US 13/230,689中，其还公开了喷雾干燥方法，以将颗粒形式的物质加载到贴剂装置的背衬上。电喷雾装置使用高压将液体分散在细小气溶胶中。然后将溶解在溶剂中的过敏原和免疫抑制剂在贴剂背衬上粉碎，其中溶剂蒸发，留下颗粒形式的过敏原和免疫抑制剂。根据所需的蒸发时间，溶剂可以是例如水或乙醇。技术人员可以选择其他溶剂。这种在贴剂背衬上施加物质的方法允许纳米尺寸和单一尺寸的颗粒在背衬上具有规则且均匀的颗粒重新分配。该技术适用于任何类型的贴剂，例如具有背衬的贴剂，所述贴剂包括绝缘聚合物，掺杂的聚合物或有导电层的聚合物。优选地，背衬包括导电材料。
在另一个实施方案中，背衬的周边用干燥的亲水性聚合物覆盖，能够通过与湿润的皮肤接触形成粘合性水凝胶膜(如US 12/680,893中所述)。在该实施方案中，在施用贴剂之前必须使皮肤保湿。当水凝胶与湿润的皮肤接触时，聚合物颗粒吸收液体并变成粘合剂，从而当贴剂施用于皮肤上时产生密闭的腔室。这种水凝胶的实例包括聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酸酯钠，甲基乙烯基和马来酸酐共聚物醚。
在另一个具体实施方案中，过敏原和免疫抑制剂组合物液体在吸收材料储库中，保持在贴剂的支持物上。该组合物可以由过敏原+免疫抑制剂溶液组成，或者是混合物分散体中，例如在甘油中。吸附材料可以由例如乙酸纤维素制成。
背衬可以是刚性的或柔性的，可以是或不是亲水的，取决于组成材料，可以是半透明的或不是半透明的。在为玻璃的情况下，通过将一片塑料粘合到玻璃上，可以使支撑件具有抗破裂性。在一个实施方案中，贴剂的背衬含有透明区，允许直接观察和控制炎症反应，而不必去除贴剂。合适的透明材料包括聚乙烯薄膜，聚酯(聚对苯二甲酸乙二醇酯)薄膜，聚碳酸酯和各种透明或半透明的生物相容性薄膜或材料。
本发明还公开了通过将所述抗原和所述免疫抑制剂/药物的混合物作为注射剂施用于有需要的对象/患者来治疗自身免疫疾病和变态反应或抑制抗药物抗体产生或诱导抗原特异性免疫耐受的方法和试剂。该注射剂可以作为皮下注射或肌内注射或皮内注射给予。该注射剂包含增稠剂以在注射后具有高粘度，这样可充当抗原和免疫抑制剂的持续释放制剂。可以促进T/B reg扩增的分子(例如IL-2和/或TGF-β和PD-L1)也可以与其他免疫抑制剂组合添加到注射剂中。抗原和免疫抑制剂可以是游离分子形式或纳米/微米颗粒包括脂质体形式。在某些实施方案中，注射剂在室温下的粘度大于10,000cps。在某些实施方案中，注射剂在室温下的粘度大于100,000cps。在某些实施方案中，注射剂在室温下的粘度大于5,000,000cps。在某些实施方案中，注射剂在室温下的粘度为11,000,000cps。增稠剂的实例可以容易地从已知的药学上可接受的赋形剂种找到,如透明质酸，淀粉和卡波姆。在一些实施方案中，增稠剂是可生物降解的。在一个实例中，高粘度注射剂包含5mg/mL的麸质蛋白(例如来自小麦的G5004麸质蛋白，Sigma)和5mg/mL的雷帕霉素或50mg/mL的甲氨蝶呤和适量的透明质酸(例如50mg/mL)以达到目标为5,000,000cps的粘度,还可任选的含有1mg/mL IL-2。注射剂也可以是热相变剂。热相改变制剂是当温度升高至体温(37℃)时其相从低温或室温(25℃)下的液体变为半固体/凝胶的制剂，其可以使用泊洛沙姆作为赋形剂。包含抗原和免疫抑制剂的热相变化注射剂可以通过皮下注射或肌内注射或皮内注射给予，以诱导抗原特异性免疫耐受并治疗相应的自身免疫性疾病或过敏。在低温或室温下粘度低，而在体温下粘度高。这种热相变可注射制剂的制备可由本领域技术人员容易地从相关出版物中采用。
如美国专利申请15/723,173中所述，免疫抑制剂也可以与碳水化合物聚合物缀合以形成前药。新型前药可以是碳水化合物(或其他聚合物)药物缀合物的形式，其中药物通过可裂解键连接到碳水化合物(或其他聚合物)上。可以将多于一种药物缀合到聚合物主链上。合适的碳水化合物包括含唾液酸的聚合物，透明质酸，硫酸软骨素，葡聚糖，羧基葡聚糖，纤维素，羧基纤维素及其衍生物。
适用于本发明的含唾液酸的聚合物包括由与α2,3或α2,6或α2,8或α2,9键连接的唾液酸单体或它们的组合形成的聚唾液酸。它还包括接枝聚合物或含有唾液酸的支化聚合物。它也可以是线性聚合物主链骨架(例如葡聚糖或合成聚合物，例如PVA，PAA)。
此外，免疫抑制药物也可以直接与抗原缀合或通过连接子或载体与抗原缀合，并用于贴剂中。载体可以是聚合物。例如，美国专利申请15/723,173中图8的聚唾液酸-雷帕霉素可用于通过EDC偶联的蛋白质赖氨酸结合(例如麸质蛋白或抗体药物或麦醇溶蛋白或花生抗原蛋白ara h2)并用于贴剂中(例如100ug～15mg)代替抗原和药物的混合物。
图12显示了3种不同形式的抗原-药物缀合物的实例。
