CN102159706A - 生产用于酶促降解真菌毒素的添加剂的方法、以及添加剂及其用途 - Google Patents

Abstract

在生产用于酶促降解真菌毒素、特别是伏马菌素的添加剂的方法中，提供至少一种对应于序列ID Nos.1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的基因的核酸序列，所述至少一种核酸序列在原核或真核宿主细胞中表达，且至少一种由此制备的、对应于序列IDNos.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的酶或至少一种完整的重组宿主生物体，以及任选地与共底物一起，被用于植物原料中。

Description

生产用于酶促降解真菌毒素的添加剂的方法、以及添加剂及其用途

本发明涉及生产用于酶促降解真菌毒素、特别是伏马菌素(Fumonisin)的添加剂的方法，用于酶促降解植物原料和含有植物原料的混合物中的真菌毒素、特别是伏马菌素的添加剂，以及基因的用途。

真菌毒素很经常地出现在农业植物产品中，并且取决于真菌毒素的种类，其引起严重的经济损害(尤其在由所述农产品生产的食品中以及在以此类食品喂养的动物或人中)，其中所述损害是极其多样化的。已开发了大量的方法，试图将所述真菌毒素解毒或降解，或者使其无害，从而抑制真菌毒素在动物和人的营养、动物饲养，食品与饲料加工等领域造成的损害。

在已知的真菌毒素中存在数种结构上相互关联的真菌毒素，例如伏马菌素，其中伏马菌素B1是该组中最常出现的毒素。然而，已知有大量的衍生物及相关分子也在人和动物中具有有毒的效应。已知伏马菌素通过与神经酰胺合酶相作用而损害鞘脂代谢。鞘脂不仅是细胞膜的成分，也作为信号和信使分子在许多基本的细胞过程(例如细胞生长，细胞迁移和细胞结合)中、在炎症过程中和细胞内转运过程中发挥重要作用。由于对鞘脂代谢的此种损害，伏马菌素被认为对各种动物品种以及人中的有毒效应负责。已表明伏马菌素在啮齿类动物中有致癌效应，并且根据流行病学数据，已将它们与人的食管癌和神经管缺陷相关联。伏马菌素被认为对于在各种动物(例如猪)中由肺水肿引起的典型的中毒负责。在此情形中，伏马菌素是各种谷类作物中几乎普遍存在的污染源，尤其是在玉米及坚果和蔬菜中，此种与人和动物健康相关的严重负面效应是不能被忽视的。

伏马菌素的微生物降解已在EP-A1860954中被描述，根据所述描述，使用微生物对伏马菌素及其衍生物进行解毒，其中向饲料中加入选自准确确定的株系的、用于对伏马菌素进行解毒的解毒性细菌或酵母。

生物降解伏马菌素的分解代谢的代谢途径，以及对其负责的基因和酶也已被描述。例如，EP 0988383描述了对伏马菌素进行解毒的组合物和方法，其中所使用的降解伏马菌素的酶主要在转基因植物中生产，在所述植物中对伏马菌素的解毒借助于需要分子氧用于其酶活性的氨基氧化酶来实现。

此外，WO 2004/085624描述了转氨酶，脱氨酶和氨基变位酶以及用于酶促解毒的组合物和方法，从而特别是对胺化了的毒素(例如伏马菌素)进行解毒。在此情形中，利用具有脱氨酶活性的多肽来进行解毒。

但是，迄今为止已知的方法中共同的是，为了对真菌毒素进行解毒，所述方法需要分子氧用于所述的分解代谢代谢途径，其中所特别需要的氨基氧化酶在不依赖于氧的条件下不能起作用。使用此种基因和酶来对饲料进行解毒，例如在动物的消化道中，由于动物消化道中基本上无氧的环境是不可能的，或者所述已知的基因和酶不显示任何效果。

因而，现在本发明的目的在于提供生产用于酶促降解真菌毒素的添加剂的方法，通过所述方法可以安全可靠地将真菌毒素、特别是伏马菌素降解为毒理学上无害的物质，或对真菌毒素、特别是伏马菌素进行解毒。

为了解决此任务，根据本发明的方法以如下方式进行：提供至少一个对应于序列ID Nos 1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的基因的核酸序列，所述至少一个核苷酸序列在原核或真核宿主细胞中表达，且至少一种由此制备的、对应于序列ID Nos 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的酶或至少一种完整的重组宿主生物体，任选地与共底物一起，被用于植物原料中。通过提供至少一种对应于以下序列ID Nos 1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的基因的核酸序列，可以克隆和表达特定的降解伏马菌素或真菌毒素的基因，从而例如，所述表达通过标准方法在E.coli和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行，通过所述表达将能够获得对应于序列ID Nos 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的酶或者以及完整的重组宿主生物体，从而所述至少一种酶任选地与共底物一起被用于待处理的原料。以根据此类方法生产的添加剂，可以一方面例如，直接在原料中完全地和可靠地降解真菌毒素，从而用通过此方法生产的特定的酶来催化伏马菌素和降解途径的中间产物的降解；且另一方面，也可以例如直接在生物乙醇生产中、在用于醇生产的糊状物(Maische)中降解真菌毒素，或者以及在生产食品时直接在生产过程中降解真菌毒素或使其无害。

此处，植物原料理解为谷物或谷物产品、草、水果或蔬菜，以及含有用于生产食品和饲料的此类物质的中间产物，例如青贮饲料、水果泥或类似物。

添加剂被理解为特别是饲料添加剂、食品添加剂以及用于生物乙醇生产的添加剂。

通过此类方法还可以使通过伏马菌素与神经酰胺合酶的相互作用而被损害的鞘脂代谢得到维护，且与此同时，将伏马菌素生物性地降解为无毒物质。最后，将能够实现解毒的工艺上的应用，因为该方法也可用于更大的工艺规格中，从而将能够通过根据本发明的方法安全可靠地生产不含真菌毒素的产品。

在根据本发明的方法中所用的核酸序列，或利用所述核酸序列在原核和真核宿主细胞中表达的、在不依赖于氧的环境下催化性地起作用的酶如下面所示：

核酸

序列：

＞Seq ID 1(fum(伏马菌素分解代谢)基因簇，15420bp)

