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CN102203123A - 在宿主细胞中制造糖基化蛋白的新方法 - Google Patents

在宿主细胞中制造糖基化蛋白的新方法 Download PDF

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CN102203123A
CN102203123A CN2009801439193A CN200980143919A CN102203123A CN 102203123 A CN102203123 A CN 102203123A CN 2009801439193 A CN2009801439193 A CN 2009801439193A CN 200980143919 A CN200980143919 A CN 200980143919A CN 102203123 A CN102203123 A CN 102203123A
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described cell
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乔尼·赫勒纽斯
克里斯廷·纽珀特
马库斯·艾比
法劳西·帕尔赛-纳赛比
亚历山大·丹尼尔·弗雷
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Lonza AG
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Abstract

本发明改善了真核生物中的糖蛋白制造及蛋白糖基化工程，特别是类人复合物或杂交糖蛋白在例如酵母等低级真核生物中的制造。本发明提供了经糖基化修饰的真核宿主细胞，其能够制造可用作免疫球蛋白及其他治疗用蛋白的糖基化优化蛋白，并提供了能够制造具有与人细胞中制造的糖蛋白类似的多糖结构的糖蛋白的细胞。本发明进一步提供了可由所述细胞制造的具有类人多糖结构的蛋白质及其新组合物。

Description

在宿主细胞中制造糖基化蛋白的新方法
技术领域
本发明涉及真核生物中糖蛋白制造及蛋白糖基化工程的领域，特别是涉及类人复合物或杂交糖基化蛋白在例如酵母等低级真核生物中的制造。本发明进一步涉及经糖基化修饰的真核宿主细胞，其能够制造作为免疫球蛋白及其他治疗用蛋白对人类特别有效的糖基化优化蛋白。本发明还涉及基因工程改造的真核非人细胞，其能够制造与人细胞中制造的糖蛋白类似的具有多糖结构的糖蛋白。因此，本发明进一步涉及可由所述细胞制造的具有类人多糖结构的蛋白质及其新组合物。
背景技术
大多数基于蛋白质的生物药物会暴露出一些可以对与其治疗应用有关的蛋白质特性产生极大影响的翻译后修饰的形态。蛋白质糖基化是最普通的修饰(大约50％的人蛋白质是糖基化蛋白质)。糖基化可以通过在蛋白质组合物中的蛋白质上产生不同的多糖结构而向该组合物中引入重要的异质性。这样的多糖结构通过糖基化系统的各种酶的作用来形成，随着糖蛋白运输内质网(ER)和高尔基体(糖基化级联)。蛋白质多糖结构的性质对蛋白质的折叠、稳定、寿命、运输、药效学、药物动力学及免疫原性均产生影响。多糖结构对蛋白质的初级功能活性有很大影响。糖基化可以影响蛋白质局部结构并可能帮助引导多肽链的折叠。一种重要的多糖结构就是所谓的N-多糖。N-多糖通过寡糖共价键合新生多肽链共有序列NXS/T中的天冬酰胺残基的氨基(N)而产生。N-多糖可能进一步参与分选或引导蛋白质到达其最终靶点：抗体的N-多糖，例如，可能与补体成分相互作用。N-多糖还可以稳定糖蛋白，例如，可通过提高其溶解度、在其表面屏蔽疏水位点、防止蛋白水解及引导链内稳定化作用。糖基化可调节蛋白质的半衰期，例如，在人体内，N-多糖的末端唾液酸的存在可通过在血流中循环而增加蛋白质的半衰期。
寡糖的合成发生在内质网膜的两侧。糖基化级联起始于内质网膜的胞质面上连接有脂质的寡糖(lipid-linked oligosaccharide；LLO)的生成。首先，合成一个具有确定结构(Man3GlcNAc2)的与脂质连接的核心寡糖，然后添加所述寡糖至胞质面上的脂质多萜醇连接的Man3GlcNAc2以形成低聚七糖Man5GlcNAc2多糖结构。随后将该LLO转移(翻转)到内质网的腔面，进一步地，在该处加工所述庚-寡多糖以形成包含3个葡萄糖、9个甘露糖和2个N-乙酰葡糖胺残基(Glc3Man9GlcNAc2)结构的支链寡糖单元。所述Glc3Man9GlcNAc2结构通过若干糖基转移酶的作用而形成。每个单独的糖基转移酶都对特定的寡糖底物显示出很强的优先选择性，这导致可以基本线性、逐步地生物合成该支链寡糖。然后所述Glc3Man9GlcNAc2结构从多萜醇脂质转移至新生多肽。图1示出了野生型酵母的内质网上的LLO操作过程。
所述内质网糖基化途径的两个步骤不与糖基转移酶的作用直接相关：(1)Man5GlcNAc2-LLO从内质网膜的胞质面向腔面的翻转和(2)从脂质连接物到新生多肽的寡糖基转移。
翻转是在一种不依赖于ATP的双向翻转酶的催化下完成的。在酵母中，翻转酶活性是由一种包含约10个横跨内质网膜的跨膜域的多起源膜蛋白即“Rft1”支持或给予的。同源蛋白质的基因也出现在其他真核生物的基因组中。
不希望受理论的束缚，完整的寡糖Glc3Man9GlcNAc2是寡糖基转移酶(OT或OST)最佳的底物，所述寡糖基转移酶将全部寡糖从供体LLO转移至新生蛋白质或多肽的Asn-X-Ser/Thr共有序列中选定的天冬酰胺残基的氨基上。在大部分生物中，寡糖基转移酶是一种包含七或八个不同蛋白质的多聚体复合物，其中一个蛋白质(Stt3p)是催化性亚基。一旦糖蛋白适当地完成折叠和寡聚体化，就会移动到高尔基复合体中。然后，进一步修剪和修饰N-连接多糖，并且添加新的糖类例如在人细胞中生成杂交型或复合型多糖。
糖基转移酶和糖苷酶布满内质网和高尔基体的内(腔)表面，因此在蛋白质通过内质网和高尔基网时提供了一个允许糖蛋白序列加工的催化表面。事实上，顺面、中间和反面高尔基体的多区室结构及反面高尔基网(TGN)提供了可以产生糖基化反应的有序序列的不同场所。随着糖蛋白从在内质网中合成到在晚期高尔基体或TGN中完全成熟，其连续暴露于不同的糖苷酶、甘露糖苷酶和糖基转移酶，使得可以合成特定的寡糖多糖结构。
不同的生物提供不同的糖基化酶(糖基转移酶和糖苷酶)。因此，蛋白质的多糖结构的最终组成可根据宿主的不同而发生明显变化。例如，典型地，例如酵母和丝状真菌等低级真核生物在高尔基体中添加大量甘露糖残基而产生“高甘露糖”型糖蛋白；然而，在哺乳动物细胞中，多糖结构可能在高尔基体中经过修剪而去除若干个九甘露糖残基，并且可通过附加的糖残基进一步延长，这在低级真核生物的N-多糖例如唾液酸或岩藻糖中并不典型。
制造重组蛋白的可能性已经彻底改变了对患有多种不同疾病的患者的治疗。大部分治疗用蛋白需要通过添加多糖结构来进行修饰。所述糖基化对于蛋白质的正确折叠、长循环及最佳活性(大多数情况下)可能是必要的。哺乳动物细胞如常用的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)可以产生与人多糖结构类似的复合多糖结构，然而，来源于例如CHO细胞的多糖结构与人源多糖结构不同，因为CHO细胞a)唾液酸化程度较低，b)额外地使寡糖与普通唾液酸(NeuAc)合并成另一种非人唾液酸(NeuGc)，及c)包括人细胞中不存在的末端结合的α-1-3半乳糖。现在使用的用于制造重组蛋白的哺乳动物表达系统的缺点在于：(1)制造率低，(2)发酵程序昂贵，(3)菌株设计复杂，及(4)存在病毒污染的风险。
与哺乳动物细胞相反，酵母细胞是用于工业发酵的强健生物体，而且可以在成分明确的培养基中进行高密度培养。虽然糖基化在酵母和真菌中与在哺乳动物和人中有很大不同，但一些常见的要素是可以共享的。第一步，LLO在内质网中向新生蛋白质的转移在包括酵母、真菌、植物和人类的所有真核生物中是高度保存的。但是，随后N-多糖在高尔基体中的加工过程在酵母和哺乳动物中有显著不同。在酵母中，该过程包括若干甘露糖的添加。所述甘露糖基化由残留于高尔基体(例如Och1，Mnn1，Mnn2，等)中的甘露糖基转移酶催化，连续向N-多糖添加甘露糖。
对于生物制药产业来说，采用一种具有重现性和一致性的糖式模型来制造治疗用蛋白仍然是一个相当大的挑战。特别是，在酵母中制造的治疗用糖蛋白可能会在高级真核生物尤其是动物和人中引起不必要的免疫应答，从而导致在酵母及其同类中制造的治疗用蛋白的治疗价值低。对于几种重要的治疗剂类别，包括血液因子、抗凝血剂、溶血栓药、抗体、激素、刺激因子及细胞因子，例如肿瘤坏死因子(TFN)家族的调节蛋白、促红细胞生成素(EPO)、促性腺激素、免疫球蛋白G(lgG)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子及干扰素，均已经观察到糖基化对若干治疗用蛋白的分泌、稳定性、免疫原性及活性会产生影响。
最近正在开发例如毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等许多酵母以发挥此类系统的优点而消除其在糖基化方面的缺点。已对若干菌株进行基因组学研究以在蛋白质上产生明确的类人多糖结构。
发明内容
本发明的目的在于提供制造例如脂质和蛋白质等糖基化分子，特别是重组糖蛋白并且优选实例是免疫球蛋白的手段及方法。本发明的目的还在于提供一种可采用所述手段和方法制造的、具有明确的多糖结构例如特别是类人或杂交或复合多糖结构的糖蛋白及其新组合物。本发明的一个特别目的在于提供具有类人多糖结构的N-糖基化蛋白特别是免疫球蛋白，其可用于治疗人类疾病，疗效高并且不会引起不必要的副作用。
本发明所基于的技术问题是主要通过提供一种新的与脂质连接的寡糖(以下有时简称为脂质连接寡糖，缩写为LLO)翻转酶活性物(LLO翻转酶活性)而得到解决的。所述新的翻转酶活性物主要特征在于，其能够高效地翻转含有包含一个甘露糖残基的多糖结构特别是Man1GlcNAc2的LLO；能够高效地翻转含有包含两个甘露糖残基的多糖结构特别是Man2GlcNAc2的脂质连接寡糖；还能够高效地并且尤其高活性地翻转含有包含三个甘露糖残基的多糖结构特别是Man3GlcNAc2的脂质连接寡糖。
本发明提供了一种与已知的翻转酶活性物特别是Rft-1型活性物相反的新型“LLO翻转酶活性物”，其对于所要被翻转的寡糖基结构显示出“松弛”的特异性。不希望受理论的束缚，已知的翻转酶，例如低级真核生物的之前已经被表征的翻转酶活性物，对于要被翻转的脂质连接寡糖的特定多糖结构显示出很高的特异性。更特别地，Rft-1型活性物(同义词：YBL020W；Man5GlcNAc2-PP-Dol翻转酶)主要能够翻转包含五个甘露糖残基特别是Man5GlcNAc2多糖结构的脂质连接寡糖，但基本不能翻转包含Man1GlcNAc2多糖结构的脂质连接寡糖。
本文中所述术语“高效”主要是指酶活性或转移活性以足以实现本发明所述的范围和目标内的宿主细胞的技术目的的数量或比例呈现。例如，据认为，“高效”的转移或合成不是类似于或反映为了制造本发明所述的糖蛋白而在宿主细胞中进行的酶合成级步骤中的化合物流动中的主要限速步骤。
本发明还通过提供一种修饰或基因工程细胞或宿主细胞，特别是一种包含和表达所述新型脂质连接寡糖翻转酶活性物的真核细胞，解决了其潜在的技术问题。
发明人惊奇地发现，有可能提供所述对于要被翻转的脂质连接寡糖的多糖结构具有松弛的特异性的新型“LLO翻转酶”。该新型LLO翻转酶有利地使得能够在细胞内的细胞器官膜特别是内质网膜上进行糖基化加工的基因工程。
根据本发明的第一个方面，提供了一种具有松弛的特异性的新型LLO翻转酶，其可用作一种在宿主细胞中修饰和控制糖基化的有价值的手段。在优选实施方案中，将所述宿主细胞的修饰与在膜的胞质面和/或细胞器的腔面构建LLO结构的过程中的至少一种或多种遗传修饰相结合(见图1)。
在更优选的实施方案中，在所述构建过程末期，由细胞器介导的向新生多肽进行寡糖基转移时，这些修饰进一步与寡糖基转移酶的遗传修饰相结合。这些修饰的复合体系有利地使得能够提供新修饰的宿主细胞，其尤其能够在细胞内的细胞器更特别是内质网中，具体地合成包含1、2或3个甘露糖残基的多糖结构，特别是Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2。
在本发明的一个优选方面，所述细胞被进一步修饰来使其缺乏或具有被抑制、减少或耗尽的一个或多个定位于细胞器或内质网的糖基转移酶活性物，特别是甘露糖基转移酶活性物，并且更特别是来替换表达异源糖基转移酶活性物及其他为蛋白质的杂交或复合N-糖基化所必需的酶。
根据本发明的第二个方面，提供了一种细胞，该细胞被替代性地或附加性地修饰以包含或表达一个或多个定位于细胞器或内质网的修饰、特别是异源的寡糖基转移酶(OT)活性物，所述寡糖基转移酶(OT)活性物对于被从LLO转移到蛋白质的多糖结构具有松弛的特异性。特别地，此类寡糖基转移酶对Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2多糖结构的转移活性高。在本文中，术语“高”意味着Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2将被转移至新生蛋白质中的至少20％，至少40％，至少60％，优选至少80％，最优选至少90％。所述细胞的特征可以进一步在于：所述细胞包含一个或多个编码寡糖基转移酶活性物的核酸分子，特征在于所述寡糖基转移酶活性物不优先转移Glc3Man9GlcNAc2到蛋白质，但能够转移除Glc3Man9GlcNAc2之外的寡糖到蛋白质，优选带有1到9个甘露糖残基的寡糖，最优选为Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2。更特别地，所述细胞的特征在于，所述寡糖基转移酶活性物不仅转移Glc3Man9GlcNAc2到蛋白质，还能够高效地转移除Glc3Man9GlcNAc2之外的寡糖到蛋白质，优选带有1到9个甘露糖残基的寡糖(Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2，Man3GlcNAc2，Man4GlcNAc2 Man5GlcNAc2，Man6GlcNAc2，Man7GlcNAc2，Man8GlcNAc2 Man9GlcNAc2)，最优选为Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2和/或Man3GlcNAc2。
更特别地，所述寡糖基转移酶(OT)活性物是一个单独的单位或原生型寡糖基转移酶，其以一个单独蛋白质单位的形式产生寡糖基转移酶活性。在一个更特别的实施方案中，所述寡糖基转移酶(OT)活性物来源于原生动物体，即原生动物寡糖基转移酶(POT)。这一方案的所述细胞优选的特征进一步在于，所述原生动物寡糖基转移酶活性物来源于弓形虫(Toxoplasma gondii(Tg))，硕大利什曼虫(Leishmania major(Lm))；婴儿利什曼虫(Leishmania infantum(Li))，巴西利什曼虫(Leishmania braziliensis(Lb))，墨西哥利什曼虫(Leishmania Mexicana(Lmx))，杜氏利什曼虫(Leishmania donovani(Ld))，利什曼虫圭亚那亚种(Leishmania guyanensis(Lg))，热带利什曼虫(Leishmania tropica (Lt))，克氏锥虫(Trypanosoma cruzi(Tc))，及布氏锥虫(Trypanosoma brucei(Tb))。本发明还涉及与所述POT有关或来源于所述POT的同源或人造结构，其功能是在细胞中产生POT活性。
在本发明的一个特别方面，所述细胞被进一步修饰而使其缺乏或具有被抑制、减少或耗尽的一个或多个定位于高尔基体的甘露糖基转移酶活性物。
本发明所述的细胞优选包含一个或多个核酸分子，所述核酸分子编码一个或多个糖蛋白，特别是异源和重组糖蛋白，并且能制造所述糖蛋白或由一个或多个所述糖蛋白构成的组合物。本发明还提供了制造所述糖蛋白或糖蛋白组合物的方法或工艺，其中所述方法的主要特征在于，提供并使用本发明所述的细胞来制造所述糖蛋白。本发明还提供了可利用本发明所述细胞制造的或利用本发明所述细胞制造的糖蛋白，特别是新的糖蛋白组合物。
根据本发明所述的细胞，与该宿主细胞未经修饰的野生型菌株相比，Man1至Man3型脂质连接寡糖的腔内浓度更高。特别地，腔内浓度增加至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，70％，或90％，更特别地，增加至少100％，200％，500％，700％，1000％，1500％，2000％或更多。因此，与该宿主细胞未经修饰的野生型菌株相比，所述细胞表现出糖基化效率提高。特别地，尤其是对于基于Man3的结构，糖基化率提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，70％，或90％，更特别地，提高至少100％，200％，500％，700％，1000％，1500％，2000％或更多。
关于内质网敲除突变株，即在内质网中具有被修饰的糖基化特别是采用alg修饰途径的菌株，与未经修饰的内质网敲除突变株相比，根据本发明方法修饰的此类突变株表现出了生长率增加和/或温度敏感性降低。特别地，内质网敲除突变株中的生长率增加至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，70％，或90％，更特别地，增加至少100％，200％，500％，700％，1000％，1500％，2000％或更多。
本发明的一个特别方面涉及一种分离的脂质连接寡糖翻转酶及编码所述翻转酶的分离的核酸分子。根据本发明所述的翻转酶是一种包含至少一个跨膜域及至少一个细胞内膜的定位序列的蛋白质，并且是膜结合的。所述翻转酶的进一步特征在于能跨膜翻转脂质连接寡糖的Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2，或Man3GlcNAc2结构，例如将所述Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2，或Man3GlcNAc2结构从所述细胞器的胞质面翻转至腔面。根据下文进一步描述的方法可分离出所述脂质连接寡糖翻转酶。本发明进一步涉及用于在细胞中表达所述翻转酶活性物的表达盒及表达载体。
本发明更特别的方面涉及所述脂质连接寡糖翻转酶的用途，优选将其与对多糖结构具有松弛特异性的寡糖基转移酶，例如特别是原生动物寡糖基转移酶(POT)结合使用，或者涉及本发明所述的任意一种细胞在制造糖蛋白或包含这种糖蛋白的组合物方面的用途。本发明的其他方面涉及由包含本发明所述细胞的试剂盒制造的糖蛋白及该试剂盒，和它们在制造所述糖蛋白中的应用。
更特别地，在第一个方面，本发明提供了一种细胞或宿主细胞，所述细胞或宿主细胞被修饰以表达脂质连接寡糖翻转酶活性物，所述翻转酶活性物能高效地将包含1至3个甘露糖残基的所有脂质连接寡糖从胞内细胞器的胞质面翻转至腔面。
在本发明的一个特别方面，所述细胞的特征还在于，所述脂质连接寡糖翻转酶具有高效翻转脂质连接寡糖的活性，所述脂质连接寡糖选自由Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2和Man3GlcNAc2组成的组。
在本发明的一个优选方面，所述细胞的特征还在于，所述脂质连接寡糖翻转酶活性物由一个或多个核酸分子的表达来赋予，所述核酸分子选自：
a)包含下述一个或多个序列或者由下述一个或多个序列组成的核酸分子：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，及SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，及SEQ ID NO：29；
b)包含下述一个或多个序列的编码聚氨基酸的核酸分子：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14；SEQ ID NO 16及SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，及SEQ ID NO：30；及
c)a)或b)所述的核酸分子的片段、变体、类似物或衍生物。
如以上任一方面中所述的细胞，其特征还可以在于，所述细胞器为内质网(ER)。
如以上任一方面中所述的细胞，其特征还可以在于，所述细胞包含至少一种编码异源(糖)蛋白的核酸，并且优先表达所述(糖)蛋白。
所述细胞的特征还在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Rft-1型脂质连接寡糖翻转酶活性物。优选地，此方面的所述细胞的特征还在于，所述Rft-1型脂质连接寡糖翻转酶的特征在于，其对带有少于5个甘露糖残基的脂质连接寡糖的翻转活性小于其对带有5个甘露糖残基的脂质连接寡糖的翻转活性。更特别地，所述Rft-1型脂质连接寡糖翻转酶的特征在于，其对带有少于5个甘露糖残基的脂质连接寡糖的翻转活性低于其对带有5个甘露糖残基的脂质连接寡糖的翻转活性，其中，“小于”是指，与带有5个甘露糖残基的脂质连接寡糖的数量相比，小于其10％，20％，50％，80％的带有少于5个甘露糖残基的脂质连接寡糖被翻转。
该特别方案中所述的细胞进一步优选的特征在于，所述细胞为rft1基因或rft1同源基因的敲除突变株。
进一步地，所述细胞的特征还可以在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的一个或多个定位于内质网的糖基转移酶活性物。进一步优选地，所述细胞的特征在于，所述定位于内质网的糖基转移酶为甘露糖基转移酶。
进一步地，所述细胞的特征还可以在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的一个或多个定位于内质网的脂质连接单糖(LLM)翻转酶活性物。
进一步地，所述细胞的特征还可以在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg-11型活性物。进一步优选地，所述细胞的特征还可以在于，所述细胞为alg11基因或alg11同源基因的敲除突变株。
进一步地，所述细胞的特征在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg-11型活性物，并且进一步缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的一个或多个脂质连接单糖(LLM)翻转酶活性物。进一步优选地，所述细胞的特征在于，所述细胞为alg11基因或alg11同源基因及一个或多个编码脂质连接单糖(LLM)翻转酶活性物的基因的敲除突变株。
进一步地，所述细胞的特征可以在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg11型活性物，并且进一步缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg3型活性物。进一步优选地，所述细胞的特征在于，所述细胞为alg11基因或alg11同源基因及alg3基因或alg3同源基因的敲除突变株。
进一步地，所述细胞的特征可以在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg11型活性物，并且进一步缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的β-D-甘露糖基转移酶或DPM1型活性物。进一步优选地，所述细胞的特征在于，所述细胞为alg11基因或alg11同源基因及dpm1基因或dpm1同源基因的敲除突变株。
进一步地，所述细胞的特征可以在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg2型活性物。进一步优选地，所述细胞的特征在于，所述细胞为alg2基因或alg2同源基因的敲除突变株。
进一步地，所述细胞的特征可以在于，所述细胞包含一种或多种编码寡糖基转移酶活性物的核酸分子，所述寡糖基转移酶活性物的特征在于，不优先转移Glc3Man9GlcNAc2至蛋白质，而是还能够转移除Glc3Man9GlcNAc2之外的寡糖至蛋白质，优选具有1-9个甘露糖残基的寡糖，最优选Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2，和/或Man3GlcNAc2。更特别地，所述细胞的特征在于，所述酶活性物不仅转移Glc3Man9GlcNAc2至蛋白质，还能够高效地转移除Glc3Man9GlcNAc2之外的寡糖至蛋白质，优选所述寡糖具有1-9个甘露糖残基(Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2，Man3GlcNAc2，Man4GlcNAc2 Man5GlcNAc2，Man6GlcNAc2，Man7GlcNAc2，Man8GlcNAc2，Man9GlcNAc2)，最优选Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2，和/或Man3GlcNAc2。
进一步优选地，前述方面中所述的细胞的特征在于，所述原生动物寡糖基转移酶活性物选自TbStt3Bp型活性物，TbStt3Cp型活性物，LmStt3Ap型活性物，LmStt3Bp型活性物，及LmStt3Dp型活性物。
进一步地，所述细胞的特征可以在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的一种或多种定位于高尔基体的甘露糖基转移酶。
前述方面中任一或多项所述的细胞，特别地，其特征在于，所述定位于高尔基体的甘露糖基转移酶选自Och1型活性物及Mnn甘露糖基转移酶家族，尤其是Mnn1型活性物、Mnn2型活性物、Mnn4型活性物、Mnn5型活性物、Mnn9型活性物、Mnn10型活性物及Mnn11型活性物。进一步优选地，所述细胞的特征在于，所述细胞为选自och1，mnn1，mnn2，mnn4，mnn5，mnn9，mnn10，mnn11和/或它们的同源基因中的至少一种基因的敲除突变株。
前述方面中任一或多项所述的细胞，特别地，其特征在于，所述定位于高尔基体的甘露糖基转移酶选自Ktr甘露糖基转移酶家族，尤其是Ktr1型活性物、Ktr2型活性物、Ktr3型活性物、Ktr5型活性物、Ktr6型活性物及Ktr7型活性物。进一步优选地，所述细胞的特征在于，所述细胞为选自ktr1，ktr2，ktr3，ktr4，ktr5，ktr6，ktr7和/或它们的同源基因中的至少一种基因的敲除突变株。
前述方面中任一或多项所述的细胞，特别地，其特征在于，所述定位于高尔基体的甘露糖基转移酶选自Van甘露糖基转移酶家族，尤其是Van1型活性物及Vrg4型活性物。进一步优选地，所述细胞的特征在于，所述细胞为选自van1，vrg4和/或它们的同源基因中的至少一种基因的敲除突变株。
进一步优选地，前述方面中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Mnn2型活性物，并且进一步缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Mnn5型活性物。进一步优选地，所述细胞的特征在于，所述细胞为mnn2基因或mnn2同源基因及mnn5基因或mnn5同源基因的敲除突变株。
进一步地，所述细胞的特征可以在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Och1型活性物。进一步优选地，所述细胞的特征在于，所述细胞为och1基因或och1同源基因的敲除突变株。
进一步地，所述细胞的特征可以在于，所述细胞表达一种或多种定位于高尔基体的异源酶或其催化域，优选地，所述定位于高尔基体的异源酶或其催化域选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)；
β-1，4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIII)；
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIV)；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，6-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTV)；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTVI)；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)；
α(1，6)岩藻糖基转移酶(FucT)；
β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶(ST)；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(NeuC)；
唾液酸合酶(NeuB)；
CMP-Neu5Ac合酶；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体；
UDP-半乳糖转运体；
GDP-岩藻糖转运体；
CMP-唾液酸转运体；
核苷酸二磷酸酶；
GDP-D-甘露糖4，6-脱水酶；及
GDP-4-酮-去氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶-4-还原酶。
进一步地，所述细胞的特征可以在于，所述细胞选自：包括真菌细胞在内的低级真核细胞及包括哺乳动物细胞、哺乳动物细胞系、植物细胞和昆虫细胞在内的高级真核细胞。
第三方面，本发明提供了一种或多种分离的核酸分子，其能够编码或提供本发明第一方面中所述的脂质连接寡糖翻转酶活性物。在一个优选方面，所述核酸分子的特征在于，所述分子选自本发明前述方面中任一项所述的核酸分子的一种或多种。
第四方面，本发明提供了一种用于在真核宿主细胞中表达的表达盒，包含本发明前述方面中任一项所述的任一种核酸分子的一个或多个拷贝，所述一个或多个拷贝与编码启动子的核酸分子和编码终止子的核酸分子中的至少一种核酸分子结合在一起。
在其一个优选方面，所述表达盒还包含编码本发明前述方面中任一项所述的寡糖基转移酶的核酸分子的一个或多个拷贝。
第五方面，本发明提供了一种用于真核宿主细胞转化的载体，所述载体包含选自以下拷贝中的一种或多种：本发明前述方面中任一项所述的任一种核酸分子的拷贝和本发明前述方面中任一项所述的表达盒的一个或多个拷贝。
第六方面，本发明提供了一种用于制造细胞的方法，所述细胞能够在其细胞内的细胞器如内质网中特别合成具有Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2多糖结构的脂质连接寡糖，所述方法至少包括下述步骤：
用至少一种编码脂质连接寡糖翻转酶活性物的构造或结构转化所述细胞，所述构造或结构选自：
本发明前述方面中任一项所述的核酸分子；
本发明前述方面中任一项所述的表达盒；及
本发明前述方面中任一项所述的载体；
以使得所述细胞能够表达由所述构造或结构编码的脂质连接寡糖翻转酶活性物。
在其一个优选方面，所述构造还编码寡糖基转移酶活性物，以使得所述细胞能够表达由所述结构编码的脂质连接寡糖翻转酶活性物和寡糖基转移酶活性物。
在一个或多个前述方面的优选方面，所述方法还包括在细胞内减少或耗尽以下的至少一种酶活性物的步骤，所述酶活性物选自：
Alg2型活性物；
Alg11型活性物；
Alg3型活性物；
DPM1型活性物；以及
脂质连接单糖(LLM)翻转酶型活性物。
第七方面，本发明提供了一种或多种分离的细胞，所述细胞能够在细胞内的细胞器中特别合成具有Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2和/或Man3GlcNAc2多糖结构的脂质连接寡糖，并且能够将所述多糖结构转移至在所述细胞中表达的新生蛋白质，其特征在于，所述细胞可以由或实际上由本发明前述方面中任一项所述的方法来制造。
第八方面，本发明提供了一种用于制造糖蛋白或糖蛋白组合物的方法，包括如下步骤：
提供本发明前述方面中任一项所述的细胞；
在使所述细胞内允许制造所述糖蛋白或糖蛋白组合物的条件下，于培养基中培养所述细胞；及
必要时，从所述细胞和/或所述培养基中分离所述糖蛋白或糖蛋白组合物。
第九方面，本发明提供了一种用于制造糖蛋白或糖蛋白组合物的试剂盒，包括：
本发明前述方面中任一项所述的细胞；及
培养基，用于培养所述细胞以制造所述糖蛋白。
第十方面，本发明提供了一种糖蛋白或糖蛋白组合物，其特征在于，所述糖蛋白或糖蛋白组合物的多糖结构选自：
GlcNAcMan3-5GlcNAc2，
GlcNAc2Man3GlcNAc2，
GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型
Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，
Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc，
Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型，
Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型，
NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，
NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc，
NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型，
NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型，
GlcNAc3Man3GlcNAc2，
Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2，
Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc，
NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2，及
NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc
第十一方面，本发明提供了一种宿主细胞，能够特别制造本发明第九方面所述的一种或多种糖蛋白或糖蛋白组合物。
第十二方面，本发明提供了一种糖蛋白，选自：
可由本发明前述方面中任一项所述的细胞制造的糖蛋白；
可利用本发明前述方面中任一项所述的方法制造的糖蛋白；及
本发明第十方面所述的糖蛋白。
一个优选方面为一种糖蛋白组合物，包含两种或多种第十方面所述的糖蛋白。
一个优选方面为一种或多种重组蛋白。一个优选方面为一种或多种治疗活性蛋白。
一个优选方面为一种或多种免疫球蛋白。
第十三方面，本发明提供了一种药物组合物，包含本发明前述方面中任一项所述的糖蛋白中的一种或多种糖蛋白，并且优选地，包含至少一种药学上可接受的载体或辅药(佐剂)。
第十四方面，本发明提供了一种治疗失调的方法，所述失调可通过施用本发明前述方面中任一或多项所述的糖蛋白或其组合物中的一种或多种来治疗，所述方法包括下述步骤：
给对象施用如上所述的糖蛋白或其组合物，其中，所述对象患有或疑似患有可通过施用所述糖蛋白或其组合物治疗的疾病。
附图说明
图1显示了酵母中生物合成脂质连接寡糖(LLO)途径的图示。脂质连接寡糖合成起始于内质网的外膜，当生成Man5GlcNAc2(M5)结构时，所述脂质连接寡糖被翻转进入内质网腔并完成所述脂质连接寡糖合成。所述寡糖由OT(OST)转移至蛋白质。
图2显示了来源于Δalg11突变菌株(YG1365)(图2A)及Δalg3Δalg11突变菌株(YG1363)(图2B)的[3H]-甘露糖标记的脂质连接寡糖的HPLC图，示出Man3GlcNAc2结构(M3)在YG1363中的产生。
图3显示了来源于Δalg111突变菌株(YG1365)(图3A)及Δalg3Δalg11突变菌株(YG1363)(图3B)的[3H]-甘露糖标记的蛋白连接寡糖的HPLC图。所述内质网合成的Man3GlcNAc2 LLO结构(M3)在高尔基体区室中被进一步延伸成Man4GlcNAc2(M4)及Man5GlcNAc2(M5)。
图4显示了从来源于野生型菌株(WT)(图4A)、Δalg11突变菌株(YG1365)(图4B)及Δalg3Δalg11突变菌株(YG1363)(图4C)的细胞壁蛋白质中分离的2-AB-标记N-多糖的MALDI-TOF MS谱。每个N-多糖峰在各峰下方已有注释，代表Man3GlcNAc2至Man12GlcNAc2多糖结构(M3至M12)。每个标记的结构都由2个N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)残基和各自指定数目的甘露糖组成；在m/z 1053处的峰代表M3，在m/z 1215处的峰代表M4，在m/z 1377处的峰代表M5。所述内质网合成的M3 LLO结构在高尔基体区室中被进一步延伸成M4及M5。
图5A-K列举了编码Flc2’或其片段的核苷酸序列或其转录物的氨基酸序列。(内质网定位信号以下划线印出，跨膜域以加粗字体印出)
图5A表示编码Flc2’的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)；图5B表示Flc2’转录物的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)；
图5C表示编码内质网定位信号及编码flc2’的编码区的跨膜域(TM)1至3(TM1-3)的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)；图5D表示图5C的核苷酸序列的转录物的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)；
图5E表示编码内质网定位信号及编码flc2’的编码区的跨膜域(TM)1至2(TM1-2)的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)；图5F表示图5E的核苷酸序列的转录物的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)；
图5G表示编码内质网定位信号及编码flc2’的编码区的跨膜域(TM)2至4(TM2-4)的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)；图5H表示图5G的核苷酸序列的转录物的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)；
图5I表示编码内质网定位信号及编码flc2’的编码区的跨膜域(TM)3至4(TM3-4)的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)；图5K表示图5I的核苷酸序列的转录物的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)；
图5L表示代表flc2’的内源性启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO：61)；下划线部分标识了起始密码子。
图6A显示了将野生型菌株与携带空载体、Rft1(oe RFT1)或Flc2’表达质粒(oe Flc2’)的Δrft1突变菌株相比较的斑点分析。每排由指定菌株的一系列稀释物组成。质粒运载的Flc2’可以补足Rft1缺失；图6B显示了将野生型菌株与Δalg11突变菌株相比较的各自的斑点分析；图6C显示了将野生型菌株与Δalg2-1突变菌株相比较的各自的斑点分析。
图7A及B显示了携带空载体、Rft1、Flc2’、包含跨膜域3(TM 3)、跨膜域1和3(TM1-3)或跨膜域3和4(TM 3-4)的Flc2’片段或Flc2表达质粒的Δrft1突变菌株的斑点分析。每排由指定菌株的一系列稀释物组成。质粒运载的Flc2’可以补足Rft1缺失。相反，全长Flc2的超表达(oe Flc2)不能补足生长缺陷，因此引起对内源性翻转酶活性物缺乏的补偿。
图7C显示了羧肽酶Y在野生型酵母菌株或携带空质粒(YEp352)或用于Rft1的超表达的质粒中任一种及Flc2’翻转酶的Δrft1突变菌株中的N-糖基化。代表CPY的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的带以-1，-2，-3及-4显示。YEp26.2代表在HCSS中鉴定的初始克隆。
图8显示了来源于Δrft1突变菌株的[3H]-甘露糖标记的脂质连接寡糖的HPLC图。图8A：携带空载体YEp352的Δrft1突变菌株；图8B：携带Rft1表达构造的Δrft1突变菌株；图8C：携带Flc2’表达构造的Δrft1突变菌株。
图9描述了羧肽酶Y在携带空质粒(YEp352)、用于Flc2’的超表达的质粒或Rft1翻转酶的野生型酵母或Δalg3Δalg11突变菌株中的N-糖基化结果。
图10描述了羧肽酶Y(CPY)和β-1，3-葡聚糖转移酶(Gas1p)在野生型酵母(YG1509)或表达Flc2’翻转酶、LmStt3D、或由Flc2’翻转酶和LmStt3D组成的组合的突变酵母株YG1365(Δalg11)及YG1363(Δalg3Δalg11)中N-糖基化的蛋白免疫印迹(Western blot)结果。指出了代表CPY及Gas1p的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的带。
图11描述了羧肽酶Y在携带空载体(例如，YEp352)或用于Flc2’、POT或Flc2’和POT的超表达的质粒的Δalg11突变菌株中的N-糖基化。代表CPY的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的带以-1，-2，-3及-4显示。
图12显示了根据本发明所述的用于在以酵母为例的低级真核生物中的N-连接糖基化的优选复合系统的图示。更详细地，脂质连接寡糖的合成发生在内质网的胞质面；所述合成通过由Sec59p将磷酸残基向多萜醇转移而发起，并且通过数个单糖转移酶在内质网胞质面和腔面的连续动作来延伸寡糖供体，最终形成脂质连接的Glc3Man9GlcNAc2。脂质连接的Glc3Man9GlcNAc2作为内源性多亚基酵母寡糖基复合物(Ost复合物)的底物；在复合系统中，alg3及alg11基因缺失(Δalg11，Δalg3)导致脂质连接Man3GlcNAc2的产生。剩余的转移酶仍然存在于细胞中，但是，对脂质连接GlcNAc2Man3底物是无活性的。添加了本发明所述的新的脂质连接寡糖翻转酶(Flc2’)及原生动物寡糖基转移酶(POT硕大利什曼虫Stt3D)。在一个可替代的实施方案中，脂质连接Man3GlcNAc2的产生是由dpm1基因的缺失而赋予的，所述基因产物在内质网膜的胞质面制造脂质连接甘露糖(DPM1)。在一个可替代的实施方案中，脂质连接Man3GlcNAc2是由单糖翻转酶的缺失而产生的，所述翻转酶将多萜醇连接的甘露糖翻转入内质网腔(星号)。脂质连接甘露糖为定位于内质网腔的寡糖基转移酶提供供体。通过与alg11突变结合，这种细胞还能制造脂质连接Man3GlcNAc2。多余未用的转移酶、翻转酶(Rft1)、酵母Ost复合物的组分及未合成的结构以灰体示出。
图13描述了一个优选实施方案Flc2’表达质粒YEp352Flc2’的核苷酸序列(SEQ ID NO：31)。
图14描述了另一个优选实施方案LmStt3D和Flc2’共表达质粒pAX306f的核苷酸序列(SEQ ID NO：32)。
图15A显示了酵母Flc2蛋白的截短译本Flc2’(跨膜域1-4)的图示。图15B描述了Δrft1突变菌株的斑点分析，所述突变菌株或携带空载体(v.c.)，或携带用于Flc2’(oe Flc2*)或截短部分(TMD1-2，TMD1-3，TMD3-4)的超表达的载体、或Flc2’的单个跨膜域1，3或4(TMD1，TMD3，TMD4)。带有跨膜域3和4(TMD3-4)及跨膜域4(TMD4)的截短部分被露出以补足Rft1的缺失至与全长Flc2’(＝跨膜域1至4)相似的水平。图15C描述了羧肽酶Y(CPY)在Δrft1突变酵母菌株中的N-糖基化结果，所述突变菌株或携带空载体(v.c.)，或携带质粒，所述质粒用于Flc2’的超表达(oe Flc2*)或仅包含Flc2’跨膜域4(Flc2*-TMD4)的Flc2’的截短译本的超表达。指出了代表CPY的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的带。跨膜域4(Flc2*-TMD4)的超表达能单独补足Δrft1突变酵母菌株中的糖基化缺陷。
图16A描述了羧肽酶Y(CPY)在Δrft1突变酵母菌株中的N-糖基化结果，所述突变菌株或携带空载体(v.c.)，或携带用于Rft1(oe Rft1)，Flc2’(oe Flc2*)或内源性Flc2(oe Flc2)的超表达的质粒。指出了代表CPY的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的带。Flc2的超表达不能补足Rft1缺失时被观察到的低糖基化表型。图16B描述了携带空载体(v.c.)、用于Rft1(oe Rft1)，Flc2*(oe Flc2*)或Flc2的超表达的质粒的Δrft1细胞的生长分析。该生长分析证实了Flc2*能补足Rft1缺陷，及全长Flc2不能补足Rft1缺陷。
图17ABC显示了[3H]-甘露糖标记的脂质连接寡糖的HPLC图，该脂质连接寡糖是从携带空载体(v.c.)(图17A)的Δalg11突变菌株(YG1365)、携带用于Rft1(oe Rft1)(图17B)或Flc2’(oe Flc2*)(图17C)的超表达的质粒的Δalg11突变菌株(YG1365)中分离的。检测到的脂质连接寡糖物种为Man2GlcNac2(Man2，M2)，Man3GlcNac2(Man3，M3)，Man5GlcNac2(Man5，M5)，Man6GlcNac2(Man6，M6)，及Man7GlcNac2(Man7，M7)。M2及M3寡糖定位于内质网膜的胞质面(cytopl.)，M5至M7寡糖定位于内质网膜的腔面(lumenal)。细胞质的脂质连接寡糖物种之于内腔的脂质连接寡糖物种的相对量可用于表示被表达蛋白质的翻转酶活性物。
图18A描述了携带空载体(v.c.)、携带用于Rft1(oe Rft1)或Flc2’(oe Flc2*)的超表达的质粒的Δalg11Δalg3突变酵母菌株的生长分析。图18B描述了各自细胞的斑点分析。所述生长分析及斑点分析显示出Flc2’或Rft1的超表达能够改善Δalg11Δalg3突变酵母菌株的生长。图18C描述了羧肽酶Y(CPY)在Δalg11Δalg3突变酵母菌株中的N-糖基化结果，所述突变菌株或携带空载体(v.c.)，或携带用于Rft1(oe Rft1)或Flc2’(oe Flc2*)的超表达的质粒。指出了代表CPY的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的带。Rft1或Flc2’的超表达改善了CPY的N-糖基化。
图19A描述了携带空载体(v.c.)、携带用于Rft1(oe Rft1)或Flc2’(oe Flc2*)的超表达的质粒的Δalg11突变酵母菌株的生长分析。图19B描述了各细胞的斑点分析。所述生长分析及斑点分析显示出Flc2’或Rft1的超表达能够改善Δalg11突变酵母菌株的生长。图19C描述了羧肽酶Y(CPY)在Δalg11突变酵母菌株中的N-糖基化结果，所述突变菌株或携带空载体(v.c.)，或携带用于Rft1(oe Rft1)或Flc2’(oe Flc2*)的超表达的质粒。指出了代表CPY的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的带。Rft1或Flc2’的超表达改善了CPY的N-糖基化。
图20A显示了具有温度敏感性Alg2蛋白的alg2-1菌株中的脂质连接寡糖合成的图示。Alg2催化甘露糖向Man1GlcNAc2(M1)结构的两步连续添加而产生Man2GlcNAc2(M2)及Man3GlcNAc2(M3)。该突变降低Alg2活性，所述Alg2反过来减少大于M1的脂质连接寡糖种类的合成。但是，Alg2的剩余活性足以维持常规的脂质连接寡糖合成，从而导致Glc3Man9GlcNAc2结构的产生。M1和M2结构的翻转与由Alg2催化的延伸反应互相竞争。如果M1和M2结构被翻转至内质网腔内，这些结构在内质网腔中将不作为甘露糖基转移酶的底物，并且不被进一步延长。最终，来源于不同脂质连接寡糖供体的寡糖被转移到蛋白质的N-糖基化共有序列的Asn残基上。图20B显示了MALDI-TOF质谱的图示，具有预期的峰Man1GlcNAc2(M1)，Man2GlcNAc2(M2)和高甘露糖结构Man8GlcNAc2至Man12GlcNAc2(M8-M12)。根据NLO种类的峰强度，可以计算出每个结构的相对丰度。M1类的相对增加表明M1的翻转在由Alg2催化的Man1GlcNAc2(M1)的延伸反应中占优势地位。
图21A描述了羧肽酶Y(CPY)在Δalg11突变酵母细胞中的N-糖基化结果，所述突变细胞携带用于Flc2’(oe Flc2*)或原生动物寡糖基转移酶POT(oe POT)及由Flc2’和POT组成的组合(oe Flc2* & POT)的超表达的载体。指出了代表CPY的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的带。图21B显示了羧肽酶Y(CPY)在Δalg11Δalg3突变酵母细胞中的N-糖基化结果，所述突变细胞携带用于Flc2’(oe Flc2*)、POT(oe POT)及由Flc2’和POT组成的组合(oe Flc2* & POT)的超表达的载体。指出了代表CPY的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的带。POT和Flc2’的共表达在Δalg11及Δalg11Δalg3这两种酵母菌株中均抑制低糖基化表型向更高程度变化。
图22AB描述了从来源于Δalg3Δalg11酵母突变菌株(图22A)及Δalg11Δalg3Δmnn1酵母突变菌株(图22B)的细胞壁蛋白质中分离的2-AB-标记N-多糖的MALDI-TOF MS谱。每个N-多糖峰在各自峰上面进行了注释，代表Man3GlcNAc2(M3)至Man6GlcNAc2(M6)。除甘露糖之外，每个指明的结构包含2个附加的Gn残基。在m/z 1053处的峰代表M3，在m/z 1215处的峰代表M4，在m/z 1377处的峰代表M5，在m/z 1539处的峰代表M6。所述内质网合成的Man3GlcNAc2 LLO结构在高尔基体区室中被进一步延伸成Man4GlcNAc2、Man5GlcNAc2及非常少量的Man6GlcNAc2。正如Man5峰大幅降低所显示的，mnn1的缺失部分地破坏了内质网合成的Man3GlcNAc2结构在高尔基体区室中的加工。
具体实施方式
本发明主要涉及具有被修饰的脂质连接寡糖的宿主细胞，其可以通过一组糖基转移酶、糖转运体及甘露糖苷酶的异源表达被进一步修饰，而成为制造哺乳动物例如人的治疗糖蛋白的宿主株。所述方法提供了一种基因工程的宿主细胞，其能被用于表达及靶向参与糖基化的任何所需基因。创造或挑选出具有被修饰的脂质连接寡糖的宿主细胞。在所述基因工程宿主细胞中形成的N-多糖具有Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2，和/或Man3GlcNAc2核心结构，然后所述核心结构可以通过一种或多种酶例如糖基转移酶、糖转运体及甘露糖苷酶的异源表达被进一步修饰，来制造类人糖蛋白。对于治疗用蛋白的制造，该方法可以适用于以基因工程形成细胞系，在所述细胞系中可以获得任何期望的糖基化结构。
除非另有定义，本发明中所使用的科技术语应当具有本领域普通技术人员所普遍理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数词应当包括复数，且复数词应当包括单数。本发明所述的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法来实现。一般来说，本发明所使用的命名法及所述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学、蛋白质与核酸化学和杂交中的技术均为本领域公知和常用的。除非另有指明，本发明所述的方法和技术通常根据本领域公知的及本说明书中引用和讨论的各种概括的和具体的参考文献中所述的常规方法来实现。参见，例如，Sambrook等的《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约州冷泉港(1989))；Ausubel等的《Current Protocols in Molecular Biology》(Greene Publishing Associates(1992年及2002年的添加本))；《Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual》(Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约州冷泉港(1990))；《Introduction to Glycobiology》(Maureen E.Taylor，Kurt Drickamer，Oxford Univ.Press(2003))；《Worthington Enzyme Manual》(Worthington Biochemical Corp.，新泽西州弗里霍尔德)；《Handbook of Biochemistry：Section A Proteins》(第I卷，1976年，CRC Press)；《Handbook of Biochemistry：Section A Proteins》(第II卷，1976年，CRC Press)；《Essentials of Glycobiology》(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999))。对于本文中所用的命名法及所述的生物化学与分子生物学的实验过程和技术，均为本领域公知和常用的。
提供新的脂质连接寡糖翻转酶
在本发明正文中，“脂质连接寡糖翻转酶活性物”或“翻转酶”被定义为将脂质连接寡糖(LLO)尤其是多萜醇连接寡糖从胞质面穿过膜向细胞器腔面移位的功能，所述脂质连接寡糖被结合在细胞内的细胞器的膜上，主要是被结合在该膜的胞质面。具体而言，所述细胞内细胞器为内质网(ER)。该脂质连接寡糖的移位过程的特征在于“翻转”。在一个优选实施方案中，所述翻转酶活性物以内质网为靶点。不希望受理论的束缚，术语“翻转酶”和“翻转”还指用于支持另一种潜在翻转酶蛋白以产生翻转酶活性的支持作用。
已经惊奇地发现，所述新的脂质连接寡糖翻转酶是可以分离并在细胞的糖基化级联中具有功能的，并且它们能够补偿内源性脂质连接寡糖翻转酶活性物例如Rft1型活性物的减少或缺乏。此外，还惊奇地发现，本发明所述的脂质连接寡糖翻转酶活性物能够在改变的糖基化级联中起作用。所述改变包括产生具有较少量寡糖的脂质连接寡糖，例如，包含少于5个甘露糖残基的脂质连接寡糖，并将其跨过内质网膜翻转。在野生型细胞中制造或翻转这样的脂质连接寡糖结构通常是不占优势的。已经惊奇地发现，所述新的脂质连接寡糖翻转酶在跨过细胞内的细胞器膜翻转包含少于5个甘露糖残基的脂质连接寡糖尤其是Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2，Man3GlcNAc2，或Man4GlcNAc2的脂质连接寡糖方面具有高效的活性。所述新的脂质连接寡糖翻转酶在翻转包含Man5GlcNAc2的脂质连接寡糖中显示出高活性，在翻转包含Man4GlcNAc2的脂质连接寡糖中显示出高活性，在翻转包含Man3GlcNAc2的脂质连接寡糖中显示出高活性，在翻转包含Man3GlcNAc2的脂质连接寡糖中仍显示出高活性，在翻转包含Man2GlcNAc2的脂质连接寡糖中显示出高活性，并且在翻转包含Man1GlcNAc2的脂质连接寡糖中仍显示出高活性。发现所述新的脂质连接寡糖翻转酶对于要被翻转的寡糖基结构显示出松弛的特异性。
不希望受理论的束缚，本文所用的术语“活性”，特别是对于脂质连接寡糖翻转酶而言，涉及具体对要被转运或合成的特定化合物或分子进行转运、转移或合成的比率。对于分子的跨膜转运，通过估算要被转运通过生物屏障，尤其是被翻转通过或透过细胞内的细胞器膜的具体分子或结构的净通量来估算以转运率表示的转运活性。所述净通量具体通过流入率和流出率来计算。据发现，所述净通量在很大程度上可以取决于被转运分子的分子结构。净通量及相应的转运活性对于每个被转运或翻转的单独结构可以是特定的。不希望受理论的束缚，可以通过确定混入存在于内质网胞质面的脂质连接寡糖的带标记甘露糖的数量，并以该数量除以混入脂质连接寡糖的带标记甘露糖(优选[3H]-甘露糖)的总数来计算所述翻转酶活性。可替代地，所述脂质连接寡糖翻转酶活性可以使用“人工”囊泡来确定。例如，Rft1型脂质连接寡糖翻转酶对具有Man5GlcNAc2结构的脂质连接寡糖的翻转活性很高，但发现其对于具有Man1GlcNAc2结构的脂质连接寡糖的翻转活性即使有的话也很低。因此，Rft1型脂质连接寡糖翻转酶对翻转Man5GlcNAc2结构显示出很高的特异性。相反，本发明所述的新的脂质连接寡糖翻转酶对具有Man1GlcNAc2结构的脂质连接寡糖的翻转活性很高，并且对具有Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2结构的脂质连接寡糖的翻转活性也很高。本发明所述的新的脂质连接寡糖翻转酶显示出对特定多糖结构特异性较低，因此显示出松弛的或低特异性的翻转酶活性。
可以通过采用附加的实施例中详细描述的高拷贝抑制基因筛选(HCSS)方式分离出(在一个优选实例中，是从酵母细胞中分离出)编码本发明所述的脂质连接寡糖翻转酶的基因或“人工”基因。简而言之，在高拷贝抑制基因筛选中可以使用其内源性脂质连接寡糖翻转酶已被失活的细胞，例如，携带rft1基因缺失的酵母细胞。然后，所述细胞可以用基因组DNA文库，例如基因组酵母DNA文库转化，从高拷贝质粒例如也携带可选择的标记的Yep352中被表达。在糖基化级联中有缺陷的细胞将产生低糖基化蛋白，并且温度和渗透敏感性较高。因此，检测高拷贝抑制基因筛选中获得的选定细胞在不存在渗透稳定剂例如山梨醇时的生长能力。然后进一步分析阳性菌落的温度敏感性及使所表达的蛋白糖基化的能力。
本发明还涉及一种或多种分离的核酸，该核酸编码具有新的脂质连接寡糖翻转酶活性的脂质连接寡糖翻转酶多肽的；包括所述分离的核酸的载体及包含所述载体的细胞。
在一个具体实施方案中，本发明提供了一种“人工”的新的脂质连接寡糖翻转酶活性物，其为flc2’的转录物。所述“人工”基因flc2’来源于flc2基因(同义名：YAL053W；定位于酵母1号染色体上；碱基45900-48251)。所述Flc2转录物是推定的FAD转运体，其定位于内质网膜并且具有使FAD进入到内质网中的功能。内源性Flc2蛋白质不作为翻转酶起作用并且不转运脂质连接寡糖。
所述“人工”基因flc2’主要是flc2的3’端的截短译本。flc2’的全部序列列于SEQ ID NO：1(图5A)中，并代表酵母1号染色体，碱基45900-47222。所述flc2’的转录物产生由452个氨基酸组成的蛋白质，其包含4个完整的跨膜域和1个截去五分之一的跨膜域(SEQ ID NO 2；图5B)。C末端的从氨基酸442至452的11个氨基酸从克隆过程中产生。意想不到的是，Flc2’即Flc2的N末端片段，能够在Δrft1突变菌株中补偿缺乏的翻转酶活性，尽管全长Flc2本身根本不显示翻转酶活性。更特别的是，据发现，所述Flc2’翻转酶对Man1结构表现出很大的亲和力，并以高比例(速率)翻转所述Man1结构。
本发明提供了编码本发明所述的新的脂质连接寡糖翻转酶的数个“人工”基因或基因构造。这些“人工”基因或基因构造全部来源于flc2基因。具体地说，提供了“人工”flc2’的片段及这些片段的一个或多个构造物。本发明不限于这些序列。本发明特别地涉及显示出本文所表征和描述的新的脂质连接寡糖翻转酶型功能的“人工”基因或基因构造。发明人惊奇地发现，定位于细胞内的细胞器膜的并且翻转脂质连接寡糖进入细胞器内腔的“人工”跨膜蛋白能被翻译或是可获得的。这些蛋白显示出所述新的脂质连接寡糖翻转酶活性，其主要特征在于对本文所述的脂质连接寡糖的多糖结构具有松弛特异性。
经过本文所提出的开创性“原理证明”之后，主要是以来源于flc2的“人工”基因或基因构造的形式，本领域技术人员通过简单地继续采取如下所述的筛选方法，可以很容易地提供编码脂质连接寡糖翻转酶类似功能的“人工”基因或基因构造。
可替代地或附加地，本发明提供了基于并且尤其包括rft1基因或多核苷酸的基因构造，所述多核苷酸编码Rft1或Rft1型活性物以在细胞中产生脂质连接寡糖翻转酶活性，尤其是在通过超表达rft1的方式Rft1以高浓度存在的经过基因修饰的细胞中；本发明还提供了制造所述细胞的手段。
在一个优选实施方案中，所述脂质连接寡糖翻转酶活性体现在一种或多种蛋白或类蛋白结构上，例如多单元转运体上。
根据本发明，提供了一种分离的或“基本上纯的”核酸分子或其功能性类似物，其能够编码或提供如上文所述的翻转酶活性物。在优选实施方案中，所述核酸分子选自如下所述的核酸分子中的一种或多种。
术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指在长度上至少有10个碱基的核苷酸的聚合物形式。所述术语包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA或合成DNA)和RNA分子(例如，mRNA或合成RNA)，以及含有非天然核苷酸类似物、非原有核苷酸间的键或同时含有两者的DNA或RNA的类似物。所述核酸可以处于任何一种拓扑构象。例如，核酸可以是单链的、双链的、三链的、四链的、部分双链的、分支的、发夹结构的、环状的或是处于挂锁构象。所述术语包括单链和双链形式的DNA。
分离的或“基本上纯的”核酸或多核苷酸(例如，RNA，DAN或混合聚合体)是一种基本上与在其天然宿主细胞中自然伴随原有多核苷酸存在的其他细胞成分例如，核糖体、聚合酶，及其自然结合的基因组序列分离开的核酸或多核苷酸。所述术语包含(1)已从其天然存在环境中脱离的核酸或多核苷酸，(2)不与多核苷酸的全部或一部分结合的核酸或多核苷酸，其中，所述“分离的多核苷酸”是在自然界中发现的，(3)可操作地连接至在自然状态下未连接的多核苷酸的核酸或多核苷酸，或(4)在自然状态下不存在的核酸或多核苷酸。
所用的术语“分离的”也可以指重组或克隆DNA分离体、化学合成的多核苷酸类似物或利用异源系统生物合成的多核苷酸类似物。但是，“分离的”不一定要求所述核酸或多核苷酸实体上从其原来环境中脱离。例如，生物体基因组中的以下内源性核酸序列被视为“分离的”：如果异源序列(即，与该内源性核酸序列不是自然相邻的序列)被置于邻近所述内源性核酸序列的位置而导致该内源性核酸序列的表达改变。举例来说，非原有启动子序列可以被替换(例如，通过同源重组)成为人细胞基因组中基因的原有启动子，从而导致该基因具有被修改的表达模式。因为所述基因可以与天然位于其侧面的至少一些序列中分开，因而成为“分离的”。如果核酸包含任何对基因组中的相应核酸不自然发生的修饰，其也被认为是“分离的”。例如，如果一种内源性编码序列包括插入序列、缺失序列或通过“人工方式”例如通过人为干预诱导的点突变，则该内源性编码序列被认为是“分离的”。“分离的核酸”还包括在异源部位整合入宿主细胞染色体的核酸，以游离基因存在的核酸构造。此外，“分离的核酸”可以基本上不含其他细胞材料，或当采用重组技术制造时可以基本不含培养基，或当采用化学合成时可以基本上不含化学前体或其他化学品。
本发明的一个主要方面涉及来源于flc2且编码所述脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子。在此方面的优选实施方案中，所述核酸分子至少携带内质网定位信号的序列和一种或多种跨膜区的序列。
在优选实施方案中，宿主细胞中的所述脂质连接寡糖翻转酶活性物通过一种或多种核酸分子的表达来提供，所述核酸分子选自：
包含下述一种或多种序列的或者由下述一种或多种序列组成的核酸分子：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，及SEQ ID NO：17；
包含下述一种或多种序列的或者由下述一种或多种序列组成的编码聚氨基酸的核酸分子：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14；SEQ ID NO 16及SEQ ID NO：18；
包含下述一种或多种序列的或者由下述一种或多种序列组成的核酸分子：SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，及SEQ ID NO：29，特别地，当被融合于编码内质网定位信号的一种或多种核酸分子时，优选选自SEQ ID NO：19及编码包含HDEL基序和/或KKxx基序的聚氨基酸序列的核苷酸序列中的一种。
包含下述一种或多种序列的或者由下述一种或多种序列组成的编码聚氨基酸的核酸分子：SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，和SEQ ID NO：30，特别是还包含一种或多种内质网定位信号的核酸分子，优选选自SEQ ID NO：20及包含HDEL基序和/或KKxx基序的聚氨基酸序列中的一种；及
上述核酸分子的提供本发明脂质连接寡糖翻转酶活性的片段、变体、类似物或衍生物。
本文所用的术语“片段”是指多核苷酸的一个节段。片段可具有末端(5′-或3′-端)和/或内部缺失。一般来说，多核苷酸的片段在长度上具有至少4个核苷酸，具体而言，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少12个，至少15个，至少18个，至少25个，至少30个，至少35个，至少40个，至少50个，至少60个，至少65个，至少70个，至少75个，至少80个，至少85个，至少90个，至少100个或更多个核苷酸。
本文所用的术语“缺失”是指核苷酸序列的以下变体：所述变体中，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20个多核苷酸段(由两个或多个核苷酸组成的多核苷酸段)从该核苷酸序列中失去或被除去。
本文所用的术语“添加”是指核苷酸序列的以下变体：所述变体中，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20个多核苷酸段(由两个或多个核苷酸组成的多核苷酸段)被加入或融合至该核苷酸序列内。添加变体也包括融合分子。
应当理解的是，在上述修饰的优选变体尤其是通过添加或缺失一个或多个核苷酸而进行修饰的优选变体中，通过添加或缺失3个或3的整数倍个核苷酸来避免移码。
本文所用的术语“类似物”或“相似物”主要是指结构上与天然存在的RNA及DNA类似(相似)的化合物。核酸是核苷酸的链状物，由以下三部分组成：磷酸主链、折叠形戊糖(核糖或脱氧核糖)及四种核酸碱基之一。类似物可以具有这些改变中的任意一种，其中，典型地，核酸碱基类似物提供不同的碱基配对和碱基堆积性质，例如能与全部四种标准碱基配对的通用碱基，而磷酸糖主链类似物影响链的性质，例如PNA(Petersson B et al.，Crystal structure of a partly self-complementary peptide nucleic acid(PNA)oligomer showing a duplex-triplex network.J Am Chem Soc.2005 Feb 9；127(5)：1424-30)，其二级结构与DNA显著不同，并且可以形成三重结构(三链螺旋)。
