CN114106119B

CN114106119B - 齿肋赤藓ScSoloist基因及其应用

Info

Publication number: CN114106119B
Application number: CN202010869805.5A
Authority: CN
Inventors: 李小双; 张道远; 杨瑞瑞; 梁玉青; 杨红兰
Original assignee: Xinjiang Institute of Ecology and Geography of CAS
Current assignee: Xinjiang Institute of Ecology and Geography of CAS
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2020-08-26
Publication date: 2024-01-26
Anticipated expiration: 2040-08-26
Also published as: CN114106119A

Abstract

本发明公开了齿肋赤藓ScSoloist基因及其应用。本发明提供了如下任一蛋白：氨基酸序列如SEQ ID No.1或其经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或具有80％以上同源性的蛋白或在其N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。本发明所提供的来源于齿肋赤藓的Soloist基因具有抗大丽轮枝菌的功能，本发明不仅丰富了植物中Soloist亚族基因的理论认识，同时也为作物抵抗生物胁迫特别是植物抗黄萎病分子育种提供候选基因。

Description

齿肋赤藓ScSoloist基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及齿肋赤藓ScSoloist基因及其应用。

背景技术

黄萎病(Verticillium wilt)是由大丽轮枝菌引起的一种植物维管束病害，其寄主范围很广，包括200多种双子叶植物，主要侵染棉花、亚麻、番茄、茄子和胡椒等经济作物，其中尤以棉花的黄萎病危害最为严重，由于感染黄萎病的棉株最后发展为整株枯死，所以往往造成棉田的严重减产甚至绝收，在我国棉铃虫得到基本控制之后，黄萎病已经成为棉花生产的第一大病害。长期以来，人们使用化学农药对其进行防治，不仅破坏了生态环境，还使得病原菌产生抗药性，而天然抗黄萎病棉花种质较少，且目前通过常规杂交育种的方法难以获得既抗黄萎病又具有较高产量的棉花品种。因此，利用现代分子生物学手段分离抗黄萎病相关基因，再通过转基因技术获得抗黄萎病的转基因植株，进一步利用遗传工程手段培育抗病品种具有重要意义和广阔的应用前景。

植物AP2/ERF(APETALA2/ethylene-responsive factor)是一个庞大的转录因子基因家族，含有由60-70个氨基酸组成的AP2/ERF结构域而得名。目前已经从拟南芥、水稻、玉米、番茄等多种植物中分离出来AP2/ERF基因。大量的研究证实这类转录因子在植物的生长发育以及植物抵抗生物和非生物胁迫信号转导中发挥着重要作用。根据所含AP2结构域的数目及是否含有B3结构域，将拟南芥中的AP2/EREBP基因分为AP2亚家族、DREB亚家族、ERF亚家族、RAV亚家族和单独亚族成员Soloist。Soloist基因也只有一个AP2结构域，但与其他DREB和ERF家族基因的进化关系很远，因此成为单独亚族基因。目前对AP2/ERF家族的研究多集中于DREB和ERF亚家族，Soloist亚家族基因研究较少，其基因特性和功能都知之甚少。截至目前，未见Soloist基因对黄萎病抗性的研究报道。

齿肋赤藓(Syntrichia caninervis)是我国西北荒漠地区耐干性藓类结皮层中的优势物种，齿肋赤藓具有超强的综合抗逆能力，是抗性基因挖掘的好材料。开展该种的抗性基因克隆，对于深入开展抗逆基因资源的开发利用和定向培育抗性植物新品种具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种齿肋赤藓ScSoloist基因及其应用。

第一方面，本发明要求保护一种蛋白质。

本发明所要求保护的蛋白质名称为ScSoloist，来源于齿肋赤藓。具体可为如下(A1)-(A4)中任一所示：

(A1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；

(A2)将(A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对氨基酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述蛋白质中，所述ScSoloist可来源于齿肋赤藓。

第二方面，本发明要求保护编码前文所述蛋白质的核酸分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

进一步地，所述核酸分子(ScSoloist基因)可为如下任一：

(B1)SEQ ID No.2(cDNA)或SEQ ID No.3(基因组)所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述核酸分子中，同一性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对核苷酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述核酸分子中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

第三方面，本发明要求保护含有前文所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

其中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达前文第一方面中所述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

构建含有所述ScSoloist基因表达盒的重组表达载体。所利用的植物表达载体可为双元农杆菌载体等，如pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1300、pBin438、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用ScSoloist构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

在本发明的具体实施方式中，所述重组载体中启动所述核酸分子转录的启动子为35S启动子。更加具体地，所述重组载体为将所述核酸分子插入到pCAMBIA1301载体的多克隆位点处(如Kpn I和BamH I)后得到的重组质粒。

第四方面，本发明要求保护前文所述蛋白质或前文所述核酸分子或前文所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下任一中的应用：

P1、调控植物对黄萎病的抗性；

P2、调控植物对大丽轮枝菌的抗性；

P3、调控植物活性氧(ROS)清除能力；

P4、调控植物体内木质素含量；

P5、调控植物体内水杨酸含量；

P6、调控植物体内水杨酸合成酶关键基因的表达；

P7、调控植物体内木质素合成酶关键基因的表达；

P8、调控植物体内经典病程相关基因的表达；

P9、植物育种。

进一步地，所述蛋白质在所述植物中的表达量和/或活性提高，所述植物对黄萎病的抗性提高。

进一步地，所述蛋白质在所述植物中的表达量和/或活性提高，所述植物对大丽轮枝菌的抗性提高。

进一步地，所述蛋白质在所述植物中的表达量和/或活性提高，所述植物在大丽轮枝菌的胁迫下活性氧(ROS)清除能力提高、体内木质素含量提高、体内水杨酸含量提高、体内水杨酸合成酶关键基因的表达量提高、体内木质素合成酶关键基因的表达量提高，和/或体内经典病程相关基因的表达量提高。

进一步地，在所述应用中，可将表达所述蛋白质(ScSoloist蛋白)的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种。

第五方面，本发明要求保护一种培育植物的方法。

本发明要求保护的培育植物的方法，包括提高受体植物中前文所述蛋白质(ScSoloist蛋白)的表达量和/或活性的步骤，所得目的植物具有如下任一性状：

(a1)对黄萎病的抗性提高；

(a2)对大丽轮枝菌的抗性提高；

(a3)在大丽轮枝菌的胁迫下活性氧(ROS)清除能力提高、体内木质素含量提高、体内水杨酸含量提高、体内水杨酸合成酶关键基因的表达量提高、体内木质素合成酶关键基因的表达量提高，和/或体内经典病程相关基因的表达量提高。

所述方法可以通过杂交手段实现，也可以通过转基因手段实现。

第六方面，本发明要求保护一种培育转基因植物的方法。

本发明要求保护的培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入前文所述核酸分子(ScSoloist基因)，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比具有如下任一性状；