TGTCGGCGATCRGTAAACTTCTACCGTGGTCCTCGTTCGCCCACAKCATACATCACAGACRTCGGGATTTCCAACTGAACGGGTCCCGGCCTGCCGGCCCACATTTCCCGGAACGCCATATGGGTGATTTCGACAATCCGGTTCCAGGCGAAGATGGGTGCGCCCCATTTAACCGCGGGTCGAAAGAGGTCGATCTGGTCTTGTCCCTGAAAGGTTTTTGGCGTGCAGGGATAAACGACACCAAGTTGATGCTGGGACGTTATTGCGACGAAGGGAACCCCTTCGTGGCGTGCCGTCACGACTCCAGGCAGAAGGTTTGCCGTACCGGGACCCGGATTCGTGACAATCGCGGCGACCTGTCCGGTGGTCTTGTAAATGCCCTCGGCCATATAGGCTGCGGCGGCCTCGTGCCGCACCGGGACGAACAATATCCCATTGTCTTCGAGCGCAGCCAGGAGCGGATCCACCTCCGGCGACATGAGGCCGAAGACATACCGGACGCCTTCGACGGCCAAACATCGTGCCAATAATTCTCCGCCCGTGAGGCGCATGACGATCTCCAGTACGAAAGGTGAGTGCCCAGGTTCCGGCACATTCGCTGTGGTTAGTTGATGCGCTGATCGGCCAACCGACTGAGTGGAGTTGGATGGCCGCACCTTACCCTGTCGCGCATAACTCTCAGATCCGGAAACGGACCCCGACATTAAAATAGCGGCCGACCGGATCATAGGCAGAGCTGGTCGGGCTGGAAAAACTGCTGGGGTCGTTCGTCGCTATTGGCGGATCTCGGTCGAACAAATTATTGACCGATAGAAACAGCTGCTGCTTCTGGCCAAAAGCCGCGATGTCGAAGGTCAATGTCGCGTCGGTGTACCAAACCGCCGGAGCGTGGTTCAAATTCGTATCGACGCCCTCCACATTGTCGGCATTGAACACCGATGCTGCGATGAAGCGCTGCTGCACGAGAAGCGCCCAATCGTCGGTCGAATATCGCGCCTGGAAGTTGGCCGACCATTTTGGCGTGTCCGGTTGTCCGAGCGAACGGATGGGCGCCGAGCCGGTCGCGATGCGATAGGCAGAGGTATGGTGCGTTGCCAGCGCACGAAGACTGAACGTGCCGCCGCCGACGGGGCGTGAGTAATAGGCCTCGAAGTCAATTCCCGCCGCTTTCTGGACAGCCAGGTTGAGATTGGGACCCGTCACTGTGATGGTGCCGTCCGGATTCTCCGTTATGAGGTCGCAGAAGAAGGTGTTTCCTGCATCGCACGCGTCGATTTCCTGCTGGGGAAGGAGGAAATCGATCGCGCCCTTCACCTTCACCACATAGCGATCGACCGAAAACTGAAACCCCGGCACGAAGGCGGGGCGTAGCACCGCGCCGAATGTAAGGACGTCCGCCTTTTCAGGGCGCAAATCCGCGTTGCCGGCGGTAAAGAACCGCGTCTGCACAGCCTGTCCGCCATAAATTGAATTGAGCGTCGCCTGACGGCCGGGGTCGAATAGCTCGACAAGGCTTGGCCCGCGGATATCTCGCGAACGGGTCGCGCGGAACCTGAGGCCGTCGATCGGCTCATATTCTCCGCCCAGCTTCCAGGTTGTTACTCCACCGGACTGGCTGTAATCGGCATATCGGACGGCGCCGTTTAAGTTCAGCGAACGTCCCAGCGCGCTGTCCTTCAGAATCGGGACGCCGATTTCGACAAAACCTTCCTTGATGTCATAGCTTCCCGAGAAGGGAAGTGGGTTGTAGAGATTGAAGCCTCCAGGCCGACCTGCCTGCGCCGCCGGAGCCCCCCTGATTCCCGTGATCGAGGTCGTCGCCTGCGATATCGCGTCGGTTTCCTGCCGGGCCTTCTCCTTGCGATATTCGATACCAGCGGCGACCGAGACCGGGCCCGCGCCGAACGACAGGCTATCGCCGAGGTCGCCGGAAATCGTGAGTCCCGCCACATATTGCTCAAGCCTCAGCTGAGCGACGCCATCAGCGGTGACATAGTCGATGGCCGACGCGCTCGGCGAGCCTGTGCCGAAGAGATTGAGCGGCACGCAATCTTGGTCGAGGCCGGCCAGTGTTGAACGGCAGACGATATTGCCCGCGGGATCGCGGACCGCATCGACGGCGGCGTAGAGATTGCGGTTGATGGTGAGATTGTTTTCACGAAGCTCGAGGTCCGTAAGGCCAAAGGAGGCCGAGCCATCGAGTTTCCAGCCATTGCCAATGTCTGCCCGGAAGCCGGCAGCGCCGCGGTAGACCTTTGCGAAATTCTCGATTTCGACCAAGGGAAAGTCGCTTGAGAAGCGACCGACAACGATCGAAGCCTGGGCATTTCTGTCCATGAGCGTCGCGAGTGGAGCCGGAAGGAAGGCGTTATCACGGAAGATCCGGAAATTATTCGAGCCACCGACATGCGATATTACGAATGCACCCAGGTTGGTGTGGGAATAAGCATAGGTGCCCTCCGCATACACCTGCACAGTGTCGGACACATCATATGCGGCGCGTAGGAACGCGTTGTAGCGAAGCTGATCCGGGGCGAAGCCGATATTCACGCGCGGTCCATCGCCGCCGCTCTGGAACGACGAGCTCGTAAAATTCCCGTAGTCGAAGGTCCCTAGGACTCCTCCGGGCAAAAACGCGATGCCTTTCAGAGGGCCGGACGTGACAAGTCCGCCGTAGGATCCGCGAGAACTGCGAATATCGGGCACGACCGTGACGCCTGTCGTAGCGCCGGGCACGGGATATTGGCCGGCGGCGATGTCGAACCAGCGGCGACCCGTTGCTTCATCGGCCCGGATTCCGTCCTGTCGAAAATATTCGAAGCTGCCGAGCAAGTGCAACCGGTCGTCGGCAAACGAAGTGCCGAAGGCGATCGAACCGCCGTAGGACGGGAGGTCGCCGCGGGTTGAAACACCCGACTGGAGCTCGGCCCTGATGCCTTCCAGATCTTCGTCGAGCACGAAGTTGATGACGCCCGAAACGGCATCGGAACCGTAGGCGGCCGAGGCGCCGCCCGTCACGACATCGACGCGCTTGACCAACGCCTGCGGCAGCACGTTGATATCGACCGAGCCTGTGAAATTGGTCGCGACGAAACGGTTGCCGTTCAGCAGGACGAGGTTCCGGTTTGACCCGAGGCCGCGCATGTTGAGCAGGTTCTGACCGCTGTTCCCCGTTCCGGGTGTCGTGCCAGGGTTGGAGGTCTTCAAGCTGTCGTTGAACACGGGCAGCTGGTTGAGTGCGTCGGCAAGGTTGGTCGGAGATGCCTCCTTCAACTGCTCGCTGGATACGGCTGTAACCGGCGTCGGCGAATTGAAGCCGTTCTGGAGGCGGCTGCCGGTCACGACGATTTCGCTCGTTCCCCGGTCCGTGTCCGCTTCGTCCGGCTGACCTATCGATGCGGGATCGCTATCCTGAGCACTGGCAGAGACAGGAAATGCGAGGGTGCCGAGCGCTACTGCGCCGAGCAAACTATTTGCCTTGCCGGGCTTTTCGATTCTGAACTTCCGATACATCTGCAGTCCCTCCCGAATTGATAGGGACTCCGTTTGAGTCCCCTTGTTTCTTGACGCCGCCGTCGCTCACCACGGTCCGGTCGGAGGCTAAGCGTCGGGCCTAAGGACCCGCAATTTGAACATCAAATGCAATGATCGGAGGCTTCATTGCACTTCGCGCATAGACCGGCGCGGTAGCTGAAAGTGCCAATAATCAGGGATTTTGCTGAACAGTTGCGGCATGACGTCCGGCATCGGCCACGCGGTTGGCGGCATCGACGTGGCTTTCGCGTCGCCGCCCCTCAAGCACCGGCGAGTTGCATTAAAATGGGATGAGGCTGGAGAGACGCAAAATCTCTGAGGACCGCGCTGAACGCGCGATCCGTCGCCTCGAGGGTCTCCGTTACATCGTCAACTGTATGGGCCGCAGAGAGAAACATATTGTGATAGGGATGAACATAGACGCCGCCCTTCAGGCACGCCGCGGCCCACGCATAGCCGATCCGAAAATCGGGATCGTCCGCAAAGAATATTTGCGGCATCTGCGCCGGGCCCGTCTGCTTCAACTCAAGACCATGGCGCTGAGACTGTGCCTCCAGGCCTGCCCGCAGGGCGGCGCCGCTGGCGATCAGCGTTTCGAGATAAGGCGTCTCTCGAATGATCCTGAGGGTTTCGATCGCGGCCGCCATCGGTACCGCAGAGAACCAGAAGGAGCCGGTCACAAATATATCCCGCGCCGCATCGCGCGCCTTGTTCGAGCCCAGCAGGGCGGAGATCGGATAGCCATTCGCAAAGCATTTTCCCCAGCAACTGAGATCGGGTTCGATACCCAAATGCGTCCAGCTGCAATCGCGCGCCACCCGGAAACCTGCGCGCACATCGTCAACGACCAGAAGCGCACCGGTCTCGTCACAACATTTTCGAGCGGTGCGCGCGAACTCAAGCTGGGCGAGGGCCTGGTCCTCAAATACTTCGTGTCGGAAAGGTGTGGCAAAGACAGCCGCAATATCGCCATCGTGCGCCTTGAACGCGTCCGATAAGCTTTGGGCGTCGTTATAGGTATAATATGCGACATGCACGCGATCGGAAGCGAGAATCCCGGCAGTATGCGGAGTGTTCCACGGGGAAGCGCCATGATAGGCGCCTTTGGCGCATAATATGGTTTTGCGCCCCGTATGGGCACGCGCGAGAACCATCGCCGTTGAGGTGGCATCGCTGCCATTTTTGCAGAACATCGCCCAATCCGCATGACGGACCATGCCCACAAAGGCTTCGGCGAGGTTGACCATGATCTCCGAAGGACCGGTCATGGTGTCGCCGAGAAGTCGCTGCGCATCAGCCGCGGCTTCGATTTCGGATTGCCGGTAACCGAGCAAATTTGGCCCATACGCGCACATATAGTCGATATAGGGCTGCTCGTCGGCGTCCCAAATTCGTGCCCCCAGCGCGCGCCTGAAGAACTGGGGGAATTCTGGCGGCAGCAACCGTGTCGACTCGTGGCCGTACAT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AAAGTGATTGTGGACCCTTGGCGCTGAGCCTGAGGATGCCAAGGGTGCGACGTTGGGCATCGTCAAAGAAGGCGACGTTGACCCGGTATGTGAACATCCCCATATTCTTCCGCAGCTGAAGCAGTTGGTAAACATGCCAAAATATGAACTGTAGTATTGCGTCGGGGTTCTCATTGTGGGGTTTGCCATTGTCATCGCTCGCACCCGGCGACAAAGATTAGATGTACTTCCGATAATCCGTGCTCTCGACCTGGCCTTCCTTCATATATTTCAGGACCTCTCCGACCATGCGTGCGGCGCGGATCGGGATCGGCAGGCGTTGGTTCATCTGGGTCGAGTTCCAGTTGATCTTCGTAAGAGAGAACACCTCCTCGGCTAACTGCGCCGCGGTACTATCGCAGGATCGTCTCGAGCGTYCGC

＞Seq ID 2(fumA)

ATGCGGAACGTCAGCGACAAGGCGCCGCCCCACGAGACGCTCACCGTAGTCGTCGCGGCAATGATCGTTGGCACGGCCGCCTTGATGGTGCTTGGAATACAGCCCATCCTTCTCGGCGCCCTTGTAGAGGAGGGGCGTATTCCCGCCGAGGGGTTGGGATCGGCGGCAACGGTGGAAATACTGGCGATCGCGGCGGGAACATGCATCGGACCCGTTCTTATGAAGACGGGATATCTGCGGGCGAAATGCGCGGCACTCTGCTTAATGCTCGCCGCAATCAACTTCGGATTGACGTTGCCGGGTTTCGATTTGCCCATCGTGGCTTGCCGAGCGGCAGCGGGAGCCCTGGAAGGTCTTTCGCTCAGCGCGGCGATCCTGATCATGACTCATAATCGGCGGCCGGACCGGCTGAGCGGAATATTTCTGGGCGCGCAGACGATACCGCAGGTAATATCTGCTTATTTGCTCCCGACGGAGATTATTCCGCGCTGGGGGAGCGCAGGCGGCTTCACGATCCTGGGCATTCTCGCGGCGATCGCCGCGATCGCGGCTCTGTGCCTCGTCGATCGCGTTGAGCTCGATCCGACGACCGTTAACGACGACTTGCAGTGGTCACCCGCGGCGATCGTCATTTCGATGGCGGCATTCGTTCAATTCTCGGGGGTCGGTGCCGCATGGAGCTATCTGGAGCGACTGGCTGCGCAGCACGGATTTTCGGGAGAAACGATCGGTATCGCCATTTCCGGGAGTTTGCTTTGCCAGGTAGGCGGGGCTTGGCTGGCCGCTTGGATCGGTGGGCGGGTCGGATATCGCTTCGCCTTAATCGCTGGGAGCCTGCTTCAGGCGGGCAACGTGATCGCATTGGCGGTGGCCGATCAGCCAAGCTGGTTTATTTCCGCTTCCTGTGCTTTCGGCCTGTTCTGGTTGGCGATGCAGCCCTTCCAAATCCGCTTCGCGATCGCGATAGATAACAGCCGGCAGCTTGCTGTACTGCTGACGCCGATCGCCCTCGTCGGGTTGAGCGCGGGGCCCTTGTTGCTCTCTCGCTTTGCCGGGGCGACCGACTTGCGCTGGATCTTTGTGGGGAGTTCGACCTTGTTGCTGGCCAGCGCGCTTCTGTATCTTTGCGCTTCTCTGTTTCAACCGCGCGGAAAGGTGATCGCTGAAACGGTGGACGTA

＞Seq ID 4(fum B)

ATGACATCGCAGGTCAAGCTTCGTAGCGCGGCAAAGCGGCCGCGCAGTCCTAAAAGCGAGCGAGGTCTTGCTCGTTACGAGTCCTTGCTTGATGCGACCGACAGGCTGTTGGTCGATCTAGACCCCGATCAGGTCGGTCTCTATCAGATTGCAGAGGAAGCGGGTGCCTCACCGTCGTCCGTCTATCATTTCTTTCCGACCAAGGAAGTGGCTCATCTCGCTCTGATGCGCCGCTATCTGGAGGGGCTCCGGAATCTCGACGCGATGGAAGTCGACATCGGCCAGCTCGAAAGCTGGCAGGACCTGATGAAGTTGGATCAGATCAGGGCGCGAGACTATTATAATAGCCACCCGCCCGCCCTCAAGCTTCTGTTCGGCGGATATGGCGGGGTCGAGGCCAGAAAGCTTGACGAGCGATACTCCGAGGAAATCGTGAGCTCCATGTATGGCAGATACAACGGCATTTTCCATATGCCGCAAATGGAGAATGAGGCTCTCATGTTCACGATCTGCTTCGCAATTCTCGACGCGGTATGGGCCGTCTCCTTTCGCCGGTTCGGTGAAATTACGTCGGATTTTCTTCGGGAGGGGCAAGCGGCTTGCATTGCCTATTGCCGACACTATCTGCCCGAGCGAACGCCATCAGCGTGA

＞Seq ID 6(fumC)