一个优选实施方案为一种或多种分离的核酸分子，选自：(a)具有如上特征的核酸分子和(b)在高严格条件下杂交成(a)核酸分子的补体的核酸分子。高严格条件通常被定义为等同于在45℃于6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，随后于65℃在0.2XSSC、0.1％SDS中清洗。
所述实施方案的优选变型为分离的核酸分子，其包含与本文所述的任一核酸序列至少有80％相同的序列或由所述序列组成。
“内质网定位信号”是指一种肽序列，其引导具有该肽序列的蛋白质被转运至并被保留在内质网中。这种内质网定位序列通常见于驻留在内质网中并起作用的蛋白质中。对于本领域技术人员来说，内质网定位或“保留”信号是可以获得的，例如，S.cerevisiae内质网蛋白MNS1的最初21个氨基酸残基(Martinet et al.Biotechnology Letters 20：1171-1177，1998)。本发明使用的优选内质网定位信号为肽HDEL(SEQ ID NO：31)。所述发现于许多酵母蛋白的C-末端的HDEL肽序列，作为保留/回收信号作用于内质网(Pelham EMBO J.7：913-918，1988)。具有HDEL序列的蛋白质被膜结合受体(Erd2p)结合，然后进入逆向转运途径从高尔基体返回到内质网。
可替代地，KKxx序列可以提供内质网定位(Jackson J.Cell Biol.121：317)。该基序存在于若干内源性内质网膜蛋白上。所述序列可以存在于所述蛋白的N末端或者C末端，并且从内质网后区室中被回收。
本发明的主要方面是提供适当的宿主细胞(见下文)的修饰或基因工程的方法和手段，并在所述细胞中提供改变的和更合适的N-糖基化。
因此，本发明还提供一种表达盒或其功能性类似物，用于在真核宿主细胞中表达如上所述的新的脂质连接寡糖翻转酶活性物，其包含任一种如上所述的核酸分子的一个或多个拷贝。所述载体中的核酸序列可以被操作性地连接到表达调控序列上。优选地，所述核酸分子的一种或多种与编码启动子的核酸分子和编码终止子的核酸分子中的至少一种结合存在。
本文所用的“启动子”是指一种能使基因被转录的DNA序列。所述启动子被RNA聚合酶识别，然后开始转录。启动子包含被RNA聚合酶直接结合的DNA序列或者参与募集RNA聚合酶的DNA序列。启动子序列还可以包含“增强子区”，所述“增强子区”为一个或多个DNA区域，可以在基因簇中与蛋白质(即，反式作用因子，更类似于一组转录因子)结合来增强基因的转录水平(因此得名)。典型地，当位于编码区的5′端时，增强子还可以是与启动子序列分离的，并且可以是例如基因的固有区域或该基因的3′端至编码区。
根据本发明，所述启动子优选为基因的内源性启动子。在一个优选实施方案中，所述基因位于高拷贝数质粒上，优选为引起超表达的高拷贝数质粒上。在另一个优选实施方案中，所述基因位于低拷贝数质粒上。所述启动子可以为异源启动子。在一个具体的变型中，所述启动子为组成型启动子。在另一个具体的变型中，所述启动子为诱导型启动子。根据本发明所述的一种具体的启动子可进行所述核酸分子的一个或多个拷贝的超表达。在优选实施方案中，与从内源性启动子的表达相比，所述分子被超表达2倍，更优选为5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍，最优选为2000或更多倍。例如，当宿主细胞为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)时，适合的启动子包括但不限于，aox1、aox2、das、gap、pex8、ypt1、fld1及p40；当宿主细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)时，适合的启动子包括但不限于，gal1、交配因子a、cyc-1、pgk1、adh2、adh、tef、gpd、met25、galL、galS、ctr1、ctr3及cup1；当宿主细胞例如是哺乳动物细胞时，适合的启动子包括但不限于，CMV、SV40、肌动蛋白启动子、rps21、劳氏肉瘤病毒基因组大基因组长端重复序列(RSV)、金属硫蛋白、胸苷激酶或干扰素基因启动子。
“终止子”或3′末端序列是结构基因的终止密码子，其功能为稳定基因的mRNA转录产物，在所述转录产物上例如诱发聚腺苷酸化的序列等可被操作性地连接。可以从Pichia或其他甲基营养型酵母或其他酵母或高级真菌或其他真核生物中获得3′末端序列。可用于本发明实际应用的Pichia pastoris 3′末端序列的实例包括选自aox1基因、p40基因、his4基因和fld1基因的末端序列。
根据本发明，还提供了一种用于真核宿主细胞转化的载体，包含任一种如上所述的核酸分子的一个或多个拷贝或如上所述的表达盒的一个或多个拷贝。
本文所用的术语“载体”意指能转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。载体的一种类型为质粒，其是指附加的DNA片段可以接入其内部的一种环状双链DNA。其他载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)及酵母人工染色体(YAC)。载体的另一种类型为病毒载体，其中，附加的DNA片段可以被接入病毒基因组(下文将详细讨论)。某些载体能在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。其他载体可以在被引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随着宿主细胞被复制。此外，特定的优选载体能引导与其操作性连接的基因的表达。这种载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。
优选地，本发明所述的载体包括选择性标记基因。此类系统的实例包括可用于补足his4 Pichia菌株的Saccharomyces cerevisiae或Pichia pastoris his4基因，可用于补足Pichia pastoris arg突变菌株的S.cerevisiae或Pichia pastoris arg4基因，或分别可用于补足Pichia pastoris ura3或ade1突变菌株的Pichia pastoris ura3和ade1基因。其他作用于Pichia pastoris的选择性标记基因包括zeoR基因、g418R基因、杀稻瘟菌素抗性基因及其类似基因。
本发明所述的载体还包括自主复制序列(ARS)。所述载体还包括作用于细菌的选择性标记基因及负责在细菌中复制和染色体外保持的序列。在替代的实施方案中，营养缺陷标记提供所述选择。细菌选择性标记基因的实例包括氨苄西林抗性(ampr)、四环素抗性(tetr)、新霉素抗性、潮霉素抗性及博来霉素抗性(zeoR)基因。
本发明还提供了用于直接基因整合的各种手段。本发明所述的编码在细胞中被表达的蛋白质的核苷酸序列，可以被置于整合载体或者置于复制型载体(例如复制型环状质粒)中。通常，整合载体包括至少第一插入DNA片段、选择性标记基因和第二插入DNA片段的连续排布序列。所述第一和第二插入DNA片段每个在长度上各为大约200个核苷酸，并且具有与被转化物种的部分基因组DNA同源的核苷酸序列。在所述载体的第一和第二插入DNA片段之间而不限于所述标记基因之前或之后，插入有包含表达所涉及的结构基因的核酸序列。整合载体能在酵母转化之前被线性化，以促进有关的核酸序列向宿主细胞基因组的整合。
本发明还提供了一种聚氨基酸分子，具体地说，提供了一种或多种蛋白质，其能翻转脂质连接的、截短的或完整的前体寡糖(LLO)，特别是Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2和/或Man3GlcNAc2。术语“聚氨基酸分子”“多肽”“蛋白质”可替换使用，并且不考虑其长度或是否翻译后修饰，均意味着氨基酸的任何肽连接链。
在本发明的一个具体并优选的实施方案中，所述分子包含编码Flc2’的跨膜域4(TM4)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。在本发明一个具体并优选的实施方案中，所述分子包含编码Flc2’的跨膜域3-4(TM3-4)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。
所述分子可以包含编码Flc2’的跨膜域1(TM1)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。所述分子还可以包含编码Flc2’的跨膜域2(TM3)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。在一个具体并优选的实施方案中，所述分子包含编码Flc2’的跨膜域1-2(TM1-2)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。在另一个实施方案中，所述分子包含编码Flc2’的跨膜域2-4(TM2-4)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。
所述分子可以包含编码Flc2’的跨膜域3(TM3)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。在一个具体实施方案中，所述分子包含编码Flc2’的跨膜域1-3(TM1-3)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。在另一个实施方案中，所述分子包含编码Flc2’的跨膜域2-3(TM2-3)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。
在一个主要方面，所述聚氨基酸为上述来源于flc2’并包括flc2’的“人工”构造中的一种或多种“人工”构造的转录物。在一个优选实施方案中，所述转录物包含下述一种或多种序列或由下述一种或多种序列组成：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18。
在另一个优选实施方案中，所述转录物包含下述一种或多种序列或由下述一种或多种序列组成：SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，和SEQ ID NO：30，其被融合至内质网定位信号，优选地，选自SEQ ID NO：20及包含HDEL基序和KKxx基序的聚氨基酸序列中的一种。
在另一个优选实施方案中，所述聚氨基酸分子为上述转录物中的一种或多种转录物的片段、类似物及衍生物。本文所用的转录物的“片段”、“类似物”及“衍生物”是指具有生物活性的变体，其可以包含添加、缺失或置换。
优选地，带有置换的变体具有不多于50个的保守氨基酸置换，具体而言，不多于1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，20，25，30，35，40或45个保守氨基酸置换。“保守置换”应理解为一种氨基酸置换为具有相似特征的另一种氨基酸。保守置换包括在下述组内的置换：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；及，苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。相反的，非保守置换是一种氨基酸置换为具有相似特征的另一种氨基酸。
本发明所述的聚氨基酸分子显示出或提供了本文中所述的脂质连接寡糖翻转酶活性。具体地说，其特征在于能翻转脂质连接的、截短的或完整的前体寡糖(LLO)，尤其是Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2和/或Man3GlcNAc2。
不希望受理论的束缚，可以采用本领域技术人员公知的方法来测定脂质连接寡糖翻转酶或其片段、变体、类似物或衍生物的活性或特异性。不希望受理论的束缚，一种估算本发明所述的脂质连接寡糖翻转酶活性的优选方法可以包括下述步骤：生长和培养正在表达蛋白质的细胞，所述蛋白质为推定的脂质连接寡糖翻转酶；在特定温度下暴露所述细胞于标记的甘露糖底物中一定时间，所述甘露糖底物具体为放射性标记的[3H]-甘露糖(标记)；及分离甘露糖标记的脂质连接寡糖；及分析[3H]-甘露糖标记的脂质连接寡糖中的寡糖含量。可以按照本发明实施例中详细描述的方法分离[3H]-标记的脂质连接寡糖。可以采用适当的检测方法例如质谱法(例如，MALDI-TOF-MS)或高效液相色谱法(HPLC)来分析[3H]-甘露糖标记的脂质连接寡糖中的寡糖含量。然后，可以通过确定混入存在于内质网胞质面的脂质连接寡糖的[3H]-甘露糖的数量，并将所述数量除以混入脂质连接寡糖的[3H]-甘露糖的总数来计算所述翻转酶活性。不能翻转具有特定多糖结构的脂质连接寡糖的细胞将积聚胞质脂质连接寡糖。例如，当具有Man5GlcNAc2结构的脂质连接寡糖被翻转并且在内质网腔中被甘露糖基转移酶进一步修饰时，可检测到本发明所述的推定的脂质连接寡糖翻转酶。
在野生型细胞中，具有Man5GlcNAc2结构的脂质连接寡糖是脂质连接寡糖翻转酶例如Rft1翻转酶的底物。表达功能性翻转酶的野生型细胞会主要产生腔脂质连接寡糖，其被进一步加工为具有Glc3Man9GlcNAc2结构的最终脂质连接寡糖。然而，缺失脂质连接寡糖翻转酶或具有脂质连接寡糖翻转酶缺陷的细胞，例如rft1敲除细胞会主要产生存在于内质网胞质面并且可测量的具有Man5GlcNAc2结构的脂质连接寡糖，表明阻碍所述脂质连接寡糖移位进入内质网腔，换言之，阻碍所述脂质连接寡糖进一步加工形成最终的具有Glc3Man9GlcNAc2结构的内质网腔脂质连接寡糖。
可替代地，可以使用“人工”囊泡来确定所述脂质连接寡糖翻转酶的活性或特异性。可以通过从细胞中提取内质网膜来生成此类囊泡。从这种被耗竭的膜中重组内源性脂质连接寡糖翻转酶例如Rft1，并用新的脂质连接寡糖翻转酶组装所述囊泡以允许确定所述新蛋白质的翻转酶活性。添加[3H]-甘露糖进行标记，胞质甘露糖基转移酶活性使所述[3H]-甘露糖合并入胞质面的脂质连接寡糖。然后，所述脂质连接寡糖可借助一种活性脂质连接寡糖翻转酶翻转进入内质网腔。通过用一种Endo H酶处理所述囊泡，修剪暴露于囊泡表面的脂质连接寡糖，仅在多萜醇脂质上留下末端GlcNAc残基并且从而从囊泡表面去除放射性标记。通过定量测定囊泡腔中出现在Endo H酶处理的[3H]-甘露糖及未经Endo H酶处理的囊泡中的放射性活度，能够计算翻转数量；其中，所测得的放射性越小，脂质连接寡糖翻转酶对特定脂质连接寡糖的活性或特异性越小。
可以通过使用至少一种细胞质甘露糖基转移酶缺乏或具有缺陷的细胞来确定脂质连接寡糖翻转酶对特定类型脂质连接寡糖的特异性或活性，其根据寡糖结构的不同而不同。例如，Alg2型活性具有缺陷的细胞会产生具有Man1GlcNAc2或Man2GlcNAc2结构的脂质连接寡糖；然而，Alg11型活性和可选地，Alg3型活性缺乏或具有缺陷的细胞会产生具有Man3GlcNAc2结构的脂质连接寡糖。此类突变细胞或其重组的内质网膜囊泡可以被用于测定和确定新分离的脂质连接寡糖翻转酶的活性及特异性。
本文中进一步详细描述的翻转酶被测定具有翻转酶活性，其对于翻转脂质连接的低甘露糖寡糖，即具有Man1-3GlcNAc2结构的寡糖具有很小的特异性，或基本无特异性，其中，所述Man1-3GlcNAc2结构为Man1GlcNAc2、Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2结构。相反，内源性脂质连接寡糖翻转酶尤其是Rft1，对具有Man5GlcNAc2结构的脂质连接寡糖具有最高的翻转酶活性或特异性，其次是对具有Man3GlcNAc2结构的脂质连接寡糖。更特别地，本发明所述的翻转酶对脂质连接寡糖显示出相对于内源性Rft1反向的特异性，对小的脂质连接寡糖例如Man1GlcNAc2具有最高的特异性，对Man5GlcNAc2具有最低的特异性。
合适的宿主细胞
内质网中脂质连接寡糖向新生蛋白质的转移在包括酵母、真菌、植物、动物和人类的所有真核生物中都是高度保守的。因此，如上文详细描述的本发明的细胞在原则上可以是任意一种真核细胞，包括低级真核细胞、真菌细胞，还包括植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本发明所述的“宿主细胞”旨在涉及一种已经导入重组载体的细胞。应当理解的是，该术语意为不仅是指特殊的主体细胞，还指这种细胞的子代。由于突变或环境影响，特定的修饰可能发生在随后的几代中，因此，虽然实际上这样的子代可能与其亲代细胞不相同，但是仍然包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以为生长在培养基中的分离的细胞或细胞系，或者可以为存在于活组织或生物体的细胞。用于制造异源糖蛋白的术语“细胞”或“宿主细胞”是指能导入/转染或者导入/转染核酸，例如编码异源糖蛋白的核酸的细胞。这种细胞不仅包括用于载体或质粒增殖的原核细胞，还包括真核细胞。
在优选实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。优选地，所述细胞选自并优选为无限增殖化的，杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或人细胞的细胞系，骨髓瘤细胞优选为大鼠骨髓瘤细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
在其更多优选的变型中，所述细胞选自但不限于，CHO细胞尤其是CHO K-1和CHO DG44、BHK细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、HEK293EBNA细胞、PER.C6细胞、COS细胞、3T3细胞、YB2细胞、HeLa细胞和Vero细胞。在优选变型中，所述细胞选自DHFR缺陷CHO细胞，例如dhfr-CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.77，p.4216-4220，1980)和CHO K-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.60，p.1275，1968)。
在另一个优选实施方案中，所述宿主细胞为两栖动物细胞。优选地，所述细胞选自但不限于，Xenopus laevis卵母细胞(Nature，Vol.291，p.358-360，1981)。
在另一个优选实施方案中，所述宿主细胞为昆虫细胞。优选地，所述细胞选自但不限于，Sf9、Sf21和Tn5。
在另一个优选实施方案中，所述宿主细胞为植物细胞。优选地，所述细胞选自但不限于，来源于烟草(Nicotiana tabacum)、水生植物浮萍(Lemna minor)或苔藓Physcomitrella patens(球蒴藓)的细胞。这些细胞作为制造多肽的体系是公知的，并且还可以作为愈伤组织培养。
在目前最优选的实施方案中，所述宿主细胞为低级真核细胞。本发明所述的低级真核细胞包括但不限于，单细胞、多细胞和丝状真菌，优选选自：Pichia sp.Candida sp.Saccharomyces sp.、Saccharomycodes sp.、Saccharomycopsis sp.、Schizosaccharomyces sp.、Zygosaccharomyces sp.Yarrowia sp.、Hansenula sp.、Kluyveromyces sp.、Trichoderma sp.、Aspergillus sp.和Fusarium sp.及菌物界，优选选自子囊菌尤其是Chysosporium lucknowense，和担子菌尤其是Coniphora sp.和Arxula sp。
在更优选的变型中，所述细胞选自但不限于，P.pastoris，P.stiptis，P.methanolica，P.bovis，P.canadensis，P.fermentans，P.membranaefaciens，P.pseudopolymorpha，P.quercuum，P.robertsii，P.saitoi，P.silvestrisi，P.strasburgensis；P.finlandica，P.trehalophila，P.koclamae，P.opuntiae，P.thermotolerans，P.salictaria，P.guercuum，P.pijperi；C.albicans，C.amphixiae，C.atlantica，C.corydalis，C.dosseyi，C.fructus，C.glabrata，C.fermentati，C.krusei，C.lusitaniae，C.maltosa，C.membranifaciens，C.utilis；S.bayanus，S.cerevisiae，S.bisporus，S.delbrueckii，S.fermentati，S.fragilis，S.mellis，S.rosei；Saccharomycodes ludwigii，Saccharomycopsis capsularis；Schizosaccharomyces pombe，Schizosaccharomyces octosporus，Zygosaccharomyces bisporus，Zygosaccharomyces mellis，Zygosaccharomyces rouxii；Yarrowia lipolytica，Hansenula polymorpha，Kluyveromyces sp.，Trichoderma reseei.，A.nidulans，A.candidus，A.carneus，A.clavatus，A.fumigatus，A.niger，A.oryzae，A.versicolor，Fusarium gramineum，Fusarium venenatum，及Neurospora crassa和Arxula adeninivorans。
Rft1翻转酶缺乏的宿主细胞
本文所述的及表1和2中所指的所有酶及基因均根据它们各自在酵母S.cerevisiae中的基因座位来命名。本领域技术人员能够提供它们各自存在于其他生物体包括原核生物中的相应活性物。可供选择的来源的实例为酿酒酵母，毕赤酵母，曲霉菌(Aspergillus)，假丝酵母(Candida)，及类似菌株。在已知的酶的同源物的基础上，本领域技术人员可以设计PCR引物或者可以用编码此类酶的基因或基因片段来作为探针在靶标生物体的DNA文库中识别出同源物。可替代地，本领域技术人员可以在有关生物体中补足特别的表型。
可替代地，如果一种特别相关的真菌的全部基因组序列是已知的，本领域技术人员通过检索公众可获得的DNA数据文库可以简单地鉴定该基因，所述DNA数据文库可从例如NCBI，Swissprot等一些来源获得。例如，通过用来源于S.cerevisiae的已知基因检索给定的基因组序列或数据文库，本领域技术人员能在这样一个基因组中识别出具有高同源性的基因，其以高度确定性编码具有相似或相同活性的基因。例如，使用这些方法中的任意一种方法已经在P.pastoris中识别出来源于S.cerevisiae的已知甘露糖基转移酶的同源物；这些基因与S.cerevisiae中的蛋白质的甘露糖基化涉及的基因具有相似的功能，因此，可以应用它们的缺失以在P.pastoris或具有相似糖基化途径的任何其他真菌中操纵糖基化模式。
在上述实施方案的优选变型中，通过例如敲除rft1和/或rft1同源基因的方式，进一步修饰或以基因工程改造所述宿主细胞，使其缺乏或减少或耗竭(内源性)脂质连接寡糖翻转酶，尤其是Rft1。更特别地，所述细胞为rft1基因的敲除突变株。本发明还涉及制造所述细胞的方法。
因此，本发明涉及基因工程细胞，其中，通过采用一种或多种方式，使其中至少一种内源性酶活性缺乏或失活，所述方法选自倒位引起的抑制、反义结构引起的抑制、缺失引起的抑制、转录水平上的抑制、翻译水平上的抑制及其他方法。这些对于分子生物学领域的技术人员来说都是公知的。
在本发明正文中，术语“敲除”或“敲除突变株”是指该基因或转录物根本不存在的全部敲除系统，及该基因或转录物仍然存在但是沉默的或低浓度的部分敲除突变株，均导致转录物在细胞中没有发挥充分影响。
一旦确定给定的靶基因序列，基因敲除的建立在酵母和真菌分子生物学界是一种完善的技术，并且任何一个本领域普通技术人员都能实施(例如，见R.Rothsteins，(1991)Methods in Enzymology，vol.194，p.281)。事实上，对于这类宿主，良性转化的利用性及基因中断技术都可能影响宿主生物体的选择。如果一些转移酶必须被敲除，已经开发了允许重复使用标记物例如URA3标记物来连续去除所有不期望的内源性转移酶或本文所引用的其他酶的方法。该技术已经被其他人完善，但基本上包括使用攻击反选择性标记物侧面的两种重复DNA序列。所述标记物的存在在转化株的后续选择中是有用的；例如，可以应用在酵母ura3，his4，suc2，g418，bla，或shble基因中。例如，可以使用ura3作为标记物来确保选择一种已经整合了构造的转化株。通过用直接重复序列攻击ura3标记物，技术人员可以首先对已经整合了所述构造并因此中断靶基因的转化株进行选择。分离所述转化株及它们的表型之后，技术人员可以在第二轮中对具有5′FOA抗性的转化株进行反选择。能在包含5′FOA的平板上生存的菌落已经通过涉及上述重复序列的交叉事件重新失去ura3标记物。因此，该方法允许重复使用相同的标记物，并且不需要额外标记物的情况下促进多基因的中断。
本文所用的适用于核酸或多肽的术语“野生型”是指存在于生物有机体(自然界中存在的生物有机体)中的核酸或由所述生物有机体产生的多肽。
本文中适用于宿主细胞中的核酸或由宿主细胞制造的多肽的术语“异源”是指不是来源于与宿主细胞同种的细胞的任何核酸或多肽(例如，基因N-糖基化的蛋白质)。因此，本文所用的“同源”核酸或蛋白质，是存在于与宿主细胞同种的细胞中或由所述细胞制造的核酸或蛋白质。
更特别地，本文所用的与核酸及具体的宿主细胞有关的术语“异源”是指不存在于(并且不能从其获得)自然界中发现的具体细胞中的任何核酸。因此，非天然存在的核酸一旦被导入宿主细胞，就被认为对于该宿主细胞是异源的。值得注意的是，非天然存在的核酸可以包含自然界中发现的核酸序列或核酸序列片段，假如所述核酸作为一个整体在自然界中不存在。例如，在表达载体内包含基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，因此一旦被导入宿主细胞，就被认为对于该宿主细胞是异源的，因为所述核酸分子作为一个整体(基因组DNA加上载体DNA)在自然界中不存在。因此，任何一种作为整体在自然界中不存在的载体、自主复制质粒或病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)均被认为是非天然存在的核酸。由此可见，通过PCR或限制性核酸内切酶处理制造的基因组DNA片段，及cDNAs均被认为是非天然存在的核酸，因为未发现它们在自然界中以分离的分子存在。
由此还可以得知，任何一种在自然界中未发现的在一种排列中包含启动子序列和多肽编码序列(例如，cDNA或基因组DNA)的核酸是非天然存在的核酸。一种非天然存在的核酸对于具体的细胞来说可以是异源的。例如，从酵母x的细胞中分离的完整染色体一旦被导入酵母y的细胞，对于酵母y的细胞来说就是一种异源核酸。
进一步缺乏定位于内质网的甘露糖基转移酶的宿主细胞
本发明所述的翻转酶在突变细胞中被表达时支持生长和稳定，所述突变细胞缺乏定位于内质网的多糖的合成途径(例如通过基因工程)的一种或多种酶活性物，尤其是缺乏具有甘露糖基转移酶活性的一种或多种酶，所述甘露糖基转移酶活性转移甘露糖残基至多糖结构例如具有Man1-3GlcNAc2结构的脂质连接寡糖。
在一个优选实施方案中，所述细胞经特别设计或选择用来合成新生糖蛋白，所述糖蛋白具有适合进一步在高尔基体中进行糖基化加工的Man1GlcNAc2结构。
在另一个优选实施方案中，所述细胞经特别设计或选择用来合成新生糖蛋白，所述糖蛋白具有适合进一步在高尔基体中进行糖基化加工的Man2GlcNAc2结构。
在另一个优选实施方案中，所述细胞经特别设计或选择用来合成新生糖蛋白，所述糖蛋白具有适合进一步在高尔基体中进行糖基化加工的Man3GlcNAc2结构。
在一个优选方面，本发明所述的被修饰后表达上述新脂质连接寡糖翻转酶的宿主细胞被进一步修饰或基因工程改造，以缺乏一种或多种定位于细胞内的细胞器的糖基转移酶活性物。这些优选实施方案的基本构思是减少和控制脂质连接寡糖在细胞器表面和/或细胞器内的糖基化，尤其是甘露糖基化。提供本发明所述的宿主细胞能有选择地控制糖基化并且有可能特备提供下述改进的实施方案，所述宿主细胞被修饰后表达上述具有松弛特异性的新脂质连接寡糖翻转酶活性物并因此能翻转低甘露糖尤其是Man1-3多糖结构至内腔。
优选地，在所述宿主细胞中被敲除、减少或耗竭的定位于内质网的糖基转移酶为甘露糖基转移酶(见表1)。在所述宿主细胞的优选方案中，Alg2、Alg3和Alg11型活性物中的一种或多种被敲除、减少或耗竭。在更优选的变型中，这些实施方案进一步缺乏或被减少或耗竭β-D-甘露糖基转移酶(Dpm1)和脂质连接单糖(LLM)翻转酶活性物中的一种或多种。
表1定位于内质网的糖基转移酶活性物
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在一个具体实施方案中，所述宿主细胞为缺乏Alg2型活性物的突变菌株。更特别地，所述细胞为alg2基因和/或alg2同源基因的敲除突变株。特别地，所述宿主细胞能合成具有Man1GlcNAc2和Man2GlcNAc2结构的脂质连接寡糖。本发明还涉及制造所述细胞的方法。
在另一个具体实施方案中，所述宿主细胞为缺乏Alg11型活性物的突变菌株。更特别地，所述细胞为alg11基因和/或alg11同源基因的敲除突变株。特别地，所述细胞能合成具有Man3GlcNAc2、Man6GlcNAc2和Man7GlcNAc2结构的脂质连接寡糖。在其一个优选的变型中，所述宿主细胞为同时缺乏Alg11型活性物和脂质连接单糖(LLM)翻转酶活性物的突变菌株。更特别地，所述细胞为alg11基因和/或alg11同源基因及一个或多个编码脂质连接单糖(LLM)翻转酶活性物的基因的敲除突变株。特别地，所述细胞能主要合成具有Man3GlcNAc2结构的脂质连接寡糖。本发明还涉及制造所述细胞的方法。
在其另一个优选的变型中，所述宿主细胞为同时缺乏Alg11型活性物和β-D-甘露糖基转移酶(DPM1)型活性物的突变菌株。更特别地，所述细胞为alg11基因或alg11同源基因及dpm1基因或dpm1同源基因的敲除突变株。特别地，所述细胞能主要合成具有Man3GlcNAc2结构的脂质连接寡糖。本发明还涉及制造所述细胞的方法。
在另一个具体实施方案中，所述宿主细胞为缺乏Alg3型活性物的突变菌株。更特别地，所述细胞为alg3基因和/或alg3同源基因的敲除突变株。在一个更优选的实施方案中，所述细胞为同时缺乏Alg3型活性物和Alg11型活性物的突变菌株。更特别地，所述细胞为alg3基因和alg11基因和/或其任何同源基因的敲除突变株。特别地，所述细胞能合成具有Man3GlcNAc2结构的脂质连接寡糖。本发明还涉及制造所述细胞的方法。
在上述实施方案的优选变型中，所述宿主细胞被进一步修饰或基因工程改造，以缺乏或被减少或耗竭至少一种定位于高尔基体的甘露糖基转移酶活性物。本发明还涉及制造所述细胞的方法。
表达POT-复合系统的宿主细胞
本发明一个特别优选的实施方案涉及一种寡糖基转移酶(OST或OT)和/或修饰的寡糖基转移酶的表达，优选为异源的寡糖基转移酶。所述寡糖基转移酶为糖基转移酶。所述寡糖基转移酶是一种膜蛋白或蛋白复合物，转移脂质连接寡糖中的寡糖至新生蛋白质。在野生型细胞中，脂质连接寡糖的Glc3Man9GlcNAc2结构会被转移并被附加到将被糖基化的蛋白质的天冬酰胺(Asn)残基上。所述被寡糖基转移酶催化的反应在N-连接糖基化途径中是重要的步骤。
酵母和脊椎动物的寡糖基转移酶是由7或8个亚单位(酵母中为Ost1p，Ost2p，Ost3p/Ost6p，Ost4p，Ost5p，Stt3p，Wbp1p，和Swp1p；在哺乳动物细胞中为核糖体结合蛋白I，DAD1，N33/IAP，OST4，Stt3A/Stt3B，Ost48，和核糖体结合蛋白II)组成的复合异源寡聚蛋白。与酵母或脊椎动物的多蛋白复合物相反，除了仅包含催化Stt3亚单位的Trypanosoma sp.和Leishmania sp之外，原生动物体的基因组具有2-4个亚单位，编码3或4种完整的旁系同源基因。原生动物寡糖基转移酶(POT)与酵母和脊椎动物的寡糖基转移酶在它们对不同脂质连接寡糖结构的特异性上是有区别的。
不希望受理论的束缚，内源性寡糖基转移酶对转移具有高甘露糖多糖结构的脂质连接寡糖可以是高度特异的，所述高甘露糖多糖结构是野生型细胞的内质网中典型具有的。因此，内源性寡糖基转移酶对转移具有Glc3Man9GlcNAc2结构的脂质连接寡糖可以是高度特异的。在本发明所述的宿主细胞中，内质网中的甘露糖基化被抑制，并且被修饰的细胞主要制造具有Man1-3GlcNAc2结构的脂质连接寡糖。内源性寡糖基转移酶例如酵母多萜基二磷酸寡糖蛋白糖基转移酶(亚单位：Wbp1，Ost1，Ost2，Ost3，Ost4，Ost5，Ost6，Swp1，Stt3p)对此类低甘露糖脂质连接寡糖的活性可能很低。例如，预期酵母寡糖基转移酶(见图1)对具有Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2，Man3GlcNAc2，Man4GlcNAc2或Man5GlcNAc2结构的脂质连接寡糖的活性可能很低。不希望受理论的束缚，内源性寡糖基转移酶的存在可能影响限速步骤，并可能在糖基化级联中引起“瓶颈”，因为低甘露糖多糖向新生蛋白质的转移以非常受限的速率发生，如果真发生的话。