当使用脂质体时，可以将药物包封在脂质体中或抗原和免疫抑制药物两者都包封在脂质体中。
皮肤中树突状细胞丰富，在贴片中加入DC调节药物和抗原/过敏原可有效诱导耐受。
除局部施用外，还可以注射或口服混合物或缀合物以诱导免疫耐受并治疗自身免疫疾病/过敏。
局部制剂或植入物可含有抗原+药物或抗原-药物缀合物或包封的抗原/药物(例如在微球或脂质体中)或它们的组合。抗原可以是粗抗原(例如花生提取物，麸质蛋白)或纯化抗原(例如花生抗原蛋白ara h2，麦醇溶蛋白)或抗原-药物缀合物或包封抗原(例如微球或脂质体)或它们的混合物的形式。
在另一种形式中，如图5所示，表位(抗原)-富含唾液酸聚合物的缀合物或表位(抗原)-富含Siglec配体的聚合物的缀合物可用于治疗自身免疫性疾病或过敏或诱导免疫耐受，可以是注射或植入(封装在植入物内)或局部施用。抗原/表位可以是B细胞抗原或T细胞抗原或其组合。例如，抗原的赖氨酸基团可用于通过众所周知的EDC偶联方法与唾液酸的–COOH基团偶联。可以使用药学上可接受量的缀合物，只要它可以产生令人满意的治疗(例如免疫耐受)效果，其可以通过用众所周知的方案筛选和测试来实验确定。
术语“富含唾液酸的聚合物”是指具有与其主链骨架缀合的多个唾液酸或siglec配体的聚合物。骨架可以是支链或线性聚合物或树枝状聚合物，例如合成聚合物PVA，PAA，多胺，或天然聚合物，例如聚唾液酸，碳水化合物。唾液酸或含有唾液酸的片段或siglec配体与聚合物骨架缀合。唾液酸聚合物含有可以与Siglec结合的α2,3或α2,6或α2,8唾液酸苷或唾液酸或其衍生物(例如J Immunol.2006 Sep 1；177(5):2994-3003，美国专利申请US9522183和美国专利US8357671中描述的那些)。具有α2,8连接骨架的寡/聚唾液酸本身也是富含唾液酸的聚合物。富含唾液酸的聚合物还可在其骨架上含有不同的唾液酸苷，唾液酸和/或其衍生物的混合物。在其表面上附着有唾液酸或唾液酸苷的脂质体也可以被认为是富含唾液酸的聚合物(例如在美国专利US9522183中描述的那些)。
有许多适用于本申请的富含唾液酸/siglec配体的聚合物可以容易地在文献中找到，例如描述于J Immunol.2006 Sep 1；177(5):2994-3003,Nat Chem Biol.2014 Jan；10(1):69-75,J Am Chem Soc.2013 Dec 11；135(49):18280-18283,J Immunol.2014 Nov 1；193(9):4312-21,J Allergy Clin Immunol.2017 Jan；139(1):366-369.e2,Angew ChemInt Ed Engl.2015 Dec 21；54(52):15782-8,Proc Natl Acad Sci U S A.2009 Feb 24；106(8):2500-5,J Exp Med.2010 Jan 18；207(1):173-87,J Immunol.2013 Aug 15；191(4):1724-31,Proc Natl Acad Sci U S A.2016 Sep 13；113(37):10304-9,J ClinInvest.2013 Jul；123(7):3074-83,Proc Natl Acad Sci U S A.2016 Mar 22；113(12):3329-34,专利申请US9180182和美国专利US9552183中的。这些富含唾液酸/siglec配体的聚合物可以容易地转用于本发明。在一些实施方案中，每种聚合物与超过10个拷贝的抗原缀合。
使用表位(抗原)-富含唾液酸聚合物的缀合物，抗原将与自身免疫T细胞或B细胞克隆结合，这将引导富含共轭唾液酸的聚合物选择性地灭活这些抗原特异性自身免疫T细胞或B细胞克隆。
图6显示了适用于本发明的含有唾液酸/siglec配体的缀合物的例子。可以在抗原和聚合物之间和/或在siglec配体和聚合物之间添加任选的连接子。
当使用表达抗原和siglec配体的脂质体时(例如本发明中描述的那些和J ClinInvest.2013 Jul；123(7):3074-83,J Immunol.2013 Aug 15；191(4):1724-31和美国专利US9552183中描述的那些)，脂质体可以进一步包封免疫抑制药物如雷帕霉素。例如，每个脂质体颗粒可含有药物有效量的雷帕霉素(例如雷帕霉素为1％～50％脂质体重量)。这将进一步提高诱导免疫耐受和治疗自身免疫疾病/过敏的功效。
适用于当前应用的另一种形式是使用微球。术语微球包括从纳米尺寸到微米(例如直径50nm～50um)的颗粒。优选地，微球是生物可降解的(例如由可生物降解的聚合物如聚丙交酯乙交酯共聚物(PLGA)制成)，微球可以进一步包封免疫抑制药物，例如雷帕霉素(其含量例如微球的1％～80％重量)。
