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CN102143957B - 作为沉默调节蛋白调节剂的苯并咪唑类和相关的类似物 - Google Patents

作为沉默调节蛋白调节剂的苯并咪唑类和相关的类似物 Download PDF

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CN102143957B CN200980134249.9A CN200980134249A CN102143957B CN 102143957 B CN102143957 B CN 102143957B CN 200980134249 A CN200980134249 A CN 200980134249A CN 102143957 B CN102143957 B CN 102143957B
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Abstract

本发明提供了式(II)的沉默调节蛋白-调节性化合物。该沉默调节蛋白-调节性化合物可以用于增加细胞寿命及治疗和/或预防多种疾病与病症，包括，例如与老化或应激有关的疾病或病症、糖尿病、肥胖、神经变性疾病、心血管疾病、血液凝结病症、炎症、癌症和/或潮红以及会因线粒体活性的增加而受益的疾病或病症。本发明还提供了含有沉默调节蛋白的调节性化合物和另一治疗剂的组合药物。

Description

作为沉默调节蛋白调节剂的苯并咪唑类和相关的类似物
相关申请
本申请要求2008年7月3日提交的美国临时申请号61/133,938的权益，其全部内容并入本文作为参考。
背景技术
基因的沉默信息调节剂(Silent Information Regulator，SIR)家族代表存在于范围从古细菌(archaebacteria)至更高级的真核生物的生物体的基因组中的高度保守性一组基因。编码的SIR蛋白质涉及从基因沉默的调节至DNA修复的各种不同程序。由SIR基因家族成员编码的蛋白质显示：在250氨基酸核心结构域中有高度序列保守。此家族中已相当特征化的基因为酿酒酵母SIR2(S.cerevisiae SIR2)，其涉及含有指定酵母交配型、端粒位置效应及细胞老化的信息的沉默HM基因座。酵母Sir2蛋白质属于组蛋白脱乙酰基酶的家族。于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)中的Sir2同系物(homolog)(CobB)，起到NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)-依赖性ADP-核糖基转移酶的作用。
Sir2蛋白为使用NAD作为协同底物的第III类脱乙酰基酶。不同于其他脱乙酰基酶，这些中的许多涉及基因沉默，Sir2对第I类及第II类组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，例如曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)不具敏感性。
通过Sir2进行的乙酰基-赖氨酸的脱乙酰基化，与NAD水解作用紧密结合，产生烟酰胺与新的乙酰基-ADP核糖化合物。Sir2的NAD-依赖性脱乙酰基酶活性对于将其生物学角色与酵母中的细胞代谢作用结合这一其功能而言是必需的活性。哺乳动物Sir2同系物具有NAD-依赖性组蛋白脱乙酰基酶活性。
生物化学的研究已显示，Sir2可容易地将组蛋白H3与H4的氨基末端尾部脱乙酰基化，导致形成1-O-乙酰基-ADP-核糖与烟酰胺。具有额外SIR2拷贝的菌株显现其rDNA沉默增加且寿命增长30％。最近已显示，秀丽隐杆线虫(C.elegans)SIR2同系物(sir-2.1)及果蝇(D.melanogaster)dSir2基因的额外拷贝会大大延长这些生物体的寿命。这暗示了，针对老化的SIR2-依赖性调节途径，其在演化早期已出现且已经是相当保守的(conserve)。现今，Sir2基因据相信已经演化以增强生物体的健康与抗压性，来增加其度过存活逆境的机会。
在人中有7种Sir2-样基因(SIRT1-SRT7)，它们共享Sir2保守催化结构域。SIRT1为与Sir2具有最高程度序列相似的核蛋白。SIRT1通过脱乙酰化作用调节多重细胞靶物，包括肿瘤抑制基因p53、细胞信号传导因子NF-κB和FOXO转录因子。
SIRT3为SIRT1的同系物，其在原核生物与真核生物中具保守性。SIRT3蛋白通过位于N-末端的独特结构域靶向至线粒体的嵴(cristae)。SIRT3具有NAD+-依赖性蛋白质脱乙酰基酶活性，且被普遍地(upbiquitously)表达在，特别是，具有代谢活性的组织中。在转移至线粒体时，相信SIRT3被线粒体基质加工肽酶(MPP)裂解成更小的、具活性的形式。
已知摄热量限制(caloric restriction)有70年以上，以增进健康并延长哺乳动物的寿命。酵母(如后生动物)的寿命也通过类似摄热量限制(例如低葡萄糖)的介入来增长。发现缺乏SIR2基因的酵母与蝇类在经摄热量限制时都不再存活，这为SIR2基因介导此类限制热量的饮食有益健康功效提供了证据。而且，降低酵母葡萄糖-响应性cAMP(腺苷3′，5′-单磷酸)-依赖性(PKA)途径活性的突变，会延长野生型细胞的寿命，但在突变型sir2菌株中则不会延长，这证明SIR2似乎是摄热量限制途径的关键下游组分。
发明概述
本发明提供新的沉默调节蛋白(sirtuin)-调节性化合物及其利用方法。
一方面，本发明提供如下所详述的具有结构式(I)、(II)(例如IIa、IIb和IIc)和(III)的沉默调节蛋白(sirtuin)调节性化合物。
在另一个方面，本发明提供了使用沉默调节蛋白-调节化合物的方法、或包含沉默调节蛋白-调节化合物的组合物。在某些实施方案中，提高沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白-调节化合物可以用于各种治疗应用，包括，例如，提高细胞寿命，治疗和/或预防多种疾病和病症，包括，例如，与衰老或应激反应有关的疾病或病症，糖尿病，肥胖症，神经变性疾病，化学疗法引起的神经病，与缺血状况有关的神经病，眼睛疾病和/或病症，心血管疾病，血液凝固病症，炎症，和/或潮红，等等。提高沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白调节化合物也可以用于治疗患者的受益于线粒体活性提高的疾病或病症，用于增强肌肉性能，用于提高肌肉ATP水平，或用于治疗或预防与缺氧或局部缺血有关的肌肉组织伤害。在其它实施方案中，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白-调节化合物可以用于各种治疗应用，包括，例如，提高细胞对应激反应的敏感性，提高细胞程序死亡，治疗癌症，刺激食欲，和/或刺激体重增加，等等。如下面进一步所描述，该方法包括给药需要的患者药物有效量的沉默调节蛋白-调节化合物。
在一些方面，沉默调节蛋白的调节性化合物可单独给药，或与其他化合物包括其他沉默调节蛋白的调节性化合物，或其他治疗剂组合进行给药。
发明详述
1.定义
用于本文的下列术语及短语应具有于下文所叙述的含义。除非另行定义，所有于本文中所使用的技术与科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
本文中术语“药物(agent)”用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子(例如核酸、抗体、蛋白质或其部分例如肽)、或从生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制得的提取物。此类药物的活性可使其适宜用作在受治疗者体内局部地或全身性地起作用的在生物学上、生理学上或药学上是活性物质的“治疗剂”。
术语“生物可利用的”当涉及化合物时为本领域所认知的，且所考虑到的涉及化合物形式或所给药化合物的一部分的量，能够被所给药的受治疗者或患者吸收、混入或以其他方式在生理学上被利用。