因此，在另一个方面，本方面还提供了一种或多种被修饰的或优选的异源的寡糖基转移酶，及特别是表达或超表达这些被修饰的或优选的异源的寡糖基转移酶中的一种或多种寡糖基转移酶的细胞。可替代地或附加地，根据本发明提供的宿主细胞被修饰或基因工程改造，来表达或包含一种或多种被修饰的或优选的异源的寡糖基转移酶活性物，其特征在于，所述寡糖基转移酶活性物不优先转移Glc3Man9GlcNAc2至蛋白质，而是还能够转移除Glc3Man9GlcNAc2之外的寡糖至蛋白质，所述寡糖优选是具有1-9个甘露糖残基的寡糖，最优选Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2，和/或Man3GlcNAc2。换言之，本发明提供了具有至少一种定位于内质网的寡糖基转移酶活性物的宿主细胞，所述寡糖基转移酶活性物对不同类型的将被转移至蛋白质的多糖结构显示出松弛特异性。具体地说，这种活性物在本文中被称作“类POT活性物”或“POT活性物”。
在一个具体实施方案中，提供一种在本发明的宿主细胞中使用的原生动物寡糖基转移酶(POT)，其对转移低甘露糖结构，尤其是Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2，显示出相当大的活性。
在更优选的变型中，所述原生动物寡糖基转移酶为一种原生动物的酵母寡糖基转移酶的Stt3亚单位的同源物，具体的所述原生动物选自但不限于，Toxoplasma sp.，Leishmania sp.，和Trypanosoma sp.。优选地，所述原生动物选自但不限于，Toxoplasma gondii(Tg)，Leishmania major(Lm)；Leishmania infantum(Li)，Leishmania braziliensis(Lb)，Leishmania mexicana(Lmx)，Leishmania donovani(Ld)，Leishmania guyanensis(Lg)，Leishmania tropica(Lt)，Trypanosoma cruzi(Tc)，和Trypanosoma brucei(Tb)。在具体实施方案中，所述原生动物寡糖基转移酶选自下述旁系同源基因中的一种或多种：Trypanosoma brucei的TbStt3Bp和TbStt3Cp；Leishmania infantum的LiStt3-1，LiStt3-2，和LiStt3-3；Leishmania braziliensis的LbStt3-1，LbStt3-2，和LbStt3-3；和Leishmania major及其同源结构的LmStt3A，LmStt3B，LmStt3C，和LmStt3D。在另一个实施方案中，所述原生动物寡糖基转移酶选自下述一种或多种：Trypanosoma brucei的TbStt3Bp和TbStt3Cp；及Leishmania major的LmStt3Ap，LmStt3Bp，和LmStt3Dp。
因此，本发明还涉及本发明所述的宿主细胞，其包含一种或多种编码一种或多种原生动物寡糖基转移酶的核酸。表达所述原生动物寡糖基转移酶或类原生动物寡糖基转移酶活性物的启动子可以是一种内源性启动子，内源性是针对所述活性物被表达时所在的细胞而言。启动子可以进行所述核酸分子的一个或多个拷贝的超表达。可以使用例如ADH，Tef或GPD的启动子在酵母中表达所述原生动物寡糖基转移酶活性物或类原生动物寡糖基转移酶活性物。在一个优选实施方案中，编码所述原生动物寡糖基转移酶活性物或类原生动物寡糖基转移酶活性物的基因位于一种高拷贝数质粒上，所述质粒优选引起超表达。在优选实施方案中，与从低拷贝数质粒或从单拷贝染色体整合的表达相比，所述分子被超表达2倍，更优选为5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍，最优选为2000或更多倍。表达所述原生动物寡糖基转移酶活性物或类原生动物寡糖基转移酶活性物的启动子可以为adh，Tef或gpd，例如在一种高拷贝数质粒上。
本发明还涉及制造这些细胞的方法。
脂质连接单糖(LLM)敲除-原生动物寡糖基转移酶(POT)复合系统
本发明提供了一种被修饰的或基因工程改造的宿主细胞，在下文中被称为“复合系统”。本发明所述的复合系统是指一种宿主细胞，其特别能合成具有低甘露糖多糖结构的脂质连接寡糖，并转移所述低甘露糖多糖至一种或多种在所述细胞中表达的新生蛋白质；所述细胞：
(i)被修饰以在细胞内的细胞器中合成具有低甘露糖多糖结构，尤其是Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2结构的脂质连接寡糖；尤其是通过敲除至少一种定位于细胞器的甘露糖基转移酶，并且根据情况敲除脂质连接单糖(LLM)翻转酶的方式来完成所述修饰，如本文中所详细描述的；及
(ii)进一步被修饰后表达外源性/异源性寡糖基转移酶，其对将被转移至新生蛋白质的低甘露糖多糖结构显示出松弛的底物特异性，尤其是与内源性寡糖基转移酶的底物特异性相比，其中，所述外源性/异源性寡糖基转移酶为原生动物寡糖基转移酶(POT)。
在一个具体实施方案中，对将被转移至新生蛋白质的低甘露糖多糖结构显示出松弛的底物特异性的寡糖基转移酶为原生动物寡糖基转移酶(POT)。在一个具体实施方案中，将在本发明所述的宿主细胞中被表达或超表达的原生动物寡糖基转移酶为Leishmania major的旁系同源基因(paralogue)LmStt3B或其同源结构。在另一个具体实施方案中，将在本发明所述的宿主细胞中被表达或超表达的原生动物寡糖基转移酶为Leishmania major的旁系同源基因LmStt3C或其同源结构。在另一个具体实施方案中，将在本发明所述的宿主细胞中被表达或超表达的原生动物寡糖基转移酶为Leishmania major的旁系同源基因LmStt3D或其同源结构。
在另一个具体实施方案中，将在本发明所述的宿主细胞中被表达或超表达的原生动物寡糖基转移酶为Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbStt3-1或其同源结构。在所述宿主细胞中被表达或超表达的原生动物寡糖基转移酶还可以为Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbStt3-2或其同源结构。在另一个具体实施方案中，将在本发明所述的宿主细胞中被表达或超表达的原生动物寡糖基转移酶为Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbStt3-3或其同源结构。
在另一个具体实施方案中，将在本发明所述的宿主细胞中被表达或超表达的原生动物寡糖基转移酶为Leishmania infantum的旁系同源基因LiStt3-1或其同源结构。在另一个具体实施方案中，将在本发明所述的宿主细胞中被表达或超表达的原生动物寡糖基转移酶为Leishmania infantum的旁系同源基因LiStt3-2或其同源结构。在所述宿主细胞中被表达或超表达的原生动物寡糖基转移酶还可以为Leishmania infantum的旁系同源基因LiStt3-3或其同源结构。
在另一个具体实施方案中，将在本发明所述的宿主细胞中被表达或超表达的原生动物寡糖基转移酶为Trypanosoma brucei(布氏锥虫)的旁系同源基因TbStt3A或其同源结构。在另一个具体实施方案中，将在本发明所述的宿主细胞中被表达或超表达的原生动物寡糖基转移酶为Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbStt3B或其同源结构。在另一个具体实施方案中，将在本发明所述的宿主细胞中被表达或超表达的原生动物寡糖基转移酶为Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbStt3C或其同源结构。
在本发明的具体实施方案中，提供了一种表达盒或其功能性类似物，用于表达一种或多种对低甘露糖多糖结构具有松弛的底物特异性的原生动物寡糖基转移酶，例如尤其是上述原生动物寡糖基转移酶中的一种或多种。所述表达盒包含编码寡糖基转移酶的任一种核酸分子的一个或多个拷贝，所述寡糖基转移酶对低甘露糖多糖结构具有松弛的底物特异性，选自上述原生动物寡糖基转移酶。
在其一个具体的变型中，还提供了一种用于转化真核宿主细胞的载体，包含编码上述原生动物寡糖基转移酶中的一种或多种的核酸分子的一个或多个拷贝。所述载体中的核酸序列能被操作性地连接到表达调控序列。优选地，所述核酸分子中的一种或多种与编码启动子的核酸分子及编码终止子的核酸分子中的至少一种核酸分子结合存在。表达原生动物寡糖基转移酶的启动子可以为ADH，Tef或GPD，例如在一种高拷贝数质粒上。
在更优选的实施方案中，本发明提供了一种转基因突变细胞，其表达Leishmania major的旁系同源基因LmStt3D或其同源结构。在其一个具体的变型中，LmStt3D在一种低拷贝载体的所述细胞中被表达。在其另一个具体的变型中，LmStt3D在一种高拷贝载体的所述细胞中被表达。
在另一个优选实施方案中，所提供的细胞表达Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbStt3-3或其同源结构。在其一个具体的变型中，LbStt3-3在一种低拷贝载体的所述细胞中被表达。在其另一个具体的变型中，LbStt3-3在一种高拷贝载体的所述细胞中被表达。
在另一个优选实施方案中，所提供的细胞表达Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbStt3-1或其同源结构。在其一个具体的变型中，LbStt3-1在一种高拷贝载体的所述细胞中被表达。
在另一个优选实施方案中，所提供的细胞表达Leishmania infantum的旁系同源基因LiStt3-2或其同源结构。在其一个具体的变型中，LiStt3-2在一种低拷贝载体的所述细胞中被表达。
在另一个优选实施方案中，所提供的细胞表达Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbStt3B或其同源结构。在其一个具体的变型中，TbStt3B在一种高拷贝载体的所述细胞中被表达。
在另一个优选实施方案中，所提供的细胞表达Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbStt3C或其同源结构。在其一个具体的变型中，TbStt3C在一种高拷贝载体的所述细胞中被表达。
在所述复合系统的一个具体实施方案中，所述细胞为一种突变菌株，其(i)至少缺乏Alg2型活性物，及(ii)表达或超表达原生动物寡糖基转移酶型活性物。更特别地，所述细胞(i)为alg2基因和/或alg2同源基因的敲除突变株，及(ii)表达一种或多种上述原生动物寡糖基转移酶型活性物。本发明还涉及制造所述细胞的方法。
在所述复合系统的一个具体实施方案中，所述细胞为一种突变菌株，其(i)至少缺乏Alg11型活性物，及(ii)表达或超表达原生动物寡糖基转移酶型活性物。更特别地，所述细胞(i)为alg11基因和/或alg11同源基因的敲除突变株，及(ii)表达一种或多种上述原生动物寡糖基转移酶型活性物。在一个优选实施方案中，本发明提供了一种表达Leishmania major的旁系同源基因LmStt3D的alg11基因和/或alg11同源基因的敲除突变株。在本发明一个具体的变型中，LmStt3D在一种低拷贝载体中被表达。在另一个优选实施方案中，所述突变细胞表达Leishmania braziliensis的旁系同源LbStt3-3。在一个具体的变型中，LbStt3-3在一种低拷贝载体中被表达。本发明还涉及制造这些细胞的方法。
在所述复合系统的另一个具体实施方案中，所述细胞为一种突变菌株，其(i)至少缺乏Alg3型活性物和Alg11型活性物，及(ii)表达或超表达原生动物寡糖基转移酶型活性物。更特别地，所述细胞(i)为alg3基因和alg11基因和/或其任一种同源基因的敲除突变株，及(ii)表达一种或多种上述原生动物寡糖基转移酶型活性物。在一个优选实施方案中，本发明提供了一种表达Leishmania major的旁系同源基因LmStt3D的alg3基因和alg11基因和/或其任一种同源基因的敲除突变株。在其一个具体的变型中，LmStt3D在一种低拷贝载体中被表达。在另一个优选实施方案中，所述突变细胞表达Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbStt3-3。在其一个具体的变型中，LbStt3-3在一种低拷贝载体中被表达。在另一个优选实施方案中，所述突变细胞表达Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbStt3B或TbStt3C。在一个具体的变型中，TbStt3B或TbStt3C在一种高拷贝载体中被表达。本发明还涉及制造这些细胞的方法。
在所述复合系统的另一个具体实施方案中，所述细胞为一种突变菌株，其(i)至少缺乏Alg11型活性物和脂质连接单糖(LLM)翻转酶型活性物，及(ii)表达或超表达原生动物寡糖基转移酶型活性物。更特别地，所述细胞(i)为alg11基因和/或alg11同源基因及一个或多个编码脂质连接单糖(LLM)翻转酶型活性物的基因的敲除突变株，及(ii)表达一种或多种上述原生动物寡糖基转移酶型活性物。本发明还涉及制造这些细胞的方法。
在所述复合系统的另一个具体实施方案中，所述细胞为一种突变菌株，其(i)至少缺乏Alg11型活性物和β-D-甘露糖基转移酶(DPM1)型活性物，及(ii)表达或超表达原生动物寡糖基转移酶型活性物。更特别地，所述细胞(i)为alg11基因和/或dpm1基因和/或其同源基因的敲除突变株，及(ii)表达一种或多种上述原生动物寡糖基转移酶型活性物。本发明还涉及制造这些细胞的方法。
不希望受理论的束缚，在优选变型中，要求对内源性寡糖基转移酶无敲除突变。然而，在一个优选变型中，内源性寡糖基转移酶在细胞中是不存在或是被抑制的。因此，提供了一种细胞，其中一种或多种编码内源性寡糖基转移酶亚单位的基因被敲除。在包括酵母细胞的优选变型中，所述内源性寡糖基转移酶的至少一种亚单位选自Wbp1p，Ost1p，Ost2p，Ost3p，Ost4p，Ost5p，Ost6p，Swp1p，和Stt3p。在一个优选实施方案中，所述细胞为wbp1基因和stt3基因的敲除突变株。在另一个优选实施方案中，所述细胞为ost1基因和ost2基因的敲除突变株。
在一个具体的变型中，所述宿主细胞为Stt3p的突变菌株，更特别地，所述宿主细胞为酵母菌株YG543，其具有stt3-7等位基因的温度敏感性表现型(Spirig et al.Mol.Gen.Genet.256，p.628-637，1997)。
脂质连接单糖敲除-脂质连接寡糖翻转酶-原生动物寡糖基转移酶复 合系统
根据另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其特别能合成具有低甘露糖多糖结构的脂质连接寡糖，并转移所述低甘露糖多糖至一种或多种在所述细胞中表达的新生蛋白质；所述细胞：
(i)被修饰以在细胞内的细胞器中合成具有低甘露糖多糖结构，尤其是Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2结构的脂质连接寡糖；尤其是通过敲除至少一种定位于细胞器的甘露糖基转移酶，并且根据情况敲除脂质连接单糖(LLM)翻转酶的方式来形成，如本文中所详细描述的；
(ii)被修饰以表达新的对低甘露糖脂质连接寡糖具有松弛特异性的脂质连接寡糖翻转酶，如本文中所详细描述的；及
(iii)进一步被修饰以表达寡糖基转移酶，其对将被转移至新生蛋白质的低甘露糖多糖结构显示出松弛的底物特异性，优选地，所述寡糖基转移酶为原生动物寡糖基转移酶(POT)，更特别选自上述原生动物寡糖基转移酶。
本发明提供了一种表达盒或其功能性类似物，用于表达上述新的脂质连接寡糖翻转酶活性物，及对低甘露糖多糖结构具有松弛的底物特异性的寡糖基转移酶例如原生动物寡糖基转移酶。所述表达盒包含编码上述脂质连接寡糖翻转酶活性物的任一种核酸分子的一个或多个拷贝，及编码寡糖基转移酶例如上述原生动物寡糖基转移酶的任一种核酸分子的一个或多个拷贝，所述寡糖基转移酶对低甘露糖多糖结构具有松弛的底物特异性。
在其一个具体的变型中，还提供了一种用于转化真核宿主细胞的载体，包含编码上述核酸分子中的任一种的一个或多个拷贝，或包含上述表达盒的一个或多个拷贝。所述载体中的核酸序列能被操作性地连接到表达调控序列。优选地，所述核酸分子中的一种或多种与编码启动子的核酸分子及编码终止子的核酸分子中的至少一种核酸分子结合存在。表达原生动物寡糖基转移酶的启动子可以为ADH，Tef或GPD，例如在一种高拷贝数质粒上。
一个关于为宿主细胞提供新的脂质连接寡糖翻转酶活性物和原生动物寡糖基转移酶活性物的载体的优选实施方案示于图14中。所述核酸序列提供于SEQ ID NO：32中。
本文所用的术语“来源于flc2’”还包括包含flc2’(SEQ ID NO：1)的完整序列的分子，并且在更优选的变型中，包括包含flc2’的一个或多个片段的分子，所述一个或多个片段编码一个或多个Flc2分子的跨膜域。在本发明一个具体并优选的实施方案中，所述分子包含编码Flc2’的跨膜域4(TM4)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。在本发明一个具体并优选的实施方案中，所述分子包含编码Flc2’的跨膜域3-4(TM3-4)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。
所述分子可以包含编码Flc2’的跨膜域1(TM1)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。所述分子还可以包含编码Flc2’的跨膜域2(TM3)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。在本发明一个具体并优选的实施方案中，所述分子包含编码Flc2’的跨膜域1-2(TM1-2)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。在本发明的另一个实施方案中，所述分子包含编码Flc 2’的跨膜域2-4(TM2-4)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。
所述分子可以包含编码Flc2’的跨膜域3(TM3)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。在本发明的一个具体实施方案中，所述分子包含编码Flc2’的跨膜域1-3(TM1-3)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。在本发明的另一个实施方案中，所述分子包含编码Flc2’的跨膜域2-3(TM2-3)的片段或其同源功能性结构，或基本上由其组成。
在所述复合系统的一个具体实施方案中，所述细胞为一种突变菌株，其(i)至少缺乏Alg2型活性物；(ii)表达本发明所述的新的脂质连接寡糖翻转酶活性物；及(iii)表达原生动物寡糖基转移酶活性物。更特别地，所述细胞(i)为alg2基因和/或alg2同源基因的敲除突变株；(ii)表达一种或多种提供脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子；及(iii)表达一种或多种上述原生动物寡糖基转移酶活性物。在一个更具体的实施方案中，所述细胞表达一种或多种来源于flc2’的提供脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子，如上文中所详细描述的。在另一个变型中，所述细胞表达一种或多种来源于rft1的提供脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子，如上文中所描述的。特别地，所述细胞能合成具有Man1GlcNAc2和Man2GlcNAc2结构的脂质连接寡糖，并能转移所述结构至新生蛋白质。本发明还涉及制造所述细胞的方法。
在另一个优选实施方案中，所述细胞为一种突变菌株，其(i)至少缺乏Alg11型活性物，(ii)表达本发明所述的新的脂质连接寡糖翻转酶活性物，及(iii)表达原生动物寡糖基转移酶活性物。更特别地，所述细胞(i)为alg11基因和/或alg11同源基因的敲除突变株，(ii)表达一种或多种提供脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子，及(iii)表达一种或多种上述原生动物寡糖基转移酶活性物。在一个更优选的实施方案中，所述细胞表达一种或多种来源于flc2’的提供脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子，如上文中所详细描述的。在另一个变型中，所述细胞表达一种或多种来源于rft1的提供脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子，如上文中所描述的。特别地，所述细胞能合成具有Man3GlcNAc，Man6GlcNAc2，Man7GlcNAc2和/或Man8GlcNAc2结构的脂质连接寡糖，并能转移所述结构至新生蛋白质。本发明还涉及制造所述细胞的方法。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞为一种突变菌株，其(i)至少缺乏Alg3型活性物和Alg11型活性物，(ii)表达本发明所述的新的脂质连接寡糖翻转酶活性物，及(iii)表达原生动物寡糖基转移酶活性物。更特别地，所述细胞(i)为alg3基因和alg11基因或其任一种同源基因的敲除突变株，(ii)表达一种或多种提供脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子，及(iii)表达一种或多种上述原生动物寡糖基转移酶活性物。在一个更具体的实施方案中，所述细胞表达一种或多种来源于flc2’的提供脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子，如上文中所详细描述的。在另一个变型中，所述细胞表达一种或多种来源于rft1的提供脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子，如上文中所描述的。特别地，所述细胞能合成具有Man3GlcNAc2结构的脂质连接寡糖，并能转移所述结构至新生蛋白质。本发明所述的一个优选突变细胞表达Leishmania major的旁系同源基因LmStt3D。在一个具体的变型中，LmStt3D在一种低拷贝载体中被表达。在另一个优选实施方案中，所述突变细胞表达Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbStt3-3。在一个具体的变型中，LbStt3-3在一种低拷贝载体中被表达。在另一个优选实施方案中，所述突变细胞表达Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbStt3B或TbStt3C。在一个具体的变型中，TbStt3B或TbStt3C在一种高拷贝载体中被表达。本发明还涉及制造这些细胞的方法。
在另一个优选实施方案中，所述细胞为一种突变菌株，其(i)至少缺乏Alg11型活性物和脂质连接单糖(LLM)翻转酶活性物，(ii)表达本发明所述的新的脂质连接寡糖翻转酶活性物，及(iii)表达原生动物寡糖基转移酶活性物。更特别地，所述细胞(i)为alg11基因和/或alg11同源基因及一个或多个编码脂质连接单糖(LLM)翻转酶活性物的基因的敲除突变株，(ii)表达一种或多种提供脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子，及(iii)表达一种或多种上述原生动物寡糖基转移酶活性物。在一个更具体的实施方案中，所述细胞表达一种或多种来源于flc2’的提供脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子，如上文中所详细描述的。可替代地或附加地，所述细胞表达一种或多种来源于rft1的提供脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子，如上文中所描述的。本发明所述的一个优选突变细胞表达Leishmania major的旁系同源基因LmStt3D。在一个具体的变型中，LmStt3D在一种低拷贝载体中被表达。在另一个优选实施方案中，所述突变细胞表达Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbStt3-3。在一个具体的变型中，LbStt3-3在一种低拷贝载体中被表达。在另一个优选实施方案中，所述突变细胞表达Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbStt3B或TbStt3C。在一个具体的变型中，TbStt3B或TbStt3C在一种高拷贝载体中被表达。本发明还涉及制造这些细胞的方法。特别地，所述细胞能合成具有Man3GlcNAc2结构的脂质连接寡糖，并能转移所述结构至新生蛋白质。本发明还涉及制造所述细胞的方法。
在另一个优选实施方案中，所述细胞为一种突变菌株，其(i)至少缺乏Alg11型活性物和β-D-甘露糖基转移酶(DPM1)型活性物，(ii)表达本发明所述的新的脂质连接寡糖翻转酶活性物，及(iii)表达原生动物寡糖基转移酶活性物。更特别地，所述细胞(i)为alg11基因和/或alg11同源基因及dpm1基因和/或dpm1同源基因的敲除突变株，(ii)表达一种或多种提供脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子，及(iii)表达一种或多种上述原生动物寡糖基转移酶活性物。所述细胞表达一种或多种来源于flc2’的提供脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子，如上文中所详细描述的。可替代地或附加地，所述细胞表达一种或多种来源于rft1的提供脂质连接寡糖翻转酶活性物的核酸分子，如上文中所描述的。本发明所述的一个优选突变细胞表达Leishmania major的旁系同源基因LmStt3D。在一个具体的变型中，LmStt3D在一种低拷贝载体中被表达。在另一个优选实施方案中，所述突变细胞表达Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbStt3-3。在一个具体的变型中，LbStt3-3在一种低拷贝载体中被表达。在另一个优选实施方案中，所述突变细胞表达Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbStt3B或TbStt3C。在一个具体的变型中，TbStt3B或TbStt3C在一种高拷贝载体中被表达。本发明还涉及制造这些细胞的方法。特别地，所述细胞能合成具有Man3GlcNAc2结构的脂质连接寡糖，并能转移所述结构至新生蛋白质。本发明还涉及制造所述细胞的方法。
具体地讲，提供了一种细胞，其中一种或多种编码内源性寡糖基转移酶亚单位的基因被敲除。在包括酵母细胞的优选变型中，内源性寡糖基转移酶的至少一种亚单位选自Wbp1p，Ost1p，Ost2p，Ost3p，Ost4p，Ost5p，Ost6p，Swp1p，和Stt3p。在一个优选实施方案中，所述细胞为wbp1基因和stt3基因的敲除突变株。在另一个优选实施方案中，所述细胞为ost1基因和ost2基因的敲除突变株。
在本发明更优选的实施方案中，任何一种如上所述的细胞可以还包含至少一种编码异源糖蛋白的核酸。表达异源糖蛋白的启动子可以为内源性启动子，内源性是针对所述酶被表达时所在的细胞而言的。在另一个优选实施方案中，启动子为一种异源启动子、诱导型或构建型启动子，其超表达核酸分子的一个或多个拷贝。特别地，这些细胞能主要合成具有Man1-3GlcNAc2结构的脂质连接寡糖，并能转移所述结构至所述异源蛋白质。
不希望受理论的束缚，上述指定的敲除缺失菌株仅能够在内质网上或内质网中制造低甘露糖脂质连接寡糖，尤其是Man3GlcNAc2，其然后被附加到内质网中的蛋白质上。在一些情况下可以发现，随后在高尔基体中甘露糖基转移酶作用下添加附加的甘露糖残基，可能在蛋白质上形成Man4GlcNAc2和Man5GlcNAc2结构。为了减少不期望的Man4GlcNAc2和Man5GlcNAc2结构的数量，本发明提供了避免其发生的措施。一个优选的措施为在如上所述的本发明任何一种细胞中缺失一种或多种编码定位于高尔基体的甘露糖基转移酶的基因。
本发明与现有技术的在先教导明确相反，其中，通过使用同源或异源甘露糖苷酶修剪或分裂高甘露糖(例如，Man8GlcNAc2或Man 9GlcNAc2)或高甘露糖基化糖形，得到期望的低甘露糖基化多糖。因此，在一个优选实施方案中，本发明涉及不表现出有效的甘露糖苷酶活性或根本无甘露糖苷酶活性的细胞。
具有修饰的高尔基体-糖基化的宿主细胞
在内质网由寡糖基转移酶产生的主要糖蛋白可以在高尔基体中进一步糖基化，如下文详细描述的。本发明更主要的方面在于提供用于在本发明所述的宿主细胞中修饰基于高尔基体的糖基化的手段和方法。上文中详细描述的基于内质网的糖基化的修饰及下文中详细描述的基于高尔基体的糖基化的修饰是密不可分的。本发明有利地提供了具有低甘露糖多糖结构的主要糖蛋白，为随后在高尔基体中的修饰糖基化形成理想的底物
进一步缺乏定位于高尔基体的甘露糖基转移酶的宿主细胞
在优选实施方案中，本发明所述的宿主细胞被进一步修饰或基因工程改造，以缺乏或被抑制或耗竭一种或多种，至少两种，优选至少三种、至少四种或至少五种定位于高尔基体的甘露糖基转移酶。优选地，所述甘露糖基转移酶选自：Och1p，Mnn1p，Mnn2p，Mnn4p，Mnn5p，Mnn9p，Mnn10p，及Mnn11p，及其同源物(见表2)。优选地，所述细胞为至少一种基因的敲除突变株，所述基因选自：och1，mnn1，mnn2，mnn4，mnn5，mnn9，mnn10，和mnn11基因及其同源基因。同源基因还包括相同或相关基因家族的其他成员。
表2定位于高尔基体的甘露糖基转移酶
Figure BPA00001358342600521
所述细胞可以为och1，or mnn1，mnn2，mnn4，mnn5，mnn9，mnn10，mnn11和/或它们的同源基因中至少一种基因的敲除突变株。所述细胞还可以为ktr1，ktr2，ktr3，ktr4，ktr5，ktr6，ktr7和/或它们的同源基因中至少一种基因的敲除突变株。所述细胞还可以为van1，vrg4和/或它们的同源基因中至少一种基因的敲除突变株。
在一个优选实施方案中，本发明所述的细胞尤其是上述复合系统，进一步缺乏至少一种Och1，更特别是α-1，6-甘露糖基转移酶。更特别地，所述细胞进一步为och1基因的敲除突变株。例如，本发明所述的复合系统能在Pichia pastoris的高甘露糖基化-阴性(Och1)突变菌株的基础上进行基因工程改造。在一个优选实施方案中，本发明所述的细胞尤其是上述复合系统，至少缺乏由mnn1基因或其同源基因提供的α-1，3-甘露糖基转移酶。更特别是至少mnn1基因或其同源基因的敲除突变株。所述细胞还可以缺乏一种或多种上述甘露糖基转移酶，更特别地，所述细胞为一种或多种编码所述甘露糖基转移酶的基因，尤其是选自mnn9，mnn5，van1及其同源基因中的一种或多种基因的敲除突变株。
在一个优选实施方案中，所述细胞为至少缺乏Alg11及Mnn1的突变菌株。更特别地，所述细胞为至少alg11及mnn1的敲除突变株。一个优选的实施方案为突变细胞，优选为酵母细胞，其为一种复合系统，所述复合系统：
(i)被修饰以表达至少一种新的脂质连接寡糖翻转酶活性物，尤其是由一种或多种本发明所述的核酸分子编码的脂质连接寡糖翻转酶活性物，并且所述复合系统是alg11或其同源基因的敲除突变株；
(ii)是至少mnn1或其同源基因的敲除突变株；及
(iiia)进一步表达或超表达至少一种上述原生动物寡糖基转移酶活性物；及，可替代地或附加地，
(iiib)进一步表达或超表达至少一种上述脂质连接寡糖翻转酶活性物。
特别地，所述细胞能主要合成具有Man3GlcNAc2结构的脂质连接寡糖，并能转移所述结构至新生蛋白质。本发明还涉及制造所述细胞的方法。
在一个优选实施方案中，所述细胞为至少缺乏Alg3、Alg11及Mnn1的突变菌株。更特别地，所述细胞为至少alg11、alg3及mnn1的敲除突变株。一个优选的实施方案为突变细胞，优选为酵母细胞，其为一种复合系统，所述复合系统：
(i)被修饰以表达至少一种新的脂质连接寡糖翻转酶活性物，尤其是由一种或多种本发明所述的核酸分子编码的脂质连接寡糖翻转酶活性物，并且所述复合系统是alg3及alg11或其它们的同源基因的敲除突变株；
(ii)是至少mnn1或其同源基因的敲除突变株；及
(iiia)进一步表达或超表达至少一种上述原生动物寡糖基转移酶活性物；及，可替代地或附加地，
(iiib)进一步表达或超表达至少一种上述脂质连接寡糖翻转酶活性物。
特别地，所述细胞能主要合成具有Man3GlcNAc2，Man6GlcNAc2，Man7GlcNAc2，或Man8GlcNAc2结构的脂质连接寡糖，并能转移所述结构至新生蛋白质。本发明还涉及制造所述细胞的方法。
在另一个优选实施方案中，所述细胞为至少缺乏Alg11、DPM1及Mnn1的突变菌株。更特别地，所述细胞为至少alg11、dpm1及mnn1的敲除突变株。一个优选的实施方案为突变细胞，优选为酵母细胞，其为一种复合系统，所述复合系统：
(i)被修饰以表达至少一种新的脂质连接寡糖翻转酶活性物，尤其是由一种或多种本发明所述的核酸分子编码的脂质连接寡糖翻转酶活性物，并且所述复合系统是dpm1及alg11或其它们的同源基因的敲除突变株；