图7显示了用于诱导免疫耐受和治疗自身免疫疾病/过敏的基于微球的药剂的结构的示意性例子。例如，微球可以是可生物降解的合成聚合物，例如PLGA。免疫抑制药物如雷帕霉素(例如以微球的1％～80％重量)被包封。微球的尺寸为3μm或300nm。富含唾液酸的聚合物或其他siglec配体直接或通过连接子与微球表面缀合，抗原也直接或通过连接子与微球表面缀合。或者，富含唾液酸的聚合物直接或通过连接子与微球表面缀合，并且抗原与富含唾液酸的聚合物缀合。抗原也可以包封在微球体中。或者，药物(免疫抑制剂)可以与微球体的表面缀合或与富含唾液酸的聚合物缀合而不是被包封。适用于本申请的微球的实例可以容易地从诸如美国专利申请US 13/880,778，US 14/934,135，US 13/084,662,加拿大专利CA 2910579和美国专利US 8652487以及由Selecta Biosciences提交的其他专利申请中的那些出版物中的公开内容得到转用。它可用于治疗自身免疫疾病或过敏或诱导免疫耐受，其可以注射或植入(封装在植入物内)或局部施用于患者。可以使用这些类型的缀合物的药学上可接受的量，只要它可以产生令人满意的治疗(例如免疫耐受)效果，这可以通过用众所周知的方案筛选和测试来实验确定。
适用于本申请的另一种形式是使用与抗原，siglec配体和/或其他免疫抑制剂缀合的聚合物载体，如图8所示。或者，siglec配体和其他免疫抑制剂都可以与抗原缀合。图8显示了适用于本发明的不同形式。与多抗原(例如1-100)，多个siglec配体(例如5～500个拷贝)和多拷贝的其他免疫抑制剂缀合的聚合物基本上是先前描述的与抗原和siglec配体缀合的聚合物，并其进一步与多个免疫抑制剂分子缀合(例如5～500个分子)。或者，与多个免疫抑制剂分子和多个siglec配体缀合的聚合物可以与一个抗原分子缀合。或者，多个免疫抑制剂分子和多个siglec配体可以直接或通过连接子与一个抗原分子缀合但不含聚合物载体。或者，可以将一个或多个与多个免疫抑制剂分子缀合的聚合物和一个或多个与siglec配体缀合的多个聚合物缀合到一个抗原分子上。或者，可以将一个或多个与多个免疫抑制剂分子缀合的聚合物和一个或多个与siglec配体缀合的聚合物缀合在一起，然后与一种抗原分子缀合。也可以缀合可以促进T/B reg扩增的其他分子(例如IL-2和/或TGF-β和/或PD-L1)。
它们可用于治疗自身免疫疾病或过敏或诱导由用于构建这些缀合物的抗原引起的免疫耐受，其可以注射或植入(被包封在植入物内)或局部施用于需要的受试者。可以使用在药学上可接受的制剂中的药学上可接受的量的缀合物，只要它可以产生令人满意的治疗(例如免疫耐受)效果，其可以通过用众所周知的方案筛选和测试来实验确定。该方法可用于治疗抗原特异性自身免疫疾病或过敏。
用于系统性红斑狼疮(SLE)的富含唾液酸的聚合物-抗原缀合物的示例显示在图9中。用于SLE治疗的唾液酸聚合物-抗原缀合物具有DNA-连接子-唾液酸聚合物的结构。在一个实例中，患有SLE的患者将每周静脉内接受200mg～1g所述缀合物，注射治疗SLE。
使用抗原和免疫抑制剂组合的透皮递送系统可以用于过敏，自身免疫疾病和抗药物抗体治疗。当用免疫增强剂(例如疫苗佐剂如TLR激动剂)代替上述实施例和方法中的免疫抑制剂并且抗原是病原体抗原时，透皮递送系统就成为病原体抗原的疫苗或疫苗加强剂。例如，透皮递送系统是皮肤贴剂，其含有免疫增强剂以及病原体抗原，任选的透皮递送促进剂(例如，azone，脂肪酸，透明质酸)，配伍在
Figure BDA0002400586910000231
贴片或类似的皮肤贴片样结构中。它也可以是乳液，凝胶，液体，喷雾剂，薄膜或适于局部施用于皮肤或膜的其他剂型。疫苗佐剂型分子如TLR激动剂可用于本发明，例如MPLA，CpG ODN，咪喹莫特，聚IC，瑞喹莫德，加地喹莫德，R848和3M-052。抗原的实例可以是合成的或纯化的，或者是由病原体制成的混合物。例如，它可以是HIV gp-120，它可以是流感神经氨酸酶，它可以是流感病毒裂解物，它可以是HBV表面抗原，它可以是肿瘤细胞裂解物。使用这些抗原将产生针对病原体的免疫应答而作为疫苗或疫苗加强剂。