“沉默调节蛋白的生物学上具活性的部分”是指具有生物活性，例如脱乙酰基化能力的沉默调节蛋白的一部分。沉默调节蛋白的生物学上具活性的部分可包含沉默调节蛋白的核心结构域。具有GenBank登录编号NP_036370的SIRT1的生物学上具活性部分，包括NAD+结合结构域与底物结合结构域，例如，可包括但不限于GenBank登录编号NP_036370的氨基酸62-293，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸237至932所编码。因此，此区域有时被称作核心结构域。SIRT1的其他生物学上具活性部分(也有时也被称作核心结构域)包括大致为GenBank登录编号NP_036370的氨基酸261至447，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸834至1394所编码；大致为GenBank登录编号NP_036370的氨基酸242至493，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸777至1532所编码；或大致为GenBank登录编号NP_036370的氨基酸254至495，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸813至1538所编码。
术语“陪伴动物”是指猫与狗。用于本文的术语“狗”是指犬科家族(Canisfamiliaris)的任一成员，其中有许多不同品种。术语“猫”是指猫科动物，包括驯养猫及猫科猫属(family Felidae，genus Felis)的其他成员。
“糖尿病”是指高血糖或酮酸中毒，以及因长期高血糖状态或葡萄糖耐受性减低所引起的慢性、一般性代谢异常。“糖尿病”包含该疾病的I与II型(非胰岛素依赖性糖尿病或NIDDM)两种形式。糖尿病的危险因素包括下列因素：男子腰围超过40英寸或女子腰围超过35英寸，血压为130/85mmHg或以上，甘油三酸酯高于150mg/dl，空腹血糖大于100mg/dl，或男子中高密度脂蛋白少于40mg/dl或女子中少于50mg/dl。
术语“ED50”为本领域所认知的。在一些实施方案中，ED50是指药物产生其最大响应或功效的50％时的剂量，或者在50％的测试受试者或制剂中产生预定响应的剂量。术语“LD50”为本领域所认知的。在一些实施方案中，LD50是指药物使50％的测试受试者致死的剂量。术语“治疗指数”为本领域所认知的术语，指药物的治疗指数，定义为LD50/ED50。
术语“高胰岛素血症”是指个体血液中胰岛素水平高于正常值的状况。
术语“胰岛素抗性”是指这样的一种状态，其中正常量胰岛素产生相对于在不具有胰岛素抗性的受治疗者中的生物响应而言，为低于正常(subnormal)生物响应的状态。
本文所讨论的“胰岛素抗性病症”是指由胰岛素抗性所造成或引起的任何疾病或病症。实例包括：糖尿病、肥胖症、代谢综合征(syndromes)、胰岛素抗性综合征、综合征X(syndromes X)、胰岛素抗性、高血压、血压过高、高血胆固醇、血脂异常、高脂血症、血脂异常、动脉粥样硬化疾病包括中风、冠状动脉疾病或心肌梗塞、高血糖症、高胰岛素血症和/或高胰岛素原血症(hyperproinsulinemia)、葡萄糖耐受性不良、延迟胰岛素释出、糖尿病并发症包括冠心病、心绞痛、充血性心脏衰竭、中风、痴呆的识别功能、视网膜病、周围神经病、肾病、肾小球肾炎、肾小球硬化症、肾病变综合征、高血压性肾硬化、一些类型癌症(例如子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌与结肠癌)、妊娠并发症、雌性生殖健康变差(例如月经不规则、不孕、不规则排卵、多囊卵巢性综合征(PCOS))、脂肪代谢障碍、胆固醇相关病症(例如胆石、胆囊炎与胆石病)、痛风、障碍性睡眠呼吸暂停与呼吸问题、骨关节炎，及预防与治疗骨丢失(bone loss)例如骨质疏松症。
术语“家畜动物”是指经驯化的四足动物，其包括那些为肉类与各类副产品而饲养的动物，例如牛类动物包括牛与其他牛属(genus Bos)的成员，猪类动物包括驯养猪与其他猪属(genus Sus)的成员，羊类动物包括绵羊与其他羊属(genus Ovis)的成员、驯养山羊与其他山羊属(genus Capra)的成员；为特定任务例如用做为负重的兽而饲养的经驯化的四足动物，例如马类动物包括驯养马与其他马科马属(family Equidae，genus Equus)的成员。
术语“哺乳动物”为本领域已知的，且例举性哺乳动物包括人类、灵长类、家畜动物(包括牛类、猪类等)、陪伴动物(例如犬类、猫类等)及啮齿类(例如小鼠与大鼠)。
“肥胖的”个体或承受肥胖之苦的个体，一般指具有的体重指数(BMI)为至少25或以上的个体。肥胖可能或不可能与胰岛素抗性相关。
术语“经肠道外给药”及“经肠道外进行给药”为本领域所认知的，且指除了肠内与局部给药以外的给药型式，一般经由注射，且包括但不限定于：静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内与胸骨内注射及输注(infusion)给药。
“患者”、“受治疗者”、“个体”或“宿主”是指人类或非人类动物。
术语“药学上可接受的载体”为本领域所认知的，且是指携带或运送任何主体组合物或其组分的药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封物料。各种载体就其可与主体组合物或其组分相容的意义而言必须为“可接受的”，且对患者是无害的。可用作药学上可接受载体的材料的一些实例包括：(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖与蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉与马铃薯淀粉；(3)纤维素与其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素醋酸酯；(4)成粉末的西黄耆胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂与栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、蓖麻油、葵花油、芝麻油、橄榄油、玉米油与大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇类，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇与聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯与月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁与氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水(isotonic saline)；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；及(21)其他用于医药制剂的无毒性可相容物质。
术语“预防性”或“治疗性”治疗为本领域所认知的，且指将药物给药至宿主。如果在临床显现不希望病症(例如，宿主动物的疾病或其他不希望状态)之前进行给药，则该治疗为预防性，即其保护宿主不会发展成该不希望病症，而如果在临床显现不希望病症之后进行给药，则该治疗为治疗性的(即意在减少、改善或维持现有的不希望病症或由其产生的副作用)。
术语“无热原(pyrogen-free)”在关于组合物时，是指不含有热原的组合物，而其含量会在已给药该组合物的受治疗者中导致有害作用(例如，刺激、发热、炎症、腹泻、呼吸性窘迫、内毒素性休克等)。例如，该术语意欲包括不含(或基本上不含)诸如脂多糖(LPS)等内毒素的组合物。
细胞的“复制寿命”是指由单个“母细胞”所产生的许多子细胞。另一方面，“时序衰老(chronolo gical aging)”或“时序寿命”是指一群不分裂的细胞当被除去养分时仍保持存活的时间长度。“增加细胞寿命”或“延长细胞寿命”当应用于细胞或生物体时，是指增加由一个细胞所产生的许多子细胞；增加细胞或生物体对抗应激及对抗损伤，例如对DNA、蛋白质的应激和损伤的能力；和/或增加细胞或生物体可于特别条件例如应激(如热休克、渗透压力、高能量照射、化学诱导的应激、DNA损伤、不适当的盐水平、不适当的氮水平或不充足的营养物水平)下存活和生存的状态达较长时间的能力。使用本文中所述的方法，寿命可增加至少约20％、30％、40％、50％、60％，或20％至70％、30％至60％、40％至60％或以上。
