CN102277354B

CN102277354B - 小麦脱水素基因的启动子及其应用

Info

Publication number: CN102277354B
Application number: CN2011101777095A
Authority: CN
Inventors: 秦余香; 夏光敏
Original assignee: Shandong University; University of Jinan
Current assignee: Shandong University; University of Jinan
Priority date: 2011-06-29
Filing date: 2011-06-29
Publication date: 2012-10-31
Anticipated expiration: 2031-06-29
Also published as: CN102277354A

Abstract

本发明公开了一种小麦脱水素基因的启动子TaDHNP及其应用，其目的是提供一种在单子叶植物中能被非生物胁迫(盐/冷)诱导表达的启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。该启动子受盐、冷胁迫诱导表达，可用该启动子与一些耐盐、耐冷基因融合，构建诱导表达载体，对植物特别是小麦耐盐、耐冷基因工程育种具有重要的意义。

Description

小麦脱水素基因的启动子及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种小麦脱水素基因的启动子及其应用。

背景技术

近年来，各种非生物胁迫严重影响作物的产量。在各种非生物胁迫中，盐胁迫和冷胁迫常常由于引起细胞的脱水而导致作物产量的降低。特别是随着工业的发展，土壤盐渍化愈来愈严重，已成为一个全球关注的社会问题。因此，通过基因工程培育耐逆农作物新品种已成为当前一个十分迫切的任务。在基因工程育种中，常用的是组成型表达的启动子，例如花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子、Ubiquitin启动子等。但组成型表达的启动子在整个生长发育过程中均能高效地启动目的基因的转录，这种高效表达经常是以大量的营养消耗为代价，从而直接影响了植株的生长发育，表现为植物生长延滞、植株矮小、产量降低等。而诱导型启动子只在某些物理或化学信号的刺激下或者植物发育到特定的阶段，才启动外源基因的转录。它不仅能使目的基因的表达产物在一定时空积累，增加区域表达量，提高植株的抗逆性，同时可避免由组成型启动子启动外源基因超表达引起的对植物发育的负面影响，是基因工程育种中的理想启动子。

脱水素又称胚发育后期丰富蛋白，在盐、旱、冷等引起的细胞脱水过程中大量表达，因此脱水素基因的启动子是抗逆基因工程育种中很好的候选诱导型启动子。目前脱水素基因的启动子已在拟南芥等几种植物中被克隆，但有关小麦脱水素基因启动子的克隆及应用还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种在单子叶植物中能被非生物胁迫（盐、冷）诱导表达的启动子TaDHNP。

本发明的技术方案在于首先根据小麦的表达谱芯片数据选出在小麦幼苗根中显著受盐诱导表达的脱水素基因，然后根据基因序列设计基因特异性引物，利用GenomeWalker方法克隆目的基因的启动子，然后在拟南芥中进行功能验证。

本发明所提供的启动子来自小麦脱水素基因TaDHN的上游序列，命名为TaDHNP。可以是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中序列的SEQ ID No.1DNA序列。

2）在高严谨条件下可与序列表中序列 SEQ ID No.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。上述高严谨条件为可在0.1×SSC（或SSPE）、0.1%SDS 溶液中，65℃杂交并洗膜。

本发明还提供了含上述启动子的植物表达载体pCAM1391Z/TaDHNP。

本发明所述启动子TaDHNP在培育耐盐、耐冷植物中的应用。所述植物所述植物为小麦或拟南芥，优选是普通小麦。

所述的小麦脱水素基因的启动子的植物表达载体在培育耐盐、耐冷植物中的应用，所述植物为小麦或拟南芥。

将任何植物逆境相关基因连接到本发明所述诱导型启动子的下游均可被诱导转录。而且任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用。