(a1)对黄萎病的抗性提高；

(a2)对大丽轮枝菌的抗性提高；

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，其中所述核酸分子(ScSoloist基因)可先进行如下修饰，再导入所述受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV、MCMV和AMV)。

所述核酸分子(ScSoloist基因)可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for PlantMolecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

在上述各方面中，所述对黄萎病的抗性提高和所述对大丽轮枝菌的抗性提高均具体可体现为病情指数降低、病级降低和/或所述植物体内病原菌菌体含量降低。

在上述各方面中，所述活性氧(ROS)清除能力提高具体可体现为活性氧(ROS)积累降低和/或过氧化酶活性升高。

进一步地，所述活性氧(ROS)积累降低具体可体现为丙二醛(MDA)含量降低和/或过氧化氢(H₂O₂)含量降低；所述过氧化酶活性升高具体可体现为超氧化物歧化酶活性(SOD)升高和/或过氧化物酶活性(POD)升高；

在上述各方面中，所述水杨酸合成酶关键基因具体可为ICS1基因和/或EDS5基因。所述木质素合成酶关键基因具体可为PAL2基因和/或4CL2基因。所述经典病程相关基因具体可为PR1基因、PR2基因和/或PR5基因。

在上述各方面中，所述植物可为种子植物或苔藓植物。

进一步地，所述种子植物可为被子植物。所述苔藓植物具体可为齿肋赤藓。

更进一步地，所述被子植物可为双子叶植物。

在本发明的具体实施方式中，所述植物具体为拟南芥。

本发明从齿肋赤藓中克隆得到一个Soloist基因，该基因与非苔藓植物如拟南芥，大豆，水稻等植物中的同源Soloist基因的氨基酸序列比对结果表明，除了AP2结构域的氨基酸组成保守外，非AP2结构域部分只有极低的氨基酸组成一致性，且系统进化树分析也表明，ScSoloist与苔藓植物泥碳藓和小立碗藓聚在一支，与拟南芥、水稻、大豆、棉花等物种进化距离很远。ScSoloist基因的结构，序列比对和进化关系均说明来自沙漠苔藓齿肋赤藓的ScSoloist是一个独特的新基因。此外，实验证明转ScSoloist基因能显著提高转基因拟南芥的抗大丽轮枝菌的能力，并从形态、生理和分子三个层面综合揭示ScSoloist基因的抗病机理。这是首例证实Soloist家族基因有抗大丽轮枝菌的功能的发现，不仅丰富了植物中Soloist亚族基因的理论认识，同时也为作物抵抗生物胁迫特别是植物抗黄萎病分子育种提供候选基因。

有益效果：

1、本发明是首次证实Soloist基因能显著提高植物对真菌性病原菌大丽轮枝菌的抗性，是Soloist家族基因新功能的报道。并从形态、生理和分子三个层面综合揭示ScSoloist基因的抗黄萎病机理，为植物抗病分子育种提供了抗病性强的候选基因。

2、本发明中大丽轮枝菌胁迫结果表明，转基因株系相对于WT拟南芥，具有明显的抗棉花黄萎病病菌大丽轮枝菌的能力，在拟南芥发病的叶片上，转基因株系的萎黄程度相对于野生型拟南芥的表现为更轻，并且野生型拟南芥的发病程度和发病率明显高于转基因株系，体现在更为严重的病情指数和病级。

3、本发明中转基因拟南芥可能是通过降低ROS损伤，增强ROS清除能力，并提高木质素、病程相关蛋白等相关基因的表达量来提高转基因拟南芥的抗大丽轮枝菌的能力。

4、构建ScSoloist基因过表达载体，获得ScSoloist基因转基因植株。转基因植株对黄萎病的抗性明显增强，说明ScSoloist基因提高了植物对黄萎病的防御抗性，具有基因工程应用价值。

附图说明

图1为ScSoloist基因结构图。

图2为ScSoloist与其他物种Soloist基因的序列比对和进化树分析。A.ScSoloist和4个代表物种Soloist的多序列比对结果，AtSoloist来自拟南芥(At4g13040),PpSoloist来自小立碗藓(Pp3c5_19550V3.1)，GmSoloist来自大豆(Glyma.18G159900.1),OsSoloist来自水稻(LOC_Os02g29550.1)；B.10个代表物种Soloist的进化树分析。10个物种分别为拟南芥、水稻、大豆、棉花、豇豆、泥碳藓、小立碗藓、紫萍、云杉。

图3为ScSoloist基因在激素处理和病原菌接菌后的齿肋赤藓中的基因表达水平。A：大丽轮枝菌侵染齿肋赤藓5d过程中不同时间点ScSoloist基因表达水平；B：植物激素水杨酸(SA)处理齿肋赤藓2d过程中不同时间点ScSoloist基因表达水平；C：植物激素茉莉酸甲酯(MeJA)处理齿肋赤藓2d过程中不同时间点ScSoloist的基因表达水平。

图4为ScSoloist蛋白亚细胞定位及自激活活性分析。A：ScSoloist亚细胞定位分析；B：ScSoloist转录自激活活性分析，EsDREB为阳性对照，P1-P5为ScSoloist不同截短片段。

图5为植物表达载体pCAMBIA1301-ScSolois双酶切鉴定。泳道a：pCAMBIA1301-ScSoloist双酶切结果；泳道b：pCAMBIA1301空载双酶切；泳道c：ScSoloist基因片段

图6为转基因拟南芥株系ScSoloist基因的PCR鉴定。L1-L11是转基因拟南芥，WT是野生型拟南芥。

图7为大丽轮枝菌胁迫后的野生型和不同株系转基因拟南芥(1-3和2-18)的发病情况。A：胁迫后不同株系拟南芥的表型对比；B：胁迫后不同株系拟南芥的病级分布；C：胁迫后不同株系拟南芥的病情指数；D：胁迫后不同株系拟南芥的大丽轮枝菌菌体含量，**p<0.01，***p<0.001。

图8为大丽轮枝菌胁迫20d处理后转基因拟南芥ROS积累和ROS清除相关酶活性的分析。A：胁迫后不同株系拟南芥叶片的DAB染色和NBT染色；B：胁迫后不同株系拟南芥叶片的H₂O₂含量测定；C：胁迫后不同株系拟南芥叶片的丙二醛(MDA)含量测定；D：胁迫后不同株系拟南芥叶片内的SOD活性测定E：胁迫后不同株系拟南芥叶片内的POD活性测定，*p<0.05，**p<0.01。

图9为大丽轮枝菌胁迫下转基因拟南芥植株游离水杨酸及其合成相关基因的表达量测定。A：胁迫后不同株系拟南芥游离水杨酸含量；B：AtICS1在不同时间点的表达量；C：AtEDS5在不同时间点的表达量。