“沉默调节蛋白的活化化合物”是指使沉默调节蛋白水平增加，和/或增加沉默调节蛋白的至少一种活性的化合物。在例举性的实施方案中，沉默调节蛋白的活化化合物可使沉默调节蛋白的至少一种生物活性增加至少约10％、25％、50％、75％、100％或以上。沉默调节蛋白的例举性生物活性包括(例如)组蛋白与p53的脱乙酰基化；延长寿命；增加基因组的稳定性；沉默转录作用；及调控母细胞与子细胞间的经氧化蛋白质的分离。
“沉默调节蛋白”是指沉默调节蛋白的脱乙酰基酶蛋白家族(或优选指sir2家族)的成员，其包括酵母Sir2(GenBank登录编号P53685)、秀丽隐杆线虫Sir-2.1(GenBank登录编号NP_501912)及人类SIRT1(GenBank登录编号NM_012238与NP_036370(或AF083106))与SIRT2(GenBank登录编号NM_012237、NM_030593、NP_036369、NP_085096与AF083107)蛋白质。其他家族成员包括四种称作“HST基因”(Sir2的同系物)的额外酵母Sir2类基因HST1、HST2、HST3与HST4，及五种其他人类同系物hSIRT3、hSIRT4、hSIRT5、hSIRT6与hSIRT7(Brachmann等人(1995)Genes Dev.9：2888及Frye等人(1999)BBRC 260：273)。优选的沉默调节蛋白是那些和SIRT2相比，与SIRT1，即hSIRT1和/或Sir2共有更多相似性的沉默调节蛋白，例如那些具有至少一部分存在于SIRT1中而不存在于SIRT2中的，例如SIRT3所具有的N-末端序列的成员。
“SIRT1蛋白”是指沉默调节蛋白的脱乙酰基酶的Sir2家族的成员。在一个实施方案中，SIRT1蛋白质包括酵母Sir2(GenBank登录编号P53685)、秀丽隐杆线虫Sir-2.1(GenBank登录编号NP_501912)、人类SIRT1(GenBank登录编号NM_012238或NP_036370(或AF083106))蛋白质，及其等同物与片段。在另一个实施方案中，SIRT1蛋白质包括多肽，其包含由或基本上由列示于GenBank登录编号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685中的氨基酸序列所组成的序列。SIRT1蛋白质包括含有下列氨基酸序列的全部或一部分的多肽及其功能性片段：列示于GenBank登录编号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685中的氨基酸序列；列示于GenBank登录编号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685中的具有1至约2、3、5、7、10、15、20、30、50、75或更多保守性氨基酸取代的氨基酸序列；与GenBank登录编号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。本发明的多肽也包括GenBank登录编号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685的同源物(直向同源物(orthologs)与侧向同源物(paralogs))、变体或片段。
“SIRT3蛋白”是指沉默调节蛋白的脱乙酰基酶蛋白家族的成员，和/或指SIRT1蛋白质的同系物。在一个实施方案中，SIRT3蛋白质包括人类SIRT3(GenBank登录编号AAH01042、NP_036371或NP_001017524)与小鼠SIRT3(GenBank登录编号NP_071878)蛋白质，及其等同物与片段。在另一个实施方案中，SIRT3蛋白质包括多肽，其包含由或基本上由列示于GenBank登录编号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878中的氨基酸序列所组成的序列。SIRT3蛋白质包括含有下列氨基酸序列的全部或一部分的多肽及其功能性片段：列示于GenBank登录编号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878中的氨基酸序列；列示于GenBank登录编号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878中的具有1至约2、3、5、7、10、15、20、30、50、75或更多保守性氨基酸取代的氨基酸序列；与GenBank登录编号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。本发明的多肽也包括GenBank登录编号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878的同源物(直向同源物与侧向同源物)、变体或片段。在一个实施方案中，SIRT3蛋白质包括以线粒体基质加工肽酶(MPP)和/或线粒体中间体肽酶(MIP)裂解而产生的SIRT3蛋白质片段。
术语“全身性给药”、“全身地给药”、“周围性给药”及“周围地给药”为本领域所认知的，且指主体组合物、治疗剂或其他物质的除了直接进入中枢神经系统以外的给药方式，以使其能进入患者的全身，而因此进行代谢作用及其他类似过程。
术语“治疗剂”为本领域所认知的，且是指任何其为生物学上、生理学上或药理学上具活性的、可于受治疗者内局部或全身性起作用的化学部分(moiety)。该术语也是指任何欲用于诊断、治愈、减轻、治疗或预防疾病的物质，或用于增进动物或人体的希望的身体或精神发展和/或状况的物质。
术语“治疗功效”为本领域所认知的，且指动物(特别是哺乳动物，且更特别地为人类)中由药理学上具活性的物质产生的局部或全身性功效。短语“治疗上有效量”是指，使物质能以可应用至任何治疗的合理利益/风险比下，产生某种所希望的局部或全身功效的量。此类物质的治疗上有效量将随欲受治疗的受治疗者与疾病状况、受治疗者的体重与年龄、疾病状况的严重度、给药方式等而有所变化，其可由本领域技术人员确定。例如，本文所述的一些组合物可以在可应用至此类治疗的合理利益/风险比下产生所希望功效的足够量来进行给药。
“治疗”病症或疾病是指治愈以及改善该病症或疾病的至少一种症状。
术语“视力损伤”是指视力减弱，其在进行治疗(例如手术)时往往仅部分可逆或不可逆。特别严重的视力损伤称为“盲”或“视力丧失”，其是指视力完全丧失、视力变差于20/200以致无法经由矫正镜片改善，或视野小于20度直径(10度半径)。
2.沉默调节蛋白的调节剂
在一个方面，本发明提供用于治疗和/或预防种类繁多的疾病与病症的新颖沉默调节蛋白的调节性化合物，上述疾病与病症包括，例如与老化或应激有关的疾病或病症、糖尿病、肥胖症、神经变性性疾病、眼部疾病与病症、心血管疾病、血液凝固病症、炎症、癌症和/或潮红等。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物也可用于治疗受治疗者中因增加线粒体活性而受益的疾病或病症，用于增进肌肉机能，用于增加肌肉ATP水平，或用于治疗或预防与缺氧或缺血相关的肌肉组织损伤。本文中所公开的其他化合物可适用于药物组合物，和/或一种或多种本文中所公开的方法。
在一个实施方案中，本发明的沉默调节蛋白-调节性化合物由结构式(I)或其盐表示：
其中：
Z1和Z2之一为CR3，并且Z1和Z2另一个选自N和CR3，其中
在各种情况下，R3选自氢、羟基、卤素、-C≡N、氟取代的C1-C2烷基、-O-氟取代的(C1-C2)烷基、-S-氟取代的(C1-C2)烷基、C1-C4烷基、-O-(C1-C4)烷基、-S-(C1-C4)烷基、C3-C7环烷基；
R选自氢、-(C2-C4)烷基、-氟取代的(C1-C4)烷基、-(C1-C4)烷基-N(R7)(R7)、-(C1-C4)烷基-C(O)-N(R7)(R7)、-(C2-C4)烷基-O-R7和-(C2-C4)烷基-N(R7)-C(O)-R7，其中：
每个R7独立地选自氢和-C1-C4烷基；或者