在一些实施方案中，局部制剂在每个贴剂中含有0.1～100mg抗原，0.1～50mg TLR激动剂或0.1～100mg抗原，0.1～50mg TLR激动剂于每mL凝胶/洗剂/液体。也可以向其中加入透皮增强剂，例如DMSO，azone(例如1％～10％)，表面活性剂，脂肪酸(例如1％～10％油酸)。在一个实例中，制剂含有10mg/mL流感病毒裂解物，5mg/mL咪喹莫特，20mg/mL SDS于1XPBS和5％蔗糖中，然后冻干。冻干粉末可用于制备皮肤贴剂并以10～500mg粉末/贴剂附着于皮肤。在另一个实例中，将10～100mg HBV表面抗原，5-50mg咪喹莫特混合在一起并加入到类似Viaskin的皮肤贴片结构中。它可以每周两次施用于皮肤，持续2周，每次作为疫苗接种2天，然后在1个月和3个月后作为加强剂施用2天以产生针对HBV的免疫力。在另一个实例中，将100mg病原体抗原，20mg聚IC，20mg咪喹莫特和100mg DMSO混合在一起并加入皮肤贴剂中。它可以每周两次施用于皮肤，持续2周，每次作为疫苗接种2天，然后在1个月和3个月后作为加强剂施用2天以产生针对所述病原体的免疫力。病原体抗原可以是可以与MHC结合形成MHC-肽复合物的抗原肽。使用抗原肽代替MHC-肽复合物可以促进透皮给药。
另一种形式是将多个抗原/表位与接头连接以形成线性聚合物，并且将药物(例如唾液酸或本发明中所列的其他免疫抑制剂，包括PD-L1)缀合至接头区或抗原/表位区或两者都缀合,如图10所示。接头可以是合成聚合物，例如PEG(例如MW
Figure BDA0002400586910000232
)，也可以是由亲水氨基酸组成的柔性肽接头(又称为连接子)，例如-GGEGGGEGEEEGGGEGGEGGEEGGGEEDGG-(SEQ ID NO：3)。合适的接头的例子可以在本发明人的美国专利申请15/373,483和15/169,640和62/517,994中找到。来自Amunix Inc.的XTEN多肽也可用作肽接头。当使用肽接头时，如果抗原/表位也是肽或蛋白质并可以在其N和C末端与接头连接的，则可以通过重组技术表达其为线性聚合物。药物可以直接或通过第二连接体偶联至线性聚合物。缀合的药物可以是单分子形式或多分子形式，例如在载体中或以纳米/微粒形式或脂质体形式被封装。在一些实施方案中，一个或多个PD-L1与多个抗原和接头融合或缀合以形成融合蛋白，其可以通过表达来构建。也可以使用可以与抑制性检查点受体结合的抑制性配体(例如A2AR，BTLA，CTLA-4，KIR，LAG3，TIM-3，VISTA，CD47等)代替PD-L1。在一些实施方案中，每个聚合物主链中的抗原/表位的数目大于6，优选大于8。在一些实施方案中，缀合至每个聚合物主链的抗原/表位的数目大于10。在一些实施方案中，与每个聚合物主链结合的药物数目大于4。在一些实施方案中，与每个聚合物主链结合的药物数目大于8。抗原可以是MHC-肽复合物形式的B细胞抗原或T细胞抗原，或可以与MHC结合的抗原肽(或其衍生物),或其组合。
或者，可以将各自包含一种或多种抗原/表位的一种或多种含抗原/表位的聚合物缀合或涂覆到纳米/微粒上，所述纳米/微粒封装了免疫抑制剂和任选的抗原/表位。示例方案可参见图11。
在一些实施方案中，药物不是必需的。一种形式是将多个抗原/表位与接头连接以形成线性聚合物。接头可以是合成聚合物，例如PEG(例如其分子量为
Figure BDA0002400586910000241
)，或者是由亲水性氨基酸组成的柔性肽接头(接头又称为连接子)，例如-GGEGGGEGEEEGGGEGGEGGEEGGGEEDGG-(SEQ ID NO：3)。合适的接头的例子可以在本发明人的美国专利申请15/373,483和15/169,640和62/517,994中找到。来自Amunix Inc.的XTEN多肽也可用作肽接头。当使用肽接头时，如果抗原/表位也是肽或蛋白质并可以在其N和C末端与接头连接，则可以通过重组技术表达线性聚合物。示例性方案可见于图12。
图13中显示了另一种形式，其本质上是缀合至聚合物主链(聚合物载体)的多个抗原/表位。聚合物主链骨架可以是多肽，例如来自Amunix的Xten，合成聚合物，例如聚丙烯酸，碳水化合物包括含有唾液酸的聚合物，透明质酸，硫酸软骨素，葡聚糖，羧基葡聚糖，纤维素，羧基纤维素及其衍生物。先前描述的前药或先前的药物/抗原结合物中使用的聚合物主链可以很容易地被采用。例如，碳水化合物或其他聚合物载体其平均分子量在
Figure BDA0002400586910000251
道尔顿之间。在一些实施方案中，缀合至每个聚合物主链的抗原/表位的数目大于8，优选大于10。抗原/表位可直接或经由接头缀合至聚合物。接头可以是共价的或非共价的。例如，接头可以是与聚合物结合的抗生物素蛋白与抗原/表位缀合的生物素结合。在一些实施方案中，聚合物载体可溶于水溶液。
类似地，可以将各自包含一个或多个抗原/表位的一种或多种含抗原/表位的聚合物缀合或涂覆到纳米/微粒上，所述纳米/微粒可任选地封装抗原/表位。示例方案可参见图14。
抗原可以是B细胞抗原/表位或T细胞抗原/表位(例如MHC-抗原肽复合物或缀合物；或可以与MHC结合的肽抗原)或其组合。它们的示例可以在当前申请以及相关的出版物和专利申请中找到。