图10为大丽轮枝菌胁迫下转基因拟南芥植株木质素及其合成相关基因表达量分析，与病程相关蛋白PR相关基因表达量分析。A：胁迫后不同株系拟南芥木质素含量；B：At4CL2在不同时间点的表达量；C：AtPAL2在不同时间点的表达量；D：AtPR1在不同时间段的表达量；E：AtPR2在不同时间段的表达量；F：AtPR5在不同时间段的表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、齿肋赤藓ScSoloist基因的克隆

本发明中的齿肋赤藓来自于新疆古尔班通古特沙漠。

据齿肋赤藓混合转录组数据库中信息设计基因引物进行扩增。以齿肋赤藓基因组和cDNA为模板，分别进行PCR和RT-PCR扩增。具体步骤如下：

利用齿肋赤藓混合转录组数据库设计扩增引物P1和P2，以齿肋赤藓基因组DNA为模板进行PCR扩增，以齿肋赤藓cDNA第一链为模板进行RT-PCR扩增。

P1：5’-ATGGTTAGTATCAGGAAACGCCG-3’；

P2：5’-TTAGGACGGGCACTTTACAGAC-3’。

PCR和RT-PCR产物经1.0％的琼脂糖电泳后用OMEGA公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收片段，分别连接到pMD19-T载体上(所得重组质粒命名为pMD19-ScSoloist)，转化大肠杆菌DH5α，PCR检测单克隆，阳性克隆进行测序，测序正确后保存备用。

测序结果显示：

齿肋赤藓基因组DNA的PCR扩增产物序列如SEQ ID No.3所示；齿肋赤藓cDNA第一链的RT-PCR扩增序列如SEQ ID No.2所示。SEQ ID No.2和SEQ ID No.3均编码SEQ ID No.1所示蛋白质。将该蛋白命名为ScSoloist蛋白，相应的编码基因为ScSoloist基因。

实施例2、ScSoloist基因的生物信息学分析

利用Gene Structure Display Server 2.0(GSDS)在线软件对ScSoloist基因序列(SEQ ID No.2或SEQ ID No.3)进行了基因结构的绘制，利用NCBI在线结构域预测工具(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行保守结构域分析，通过在线软件cNLS Mapper(http：//nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)对ScSoloist进行信号肽的预测，利用NCBI的blastp对ScSoloist蛋白(SEQ IDNo.1)进行同源蛋白比对搜索。找到与ScSoloist基因的核苷酸序列相似的代表性序列，用Clustal W进行多重序列比对，用Jalview软件对多序列比对结果进行编辑，用Mega6.0软件构建进化树。

如图1所示：ScSoloist基因全长955bp，含有6个外显子，5个内含子，开放式阅读框561bp，预测编码186个氨基酸，含有一个典型且完整的AP2保守结构域，N端有一个和核定位信号肽。

利用NCBI的blastp进行比对发现，ScSoloist与模式苔藓小立碗藓的氨基酸一致性最高，达到69％，但小立碗藓中该基因的功能未见报道。ScSoloist与非苔藓植物如拟南芥，大豆，水稻等植物中的同源Soloist基因的氨基酸序列比对结果如图2中A所示，除了AP2结构域的氨基酸组成保守外，非AP2结构域部分只有极低的氨基酸组成一致性。ScSoloist基因与其他代表植物中的Soloist基因的进化树分析表明，ScSoloist与苔藓植物泥碳藓和小立碗藓聚在一支，与拟南芥、水稻、大豆、棉花等物种进化距离很远(图2中B)。ScSoloist基因的结构，序列比对和进化关系均说明来自沙漠苔藓齿肋赤藓的ScSoloist是一个独特的新基因。

实施例3、qRT-PCR检测ScSoloist在病原菌及激素处理下的基因表达水平

本发明中将从新疆古尔班通古特齿肋赤藓在正常光照下进行完全复水24h，然后进行水杨酸(SA)和茉莉酸(MeJA)以及大丽轮枝菌(V991菌株)的处理。以Tubulin为内参基因，测定ScSoloist基因在各种处理下的基因表达水平。具体操作如下：

实验材料处理方法：将从新疆古尔班通古特齿肋赤藓在正常光照下进行完全复水24h，然后进行各种胁迫的处理。

植物激素处理：用SA(1mM)，MeJA(50μM)两种植物激素分别处理，苔藓中加的SA和MeJA激素处理液体不能过多，以不淹没苔藓植株为宜(90mm培养皿中加上8mL胁迫液)，同时将等量蒸馏水处理的苔藓样品作为对照组，激素处理后0，0.5h，2h，4h，6h，8h，24h，48h取样。

病原菌处理：挑取大丽轮枝菌(V991菌株)的菌丝接种到查氏固体培养基上，25℃倒置培养5～7d；将新鲜菌体接种到查氏液体培养基中，200rpm，培养5～7d；用灭菌的四层纱布进行过滤，以除去孢子丝，将培养好的液体大丽轮枝菌(V991菌株)菌液用血球计数板进行细胞计数后，用无菌的蒸馏水将菌液稀释成10⁶个/ml的数量级浓度对齿肋赤藓(复水24h)进行侵染，用注射器将每一个待浸染的苔藓轻刺一个小的伤口，便于病原菌更容易浸染齿肋赤藓，同时将蒸馏水处理的苔藓样品作为对照组(对照组同样也用注射器进行轻刺)。病原菌处理0，1d，3d，5d取样。

将植物激素或是病原菌处理后的苔藓，用干净的吸水纸将水吸净，每个处理分别取3个生物学重复，每个生物学重复称取0.1g样品，立即放入液氮速冻，之后将样品转移至-80℃冰箱保存。

根据特异性基因ScSoloist及内参基因Tubulin序列，使用Primer5进行引物设计如下：

qPCR-ScSoloist-1F：5’-GGCGGACTCTCTCCAGGTAAAT-3’；

qPCR-ScSoloist-1R：5’-GAATAACTGATGGTGCAGCTCC-3’。

Sc-α-Tubulin-F：5’-CGGTCATTACACCGTGGGAA-3’；

Sc-α-Tubulin-R：5’-CCTCTCCAGCAACAGCGAA-3’。

RNA提取及cDNA第一条链的合成：将保存在-80℃的苔藓样品取出进行RNA提取，用RNA提取试剂盒(Omega,Plant RNA Kit,R6827-02)进行提取。提取后的RNA利用反转录试剂盒PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(takara,RR047A)进行cDNA第一链的合成。

实时荧光定量PCR实验：将反转录得到的cDNA利用TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(takara,RR420Q)进行实时定量PCR。体系为：7μL的ddH₂O，10μL TBGreen Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2X)，0.5μL的正向引物(10μM)/反向引物(10μM)，2μL的cDNA，总体积为20μL。程序为：94℃预变性30s；94℃变性5s，60℃退火及延伸30s，40个循环。