与相同的氮原子相连的两个R7与该氮原子一起形成任选包含另一个选自下列的杂原子的4至7元饱和的杂环：N、S、S(＝O)、S(＝O)2和O，其中该饱和的杂环在单个碳原子上任选被下列基团取代：-OH、-C1-C4烷基、氟、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NH(CH2CH2OCH3)或-N(CH2CH2OCH3)2；
R1选自碳环和杂环，其中R1任选被一至两个独立地选自下列的取代基所取代：卤素、-C≡N、C1-C3烷基、＝O、C3-C7环烷基、氟取代的C1-C2烷基、-O-R8、-S-R8、-(C1-C2烷基)-N(R8)(R8)、-N(R8)(R8)(例如-NH-CH2-CH(OH)-CH2OH和-O-CH2-CH(OH)-CH2OH)、-O-(C1-C2烷基)-N(R8)(R8)、-(C1-C2烷基)-O-(C1-C2烷基)-N(R8)(R8)、-C(O)-N(R8)(R8)-(C1-C2烷基)-C(O)-N(R8)(R8)，并且其中R1为苯基，R1也任选被下列基团所取代：3，4-亚甲基二氧基，氟取代的3，4-亚甲基二氧基，3，4-亚乙基二氧基和氟取代的3，4-亚乙基二氧基；
每个R8独立地选自氢和-C1-C4烷基；或者
两个R8与它们所结合的氮原子一起形成任选包含一个另外杂原子的4至8元饱和的杂环，所述杂原子选自N，S，S(＝O)，S(＝O)2和O，其中所述烷基任选被一个或多个-OH、氟、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NH(CH2CH2OCH3)或-N(CH2CH2OCH3)2取代，该饱和的杂环在碳原子上任选被-OH、-C1-C4烷基、氟、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NH(CH2CH2OCH3)或-N(CH2CH2OCH3)2取代。
R2选自含有至少五个环原子的碳环以及除了哌嗪外的杂环，其中R2任选被一至两个独立地选自下列的取代基所取代：卤素、-C≡N、C1-C3烷基、C3-C7环烷基、氟取代的C1-C2烷基、-O-R8、-S-R8、-(C1-C2烷基)-N(R8)(R8)、-N(R8)(R8)(例如(例如-NH-CH2-CH(OH)-CH2OH和-O-CH2-CH(OH)-CH2OH)、-O-(C1-C2烷基)-N(R8)(R8)、-(C1-C2烷基)-O-(C1-C2烷基)-N(R8)(R8)、-C(O)-N(R8)(R8)、-(C1-C2烷基)-C(O)-N(R8)(R8)、-O-苯基、苯基、第二个杂环，并且当R2为苯基时，R2也任选被下列基团所取代：3，4-亚甲基二氧基，氟取代的3，4-亚甲基二氧基，3，4-亚乙基二氧基或氟取代的3，4-亚乙基二氧基，其中R2的任何苯基或第二个杂环取代基任选被下列取代基所取代：卤素；-C＝N；C1-C3烷基、氟取代的C1-C2烷基、-O-氟取代的(C1-C2)烷基、-O-(C1-C3)烷基、-S-(C1-C3)烷基、-S-氟取代的(C1-C2)烷基、-NH-(C1-C3)烷基和-N-(C1-C3)2烷基；和
R4选自氢、卤素、-C＝N、氟取代的C1-C2烷基、-S-氟取代的(C1-C2)烷基、C1-C4烷基、-S-(C1-C4)烷基和C3-C7环烷基；
X选自： 和其中：
代表X与R1键合的位置；和
每个R5和R6独立地选自氢、C1-C4烷基、-CF3和(C1-C2烷基)-CF3，其中：
当每个Z1和Z2是CH，并且R1为任选取代的苯基时，则R2不是吡啶基；
当每个Z1和Z2是CH，R1是苯基，并且R和R4是H时，则R2不是喹啉基或吲唑基；
当每个Z1和Z2是CH，R1是4-甲氧基苯基，并且R和R4是H时，则R2不是吡啶基；和
当Z1为N，Z2为CR3，R3为H或CH3，R4为H，R为-CH3，并且R1为苯基时，则R2不是三唑基。
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物选自：
在一些实施方案中，该化合物具有下式：
在一些实施方案中，R选自氢、-(C1-C4)烷基-N(R7)(R7)、-(C1-C4)烷基-C(O)-N(R7)(R7)、-(C2-C4)烷基-O-R7和-(C2-C4)烷基-N(R7)-C(O)-R7。在一些实施方案中，R为氢。
在一些实施方案中，Z1和Z2都是CR3。
在一些实施方案中，R4选自氢、卤素、-C≡N、C1-C4烷基和氟取代的C1-C2烷基。在一些实施方案中，R4为氢。在一些实施方案中，其中Z1和Z2都是CR3，R和R4都是H。
在一些实施方案中，在一些实施方案中，X为其中在一些实施方案中，R5和R6独立地选自氢和C1-C4烷基。在一些实施方案中，R5和R6都是氢。在一个示例性的实施方案中，X为Z1和Z2都是CR3，并且R和R4都是H。
在一些实施方案中，R1选自包含一个或多个选自N、O和S的杂原子的杂环。在具体的实施方案中，R1选自包含一个或两个氮的杂环。在具体的实施方案中，R1选自包含最多三个选自S和N的杂原子的杂环。在其它实施方案中，R1选自包含最多三个选自O和N的杂原子的杂环。
R1的实例包括：
在一些实施方案中，R1选自：
在上述实施方案中，R1任选被1或2个独立地选自卤素、(C1-C4)烷基和＝O的取代基所取代。在一些实施方案中，R1为三唑基，其任选被一个或多个选自卤素和(C1-C4)烷基的取代基所取代。在一些实施方案中，R1为任选取代的2-三唑基。在一些实施方案中，当R1为任选取代的三唑基时，X为
在一些实施方案中，R2选自芳基和杂芳基。R2的实例包括：
在具体的实施方案中，关于R2与化合物其余部分的连接，R2为间位取代的，并且其中R2任选进一步按照上述被取代。在一些实施方案中，R2选自：
在一些实施方案中，R2任选被一至两个独立选自下列的取代基所取代：卤素、-C≡N、C1-C4烷基、氟取代的C1-C2烷基、-OR8，其中R8为任选被一个或多个卤素取代基所取代的烷基。在一些实施方案中，R2为苯基，其任选被一个或多个独立地选自下列的取代基所取代：-Cl、-Br、-F、-C≡N、-CF3和-OCF3。
在另一实施方案中，本发明提供了由结构式II表示的化合物或其盐：
其中：
Z11和Z12之一为CR13，并且Z11和Z12另一个选自N和CR13，其中
R13选自氢、卤素、-OH、-C＝N、氟取代的C1-C2烷基、-O-(氟取代的C1-C2烷基)、-S-(氟取代的C1-C2烷基)、C1-C4烷基、-(C1-C2烷基)-N(R14)(R14)、-O-CH2CH(OH)CH2OH、-O-(C1-C4)烷基、-O-(C1-C3)烷基-N(R14)(R14)、-N(R14)(R14)、-S-(C1-C4)烷基和C3-C7环烷基；
R选自氢、-(C2-C4)烷基、-氟取代的(C1-C4)烷基、-(C1-C4)烷基-N(R7)(R7)、-(C1-C4)烷基-C(O)-N(R7)(R7)、-(C2-C4)烷基-O-R7和-(C2-C4)烷基-N(R7)-C(O)-R7，其中：
每个R7独立地选自氢和-C1-C4烷基；或
与相同的氮原子相连的两个R7与该氮原子一起形成任选包含另一个选自下列的杂原子的4至7元饱和的杂环：N、S、S(＝O)、S(＝O)2和O，其中该饱和的杂环在单个碳原子上任选被下列基团取代：-OH、-C1-C4烷基、氟、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NH(CH2CH2OCH3)或-N(CH2CH2OCH3)2；
R4选自氢、卤素、-C≡N、氟取代的C1-C2烷基、-S-氟取代的(C1-C2)烷基、C1-C4烷基、-S-(C1-C4)烷基和C3-C7环烷基；
X选自： 和 其中
代表X与R1键合的位置；和
R15和R16独立地选自氢、C1-C4烷基、CF3和-(C1-C4烷基)-CF3；
R11选自碳环和杂环，其中R11任选被一至两个独立选自下列的取代基所取代：卤素、-C≡N、C1-C3烷基、C3-C7环烷基、氟取代的C1-C2烷基、＝O、-O-R14、-S-R14、-(C1-C4烷基)-N(R14)(R14)、-N(R14)(R14)、-O-(C2-C4烷基)-N(R14)(R14)、-C(O)-N(R14)(R14)、-C(O)-O-R14和-(C1-C4烷基)-C(O)-N(R14)(R14)，并且当R11为苯基时，R11也任选被下列基团所取代：3，4-亚甲基二氧基、氟取代的3，4-亚甲基二氧基、3，4-亚乙基二氧基、氟取代的3，4-亚乙基二氧基、O-(饱和的杂环)、氟取代的-O-(饱和的杂环)和C1-C4烷基-取代的O-(饱和的杂环)；其中