本发明的有益效果：通过转基因实验表明，本发明所克隆的启动子能被盐和冷诱导表达。该启动子可以启动任何植物逆境相关基因的表达，可广泛用于培育耐盐、耐冷农作物新品种。

TaDHNP启动子序列分析；

其中，带有下划线的序列为顺式作用元件序列；顺式作用元件名称分别为：CGGGGG- GC-motif， CAGTTG- MBS， TTATTACGAA- WUN-motif， TGACG- CGTCA-motif， TACGTG- ABRE， ACGTGGC- ABRE， CACGTA- ABRE；

CACGGCCCGGGCTGGTAAAAACGAAGAGAGTATTGTGCATGGCGTTTCATACTTGCTTTTCATGGAAGTTCATACCAGGCTGTTGTCTCTCTCATTCATCTTGAATCTTGACAAATGCCATCCCGACAAGTTACAAGTCAGCTCAAATCTCGTCCGGAAACTTCAGCATAATGACAGTCCTGTTCTAGGCTCCTAGCTCAGATCACCGACCTCCTTTCCTCGATTACTTGTTCTCCTAACCAAAACTGAATGAAGTAACATGAGTCTTGCTTGTGGCTGGCCTACAACCGCACGCCCGCGACGGAGCTCCCATCGTGGTGACACCGCGCTGCGCACAAGCGACTAGCGCTGCCACAATCGAGGACGCCGCCGTGAAGACGAGCTCCGGACTATCACCAGCCGCCTGAGATCTCCCCATCAAAAGAGCAGCCGGCGAGGAGCACGAGCCCCGCCGCCGCCGGCTCCACGCATGCTTTGCATGTCAGAGGCCACCGGCGATGGCGAGGGGGTGGATGGGATGGGTGAGGCGAGGAGAGGCTGGTGTTTTTCGCCACCCGTGTCGCCCTGGGGAGGGCGCGACGCGGGGGCAGATGGGATCCACTAGTTCGATCAGTTGAAGCCCTACGTATATTTTTTCCGATATGAAATATAAAATATTGGGAAGATATTTATTACTCAAATGCATAGAACAACATTATTACGAAAGGAAGAAGAAAAAAAGGTGAACAACACCCCCAGCAAACGACAACAACAATGACGACAAGCATCAATGATAGCACCCATAGGTAACAGTATACGTGCTTTAACAATGATGCTTTTAGGGAGGTATAGGTGCTTCAACAATGATGCTTTCAGGAAGAGAACAACACATGAGCGCTGTCGTCGTTGTAACCAACCACTAAGGTTAGATCGTGAATTTTCACCTCGAAGAGGAGTTTGAGTAAACTTCATGCAATGTCTTCAACTAGAGAATGTCATATGAACAACAACATTCCCATGTTCAACCAATGAAGGTGGATCATAAGTTTTCACCCTGAGACTCAGCCCTTGCACTCAACTTCTGTCACCTAACCTACTTCGCCTTGTGTTGCTAGCATACCATCACCTGCCGACCCATTTTCCCATTTTTAATGAGCAGGGTTATGATTTTCAGTCGATGCATATTTTCATGGACGTGCGATGGACATCCTCGCGGGCATAAAAATGAATTTGATATTGCTCGATCATAATAACCCGAACGCGCCTACTTTTAATGATAGGATACCTTTGGTCCATATAGTTCCATTTTTGTTCCATGCCGACGCTTCGAGCTGTCAGTTTCCGAAGCAAACAAGACGACTTTTGGAAGTGTCCCTTGTGTGTCATCACCTCTTCGAGAACAAGCTCAGACGTGGCAACCCGAAGGCGCCCAGTAGCTGCACACGTCCGACCTCTCTTTATGGGCTAGTCATCAGTCACCGGCAACCCGCTCCCGCGAGCACACGTAGCGCCTCCGACGATCCTATCCCGTCGGCTATAAATTGTGCCTCGTGCTGGACCTGCCTACACAACACAGCCACGAGTAGCAGCCAAGTCGGGAAGACAACCAAGATCAACACCTGTGCAAGTCTGCAAGATG。