GTGGCCAGCAAGTTCAACTGTGAGTTACTCGATCTGCGATCATTTGTTGCGGTGTATGAAACGCGAAGTTTTAGCCACGCCGCGCGGCTTCTGAATCAATCGCAGCCCGCGCTCAGCCGGAGAATCCAGCGCCTCGAGAGTCTCGTGGGCGGTCCGTTGTTCGAGCGGACCAGTCGGTCGCTTGCCGAAACGGCGCTCGGCAAAGAGTTGCTCCCGGTCGCCCACCGAGCGTTGGAACTTGTCGATACGTCGCTGTTTGCGTCGCCCAATGTCCGGGAGTTCCGCTGGACAGACATCACGATTGCCTGTGTACAGACCGCCGCCTTCCATGTTCTCCCGCGAGCTGCGCGCTTGTACATGGATCAAAATCCGAGGGTCCGACTCCGCATCCTTGACGTGCCGGCGGTCGAGGCTGCGGACCTGGTTGCGAGCGGCGAGGCGGAGTTCGGCATCAGCATTGAGAGCCTGTTGCCATCAAGCCTGCGGTTCGATGCGCTCCACGAGGACCCGTTCGGCCTGGCATGCCACCGAAGCCATCCGCTGGCGTCGCTCGAGATCCTTGAATGGACGCAATTGAAAGGTGAAAGCCTGATCGCCGTTCACCGTGCGAGCCGGAACCGCACGTTGCTCGATGCCGAACTCGCGCGCAACAATATCGCGCTGGAATGGCGGTATGAGGTCGCGCATCTGACGACGGCGCTGGGATTGATCGATGCGCAATTGGGTGTCGCTGTTATGCCCCGCATGGTTATGCCCCGCTCGGGTCGGTCGGAGGTCGTCTGGCGCCCCGTCGTCGCGCCGGTCGTCCAACGCACGATCGGCATCGTTCAGCGCCGCACCGGCTCGATGCACCCTGCCGCACAGCAATTGCTTGCGCGGCTCCGCGCGGCCTGGTCGTCCGCCAATCTGGGCGACATCGCGTCTCGCGAAGATGGGGCATCGTGA

＞Seq ID 8(fumD)

GTGAAAGAGCACCAATGCCGTGGCGGCCGGGCGTCCCCCGCTGCGCCCGCCACGTGGCTTGCGCGGATCAGCGTTTCCCGGGGGGCCTCCGCCATCGCCTGGACCTTCATGCTTGGCGCAACTGCCATTCCCGTGGCTGCGCAAACTGACGATCCGAAGCTCGTTCGTCATACCCAGTCGGGCGCCGTCGAGGGCGTCGAGGGCGACGTCGAGACTTTTTTGGGAATACCCTTCGCGGCTCCGCCGGTCGGCGACCTGCGATGGCGGCCGCCGGCTCCGCCGAGGGCGTGGGCGGGCACCAGGGACGGCCGCCGCTTTGCGCCCGATTGCATCGGGAACGAGCGGCTTAGAGAGGGGAGCCGGGCTGCCGGGACGAGCGAAGACTGCCTCTATCTGAATATCTGGTCTCCCAAACAGGTCGGTAAGGGGGGGCTCCCCGTCATGATCTGGGTTTACGGCGGTGGGTTTAGCGGCGGTTCTGGCGCGGTGCCATATTATGACGGCTCTGCGCTCGCGCAGAAGGGCGTGGTGGTCGTCACGTTCAACTATCGCGCCGGGATTCTGGGCTTTCTTGCCCATCCGGCGCTTTCAAAGGAAAGTCCGAATGGCGTGTCGGGCAACTATGGTCTTCTCGACATGCTCGCGGCGTTCAAATGGGTTCAGAACAACATAAGGGAGTTCGGCGGAGACCCGAACCGTGTCACGGTCTTTGGCGAGTCCGCCGGCGCGAGCGCGCTCGGACTGCTCCTGACCTCGCCGCTCAGTGAGAGCGCCTTCAATCAGGCGATACTGCAAAGTCCGGGTCTGGCCAGGCCGCTCGCCACGCTTTCTGAAAGCGAAGCGAATGGGCTGGAGCTGGGAGCCGATATTTCTGCTCTACGGCGTGCCGATGCGGGCGAATTGACGAAGATCGCGCAATCGCGAATACCCATGTCGCGCCAGTTCACCAAGCCGCGGCCGATGGGTCCGATTCTGGACGGCTATGTTTTGCGCACCCTTGACGTCGATGCCTTCGCCAAGGGGGCCTTCCGCAAGATACCCGTTCTGGTCGGCGGAAACGCCGACGAAGGGCGCGCTTTTACGGATCGCCTGCCGGTCAAAACGGTCCTTGAATATCGAGCCTATCTCACAGAACAATTTGGTGACGAGGCGGACGCATGGGAGCGTTGTTATCCCGCGAACTCCGACGCCGACGTCCCCGCCGCCGTTGCCCGTCTTTTTGGGGATAGTCAGTTCAACAACGGGATCGAGCTGCTCTCGGCAGCCTTCGCGAAATGGCGAACGCCGCTTTGGAGATATCGCTTTACGGGCATTCCAGGAGCCGGCCGTCGCCCCGCCACGCATGGAGACGAAATTCCCTATGTCTTCGCAAATCTGGGGCCGTCGTCCGTATCTATGTTTGGGTCGCTCGAAGGCGGCGCCGGGGCGTCGGACATCAAACTTGCGACCGAAATGTCCGCGGCCTGGGTGAGCTTCGCGGTGCACGGGGTCCCCGATCAGGGCACGAAATCGCACTGGCCGCGCTTCGAGCGGCGAGGGGAGATCATGACTTTTGGTTCGCAGGTTGGCTCTGGGGAAGGTCTTGGAGTTTCGCCGAGCAAAGCCTGCCAACCCTCAAAATAG

＞Seq ID 10(fumE)

TTGGAGTTTCGCCGAGCAAAGCCTGCCAACCCTCAAAATAGCGCCCGGCCTGTGCGTGCTTCAGCACGCCGTCCCGCTTTGCGGGCGACGGGCTGTGCCCTCTGCCTAGAAGGAAGTAAGTTGCGCTACGACGTCGCGATAATTGGAGGTGGCAACGCTGCATTGACGGCAGCCGTGACGGCGCGTGAAGCGGGGGCCTCGGTTCTTGTGATCGAGCATGCGCCGCGCGCCATGCGCGGCGGCAACAGTCGTCACACACGCAATATGCGTACGATGCACGAACGTCCCCTGTCGCCGTTGACCGGTGAATATTCGGCGGACGAATATTGGAATGATCTTGTCCGCGTCACGGGGGGGCGCACCGACGAAGAACTCGCGCGGCTCGTTATCCGCAACACCACCGACGCTATTCCCTTCATGACGCGCTGCGGTGTGCGTTTCCAGCCCTCGCTGTCGGGCACGCTGAGTTTATCGCGAACCAACGCATTCTTCCTTGGCGGCGGGAAGGCGCTTGTAAACGCATATTACGCCACGGCCGAACGGCTAGGCGTCGATATTCTCTATGATTCTGAGGTGACCGAGATCAACCTTCAGCAAGGCGTCGTGCAGCGTCTGCAATTGCGCAGCCGGGGATTCCCTGTCGAAGTGGAAGCCAAGGCTGCCATCGCCTCGTCCGGAGGATTCCAGGCAAATCTTGACTGGCTCTCAAGCGCATGGGGGCCTGCTGCGGCGAACTTCATCGTACGGGGCACGCCATATGCGACTGGCACGGTGCTCAAGAACCTGTTGGAGCAAGGCGTCGCCTCGGTGGGAGATCCAACCCAATGCCATGCTGTCGCGATCGATGGGCGAGCGCCCAAATACGACGGCGGCATCGTCACACGACTGGACTGCGTTCCCTTCTCGATCGTCGTCAACAAGGACGCCTTGCGCTTCTACGATGAAGGCGAAGATGTGTGGCCGAAGCGTTACGCCATATGGGGTCGCTTGGTGGCACAGCAGCCTGATCAGATCGCTTTCAGCATAATCGATCGGCAGGCCGAAGACCTCTTCATGCCGTCAGTGTTCCCCCCCGTGCAAGCGGACACGATCGCGGGTCTGGCCGAGAAACTCGGTCTGAATCCCGTAACCCTGGAACGCACGGTGGCCGAATTCAACGCCGCATGCGTGCCCGGCGAATTCGGCGGCCAAGATCTCGACGACCTCCACACCGAGGGAATCGAACCAAAGAAATCCAACTGGGCCCGACCGATTATTGTGCCCCCGTTCAGCGCCTATCCTCTCCGGCCCGGGATCACCTTCACCTATCTCGGCGTCAAGGTAGACAGCCGTGCGCGGGTCATCATGGAGACAGGTGAGCCGACAAAAAACCTGTTTGCTTCGGGGGAAATAATGGCGGGCAGCATTCTCGGCCAAGGTTATCTCGCTGGATTTGGAATGGCGATTGGTACCGTATTCGGCCGCATCGCGGGTTGGGAGGCCGCACGTCATGCAGGATTTTGA

＞Seq ID 12(fumF)

ATGCAGGATTTTGATCTCGTAAAAATGCTGTCTGACTTGCCGTCGGCGCCGGAGCTGGAAGCCAGGCGCGTTATGGAGGTGTGCAACGCGTGCCGCTATTGCGAAGGGTTCTGCGCGGTATTTCCTGCAATGACCTTGCAGCGTCATTTCGCCAGCGGCGATCTCAGCCACCTCGCCAATCTCTGCCACTCGTGCCAAGGTTGCTATTACGCCTGCCAATACGCCCCTCCGCATGAGTTCGGAATAAACGTTCCAAAGGCGCTGTCGGAGTTGCGGCTCGAGAGCTACGAGCAGCATGCTTGGCCCCGGCCGGTCGCCGCTCTCTATCGCAAGAATGCGCTCATCATTTCCATCTTGTCGGCGGCATGCATAACCGGCGTCCTTCTGCTTGCCGCCATCTTCAACGGGGATGCACTTTTCGCGAAACACGCATCGGTGCCCGGCGGCGGGTTTTACAACGTTATTCCTTATCAGGCGATGATTGCCGTCGCGGCGACCACATTTCTTTATTCCGCGCTGGCGCTGGCGATCAGTCTCGTTCGCTTTTCGCGGACGATCGGTCTGGGAATTAAGGTTCTTTATCAGCACGTGCCGGTTCTTCGGGCGCTACGCGATGCGGCGACTCTGCGATATCTCGGCGGCAGCGACGGCGAGGGGTGTAACGACGCGGACGAGACATTTTCGACGACCCGGCGAAAATTTCATCACGCCCTTGCCTATGGCTTCGGACTTTGTTTCGCGGCCACAGCCACGGGCACGATCTACGATCATATGTTCGGCTGGCCGGCGCCCTATGCGCTTTTCAGCTTGCCGGTCGTCCTAGGGACCGTTGGGGGGATCGGAATGGTCGTGGGCGCGATCGGCCTACTCTGGCTCAAGCTGGCCGGCGAAGACGCTCCTCGATCACCGGCACTGCTTGGGCCGGATGTTGCCCTGTTGGTGCTTCTGCTTGCCATAGCGGCAACGGGCCTCCTCCTTTTAGCGGTCCGCAGCACCGAAGTCATGGGCGTCGCGCTCGCCGTCCATCTCGGCGTCGTCTTGGCCTTCTTTTTGGTGATGCCATACAGCAAATTTGTCCACGGTATCTTCAGGCTCACGGCTCTCGTGCGCCATCATGCTGACCGCGAGGCAAGTAATGGCTTCGCCTCCAGCCCTCCCACGAAAAAGGGTTAA