数据分析：基因表达的相对值用2^-ΔΔt法计算，内参使用Sc-α-Tubulin,每个处理三个生物学重复，每个生物学重复三个技术重复。

实时荧光定量结果如图3所示：ScSoloist基因受黄萎病菌株大丽轮枝菌V991的诱导上调表达，同时受SA和MeJA的诱导表达，ScSoloist基因在SA处理后呈现先上升后下降再上升的表达趋势，ScSoloist基因在MeJA处理后是先下降后上升。

实施例4、ScSoloist蛋白亚细胞定位

本发明中使用基因枪轰击洋葱细胞的方法，将带有绿色荧光蛋白的pBI121-ScSoloist-EGFP质粒通过钨粉带入到洋葱细胞当中进行表达，通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白的特异性表达位点，验证ScSoloist基因的亚细胞定位情况。具体操作如下：

1、pBI121-ScSoloist-EGFP质粒的构建

根据In-Fusion HD Cloning Kit的使用说明，根据ScSoloist基因的cDNA序列(SEQ ID No.2)和pBI121-EGFP载体多克隆酶切位点处的60多个碱基序列进行引物设计。

以实施例1构建的pMD19-ScSoloist(携带SEQ ID No.2)为模板，引物中加入同源重组序列，上游引物pBI121(in-fusion)-ScSoloist-F：5’-TCTAGACTGGTACCCATGGTTAGTATCAGGAAACG-3’，下游引物pBI121(in-fusion)-ScSoloist-R：5’-CTAGTCAGTCGACCCTTGGACGGGCACTTTACAG-3’(下划线标注部分为载体序列)。进行目的基因ScSoloist的克隆。PCR的产物使用Omega胶回收试剂盒回收，回收后使用1％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小和浓度。

使用Sma I限制性内切酶对pBI121-EGFP进行单酶切。酶切的产物进行胶回收，并使用1％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小和浓度。

根据Clontech提供的网站http://www.clontech.com/US/Support/xxclt_onlineToolsLoad.jsp？citemId＝http://bioinfo.clontech.com/infusion/molarRatio.do&section＝16260&xxheight＝750，计算出连接所需加入的量。将反应体系置于50℃孵育15min，然后置于冰上。连接液即可进行DH5α感受态细胞的转化。

2、基因枪轰击洋葱表皮细胞

将新鲜的洋葱用清水泡一天，然后将中间2～3层葱瓣的表皮撕掉，平铺在提前倒好的固体1/2MS平板上。

称取微载体大约30mg左右，将其放入1.5mL的离心管当中；在离心管内加入1mL70％乙醇；在涡旋混合器上充分震荡3～5min；震荡结束后静置15min；将离心管离心约5s，用移液器轻轻的将上清弃去；向离心管当中加入1mL蒸馏水；充分震荡1min；震荡结束后静置1min；将最大速度离心10s后，吸弃水溶液，再重复6～9的步骤2次；将500μL灭菌的50％甘油加入到离心管当中。

吸取适量的微载体溶液，使其大约为3mg，加入1.5mL的离心管内；分别加入5μLpBI121-EGFP空载质粒和pBI121-ScSoloist-EGFP(1μg/μL)；分别加入50μL 2.5M CaCl₂；分别加入20μL 0.1M亚精胺，持续震荡2～3min；静置1min，然后轻轻的放于离心机当中离心约2s，弃上清；向离心管中加入140μL 70％乙醇，高速离心10s左右，弃上清；加入140μL 100％乙醇，高速离心10s左右，弃上清；最后在包埋好的微载体中加入48μL 100％乙醇，在振荡器上低速顺时震荡即可；使用PDS-1000台式基因枪进行轰击。将轰击的洋葱表皮细胞进行暗培养24h后，将其放置在载玻片上进行激光共聚焦显微镜的拍摄。

如图4中A所示，ScSolosit蛋白特异定位于洋葱表皮细胞的细胞核，阳性对照pBI121-GFP分布于整个洋葱细胞。

实施例5、ScSoloist蛋白自激活验证

本发明中通过酵母双杂的体系验证ScSoloist是否具有转录调控区。具体操作如下：

1、诱饵载体pGBKT7-ScSoloist的构建

根据In-Fusion HD Cloning Kit的使用说明设计引物(下划线标注部分为载体序列)。

pGBKT7-(in-fusion)-ScSoloist-F：5’-CATGGAGGCCGAATTCATGGTTAGTATCAGGAAACG-3’；

pGBKT7-(in-fusion)-ScSoloist-R：5’-GCAGGTCGACGGATCCTTAGGACGGGCACTTTACA-3’。

以实施例1构建的pMD19-ScSoloist(携带SEQ ID No.2)质粒为模板，克隆ScSoloist基因片段。pGBKT7空载质粒用BamH I和EcoR I进行双酶切。将ScSoloist和pGBKT7载体双酶切产物进行胶回收，方法参照Omega胶回收试剂盒。根据Clontech在线网站计算出连接所需加入的量。将反应体系置于50℃孵育15min，然后置于冰上。连接液即可进行DH5α感受态细胞的转化。

将ScSoloist基因全长分别进行截短，设计5个截断短片段的引物(各片段引物见表1)，利用PCR扩增全长pGBKT7-ScSoloist质粒，克隆得到5个截短的片段，分别命名为P1，P2，P3，P4和P5，与pGBKT7载体进行连接转化后，分别挑取5个在含有50mg/mL卡那的LB固体板上生长的单菌落，然后在含有50mg/mL的液体LB培养基上，37℃，200rpm摇4～5h，然后使用载体的通用引物pGBKT7-F：5’-TAATACGACTCACTATGGGC-3’和pGBKT7-R：5’-TTTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTC-3’进行菌液PCR鉴定。

表1构建和鉴定pGBKT7-ScSoloist各个截短型片段所需引物(下划线标注部分为载体序列)

引物名称	序列(5’-3’)
		P1-F	CATGGAGGCCGAATTCATGGTTAGTATCAGGAAACG
P1-R	GCAGGTCGACGGATCCGGCTCGGTCATAGAGATG
		P2-F	CATGGAGGCCGAATTCATGGTTAGTATCAGGAAACG
P2-R	GCAGGTCGACGGATCCCGCTTTTGGGGGATTGAAT
		P3-F	CATGGAGGCCGAATTCGAGAAAGAGCTGAAGAAGAG
P3-R	GCAGGTCGACGGATCCTTAGGACGGGCACTTTACA
		P4-F	CATGGAGGCCGAATTCGAGAAAGAGCTGAAGAAGAG
P4-R	GCAGGTCGACGGATCCGGCTCGGTCATAGAGATG
		P5-F	CATGGAGGCCGAATTCGCTTACTTGTGTGGCAGAG
P5-R	GCAGGTCGACGGATCCTTAGGACGGGCACTTTACA