每个R14独立地选自氢和-C1-C4烷基；或者
两个R14与它们相连的氮原子一起形成4至8元饱和的杂环，其任选包含另一个选自下列的杂原子：N、S、S(＝O)、S(＝O)2和O，其中：
当R14为烷基时，该烷基任选被一个或多个-OH、-O-(C1-C4烷基)、氟、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NH(CH2CH2OCH3)或-N(CH2CH2OCH3)2所取代，和
当两个R14与它们相连的氮原子一起形成4至8元饱和的杂环时，该饱和的杂环在碳原子上任选被-OH、-C1-C4烷基、氟、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NH(CH2CH2OCH3)或-N(CH2CH2OCH3)2取代；并在任何可取代的氮原子上任选被-C1-C4烷基、氟取代的C1-C4烷基或-(CH2)2-O-CH3所取代；和
R12选自含有至少五个环原子的碳环以及除了哌嗪、吲唑、三唑或吡唑并吡啶外的杂环，其中R12任选被一至两个独立地选自下列的取代基所取代：卤素、-C＝N、C1-C4烷基、C3-C7环烷基、氟取代的C1-C2烷基、-O-(C1-C4烷基)、-S-R14、-S(O)-R14、-S(O)2-R14、-(C1-C4烷基)-N(R14)(R14)、-N(R14)(R14)、-O-(C2-C4烷基)-N(R14)(R14)、-C(O)-N(R14)(R14)、-(C1-C4烷基)-C(O)-N(R14)(R14)、-O-苯基、苯基，和第二个杂环，并且当R12为苯基时，R12也任选被下列基团所取代：3，4-亚甲基二氧基，氟取代的3，4-亚甲基二氧基，3，4-亚乙基二氧基、氟取代的3，4-亚乙基二氧基或-O-(饱和的杂环)，其中R12的任何苯基、饱和的杂环或第二个杂环取代基任选被下列取代基所取代：卤素；-C≡N；C1-C4烷基、氟取代的C1-C2烷基、-O-(氟取代的C1-C2烷基)、-O-(C1-C4烷基)、-S-(C1-C4烷基)、-S-(氟取代的C1-C2烷基)、-NH-(C1-C4烷基)和-N-(C1-C4烷基)2，其中：
当每个Z11和Z12是CH，R11为任选取代的苯基，并且R和R4是H时，则R12不是吡啶基或喹啉基；和
当每个Z11和Z12是CH，R11是4-甲氧基苯基，并且R和R4是H时，则R12不是吡啶基。
在式II的一些实施方案中，当每个Z11和Z12是CH，R11是苯基，并且R和R4是H时，则R12不是任选取代的苯基或吡啶-4-基。
在式II的一些实施方案中，R12不是吡唑基、咪唑基、吲哚基、噻吩并吡唑基、四氢吲唑基、四氢环戊二烯并吡唑基、二氢呋喃并吡唑基、四氢吡咯并吡唑基、四氢吡喃并吡唑基或四氢吡啶并吡唑基。
在式II的另外的实施方案中，R12不是吡唑基。
在式II的一些实施方案中，该化合物由结构式IIa、IIb和IIc中的任一个表示：
在式II的更具体的实施方案中，该化合物由结构式IIc表示：
在式II的一些实施方案中，R为氢。在该实施方案的一个方面中，该化合物由结构式IIc表示。在该实施方案的另一个方面中，R4为氢。在该实施方案的再一个方面中，任何存在的R3为氢。在该实施方案的更具体的方面中，该化合物由结构式IIc表示，并且每个R3和R4都是氢。
在一些实施方案中，在该实施方案的一个方面中，该化合物由结构式IIc表示。在该实施方案的更具体的方面中，该化合物由结构式III表示，并且R、每个R3和R4是氢。
在一些实施方案中，R11选自：
其中R11任选进一步被取代。在更具体的实施方案中，R11没有进一步被取代。在这两个实施方案的一个方面中，在这些实施方案的更具体的方面中，该化合物由结构式IIc表示。
在式II的一些实施方案中，R12选自：
其中R12任选进一步被取代。在更具体的实施方案中，R12没有进一步被取代。在这两个实施方案的一个方面中，在这些实施方案的更具体的方面中，并且该化合物由结构式IIc表示。
在另外的具体实施方案中，本发明提供了具有结构式III的化合物：
其中：
R3选自氢、氟、-OCH3和吗啉-4-基；
R11选自：
并且
当R11为时，R12不是
本发明化合物，包括本发明新化合物，也可以用于本文记载的方法中。
本文所述的化合物及其盐也包括它们相应的水合物(如半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、四水合物)和溶剂合物。用于制备溶剂合物和水合物的合适溶剂通常可以由本领域技术人员进行选择。
所述化合物及其盐可以无定形或晶体(包括共晶体和多晶型体)形式存在。
本发明的沉默调节蛋白的调节性化合物有利地调节沉默调节蛋白的水平和/或活性，特别是沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性。
独立地或除了前述性质以外，本发明的一些沉默调节蛋白的调节性化合物在该化合物有效调节沉默调节蛋白(例如，SIRT1和/或SIRT3蛋白)的脱乙酰基活性的浓度下，基本上不具有下列一种或多种活性：抑制PI3-激酶、抑制醛糖还原酶(aldoreductase)、抑制酪氨酸激酶、反式激活(transactivate)EGFR酪氨酸激酶、冠状动脉扩张或解痉挛活性。
术语“碳环”指的是其中所有环原子是碳的环系，并且包括5-7元单环和8-12元双环以及稠和的(spyrofused)和桥连的多环环系，其中该单环或双环中的每一个独立地选自饱和环、不饱和环和芳香环。除非另外指明，碳环任选被一个或多个选自下列的取代基取代：卤素、-C＝N、C1-C3烷基、氟取代的C1-C2烷基、-O-氟取代的(C1-C2)烷基、-O-(C1-C3)烷基、-S-(C1-C3)烷基、-S-氟取代的(C1-C2)烷基、羟基、氨基、-NH-(C1-C3)烷基和-N-(C1-C3)2烷基。示例性的碳环包括环戊基，环己基，环己烯基，金刚烷基，苯基和萘基。
术语“杂环”指的是含有一个或多个选自例如N、O和S原子的杂原子的环系，并且包括4-7元单环和8-12元双环以及稠和的(spyrofused)和桥连的多环环系，其中该单环或双环中的每一个独立地选自饱和环、不饱和环和芳香环。当杂环为多环时，应当理解只需要一个环含有杂原子。除非另外指明，该杂环任选被一个或多个选自下列的取代基取代：卤素，-C≡N，C1-C3烷基，氟取代的C1-C2烷基，-O-氟取代的(C1-C2)烷基，-O-(C1-C3)烷基，-S-(C1-C3)烷基，-S-氟取代的(C1-C2)烷基，羟基，氨基，-NH-(C1-C3)烷基和-N-(C1-C3)2烷基。
单环包括5-7元芳基或杂芳基、3-7元环烷基和5-7元非芳香性杂环基。单环任选被一个或多个选自下列的取代基取代：卤素，氰基，低级烷氧基，低级烷基，羟基，氨基，低级烷基氨基和低级二烷基氨基。示例性单环基团包括取代的或未经取代的杂环和碳环。具体的单环基团包括噻唑基、唑基、嗪基、噻嗪基、二噻烷基、二烷基、异唑基、异噻唑基、三唑基、呋喃基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、吡喃基、四唑基、吡唑基、吡嗪基、哒嗪基、咪唑基，吡啶基、吡咯基、二氢吡咯基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、嘧啶基、吗啉基、四氢噻吩基、噻吩基、环己基、环戊基、环丙基、环丁基、环庚基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丙烷基、氧杂环丙烷基、氮杂环丙烷基和硫吗啉基。
芳香基团(芳基)包括碳环芳基，如苯基、萘基和蒽基，和杂芳基，如咪唑基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡喃基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、噻唑基、唑基和四唑基。
芳基还包括稠合多环芳香环体系，其中碳环芳香环或杂芳基环稠合至一个或多个其他杂芳基环。实例包括苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并唑基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基和异吲哚基。