＞Seq ID 14(fumG)

ATGGAACATATGAAGTCCGTTCGCGATCGCAGTAGCGTCATGCAGATCGTGAGAGTGGCGAGTGGCAACTGTCTCGAGCAATATGATTTCTTCGTTTACGGCTTCTATGCGGCATATATTGCGAGAAGCTTTTTTCCGACCGGCGATAACGCGACATCGCTCATGCTTTCATTGGCCACTTTTGGCGCTGGTTTCCTCATGAGGCCCTTGGGGGCGATTTTTCTCGGGTCCTACATCGATCGCGTCGGGCGTCGGAAAGGCCTGATCGTGACACTCGCGATCATGGCCGTCGGAACCCTCACCATTGCGATGACTCCAAGCTATGAGGCAATTGGATTACTCGCACCGGTTATCGTGCTCGTCGGGCGACTTTTGCAGGGTTTTTCCGCTGGAGCAGAGTCGGGTGGCGTCTCAGTGTACTTGGCGGAAATTGCGTCGCCCAAATCGAGAGGCTTCTTCACCTCGTGGCAGTCTGCCAGCCAGCAGGTGGCCGTCATGATCGCCGCCGCGATCGGTCTTGCGCTGCAATCAACGCTTTCACCGGAGCAAATGAACGACTGGGGATGGCGGGTGCCCTTGTTGATCGGATGCTTGATTATCCCCGTGATACTCTGGCTGCGCCGGTCTCTCCCGGAAACGAAAGCCTATCTCCACATGGAGCACAAGGCGCATTCGATCGGCGAATCCCTCCGCGAATTGCAACAGAGCTGGGGGCTGATCTTGACGGGCATGGCGATGTCGATCCTCACGACGACCACCTTTTACATGATTACCGCCTATACGCCGACATTTGGCGAGAAAGCACTCGGACTGAGCCCGCAAGATGTCCTGCTGGTTACCATCATGGTCGGCGTGTCGAACTTCCTGTGGCTTCCGATCGGGGGTGCTCTCTCGGATCGTATCGGTAGAACCCCGATCCTACTGGTCGTGCCGGTCACCGTTCTCGCCATCGCCTTTCCCCTGATGAGCTGGCTCGTCGCGGCACCGACATTCGGAGCGCTTGCAGCTGTTCTGCTGACTTTCTCCGCATGCTTTGGACTCTATAATGGGGCGCTCATCGCGAGACTCACCGAGATTATGCCTCCCGCCATTAGAACCCTTGGCTTCTCGCTGGCGTTCAGTCTCGCGACCTCGCTGTTCGGCGGCTTCACCCCATTGGTAAGTACGGCGCTAATCCACGCGACGGGCAGCAATTCCGCGCCTGCAATCTGGCTCTGTTTTGCGGCTTTCATCAGCTTCGTCGGTGTGGCCGCATCGACCCGGCTGAGCCGGCCAATCGCCGAAGGCGCCAGATAG

＞Seq ID 16(fumH)

ATGAGAGCAGTAGTTTACCGAAATGGCGAACTTGTCCTGGGGGCCTATGCTGATCCGATACCCGCCGCCGGGCAGGTGCTCGTCAAGACCAGAGCATGCGGCATCTGCGGATCTGACCTTCATTTTTGCGATCATGCGCAGGCGTTTACGAACCTTGCATCGCGGGCGGGTATCGCCTCTATGGAAGTTGATTTGTGTCGAGACATCGTTCTGGGGCATGAATTCTGTGGCGAGATTATGGAGTTCGGGCCCTCTGCGGATCGTCGCTTCAAACCCGGACAGCTTGTGTGCTCGCTGCCGCTGGCGATCGGTCCGACCGGAGCGCGGACGATTGGCTACTCGGATGAGTATCCCGGCGGGCTCGGCGAATATATGGTCCTCACGGAAGCGCTCTTGCTGCCTGTTCCGAACGGCCTTCCGGCGACCTGCGCGGCGTTGACGGAGCCGATGGCGGTGGGATGGCATGCCGTCGAGATCGCGCAGGTTCAACCACATCACATCCCTGTGGTGATCGGGTGCGGACCGGTCGGGTTGGCAGTCGTCGCTGCCCTGAAACATAAGCAAGTTGCTCCGATTATTGCGTCGGATCCATCGCCCGATCGGCGTGCTCTTGCTCTGCGGATGGGCGCCGACGCCGTTGTCGATCCGCGCGAAGAATCACCCTTTCGCCAGGCCGAGAAGATCGCACGCCCGGTCGGACAAGGTGGGGCCCTGTCCAGCTCATTGCTGTCAAAGTCTCAAATGATATTCGAATGCGTAGGGGTGCCGGGCATGCTTCGGCATGCGATGGACGGCGCGTCCGACGGGTCCGAGATCATGGTCGTTGGCGCATGCATGCAGCCGGACGCGATCGAGCCCATGATCGGGATGTTTAAAGCGCTCACGATCAAATTCTCGCGAACTTACACGGGTGAGGAATTCGCCGCGGTGCTTCACATGATAGGTGAGGGCGCACTCGACGTATCTCCGCTCGTTACCGATGTGATTGGCCTGTCCGATGTCCCGTCCGCGTTTGAGGCTCTACGGAGTCCAGGCGCCCAAGCAAAAGTGATTGTGGACCCTTGGCGCTGA

＞Seq ID 18(fumI)

ATGGCGAACGGAACAAGGCAGAAAGATCTCAGAGAACGCGCCGAACGGGTCATTCCGGGCGGGATGTACGGCCACGAGTCGACACGGTTGCTGCCGCCAGAATTCCCCCAGTTCTTCAGGCGCGCGCTGGGGGCACGAATTTGGGACGCCGACGAGCAGCCCTATATCGACTATATGTGCGCGTATGGGCCAAATTTGCTCGGTTACCGGCAATCCGAAATCGAAGCCGCGGCTGATGCGCAGCGACTTCTCGGCGACACCATGACCGGTCCTTCGGAGATCATGGTCAACCTCGCCGAAGCCTTTGTGGGCATGGTCCGTCATGCGGATTGGGCGATGTTCTGCAAAAATGGCAGCGATGCCACCTCAACGGCGATGGTTCTCGCGCGTGCCCATACGGGGCGCAAAACCATATTATGCGCCAAAGGCGCCTATCATGGCGCTTCCCCGTGGAACACTCCGCATACTGCCGGGATTCTCGCTTCCGATCGCGTGCATGTCGCATATTATACCTATAACGACGCCCAAAGCTTATCGGACGCGTTCAAGGCGCACGATGGCGATATTGCGGCTGTCTTTGCCACACCTTTCCGACACGAAGTATTTGAGGACCAGGCCCTCGCCCAGCTTGAGTTCGCGCGCACCGCTCGAAAATGTTGTGACGAGACCGGTGCGCTTCTGGTCGTTGACGATGTGCGCGCAGGTTTCCGGGTGGCGCGCGATTGCAGCTGGACGCATTTGGGTATCGAACCCGATCTCAGTTGCTGGGGAAAATGCTTTGCGAATGGCTATCCGATCTCCGCCCTGCTGGGCTCGAACAAGGCGCGCGATGCGGCGCGGGATATATTTGTGACCGGCTCCTTCTGGTTCTCTGCGGTACCGATGGCGGCCGCGATCGAAACCCTCAGGATCATTCGAGAGACGCCTTATCTCGAAACGCTGATCGCCAGCGGCGCCGCCCTGCGGGCAGGCCTGGAGGCACAGTCTCAGCGCCATGGTCTTGAGTTGAAGCAGACGGGCCCGGCGCAGATGCCGCAAATATTCTTTGCGGACGATCCCGATTTTCGGATCGGCTATGCGTGGGCCGCGGCGTGCCTGAAGGGCGGCGTCTATGTTCATCCCTATCACAATATGTTTCTCTCTGCGGCCCATACAGTTGACGATGTAACGGAGACCCTCGAGGCGACGGATCGCGCGTTCAGCGCGGTCCTCAGAGATTTTGCGTCTCTCCAGCCTCATCCCATTTTAATGCAACTCGCCGGTGCTTGA

＞Seq ID 20(fumJ)