Parvus的NAVACIMR技术使用肽-MHC包被的纳米颗粒(pMHC-NP)来清除高亲和力的细胞毒性效应T细胞，扩大自调节性记忆T细胞的数量，以靶向和杀死抗原呈递细胞(APC)，扩增和/或发生Tr1细胞和/或B调节细胞种群，以治疗相应的自身免疫性疾病。它具体详情在出版物和专利申请中公开，例如doi：10.1016/j.immuni.2010.03.015；doi：10.1038/nature16962，doi：10.1038/nnano.2017.56。doi：10.1007/s00109-011-0757-z。美国专利申请US 12/044,435，US20090155292A1，US20150125536A1，US20170333540A1，US20170095544A1和美国专利US8354110B2。已经表明，单特异性pMHC-NP可以扩展同源的自身调节性T细胞或B细胞，抑制非同源性特异性的募集，预防或治疗自身免疫性疾病。
这些pMHC-NP中使用的抗原/表位(肽-MHC复合物，例如NRP-V7-Kd或IGRP206-214-Kd或两者)也可以用作本发明的抗原/表位，以治疗相应的自身免疫性疾病，例如1型糖尿病(T1D)。其他与T1D相关的pMHC也可以用作本发明的抗原/表位，以治疗1型糖尿病(T1D)。肽-MHC复合物可以是与主要组织相容性复合物II类(pMHCII)分子结合的自身免疫性疾病相关肽，也可以是与主要组织相容性复合物I类(pMHCI)分子结合的自身免疫性疾病相关肽。这些肽-MHC复合物的例子可以在上面列出的现有技术中找到，并且可以容易地用于本发明中以诱导相应的免疫耐受性和预防/治疗在上面引用的现有技术中列出的相应的自身免疫疾病。
上述引用的现有技术使用直径小于100nm的肽-MHC包被的纳米颗粒。对于相同的应用，较大的颗粒，包括微粒在内的更大的颗粒也可以用于涂覆肽-MHC,例如直径为
Figure BDA0002400586910000261
的颗粒，只要其表面与高密度的肽-MHC复合物结合，即可生成pMHC-MP(肽-MHC包覆的微颗粒MicroParticle)。在一些优选的实施方案中，其直径为
Figure BDA0002400586910000262
密度具有＞0.5个肽-MHC分子/100nm2表面积。合适的颗粒可以由可生物降解的材料例如PLGA制成。适用于医学应用的可生物降解的微粒的实例及其表面缀合方案是本领域技术人员众所周知的，并且可以在出版物中容易地找到。
在本发明的一些实施方案中，效应分子例如免疫抑制剂药物(例如雷帕霉素或PD-L1)可以进一步缀合或封装到pMHC涂覆的纳米/微米颗粒，例如上述现有技术中所引用的肽-MHC涂覆的纳米颗粒(pMHC-NP)(例如在Parvus的NAVACIMR技术中使用的那些)和在本发明中公开的那些,来增加其功效。例如，pMHC-NP或pMHC-MP(肽-MHC包被的微米颗粒)的表面可以被PD-L1(或其PD-1结合域或其他PD-1激动剂)包被。结合PD-L1可有效抑制细胞毒性T/B细胞并促进Treg/Breg的扩增。如图15所示，将额外的T/B调节细胞刺激分子/细胞因子(例如PD-L1，IL-2，TGF-β等)涂覆到pMHC-NP或pMHC-MP上可增加这些T/B调节细胞的扩增并直接使细胞毒性T/B细胞失活。在另一个实例中，将PD-L2或用于抑制性免疫检查点受体的其他配体涂覆到pMHC-NP或pMHC-MP的表面。在另一个实例中，将免疫抑制剂药物例如雷帕霉素缀合至pMHC-NP/pMHC-MP或封装在pMHC-NP/pMHC-MP内。在一实施例中，抗生物素蛋白包被的NP或MP是根据Diabetes 2004Jun 53(6)：1459-1466。doi.org/10.2337/diabetes.53.6.1459中的方案制备的。接下来，将生物素化的NRP-V7/H-2Kd和生物素化的PD-L1的混合溶液以超过包被的抗生物素蛋白的结合能力的量(例如，过量
Figure BDA0002400586910000263
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倍)加入抗生物素蛋白包被的NP/MP(纳米颗粒/微米颗粒)中，并在4℃下孵育过夜。接下来，将所得的pMHC-NP/pMHC-MP用PBS洗涤3次以除去未结合的蛋白质。也可以使用涂有更多抗生物素蛋白的更大尺寸的NP(例如
Figure BDA0002400586910000265
)。V7/H-2Kd与生物素化的PD-L1的示例性比率可以在10：1至1：3之间。可以促进T/B reg扩增的其他分子(例如促进T/B reg生长的细胞因子，如IL-2和TGF-β)也可以与NP或MP共同包被,例如通过使用生物素化的含有上述IL-2/TGF-β的蛋白质混合物。也可以使用其他MHC肽复合物(例如IGRP206-214-Kd)来治疗T1D。其他与疾病相关的MHC-肽复合物也可用于治疗相应的疾病，例如，pMOG 38-49/IAb(在doi：10.1038/nature16962中公开)包被的NP或MP也可以被包裹或包被免疫抑制剂来治疗实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)。