附图说明

图1 盐胁迫条件下脱水素基因TaDHN在小麦山融3号幼苗根和叶中的RT-PCR分析；

其中，Actin为内参；leaf：叶；root：根；

图2 从小麦山融3号基因组DNA中扩增TaDHNP启动子的电泳图；

其中，M：DNA分子量marker（下同）；

图3pCAM1391Z/TaDHNP启动子表达载体的酶切验证；

图4 转化pCAM1391Z/TaDHNP载体的转基因拟南芥的PCR鉴定；

其中，T1为转基因拟南芥株系；

图5 转化pCAM1391Z/TaDHNP载体的转基因拟南芥GUS染色结果；

其中，A：转化pCAM1391Z/TaDHNP的转基因拟南芥株系在对照条件下的GUS染色结果；B、C、D：转化pCAM1391Z/TaDHNP的转基因拟南芥株系经100mM NaCl处理48小时后的GUS染色结果，C、D为B图放大效果；F：转化pCAM1391Z/TaDHNP的转基因拟南芥经4℃处理48小时后的GUS染色结果。

具体实施方式

实施例1、小麦脱水素基因TaDHN的表达分析

1.1材料处理

小麦品种山融3号的种子正常萌发，一周后去掉胚乳，在Hangload培养液中培养至两周，转入含有200mM NaCl的Hangload培养液中进行胁迫处理。处理后的0、0.5、3、12、24，48小时取幼嫩的叶片和根系，液氮中保存。

1.2 Trizol法提取小麦Total RNA

1.将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

2.待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟；

3.加入0.2ml氯仿，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；

4.4℃，12000rpm离心15分钟；

5.用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，-20℃,沉淀30min；

6.4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

7.RNA沉淀用1ml的75%乙醇洗涤。4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

8.重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀；

9.去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟至RNA略显透明，加入适当体积（30-50μl）的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；

10.紫外分光光度计及1%Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD=40ug/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。

b)用1%Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1ul RNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上样缓冲液6 5℃变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3μl的1kb DNAMarker作为对照。

1.3第一链cDNA的合成

采用PrimeScript^TM RT-PCR Kit 进行。反应步骤如下:

1.在Microtube 管中配制下列混合液。

dNTP Mixture (10 mM) 1μl

Oligo dT Primer (2.5μM) 1μl

Total RNA 4μl

Rnase free H₂O 4μl

2.在PCR仪上进行变性、退火反应。

65℃ 5 min

4℃ 1 min

3.离心数秒钟使RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。

4.在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

上述变性、退火后反应液 10 μl

5×PrimerScript^TM Buffer 4 μl

RNase Inhibitor (40U/μl) 0.5 μl

PrimScript^TMRTase 0.5 μl

Rnase Free dH₂O 5 μl

5.在PCR仪上按下列条件进行反转录反应

42℃ 15-30 min

95℃ 5 min

4℃

1.4 PCR 反应及电泳

1. 以cDNA 为模板，进行PCR 反应。引物如下

TaAct-S： 5’- GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC -3’

TaAct-A: 5’- GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC -3’

TaDHN-S: 5′-CAGCCAAGTCGGGAAGACAAC-3′

TaDHN-A:5′-TGGCCACCAGGGAGCTTCTC-3′

2. PCR 体系：

ddH₂O 4.7μl

10× buffer 2μl

Primer1（2μM） 1μl

Primer2（2μM） 1μl

dNTP（10mM each） 0.2μl

rTaq polymerase（5U/μl） 0.1μl

逆转录cDNA 模板 1μl

Total Volume 10μl

3. PCR 程序：

94℃ 5min, 25～30 cycles 94℃ 20s, 57℃ 60s, 72℃ 45s；72℃ 5min.