ATGTATCGGAAGTTCAGAATCGAAAAGCCCGGCAAGGCAAATAGTTTGCTCGGCGCAGTAGCGCTCGGCACCCTCGCATTTCCTGTCTCTGCCAGTGCTCAGGATAGCGATCCCGCATCGATAGGTCAGCCGGACGAAGCGGACACGGACCGGGGAACGAGCGAAATCGTCGTGACCGGCAGCCGCCTCCAGAACGGCTTCAATTCGCCGACGCCGGTTACAGCCGTATCCAGCGAGCAGTTGAAGGAGGCATCTCCGACCAACCTTGCCGACGCACTCAACCAGCTGCCCGTGTTCAACGACAGCTTGAAGACCTCCAACCCTGGCACGACACCCGGAACGGGGAACAGCGGTCAGAACCTGCTCAACATGCGCGGCCTCGGGTCAAACCGGAACCTCGTCCTGCTGAACGGCAACCGTTTCGTCGCGACCAATTTCACAGGCTCGGTCGATATCAACGTGCTGCCGCAGGCGTTGGTCAAGCGCGTCGATGTCGTGACGGGCGGCGCCTCGGCCGCCTACGGTTCCGATGCCGTTTCGGGCGTCATCAACTTCGTGCTCGACGAAGATCTGGAAGGCATCAGGGCCGAGCTCCAGTCGGGTGTTTCAACCCGCGGCGACCTCCCGTCCTACGGCGGTTCGATCGCCTTCGGCACTTCGTTTGCCGACGACCGGTTGCACTTGCTCGGCAGCTTCGAATATTTTCGACAGGACGGAATCCGGGCCGATGAAGCAACGGGTCGCCGCTGGTTCGACATCGCCGCCGGCCAATATCCCGTGCCCGGCGCTACGACAGGCGTCACGGTCGTGCCCGATATTCGCAGTTCTCGCGGATCCTACGGCGGACTTGTCACGTCCGGCCCTCTGAAAGGCATCGCGTTTTTGCCCGGAGGAGTCCTAGGGACCTTCGACTACGGGAATTTTACGAGCTCGTCGTTCCAGAGCGGCGGCGATGGACCGCGCGTGAATATCGGCTTCGCCCCGGATCAGCTTCGCTACAACGCGTTCCTACGCGCCGCATATGATGTGTCCGACACTGTGCAGGTGTATGCGGAGGGCACCTATGCTTATTCCCACACCAACCTGGGTGCATTCGTAATATCGCATGTCGGTGGCTCGAATAATTTCCGGATCTTCCGTGATAACGCCTTCCTTCCGGCTCCACTCGCGACGCTCATGGACAGAAATGCCCAGGCTTCGATCGTTGTCGGTCGCTTCTCAAGCGACTTTCCCTTGGTCGAAATCGAGAATTTCGCAAAGGTCTACCGCGGCGCTGCCGGCTTCCGGGCAGACATTGGCAATGGCTGGAAACTCGATGGCTCGGCCTCCTTTGGCCTTACGGACCTCGAGCTTCGTGAAAACAATCTCACCATCAACCGCAATCTCTACGCCGCCGTCGATGCGGTCCGCGATCCCGCGGGCAATATCGTCTGCCGTTCAACACTGGCCGGCCTCGACCAAGATTGCGTGCCGCTCAATCTCTTCGGCACAGGCTCGCCGAGCGCGTCGGCCATCGACTATGTCACCGCTGATGGCGTCGCTCAGCTGAGGCTTGAGCAATATGTGGCGGGACTCACGATTTCCGGCGACCTCGGCGATAGCCTGTCGTTCGGCGCGGGCCCGGTCTCGGTCGCCGCTGGTATCGAATATCGCAAGGAGAAGGCCCGGCAGGAAACCGACGCGATATCGCAGGCGACGACCTCGATCACGGGAATCAGGGGGGCTCCGGCGGCGCAGGCAGGTCGGCCTGGAGGCTTCAATCTCTACAACCCACTTCCCTTCTCGGGAAGCTATGACATCAAGGAAGGTTTTGTCGAAATCGGCGTCCCGATTCTGAAGGACAGCGCGCTGGGACGTTCGCTGAACTTAAACGGCGCCGTCCGATATGCCGATTACAGCCAGTCCGGTGGAGTAACAACCTGGAAGCTGGGCGGAGAATATGAGCCGATCGACGGCCTCAGGTTCCGCGCGACCCGTTCGCGAGATATCCGCGGGCCAAGCCTTGTCGAGCTATTCGACCCCGGCCGTCAGGCGACGCTCAATTCAATTTATGGCGGACAGGCTGTGCAGACGCGGTTCTTTACCGCCGGCAACGCGGATTTGCGCCCTGAAAAGGCGGACGTCCTTACATTCGGCGCGGTGCTACGCCCCGCCTTCGTGCCGGGGTTTCAGTTTTCGGTCGATCGCTATGTGGTGAAGGTGAAGGGCGCGATCGATTTCCTCCTTCCCCAGCAGGAAATCGACGCGTGCGATGCAGGAAACACCTTCTTCTGCGACCTCATAACGGAGAATCCGGACGGCACCATCACAGTGACGGGTCCCAATCTCAACCTGGCTGTCCAGAAAGCGGCGGGAATTGACTTCGAGGCCTATTACTCACGCCCCGTCGGCGGCGGCACGTTCAGTCTTCGTGCGCTGGCAACGCACCATACCTCTGCCTATCGCATCGCGACCGGCTCGGCGCCCATCCGTTCGCTCGGACAACCGGACACGCCAAAATGGTCGGCCAACTTCCAGGCGCGATATTCGACCGACGATTGGGCGCTTCTCGTGCAGCAGCGCTTCATCGCAGCATCGGTGTTCAATGCCGACAATGTGGAGGGCGTCGATACGAATTTGAACCACGCTCCGGCGGTTTGGTACACCGACGCGACATTGACCTTCGACATCGCGGCTTTTGGCCAGAAGCAGCAGCTGTTTCTATCGGTCAATAATTTGTTCGACCGAGATCCGCCAATAGCGACGAACGACCCCAGCAGTTTTTCCAGCCCGACCAGCTCTGCCTATGATCCGGTCGGCCGCTATTTTAATGTCGGGGTCCGTTTCCGGATCTGA

＞Seq ID 22(fumK)不完整的

ATGCGCCTCACGGGCGGAGAATTATTGGCACGATGTTTGGCCGTCGAAGGCGTCCGGTATGTCTTCGGCCTCATGTCGCCGGAGGTGGATCCGCTCCTGGCTGCGCTCGAAGACAATGGGATATTGTTCGTCCCGGTGCGGCACGAGGCCGCCGCAGCCTATATGGCCGAGGGCATTTACAAGACCACCGGACAGGTCGCCGCGATTGTCACGAATCCGGGTCCCGGTACGGCAAACCTTCTGCCTGGAGTCGTGACGGCACGCCACGAAGGGGTTCCCTTCGTCGCAATAACGTCCCAGCATCAACTTGGTGTCGTTTATCCCTGCACGCCAAAAACCTTTCAGGGACAAGACCAGATCGACCTCTTTCGACCCGCGGTTAAATGGGGCGCACCCATCTTCGCCTGGAACCGGATTGTCGAAATCACCCATATGGCGTTCCGGGAAATGTGGGCCGGCAGGCCGGGACCCGTTCAGTTGGAAATCCCGARGTCTGTGATGTATGKTGTGGGCGAACGAGGACCACGGTAGAAGTTTACRGATCGCCGACA...

＞Seq ID 24

ATGGAATTGAGCCGCCAACGAGACCAGGCCTTGAGGGAGCGCGCCCAAGCGGTGATCCCGGGCGGGATGTACGGTCACGAGTCGACCTATCTGATGCCCGAGGGCACGCCACAGTTCTTCAGTCGCGGCAAAGGCGCCCGACTTTGGGACGCCGACGGCAACGAGTATGTCGATTACATGTGCGCCTATGGCCCCAACCTGCTGGGTTACGGCTTCGAACCCGTCGAAGCGGCCGCCGCAGCCCAGCAAGCCCGGGGCGATACCCTGACCGGGCCGTCGGAGGTGATGGTGCAGTTGGCGGAAGACTTCGTCGCGCAAATCAGCCACGCGGACTGGGCCATGTTCTGCAAGAACGGCACAGACGCCACCTCAATGGCGATGGTCATCGCGCGCGCACACACCGGCCGGAAGACGATCCTCTGCGCGAAAGGCGCCTATCATGGGGCCGCGCCTTGGTGCACGCCGATCCTGGCCGGAACGCTACCGGAGGATCGCGCCTTTGTAGTCTACTACGACTACAATGACGCCCAAAGCCTCGTCGACGCCTTCGAGGCCCATCAGGACGACGTCGCGGCGATCTTCGCCACCCCTCACCGTCACGAGGTGTTCAGCGACCAGATCGATCCTGATCCGGAATATGCGGCCAGCGTGCGGGCGCTCTGCGACAAGAGCGGCGCCCTGCTCGTCGTCGACGAAGTTCGAGCCGGGTTCAGGATCGCGCGCGACTGCAGCTGGGCCAAGATCGGCGTCGCTCCGGATCTGAGCACCTGGGGCAAGTGCTTCGCCAACGGCTATCCGATCTCGGCGGTCCTAGGGGGCGAAAAGGTGCGCAGCGCGGCAAAGGCCGTCTACGTCACCGGCTCGTTCTGGTTCTCGGCCACGCCCATGGCCGCAGCCGTCGAAACCCTGAAGCAAATCCGCGAGACCGACTATCTCGAGCGGATCAACGCGGCCGGGACCCGCCTGCGCGAGGGCCTGCAGCAGCAGGCTGCTCACAACGGCTTTACGTTGCGCCAAACGGGGCCCGTCTCCATGCCCCAAGTCCTCTTCGAGGAAGATCCCGATTTTCGGGTCGGCTACGGCTGGGTTCGCGAATGCCTGAAGCGAGGGGTGTACTTCAGCCCCTACCATAACATGTTCCTGTCGGCGGCCCATAGCGAGGCGGACCTGGCCAAGACCCTTGCGGCTACCGGCGACGCCTTCGTCGAGCTACGCGCCAAGCTTCCGAGCCTAGAAATCCACCAACCCCTCCTCGCCCTGAGAGCGGCCTAA

酶

序列：

＞Seq ID 3(FumA)

MRNVSDKAPPHETLTVVVAAMIVGTAALMVLGIQPILLGALVEEGRIPAEGLGSAATVEILAIAAGTCIGPVLMKTGYLRAKCAALCLMLAAINFGLTLPGFDLPIVACRAAAGALEGLSLSAAILIMTHNRRPDRLSGIFLGAQTIPQVISAYLLPTEIIPRWGSAGGFTILGILAAIAAIAALCLVDRVELDPTTVNDDLQWSPAAIVISMAAFVQFSGVGAAWSYLERLAAQHGFSGETIGIAISGSLLCQVGGAWLAAWIGGRVGYRFALIAGSLLQAGNVIALAVADQPSWFISASCAFGLFWLAMQPFQIRFAIAIDNSRQLAVLLTPIALVGLSAGPLLLSRFAGATDLRWIFVGSSTLLLASALLYLCASLFQPRGKVIAETVDV

＞Seq ID5(FumB)

MTSQVKLRSAAKRPRSPKSERGLARYESLLDATDRLLVDLDPDQVGLYQIAEEAGASPSSVYHFFPTKEVAHLALMRRYLEGLRNLDAMEVDIGQLESWQDLMKLDQIRARDYYNSHPPALKLLFGGYGGVEARKLDERYSEEIVSSMYGRYNGIFHMPQMENEALMFTICFAILDAVWAVSFRRFGEITSDFLREGQAACIAYCRHYLPERTPSA

＞Seq ID7(FumC)

VASKFNCELLDLRSFVAVYETRSFSHAARLLNQSQPALSRRIQRLESLVGGPLFERTSRSLAETALGKELLPVAHRALELVDTSLFASPNVREFRWTDITIACVQTAAFHVLPRAARLYMDQNPRVRLRILDVPAVEAADLVASGEAEFGISIESLLPSSLRFDALHEDPFGLACHRSHPLASLEILEWTQLKGESLIAVHRASRNRTLLDAELARNNIALEWRYEVAHLTTALGLIDAQLGVAVMPRMVMPRSGRSEVVWRPVVAPVVQRTIGIVQRRTGSMHPAAQQLLARLRAAWSSANLGDIASREDGAS

＞Seq ID 9(FumD)

VKEHQCRGGRASPAAPATWLARISVSRGASAIAWTFMLGATAIPVAAQTDDPKLVRHTQSGAVEGVEGDVETFLGIPFAAPPVGDLRWRPPAPPRAWAGTRDGRRFAPDCIGNERLREGSRAAGTSEDCLYLNIWSPKQVGKGGLPVMIWVYGGGFSGGSGAVPYYDGSALAQKGVVVVTFNYRAGILGFLAHPALSKESPNGVSGNYGLLDMLAAFKWVQNNIREFGGDPNRVTVFGESAGASALGLLLTSPLSESAFNQAILQSPGLARPLATLSESEANGLELGADISALRRADAGELTKIAQSRIPMSRQFTKPRPMGPILDGYVLRTLDVDAFAKGAFRKIPVLVGGNADEGRAFTDRLPVKTVLEYRAYLTEQFGDEADAWERCYPANSDADVPAAVARLFGDSQFNNGIELLSAAFAKWRTPLWRYRFTGIPGAGRRPATHGDEIPYVFANLGPSSVSMFGSLEGGAGASDIKLATEMSAAWVSFAVHGVPDQGTKSHWPRFERRGEIMTFGSQVGSGEGLGVSPSKACQPSK

＞Seq ID 11(FumE)