氟-取代的包括从一个氟的取代基至最多全氟的取代基。示例性的氟-取代的C1-C2烷基包括-CFH2、CF2H、-CF3、-CH2CH2F、-CH2CHF2、-CHFCH3、-CF2CHF2。全氟-取代的C1-C2烷基，例如，包括-CF3和-CF2CF3。
表明为取代的或未经取代的基团上的合适取代基是那些基本上不干涉所公开化合物具有一个或多个本发明公开性质的能力的取代基。当具有取代基的化合物与不具有该取代基的化合物相比，性质的强度减少大于约50％时，该取代基基本上干涉了该化合物的性质。
本发明设想的取代基与变体的组合仅是形成稳定化合物的那些。本文所使用的术语“稳定的”是指化合物拥有足以使其进行制造的稳定性，且可使该化合物的完整性维持足够时间以用于本文中所详述的目的。
本文中所公开的化合物也包括经部分及完全氘化的变体。在一些实施方案中，存在有一个或多个氘原子以供进行动力学研究。本领域普通技术人员可选择有此类氘原子存在的部位。
本发明也包括本文所述沉默调节蛋白的调节性化合物的盐类，特别是药学上可接受的盐类。具有充分酸性、充分碱性或该二性的官能基的本发明化合物，可和许多的无机碱类、及无机与有机酸类中的任一种反应形成盐类。或者，固有带电荷的化合物(例如具有季氮的化合物)可和适当抗衡离子(例如，卤离子如溴离子、氯离子或氟离子，特别是溴离子)形成盐。
一般用于形成酸加成盐的酸类为无机酸类，例如氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，及有机酸类例如对-甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对-溴苯基-磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、醋酸等。此类盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、酸式硫酸盐、亚硫酸盐、酸式亚硫酸盐、磷酸盐、磷酸单氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、醋酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、反丁烯二酸盐、顺丁烯二酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、酞酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。
碱加成盐包括衍生自无机碱类，例如铵或碱金属或碱土金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等那些盐。因此此类可用于制备本发明盐类的碱类包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾等。
根据另一实施方案，本发明提供制备前述所定义的沉默调节蛋白的调节性化合物的方法。这些化合物可使用已知技术合成。有利地，这些化合物可由容易获得的起始物料方便地合成。
可用于合成本文所述沉默调节蛋白的调节性化合物的合成化学转化作用与方法在本领域中是已知的，且包括，例如描述于R.Larock，Comprehensive Organic Transformations(综合有机转化作用)(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)，第二版，(1991)；L Fieser与M.Fieser，Fieser and Fieser’s Reagentsfor Organic Synthesis(用于有机合成的费瑟与费瑟氏试剂)(1994)；及L.Paquette编著，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis(有机合成试剂的百科全书)(1995)中的那些化学转化作用与方法。
在一个示例性的实施方案中，沉默调节蛋白的调节性化合物可能横跨细胞的胞质膜。例如，化合物可具有至少约20％、50％、75％、80％、90％或95％的细胞-可通透性。
本文所述的沉默调节蛋白的调节性化合物也可具有一种或多种下列特征：该化合物可基本上对细胞或个体无毒性；该化合物可为有机分子或具有2000amu或小于2000amu，1000amu或小于1000amu的小分子；该化合物可于正常大气条件下具有至少约30天、60天、120天、6个月或1年的半衰期；该化合物可于溶液中具有至少约30天、60天、120天、6个月或1年的半衰期；沉默调节蛋白的调节性化合物可于溶液中，较白藜芦醇(resveratrol)稳定至少约50％、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍或100倍；沉默调节蛋白的调节性化合物可促进DNA修复因子Ku70的脱乙酰基化作用；沉默调节蛋白的调节性化合物可促进RelA/p65的脱乙酰基化作用；该化合物可增加一般周转率，及增强细胞对TNF-所诱发细胞凋亡的敏感性。
在一些实施方案中，沉默调节蛋白的调节性化合物在(例如体内)有效调节沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性的浓度下，不具有抑制第I类组蛋白脱乙酰基酶(HDACs)、第II类HDAC或HDACs I与II的任何实质能力。例如，在优选的实施方案中，沉默调节蛋白的调节性化合物为沉默调节蛋白-活化化合物，且选择那些具有对活化沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性的EC50值，较对于抑制HDAC I和/或HDAC II的EC50值少至少5倍，且甚至优选少至少10倍、100倍或甚至1000倍的沉默调节蛋白-活化化合物。用于测定HDACI和/或HDAC II活性的方法为本领域所熟知，且进行此类测定的试剂盒(kit)可市场上购得。参见例如，BioVision，Inc.(Mountain View，CA；网址biovision.com)及Thomas Scientific(Swedesboro，NJ；网址tomassci.com)。
在一些实施方案中，沉默调节蛋白的调节性化合物不具有调节沉默调节蛋白同系物的任何实质能力。在一个实施方案中，人类沉默调节蛋白的活化剂，在(例如活体内)有效活化人类沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性的浓度下，可能不具有活化得自低等真核生物，特别是酵母或人类病原体的沉默调节蛋白的任何实质能力。例如，沉默调节蛋白-活化化合物可选择具有对于活化人类沉默调节蛋白(例如SIRT1和/或SIRT3)脱乙酰基酶活性的EC50值，较对于活化酵母沉默调节蛋白(例如Sir2(如念珠菌属、酿酒酵母等))的EC50值少至少5倍，且甚至更优选少至少10倍、100倍或甚至1000倍的那些化合物。在另一实施方案中，得自低等真核生物(特别是酵母或人类病原体)的沉默调节蛋白的抑制剂，在(例如活体内)有效抑制得自低等真核生物的沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性的浓度下，不具有抑制得自人类的沉默调节蛋白的任何实质能力。例如，沉默调节蛋白的抑制性化合物可选择具有对于抑制人类沉默调节蛋白(例如SIRT1和/或SIRT3)的脱乙酰基酶活性的IC50值，较对于抑制酵母沉默调节蛋白(例如Sir2(如念珠菌属、酿酒酵母等))的IC50值少至少5倍，且甚至更优选少至少10倍、100倍或甚至1000倍的那些化合物。
在一些实施方案中，沉默调节蛋白的调节性化合物可具有调节一种或多种沉默调节蛋白同系物，诸如一种或多种人类SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7的能力。在一实施方案中，沉默调节蛋白的调节性化合物具有调节SIRT1及SIRT3蛋白质的能力。