根据内参Actin 的扩增情况确定PCR 的循环数，调整cDNA 模板的加入量。

4. 1％琼脂糖凝胶电泳。结果见图1。

实施例2、小麦脱水素基因启动子TaDHNP的克隆

2.1小麦基因组DNA的提取

1.采用CTAB法提取小麦基因组DNA。步骤为：

(1)取小麦根系约0.5g在液氮中磨碎，置于1.5ml离心管中，加入700μl提取缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA-Na₂，100mmol/L NaCl，1.5%CTAB，2%巯基乙醇），65^oC水浴中温育30-60min，其间颠倒混匀3-4次；

(2)取出离心管，向每管中加入700μl苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）溶液，混匀10min；

(3)10000rpm离心10min；

(4)用枪头（剪去前端1/3）缓缓抽取上清液至另一1.5ml离心管中；

(5)加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）重复上述抽提过程。缓缓取出上清液；

(6)加入0.6倍体积的异丙醇沉淀，轻轻混匀，静置一段时间；

(7)用200μl枪头挑出DNA沉淀；

(8)70%的乙醇冲洗2~3次，DNA在室温干燥10分钟；

(9)加入500μl去离子水，在4^oC溶解。

2.小麦基因组DNA的纯化

(1)在溶解的DNA中加入1-5μlRNA酶（10mg/ml），37^oC保温1h；

(2)加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）溶液，混匀；

(3)4^oC 10000rpm离心10min；

(4)取上清液到另一离心管中；

(5)加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）重复上述抽提过程；

(6)取上清液移到一新的1.5ml离心管；

(7)加入1/10体积的3mol/L NaAc，混匀后加入2倍体积的冷无水乙醇，轻轻混匀；

(8)室温静置10分钟，用牙签挑出DNA沉淀；

(9)用70%的乙醇冲洗2~3次，室温放置至无酒精味；

(10)DNA加入100μl去离子水溶解，用紫外分光光度计测定DNA浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，样品在-20^oC保存。最后根据DNA浓度，将一部分稀释，4^oC保存待用。

2.2小麦脱水素基因启动子（TaDHNP）的克隆

采用GenomeWalker的方法（Clontech,CA,USA）克隆小麦脱水素基因启动子TaDHNP，具体过程按说明书进行。基因特异性的引物序列为：

Dsp1: 5'-TTGGTCGCCTGGCCGTGCTGCTGCTGT-3'

Dsp2: 5'-GCACAGGTGTTGATCTTGGTTGTCTTC-3'

2.3 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及回收

PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测发现扩增出一条约2kb的条带（图2），对扩增条带采用Tiangen公司的琼脂糖胶回收试剂盒，步骤按说明书进行。

2.4 PCR产物与pGEM-T (Promega)载体连接

在PCR管中依次加入下列组分：

回收的PCR产物 7μl

10×T4连接酶缓冲液 1μl

pGEM-T载体(50ng/μl) 1μl

T4DNA连接酶（3U/μl）(Takara) 1μl

dH2O至10μl

于16℃水浴连接过夜。

2.5 回收片段的克隆与测序

1. 大肠杆菌感受态细胞的制备

(1)从-80℃冰箱中拿出保存于甘油中的E.coli DH5a菌株（购自天为时代生物公司），放在冰上缓慢解冻。

(2)在超净工作台上用接种环划线（LB固体培养基，不含Amp）。

(3) 将平板于37℃恒温培养箱倒置培养过夜。

(4) 挑取平板上的单菌落接种于含5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养14－16小时。

(5)取0.5ml菌液接种于含50ml LB液体培养基的250ml的三角瓶中，37℃振荡（260rpm）培养2－3小时（OD260=0.5）。

(6)将培养的菌液置冰上1小时。

(7) 4℃离心4分钟（4000rpm），去上清。

(8) 用25ml冰预冷的溶液A将菌体轻轻悬浮起来，再在冰上放置40－45分钟。

(9)重复步骤（8）。

(10)用2.5ml冰预冷的溶液B将菌体轻轻悬浮起来，然后将菌液分装到1.5ml离心管中（每管100μl），放入-80℃冰箱备用。

2.连接产物的转化

(1)从-80℃冰箱中取出1管（100μl）感受态细胞，置冰上缓缓解冻30分钟。

(2)超净工作台上向管中加入5μl连接反应物，轻轻摇匀，置冰上30分钟。

(3)42℃水浴热激90秒，迅速置冰上3－5分钟。

(4)在超净工作台上向离心管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时（260rpm）。

(5)室温下5000rpm离心6分钟，弃掉900μl上清液，将剩余100μl上清液重新悬浮菌体，加入40μl的X-gal和4μl的IPTG，混匀，然后用涂布器将其均匀涂到准备的平板上，放置30分钟。