LEFRRAKPANPQNSARPVRASARRPALRATGCALCLEGSKLRYDVAIIGGGNAALTAAVTAREAGASVLVIEHAPRAMRGGNSRHTRNMRTMHERPLSPLTGEYSADEYWNDLVRVTGGRTDEELARLVIRNTTDAIPFMTRCGVRFQPSLSGTLSLSRTNAFFLGGGKALVNAYYATAERLGVDILYDSEVTEINLQQGVVQRLQLRSRGFPVEVEAKAAIASSGGFQANLDWLSSAWGPAAANFIVRGTPYATGTVLKNLLEQGVASVGDPTQCHAVAIDGRAPKYDGGIVTRLDCVPFSIVVNKDALRFYDEGEDVWPKRYAIWGRLVAQQPDQIAFSIIDRQAEDLFMPSVFPPVQADTIAGLAEKLGLNPVTLERTVAEFNAACVPGEFGGQDLDDLHTEGIEPKKSNWARPIIVPPFSAYPLRPGITFTYLGVKVDSRARVIMETGEPTKNLFASGEIMAGSILGQGYLAGFGMAIGTVFGRIAGWEAARHAGF

＞Seq ID 13(FumF)

MQDFDLVKMLSDLPSAPELEARRVMEVCNACRYCEGFCAVFPAMTLQRHFASGDLSHLANLCHSCQGCYYACQYAPPHEFGINVPKALSELRLESYEQHAWPRPVAALYRKNALIISILSAACITGVLLLAAIFNGDALFAKHASVPGGGFYNVIPYQAMIAVAATTFLYSALALAISLVRFSRTIGLGIKVLYQHVPVLRALRDAATLRYLGGSDGEGCNDADETFSTTRRKFHHALAYGFGLCFAATATGTIYDHMFGWPAPYALFSLPVVLGTVGGIGMVVGAIGLLWLKLAGEDAPRSPALLGPDVALLVLLLAIAATGLLLLAVRSTEVMGVALAVHLGVVLAFFLVMPYSKFVHGIFRLTALVRHHADREASNGFASSPPTKKG

＞Seq ID 15(FumG)

MEHMKSVRDRSSVMQIVRVASGNCLEQYDFFVYGFYAAYIARSFFPTGDNATSLMLSLATFGAGFLMRPLGAIFLGSYIDRVGRRKGLIVTLAIMAVGTLTIAMTPSYEAIGLLAPVIVLVGRLLQGFSAGAESGGVSVYLAEIASPKSRGFFTSWQSASQQVAVMIAAAIGLALQSTLSPEQMNDWGWRVPLLIGCLIIPVILWLRRSLPETKAYLHMEHKAHSIGESLRELQQSWGLILTGMAMSILTTTTFYMITAYTPTFGEKALGLSPQDVLLVTIMVGVSNFLWLPIGGALSDRIGRTPILLVVPVTVLAIAFPLMSWLVAAPTFGALAAVLLTFSACFGLYNGALIARLTEIMPPAIRTLGFSLAFSLATSLFGGFTPLVSTALIHATGSNSAPAIWLCFAAFISFVGVAASTRLSRPIAEGAR

＞Seq ID 17(FumH)

MRAVVYRNGELVLGAYADPIPAAGQVLVKTRACGICGSDLHFCDHAQAFTNLASRAGIASMEVDLCRDIVLGHEFCGEIMEFGPSADRRFKPGQLVCSLPLAIGPTGARTIGYSDEYPGGLGEYMVLTEALLLPVPNGLPATCAALTEPMAVGWHAVEIAQVQPHHIPVVIGCGPVGLAVVAALKHKQVAPIIASDPSPDRRALALRMGADAVVDPREESPFRQAEKIARPVGQGGALSSSLLSKSQMIFECVGVPGMLRHAMDGASDGSEIMVVGACMQPDAIEPMIGMFKALTIKFSRTYTGEEFAAVLHMIGEGALDVSPLVTDVIGLSDVPSAFEALRSPGAQAKVIVDPWR

＞Seq ID 19(FumI)

MANGTRQKDLRERAERVIPGGMYGHESTRLLPPEFPQFFRRALGARIWDADEQPYIDYMCAYGPNLLGYRQSEIEAAADAQRLLGDTMTGPSEIMVNLAEAFVGMVRHADWAMFCKNGSDATSTAMVLARAHTGRKTILCAKGAYHGASPWNTPHTAGILASDRVHVAYYTYNDAQSLSDAFKAHDGDIAAVFATPFRHEVFEDQALAQLEFARTARKCCDETGALLVVDDVRAGFRVARDCSWTHLGIEPDLSCWGKCFANGYPISALLGSNKARDAARDIFVTGSFWFSAVPMAAAIETLRIIRETPYLETLIASGAALRAGLEAQSQRHGLELKQTGPAQMPQIFFADDPDFRIGYAWAAACLKGGVYVHPYHNMFLSAAHTVDDVTETLEATDRAFSAVLRDFASLQPHPILMQLAGA

＞Seq ID 21(FumJ)

MYRKFRIEKPGKANSLLGAVALGTLAFPVSASAQDSDPASIGQPDEADTDRGTSEIVVTGSRLQNGFNSPTPVTAVSSEQLKEASPTNLADALNQLPVFNDSLKTSNPGTTPGTGNSGQNLLNMRGLGSNRNLVLLNGNRFVATNFTGSVDINVLPQALVKRVDVVTGGASAAYGSDAVSGVINFVLDEDLEGIRAELQSGVSTRGDLPSYGGSIAFGTSFADDRLHLLGSFEYFRQDGIRADEATGRRWFDIAAGQYPVPGATTGVTVVPDIRSSRGSYGGLVTSGPLKGIAFLPGGVLGTFDYGNFTSSSFQSGGDGPRVNIGFAPDQLRYNAFLRAAYDVSDTVQVYAEGTYAYSHTNLGAFVISHVGGSNNFRIFRDNAFLPAPLATLMDRNAQASIVVGRFSSDFPLVEIENFAKVYRGAAGFRADIGNGWKLDGSASFGLTDLELRENNLTINRNLYAAVDAVRDPAGNIVCRSTLAGLDQDCVPLNLFGTGSPSASAIDYVTADGVAQLRLEQYVAGLTISGDLGDSLSFGAGPVSVAAGIEYRKEKARQETDAISQATTSITGIRGAPAAQAGRPGGFNLYNPLPFSGSYDIKEGFVEIGVPILKDSALGRSLNLNGAVRYADYSQSGGVTTWKLGGEYEPIDGLRFRATRSRDIRGPSLVELFDPGRQATLNSIYGGQAVQTRFFTAGNADLRPEKADVLTFGAVLRPAFVPGFQFSVDRYVVKVKGAIDFLLPQQEIDACDAGNTFFCDLITENPDGTITVTGPNLNLAVQKAAGIDFEAYYSRPVGGGTFSLRALATHHTSAYRIATGSAPIRSLGQPDTPKWSANFQARYSTDDWALLVQQRFIAASVFNADNVEGVDTNLNHAPAVWYTDATLTFDIAAFGQKQQLFLSVNNLFDRDPPIATNDPSSFSSPTSSAYDPVGRYFNVGVRFRI

＞Seq ID 23(FumK)不完整的

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＞Seq ID 25

MELSRQRDQALRERAQAVIPGGMYGHESTYLMPEGTPQFFSRGKGARLWDADGNEYVDYMCAYGPNLLGYGFEPVEAAAAAQQARGDTLTGPSEVMVQLAEDFVAQISHADWAMFCKNGTDATSMAMVIARAHTGRKTILCAKGAYHGAAPWCTPILAGTLPEDRAFVVYYDYNDAQSLVDAFEAHQDDVAAIFATPHRHEVFSDQIDPDPEYAASVRALCDKSGALLVVDEVRAGFRIARDCSWAKIGVAPDLSTWGKCFANGYPISAVLGGEKVRSAAKAVYVTGSFWFSATPMAAAVETLKQIRETDYLERINAAGTRLREGLQQQAAHNGFTLRQTGPVSMPQVLFEEDPDFRVGYGWVRECLKRGVYFSPYHNMFLSAAHSEADLAKTLAATGDAFVELRAKLPSLEIHQPLLALRAA- 

根据优选的进一步发展，根据本发明的方法以下列方式进行：真菌毒素，特别是伏马菌素以不依赖于氧或厌氧的方式被降解。通过以不依赖于氧的方式降解真菌毒素、特别是伏马菌素，可以这样进一步发展根据本发明的方法：基因的核酸序列或酶将在没有添加任何分子氧时安全可靠地进行降解反应，由此使得因此生产的添加剂可用于所有不依赖于氧的或厌氧的介质中，在所述介质中真菌毒素可能将必须被降解，例如在人和动物的食物中，在生物乙醇生产中，但也用于制备或生产通过基因技术修饰的农作物。

根据进一步的发展，根据本发明的方法以下列方式进行：在将酶用于植物起始材料中之前，通过分子遗传学方法、诱变或分子进化来修饰所述酶。通过以下述方式进行所述方法：即在将酶用于植物起始材料中之前，通过分子遗传学方法、诱变或分子进化来修饰所述酶，可以以更稳定的、且适合于随后使用目的的形式生产所述酶，从而可以更进一步提高或完善不依赖于氧地真菌毒素、特别是伏马菌素的降解。

根据优选的本发明的进一步发展，所述方法以分离所述酶的方式进行。通过以此方式进行所述方法，能够完全地且不依赖于氧地降解特别是伏马菌素。

根据另一优选的本发明的进一步发展，所述方法以将酶包裹到保护性包被中的方式进行。通过将酶包裹到保护性包被中，可以将酶转运到使用目的地、特别地例如到消化道中，而不使所述酶被改变、特别是不被降解或损害，从而仅当所述保护性包被溶解后(例如在人或动物的胃肠道中)所述酶才开始起作用，因此将能够实现在胃肠道中不依赖于氧的环境下更有针对性地、更快速地和更完全地降解真菌毒素，并同时能够防止真菌毒素，特别是伏马菌素对将其与食物一同摄入的生物体产生有害效果。

根据优选的进一步发展，根据本发明的方法以下列方式进行：所述酶选自通透酶(ID No.3)，羧酸酯酶(ID No.9)，丙三羧酸脱氢酶(ID No.11)，柠檬酸利用蛋白(Citratverwertungsprotein)(IDNo.13)，醇脱氢酶(ID No.17)，氨基转移酶(ID No.19)和/或乙酰乳酸合酶(ID No.23)。通过以此方式进行所述方法，特别是伏马菌素可在不依赖于氧的环境中被顺利地、完全地降解。在这种情况下，在从源于具有登陆号DSM16254的原核株的核酸序列ID No.1的基因簇中分离的Fum基因簇中，开放阅读框的转录通过位于FumA和FumI之间的双向启动子(从下面的表1中可知)被控制或调节。所述簇编码下列蛋白：参与调控基因表达的蛋白(例如FumB和FumC)，参与底物探测及转运的蛋白(例如FumA，FumJ，FumG)，和参与底物分解代谢的蛋白(例如FumD，FumE，FumF，FumH，FumI，FumK)。从这些编码特殊的基因或酶的核酸序列中，根据本发明的方法的优选的进一步发展选择下列基因：所述基因负责底物分解代谢，因此使得相应形成的酶能够完全地分解代谢底物，即伏马菌素。

在这种情况下，例如选自具有ID No.1的核酸序列的基因簇的开放阅读框在原核或真核宿主细胞中表达。在具有登陆号DSM 16254的细菌株中，包含在具有ID No.1的基因簇中的开放阅读框的转录通过位于fumA和fumI之间的双向启动子(从下面的图1中可知)的控制或调节而进行。所述基因编码下列蛋白：参与调控基因表达的蛋白(例如FumB和FumC)，参与底物识别和转运的蛋白(例如FumA，FumJ，FumG)和参与底物分解代谢的蛋白(例如FumD，FumE，FumF，FumH，FumI和FumK)。