在其他实施方案中，SIRT1调节剂在(例如活体内)有效调节人类SIRT1的脱乙酰基酶活性的浓度下，不具有调节其他沉默调节蛋白同系物，诸如一种或多种人类SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7的任何实质能力。例如，沉默调节蛋白的调节性化合物可选择具有对于调节人类SIRT1脱乙酰基酶活性的ED50值，较对于调节一种或多种人类SIRT2、SIRT3、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7的ED50值少至少5倍，且甚至更优选少至少10倍、100倍或甚至1000倍的那些化合物。在一个实施方案中，SIRT1调节剂不具有调节SIRT3蛋白质的任何实质能力。
在其他实施方案中，SIRT3调节剂在(例如体内)有效调节人类SIRT3的脱乙酰基酶活性的浓度下，不具有调节其他沉默调节蛋白同系物，诸如一种或多种人类SIRT1、SIRT2、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7的任何实质能力。例如，沉默调节蛋白的调节性化合物可选择具有对于调节人类SIRT3脱乙酰基酶活性的ED50值，较对于调节一种或多种人类SIRT1、SIRT2、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7的ED50值少至少5倍，且甚至更优选少至少10倍、100倍或甚至1000倍的那些化合物。在一个实施方案中，SIRT3调节剂不具有调节SIRT1蛋白质的任何实质能力。
在一些实施方案中，沉默调节蛋白的调节性化合物可具有对于沉默调节蛋白的结合亲和力为约10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或以下。沉默调节蛋白的调节性化合物可减少(活化剂)或增加(抑制剂)沉默调节蛋白对于其底物或NAD+(或其他辅因子)的表观Km值达至少约2、3、4、5、10、20、30、50或100倍。在一些实施方案中，Km值使用本文所述的质谱分析测定。优选的活化化合物减少沉默调节蛋白对于其底物或辅因子的Km值，至较由白藜芦醇在相似浓度下所造成的更大程度，或减少沉默调节蛋白对于其底物或辅因子的Km值，使其相似于由白藜芦醇在较低浓度下所造成的程度。沉默调节蛋白的调节性化合物可增加沉默调节蛋白的Vmax值至少约2、3、4、5、10、20、30、50或100倍。沉默调节蛋白的调节性化合物可具有的对于调节SIRT1和/或SIRT3蛋白质的脱乙酰基酶活性的ED50值为少于约1nM，少于约10nM，少于约100nM，少于约1μM，少于约10μM，少于约100μM，或从约1-10nM，从约10-100nM，从约0.1-1μM，从约1-10μM或从约10-100μM。沉默调节蛋白的调节性化合物可调节SIRT1和/或SIRT3蛋白质的脱乙酰基酶活性达至少约5、10、20、30、50或100倍，是通过细胞分析或以细胞为基础的分析(cell based assay)测定。沉默调节蛋白-活化化合物可诱导沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性，相对于相同浓度的白藜芦醇大至少约10％、30％、50％、80％、2倍、5倍、10倍、50倍或100倍。沉默调节蛋白的调节性化合物可具有对于调节SIRT5的ED50值，较对于调节SIRT1和/或SIRT3的ED50值大至少约10倍、20倍、30倍、50倍。
3.例举性用途
在一些方面，本发明提供用于调节沉默调节蛋白的水平和/或活性的方法，及其使用方法。
在一些实施方案中，本发明提供使用沉默调节蛋白的调节性化合物的方法，其中沉默调节蛋白的调节性化合物活化沉默调节蛋白，例如增加沉默调节蛋白的水平和/或活性。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于各种治疗应用，包括(例如)增加细胞寿命，及治疗和/或预防许多各种疾病与病症，包括(例如)与老化或应激有关的疾病或病症、糖尿病、肥胖、神经变性性疾病、心血管疾病、血液凝结病症、炎症、癌症和/或潮红等。该方法包含将药学上有效量的沉默调节蛋白的调节性化合物，例如沉默调节蛋白的活化化合物给药于对其有需要的个体。
虽然申请人无意受限于理论，但相信本发明的活化剂可在沉默调节蛋白内的相同部位(例如，活性位置或影响该活性位置的Km或Vmax的位置)与沉默调节蛋白相互作用。认为此即一些类沉默调节蛋白的活化剂与抑制剂为何能具有实质结构相似性的原因。
在一些实施方案中，本文中所述的沉默调节蛋白的调节性化合物可单独使用或与其他化合物组合使用。在一个实施方案中，可将两种或更多种沉默调节蛋白的调节性化合物的混合物给药于对其有需要的个体。在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可与一种或多种下列化合物一起进行给药：白藜芦醇、紫铆花素(butein)、非瑟素(fisetin)、白皮杉醇(piceatannol)或槲皮素(quercetin)。在一个例举性的实施方案中，可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物与烟酸组合进行给药。在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可与一种或多种下列化合物进行给药：烟酰胺(NAM)、舒拉宁(suranim)；NF023(一种G-蛋白质拮抗剂)；NF279(一种嘌呤能受体拮抗剂)；托洛索(Trolox)(6-羟基-2，5，7，8，四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸)；(-)-表没食子儿茶精(epigallocatechin)(羟基位于位置3，5，7，3′，4′，5′)；(-)-表没食子儿茶精没食子酸酯(羟基位置5，7，3′，4′，5′，且没食子酸酯位于位置3)；氯化花青素(cyanidin choloride)(3，5，7，3′，4′-五羟基氯化黄盐)；氯化翠雀色素(delphinidin chloride)(3，5，7，3′，4′，5′-六羟基氯化黄盐)；杨梅黄酮(myricetin)(大麻双酮(cannabiscetin)；3，5，7，3′，4′，5′-六羟基黄酮)；3，7，3′，4′，5′-五羟基黄酮；棉黄素(gossypetin)(3，5，7，8，3′，4′-六羟基黄酮)、瑟汀诺(sirtinol)；及斯托米辛(splitomicin)。在又另一实施方案中，一种或多种沉默调节蛋白的调节性化合物可与一种或多种用于治疗或预防各种疾病包括(例如)癌症、糖尿病、神经变性性疾病、心血管疾病、血液凝结、炎症、潮红、肥胖、老化、应激等的治疗剂一起进行给药。在多种实施方案中，包含沉默调节蛋白的调节性化合物的组合疗法可指(1)包含一种或多种沉默调节蛋白的调节性化合物与一种或多种治疗剂(例如，一种或多种于本文中所描述的治疗剂)的药物组合物；及(2)一种或多种沉默调节蛋白的调节性化合物与一种或多种治疗剂的共同给药，其中沉默调节蛋白的调节性化合物与治疗剂尚未配制在同一组合物中(但是可存在于相同试剂盒或包装，例如泡罩包装或其他多隔室包装内；存在于可由使用者自行分开的相连结的、分别密封的容器(例如锡箔小袋)内；或存在于其中沉默调节蛋白的调节性化合物与其他治疗剂处于分开的容器中的试剂盒内)。当使用分开的制剂时，沉默调节蛋白的调节性化合物可与另一治疗剂的给药同时、间歇、交错、在其之前、在其之后，或这些方式的组合进行给药。
在一些实施方案中，使用沉默调节蛋白的调节性化合物以减少、预防或治疗疾病或病症的方法，也可包括增加沉默调节蛋白(例如人类SIRT1、SIRT2和/或SIRT3，或其同系物)的蛋白质水平。增加蛋白质水平可通过将编码沉默调节蛋白的一个或多个核酸拷贝导入细胞中而达成。例如，可通过将编码沉默调节蛋白的核酸导入哺乳动物细胞中，而增加哺乳动物细胞中沉默调节蛋白的水平，例如通过将编码列示于GenBank登录编号NP_036370的氨基酸序列的核酸导入，而增加SIRT1的水平，和/或通过将编码列示于GenBank登录编号AAH01042的氨基酸序列的核酸导入，而增加SIRT3的水平。