(6)倒置平板于37℃恒温培养箱中过夜，待出现明显单菌落时拿出。

(7)放入4℃冰箱数小时，使蓝白斑颜色分明。

(8)用灭菌的牙签挑取白斑于装有10ml LB液体培养基（含60μg/mlAmp）的试管中，37℃摇菌过夜。

3.重组质粒的PCR鉴定及测序

本实验所用的pGEM-T载体的克隆位点的上游有T7启动子，下游有SP6启动子，所以可以用这两个启动子序列做引物对插入片段进行扩增，对重组质粒进行鉴定，鉴定程序如下：

(1)超净工作台上用移液器取所摇的菌液50μl于1.5ml离心管，再向离心管中加入50μl超纯水。

(2)100℃煮沸变性10分钟后，置于冰上。

(3)PCR扩增总体积20μl：包括质粒模板10μl，10×buffer 2μl（含Mgcl2），dNTP 10mmol/L，T7和SP6引物各20ng/μl，1U Taq酶。反应条件为：94℃，5分钟；30个循环：94℃，1min；56℃，1min；72℃，2min；72℃延伸5min。

PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，取阳性克隆的菌液送公司进行测序。测序结果表明PCR扩增获得的片段具有序列表中序列1的核苷酸序列。对序列进行序列比对，结果表明该序列的3′端含有扩增启动子时所用的基因特异性引物，且3′端与本实验室克隆的小麦脱水素基因TaDHN的5′端序列完全相同，证实上述所克隆的序列片段为TaDHN基因的启动子序列。利用plantCARE数据库对所得启动子序列进行顺式作用元件预测，发现启动子区含有ABRE、MBS等响应逆境的顺式作用元件（图3）。这与所克隆的TaDHNP启动子受盐、冷等胁迫诱导表达是一致的。

实施例3、小麦脱水素基因启动子表达载体（pCAM1391Z/TaDHNP）的构建

根据启动子TaDHNP序列设计分别含有HindIII和EcoRI的启动子上下游引物，引物名称及序列为Dhy2p1：5′-CCCAAGCTTCCCGGGCTGGTAAAAACGAAG-3′（HindIII） Dhy2p2：5′-CGGAATTCCTTGCAGACTTGCACAGGTGTTG-3′（EcoRI）。以含有启动子序列的质粒为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经电泳、回收后与pGEM-T easy载体连接，转化大肠杆菌，提取质粒。用HindIII和EcoRI分别对pCAM1391Z载体和含有TaDHNP启动子的pGEM-T easy载体进行双酶切，分别回收pCAM1391Z载体大片段和TaDHNP启动子小片段，用T4 DNA 连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取重组质粒后进行酶切鉴定重组子，酶切产物经电泳检测后可见合适大小的目的启动子条带和切开的载体条带，表明所构建的植物表达载体正确（图4）。

3.1质粒pCAM1391Z载体和pGEM-T easy载体的HindIII和EcoRI双酶切

碱裂解法提取pCAM1391Z空载体和pGEM-T easy质粒，各取10μg 酶切，酶切体系如下：

HindⅢ 1μl

EcoRI 1μl

pCAM1391Z载体/ pGEM-T easy质粒 4μl

10×Buffer M 1μl

ddH₂O To 20μl

于37℃恒温水浴锅酶切3 小时以上。双酶切后以1×TAE 为电泳缓冲液，将酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下中pCAM1391Z载体的大片段和pGEM-T中大约1.6 kb 的目的基因条带，回收该条带。