(ii)是至少mnn1或其同源基因的敲除突变株；及
(iiia)进一步表达或超表达至少一种上述原生动物寡糖基转移酶活性物；及，可替代地或附加地，
(iiib)进一步表达或超表达至少一种上述脂质连接寡糖翻转酶活性物。
在具体实施方案中，这些细胞表达或超表达一种或多种来源于flc2’的核酸分子，如上文中所详细描述的，所述核酸分子提供新的脂质连接寡糖翻转酶活性物。可替代地或附加地，所述细胞表达一种或多种来源于rft1的核酸分子，如上所述，其提供脂质连接寡糖翻转酶活性物。
在具体实施方案中，这些细胞表达或超表达Leishmania major的旁系同源基因LmStt3D。在一个具体的变型中，LmStt3D在一种低拷贝载体中被表达。在另一个优选实施方案中，所述突变细胞表达Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbStt3-3。在一个具体的变型中，LbStt3-3在一种低拷贝载体中被表达。在另一个优选实施方案中，所述突变细胞表达Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbStt3B或TbStt3C。在一个具体的变型中，TbStt3B或TbStt3C在一种高拷贝载体中被表达。本发明还涉及制造这些细胞的方法。
在具体实施方案中，这些细胞还是内源性寡糖基转移酶活性物的敲除突变株，尤其是通过敲除ost1和ost2和/或wbp1和stt3和/或它们各自的同源基因。
通过异源糖基转移酶表达对基于高尔基体的糖基化的具体调控
如下文中详细描述的，本发明所述的核酸分子或聚氨基酸分子的优选实施方案被用于制造修饰的宿主细胞，所述细胞被指定用于制造如下文所述的糖蛋白或糖蛋白组合物。
本发明所述的细胞可以被进一步基因工程改造以改变高尔基体中的糖基化级联，其在不同的真核生物中明显不同，因此，所述糖蛋白根据它们被表达及被分离的细胞类型不同，其多糖结构会有区别。例如，低级真核生物通常制造含有N-多糖的高甘露糖。因此，本发明的另一个目标是提供一种可用于在除人细胞之外的细胞中制造糖蛋白的细胞，及能够在除人细胞之外的细胞中制造糖蛋白的方法，所述糖蛋白具有特定类型N-多糖结构，例如人多糖结构。因此，这种细胞将会在高尔基体糖基化途径被进一步基因修饰，允许细胞执行模拟糖蛋白例如在人类中的加工的酶反应的序列。在这些基因工程细胞中表达的重组蛋白制造与其人类配对物更相似的糖蛋白，如果不能基本上相同。如果使用如上列举的通常制造含有N-多糖的高甘露糖的低级真核细胞，所述细胞被修饰以制造N-多糖例如Man3GlcNAc2或Man5GlcNAc2或人类糖基化途径中的其他结构。优选实施例包括但不限于，包含一种或多种多糖结构的重组蛋白，所述多糖结构选自：
GlcNAcMan3-5GlcNAc2，
GlcNAc2Man3GlcNAc2，
GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型
Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，
Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc，
Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型，
Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型，
NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，
NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc，
NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型，
euAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型，
GlcNAc3Man3GlcNAc2，
Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2，
Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc，
NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2，及
NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc
本文所用的GlcNAc为N-乙酰葡糖胺，Gal为半乳糖，Fuc为岩藻糖，NeuAc为N-乙酰神经氨酸或唾液酸。在优选实施方案中，本文所用的所有多糖结构中都缺少岩藻糖，除非特别例证存在岩藻糖(Fuc)。
根据本发明，优选地，通过缺乏特定酶的菌株的基因工程和/或选择，创造了低级真核生物尤其是真菌细胞例如酵母的糖蛋白中不期望的高甘露糖型结构特征。优选地，通过基因工程改造表达异源酶的宿主细胞，所述异源酶制造不被创造高甘露糖型的酶识别的多糖结构，其被选择以在期望具有活性的低级真核细胞例如真菌中存在时，发挥最佳活性，或者以达到最佳活性的细胞器为靶点，及它们的组合，其中，基因工程的真核生物表达制造“类人”糖蛋白所必需的多重异源酶。
在优选实施方案中，本发明还涉及高尔基体中一种或多种异源酶的整合，所述酶能够制造“类人”N-多糖。在优选实施方案中，本发明提供了基因工程细胞，在高尔基体中包含至少一种异源糖基转移酶和/或一种或多种选自表3、4和5中所列举的糖基转移酶相关酶。
类人糖基化的主要特征在于，包含N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、岩藻糖和/或N-乙酰神经氨酸的复合N-多糖结构。其他唾液酸如存在于其他动物如仓鼠的N-多糖中的N-糖基神经氨酸，在人类中是不存在的。还有特殊的寡糖基连接例如末端结合的α-1-3半乳糖对于啮齿动物是典型的，但在人细胞中是不存在的。
表3异源糖基转移酶、转运体和相关酶
Figure BPA00001358342600571
Figure BPA00001358342600581
Figure BPA00001358342600591
Figure BPA00001358342600601
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所述基因工程的主要目标是制造稳健的蛋白制造菌株，其能够在工业发酵工艺中完成具有限定的类人多糖结构。多重基因向宿主(例如真菌)染色体中的整合需要仔细的计划。所述基因工程菌株将最可能被一系列不同的基因转化，并且这些基因将必须以稳定的模式被转化来确保整个发酵工艺中期望的被维持。所述酶的任何结合都要被工程整合入蛋白表达宿主细胞。
采用DNA序列信息，技术人员能使用本领域技术人员公知的标准技术来克隆编码GnT的DNA分子，编码一种或多种GnT(或编码其催化的片段)的核酸分子可以在启动子及其他表达调控序列的转录调控下被插入到合适的表达载体中，所述表达调控序列能在本发明所述的选定宿主细胞中，例如，如本文所述的Piichia sp.，Kluyveromyces sp.，Saccharomyces sp.，Yarrowia sp.和Aspergillus sp.等真菌宿主中发起转录，这样，这些哺乳动物GnT酶的一种或多种可以在选定的宿主细胞中被主动表达来制造类人复合糖蛋白。
所述工程菌株将被不同的糖基化相关基因稳定地转化，以确保在整个发酵工艺中期望的活性被维持。下述酶的任何结合都要被工程整合入表达宿主。并行地，不期望的糖基化反应中涉及的一些宿主基因将要被缺失。
在优选实施方案中，转化编码异源糖基化酶的基因的一个子集，至少两种基因(又名文库)进入宿主生物体，起初引起一个基因混合群体。然后，从所述混合群体中选择具有期望的糖基化表型的转化株。在一个优选实施方案中，所述宿主生物体为低级真核生物，并且所述宿主糖基化途径通过一种或多种人或动物糖基化酶的稳定表达被修饰，所述糖基化酶制造与人多糖结构相似或相同的N-多糖。在一个特别优选的实施方案中，所述基因的子集或“DNA文库”包括编码糖基化酶的融合的基因构造，所述糖基化酶带有针对糖基化涉及的各种细胞内场所尤其是内质网、顺面高尔基体、中间高尔基体或反面高尔基体的靶向序列。
在一些情况下，所述DNA文库可以直接从现有或野生型基因中集合。但是，在一个优选实施方案中，所述DNA文库从两个或多个子文库的融合中集合得到。通过所述子文库的框架内连接，使创造大量新的编码有用的靶向糖基化的基因构造成为可能。例如，一种有用的子文库包括编码以下记载的酶和酶活性的任一组合的DNA序列。
优选地，所述酶为人源的酶，虽然其他真核或原核酶，更尤其哺乳动物、原生动物、植物、细菌或真菌酶也有用。在一个优选实施方案中，基因被截短来提供编码酶催化域的片段。通过去除内源性靶向序列，所述酶可以在其他细胞内场所被重定向及表达。通过特殊环境的常识可以指导此类催化域的选择，在所述特殊环境下所述催化域随后被激活。另一种有用的子文库包括编码信号肽的DNA序列，其导致蛋白质向内质网、高尔基体或反面高尔基网内的特殊场所的定位。这些信号肽可以选自宿主生物体及其他相关或不相关的生物体。典型地，内质网或高尔基体的膜结合蛋白可以包括，例如，编码胞质尾区(ct)、跨膜域(tmd)和干区(sr)的N-末端序列。所述ct、tmd及sr序列足以单独地或以组合的形式将蛋白质固定在细胞器的内(腔)膜上。因此，所述信号序列的子文库的一个优选实施例包括这些蛋白质中的ct、tmd和/或sr序列。在一些情况下，期望提供具有不同长度的sr序列的子文库。这可以通过PCR使用结合在编码胞质区的DNA的5′端的启动子并使用一系列结合在干区不同部位的反启动子来实现。所述信号序列的其他有用来源还包括回收信号肽。
除开放阅读框序列之外，通常优选提供带有此类启动子、转录终止子、增强子、核糖体结合位点及其他功能性序列的每个文库的构造，其对于确保基因在转化进入宿主生物体后有效的转录及翻译可能是必需的。
据此，本发明进一步涉及，根据本发明所述的宿主细胞进一步被基因工程改造或修饰来表达至少一种优选的异源酶或其催化域，所述酶或其催化域示于表3、4和5中，并且优选地，选自基于高尔基体的异源酶：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶或N-乙酰葡糖氨基转移酶I(GnTI)；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶或N-乙酰葡糖氨基转移酶II(GnTII)；
β-1，4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖氨基转移酶或N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)；
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶或N-乙酰葡糖氨基转移酶IV(GnTIV)；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，6-N-乙酰葡糖氨基转移酶或N-乙酰葡糖氨基转移酶V(GnTV)；
α-1，6-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖氨基转移酶或N-乙酰葡糖氨基转移酶VI(GnTVI)；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶或半乳糖基转移酶(GalT)；
α(1，6)岩藻糖基转移酶或岩藻糖基转移酶(FucT)；
β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶或唾液酸转移酶(ST)；
这些酶可以进一步被下述中的一种或多种所支持：UDP-GlcNAc转移酶；UDP-GlcNac转运体；UDP-半乳糖基转移酶；UDP-半乳糖转运体；GDP-岩藻糖基转移酶；GDP-岩藻糖转运体；CMP-唾液酸转移酶；CMP-唾液酸转运体；及核苷酸二磷酸酶。
不言而喻，本文中所述至少一种酶或催化域优选包含至少一种用于细胞内膜或细胞器的定位序列。在优选实施方案中，所述细胞内膜或细胞器为高尔基体。
在优选变型中，N-乙酰葡糖氨基转移酶V(GnTV)和/或N-乙酰葡糖氨基转移酶VI(GnTVI)在被修饰的细胞中是不存在或缺乏的。在这些变型中，由这两种酶中的一或两种催化的修饰不是必需的，或是从基于高尔基体的修饰中排除在外的。
GlcNAcMan3-5GlcNAc2结构合成的实施方案
在一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物。
所述细胞还可以包含一种酶，优选为异源酶，其选自：
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这两种高尔基体加工相关酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1和slc35A3
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有GlcNAcMan3-5GlcNAc2结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
GlcNAc2Man3GlcNAc2结构合成的实施方案
在另一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；及
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1，mgat2，和slc35A3
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有GlcNAc2Man3GlcNAc2结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型结构合成的实施方案
在另一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；及
β-1，4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIII)，尤其是Mgat3型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1，mgat2，mgat3，和slc35A3
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有GlcNAc2Man3GlcNAc2-平分型结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2结构合成的实施方案
在另一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；及
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1，mgat2，mgat3，b4galt1，和slc35a2
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc结构合成的实施方案
在另一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物；
GDP-D-甘露糖4，6-脱水酶，尤其是Gmds型转录物；
GDP-4-酮-去氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶-4-还原酶，尤其是Tsta3型转录物；
GDP-岩藻糖转运体，尤其是Slc35C1型转录物；及
α(1，6)岩藻糖基转移酶(FucT)，尤其是Fut8型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1，mgat2，slc35a3，mgat3，b4galt1，slc35a2，gmds，tsta3，slc35c1和fut8
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型结构合成的实施方案
在另一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
β-1，4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIII)，尤其是Mgat3型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；及
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1，mgat2，mgat3，slc35a3，b4galt1，和slc35a2
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型结构合成的实施方案
在另一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
β-1，4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIII)，尤其是Mgat3型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物；
GDP-D-甘露糖4，6-脱水酶，尤其是Gmds型转录物；
GDP-4-酮-去氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶-4-还原酶，尤其是Tsta3型转录物；
GDP-岩藻糖转运体，尤其是Slc35C1型转录物；及
α(1，6)岩藻糖基转移酶(FucT)，尤其是Fut8型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1，mgat2，mgat3，slc3533，b4galt1，slc35a2，gmds，tsta3，slc35c1和fut8
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2结构合成的实施方案
在另一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物；
β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶(ST)，尤其是ST6gal1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(NeuC)，尤其是NeuC型转录物；
唾液酸合酶(NeuB)，尤其是NeuB型转录物；
CMP-Neu5Ac合成酶，尤其是Slc35A1型转录物；及
CMP-唾液酸转运体，尤其是NeuA/Cmas型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在其一个可替代的变型中，被修饰的细胞提供N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶和N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶来代替唾液酸合酶，更特别地，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物；
β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶(ST)，尤其是ST6gal1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(NeuC)，尤其是NeuC型转录物；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶；
CMP-Neu5Ac合成酶，尤其是Slc35A1型转录物；及
CMP-唾液酸转运体，尤其是NeuA/Cmas型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1，mgat2，slc35a3，b4galt1，slc35a2，st6gal1，neuC，neuB，slc35a1，和neuC/cmas
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型结构合成的实施方案
在另一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
β-1，4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIII)，尤其是Mgat3型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物；
β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶(ST)，尤其是ST6gal1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(NeuC)，尤其是NeuC型转录物；
唾液酸合酶(NeuB)，尤其是NeuB型转录物；
CMP-Neu5Ac合成酶，尤其是Slc35A1型转录物；及
CMP-唾液酸转运体，尤其是NeuA/Cmas型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在其一个可替代的变型中，被修饰的细胞提供N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶和N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶来代替唾液酸合酶，更特别地，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
β-1，4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIII)，尤其是Mgat3型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物；
β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶(ST)，尤其是ST6gal1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(NeuC)，尤其是NeuC型转录物；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶；
CMP-Neu5Ac合成酶，尤其是Slc35A1型转录物；及
CMP-唾液酸转运体，尤其是NeuA/Cmas型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1，mgat2，slc35a3，mgat3，b4galt1，slc35a2，st6gal1，neuC，neuB，slc35a1，和neuC/cmas
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2-平分型结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc结构合成的实施方案
在另一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物；
GDP-D-甘露糖4，6-脱水酶，尤其是Gmds型转录物；
GDP-4-酮-去氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶-4-还原酶，尤其是Tsta3型转录物；
GDP-岩藻糖转运体，尤其是Slc35C1型转录物；
α(1，6)岩藻糖基转移酶(FucT)，尤其是Fut8型转录物；
β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶(ST)，尤其是ST6gal1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(NeuC)，尤其是NeuC型转录物；
唾液酸合酶(NeuB)，尤其是NeuB型转录物；
CMP-Neu5Ac合成酶，尤其是Slc35A1型转录物；及
CMP-唾液酸转运体，尤其是NeuA/Cmas型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在其一个可替代的变型中，被修饰的细胞提供N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶和N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶来代替唾液酸合酶，更特别地，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物；
GDP-D-甘露糖4，6-脱水酶，尤其是Gmds型转录物；
GDP-4-酮-去氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶-4-还原酶，尤其是Tsta3型转录物；
GDP-岩藻糖转运体，尤其是Slc35C1型转录物；
α(1，6)岩藻糖基转移酶(FucT)，尤其是Fut8型转录物；
β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶(ST)，尤其是ST6gal1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(NeuC)，尤其是NeuC型转录物；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶；
CMP-Neu5Ac合成酶，尤其是Slc35A1型转录物；及
CMP-唾液酸转运体，尤其是NeuA/Cmas型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1，mgat2，slc35a3，b4galt1，slc35a2，gmds，tsta3，slc35c1，fut8，st6gal1，neuC，neuB，slc35a1，和neuC/cmas
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc-2Fuc结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型结构合成的实施方案
在另一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
β-1，4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIII)，尤其是Mgat3型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物；
GDP-D-甘露糖4，6-脱水酶，尤其是Gmds型转录物；
GDP-4-酮-去氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶-4-还原酶，尤其是Tsta3型转录物；
GDP-岩藻糖转运体，尤其是Slc35C1型转录物；
α(1，6)岩藻糖基转移酶(FucT)，尤其是Fut8型转录物；
β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶(ST)，尤其是ST6gal1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(NeuC)，尤其是NeuC型转录物；
唾液酸合酶(NeuB)，尤其是NeuB型转录物；
CMP-Neu5Ac合成酶，尤其是Slc35A1型转录物；及
CMP-唾液酸转运体，尤其是NeuA/Cmas型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在其一个可替代的变型中，被修饰的细胞提供N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶和N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶来代替唾液酸合酶，更特别地，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
β-1，4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIII)，尤其是Mgat3型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物；
GDP-D-甘露糖4，6-脱水酶，尤其是Gmds型转录物；
GDP-4-酮-去氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶-4-还原酶，尤其是Tsta3型转录物；
GDP-岩藻糖转运体，尤其是Slc35C1型转录物；
α(1，6)岩藻糖基转移酶(FucT)，尤其是Fut8型转录物；
β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶(ST)，尤其是ST6gal1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(NeuC)，尤其是NeuC型转录物；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶；
CMP-Neu5Ac合成酶，尤其是Slc35A1型转录物；及
CMP-唾液酸转运体，尤其是NeuA/Cmas型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1，mgat2，slc35a3，b4galt1，mgat3，slc35a2，gmds，tsta3，slc35c1，fut8，st6gal1，neuC，neuB，slc35a1，和neuC/cmas
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc-2Fuc-平分型结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
GlcNAc3Man3GlcNAc2结构合成的实施方案
在另一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；及
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIV)，尤其是Mgat4型转录物；
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1，mgat2，mgat4，和slc35A3
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有GlcNAc3Man3GlcNAc2结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2结构合成的实施方案
在另一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIV)，尤其是Mgat4型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；及
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1，mgat2，maga4，slc35a3，b4galt1和slc35a2
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc结构合成的实施方案
在另一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIV)，尤其是Mgat4型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；及
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物；
GDP-D-甘露糖4，6-脱水酶，尤其是Gmds型转录物；
GDP-4-酮-去氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶-4-还原酶，尤其是Tsta3型转录物；
GDP-岩藻糖转运体，尤其是Slc35C1型转录物；及
α(1，6)岩藻糖基转移酶(FucT)，尤其是Fut8型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1，mgat2，maga4，slc35a3，b4galt1，slc35a2，gmds，tsta3，slc35c1和fut8
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2结构合成的实施方案
在另一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIV)，尤其是Mgat4型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物；
β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶(ST)，尤其是ST6gal1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(NeuC)，尤其是NeuC型转录物；