在本发明的一些实施方案中，通过将重组单链MHC复合物包被在微米或纳米颗粒NP/MP的表面上来制备肽-MHC包被的微米或纳米颗粒(pMHC-NP/pMHC-MP)以治疗相应的自身免疫性疾病,而不是使用前述肽-MHC复合物来包被的。美国专利US 08/596,387公开了单链MHC复合物及其用途。美国专利US 5869270公开了单链MHC II类肽融合复合物,其呈递肽与该复合物的肽结合槽共价连接。发表于Eur J Immunol.2000 Dec；30(12):3522-32的论文公开了由大肠杆菌制备的重组人单链MHC-肽复合物。本领域技术人员可以容易地采用现有技术中的肽重组单链MHC复合物/缀合物，以制备用于本发明的肽重组单链MHC复合物/缀合物包被的NP。术语MHC复合物包括非共价MHC-肽复合物和共价MHC-肽缀合物，例如上述那些。此外，MHC-肽复合物的模拟物或衍生物也可以用于本发明中以代替MHC-肽复合物，只要它可以与相应的抗原特异性TCR受体结合即可。MHC-肽复合物模拟物可以通过噬菌体展示库或其他筛选方法或计算模型容易的开发。
另一种形式是使用基于聚合物的肽-MHC寡聚物/多聚体代替肽-MHC包被的微米/纳米颗粒，以诱导对MHC-肽复合物的抗原的免疫耐受并治疗相应的自身免疫疾病。优选地，每个聚合物中的MHC-肽复合物多于6个拷贝。在一些实施方案中，每个聚合物中的MHC-肽复合物多于8个拷贝。在一些实施方案中，每个聚合物中的MHC-肽复合物多于20个拷贝。聚合物可以是可溶性聚合物，例如前述聚合物载体。可溶性聚合物可以是线性聚合物。MHC多聚体的实例可以是MHC五聚体，MHCdextramer(例如，来源于www.immudex.com的那些)和在美国专利申请US 20100168390 A1 MHC multimers,methods for their generation,labeling and use中描述的那些。给药方案可以与上述的pMHC-NP相同。例如，Immudexdextramer产品目录号WB3329(肽：VLFGLGFAI；抗原：IGRP allele:HLA-A*0201)可用于治疗糖尿病。在另一个实例中，Immudex未标记的SA-Dextramer产品目录号DX01可与生物素化的NRP-V7/H-2Kd,或生物素化的NRP-V7/H-2Kd和生物素化的PD-L1的混合物混合(例如，用量为DX01链亲和素的结合能力的1.2到2倍)，并进行孵育在4℃过夜。接下来，将所得的肽-MHC聚合物在PBS中透析以除去未结合的肽-MHC。也可以加入其他能促进T/B reg扩展的分子(例如IL-2和/或TGF-β)与SA-Dextramer结合，例如。通过使用上述含有生物素化的IL-2/TGF-β的蛋白质混合物。也可以使用其他MHC肽复合物(例如IGRP206-214-Kd)来治疗T1D。肽-重组单链MHC复合物/缀合物和MHC-肽复合物模拟物也可以用作T细胞抗原来构建用于相同应用的这种聚合物。
上述基于MHC-肽包被的纳米颗粒和基于dextramer的MHC-肽复合物使用链霉亲和素/亲和素作用来缀合MHC-肽复合物。也可以使用不依靠链霉亲和素/抗生物素蛋白-生物素作用的直接结合，使用化学结合或其他亲和结合(例如Fc-蛋白A相互作用)将MHC-肽复合物引入NP/MP或线性聚合物。位点特异性缀合是本领域技术人员众所周知的，并且可以容易地从相关出版物中采用。例如，微米/纳米颗粒(MP/NP)的表面或聚合物可以进行修饰/衍生化以具有马来酰亚胺基团，从而允许肽-MHC的-SH(半胱氨酸)使用众所周知的马来酰亚胺硫醇反应与它们缀合。用于这类修饰的衍生化和缀合的方案对于本领域技术人员是众所周知的，并且可以在相关试剂的出版物和手册中容易地找到。图16显示了多个pMHC在聚合物中缀合或表达，而不是涂覆在颗粒上。