3.2酶切产物的连接

经酶切的pCAM1391Z载体载体片段和pGEM-T easy 双酶切回收片段（约1.6kb）以摩尔比1:4 的比例进行16℃连接过夜。

3.3连接产物的转化

连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化菌在含Kan 50μg/ml 的LB 固体平板上37℃培养16 小时左右。

3.4重组子的鉴定

质粒酶切鉴定

提取阳性克隆质粒，对质粒进行HindⅢ和EcoRI 双酶切，酶切体系同上。0.8％琼脂糖凝胶电泳检测被切开的启动子目的条带和切开的载体片段，两条带大小正确，表明载体构建正确（图4）。

实施例4、农杆菌感受态的制备与转化

4.1 农杆菌GV3101感受态的制备

(1)从YEP 平板(含50μg/ml 利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含50μg/ml

利福平的YEP 液体培养基中，200rpm/min，28℃培养过夜。

(2) 取2ml 过夜培养液接种于50ml 含相同抗生素的YEP 液体培养基中在相同条件

下培养至OD₆₀₀ 达0.5。

(3) 菌液冰浴30min，4℃，5000rpm 离心10min，收集菌体。

(4) 将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15mol/L 的NaCl 中，离心收集菌体。

(5) 再悬浮于1ml 20mmol/L 冰预冷的CaCl2 溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5ml

Eppendorf 管中，置液氮中速冻1min，-70℃保存备用。

4.2 冻融法转化根癌农杆菌GV3101

(1) 在室温下融化农杆菌感受态细胞，加入1μg 表达载体质粒DNA，混匀后冰浴

30min。

(2) 置液氮速冻1min，迅速移至37℃保温3min。

(3) 加入无抗生素的YEP 800μl，28℃震荡培养3hr。

(4) 7000rpm 离心30s 收集菌体，涂于含50μg/ml 利福平、50μg/ml Kan 的YEP 平板上，28℃倒置暗培养2-3 天。

4.3 菌体PCR 鉴定及电泳

菌体PCR 方法及程序及电泳同1.4，根据扩增片段长度调整PCR72℃延伸时间2min。

实施例5、启动子的功能验证－拟南芥转化及转基因株系的鉴定

5.1 拟南芥种植

将野生型拟南芥种子用7.5%次氯酸钠溶液（包括7.5%次氯酸钠和0.01% Triton-X 100）消毒15分钟，然后用无菌水漂洗5-6次，点播于MS平板上，于4°C 春化2-3天。然后移植到营养钵中（营养土与蛭石按等比例混合），23°C 培养，16/8 h 光周期，光强30-40μmol·m-2 · s-1；待植株开花后，剪去其主枝顶端，促进侧枝发展。在剪枝后的4-6 天内，进行农杆菌转化。

5.2 农杆菌的制备

分别接种含有pCAM1391Z/TaDHNP载体的GV3101 农杆菌于10mLYEB培养基（100 mg/L 利福平，25 mg/L 庆大和100 mg/L 卡那）中，28℃培养振荡过夜。然含后转接种于500 ml含相同抗生素的YEB培养基中扩大培养。5 000 rpm 离心15 min 沉淀菌体。将农杆菌重悬于200 ml 转化缓冲液中（MS大量元素，3%蔗糖，0.03%Silwet-77），OD600≈0.8-1。

5.3 拟南芥转化

把200 ml 菌液倒入浅盘中。将修剪好的拟南芥倒扣并使所有花序浸入悬浮菌液中，

轻轻搅动沾花30 sec-1 min。取出花盆侧放于托盘中，用保鲜袋包裹以保湿。将托盘置暗处培养24 h。然后取出营养钵并直立放置，恢复光照，继续培养植株至成熟。