唾液酸合酶(NeuB)，尤其是NeuB型转录物；
CMP-Neu5Ac合成酶，尤其是Slc35A1型转录物；及
CMP-唾液酸转运体，尤其是NeuA/Cmas型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在其一个可替代的变型中，被修饰的细胞提供N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶和N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶来代替唾液酸合酶，更特别地，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIV)，尤其是Mgat4型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物；
β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶(ST)，尤其是ST6gal1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(NeuC)，尤其是NeuC型转录物；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶；
CMP-Neu5Ac合成酶，尤其是Slc35A1型转录物；及
CMP-唾液酸转运体，尤其是NeuA/Cmas型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1，mgat2，slc35a3，b4galt1，mgat4，slc35a2，st6gal1，neuC，neuB，slc35a1，和neuC/cmas
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc结构合成的实施方案
在另一个优选实施方案中，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIV)，尤其是Mgat4型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物；
GDP-D-甘露糖4，6-脱水酶，尤其是Gmds型转录物；
GDP-4-酮-去氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶-4-还原酶，尤其是Tsta3型转录物；
GDP-岩藻糖转运体，尤其是Slc35C1型转录物；
α(1，6)岩藻糖基转移酶(FucT)，尤其是Fut8型转录物；
β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶(ST)，尤其是ST6gal1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(NeuC)，尤其是NeuC型转录物；
唾液酸合酶(NeuB)，尤其是NeuB型转录物；
CMP-Neu5Ac合成酶，尤其是Slc35A1型转录物；及
CMP-唾液酸转运体，尤其是NeuA/Cmas型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在其一个可替代的变型中，被修饰的细胞提供N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶和N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶来代替唾液酸合酶，更特别地，被修饰的宿主细胞提供用于基于高尔基体的加工的酶，优选为异源酶，其选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)，尤其是Mgat1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体，尤其是Slc35A3型转录物；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)，尤其是Mgat2型转录物；
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIV)，尤其是Mgat4型转录物；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)，尤其是B4galt1型转录物；
UDP-半乳糖转运体，尤其是Slc35A2型转录物；
GDP-D-甘露糖4，6-脱水酶，尤其是Gmds型转录物；
GDP-4-酮-去氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶-4-还原酶，尤其是Tsta3型转录物；
GDP-岩藻糖转运体，尤其是Slc35C1型转录物；
α(1，6)岩藻糖基转移酶(FucT)，尤其是Fut8型转录物；
β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶(ST)，尤其是ST6gal1型转录物；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(NeuC)，尤其是NeuC型转录物；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶；
CMP-Neu5Ac合成酶，尤其是Slc35A1型转录物；及
CMP-唾液酸转运体，尤其是NeuA/Cmas型转录物。
在一个最优选的实施方案中，所述细胞至少包含或只包含这些高尔基体加工相关的酶。
在该实施方案的一个优选变型中，所述细胞表达下述基因中的一种或多种：
mgat1，mgat2，slc35a3，b4galt1，mgat4，slc35a2，gmds，tsta3，slc35c1，fut8，st6gal1，neuC，neuB，slc35a1，和neuC/cmas
和/或它们的同源基因。
具体地说，所述细胞能够制造具有NeuAc3Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc结构的N-多糖。因此，本发明还涉及一种或多种宿主细胞，其被特别设计用来制造具有所述多糖结构的糖蛋白。因此，本发明还涉及一种优选为分离的，具有所述结构的糖蛋白，优选地，所述糖蛋白可以由所述细胞制造或者确实由所述细胞制造。本发明还提供了一种通过使用所述细胞来制作所述糖蛋白的方法或工艺。
用于制作糖蛋白的方法或工艺
本发明还提供了一种通过使用任意一种本发明所述的宿主细胞来制作糖蛋白的方法或工艺。不希望受理论的束缚，本发明所述的细胞能够制造大量在所述糖蛋白上带有Man1GlcNac2，Man2GlcNac2或Man3GlcNac2结构的N-多糖。所述糖蛋白可以为同源或异源蛋白。因此，任意一种如上所述的宿主细胞都优选包含至少一种编码异源糖蛋白的核酸。同源蛋白主要是指来源于宿主细胞本身的蛋白质，而被“外来的”克隆基因编码的蛋白质为所述宿主细胞的异源蛋白。更特别地，任何一种编码本发明所述的异源蛋白的核酸都能被密码子优化以在感兴趣的宿主细胞中表达。例如，一种编码Trypanosoma brucei的原生动物寡糖基转移酶的核酸能被密码子优化以在酵母细胞例如Saccharomyces cerevisiae中表达。
根据本发明所述的宿主细胞能够制造复合N-连接寡糖及杂交寡糖。在例如人促红细胞生成素(hEPO)等治疗用蛋白的生理学中已经暗含了分支的复合N-多糖。已经表明了具有双触角型结构的人促红细胞生成素具有低活性，然而具有三触角型结构的人促红细胞生成素从血流中清除缓慢，因此导致更高的活性(Misaizu T et al.(1995)Blood December 1；86(11)：4097-104)。
多糖结构意味着一种结合于蛋白核的寡糖。高甘露糖结构包括多于5个甘露糖，而主要由只延伸至少于5个甘露糖部分的甘露糖组成的多糖结构为低甘露糖多糖结构，例如Man3GlcNac2。更特别地，本文所用的术语“多糖”或“糖蛋白”是指一种N-连接寡糖，例如，一种通过天冬酰胺-N-乙酰葡萄糖胺键附加到多肽的天冬酰胺残基上的N-连接寡糖。N-多糖具有一个普通的Man3GlcNAc2(“Man”是指甘露糖；“Glc”是指葡萄糖；“NAc”是指N-乙酰基；GlcNAc是指N-乙酰葡萄糖胺)的戊糖核。N-多糖针对包含被添加到所述Man3GlcNAc2(“Man3”)核心结构的外周糖(例如，岩藻糖及唾液酸)在内的分支(触角)数目而发生变化。N-多糖根据它们的分支组成(例如，高甘露糖、复合或杂交)来进行分类。一种糖形代表携带一种特异N-多糖的糖基化蛋白。因此，糖形代表携带不同N-多糖的糖基化蛋白。一种“高甘露糖”型N-多糖具有5个或更多个甘露糖。
所述核心结构Man3GlcNac2是N-多糖的所有分类中共有的。所述核心结构通过延伸序列接在每个分支上，并由细胞型特异的己糖终止。N-多糖结构的三种普通类型可以被定义为：(1)高甘露糖多糖，主要包括在延伸序列内并且还作为终止部分的甘露糖。(2)与此相反，由不同的己糖组成的复合多糖。在人类中，它们通常包括N-乙酰神经氨酸作为终止己糖。及(3)杂交多糖，在单一多糖内包括聚甘露糖基和复合延伸序列两种。
典型地，一种“复合”型N-多糖具有至少一个附加在“三甘露糖”核的1，3甘露糖臂的GlcNAc及至少一个附加在“三甘露糖”核的1，6甘露糖臂的GlcNAc。所述“三甘露糖核”为具有一个Man3结构的戊糖核。复合N-多糖还可以具有半乳糖(“Gal”)残基，可以用唾液酸或衍生物(“NeuAc”，这里“Neu”是指神经氨酸，“Ac”是指乙酰基)任意修饰。复合N-多糖还可以具有包含“平分型”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)的链内替换。一种“杂交”型N-多糖具有至少一个在三甘露糖核的1，3甘露糖臂末端的GlcNAc及零或多个在三甘露糖核的1，6甘露糖臂上的甘露糖。
本发明的另一方面是涉及一种工艺，用于制作具有低甘露糖多糖结构的糖蛋白或包含一种或多种具有低甘露糖多糖结构的糖蛋白的糖蛋白组合物。
在一个优选实施方案中，所述蛋白为异源蛋白。在其一个优选变型中，所述异源蛋白为重组蛋白。本发明的一个优选实施方案为一种组合物，包含由或可以由本发明所述的细胞制造的异源和/或重组蛋白，其中，所述组合物包含大量具有Man1-3GlcNAc2中的一种多糖结构的糖蛋白。
“重组蛋白”、“异源蛋白”和“外源蛋白”可替换使用来指代一种通过重组DNA技术制造的多肽，其中，通常情况下，编码多肽的DNA被插入到合适的表达载体内，所述表达载体反过来被用于转化宿主细胞来制造所述异源蛋白。就是说，多肽是从异源核酸中被表达的。
在一个优选变型中，提供了一种工艺，用于制作具有Man3GlcNAc2多糖结构的糖蛋白或包含至少一种具有Man3GlcNAc2多糖结构的糖蛋白的糖蛋白组合物。在另一个优选变型中，提供了一种工艺，用于制作具有Man2GlcNAc2多糖结构的糖蛋白或包含至少一种具有Man2GlcNAc2多糖结构的糖蛋白的糖蛋白组合物。在另一个优选变型中，还提供了一种工艺，用于制作具有Man21GlcNAc2多糖结构的糖蛋白或包含至少一种具有Man1GlcNAc2多糖结构的糖蛋白的糖蛋白组合物。在另一个优选变型中，还提供了一种工艺，用于制作具有Man4GlcNAc2多糖结构的类人糖蛋白或包含至少一种具有Man4GlcNAc2多糖结构的糖蛋白的糖蛋白组合物。在另一个优选变型中，还提供了一种工艺，用于制作具有Man5GlcNAc2多糖结构的类人糖蛋白或包含至少一种具有Man5GlcNAc2多糖结构的糖蛋白的糖蛋白组合物。
所述工艺至少包含下述步骤：提供本发明所述的突变细胞。优选在液体培养基中培养所述细胞，并优选在所述细胞内允许或最优选为支持所述糖蛋白或糖蛋白组合物的制造的条件下，培养所述细胞。必要时，可以从所述细胞和/或所述培养基中分离所述糖蛋白或糖蛋白组合物。优选地，使用本领域公知的方法及手段进行分离。
本发明还提供新的糖蛋白及其组合物，可以由或是由本发明所述的细胞或方法来制造。这种组合物的特征还在于，包含选自Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2，和Man3GlcNAc2的多糖核心结构，优选为Man3GlcNAc2结构。本发明还可以提供特征在于包含选自Man4GlcNAc2和Man5GlcNAc2的多糖结构的组合物，所述多糖结构可以通过高尔基体中Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2，或Man3GlcNAc2核的进一步甘露糖基化来制造。
在优选实施方案中，一种或多种所述多糖结构在组合物中以至少40％或更多的量存在，更优选为至少50％或更多，更优选为至少60％或更多，更优选为至少70％或更多，更优选为至少80％或更多，更优选为至少90％或更多，更优选为至少95％或更多，最优选至99％或100％。不言而喻，对这种蛋白组合物普遍的其他物质及副产物被排除在所述计算结果之外。在一个最优选的实施方案中，基本上所有由所述细胞制造的多糖结构都带有Man3GlcNAc2结构。在另一个优选实施方案中，基本上所有由所述细胞制造的糖形都带有Man4GlcNAc2和/或Man5GlcNAc2结构。
作为高尔基体修饰的结果，正如上文中所详细描述的，携带复合及杂交N-多糖的糖蛋白是能获得的。所述糖蛋白包含多糖结构，其选自但不限于：
GlcNAcMan3-5GlcNAc2，
GlcNAc2Man3GlcNAc2，
GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型
Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，
Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc，
Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型，
Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型，
NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，
NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc，
NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型，
NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型，
GlcNAc3Man3GlcNAc2，
Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2，
Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc，
NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2，及
NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc
在优选实施方案中，一种或多种上述多糖结构在糖蛋白或糖蛋白组合物中以至少40％或更多的量存在，优选为至少50％或更多，更优选为至少60％或更多，更优选为至少70％或更多，更优选为至少80％或更多，更优选为至少90％或更多，更优选为至少95％或更多，最优选为99％至全部糖蛋白。不言而喻，对这种蛋白组合物普遍的其他物质及副产物被排除在所述计算结果之外。在一个最优选的实施方案中，基本上所有由本发明所述宿主细胞制造的糖蛋白都带有一种或多种上述多糖结构。
在一些实施方案中，本发明所述糖蛋白的N-糖基化形式可以为同源或基本上同源的。具体地讲，一种特殊多糖结构的片段在糖蛋白中占至少约20％或更多，约30％或更多，约40％或更多，优选至少约50％或更多，更优选至少约60％或更多，更优选约70％或更多，更优选约80％或更多，更优选约90％或更多，更优选约95％或更多，最优选为99％至全部糖蛋白。
本发明的优选实施方案为新的由或可以由宿主细胞制造的糖蛋白组合物，带有上述多糖结构的两种或多种不同的糖蛋白。不希望受理论的束缚，在一个优选实施方案中，本发明所述的特殊宿主细胞能够同时制造两种或多种不同的糖蛋白，结果得到不同结构的糖蛋白的混合物。这还涉及糖基化的中间形式。必须注意的是，在本发明最优选的变型中，所述宿主细胞提供了一种特殊多糖结构，主要地或甚至是纯粹地(大于90％；优选大于95％，最优选99％或更多)达到必要的延伸。
在另一个优选实施方案中，优选将两种或更多本发明所述的不同宿主细胞进行共培养来制造两种或更多不同的N-多糖结构，结果得到不同结构的糖蛋白的混合物。
适用于N-多糖分析的仪器包括，例如ABI PRISM
Figure BPA00001358342600901
377 DNA顺序分析仪(Applied Biosystems)。数据分析可以使用例如GENESCAN
Figure BPA00001358342600902
3.1软件(Applied Biosystems)进行。N-多糖分析的其他方法包括，例如，质谱法(例如，MALDI-TOF-MS)、正相或反相高效液相色谱法(HPLC)及离子交换色谱法(例如，当多糖未被标记时采用脉冲安培检测，如果多糖被适当标记则采用UV吸收或荧光检测)。
一个优选实施方案是一种例如IgG的重组免疫球蛋白，可以由本发明的细胞制造，包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2结构的N-多糖。
另一个更优选的实施例为重组人促红细胞生成素(rhuEPO)，可以由本发明的细胞制造，包含NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc结构的三种N-多糖。
在优选实施方案中，糖蛋白或糖蛋白组合物可以，但不必须从所述宿主细胞中分离出来。在优选实施方案中，糖蛋白或糖蛋白组合物可以，但不必须从所述宿主细胞中进一步纯化。本文所用的术语“分离的”指一种已经从组分中被分开或纯化的分子或其片段，例如，所述组分为天然伴随其存在的蛋白质或其他天然存在的生物学或有机分子。典型地，本发明所述的分离糖蛋白或糖蛋白组合物在一种药剂中构成同类分子总量的至少60％(重量)，例如，在一个样品中为同类分子总量的60％。例如，一种分离糖蛋白在药剂或样品中构成了总蛋白的至少60％(重量)。在一些实施方案中，药剂中的分离糖蛋白构成同类分子总量的至少75％，至少90％，或至少99％(重量)。
所述基因工程宿主细胞可以用于制造新的具有治疗的糖蛋白或其组合物的方法中。
由或可以由上述优选实施方案中的宿主细胞制造的优选糖蛋白或糖蛋白组合物包括但不限于，血液因子、抗凝血剂、溶血栓药、抗体、其抗原结合片段、激素、生长因子、刺激因子、趋化因子及细胞因子，更具体地，肿瘤坏死因子(TFN)家族的调节蛋白、促红细胞生成素(EPO)、促性腺激素、免疫球蛋白、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素及酶。最优选的糖蛋白或糖蛋白组合物选自：促红细胞生成素(EPO)、干扰素-[α]、干扰素-[β]、干扰素-[gamma]、干扰素-[omega]、及粒细胞-CSF、因子VIII、因子IX、人蛋白C、可溶性lgE受体[α]-链、免疫球蛋白G(IgG)、IgG的Fab、lgM、尿激酶、胃促胰酶、尿素胰蛋白酶抑制剂、IGF结合蛋白、表皮生长因子、生长激素释放因子、annexin V融合蛋白、血管生成抑素、血管内皮生长因子-2、骨髓抑制因子-1、骨保护素、葡糖脑苷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-氨基己糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、α-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖-2-硫酸酯酶、α-氨基葡糖苷-N-乙酰转移酶、β-D-葡萄糖苷酸酶、透明质酸酶、α-L-甘露糖苷酶、α-神经氨酸酶、磷酸转移酶、酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、组织蛋白酶K及脂蛋白脂酶。
本发明的另一个实施方案为重组的治疗用蛋白或多个这种蛋白，构成一种或多种上述糖蛋白，尤其是具有上述低甘露糖多糖结构的糖蛋白。优选地，所述治疗用蛋白可以由本发明所述的细胞来制造。
本发明的一个优选实施方案为一个或多个免疫球蛋白。另一个优选实施方案为抗体或包含一个或多个上述免疫球蛋白的抗体组合物。术语“免疫球蛋白”是指具有氨基酸序列的任一分子，由于特别与抗原相互影响并且其中，所述分子的任一链包括抗体可变区的功能性操纵区，无限制地包括所述分子的任一种天然存在或重组形式例如嵌合抗体或人源化抗体。本文所用的“免疫球蛋白”意指一种蛋白质，由一种或多种本质上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成。优选地，本发明所述的免疫球蛋白包括片段，优选为包含一个或多个糖基化位点片段。所述片段意指具有抗原-抗体反应的抗体的片段，并包括F(ab′)2，Fab′，Fab，Fv，及重组Fv。
本发明另一个优选实施方案为一种药物组合物，包含下述中的一种或多种：一种或多种本发明所述的上述糖蛋白或糖蛋白组合物，一种或多种本发明所述的上述重组治疗用蛋白，一种或多种本发明所述的上述免疫球蛋白，及一种或多种本发明所述的上述抗体。如果必要或可行，所述组合物还包含至少一种药学上可接受的载体或辅药。
本发明所述的糖蛋白能在药物组合物中被明确地表示。除上述物质中的一种外，这些组合物可以包含药学上可接受的辅料、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其他材料。所述材料应为无毒的并应当不影响成分的功效。所述载体或其他材料的确切性质可以取决于给药途径，例如，口服、静脉内、经皮或皮下、鼻腔、肌内、腹膜内或贴片途径。
用于口服给药的药物组合物可以以片剂、胶囊、粉末或液体的形式。片剂可以包括固体载体例如明胶或辅药。液体药物组合物通常包括液体载体例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油等。还可以包括生理盐水、葡萄糖或其他糖溶液或乙二醇类例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。对于静脉内、经皮或皮下注射，或在疼痛处的注射，所述成分将以胃肠外可接受的水性溶液的形式注射，所述水性溶液无热原并具有适当的pH、等渗性及稳定性。本领域相关技术的技术人员能很好地使用例如等渗介质来制备适当的溶液。根据要求还可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
不管给个体施用的是本发明所述的多肽、肽、或核酸分子、其他药学上有效的化合物，优选以足以对个体显示出效果的“预防有效量”或“治疗有效量”(根据情况可以，虽然预防可以被认为是治疗)进行给药。实际给药量及给药的速度和时程将取决于被治疗的疾病的性质和严重性。治疗处方例如剂量的决定等，在全科医生和其他专科医生的责任范围内，并且通常考虑被治疗的病症、个体患者的条件、传递部位、给药方法及从业人员公知的其他因素。
另一方面，本发明提供了一种治疗疾病的方法，所述疾病可以通过施用一种或多种上述经确认的糖蛋白或其组合物来治疗，所述方法包括步骤：给实验对象施用如上所述的糖蛋白或其组合物，其中，其中，所述实验对象患有或疑似患有可通过施用糖蛋白或其组合物治疗的疾病。在一个优选实施方案中，所述方法还包括步骤：(a)提供实验对象和/或(b)确定所述实验对象是否患有可通过施用所述糖蛋白或其组合物治疗的疾病。所述实验对象为动物例如人。所述疾病为例如癌、免疫紊乱、炎症或代谢紊乱。
根据本发明，还提供了一种用于制造糖蛋白的试剂盒，所述试剂盒至少包括：本发明所述的一种或多种能够制造重组蛋白的宿主细胞，及优选地，用于培养所述细胞以制造所述重组蛋白的培养基。
序列表
SEQ ID NO：1代表编码flc2基因(图5A)的截短片段flc2’的核苷酸序列。
ATGATCTTCCTAAACACCTTCGCAAGGTGCCTTTTAACGTGTTTCGTACTGTGCAGCGG TACAGCACGTTCCTCTGACACAAACGACACTACTCCGGCGTCTGCAAAGCATTTGCAGACCACT TCTTTATTGACGTGTATGGACAATTCGCAATTAACGGCATCATTCTTTGATGTGAAATTTTACC CCGATAATAATACTGTTATCTTTGATATTGACGCTACGACGACGCTTAATGGGAACGTCACTGT GAAGGCTGAGCTGCTTACTTACGGACTGAAAGTCCTGGATAAGACTTTTGATTTATGTTCCTTG GGCCAAGTATCGCTTTCCCCCCTAAGTGCTGGGCGTATTGATGTCATGTCCACACAGGTGATCG AATCATCCATTACCAAGCAATTTCCCGGCATTGCTTACACCATTCCAGATTTGGACGCACAAGT ACGTGTGGTGGCATACGCTCAGAATGACACGGAATTCGAAACTCCGCTGGCTTGTGTCCAGGCT ATCTTGAGTAACGGGAAGACAGTGCAAACAAAGTATGCGGCCTGGCCCATTGCCGCTATCTCAG GTGTCGGTGTACTTACCTCAGGGTTTGTGTCTGTGATCGGTTACTCAGCCACTGCTGCTCACAT TGCGTCCAACTCCATCTCATTGTTCATATACTTCCAAAATCTAGCTATCACTGCAATGATGGGT GTCTCAAGGGTTCCACCCATTGCTGCCGCGTGGACGCAGAATTTCCAATGGTCCATGGGTATCA TCAATACAAACTTCATGCAAAAGATTTTTGATTGGTACGTACAGGCCACTAATGGTGTCTCAAA TGTTGTGGTAGCTAACAAGGACGTCTTGTCCATTAGTGTGCAAAAACGTGCTATCTCTATGGCA TCGTCTAGTGATTACAATTTTGACACCATTTTAGACGATTCGGATCTGTACACCACTTCTGAGA AGGATCCAAGCAATTACTCAGCCAAGATTCTCGTGTTAAGAGGTATAGAAAGAGTTGCTTATTT GGCTAATATTGAGCTATCTAATTTCTTTTTGACCGGTATTGTGTTTTTTCTATTCTTCCTATTT GTAGTTGTCGTCTCTTTGATTTTCTTTAAGGCGCTATTGGAAGTTCTTACAAGAGCAAGAATAT TGAAAGAGACTTCCAATTTCTTCCAATATAGGAAGAACTGGGGGAGTATTATCAAAGGCACCCT TTTCAGATTATCTATCATCGCCTTCCCTCAAGTTTCTCTTCTGGCGATTTGGGAATTTACTCAG GTCAACTCTCCAGCGATTGTTGTTGATGCGGTAGTAATATTACTGATCGATCCTCTAGAGTCGA CCTGCAGGCATGCAAGCTAG
SEQ ID NO：2代表flc2’(图5B)的氨基酸序列。
MIFLNTFARCLLTCFVLCSGTARSSDTNDTTPASAKHLQTTSLLTCMDNSQLTASFFDV KFYPDNNTVIFDIDATTTLNGNVTVKAELLTYGLKVLDKTFDLCSLGQVSLSPLSAGRIDVMSTQVIESSITKQFPGIAYTIPDLDAQVRVVAYAQNDTEFETPLACVQAILSNGKTVQTKYAAWPIA AISGVGVLTSGFVSVIGYSATAAHIASNSISLFIYFQNLAITAMMGVSRVPPIAAAWTQNFQWS MGIINTNFMQKIFDWYVQATNGVSNVVVANKDVLSISVQKRAISMASSSDYNFDTILDDSDLYT TSEKDPSNYSAKILVLRGIERVAYLANIELSNFFLTGIVFFLFFLFVVVVSLIFFKALLEVLTR ARILKETSNFFQYRKNWGSIIKGTLFRLSIIAFPQVSLLAIWEFTQVNSPAIVVDAVVILLIDP LESTCRHAS
SEQ ID NO：3代表编码内质网定位信号和编码flc2’编码区的跨膜域(TM)1至3(TM1-3)的核苷酸序列。
ATGATCTTCCTAAACACCTTCGCAAGGTGCCTTTTAACGTGTTTCGTACTGTGCAGCGG TACAGCACGTTCCTCTGACACAAACGACACTACTCCGGCGTCTGCAAAGCATTTGCAGACCACT TCTTTATTGACGTGTATGGACAATTCGCAATTAACGGCATCATTCTTTGATGTGAAATTTTACC CCGATAATAATACTGTTATCTTTGATATTGACGCTACGACGACGCTTAATGGGAACGTCACTGT GAAGGCTGAGCTGCTTACTTACGGACTGAAAGTCCTGGATAAGACTTTTGATTTATGTTCCTTG GGCCAAGTATCGCTTTCCCCCCTAAGTGCTGGGCGTATTGATGTCATGTCCACACAGGTGATCG AATCATCCATTACCAAGCAATTTCCCGGCATTGCTTACACCATTCCAGATTTGGACGCACAAGT ACGTGTGGTGGCATACGCTCAGAATGACACGGAATTCGAAACTCCGCTGGCTTGTGTCCAGGCT ATCTTGAGTAACGGGAAGACAGTGCAAACAAAGTATGCGGCCTGGCCCATTGCCGCTATCTCAG GTGTCGGTGTACTTACCTCAGGGTTTGTGTCTGTGATCGGTTACTCAGCCACTGCTGCTCACAT TGCGTCCAACTCCATCTCATTGTTCATATACTTCCAAAATCTAGCTATCACTGCAATGATGGGT GTCTCAAGGGTTCCACCCATTGCTGCCGCGTGGACGCAGAATTTCCAATGGTCCATGGGTATCA TCAATACAAACTTCATGCAAAAGATTTTTGATTGGTACGTACAGGCCACTAATGGTGTCTCAAA TGTTGTGGTAGCTAACAAGGACGTCTTGTCCATTAGTGTGCAAAAACGTGCTATCTCTATGGCA TCGTCTAGTGATTACAATTTTGACACCATTTTAGACGATTCGGATCTGTACACCACTTCTGAGA AGGATCCAAGCAATTACTCAGCCAAGATTCTCGTGTTAAGAGGTATAGAAAGAGTTGCTTATTT GGCTAATATTGAGCTATCTAATTTCTTTTTGACCGGTATTGTGTTTTTTCTATTCTTCCTATTT GTAGTTGTCGTCTCTTTGATTTTCTTTAAGTAG
SEQ ID NO：4代表内质网定位信号和flc2’的跨膜域(TM)1至3(TM1-3)的氨基酸序列。
MIFLNTFARCLLTCFVLCSGTARSSDTNDTTPASAKHLQTTSLLTCMDNSQLTASFFDV KFYPDNNTVIFDIDATTTLNGNVTVKAELLTYGLKVLDKTFDLCSLGQVSLSPLSAGRIDVMST QVIESSITKQFPGIAYTIPDLDAQVRVVAYAQNDTEFETPLACVQAILSNGKTVQTKYAAWPIA AISGVGVLTSGFVSVIGYSATAAHIASNSISLFIYFQNLAITAMMGVSRVPPIAAAWTQNFQWS MGIINTNFMQKIFDWYVQATNGVSNVVVANKDVLSISVQKRAISMASSSDYNFDTILDDSDLYT TSEKDPSNYSAKILVLRGIERVAYLANIELSNFFLTGIVFFLFFLFVVVVSLIFFK
SEQ ID NO：5代表编码内质网定位信号和编码flc2’编码区的跨膜域(TM)1至2(TM1-2)的核苷酸序列。
ATGATCTTCCTAAACACCTTCGCAAGGTGCCTTTTAACGTGTTTCGTACTGTGCAGCGG TACAGCACGTTCCTCTGACACAAACGACACTACTCCGGCGTCTGCAAAGCATTTGCAGACCACT TCTTTATTGACGTGTATGGACAATTCGCAATTAACGGCATCATTCTTTGATGTGAAATTTTACC CCGATAATAATACTGTTATCTTTGATATTGACGCTACGACGACGCTTAATGGGAACGTCACTGT GAAGGCTGAGCTGCTTACTTACGGACTGAAAGTCCTGGATAAGACTTTTGATTTATGTTCCTTG GGCCAAGTATCGCTTTCCCCCCTAAGTGCTGGGCGTATTGATGTCATGTCCACACAGGTGATCG AATCATCCATTACCAAGCAATTTCCCGGCATTGCTTACACCATTCCAGATTTGGACGCACAAGT ACGTGTGGTGGCATACGCTCAGAATGACACGGAATTCGAAACTCCGCTGGCTTGTGTCCAGGCT ATCTTGAGTAACGGGAAGACAGTGCAAACAAAGTATGCGGCCTGGCCCATTGCCGCTATCTCAG GTGTCGGTGTACTTACCTCAGGGTTTGTGTCTGTGATCGGTTACTCAGCCACTGCTGCTCACAT TGCGTCCAACTCCATCTCATTGTTCATATACTTCCAAAATCTAGCTATCACTGCAATGATGGGT GTCTCAAGGGTTCCACCCATTGCTGCCGCGTGGACTAG