2、酵母自激活验证

以前期本课题组已经发表文章中的pGBKT7-EsDREB重组质粒作为阳性对照(参考文献Xiaoshuang Li,Daoyuan Zhang*,Haiyan Li,Yuanming Zhang,AndrewJ.Wood.EsDREB2B,a novel truncated DREB2-type transcription factor in thedesert legume Eremosparton songoricum,enhances tolerance to multiple abioticstresses in yeast and transgenic tobacco.BMC Plant Biology,14:44,2014)，pGBKT7空载作为阴性对照，以及pGBKT7-ScSoloist和带有P1-P5片段的质粒分别转化酵母感受态。将菌株分别于SD/-Trp的平板和SD/-Trp/-His上进行培养，进行自激活验证。

结果如图4中B所示，无论是全长ScSoloist蛋白还是不同形式的截短型片段均没有转录自激活活性。

实施例6、ScSoloist基因过表达载体的构建

设计引物，以实施例1构建的pMD19-ScSoloist(携带SEQ ID No.2)为模板，克隆出带有酶切位点的全长，回收产物与pCAMBIA1301载体链接，转入大肠杆菌DH5α中扩增，提取质粒并测序，保存正确质粒备用。具体步骤如下：

在ScSoloist基因片段正反两端分别加上KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点，ScSoloist的正向引物为pCAMBIA1301-ScSoloist-F，反向引物为pCAMBIA1301-ScSoloist-R(下划线标注部分为酶切位点序列)。

pCAMBIA1301-ScSoloist-F：5’-GGGGTACCATGGTTAGTATCAGGAAACGCCG-3’；

pCAMBIA1301-ScSoloist-R：5’-CGGGATCCTTAGGACGGGCACTTTACAGAC-3’。

对加酶切位点的PCR产物电泳后，用胶回收试剂盒纯化回收。用KpnⅠ和BamHⅠ酶于37℃进行双酶切，双酶切完全后电泳，用胶回收试剂盒纯化回收带有酶切位点粘性末端的目的基因，用于与载体的连接。

用KpnⅠ和BamHⅠ酶对过表达载体pCAMBIA1301质粒于37℃进行双酶切，电泳后回收带有酶切位点粘性末端的大片段，用于与目的基因的连接。

将目的基因的双酶切产物与载体pCAMBIA1301双酶切产物混合，在T4连接酶的作用下于16℃连接。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，PCR检测单克隆，选取阳性单克隆进行摇菌，提取重组质粒，经测序保存正确质粒备用。

双酶切实验结果如图5所示，pCAMBIA1301-ScSoloist重组载体双酶切实验酶切下来与ScSoloist基因大小一致的片段，载体构建正确。

pCAMBIA1301-ScSoloist载体的结构描述：在pCAMBIA1301的酶切位点KpnⅠ和BamHⅠ之间插入SEQ ID No.2所示DNA片段后的重组质粒。

实施例7、利用农杆菌介导的转化方法获得ScSoloist转基因拟南芥植株

将pCAMBIA1301-ScSolois质粒转化至农杆菌菌株EHA105中，获得转基因农杆菌，利用农杆菌介导的浸花法进行转基因拟南芥的转化。将培养至花期的拟南芥植株的花序部分浸入农杆菌悬浮浸染液中10s，放置10min后，再次浸染10s，将侵染后的植株用黑色的塑料袋黑暗保湿培36h；48h后，用水喷雾将转化的植株彻底洗干净，后正常培养至种子成熟。将侵染过农杆菌转化液的拟南芥植株的种子在1/2MS培养基中加入潮霉素的培养基上进行筛选，将在潮霉素平板上长真叶的拟南芥植株移栽到土壤当中，培养2周后提取叶片的DNA进行PCR鉴定。重复进行筛选，直到得到T2代种子。具体步骤如下：

1、农杆菌感受态的制备

将保存的EHA105菌株划线于带有利福平抗性(50mg/mL)的LB固体培养基上，28℃培养2～3d；挑取单菌落接种于5～10mL带有利福平抗性(50mg/mL)的LB液体培养基中，28℃震荡过夜；取1mL接于50mL LB(50mg/mL利福平)中，28℃培养至OD600＝0.4～0.5；菌液冰浴30min后，4℃，5000g，离心10min，弃上清；加入30mL无菌水，4℃，5000g，离心10min，弃上清；加入提前预冷的含有20％甘油的CaCl₂(20mmol/L)，混匀，按照200μL每管进行分装，液氮速冻后存于-80℃备用。

2、转化农杆菌感受态

迅速的将储存于-80℃的农杆菌感受态放置于冰上备用；将测序正确的实施例6构建的pCAMBIA1301-ScSoloist质粒1μg，加入200μL农杆菌感受态中，轻轻混匀后冰浴30min；液氮速冻5min，37℃水浴5min，然后冰浴2min；加800μL LB液体培养基，28℃，100rpm复苏4～6h；取50～200μL菌液涂布于LB(终浓度为50μg/ml利福平+终浓度为50μg/ml卡那霉素)固体平板上，28℃倒置培养2d。

3、转基因农杆菌鉴定

挑取在抗性LB平板上生长的菌落，转接到LB液体培养基(50μg/ml利福平+50μg/mL卡那霉素)，28℃，200rpm培养过夜；将菌液进行PCR鉴定；将菌液进行质粒的提取，然后再进行Kpn I和BamH I双酶切验证。将鉴定正确的重组农杆菌命名为EHA105-ScSoloist。

4、野生型拟南芥种子的灭菌及种植。

将拟南芥的种子放入1.5或者是2.0mL的灭菌EP管当中，加入1mL的灭菌水，充分震荡后，将水吸出；加入1mL 75％酒精，时间控制在30s左右，时间不宜太长；吸出酒精，立即加入灭菌水，冲洗，重复2遍；加入700μL灭菌水，300μL次氯酸钠，混匀，3min后吸弃液体；重复用灭菌水洗7～8遍；加入1mL灭菌水，将种子吹打到1/2MS培养基上，使种子分布均匀，然后把多余的水吸弃；用封口膜封上，在4℃避光春化2d；正常光照培养1周左右后，拟南芥苗长出4片叶子，此时将幼苗移栽至经灭菌处理的营养土(黑土：蛭石：珍珠岩＝5：3：2)中，用保鲜膜覆盖3d左右后揭去，每隔3d浇一次水。