本文描述的化合物(例如，本发明中公开的缀合物，聚合物和纳米/微粒)可以作为与药学上可接受的载体一起配制的药物或药品施用。因此，该化合物可用于制备药物或药物组合物。本发明的药物组合物可以配制成用于肠胃外给药的溶液或冻干粉末。粉末可以在使用前通过加入合适的稀释剂或其它药学上可接受的载体来重构。液体制剂可以是缓冲的，等渗的水溶液。粉末也可以以干燥形式喷雾。合适的稀释剂的实例是正常的等渗盐水溶液，标准的5％葡萄糖水溶液，或缓冲的乙酸钠或乙酸铵溶液。此类制剂特别适用于肠胃外给药，但也可用于口服给药或包含在计量剂量吸入器或雾化器中用于吹入。化合物可配制以包括其他医学上有用的药物或生物制剂。所述化合物还可以与对本发明化合物所针对的疾病或病症有用的其他药物或生物制剂联合给药。该化合物可以配制在药学上可接受的载体中。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料，组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂，稀释剂，赋形剂，溶剂或包囊材料，其参与或运输任何补充剂或组合物或组分,从一个器官或身体的一部分到另一器官或身体的一部分，或将药剂递送到所需组织或与所需组织相邻的组织。可以使用本领域普通技术人员已知的药学上可接受的载体，包括水或盐水。如本领域中已知的，各成分及其相对量由预期用途和递送方法确定。根据本公开内容提供的组合物被配制成用于递送至需要其的患者的溶液，并且在一些实施方案中，用于注射递送。
可以选择在组合物中使用稀释剂或载体，以使它们不降低组合物的所需效果。合适的组合物的实例包括水溶液，例如盐溶液，5％葡萄糖。可以使用其他熟知的药学上可接受的液体载体，例如醇，二醇，酯和酰胺。在某些实施方案中，组合物还包含一种或多种赋形剂，例如但不限于离子强度改性剂，溶解度增强剂，糖例如甘露醇或山梨糖醇，pH缓冲剂，表面活性剂，稳定聚合物，防腐剂和/或助溶剂。在某些实施方案中，将聚合物基质或聚合物材料用作药学上可接受的载体。本文所述的聚合物材料可包含天然或非天然聚合物，例如糖，肽，蛋白质，层粘连蛋白，胶原蛋白，透明质酸，离子型和非离子型水溶性聚合物等等；丙烯酸聚合物；亲水性聚合物，例如聚环氧乙烷，聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维素聚合物和纤维素聚合物衍生物，例如羟丙基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，甲基纤维素，羧甲基纤维素和醚化纤维素；聚(乳酸)，聚(乙醇酸)，乳酸和乙醇酸的共聚物或其他天然和合成的聚合剂。在某些实施方案中，本文提供的组合物可以配制成膜，凝胶，泡沫或其他剂型。合适的离子强度调节剂包括，例如甘油，丙二醇，甘露醇，葡萄糖，右旋糖，山梨糖醇，氯化钠，氯化钾和其他电解质。用于本文组合物中的合适的pH缓冲剂包括，例如，乙酸盐，硼酸盐，碳酸盐，柠檬酸盐和磷酸盐缓冲剂，以及盐酸，氢氧化钠，氧化镁，磷酸二氢钾，碳酸氢盐，氨水，碳酸，盐酸酸，柠檬酸钠，柠檬酸，乙酸，磷酸氢二钠，硼砂，硼酸，氢氧化钠，二乙基巴比妥酸和蛋白质，以及各种生物缓冲液，例如TAPS，Bicine，Tris，Tricine，HEPES，TES，MOPS，PIPES，cacodylate或MES。在某些实施方案中，添加pH缓冲剂体系(例如磷酸钠，乙酸钠，柠檬酸钠，硼酸钠或硼酸)以将pH维持在约pH4至约pH 8或约pH 5至5的范围内。约pH 8，或约pH 6至约pH 8，或约pH 7至约pH 8。
在一些实施方案中，所述肠胃外组合物/制剂还包括增稠剂以增加其在注射之前或之后的粘度，以使其充当持续释放制剂。在某些实施方案中，注射剂在室温下的粘度大于10,000cps。在某些实施方案中，注射剂在室温下的粘度大于100,000cps。在某些实施方案中，注射剂在室温下的粘度大于5,000,000cps。在某些实施方案中，注射剂在室温下的粘度为11,000,000cps。增稠剂的实例可以容易地从已知的药学上可接受的赋形剂如透明质酸，淀粉和卡波姆中找到。在一些实施方案中，增稠剂是可生物降解的。注射剂也可以是热相变剂。热相变制剂是当温度升高至体温(37℃)时其相从低温或室温(25℃)下的液体变为半固体/凝胶的制剂，其可以使用泊洛沙姆作为辅料。热相变可注射制剂可以皮下注射或肌内注射或皮内注射给药，以诱导抗原特异性免疫耐受并治疗相应的自身免疫疾病或过敏。在低温或室温下粘度低，而在体温下粘度高。这种高粘度制剂和热相变可注射制剂的制备可由本领域技术人员容易地从相关出版物中采用，并在本发明中先前进行了描述。
如本文所用，短语“有效量”是指足以提供足够高的浓度以对其接受者产生有益效果的剂量。任何特定受试者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症，病症的严重程度，特定化合物的活性，给药途径，化合物的清除率，治疗持续时间，与化合物组合或同时使用的药物，受试者的年龄，体重，性别，饮食和一般健康状况，以及医学领域和科学中众所周知的相似因素。在确定“治疗有效量”时考虑的各种一般考虑因素是本领域技术人员已知的并且已有描述。剂量水平通常落在约0.001至10mg/kg/天的范围内；通常适用的水平范围为约0.05至5mg/kg/天。化合物可以肠胃外给药，例如血管内，静脉内，动脉内，肌肉内，皮下等。