SEQ ID NO：6代表内质网定位信号和flc2’的跨膜域(TM)1至2(TM1-2)的氨基酸序列。
MIFLNTFARCLLTCFVLCSGTARSSDTNDTTPASAKHLQTTSLLTCMDNSQLTASFFDV KFYPDNNTVIFDIDATTTLNGNVTVKAELLTYGLKVLDKTFDLCSLGQVSLSPLSAGRIDVMST QVIESSITKQFPGIAYTIPDLDAQVRVVAYAQNDTEFETPLACVQAILSNGKTVQTKYAAWPIA AISGVGVLTSGFVSVIGYSATAAHIASNSISLFIYFQNLAITAMMGVSRVPPIAAAWT
SEQ ID NO：7代表编码内质网定位信号和编码flc2’编码区的跨膜域(TM)2至4(TM2-4)的核苷酸序列。
ATGATCTTCCTAAACACCTTCGCAAGGTGCCTTTTAACGTGTTTCGTACTGTGCAGCGG TACAGCACGTTCCTCTGACACAAACGACATTGCGTCCAACTCCATCTCATTGTTCATATACTTC CAAAATCTAGCTATCACTGCAATGATGGGTGTCTCAAGGGTTCCACCCATTGCTGCCGCGTGGA CGCAGAATTTCCAATGGTCCATGGGTATCATCAATACAAACTTCATGCAAAAGATTTTTGATTG GTACGTACAGGCCACTAATGGTGTCTCAAATGTTGTGGTAGCTAACAAGGACGTCTTGTCCATT AGTGTGCAAAAACGTGCTATCTCTATGGCATCGTCTAGTGATTACAATTTTGACACCATTTTAG ACGATTCGGATCTGTACACCACTTCTGAGAAGGATCCAAGCAATTACTCAGCCAAGATTCTCGT GTTAAGAGGTATAGAAAGAGTTGCTTATTTGGCTAATATTGAGCTATCTAATTTCTTTTTGACC GGTATTGTGTTTTTTCTATTCTTCCTATTTGTAGTTGTCGTCTCTTTGATTTTCTTTAAGGCGC TATTGGAAGTTCTTACAAGAGCAAGAATATTGAAAGAGACTTCCAATTTCTTCCAATATAGGAA GAACTGGGGGAGTATTATCAAAGGCACCCTTTTCAGATTATCTATCATCGCCTTCCCTCAAGTT TCTCTTCTGGCGATTTGGGAATTTACTCAGGTCAACTCTCCAGCGATTGTTGTTGATGCGGTAG TAATATTACTGATCGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTAG
SEQ ID NO：8代表内质网定位信号和flc2’的跨膜域(TM)2至4(TM2-4)的氨基酸序列。
MIFLNTFARCLLTCFVLCSGTARSSDTNDIASNSISLFIYFQNLAITAMMGVSRVPPIA AAWTQNFQWSMGIINTNFMQKIFDWYVQATNGVSNVVVANKDVLSISVQKRAISMASSSDYNFD TILDDSDLYTTSEKDPSNYSAKILVLRGIERVAYLANIELSNFFLTGIVFFLFFLFVVVVSLIF FKALLEVLTRARILKETSNFFQYRKNWGSIIKGTLFRLSIIAFPQVSLLAIWEFTQVNSPAIVV DAVVILLIDPLESTCRHAS
SEQ ID NO：9代表编码内质网定位信号和编码flc2’编码区的跨膜域(TM)3至4(TM3-4)的核苷酸序列。
ATGATCTTCCTAAACACCTTCGCAAGGTGCCTTTTAACGTGTTTCGTACTGTGCAGCGG TACAGCACGTTCCTCTGACACAAACGACTTCTTTTTGACCGGTATTGTGTTTTTTCTATTCTTC CTATTTGTAGTTGTCGTCTCTTTGATTTTCTTTAAGGCGCTATTGGAAGTTCTTACAAGAGCAA GAATATTGAAAGAGACTTCCAATTTCTTCCAATATAGGAAGAACTGGGGGAGTATTATCAAAGG CACCCTTTTCAGATTATCTATCATCGCCTTCCCTCAAGTTTCTCTTCTGGCGATTTGGGAATTT ACTCAGGTCAACTCTCCAGCGATTGTTGTTGATGCGGTAGTAATATTACTGATCGATCCTCTAG AGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTAG
SEQ ID NO：10代表内质网定位信号和flc2’的跨膜域(TM)3至4(TM3-4)的氨基酸序列。
MIFLNTFARCLLTCFVLCSGTARSSDTNDFFLTGIVFFLFFLFVVVVSLIFFKALLEVL TRARILKETSNFFQYRKNWGSIIKGTLFRLSIIAFPQVSLLAIWEFTQVNSPAIVVDAVVILLI DPLESTCRHAS
SEQ ID NO：11代表编码内质网定位信号和编码flc2’编码区的跨膜域(TM)1(TM1)的核苷酸序列。
ATGATCTTCCTAAACACCTTCGCAAGGTGCCTTTTAACGTGTTTCGTACTGTGCAGCGG TACAGCACGTTCCTCTGACACAAACGACACTACTCCGGCGTCTGCAAAGCATTTGCAGACCACT TCTTTATTGACGTGTATGGACAATTCGCAATTAACGGCATCATTCTTTGATGTGAAATTTTACC CCGATAATAATACTGTTATCTTTGATATTGACGCTACGACGACGCTTAATGGGAACGTCACTGT GAAGGCTGAGCTGCTTACTTACGGACTGAAAGTCCTGGATAAGACTTTTGATTTATGTTCCTTG GGCCAAGTATCGCTTTCCCCCCTAAGTGCTGGGCGTATTGATGTCATGTCCACACAGGTGATCG AATCATCCATTACCAAGCAATTTCCCGGCATTGCTTACACCATTCCAGATTTGGACGCACAAGT ACGTGTGGTGGCATACGCTCAGAATGACACGGAATTCGAAACTCCGCTGGCTTGTGTCCAGGCT ATCTTGAGTAACGGGAAGACAGTGCAAACAAAGTATGCGGCCTGGCCCATTGCCGCTATCTCAG GTGTCGGTGTACTTACCTCAGGGTTTGTGTCTGTGATCGGTTACTCATAG
SEQ ID NO：12代表内质网定位信号和flc2’的跨膜域(TM)1(TM1)的氨基酸序列。
MIFLNTFARCLLTCFVLCSGTARSSDTNDTTPASAKHLQTTSLLTCMDNSQLTASFFDV KFYPDNNTVIFDIDATTTLNGNVTVKAELLTYGLKVLDKTFDLCSLGQVSLSPLSAGRIDVMST QVIESSITKQFPGIAYTIPDLDAQVRVVAYAQNDTEFETPLACVQAILSNGKTVQTKYAAWPIA AISGVGVLTSGFVSVIGYS
SEQ ID NO：13代表编码内质网定位信号和编码flc2’编码区的跨膜域(TM)2(TM2)的核苷酸序列。
ATGATCTTCCTAAACACCTTCGCAAGGTGCCTTTTAACGTGTTTCGTACTGTGCAGCGG TACAGCACGTTCCTCTGACACAAACGACATTGCGTCCAACTCCATCTCATTGTTCATATACTTC CAAAATCTAGCTATCACTGCAATGATGGGTGTCTCAAGGGTTCCACCCATTGCTGCCGCGTGGA CTAG
SEQ ID NO：14代表内质网定位信号和flc2’的跨膜域(TM)2(TM2)的氨基酸序列。
MIFLNTFARCLLTCFVLCSGTARSSDTNDIASNSISLFIYFQNLAITAMMGVSRVPPIA AAWT
SEQ ID NO：15代表编码内质网定位信号和编码flc2’编码区的跨膜域(TM)3(TM3)的核苷酸序列。
ATGATCTTCCTAAACACCTTCGCAAGGTGCCTTTTAACGTGTTTCGTACTGTGCAGCGG TACAGCACGTTCCTCTGACACAAACGACTTCTTTTTGACCGGTATTGTGTTTTTTCTATTCTTC CTATTTGTAGTTGTCGTCTCTTTGATTTTCTTTAAGTAG
SEQ ID NO：16代表内质网定位信号和flc2’的跨膜域(TM)3(TM3)的氨基酸序列。
MIFLNTFARCLLTCFVLCSGTARSSDTNDFFLTGIVFFLFFLFVVVVSLIFFK
SEQ ID NO：17代表编码内质网定位信号和编码flc2’编码区的跨膜域(TM)4(TM4)的核苷酸序列。
ATGATCTTCCTAAACACCTTCGCAAGGTGCCTTTTAACGTGTTTCGTACTGTGCAGCGG TACAGCACGTTCCTCTGACACAAACGACGGCACCCTTTTCAGATTATCTATCATCGCCTTCCCT CAAGTTTCTCTTCTGGCGATTTGGGAATTTACTCAGGTCAACTCTCCAGCGATTGTTGTTGATG CGGTAGTAATATTACTGATCGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTAG
SEQ ID NO：18代表内质网定位信号和flc2’的跨膜域(TM)4(TM4)的氨基酸序列。
MIFLNTFARCLLTCFVLCSGTARSSDTNDGTLFRLSIIAFPQVSLLAIWEFTQVNSPAI VVDAVVILLIDPLESTCRHAS
SEQ ID NO：19代表编码flc2’编码区的内质网定位信号的核苷酸序列。
ATGATCTTCCTAAACACCTTCGCAAGGTGCCTTTTAACGTGTTTCGTACTGTGCAGCGG TACAGCACGTTCC
SEQ ID NO：20代表Flc2’的内质网定位信号的氨基酸序列。
MIFLNTFARCLLTCFVLCSGTARS
SEQ ID NO：21代表编码flc2’的第一个跨膜域(TM1)的核苷酸序列。
GCCTGGCCCATTGCCGCTATCTCAGGTGTCGGTGTACTTACCTCAGGGTTTGTGTCTGT GATCGGTTAC
SEQ ID NO：22代表Flc2’的第一个跨膜域(TM1)的氨基酸序列。
AWPIAAISGVGVLTSGFVSVIGY
SEQ ID NO：23代表编码flc2’的第二个跨膜域(TM2)的核苷酸序列。
ATTGCGTCCAACTCCATCTCATTGTTCATATACTTCCAAAATCTAGCTATCACTGCAAT GATGGGTGTCTCAAGGGTTCCACCCATTGCTGCCGCGTG
SEQ ID NO：24代表Flc2’的第二个跨膜域(TM2)的氨基酸序列。
IASNSISLFIYFQNLAITAMMGVSRVPPIAAAW
SEQ ID NO：25代表编码flc2’的第三个跨膜域(TM3)的核苷酸序列。
TTCTTTTTGACCGGTATTGTGTTTTTTCTATTCTTCCTATTTGTAGTTGTCGTCTCTTT GATTTTCTTT
SEQ ID NO：26代表Flc2’的第三个跨膜域(TM3)的氨基酸序列。
FFLTGIVFFLFFLFVVVVSLIFF
SEQ ID NO：27代表编码flc2’的第四个跨膜域(TM4)的核苷酸序列。
GGCACCCTTTTCAGATTATCTATCATCGCCTTCCCTCAAGTTTCTCTTCTGGCGATTTG G
SEQ ID NO：28代表Flc2’的第四个跨膜域(TM4)的氨基酸序列。
GTLFRLSIIAFPQVSLLAIW
SEQ ID NO：29代表编码flc2’的第五个跨膜域(TM5)的核苷酸序列。
GTAGTAATATTACTGAT
SEQ ID NO：30代表Flc2’的第五个跨膜域(TM5)的氨基酸序列。
VVILLI
SEQ ID NO：31代表Flc2’表达质粒YEp352Flc2’(图13)的核苷酸序列，所述质粒带有包含ACS启动子(1..399)的Flc2’表达盒、具有潜在终止密码子(1753..1758)的flc2’(400..1722)。
SEQ ID NO：32代表LmStt3D及Flc2’共表达质粒pAX306f(图14)的核苷酸序列，所述质粒包括：包含ACS启动子(1..399)的Flc2’表达盒、flc2’ORF(400..1722)、在终止密码子后为CYC1终止子(6904..7155)，并且还包括在反方向包含LmStt3D ORF(补体)(7192..9762)及强组成型GPD启动子(补体)(9781..10435)的POT LmStt3D表达盒；LmStt3D的ATG正好在GPD启动子之后。
SEQ ID NO：33代表编码Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbStt3-1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：34代表LbStt3-1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：35代表编码Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbStt3-2的核苷酸序列。
SEQ ID NO：36代表LbStt3-2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：37代表编码Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbStt3-3的核苷酸序列。
SEQ ID NO：38代表LbStt3-3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：39代表编码Leishmania infantum的旁系同源基因LiStt3-1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：40代表LiStt3-1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41代表编码Leishmania infantum的旁系同源基因LiStt3-2的核苷酸序列。
SEQ ID NO：42代表LiStt3-2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：43代表编码Leishmania infantum的旁系同源基因LiStt3-3的核苷酸序列。
SEQ ID NO：44代表LiStt3-3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：45代表编码Leishmania major的旁系同源基因LmStt3A的核苷酸序列。
SEQ ID NO：46代表LmStt3A的氨基酸序列。
SEQ ID NO：47代表编码Leishmania major的旁系同源基因LmStt3B的核苷酸序列。
SEQ ID NO：48代表LmStt3B的氨基酸序列。
SEQ ID NO：49代表编码Leishmania major的旁系同源基因LmStt3C的核苷酸序列。
SEQ ID NO：50代表LmStt3C的氨基酸序列。
SEQ ID NO：51代表编码Leishmania major的旁系同源基因LmStt3D的核苷酸序列。
SEQ ID NO：52代表LmStt3D的氨基酸序列。
SEQ ID NO：53代表编码Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbStt3A的核苷酸序列。
SEQ ID NO：54代表TbStt3A的氨基酸序列。
SEQ ID NO：55代表编码Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbStt3B的核苷酸序列。
SEQ ID NO：56代表TbStt3B的氨基酸序列。
SEQ ID NO：57代表编码Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbStt3C的核苷酸序列。
SEQ ID NO：58代表TbStt3C的氨基酸序列。
SEQ ID NO：59代表编码Trypanosoma cruzi的旁系同源基因TbStt3的核苷酸序列。
SEQ ID NO：60代表TbStt3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：61代表编码flc2’的内源性启动子部分的核苷酸序列。
实施例
实施例1具有Man3GlcNAc2结构的糖蛋白的制造
1.1酵母培养基及方法
除非另外说明，所有菌株都在YPD培养基上生长。菌株YG1137在YPGal上保持。除非另外说明，菌株YCN1(Δrft1)，YG1363(Δalg3Δalg11)，YG1365(Δalg11)，及YG1830(alg2-1)在补充有1M山梨醇的培养基中生长。
1.2菌株构建
通过整合包括S.cerevisiae HIS3位点的PCR产物，在SS328XSS330中取代整个Alg11开放阅读框。使转化的酵母菌株YG1141(MATa/αade2-201/ade2-201 ura3-52/ura3-52 his3Δ200/his3Δ200 tyr1/+lys2-801/+Δalg11::HIS3/+)产生孢子，并分裂四分体以获得Δalg11单倍体，及与YG248(MATaΔalg3::HIS3 ade2-101 his3Δ200 lys2-801 ura3-52)配对的YG1361(MATαade2-201 ura3-52 his3Δ200Δalg11::HIS3)。使得到的二倍体YG1362(MATa/αade2-201/ade2-201 ura3-52/ura3-52 his3Δ200/his3Δ200 lys2-801/+Δalg3::HIS3Δalg11::HIS3/+)在包括1M山梨醇的平板上产生孢子，以获得单倍体菌株YG1365(MATαade2-101 ura3-52 his3Δ200Δalg11::HIS3)和YG1363(MATαade2-101 ura3-52 his3Δ200 lys2-801Δalg3::HIS3Δalg11::HIS3)。通过在二倍体菌株中用HIS3框架取代rft1基因、所述得到的二倍体杂交菌株的孢子形成及所述得到的单倍体Δrft1::HIS3菌株(YCN1)的选择来制造Δrft1菌株。
1.3蛋白分析
如上所述进行蛋白提取及免疫印迹分析。抗CPY抗体被稀释3000倍。
1.4脂质和蛋白连接寡糖分析
如上所述，标记、提取并分析脂质连接寡糖。简单地说，在YPD中培育酵母细胞(50ml培养物在546nm处的吸光度为1)，并在用有机溶剂溶解细胞之前于包括[3H]-甘露糖的介质中孵化。使用有机溶剂提取脂质连接寡糖并通过温和酸水解释放寡糖。使用流通计数的氨基柱，采用HPLC法分析释放的寡糖。由总计数划分的每分钟计数的数目被包括在内。一个样本中总信号的百分比为使用两种测定方法的平均值。在脂质连接寡糖提取之后，从细胞碎片中纯化N-连接寡糖。将碎片中的蛋白质溶解(在100℃10min)于0.2ml 1％SDS，50mmol/l Tris-HCl，1％-巯基乙醇中。离心(2min，15,000g)后补足上清液至0.25ml中NP40为1％(v/v)，并使用PNGaseF(2单位，于37℃过夜)消化掉蛋白连接寡糖。用0.75ml甲醇沉淀蛋白并于15,000g条件下旋转样品20min。将上清液干燥并重新混悬于0.2ml 70∶30乙腈∶水中，取0.1ml采用上述的HPLC进行分析。
1.5 MALDI-TOF-MS
对于来源于细胞壁蛋白质的N-多糖的分析，使用玻璃珠在10mmol/lTris中破碎细胞，并在含有2M硫脲、7mol/l尿素、pH 8.0的2％SDS 50mmol/l Tris及10mmol/l DTT的缓冲液中减少不溶的细胞壁碎片。在含有25mmol/l碘代乙酰胺的相同缓冲液中于37℃剧烈振摇1h进行烷基化。离心收集所述细胞壁碎片并在50mmol/l NH4CO3中清洗得到的球状物。
在含有1x变性缓冲液、pH7.5的50mmol/l磷酸缓冲液及1％NP-40的缓冲液中使用1μl PNGase F，于37℃过夜，释放N-多糖。用C18和碳柱纯化N-多糖，并浓缩含有N-多糖的洗脱液。用2-氨基苯甲酰胺标记N-多糖并使用碳柱进行最后纯化。使用Autoflex MALDI-TOF MS(Bruker Daltonics，
Figure BPA00001358342601021
Switzerland)在正离子模式下并在反射模式操作下获得纯化的N-多糖制剂的质谱。测定m/z的范围为800 3000。
1.6高拷贝抑制基因筛选
对于高拷贝抑制基因筛选，将1μg包含部分消化的被导入载体YEp352(Hill et al.，1986)中的酵母染色体DNA的基因组文库(Stagljar et al.，1994)通过电穿孔转化进入1x109YNC1(Δrft1)细胞，并用1M山梨醇于25℃在缺乏尿嘧啶的基本培养基上选择转化株。通过于33℃在YPD和YPDS上影印培养来检测转化株的生长情况。检测阳性菌落(于33℃生长在YPD和YPDS上)对支持Δrft1在33、35及37℃下生长的能力。通过提取总酵母DNA来分离表现出全部或部分抑制的菌落的质粒DNA，并将其用于E.coli菌株DH5中的质粒扩增。重新转化回收的质粒并检测它们对支持Δrft1在YPD上33、35及37℃下生长的能力。进一步分析64 C.tes对改善Δrft1细胞中的糖基化的能力。用M13(GTA AAA CGA CGG CCA GT)及M13rev(GAG CGG ATA ACA ATT)引物确定选择性高拷贝抑制基因质粒的顺序。
1.7斑点分析
为评价酵母菌株或酵母突变菌株例如表达Rft1或Flc2’或其片段的Δrft1，Δalg11或Δalg2突变菌株的生长，对这些菌株进行斑点分析。将菌株过夜培养并调节培养物至相等的细胞密度。将系列稀释物涂在琼脂平板上，并将所述平板孵化3天至指定温度。
在液体介质中的生长分析按如下方法进行，将用单一菌落接种的预培养液在5ml缺少尿嘧啶的SD介质中培育48h来维持质粒，并用1mol/l山梨醇补足。在600nm测定细胞密度。以达到起始细胞密度0.05相等的细胞量接种25ml相同的介质来进行生长分析。将细胞在回转摇床上以200rpm于23℃或30℃培育48h。在指定时间点测量细胞密度。
1.8 Man3GlcNAc2结构的产生
脂质连接寡糖(LLO)作为内质网(ER)中寡糖基转移酶的底物的代表，转移装配好的糖脂N-糖基化共有序列的天冬酰胺残基。所述脂质连接寡糖的构建是序列加工，其中，来源于被激活的糖供体的糖被添加到生长的脂质连接寡糖结构上。所述脂质连接寡糖合成的详细途径如图1所述。通过从细胞中去除特定的转移酶而产生特定的脂质连接寡糖结构。
不希望受理论的束缚，发明人已经发现，在所述过程中，蛋白质Alg3p及Alg11p在脂质连接寡糖结构的构建中起到很重要的作用。通过Alg11p的靶向去除，可以成功地阻止A-分支的合成，从而导致主要产生Man6GlcNAc2及Man7GlcNAc2结构(图2A)。在本发明的宿主细胞中，Man3GlcNAc2结构能在内质网的胞质面被合成，然后被翻转进入内质网腔，作为定位于内质网腔的转移酶的底物。此外，Alg3p，作为催化发起B-分支的(1，3)-甘露糖导入的酶，也被认定在被翻转的脂质连接寡糖底物的加工中起到很重要的主要。Alg3p的去除不仅阻止B-分支的形成，而且(1，3)-甘露糖的存在对于C-分支的形成是必要的。因此，提供了突变酵母菌株或类似菌株，缺乏Alg3p和Alg11p这两种。因此，本发明的宿主细胞主要制造并优选仅制造低甘露糖，尤其是Man3GlcNAc2多糖结构，例如，通过[3H]-甘露糖标记和制造的脂质连接寡糖结构的HPLC图(图2B)所揭示的。
使用[3H]-甘露糖标记的蛋白连接寡糖(NLO)分析揭示了在Δalg3Δalg11菌株中的结构大于Man3GlcNAc2，但小于在Δalg11菌株中制造的N-多糖结构(图3B)。
使用分离自细胞壁蛋白质的2-AB标记N-多糖的MALDI-TOF MS进一步表征所述结构(图4)。在野生型酵母中，包含除GlcNAc2之外的8和9个己糖残基的多糖排列存在于还原端(图4A)，与此相反，在Δalg11菌株中，在还原端主要检测到包含除GlcNAc2之外的5至9个己糖残基的N-多糖(图4B)，在Δalg3Δalg11菌株中，检测到Man3GlcNAc2(m/z 1053)的小碎片及Man4GlcNAc2(m/z 1215)和Man5GlcNAc2(m/z 1377)的大碎片(图4C)。
总的说来，脂质连接寡糖和蛋白连接寡糖的分析表明，在Δalg3Δalg11菌株中，Man3GlcNAc2在内质网中被制造并被转移至蛋白质，但是所述结构进一步在高尔基体中被修饰。
1.9高拷贝抑制基因筛选-新翻转酶的鉴定
高拷贝抑制基因筛选(HCSS)是一种优选和有效的方法，用于选择提供期望表型的基因。
为了鉴定能补偿必要的Rft1功能缺乏的基因，在Δrft1菌株中进行了高拷贝抑制基因筛选。基因组酵母DNA文库从突变菌株的高拷贝质粒Yep352中被表达。
用1mol/l山梨醇于25℃在缺乏尿嘧啶的基本培养基上选择转化株。通过于33℃在YPD和YPDS上影印培养来检测转化株的生长情况。检测阳性菌落(于33℃生长在YPD和YPDS上)对支持Δrft1在33、35及37℃下生长的能力。进一步分析64 C.tes对改善Δrft1细胞中的糖基化的能力。
一种克隆包括了flc2基因的3’端截短翻译(flc2’)。Flc2’在酵母1号染色体上被编码。在HCSS筛选中鉴定的截短翻译包括全长基因的碱基43309至44631，所述全长基因包括其天然启动子。Flc2’表达质粒(YEp352Flc2’)的序列示于图13(SEQ ID NO：33)中，或Flc2’的编码序列描述于图5A中。Flc2’编码包含4个完整的和第五截短跨膜域的452个氨基酸的蛋白质。从氨基酸442至452的C-末端11个氨基酸来源于克隆程序(图5B)。所述flc2’基因序列及其启动子表示于图5(图5L)中。
1.10突变宿主细胞
对携带Rft1或Flc2’表达质粒的Δrft1，Δalg11或alg2-1突变菌株进行斑点分析。使细胞在YPD平板上形成斑点。将所述平板分别于37、30或31.5℃孵化3天。Flc2’的超表达导致Δrft1或Δalg11菌株生长改善，显示出与表达Rft1的突变菌株相同或相似的生长表型(图6A及6B)。Flc2’的超表达还导致alg2-1菌株生长改善，而Rft1的超表达未导致生长改善(图6C)。
所述Δalg3Δalg11菌株显示出高温度敏感性表型和生长缺陷。这些缺陷可以被Flc2’的表达强烈削弱。Flc2’的表达强烈改善菌株的生长行为并降低温度敏感性(图18B)。
此外，对携带表达质粒的Δrft1突变菌株进行了斑点分析，所述质粒编码Flc2’的跨膜域3(SEQ ID NO：16)或跨膜域3和4(SEQ ID NO：10)。如上所述细胞被形成斑点并于37℃孵化3天。Flc2’的跨膜域1-3或Flc2’的跨膜域3-4的超表达导致生长改善，而表达全长Flc2的细胞未表现出生长改善(图7A和7B)。
此外，检测了Flc2’在Δrft1菌株中恢复糖基化缺陷的能力。在SD ura介质(缺少尿嘧啶的合成葡萄糖培养基)中培育野生型菌株和Δrft1菌株，所述Δrft1菌株携带空质粒(YEp352)，或携带用于Rft1和Flc2’的超表达的质粒。在SDS-PAGE凝胶分离并通过使用抗CPY抗体的免疫印迹法总可溶蛋白质。Flc2’的超表达恢复羧肽酶CPY在Δrft1菌株中的N-糖基化至与免疫印迹所揭示的Rft1的超表达中所观察到的水平相似的水平(图7C)。
为了研究Flc2’对脂质连接寡糖合成的影响，对携带Flc2’表达构造(图8C)的Δrft1细胞进行了3H-甘露糖标记。使用携带空载体YEp352(图8A)的Δrft1细胞和携带Rft1表达构造(图8B)的Δrft1细胞作为对照。首先用[3H]-甘露糖标记细胞。通过酸水解从脂质载体中释放出寡糖，并使用HPLC纯化和分析所述寡糖。[3H]-甘露糖标记的脂质连接寡糖的HPLC图显示，在缺乏功能性翻转酶的情况下，细胞累积Man5GlcNAc2(图8A)。这表明脂质连接寡糖合成在内质网胞质面上由Alg11p催化的步骤之后停止，由于没有能翻转Man5GlcNAc2进入内质网腔的分子存在。在质粒上提供rft1恢复了脂质连接寡糖合成并导致Glc3Man9GlcNAc2的累积(图8B)。在Δrft1细胞中Flc2’的表达基础上，翻转被恢复，并且除了Man5GlcNAc2，Glc3Man9GlcNAc2也在细胞中被累积(图8C)。总的说来，该数据表明Flc2’在Δrft1酵母细胞中是作为翻转酶起作用的。
Δrft1突变菌株中Flc2’和/或Rft1的表达提高了48h后培养物的最终的细胞密度，达到相对于对照菌株细胞密度高大约3倍的近似程度(表6)。与Flc2’相反，全长Flc2的超表达为补偿在Δrft1突变菌株中的翻转酶敲除：可以看出相对于Δrft1菌株的对照，无生长改善。内源性全长Flc2不能补偿Δrft1菌株的生长缺陷。
Rft1或Flc2’的表达改善了生长并导致Δalg11(图19A)和Δalg3Δalg11(图18A)突变菌株48h后的最终光学细胞密度高于仅携带空质粒的相应的对照菌株。在Δalg11菌株中，Flc2*的表达相对于载体对照改善了生长33％，Rft1的超表达导致最终的细胞密度增长49％。在Δalg3Δalg11突变菌株中，Flc2*的表达相对于载体对照改善了生长54％，Rft1的超表达导致最终的细胞密度增长74％(表6)。
表6概括了超表达Rft1，Flc2’，全长Flc2或携带空载体(对照)的酵母菌株的生长分析的结果(n.d.＝未测出/检测)。
表6
Figure BPA00001358342601061
1.11 Man3GlcNAc2结构的翻转和转移
在Δalg3Δalg11菌株中分析了Flc2’的超表达对羧肽酶Y(CPY)的N-糖基化效率的影响。在SD ura介质中培育野生型菌株和Δalg3Δalg11菌株，所述Δalg3Δalg11菌株携带空质粒(YEp352)，或携带用于Flc2’或Rft1的超表达的质粒。在SDS-PAGE凝胶分离并通过使用抗CPY抗体的免疫印迹法总可溶蛋白质(图9)。在野生型细胞中，CPY不依赖于Rft1或Flc2’的超表达而被完全地糖基化。但是，通过CPY向高分子量的变化揭示了Δalg3Δalg11菌株中Flc2’或Rft1的表达改善了CPY的糖基化(图9)。
1.12 alg2-1菌株中翻转酶的特异性分析
为了确认Flc2’对短脂质连接寡糖的和特异性，选择了一种携带温度敏感性Alg2蛋白的酵母菌株。由于较低的Alg2，所述菌株主要累积Man1GlcNAc2(M1)和Man2GlcNAc2(M2)结构。但是，残余的酶导致常规的酵母脂质连接寡糖Glc3Man9GlcNAc2的产生。如果M1或M2被翻转入内质网腔，这两类脂质连接寡糖不是Alg途径中涉及的腔内甘露糖基转移酶的底物。M1或M2，还有Glc3Man9GlcNAc2被转移至蛋白质上。所述Glc3Man9GlcNAc2结构在内质网及高尔基体中被进一步加工，而形成包含8至14个甘露糖残基的蛋白连接寡糖(NLO)类。用Flc2’和Rft1表达载体及空载体对照来转化Alg2-1菌株。培育所述菌株至A600为1并收获所述细胞。分离、减少、烷基化细胞壁蛋白质，并使用PNGase F释放N-多糖。纯化、全甲基化N-多糖，并通过MALDI-TOF MS在m/z为700至4000范围内分析N-多糖。
在MALDI-TOF谱图中检测到M1，M2的预期大小的峰及高甘露糖结构Man8GlcNAc2至Man14GlcNAc2(M8至M14)。在NLO类的峰强度的基础上，计算每个结构的相对丰度。M1或M2类中相对增加表明这些结构的翻转优势于由Alg2催化的延长。Flc2’的表达导致M1结构累积了88.5％。相反，在表达Rft1或携带空载体的Alg2-1菌株中，M1结构对总的N-多糖仅贡献了74.7％和78.7％(表7)。
表7概括了N-多糖在超表达Rft1或Flc2*或携带空载体的Alg2-1菌株中的相对丰度(％)。
表7
Figure BPA00001358342601081
1.13Δalg11菌株中翻转酶的特异性分析
为了确认Flc2’对Man3GlcNac2(M3)结构的和特异性，选择了一种Δalg11酵母菌株。该菌株的使用允许确定脂质连接寡糖结构在内质网膜的胞质面和腔面的相对丰度。由于alg11基因的失活，胞质面上脂质连接寡糖的合成仅进行到M3的水平。所述结构如果被翻转入内质网腔，就会被Alg3进一步修饰，并且随后的甘露糖基转移酶导致M7的产生。采用3H-甘露糖标记细胞允许使用HPLC对不同脂质连接寡糖类的相对丰度进行定量。如果翻转是无效的，则胞质脂质连接寡糖类累积到内质网膜的胞质面上，与腔内脂质连接寡糖减少的相对量正好相反。
Flc2’和Rft1在Δalg11菌株中的表达降低了胞质脂质连接寡糖类对脂质连接寡糖总量的相对贡献(图17A，17B，17C)，因此增加腔内脂质连接寡糖类从对照菌株中的大约43％至超表达Flc2’或Rft1的两种菌株中的大约70％(表8)。