5.4 阳性植株的筛选

T0 代种子用7.5%次氯酸钠溶液（包括7.5%次氯酸钠和0.01% Triton-X 100）消毒后，点播在MS 选择培养板(30 mg/L 潮霉素)上。于4℃下春化2-3 天。移入培养室中培养。大约10天左右，挑选潮霉素抗性植株（长出真叶1-2 对，根伸长至培养基中）并移栽到营养钵中。培养直至种子成熟。同样方法筛选T1 代种子得到T2 代植株。

5.5 转基因拟南芥的PCR鉴定

拟南芥基因组DNA的提取同2.1

PCR体系、程序及电泳条件同4.3。检测结果表明在转基因拟南芥株系中可见到合适大小的外源基因条带（图5）。表明外源启动子已转入拟南芥植株。

6.GUS 染色

(1 )取材：收集生长1-2周的T2代整株幼苗，迅速放入装有预冷的90%丙酮中试管中。室温脱色30 min。

(2 )将材料转入预冷的不含X-gluc 的染色缓冲液（0.2% Triton X-100，2 mmol/L亚铁氰化钾，2mmol/L铁氰化钾，50 μmol/L 磷酸钠缓冲液，pH7.2）中洗涤。

(3) 染色：去除洗涤染色缓冲液，加入含X-gluc 的染色缓冲液（0.2% Triton X-100，2 mmol/L 亚铁氰化钾，2 mmol/L 铁氰化钾，2 mmol/L X-gluc，50 μmol/L 磷酸钠缓冲液，pH7.2），并将样品放到冰上真空抽滤15-20 min，直至所有材料都浸没在溶液中。

(4) 将材料转移到37℃染色过夜或染色两天。

(5) 脱水：等组织出现蓝色时，去除染色液，用20%，35%，50%的乙醇梯度脱水，每步30 min。

(6) 固定：将材料放在FAA（50%乙醇，10%冰乙酸，5%甲醛）中于室温固定30 min。

(7) 去除FAA，加入70%乙醇。

(8) 直接在显微镜下观察材料并照相。染色结果表明：正常培养条件下，TaDHNP启动子不能启动外源基因表达，转基因拟南芥株系未见有GUS染色（图5A）；在100 mM NaCl处理和4℃处理48h，TaDHNP启动子被诱导启动外源基因表达，GUS染色成阳性（图5 B、C、D、E）。