下面的表1中列出了伏马菌素分解代谢的基因簇的基因名称，其中O表示方向，即f为正向，r为反向。

表1

基因	ID No.	O	起始	终止	长度	名称
							fumA	2	f	5214	6395	1182	通透酶
fumB	4	f	6418	7068	651	tetR-型转录调控子
							fumC	6	f	7232	8176	945	lysR-型转录调控子
fumD	8	f	8294	9916	1623	羧酸酯酶

fumE	10	f	9876	11378	1503	丙三羧酸脱氢酶
							fumF	12	f	11494	12537	1044	柠檬酸利用蛋白B
fumG	14	f	12541	13836	1296	丙三羧酸质子同向转运
							fumH	16	f	13957	15027	1071	醇脱氢酶
fumI	18	r	5063	3795	1269	氨基转移酶
							fumJ	20	r	3513	679	2835	TonB-依赖性受体
fumK	22	r	551	？	？	乙酰乳酸合酶(部分)

根据本发明的方法优选地如下进行：使用与酶ID No.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中的至少一个有至少90％序列一致性的酶，由此能够确保甚至更完全地降解伏马菌素，从而使得不仅是伏马菌素，而且还有与伏马菌素相关的或结构类似的真菌毒素(例如AAL-毒素)能够同时被完全解毒，特别是在厌氧或不依赖于氧的环境中。

所述方法优选地如下进行：使用氨基转移酶ID No.19时，使用酮、特别是α-酮酸作为共底物，由此能够特别地通过伏马菌素的氨基基团的降解及同时使用α-酮酸(例如丙酮酸)，将伏马菌素分子上的氨基基团替换为酮基团，并形成丙氨酸作为该反应的副产物，其是完全无害的，从而确保将伏马菌素完全降解为无害物质。

根据优选的进一步发展，根据本发明的方法也可以如下进行：当使用羧酸酯酶ID No.9时，还使用特别地选自黏土矿物的至少一种吸附剂。通过在使用羧酸酯酶ID No.9时还使用特别地选自黏土矿物的至少一种吸附剂，通过在第一步中由羧酸酯酶裂解伏马菌素分子的两个丙三羧酸侧链并形成所谓的水解伏马菌素，还能够不添加另外的酶而使得真菌毒素，特别是伏马菌素完全无害。水解伏马菌素是基本上链状的分子，其可随后被吸附到例如黏土矿物上，从而使得真菌毒素、特别是伏马菌素也能够在一步的酶促降解过程中成为完全无害的。

根据优选的进一步发展，根据本发明的方法如下进行：由此产生的添加剂被用于为了生物乙醇生产的糊状物或待发酵的植物起始材料中。通过将根据本发明的方法生产的添加剂用于为了生物乙醇生产的糊状物或待发酵的植物起始材料中，可以清除(特别是在不依赖于氧的环境中)乙醇生产中产生的副产物中的伏马菌素或真菌毒素，所述副产物即残渣(Trester)(即干的谷物残余和未溶解的成分)或干的酒糟(具有可溶物的干酒糟-DDGS)。

本发明的目的还在于用于酶促降解真菌毒素、特别是伏马菌素的添加剂，通过所述添加剂可以安全可靠地、特别是不依赖于氧地降解此类真菌毒素或对其进行解毒。

为解决这些任务，此类型添加剂的特征在于：其包含至少一种序列ID No.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的酶或至少一种用于表达相应基因的完整的重组宿主生物体，以及任选地另外的至少一种用于至少一种或数种所使用的酶的共底物，及惰性载体。

包含至少一种酶或用于表达所述酶的完整的重组宿主生物体、以及任选地另外的至少一种用于至少一种或数种所使用的酶的共底物及惰性载体的该类添加剂，通过有针对性地降解真菌毒素、特别是伏马菌素并因此对其进行解毒而出色。通过使用基本上由分离的酶以及任选地其共底物和载体组成的根据本发明的添加剂，提供了下述优势：所述酶在例如完整的微生物体将没有活性或仅有很少活性的环境和条件下，将保持其催化活性，以及同时可达到显著更高的特异性活性并可以催化确定的反应而避免不期望的副反应。

另外，根据现有技术由于使用可繁殖的微生物对农业原产品造成的问题可被安全地避免；而且此外，仅含有分离的酶的添加剂不仅显示出用于有针对性的和受控的激活(即例如在消化道的确定位置)的、改善的制剂能力，而且显示出避免不期望的、增加的底物消耗。为了进一步提高特异性，根据本发明的添加剂如下被优选地进一步发展：使用通过分子遗传学方法、诱变或分子进化而被修饰的酶。

根据优选的进一步发展，如下生产所述添加剂：使用与ID No.3、5、7、9、11、13、15、19、21、23或25的酶具有至少90％序列一致性的酶。当使用或使用了与ID No.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25的酶具有至少90％序列一致性的酶时，除优选待降解的伏马菌素之外，还可以安全可靠地、不依赖于氧地降解其他的真菌毒素，因此能够广泛地对例如存在于植物原产品中的真菌毒素，特别是伏马菌素进行解毒。

相应于本发明的优选的进一步发展，通过如下方式形成的添加剂，即所述酶、经修饰的酶和/或至少90％相同的酶经保护性包被包覆而被使用，能确保所述酶、所述至少90％相同的酶或所述经修饰的酶针对任何过早的活性丧失将是安全的，且安全可靠地在预定的位置，例如在胃肠道中，发挥其效果。

通过优选地，以所述酶选自羧酸酯酶ID No.9、丙三羧酸脱氢酶ID No.11、柠檬酸利用蛋白ID No.13、醇脱氢酶ID No.17、氨基转移酶ID No.19和/或ID No.25、和/或乙酰乳酸合酶ID No.23的方式进一步发展所述添加剂，将基本上施用能进行底物的分解代谢的酶，从而除了确保减少将施用的酶的量外，还能确保当使用所述酶时不出现不期望的副反应。

根据本发明的优选的进一步发展，如下形成所述添加剂：其包含羧酸酯酶ID No.9、氨基转移酶ID No.19或ID No.25、作为共底物的α-酮酸、和惰性载体。通过所述包含羧酸酯酶、氨基转移酶、作为共底物的α-酮酸、和惰性载体的添加剂，通过借助羧酸酯酶裂解伏马菌素的丙三羧酸残基，可以首先水解包含在食物中的例如伏马菌素，并随后在氨基转移酶和作为共底物的α-酮酸(在当前的情况下优选丙酮酸)的作用下进一步转化所产生的水解伏马菌素，其通过将水解伏马菌素分子的氨基基团替换为酮基团，从而形成对于例如哺乳动物完全无害的、且可不被改变地被分泌的2-酮-水解伏马菌素，以及作为副产物的丙氨酸，所述丙氨酸例如在生物体上也不产生或具有任何负面效果。

根据本发明的优选的进一步发展，所述添加剂被进一步发展为包含羧酸酯酶ID No.9、至少一种吸附剂(特别是至少一种黏土矿物)以及任选地惰性载体。当仅使用羧酸酯酶ID No.9和至少一种吸附剂时，对于伏马菌素的解毒也可以通过下列方式进行：仅裂解丙三羧酸残基，且因而形成的水解伏马菌素被吸附于所述吸附剂上。通过利用羧酸酯酶裂解丙三羧酸残基，形成基本上长链的分子，所述分子可被容易地且可靠地吸附，从而确保仅通过针对性的单一酶的使用、特别地通过不依赖于氧地降解伏马菌素和随后的吸附，而完全解毒。

根据本发明的进一步发展，在生物乙醇生产时不依赖于氧的环境中、特别是与糊状物或植物起始材料一起使用所述添加剂，通过选择所述添加剂使得其中含有的酶完全源自经高度特异性的降解途径催化伏马菌素的分解代谢的细菌，可以以高特异性、活性和效率使用所述酶，从而使得所述添加剂也可在不依赖于氧的环境中被工艺化地应用。

最后，本发明的目的在于在植物原料的加工或利用中，序列IDNos.1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24中所示的基因、或用于表达酶序列ID No.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的完整的重组宿主生物体、以及任选地共底物在生产用于降解真菌毒素、特别是伏马菌素的添加剂中的用途。以此方式生产的添加剂可以完全且可靠地降解真菌毒素、特别是伏马菌素，特别在不依赖于氧的环境中。

以优选的方式，根据本发明使用选自由羧酸酯酶ID No.9、氨基转移酶ID No.19、ID No.25、或α-酮酸组成的组的共底物，以及惰性载体，通过所述应用可以将例如植物原料或起始材料中的例如伏马菌素安全可靠地、完全降解为无害成分。

另外的优选应用的特征为，使用羧酸酯酶、至少一种吸附剂(特别是黏土矿物)以及任选地惰性载体。通过使用羧酸酯酶和至少一种吸附剂，可以仅使用单一的酶而安全且可靠地对真菌毒素、特别是伏马菌素进行解毒，其中通过或借助于所述酶裂解伏马菌素的丙三羧酸侧残基，并且因此形成的长链水解伏马菌素随后被吸附于吸附剂上，从而以安全可靠的方式使得毒素无害。

根据优选的应用，根据本发明的添加剂被用于不依赖于氧或厌氧地处理生物乙醇生产中的糊状物或植物起始材料。在这种情况下，可以在生物乙醇生产中、在不依赖于氧的环境中安全可靠地使包含在植物起始材料或原料中的真菌毒素无害，从而随后能够将来自乙醇生产的残留物(即残渣或干酒糟)直接地或者在干燥和粒化之后，不作进一步处理(特别是解毒)而作为不含真菌毒素、或特别是伏马菌素的饲料使用。

下面通过实施例和附图更详细地解释本发明。其中：

图1显示伏马菌素-分解代谢性基因簇；

图2显示伏马菌素羧酸酯酶FumD的米-曼二氏曲线(Michaelis-Menten-Kurve)；

图3显示水解伏马菌素B1的降解曲线；

图4显示加入ID No.9的羧酸酯酶后，将伏马菌素FB1转化为水解伏马菌素HFB1；和

图5显示通过加入氨基转移酶ID No.19降解水解伏马菌素HFB1。

图1描绘了作为具有登陆号DSM16254的微生物株的15420碱基对的部分序列的伏马菌素分解代谢基因簇。在原核株DSM16254的fum基因簇中，开放阅读框的转录由位于fumA和fumI之间的双向启动子控制或调节。所述簇编码下列蛋白：参与调控基因表达的蛋白(例如FumB和FumC)，参与底物识别及转运的蛋白(例如FumJ，FumA和FumG)，和参与底物分解代谢的蛋白(例如FumD，FumE，FumF，FumH，FumI和FumK)。

实施例

实施例1：伏马菌素羧酸酯酶的酶动力学

克隆并通过标准方法在巴斯德毕赤酵母中表达编码伏马菌素羧酸酯酶的fum D基因(序列ID No.8)。回收并通过亲和色谱法从上清培养溶液中纯化经组氨酸标记的酶。确定酶浓度，并用50μg-25mgFB₁/升范围内的七个不同底物浓度和0.33ng/ml的酶浓度确定酶动力学参数。在含0.1mg/ml牛血清白蛋白的20mM Tris-Cl缓冲液(pH8.0)中缓冲所述反应并在30℃孵育。在孵育0、30、60、120和240分钟后取样品并用HPLC-MS/MS进行分析。基于以纯化的参照底物和完全¹³C标记的内部FB1标准进行的校准来定量伏马菌素B₁(FB₁)和水解伏马菌素B₁。