表8概括了不同脂质连接寡糖类在超表达Rft1或Flc2*或携带空载体的Δalg11菌株中的相对丰度(％)。脂质连接寡糖被指定到胞质组或腔内组。
表8
Figure BPA00001358342601082
1.14 Δalg3 Δalg11 Δmnn1敲除菌株的产生
用Δalg3缺失菌株与Δmnn1缺失菌株进行杂交。使二倍体杂交Δalg3Δalg11菌株形成孢子并检测单倍体孢子的Δalg3和mnn1基因是否缺乏。通过PCR分析检测双敲除菌株的Δalg3和mnn1基因是否缺乏。然后，进一步用Δalg3Δalg11菌株与选择的Δalg3Δmmn1菌株进行杂交，使得到的菌株形成孢子，并分析四分体是否为缺乏alg3，alg11和mnn1基因的菌株。
分析双重突变和三重突变的糖形。用PNGase F从细胞壁蛋白质中释放N-多糖，用2-AB对N-多糖进行标记并采用MALDI-TOF MS进行分析。来源于Δalg3Δalg11和三重突变菌株的N-多糖谱的比较揭示了在m/z＝1377处代表M5结构的峰减少。这些数据表明通过去除mnn1基因，可以终止NLO在高尔基体中的修饰。图22描述了从来源于Δalg3Δalg11酵母突变菌株(图22A)及Δalg11Δalg3Δmnn1酵母突变菌株(图22B)的细胞壁蛋白质中分离的2-AB-标记N-多糖的MALDI-TOF MS谱。
实施例2用于糖基化的复合系统
2.1新的脂质连接寡糖和原生动物寡糖基转移酶在酵母突变菌株中的表达
在一个优选实施方案中，提供了一种用于蛋白质糖基化，尤其是在酵母中糖基化的复合系统，包括至少3个实体：(i)作为寡糖基转移酶前体的脂质连接Man3GlcNAc2的产生；(ii)一种翻转酶例如(Flc2’)；及(iii)显示出松弛底物特异性的原生动物寡糖基转移酶(POT)。
为了将翻转酶和原生动物寡糖基转移酶这两种异源蛋白结合，构建了包括这两部分的载体。
结果，在GPD启动子和cyc1终止子调控下的原生动物寡糖基转移酶(LmStt3D)以反转录基因的形式被插入到包括Flc2’的载体中。携带LmStt3D，Flc2’或携带这两种酶的质粒被转化入野生型酵母(YG1509)或缺乏alg11(YG1365)或缺乏alg11和alg3(YG1363)的酵母细胞中，并用蛋白免疫印迹法分析CPY和Gas1p的N-糖基化(图10)。
在未缺失定位于内质网的寡糖基转移酶的对照菌株中，CPY流动性在Flc2’或LmStt3D，或Flc2’和LmStt3D两者的表达上是相同的。在缺乏alg11并制造脂质连接GlcNAc2Man5的酵母菌株YG1365或缺乏alg11和alg3并制造脂质连接GlcNAc2Man3的酵母菌株YG1363中，Flc2’和LmStt3D的共表达使CPY向相对于单独表达Flc2’或Rft1的细胞较高的分子量变化，表明在Flc2’和LmStt3D存在下，CPY更完整的N-糖基化。在β-1，3-葡聚糖转移酶(Gas1p)观察到流动性的相似变化。该GPI锚定蛋白定位在细胞壁上，并且也经历发生在高尔基体中的修饰。
在Δalg11菌株中分析了Flc2’和LmStt3D的超表达对羧肽酶Y(CPY)的N-糖基化效率的影响，所述Δalg11菌株携带空质粒(YEp352)，或携带用于Flc2’，或LmStt3D，或Flc2’和LmStt3D的超表达的质粒。在SD ura介质中于23℃培育所述菌株。在SDS-PAGE凝胶分离并通过使用抗CPY抗体的免疫印迹法总可溶蛋白质(图11)。在超表达Flc2’和LmStt3D的Δalg11细胞中，CPY被完全地糖基化(mCPY)，然而，仅超表达Flc2’或POT LmStt3D的细胞与载体对照相比，减少CPY的低糖基化，但未达到与Flc2′和POT共表达相同的程度(图11)。
在被示意性地示于图12中的复合系统中，alg3及alg11两种基因被缺失致脂质连接Man3GlcNAc2的产生。剩余的转移酶仍然存在于细胞中，但是，对脂质连接Man3GlcNAc2底物是无的。在第一个方法中，添加了新的翻转酶(例如Flc2’)。第二，添加了原生动物寡糖基转移酶(POT，例如Leishmania major Stt3D)。替代脂质连接Man3GlcNAc2的产生的方案可以是缺失dpm1基因，所述基因产物在内质网膜的胞质面制造脂质连接甘露糖，或者缺失翻转多萜醇连接寡糖进入内质网腔的单糖翻转酶。脂质连接甘露糖为定位于内质网腔的寡糖基转移酶提供供体。通过与alg11突变结合，这样一种细胞还能制造脂质连接Man3GlcNAc2。多余未用的转移酶、翻转酶(Rft1)、酵母Ost复合物的组分及未合成的结构以灰体描述。
2.2原生动物寡糖基转移酶在酵母突变菌株中的表达
提供了一种用于蛋白质糖基化，尤其是在酵母中糖基化的复合系统，包括至少2个实体：(i)作为寡糖基转移酶前体的脂质连接Man3GlcNAc2的产生；(ii)显示出松弛底物特异性的原生动物寡糖基转移酶(POT)的一种或多种旁系同源基因的表达。
构建了包括原生动物寡糖基转移酶的载体。L.major具有LmStt3A至LmStt3D四个Stt3旁系同源基因；L.braziliensis and L.infantum每种具有分别命名为Lb3_1至Lb3_3，及Li3_1至Li3_3的三种不同的Stt3旁系同源基因。低拷贝数质粒和高拷贝数质粒上均包括所有单个的原生动物寡糖基转移酶基因。此外，高拷贝数质粒上还包括Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbStt3_B及TbStt3_C的原生动物寡糖基转移酶基因。
每个原生动物寡糖基转移酶旁系同源基因在被修饰的Δalg11突变酵母菌株及Δalg3Δalg11突变酵母菌株中被表达，所述菌株导入了原生动物寡糖基转移酶质粒。制备所有菌株的细胞提取物，并采用CPY特殊抗体对其进行分析。N-糖基化效率结果的比较揭示每个原生动物寡糖基转移酶的效果在不同的突变菌株中有所区别，表明不同的原生动物寡糖基转移酶对脂质连接寡糖底物具有不同的偏爱。原生动物寡糖基转移酶从低拷贝数质粒的表达在改善N-糖基化方面比从高拷贝数质粒的表达更有效，表明适当的表达水平是关键的并且可以被优化。
为建立N-糖基化计分，分析了一组Western CPY印迹(n＝2 to 5)，将N-糖基化效率与未修饰的Δalg11及Δalg3Δalg11参照相比较，计为0(无附加影响)至3(高附加影响)。通过合计单个实验的点并划分重复的总沟数计算N-糖基化计分。结果概括于表9中。
表9
Figure BPA00001358342601111
Figure IPA00001358342000011
Figure IPA00001358342000021
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Claims (101)

1.一种被修饰以表达脂质连接寡糖(LLO)翻转酶活性物的细胞，所述脂质连接寡糖翻转酶活性物能够从细胞器的胞质面向其腔面高效地翻转包含1个甘露糖残基的脂质连接寡糖，能够高效地翻转包含2个甘露糖残基的脂质连接寡糖，并且能够高效地翻转包含3个甘露糖残基的脂质连接寡糖。
2.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述脂质连接寡糖翻转酶具有翻转选自Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2和Man3GlcNAc2的脂质连接寡糖的活性。
3.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述脂质连接寡糖翻转酶活性物通过一种或多种核酸分子的表达来提供，所述核酸分子选自：
a)包含下述一个或多个序列的核酸分子：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，和SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，和SEQ ID NO：29；
b)包含下述一个或多个序列的编码聚氨基酸的核酸分子：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14；SEQ ID NO 16和SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，和SEQ ID NO：30；及
c)a)或b)所述的核酸分子的片段、变体、类似物或衍生物。
4.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述的细胞器为内质网(ER)。
5.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞包含至少一种编码异源(糖)蛋白的核酸，并表达所述(糖)蛋白。
6.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Rft1型脂质连接寡糖翻转酶活性物，其中，所述Rft1型脂质连接寡糖翻转酶活性物的特征在于，对带有1至3个甘露糖残基的脂质连接寡糖的翻转活性小于对带有5个甘露糖残基的脂质连接寡糖的翻转活性。
7.如权利要求6所述的细胞，其中，所述细胞为rft1基因或rft1同源基因的敲除突变株。
8.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的一种或多种定位于内质网的糖基转移酶活性物。
9.如权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述定位于内质网的糖基转移酶为甘露糖基转移酶。
10.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的一种或多种定位于内质网的脂质连接单糖(LLM)翻转酶活性物。
11.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg11型活性物。
12.如权利要求11所述的细胞，其中，所述细胞为alg11基因或alg11同源基因的敲除突变株。
13.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg11型活性物，并且进一步缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的一种或多种脂质连接单糖(LLM)翻转酶型活性物。
14.如权利要求13所述的细胞，其中，所述细胞为alg11基因或alg11同源基因及一种或多种编码脂质连接单糖(LLM)翻转酶活性物的基因的敲除突变株。
15.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg11型活性物，并且进一步缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg3型活性物。
16.如权利要求16所述的细胞，其中，所述细胞为alg11基因或alg11同源基因及alg3基因或alg3同源基因的敲除突变株。
17.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg11型活性物，并且进一步缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的β-D-甘露糖基转移酶或DPM1型活性物。
18.如权利要求17所述的细胞，其中，所述细胞为alg11基因或alg11同源基因及dpm1基因或dpm1同源基因的敲除突变株。
19.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg2型活性物。
20.如权利要求19所述的细胞，其中，所述细胞为alg2基因或alg2同源基因的敲除突变株。
21.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞包含一种或多种编码寡糖基转移酶活性物的核酸分子，所述寡糖基转移酶活性物的特征在于，其能够转移除Glc3Man9GlcNAc2之外的寡糖至蛋白质。
22.如权利要求21所述的细胞，其特征在于，所述寡糖基转移酶活性物为原生动物寡糖基转移酶(POT)活性物。
23.如权利要求22所述的细胞，其特征在于，所述原生动物寡糖基转移酶活性物来源于弓形虫(Toxoplasma gondii(Tg))，硕大利什曼虫(Leishmania major(Lm))；婴儿利什曼虫(Leishmania infantum(Li))，巴西利什曼虫(Leishmania braziliensis(Lb))，墨西哥利什曼虫(Leishmania Mexicana(Lmx))，杜氏利什曼虫(Leishmania donovani(Ld))，利什曼虫圭亚那亚种(Leishmania guyanensis(Lg))，热带利什曼虫(Leishmania tropica(Lt))，克氏锥虫(Trypanosoma cruzi(Tc))，或布氏锥虫(Trypanosoma brucei(Tb))。
24.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述原生动物寡糖基转移酶活性物选自TbStt3Bp型活性物，TbStt3Cp型活性物，LmStt3Ap型活性物，LmStt3Bp型活性物，及LmStt3Dp型活性物。
25.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述原生动物寡糖基转移酶活性物选自TbStt3B型活性物，TbStt3C型活性物；LmStt3A型活性物，LmStt3B型活性物，LmStt3C型活性物，及LmStt3D型活性物；LiStt3-1型活性物，LiStt3-2型活性物，及LiStt3-3型活性物；LbStt3-1型活性物，LbStt3-2型活性物，及LbStt3-3型活性物。
26.一种被修饰以表达寡糖基转移酶活性物的细胞，所述寡糖基转移酶活性物能够高效地转移包含3个甘露糖残基、4个甘露糖残基和/或5个甘露糖残基的寡糖至蛋白质。
27.如权利要求26所述的细胞，其特征在于，所述寡糖基转移酶活性物为单单元原生动物寡糖基转移酶(POT)。
28.如权利要求27所述的细胞，其特征在于，所述原生动物寡糖基转移酶活性物来源于弓形虫(Toxoplasma gondii(Tg))，硕大利什曼虫(Leishmania major(Lm))；婴儿利什曼虫(Leishmania infantum(Li))，巴西利什曼虫(Leishmania braziliensis(Lb))，墨西哥利什曼虫(Leishmania Mexicana(Lmx))，杜氏利什曼虫(Leishmania donovani(Ld))，利什曼虫圭亚那亚种(Leishmania guyanensis(Lg))，热带利什曼虫(Leishmania tropica(Lt))，克氏锥虫(Trypanosoma cruzi(Tc))，或布氏锥虫(Trypanosoma brucei(Tb))。
29.如权利要求28所述的细胞，其特征在于，所述原生动物寡糖基转移酶活性物选自TbStt3Bp型活性物，TbStt3Cp型活性物，LmStt3Ap型活性物，LmStt3Bp型活性物，及LmStt3Dp型活性物。
30.如权利要求28所述的细胞，其特征在于，所述原生动物寡糖基转移酶选自TbStt3B型活性物，TbStt3C型活性物；LmStt3A型活性物，LmStt3B型活性物，LmStt3C型活性物，及LmStt3D型活性物；LiStt3-1型活性物，LiStt3-2型活性物，及LiStt3-3型活性物；LbStt3-1型活性物，LbStt3-2型活性物，及LbStt3-3型活性物。
31.如权利要求26-30中任一权利要求所述的细胞，其特征还在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的一种或多种定位于内质网的糖基转移酶活性物。
32.如权利要求31所述的细胞，其特征在于，所述定位于内质网的糖基转移酶为甘露糖基转移酶。
33.如权利要求26-32中任一权利要求所述的细胞，其特征还在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的一种或多种定位于内质网的脂质连接单糖(LLM)翻转酶活性物。
34.如权利要求26-33中任一权利要求所述的细胞，其特征还在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg11型活性物。
35.如权利要求34所述的细胞，其中，所述细胞为alg11基因或alg11同源基因的敲除突变株。
36.如权利要求26-35中任一权利要求所述的细胞，其特征还在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg11型活性物，并且进一步缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的一种或多种脂质连接单糖(LLM)翻转酶型活性物。
37.如权利要求36所述的细胞，其中，所述细胞为alg11基因或alg11同源基因及一个或多个编码脂质连接单糖(LLM)翻转酶活性物的基因的敲除突变株。
38.如权利要求26-37中任一权利要求所述的细胞，其特征还在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg11型活性物，并且进一步缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg3型活性物。
39.如权利要求38所述的细胞，其中，所述细胞为alg11基因或alg11同源基因及alg3基因或alg3同源基因的敲除突变株。
40.如权利要求26-39中任一权利要求所述的细胞，其特征在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Alg11型活性物，并且进一步缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的β-D-甘露糖基转移酶或DPM型活性物1。
41.如权利要求40所述的细胞，其中，所述细胞为alg11基因或alg11同源基因及dpm1基因或dpm1同源基因的敲除突变株。
42.如权利要求26-41中任一权利要求所述的细胞，其特征还在于，所述细胞显示出Rft1型脂质连接寡糖翻转酶活性物。
43.如权利要求42所述的细胞，所述细胞与野生型细胞相比，超表达Rft1型活性物。
44.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的一种或多种定位于高尔基体的甘露糖基转移酶活性物。
45.如权利要求44所述的细胞，其特征在于，所述定位于高尔基体的甘露糖基转移酶活性物选自Och1型活性物，Mnn1型活性物，Mnn2型活性物，Mnn4型活性物，Mnn5型活性物，Mnn9型活性物，Mnn10型活性物，及Mnn11型活性物。
46.如权利要求45所述的细胞，其中，所述细胞为选自och1，mnn1，mnn2，mnn4，mnn5，mnn9，mnn10，mnn11，及它们的同源基因中的至少一种基因的敲除突变株。
47.如权利要求44所述的细胞，其特征在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Mnn1型活性物。
48.如权利要求47所述的细胞，其中，所述细胞为mnn1基因和/或mnn1同源基因的敲除突变株。
49.如权利要求44所述的细胞，其特征在于，所述细胞缺乏或具有被抑制、减少或耗竭的Och1型活性物。
50.如权利要求49所述的细胞，其中，所述细胞为och1基因或och1同源基因的敲除突变株。
51.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞表达一种或多种定位于高尔基体的异源酶或其催化域，所述定位于高尔基体的异源酶或其催化域选自：
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTI)；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTII)；
β-1，4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIII)；
甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTIV)；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，6-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTV)；
甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶(GnTVI)；
β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)；
α(1，6)岩藻糖基转移酶(FucT)；
β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶(ST)；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(NeuC)；
唾液酸合酶(NeuB)；
CMP-Neu5Ac合酶；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶；
N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶；
UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运体；
UDP-半乳糖转运体；
GDP-岩藻糖转运体；
CMP-唾液酸转运体；
核苷酸二磷酸酶；
GDP-D-甘露糖4，6-脱水酶；及
GDP-4-酮-去氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶-4-还原酶。
52.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自：包括真菌细胞的低级真核细胞及包括哺乳动物细胞、哺乳动物细胞系、植物细胞和昆虫细胞的高级真核细胞。
53.一种或多种分离的核酸分子，其能够编码或提供权利要求1或2所述的脂质连接寡糖翻转酶活性物。
54.如权利要求53所述的核酸分子，其特征在于，所述分子选自权利要求3所述的核酸分子中的一种或多种。
55.一种用于在真核宿主细胞中表达的表达盒，包含权利要求53或54所述的任一种核酸分子的一个或多个拷贝，所述一个或多个拷贝与编码启动子的核酸分子和编码终止子的核酸分子中的至少一种核酸分子结合。
56.如权利要求55所述的表达盒，还包含编码权利要求21-25中任一项所述的寡糖基转移酶活性物的核酸分子的一个或多个拷贝。
57.一种用于真核宿主细胞转化的载体，包含权利要求53或54所述的任一种核酸分子的一个或多个拷贝和/或权利要求55或56所述的表达盒的一个或多个拷贝。
58.一种用于制造细胞的方法，所述细胞具体能够在所述细胞的细胞器中合成具有Man3GlcNAc2多糖结构的脂质连接寡糖，所述方法包括下述步骤：
用至少一种编码脂质连接寡糖翻转酶活性物的构造或结构转化所述细胞，所述构造或结构选自：
权利要求53或54所述的核酸分子；
权利要求55或56所述的表达盒；及
权利要求57所述的载体；
以使得所述细胞能够表达由所述构造或结构编码的脂质连接寡糖翻转酶活性物。
59.如权利要求58所述的方法，其中，所述构造或结构还编码寡糖基转移酶活性物，并选自：
权利要求56所述的表达盒，及
包含权利要求57所述的表达盒的一个或多个拷贝的载体，
以使得所述细胞能够表达由所述构造或结构编码的脂质连接寡糖翻转酶活性物和寡糖基转移酶活性物。
60.如权利要求58或59所述的方法，还包括步骤：
在所述细胞内减少或耗竭至少一种酶活性物，所述酶活性物选自：
Alg2型活性物；
Alg11型活性物；
Alg3型活性物；
DPM1型活性物；
脂质连接单糖(LLM)翻转酶型活性物。
61.一种或多种分离的细胞，所述细胞能够在细胞器中合成具有Man1GlcNAc2，Man2GlcNAc2和/或Man3GlcNAc2多糖结构的脂质连接寡糖，并且能够转移所述多糖结构至在所述细胞中表达的新生蛋白质，其特征在于，所述细胞根据权利要求58-60中任一项所述的方法来制造。
62.一种用于制造糖蛋白或糖蛋白组合物的方法，包括如下步骤：
提供权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞；
在所述细胞内允许制造所述糖蛋白或糖蛋白组合物的条件下，于培养基中培养所述细胞；及
必要时，从所述细胞和/或所述培养基中分离所述糖蛋白或糖蛋白组合物。
63.一种用于制造糖蛋白或糖蛋白组合物的试剂盒，包括：
权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞；及
培养基，用于培养所述细胞以制造所述糖蛋白。
64.如权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞，其具体经设计用来制造具有GlcNAcMan3-5GlcNAc2结构的糖蛋白。
65.一种具有GlcNAcMan3-5GlcNAc2多糖结构的糖蛋白，由权利要求45所述的细胞制造。
66.如权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞，其具体经设计用来制造具有GlcNAc2Man3GlcNAc2结构的糖蛋白。
67.一种具有GlcNAc2Man3GlcNAc2多糖结构的糖蛋白，由权利要求66所述的细胞制造。
68.如权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞，其具体经设计用来制造具有GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型多糖结构的糖蛋白。
69.一种具有GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型多糖结构的糖蛋白，由权利要求68所述的细胞制造。
70.如权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞，其具体经设计用来制造具有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2多糖结构的糖蛋白。
71.一种具有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2多糖结构的糖蛋白，由权利要求70所述的细胞制造。
72.一种具有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2或GalGlcNAc2Man3GlcNAc2多糖结构的糖蛋白组合物，由权利要求70所述的一种或多种细胞制造。
73.如权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞，其具体经设计用来制造具有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc多糖结构的糖蛋白。
74.一种具有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc多糖结构的糖蛋白，由权利要求73所述的细胞制造。
75.如权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞，其具体经设计用来制造具有Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型多糖结构的糖蛋白。
76.一种具有Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型多糖结构的糖蛋白，由权利要求75所述的细胞制造。
77.如权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞，其具体经设计用来制造具有Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型多糖结构的糖蛋白。
78.一种具有Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型多糖结构的糖蛋白，由权利要求77所述的细胞制造。
79.如权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞，其具体经设计用来制造具有NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2多糖结构的糖蛋白。
80.一种具有NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2多糖结构的糖蛋白，由权利要求79所述的细胞制造。
81.如权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞，其具体经设计用来制造具有NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc多糖结构的糖蛋白。
82.一种具有NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc多糖结构的糖蛋白，由权利要求81所述的细胞制造。
83.如权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞，其具体经设计用来制造具有NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型多糖结构的糖蛋白。
84.一种具有NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型多糖结构的糖蛋白，由权利要求83所述的细胞制造。
85.如权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞，其具体经设计用来制造具有NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型多糖结构的糖蛋白。
86.一种具有NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型多糖结构的糖蛋白，由权利要求85所述的细胞制造。
87.如权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞，其具体经设计用来制造具有GlcNAc3Man3GlcNAc2多糖结构的糖蛋白。
88.一种具有GlcNAc3Man3GlcNAc2多糖结构的糖蛋白，由权利要求87所述的细胞制造。
89.如权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞，其具体经设计用来制造具有Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2多糖结构的糖蛋白。
90.一种具有Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2多糖结构的糖蛋白，由权利要求89所述的细胞制造。
91.如权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞，其具体经设计用来制造具有NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2多糖结构的糖蛋白。
92.一种具有NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2多糖结构的糖蛋白，由权利要求91所述的细胞制造。
93.如权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞，其具体经设计用来制造具有NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc多糖结构的糖蛋白。
94.一种具有NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc多糖结构的糖蛋白，由权利要求93所述的细胞制造。
95.一种或多种分离的糖蛋白，选自下述一种或多种：
由权利要求1-52或权利要求61中任一项所述的细胞制造的糖蛋白；
可利用权利要求62所述的方法制造的糖蛋白；及
权利要求63，67，69，71，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，及94中任一项所述的糖蛋白。
96.一种糖蛋白组合物，包含两种或多种不同的如权利要求95所述的糖蛋白。
97.一种或多种重组的治疗用蛋白，其如权利要求95或96所述。
98.一种或多种免疫球蛋白，其如权利要求96或97所述。
99.一种药物组合物，包含权利要求95-98中任一项或多项所述的糖蛋白或糖蛋白组合物中的一种或多种，并且包含至少一种药学上可接受的载体或辅药。
100.如权利要求95-99中任一权利要求所述的糖蛋白或糖蛋白组合物，应用在可通过施用所述糖蛋白或糖蛋白组合物来治疗的疾病的治疗方法中。
101.一种治疗失调的方法，所述失调可通过施用权利要求95-99中任一项或多项所述的糖蛋白或糖蛋白组合物中的一种或多种来治疗，所述方法包括下述步骤：
给对象施用如上所述的糖蛋白或糖蛋白组合物，其中，所述对象患有或疑似患有可通过施用所述糖蛋白或糖蛋白组合物治疗的疾病。
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