5、农杆菌侵染

将保存的EHA105-ScSoloist菌株划线于LB固体培养基(50μg/ml利福平+50μg/mL卡那霉素)上，28℃培养2～3d；挑取在抗性LB平板上生长的菌落，转接到5mL LB液体培养基(50μg/ml利福平+50μg/mL卡那霉素)，28℃，200rpm培养过夜；取1mL菌液接种到100mL的LB(50μg/ml利福平+50μg/mL卡那霉素)液体培养基中，28℃震荡培养至OD600＝0.6左右；将菌液接种与新鲜的100mL LB液体培养基中，使OD600＝0.2，再28℃震荡培养至OD600＝0.8左右即可浸染拟南芥；5000rpm离心收集菌体，用配好的侵染液将菌体悬浮至OD600＝0.8左右；将拟南芥的地上部分浸泡在菌液当中10s，期间轻轻摇晃，然后取出放置10min，重复此步骤；将侵染后的植株用黑色的塑料袋黑暗保湿培养36h；48h后，用水喷雾将转化的植株彻底洗干净。

6、转基因拟南芥筛选

将侵染过的拟南芥植株的种子(T0代种子)进行筛选，在1/2MS培养基中加入潮霉素，将在潮霉素平板上长真叶的拟南芥植株移栽到土壤当中，培养2周后提取叶片的DNA，以实施案例1中的P1和P2引物进行PCR鉴定。重复进行筛选，直到得到T2代种子。

转基因拟南芥的PCR结果如图6所示：转基因拟南芥cDNA扩增出ScSoloist目标基因大小一致目的条带，PCR产物送测序鉴定为ScSoloist基因，获得转ScSoloist基因转基因拟南芥。

实施例8、转基因拟南芥抗大丽轮枝菌功能分析

1、大丽轮枝菌孢子悬浮液的制备及拟南芥的胁迫处理

挑取少量大丽轮枝菌(V991菌株)的菌丝接种到查氏固体培养基上，25℃倒置培养5～7d；接种到查氏液体培养基当中，200rpm，培养5～7d；用灭菌的四层纱布进行过滤，以除去孢子丝；用血球计数板统计孢子悬浮液的浓度，加入适量灭菌水将孢子悬浮液浓度调至5.0×10⁶个孢子/mL；将实施例7获得ScSoloist转基因拟南芥和野生型拟南芥在土壤当中培养3～4周左右，待土壤微干后浇入孢子悬浮液；放置一段时间，待土壤充分吸收水分后，将多余的孢子悬浮液倒出；浸染后的拟南芥在正常的培养环境和浇水下继续进行培养，并观察大丽轮枝菌侵染后的植株表型。在不同侵染后时间段(0d，5d，10d，15d，20d，25d)分别取野生型WT与转基因拟南芥(1-3与2-18)的莲座叶片3个生物学重复，每个生物学重复称取0.3g样品，立即放入液氮速冻，之后将样品转移至-80℃冰箱保存。实验同时设置向野生型拟南芥中导入pCAMBIA1301的空载对照组(具体操作参见前文)。

2、胁迫后拟南芥的病级和病情指数计算

在接种大丽轮枝菌20d后，统计拟南芥发病程度，并按以下方法定义病情指数的不同级值：0：没有症状，1：达到20％的叶片萎黄；2：达到40％的叶片萎黄；3：达到60％的叶片萎黄；4：达到80％的叶片萎黄；5：达到100％的叶片萎黄。同时按照如下公式计算病情指数。

病情指数(％)＝100×∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)。

3、拟南芥胁迫后植株中大丽轮枝菌含量分析

对接种大丽轮枝菌0，5d，10d，15d，20d，25d后的拟南芥进行DNA提取，采用DNA提取试剂盒(Omega，E.Z.N.A.Plant DNA Kit)进行拟南芥DNA的纯化，并用大丽轮枝菌V991菌株28S核糖体RNA特异性基因引物，qPCR-V991-F：5’-CGTTTCCCGTTACTCTTCT-3’和qPCR-V991-R：5’-GGATTTCGGCCCAGAAAC T-3’(Guillaume J.Bilodeau,Steven T.Koike,PedroUribe,et al.Development of an assay for rapid detection and quantification ofVerticillium dahliae in soil.Phytopathology,2012,102(3):331)进行实时定量PCR(qPCR)扩增来对植株中的大丽轮枝菌的菌体含量(拷贝数)进行定量分析。(qPCR)实验步骤如下：

(1)标准质粒制备

以拟南芥DNA为模版，用上述的引物qPCR-V991-F和qPCR-V991-R进行PCR扩增，将扩增的产物构建到pMD18-T载体上，经测序验证正确的重组质粒命名为pMD18-V991。将pMD18-V991质粒转化到Trans5α大肠杆菌中，并提取阳性克隆的目的质粒备用。

(2)绝对定量PCR

将提取的标准质粒按10倍进行梯度稀释，稀释8个梯度，进行标准曲线的制作。用TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(takara，RR420Q)进行实时定量PCR体系，PCR体系和程序按实施方案3进行。

(3)数据分析

利用绝对定量的方法计算，先通过标准质粒PCR获得标准曲线，根据质粒的标准曲线计算出每个样品中菌体DNA的拷贝数。菌体DNA的拷贝数为：

(6.02×10²³)×(g/ml)/(DNA length×660)＝copies/ml。

每个处理三个生物学重复，每个生物学重复三个技术重复。

结果如图7所示，大丽轮枝菌处理20d后，野生型拟南芥出现了严重的黄萎病症，甚至死亡，而转基因拟南芥病症较轻(图7中A)，进一步的分析显示转基因相对WT拟南芥有更轻的病级分布和更低的病情指数(图7中B和C)，另外，转基因拟南芥中的大丽轮枝菌的含量也显著低于WT拟南芥(图7中D)。过表达植株与对照之间的病情指数，病级和病原菌菌体含量均存在极显著差异。空载对照与野生型植物的表型、病情指数，病级和病原菌菌体含量基本一致，无统计学差异。

实施例9、ROS积累分析与过氧化酶活性的测定

供试植株：实施例7获得ScSoloist转基因拟南芥和野生型拟南芥，以及向野生型拟南芥中导入pCAMBIA1301的空载对照，按照实施例8的方法用大丽轮枝菌胁迫20d。

对植物叶片进行离体染色的方法如下：取实施例8中大丽轮枝菌(V991菌株)胁迫20d后干净的离体叶片置于1mg/mL的DAB或1mg/mL的NBT溶液中，室温染色12h以上，用比例为无水乙醇：乙酸：甘油：水＝8∶1∶1∶1(体积比)的脱色液在37℃脱色24～48h，拍照观察。测定不同株系胁迫2d后以丙二醛(MDA)、过氧化氢(H₂O₂)为代表的ROS积累，和以超氧化物歧化酶活性(SOD)、过氧化物酶活性(POD)为代表的过氧化酶保护系统，具体方法按照南京建成试剂公司的使用说明书进行。实验进行三次独立重复。并用Prism 5软件对试验数据进行统计分析。