给药还可以通过气溶胶口服，经鼻，直肠，透皮或吸入给药。化合物可以推注给药，或缓慢输注。最初可以通过从细胞培养测定IC50测定估计治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到血药浓度范围，血药浓度范围包括在细胞培养中测定的IC50。这些信息可用于更准确地确定人体中有用的初始剂量。血浆中的药物水平可以例如通过HPLC测量。确切的配方，给药途径和剂量可以由个体医生根据患者的病情选择。在一些实施方案中，化合物每周两次以1mg/kg-10mg/kg的剂量注射给需要IV或SQ的受试者。在一些实施方案中，该化合物每两周一次以IV或SQ注射1mg/kg-10mg/kg，持续3个月。
在当前的申请中，“/”标记表示“和”或“或”或”和与或”。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本说明书中提及的所有专利和出版物表示本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和出版物在此引入作为参考，其程度如同每个单独的出版物被具体和单独地指出通过引用并入。上述发明涉及许多众所周知的化学，仪器，方法和技能。技术人员可以容易地从诸如化学教科书，科学期刊论文和其他众所周知的参考源之类的教科书中找到相关知识。
SEQUENCE LISTING
<110> 王天欣
<120> 治疗自身免疫性疾病和过敏的方法和试剂
<130> 001
<150> US 15/723,173
<151> 2017-10-03
<150> US 62/529,476
<151> 2017-07-07<130>
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> synthetic artificial DNA antigen
<400> 1
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> synthetic artificial DNA antigen
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cacacacaca cacacacaca 20
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成
<220>
<223> peptide linker
<400> 3
Gly Gly Glu Gly Gly Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Gly Gly Glu Gly
1 5 10 15
Gly Glu Gly Gly Glu Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Gly Gly
20 25 30

Claims (10)

1.一种诱导免疫耐受的聚合物缀合物，其包含引起免疫不耐受的抗原和缀合至线性聚合物的免疫抑制剂。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述抗原是B细胞抗原。
3.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述抗原是呈MHC-肽复合物形式的T细胞抗原。
4.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述免疫抑制剂选自雷帕霉素,福吉霉素和甲氨蝶呤。
5.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述第一免疫抑制剂是PD-L1。
6.一种在受试者中诱导免疫耐受的方法，其包括向所述受试者施用线性聚合物缀合物，所述线性聚合物缀合物包含引起免疫不耐受的抗原和免疫抑制剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗原是B细胞抗原。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗原是呈MHC-肽复合物形式的T细胞抗原。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述免疫抑制剂选自雷帕霉素，福吉霉素和PD-L1。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述免疫不耐受是选自自身免疫性疾病，变态反应和抗药物抗体的病症。
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