序列表

<110>济南大学、山东大学

<120>小麦脱水素基因的启动子及其应用

<141>2010-6-1

<160> 1

<210> 1

<211>1615

<212>DNA

<213>小麦

<221>小麦脱水素基因的启动子

<222>（1）…（1615）

<400>1

1 CACGGCCCGG GCTGGTAAAA ACGAAGAGAG TATTGTGCAT GGCGTTTCAT ACTTGCTTTT

61 CATGGAAGTT CATACCAGGC TGTTGTCTCT CTCATTCATC TTGAATCTTG ACAAATGCCA

121 TCCCGACAAG TTACAAGTCA GCTCAAATCT CGTCCGGAAA CTTCAGCATA ATGACAGTCC

181 TGTTCTAGGC TCCTAGCTCA GATCACCGAC CTCCTTTCCT CGATTACTTG TTCTCCTAAC

241 CAAAACTGAA TGAAGTAACA TGAGTCTTGC TTGTGGCTGG CCTACAACCG CACGCCCGCG

301 ACGGAGCTCC CATCGTGGTG ACACCGCGCT GCGCACAAGC GACTAGCGCT GCCACAATCG

361 AGGACGCCGC CGTGAAGACG AGCTCCGGAC TATCACCAGC CGCCTGAGAT CTCCCCATCA

421 AAAGAGCAGC CGGCGAGGAG CACGAGCCCC GCCGCCGCCG GCTCCACGCA TGCTTTGCAT

481 GTCAGAGGCC ACCGGCGATG GCGAGGGGGT GGATGGGATG GGTGAGGCGA GGAGAGGCTG

541 GTGTTTTTCG CCACCCGTGT CGCCCTGGGG AGGGCGCGAC GCGGGGGCAG ATGGGATCCA

601 CTAGTTCGAT CAGTTGAAGC CCTACGTATA TTTTTTCCGA TATGAAATAT AAAATATTGG

661 GAAGATATTT ATTACTCAAA TGCATAGAAC AACATTATTA CGAAAGGAAG AAGAAAAAAA

721 GGTGAACAAC ACCCCCAGCA AACGACAACA ACAATGACGA CAAGCATCAA TGATAGCACC

781 CATAGGTAAC AGTATACGTG CTTTAACAAT GATGCTTTTA GGGAGGTATA GGTGCTTCAA

841 CAATGATGCT TTCAGGAAGA GAACAACACA TGAGCGCTGT CGTCGTTGTA ACCAACCACT

901 AAGGTTAGAT CGTGAATTTT CACCTCGAAG AGGAGTTTGA GTAAACTTCA TGCAATGTCT

961 TCAACTAGAG AATGTCATAT GAACAACAAC ATTCCCATGT TCAACCAATG AAGGTGGATC

1021 ATAAGTTTTC ACCCTGAGAC TCAGCCCTTG CACTCAACTT CTGTCACCTA ACCTACTTCG

1081 CCTTGTGTTG CTAGCATACC ATCACCTGCC GACCCATTTT CCCATTTTTA ATGAGCAGGG

1141 TTATGATTTT CAGTCGATGC ATATTTTCAT GGACGTGCGA TGGACATCCT CGCGGGCATA

1201 AAAATGAATT TGATATTGCT CGATCATAAT AACCCGAACG CGCCTACTTT TAATGATAGG

1261 ATACCTTTGG TCCATATAGT TCCATTTTTG TTCCATGCCG ACGCTTCGAG CTGTCAGTTT

1321 CCGAAGCAAA CAAGACGACT TTTGGAAGTG TCCCTTGTGT GTCATCACCT CTTCGAGAAC

1381 AAGCTCAGAC GTGGCAACCC GAAGGCGCCC AGTAGCTGCA CACGTCCGAC CTCTCTTTAT

1441 GGGCTAGTCA TCAGTCACCG GCAACCCGCT CCCGCGAGCA CACGTAGCGC CTCCGACGAT

1501 CCTATCCCGT CGGCTATAAA TTGTGCCTCG TGCTGGACCT GCCTACACAA CACAGCCACG

1561 AGTAGCAGCC AAGTCGGGAA GACAACCAAG ATCAACACCT GTGCAAGTCT GCAAG

Claims

1. 一种小麦脱水素基因的启动子TaDHNP，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2. 含有权利要求1所述小麦脱水素基因的启动子的植物表达载体，其特征在于，根据启动子TaDHNP序列设计分别含有HindIII和EcoRI的启动子上下游引物，引物名称及序列为Dhy2p1：5′-CCCAAGCTTCCCGGGCTGGTAAAAACGAAG-3′；Dhy2p2：5′-CGGAATTCCTTGCAGACTTGCACAGGTGTTG-3′，以含有启动子序列的质粒为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经电泳、回收后与pGEM-T easy载体连接，转化大肠杆菌，提取质粒；用HindIII和EcoRI分别对pCAM1391Z载体和含有TaDHNP启动子的pGEM-T easy载体进行双酶切，分别回收pCAM1391Z载体大片段和TaDHNP启动子小片段，用T4 DNA 连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取重组质粒后进行酶切鉴定重组子，酶切产物经电泳检测后可见合适大小的目的启动子条带和切开的载体条带，表明所构建的植物表达载体正确。

3. 如权利要求1所述的小麦脱水素基因的启动子在培育耐盐、耐冷植物中的应用，其特征在于：所述植物为小麦或拟南芥。

4. 如权利要求2所述的含有小麦脱水素基因的启动子的植物表达载体在培育耐盐、耐冷植物中的应用，其特征在于：所述植物为小麦或拟南芥。