结果如图8所示：大丽轮枝菌处理20d后，转基因拟南芥相对于野生型拟南芥有更低的ROS损伤，体现在更浅的DAB、NBT染色程度，更低的H₂O₂和MDA含量(图8中A、B和C)，同时转基因拟南芥表现为更为强的ROS清除能力，抗氧化酶SOD和POD活性都显著高于WT植株(图8中D和E)。空载对照与野生型植物的DAB、NBT染色、H₂O₂和MDA含量，以及SOD和POD活性基本一致，无统计学差异。

实施例10、游离水杨酸的测定和水杨酸合成酶关键基因的表达量分析

供试植株：实施例7获得ScSoloist转基因拟南芥和野生型拟南芥，以及向野生型拟南芥中导入pCAMBIA1301的空载对照，用大丽轮枝菌胁迫处理2d，并在处理后0，3h，6h，12h，24h后分别取样进行SA含量测定和SA合成酶关键基因的定量分析。

1、游离水杨酸的测定

提取方法：称取约0.1g样本，放入研钵中磨碎，加入1mL预冷的90％甲醇水溶液，4℃浸提过夜。8000g离心10min，取上清液，残渣用0.5mL 90％甲醇水溶液浸提2小时，离心后取出上清液，合并两次上清，40℃减压蒸发至不含有机相(大约0.3mL水溶液)，加入20μL1mg/mL三氯乙酸水溶液，混匀震荡1min。加入1mL的乙酸乙酯与环己烷的混合液(1:1v/v)萃取两次，转移上层有机相至新的EP管，氮吹吹干，加入0.5mL流动相溶解，混匀，针头式过滤器过滤后待测。

HPLC液相条件：Rigol L3000高效液相色谱仪，Kromasil C18反相色谱柱(250mm*4.6mm，5μm)，流动相甲醇：1％乙酸水＝3：2。开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10μL，流速0.8mL/min，柱温35℃，保留时间30min，荧光检测器，激发波长294nm，发射波长426nm，设置完毕保存方法组。用流动相过柱子，待基线稳定后开始加样测定。

2、水杨酸合成关键基因实时荧光定量分析

选取游离水杨酸合成代谢相关基因AtICS1、AtEDS5；同时以拟南芥泛素基因AtUBQ10作为荧光定量PCR反应的内参基因来分析基因在不同时间的表达情况。同时以拟南芥泛素基因AtUBQ10作为荧光定量PCR反应的内参基因来分析基因在不同时间的表达情况。荧光实时定量PCR实验所用引物见表2。PCR扩增体系参考TaKaRa公司的SYBR Premix ExTaq TM kit(Takara)试剂盒操作指南，两步法PCR反应程序为：预变性95℃30s，95℃5s，60℃30s，40个循环。PCR扩增在Bio-Rad CFX96Real-Time PCR System实时定量PCR仪上进行，PCR程序结束后，观察扩增和溶解曲线，利用仪器配套软件进行数据分析，基因表达的相对值用2^-ΔΔt法计算，每个处理三个生物学重复，每个生物学重复三个技术重复。

表2实时荧光定量实验RT-qPCR所用引物信息

水杨酸含量和其合成相关基因表达量如图9所示：在病原菌胁迫2d后，转基因拟南芥相对于WT具有更高的游离水杨酸含量，尤其是2-18株系，SA含量在病原菌胁迫后一直呈上升趋势(图9中A)，同时，相应的水杨酸合成关键酶基因AtICS1、AtEDS5表达量也显著高于WT植物(图9中B和C)。空载对照与野生型植物的SA含量，以及AtICS1、AtEDS5基因表达量基本一致，无统计学差异。

实施例11、用紫外分光光度法测定木质素的含量

由于木质素和溴乙酰在70℃形成的复合物在280nm处有明显的吸收峰，因此常用紫外分光光度法测定植物中木质素的含量。

取胁迫20d拟南芥的地上3cm以上的主茎，用液氮研磨破碎；将研磨后样品置于60℃烘箱中烘干至恒重，称取10mg样品，放入15ml离心管中，加入10ml去离子水，65℃加热震荡1h以上；每个样品用GF/A玻璃纤维滤纸过滤后，将滤渣依次用水、乙醇、丙酮、乙醚漂洗除去可溶性杂质，每次漂洗1～2分钟；将滤纸烘干后置于15ml离心管中，并加入2.5ml 25％溴乙酰(溶于冰乙酸)，70℃震荡加热1h；待样品冷却至室温后，加入0.1ml 7.5M的盐酸羟胺、0.9ml 2M的氢氧化钠和3ml冰醋酸以终止反应；将上述样品全部移入50ml容量瓶中，用冰乙酸定容后静置1h以上；用Lumda 35紫外可见分光光度计测定280nm处的吸光度；木质素的含量(％)＝280nm吸光度*定容体积*100/(样品干重*Astandard)；其中Astandard＝17.2。

结果如图10中A所示：转基因拟南芥与WT植株比，在病原菌胁迫后有更高的木质素含量。空载对照与野生型植物的木质素含量基本一致，无统计学差异。

实施例12、木质素合成相关基因和植物经典抗病基因的表达量分析

供试植株：实施例7获得ScSoloist转基因拟南芥和野生型拟南芥，以及向野生型拟南芥中导入pCAMBIA1301的空载对照，按照实施例8的方法用大丽轮枝菌胁迫5、10、15、20、25d。

选取了拟南芥中经典的抗病相关基因AtPR1、AtPR2、AtPR5，选取了木质素合成代谢相关基因AtPAL2、At4CL2，同时以拟南芥泛素基因AtUBQ10作为荧光定量PCR反应的内参基因来分析基因在不同时间的表达情况。荧光实时定量PCR实验所用引物见表2。PCR扩增体系参考TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq TM kit(Takara)试剂盒操作指南，两步法PCR反应程序为：预变性95℃30s，95℃5s，60℃30s，40个循环。PCR扩增在Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System实时定量PCR仪上进行，PCR程序结束后，观察扩增和溶解曲线，利用仪器配套软件进行数据分析，基因表达的相对值用2^-ΔΔt法计算，每个处理三个生物学重复，每个生物学重复三个技术重复。

结果如图10中B、C、D、E和F所示：转基因拟南芥与WT植株比，在病原菌胁迫后木质素合成酶关键基因AtPAL2、At4CL2的表达量在病原菌V991接菌的不同时间段内都有显著高的表达量。经典病程相关基因PR1、PR2、PR5基因表达量在转Soloist基因拟南芥中的表达量也显著高于WT植株。空载对照与野生型植物的前述各基因的表达基本一致，无统计学差异。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国科学院新疆生态与地理研究所

<120> 齿肋赤藓ScSoloist基因及其应用

<130> GNCLN202080

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 186

<212> PRT

<213> Syntrichia caninervis

<400> 1

Met Val Ser Ile Arg Lys Arg Arg His Gly Gly Leu Ser Pro Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ile Gln Pro Lys Val Tyr Lys Arg Ala Ala Val Thr Ala Asp Gln