图2显示通过伏马菌素羧酸酯酶FumD水解伏马菌素B1(FB1)的米-曼二氏曲线，所述曲线在Tris-Cl缓冲液(pH8.0)中0.33ng/ml的酶浓度下被确定、其中以初始的酶速率相对于底物浓度绘制。所述米-曼二氏曲线显示在较高底物浓度处的下降，因为酶速率是基于产物(即水解FB₁的产生)被计算的。由于水解FB₁是在通过仅保留一个丙三羧酸侧链而裂解一个侧链的部分水解FB₁的两步反应中从FB₁形成的，终产物的形成在高底物浓度处被延迟。米-曼二氏常数K_M被计算为0.90μmol/l，其等同于650ppb，且转化数为900/秒。

从图2得出，伏马菌素可在相关浓度范围内被羧酸酯酶快速和完全地水解。

实施例2：HFB1(水解伏马菌素B1)氨基转移酶的催化活性

通过使用标准方法克隆序列ID Nos.18和24，并在噬菌体T7启动子的控制或调节下在E.coli中表达所述序列。细菌细胞被收集在50mM的磷酸钠缓冲液中、重新悬浮并通过超声波被裂解。加入水解伏马菌素，并在25℃孵育样品。在时间间隔下取出样品并通过HPLC-MS/MS进行分析。未观察到水解FB₁浓度的降低。当向反应中加入共底物，例如α-酮酸(例如丙酮酸或草醋酸盐)时，可观察到水解伏马菌素被完全降解为2-酮-HFB₁(如图3所示)。该物质对哺乳动物是完全无害的。

实施例3：肠内环境中的酶活性

为检测FUM-羧酸脂酶在消化道中的酶活性，使用新鲜屠宰的猪肠并将其在排除氧的条件下转运到实验室中，且在缺氧的无菌操作台中检验。扎住并切下约10cm长的十二指肠和空肠。浓缩的水溶液中的伏马菌素B1被稀释至终浓度为约10ppm，用针头将其注射并与肠内容物混合。随后注射水溶液中的5μg羧酸脂酶或在阴性对照中注射相同体积的水，并进行混合。在39℃下孵育肠切段。借助针头拉住样品并通过HPLC-MS/MS进行分析。这显示出，两小时后第一次取样时，十二指肠或空肠中的伏马菌素B1已经被完全水解了。

实施例4：确定伏马菌素羧酸脂酶活性的温度范围

为确定伏马菌素羧酸脂酶在其中有活性的温度范围，将20mMTris-Cl缓冲液中(pH7.0)的1.6ng/ml FUM-羧酸脂酶与0.1mg/ml BSA及10ppm伏马菌素B1在不同温度下孵育。这显示，对于酶而言的最佳温度是30℃。酶活性在40℃以及甚至50℃时也被明确检测到。因此，FUM-羧酸脂酶适合在如消化道中的温度条件下应用，或适合于在升高的温度下进行的、食物或饲料生产的工艺步骤过程中应用。

实施例5：确定伏马菌素羧酸酯酶活性的pH范围

为了确定伏马菌素羧酸脂酶在其中有活性的pH范围，使用Teorell-Stenhagen缓冲液。该缓冲液可通过柠檬酸盐，磷酸盐和硼酸盐的组合、以相同的缓冲能力在10个pH单位的范围内被调节。浓度为3.3ng/ml的FUM-羧酸酯酶与10ppm伏马菌素B1在该缓冲液中、在不同的pH值下、且在25℃被孵育。在pH 8.0时显示最高的活性，然而在pH 5至pH10的整个范围内均可检测到活性。通过在此宽pH范围内的活性，使得所述酶能够作为饲料添加剂或在食品和饲料加工过程中在工艺上被应用。

实施例6：仔猪饲养实验

实验在有12个各用于10只动物的畜栏的猪圈中进行。猪圈配备有板条地板，饮水槽

和电脑控制的饲养系统。自动装置沿猪圈的墙壁排列。每天自动记录猪圈的气候，并根据用于仔猪饲养的标准建议来设定温度。

120只混合性别的断奶仔猪(年龄：大约4周，平均设定体重8.21kg)。对每只仔猪进行耳标记并单独称重。将120只仔猪随机分入12个畜栏中。所有仔猪均来自奥地利饲养项目

(＝(大白猪x兰德瑞斯(Landrasse))x皮特兰猪(Pietrain))。

刚刚断奶后，以起始饲料喂养所述仔猪两天，在该适应期后进行向实验饲料的转换。饲养以两个阶段进行：断奶期第1-14天，饲养期第15-42天。各畜栏单独地，通过Spotmix饲养装置混合实验饲料，并根据仔猪数量、体重发展和饲料消耗以干饲料形式每天两次分配实验饲料。水可随意取用。12个畜栏以各三次重复被分成4个不同的应用组，并在上述饲料中获得下面的混合物：

在阳性对照组中观察到几乎一半的动物有呼吸系统问题，其中还发生了一例损失。所有其他组表现健康。

表现数据

实施例7：在生物乙醇糊状物中降解伏马菌素

取用于生物乙醇生产的玉米糊状物样品，并在30至65℃下、在搅拌孵育，其中研究在搅拌(搅拌时间为分钟)下，加入770单位羧酸酯酶ID No.9/立方米糊状物后，伏马菌素B1的降解。取出样品后通过煮沸使其灭活，然后将样品离心用于分析，使上清液的等份蒸发。将剩余物放入200μl含有C¹³标记的内部伏马菌素标准的样品缓冲液中，摇动1.5分钟，离心，然后使之经受LC-MS-分析。从该结果可知，如图4所示，伏马菌素FB1被完全转化为水解伏马菌素HFB1。加入氨基转移酶ID No.19后，水解伏马菌素HFB1被完全降解为无害成分，如图5所示。

实施例8：降解玉米饼糊(Maistortillabrei)和玉米片糊中的伏马菌素及其衍生物

在用于玉米饼和玉米片生产的玉米糊样品(玉米渣)中研究伏马菌素降解酶的效果。含有伏马菌素的玉米(约1ppm)被磨成玉米面，掺入水并煮沸。对于玉米饼生产，向冷却至约50至60℃玉米糊中掺入碱性溶液中的蛋白水解酶混合物。30至180分钟后，当pH值降至低于9(优选低于8)时，加入羧酸酯酶和氨基转移酶(各500-1000单位/m³)的混合物并再孵育30至60分钟。在玉米片生产的情形中，将来自经研磨的玉米的玉米糊和大麦芽在压力容器中煮沸大约一小时，在冷却至低于60℃(优选50℃)后，加入由羧酸酯酶和氨基转移酶(各500-1000单位/m³)组成的酶混合物并再孵育30至60分钟。然后从该混合物中取出样品并如实施例7中所示研究FB1或HFB1剩余物。在所有样品中，HFB1水平均低于80ppb，显然，形成自FB1的HFB1被继续进一步转化。在下表中显示所测定的FB1值。

表格：酶促降解玉米糊中的FB1和HFB1；伏马菌素浓度为ppb(μg/kg)

Claims (22)

1.生产用于酶促降解真菌毒素、特别是伏马菌素的添加剂的方法，其特征在于，提供至少一种对应于序列ID Nos.1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的基因的核酸序列，所述至少一种核酸序列在原核或真核宿主细胞中表达，且至少一种由此制备的、对应于序列ID Nos.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的酶或至少一种完整的重组宿主生物体，任选地与共底物一起，被用于植物原料中。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述真菌毒素、特别是伏马菌素不依赖于氧地被降解。

3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，在将酶用于植物原料中之前，通过分子遗传学方法、诱变或分子进化来修饰所述酶。

4.根据权利要求1、2或3的方法，其特征在于，所述酶是经分离的。

5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于，所述酶被包裹在保护性包被中。

6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于，所述酶选自：通透酶ID No.3，羧酸酯酶ID No.9，丙三羧酸脱氢酶ID No.11，柠檬酸利用蛋白ID No.13，醇脱氢酶ID No.17，氨基转移酶ID No.19和/或25，和/或乙酰乳酸合酶ID No.23。

7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于，使用与酶ID No.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中的至少一个具有至少90％序列一致性的酶。

8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于，当使用至少一种氨基转移酶ID No.19或ID No.25时，使用酮，特别是α-酮酸作为共底物。

9.根据权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于，当使用羧酸酯酶ID No.9时，还使用至少一种吸附剂，所述吸附剂特别地选自黏土矿物。

10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其特征在于，在用于生物乙醇生产的糊状物或待发酵的植物原料中使用所述添加剂。

11.用于酶促降解植物原料和含有植物原料的混合物中的真菌毒素、特别是伏马菌素的添加剂，其特征在于，所述添加剂含有至少一种序列ID Nos.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的酶，或至少一种用于表达所述酶基因序列的完整的重组宿主生物体，以及任选地另外的至少一种用于至少一种或数种所使用的酶的共底物和惰性载体。

12.根据权利要求11的添加剂，其特征在于，使用通过分子遗传学方法、诱变或分子进化来修饰的酶。

13.根据权利要求11或12的添加剂，其特征在于，所使用的酶与ID No.3、5、7、9、11、13、15、19、21、23或25的酶具有至少90％的序列一致性。

14.根据权利要求11、12或13的添加剂，其特征在于，所述酶、经修饰的酶和/或至少90％一致的酶以保护性包被包覆而被使用。

15.根据权利要求11-14中任一项的添加剂，其特征在于，所述酶选自羧酸酯酶ID No.9，丙三羧酸脱氢酶ID No.11，柠檬酸利用蛋白ID No.13，醇脱氢酶ID No.17，氨基转移酶ID No.19或ID No.25，和/或乙酰乳酸合酶ID No.23。

16.根据权利要求11-15中任一项的添加剂，其特征在于，所述添加剂含有羧酸酯酶ID No.9，至少一种氨基转移酶ID No.19或IDNo.25，α-酮酸作为共底物，以及惰性载体。

17.根据权利要求11-16中任一项的添加剂，其特征在于，所述添加剂含有羧酸酯酶ID No.9，至少一种吸附剂，特别是至少一种黏土矿物，以及任选地惰性载体。

18.根据权利要求11-17中任一项的添加剂，其特征在于，在生物乙醇生产时、在不依赖于氧的环境中使用所述添加剂，特别是与糊状物或植物起始材料一起使用。

19.下列在生产用于降解植物材料中的真菌毒素、特别是伏马菌素的添加剂中的用途：序列ID Nos.1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24中所示的基因，或用于表达酶序列ID No.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的完整重组宿主生物体，以及任选地共底物。

20.根据权利要求19的用途，其特征在于，使用选自羧酸酯酶ID No.9、氨基转移酶ID No.19或ID No.25、或α-酮酸的共底物，以及惰性载体。

21.根据权利要求19的用途，其特征在于，使用羧酸酯酶、至少一种吸附剂特别是黏土矿物、以及任选地惰性载体。

22.根据权利要求19、20或21中任一项的用途，用于不依赖于氧地处理生物乙醇生产中的糊状物或植物起始材料。

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