20 25 30

Pro Pro Lys Gln Glu Val Arg Phe Ala Pro Ser Pro Pro Val Pro Thr

35 40 45

Phe Gln Glu Leu His His Gln Leu Phe Asn Pro Pro Lys Ala Glu Lys

50 55 60

Glu Leu Lys Lys Arg Lys Arg Gln Arg Arg Lys His Gln Glu Asn Gln

65 70 75 80

Glu Pro Cys Val Met Arg Gly Val Tyr Phe Lys Asn Met Lys Trp Gln

85 90 95

Ala Ala Ile Lys Val Glu Lys Lys Gln Val His Leu Gly Thr Val Asn

100 105 110

Ser Gln Lys Glu Ala Ala His Leu Tyr Asp Arg Ala Ala Tyr Leu Cys

115 120 125

Gly Arg Glu Pro Asn Phe Glu Leu Thr Glu Ala Glu Lys Gln Glu Leu

130 135 140

Gln Leu Leu Gln Trp Glu Asp Phe Leu Glu Gln Thr Arg Gln Ser Ile

145 150 155 160

Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Gly Asn Arg Asp Val Thr Glu Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Gln Thr Ser Val Lys Cys Pro Ser

180 185

<210> 2

<211> 561

<212> DNA

<213> Syntrichia caninervis

<400> 2

atggttagta tcaggaaacg ccggcacggc ggactctctc caggtaaatc aattcagccc 60

aaagtctaca agcgcgccgc tgttacggca gaccaaccac caaagcagga agtgagattt 120

gcaccttcgc cgcctgtgcc cacctttcag gagctgcacc atcagttatt caatccccca 180

aaagcggaga aagagctgaa gaagaggaag cggcaacgga ggaagcacca ggagaatcag 240

gagccttgcg tgatgcgtgg agtgtacttc aagaacatga agtggcaagc tgctatcaag 300

gtggagaaga aacaagtgca cctaggcaca gtgaattccc agaaagaggc ggcgcatctc 360

tatgaccgag ccgcttactt gtgtggcaga gagcccaact ttgagctgac tgaagccgag 420

aagcaggagc tccagctgct gcagtgggag gattttctgg agcaaacacg gcaatcaatc 480

ttaagcaaaa agcgaaaacg tggcaataga gacgtcacgg aagcggcttc ttcgcagacg 540

tctgtaaagt gcccgtccta a 561

<210> 3

<211> 955

<212> DNA

<213> Syntrichia caninervis

<400> 3

atggttagta tcaggaaacg ccggcacggc ggactctctc caggtacttc tcacattaga 60

ttgattggga tgagcgctag tccgatgtta aattactatt gatgttgtta ttattcccta 120

gtacaggtaa atcaattcag cccaaagtct acaagcgcgc cgctgttacg gcagaccaac 180

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cctttcagga gctgcaccat cagttattca atcccccaaa aggttgtgag cttctctagc 360

attcattaag atgcaggttc tgtctgtctg tatcctgaca ctgtcggtgg atgtgcagcg 420

gagaaagagc tgaagaagag gaagcggcaa cggaggaagc accaggagaa tcaggagcct 480

tgcgtgatgc gtggagtgta cttcaagaac atgaagtggc aagctgctat caaggtggag 540

aagaaacaag tgcacctagg cacagtgaat tcccagaaag aggcggcgca tctctatgac 600

cggtatgttt ctcaccctgg aggtggtttc tattaccact tgacgtctct aaatcgtatt 660

gatttggaat tgttggaagc agagccgctt acttgtgtgg cagagagccc aactttgagc 720

tgactgaagc cgagaagcag gagctccagc tgctgcagtg ggaggatttt ctggagcaaa 780

cacggcaatc aatcttaagc aaaagtatgt ccaatctaat cactagaaaa gcactgtttt 840

tgctattgtt tttcttacat ttcaagattt gttggttgtt tcagagcgaa aacgtggcaa 900

tagagacgtc acggaagcgg cttcttcgca gacgtctgta aagtgcccgt cctaa 955

Claims

1.蛋白质，为如下（A1）-（A2）中任一所示：

（A1）氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3. 根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为SEQ ID No.2或SEQID No.3所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。

5.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。

6.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌。

7.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述表达盒或权利要求5所述的重组载体或权利要求6所述的重组菌在如下任一中的应用：

P1、调控植物对黄萎病的抗性；

P2、调控植物对大丽轮枝菌的抗性；

P3、调控植物活性氧清除能力；

P4、调控植物体内木质素含量；

P5、调控植物体内水杨酸含量；

P6、调控植物体内水杨酸合成酶关键基因的表达；

P7、调控植物体内木质素合成酶关键基因的表达；

P8、调控植物体内经典病程相关基因的表达；

P9、植物育种；

在P1中，所述蛋白质在所述植物中的表达量提高，所述植物对黄萎病的抗性提高；

在P1中，所述蛋白质在所述植物中的表达量提高，所述植物对大丽轮枝菌的抗性提高；

在P3-P8中，所述蛋白质在所述植物中的表达量提高，所述植物在大丽轮枝菌的胁迫下活性氧清除能力提高、体内木质素含量提高、体内水杨酸含量提高、体内水杨酸合成酶关键基因的表达量提高、体内木质素合成酶关键基因的表达量提高，和/或体内经典病程相关基因的表达量提高；

所述水杨酸合成酶关键基因为AtICS1基因和/或AtEDS5基因；

所述木质素合成酶关键基因为AtPAL2基因和/或At4CL2基因；

所述经典病程相关基因为AtPR1基因、AtPR2基因和/或AtPR5基因；所述植物为拟南芥。

8.一种培育具有如下任一性状的植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量的步骤；

（a1）对黄萎病的抗性提高；

（a2）对大丽轮枝菌的抗性提高；

（a3）在大丽轮枝菌的胁迫下活性氧清除能力提高、体内木质素含量提高、体内水杨酸含量提高、体内水杨酸合成酶关键基因的表达量提高、体内木质素合成酶关键基因的表达量提高，和/或体内经典病程相关基因的表达量提高；

所述水杨酸合成酶关键基因为AtICS1基因和/或AtEDS5基因；

所述木质素合成酶关键基因为AtPAL2基因和/或At4CL2基因；

所述经典病程相关基因为AtPR1基因、AtPR2基因和/或AtPR5基因；

所述植物为拟南芥。

9.一种培育具有如下任一性状的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入权利要求2或3所述核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比具有如下任一性状；

（a1）对黄萎病的抗性提高；

（a2）对大丽轮枝菌的抗性提高；

所述水杨酸合成酶关键基因为AtICS1基因和/或AtEDS5基因；

所述木质素合成酶关键基因为AtPAL2基因和/或At4CL2基因；

所述经典病程相关基因为AtPR1基因、AtPR2基因和/或AtPR5基因；

所述植物为拟南芥。