经导入细胞中以增加沉默调节蛋白水平的核酸，可编码与沉默调节蛋白(例如SIRT1和/或SIRT3蛋白)的序列至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的蛋白质。例如，编码该蛋白质的核酸可与编码SIRT1(例如GenBank登录编号NM_012238)和/或SIRT3(例如GenBank登录编号BC001042)蛋白的核酸至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。核酸也可为(优选于严格杂交条件下)与编码野生型沉默调节蛋白(例如SIRT1和/或SIRT3蛋白)的核酸杂交的核酸。严格杂交条件可包括在0.2×SSC中于65℃下杂交并且清洗。当使用编码与野生型沉默调节蛋白不同的蛋白质(例如其为野生型沉默调节蛋白的片段的蛋白质)的核酸时，该蛋白质优选是生物学活性的，例如能够进行脱乙酰基化作用。仅需要在细胞中表达沉默调节蛋白具有生物学活性的部分。例如，与具有GenBank登录编号NP_036370的野生型SIRT1不同的蛋白质，优选含有其核心结构。核心结构有时指GenBank登录编号NP_036370的氨基酸62-293，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸237至932编码，其包含NAD结合以及底物结合结构域。SIRT1的核心结构域也可指GenBank登录编号NP_036370的氨基酸261至447，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸834至1394所编码；指GenBank登录编号NP_036370的氨基酸242至493，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸777至1532所编码；或指GenBank登录编号NP_036370的氨基酸254至495，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸813至1538所编码。可根据本领域已知的方法测定蛋白质是否保留生物功能，例如脱乙酰基化能力。
在一些实施方案中，使用沉默调节蛋白的调节性化合物以减少、预防或治疗疾病或病症的方法，也可包括降低沉默调节蛋白(例如人类SIRT1、SIRT2和/或SIRT3，或其同系物)的蛋白质水平。降低沉默调节蛋白水平可根据本领域已知的方法达成。例如，可于细胞中表达靶向沉默调节蛋白的siRNA、反义核酸或核酶。也可使用显性阴性(dominant negative)的沉默调节蛋白的突变体，例如不能进行脱乙酰基化的突变体。例如，可使用经描述于(例如)Luo等人(2001)Cell 107：137中的SIRT1突变体H363Y。或者，可使用抑制转录作用的试剂。
用于调节沉默调节蛋白水平的方法也包括，调节编码沉默调节蛋白的基因转录作用的方法，稳定化/去稳定化相对应mRNA的方法，及其他本领域已知的方法。
老化/应激
在一个实施方案中，本发明提供通过将细胞与本发明增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物接触，而延长细胞寿命、增加细胞增生能力、减缓细胞老化、促进细胞存活、延迟细胞衰老、模拟摄热量限制功效、增加细胞对压力的抗性或防止细胞凋亡的方法。在一个例举性的实施方案中，该方法包含将细胞与沉默调节蛋白-活化化合物接触。
本文所述的方法可用于增加细胞、特别是初生细胞(即得自生物体，例如人类的细胞)在细胞培养物中可保持存活的时间量。胚胎干细胞(ES)与多潜能细胞(pluripotent cell)及由其分化的细胞，也可用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物来处理，以使细胞或其子代在培养物中保持较长的时间。此类细胞也可用于(例如)在进行离体修饰(ex vivomodification)后移植入个体中。
在一个实施方案中，可用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物处理要长时间保存的细胞。细胞可存在于悬浮液(例如血细胞、血清、生物学生长培养基等)中，或存在于组织或器官中。例如，可用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物处理收集自个体的、供输血目的的血液，使血细胞保存较长的时间。此外，用于法医目的的血液也可使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物进行保存。其他可经处理以延长其寿命或保护其对抗凋亡的细胞，包括供消费的细胞例如得自非人类哺乳动物的细胞(例如肉类)，或植物细胞(例如蔬菜)。
也可在哺乳动物、植物、昆虫或微生物的发育及生长期施用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，以(例如)改变、减缓或加速发育和/或生长过程。
在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于处理有用于供移植或细胞疗法的细胞，包括(例如)固体组织移植物、器官移植物、细胞悬浮液、干细胞、骨髓细胞等。细胞或组织可为自体移植、同种异体移植(allograft)、同种同基因移植(syngraft)或异种移植。可将细胞或组织于给药/植入之前、于给药/植入的同时、以及于给药/植入个体之后，以沉默调节蛋白的调节性化合物进行处理。可将细胞或组织于从供给者个体取出之前、于从供给者个体取后离体地(ex vivo)、或于植入接受体之后进行处理。例如，可用沉默调节蛋白的调节性化合物对供给者或接受体个体进行全身性处理，或增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物对细胞/组织的亚型(subset)进行局部性处理。在一些实施方案中，可额外地用另一种有用于延长移植物存活的治疗剂，例如免疫抑制剂、细胞因子、血管生成因子等处理细胞或组织。
在其他的实施方案中，可在体内用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物处理细胞，以增加其寿命或防止细胞凋亡。例如，可通过增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物来处理皮肤或表皮细胞，而保护皮肤不会老化(例如，发展出皱纹、丧失弹性等)。在一个例举性的实施方案中，将皮肤与包含增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物的药物或化妆品组合物接触。可根据本文所述方法处理的例举性皮肤困扰或皮肤病症，包括与炎症、晒伤或自然老化相关或由其引起的病症或疾病。例如，组合物可用于预防或治疗接触性皮炎(包括刺激性接触性皮炎与过敏性接触性皮炎)、特应性皮肤炎(也称作变应性湿疹)、光化性角化病、角质化病症(包括湿疹)、大疱性表皮松解病(包括天疱疮(penfigus))、剥脱性皮肤炎、脂溢性皮肤炎、红斑(包括多形红斑与结节性红斑)、由日晒或其他光源造成的损伤、盘状红斑性狼疮、皮肌炎、牛皮癣、皮肤癌及自然老化作用。在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗创伤和/或烧伤以促进愈合，包括(例如)第一度、第二度或第三度烧伤和/或热烧伤、化学烧伤或电烧伤。可将制剂局部地给药至皮肤或粘膜组织。
包含一种或多种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物的局部制剂，也可用作为预防性(例如化学预防性)组合物。当使用于化学预防性方法时，在特定个体出现可目视病症之前处理易感染的皮肤。
可将沉默调节蛋白的调节性化合物局部或全身性地递送至个体。在一个实施方案中，通过注射、局部制剂等，将沉默调节蛋白的调节性化合物局部地给药至个体的组织或器官。
在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于，治疗或预防因个体中细胞衰老所诱发或加重的疾病或病症；用以减低个体衰老速度(例如在开始衰老之后)的方法；用以延长个体寿命的方法；用以治疗或预防与寿命有关的疾病或病症的方法；用以治疗或预防与细胞增殖能力有关的疾病或病症的方法；及用以治疗或预防由细胞损伤或死亡所导致的疾病或病症的方法。在一些实施方案中，该方法并非通过减低那些缩短个体寿命的疾病的发生率而起作用。在一些实施方案中，该方法并非通过减低因疾病(例如癌症)所造成的致死率而起作用。
在又一个实施方案中，为了一般性地增加个体的细胞寿命以及为了保护其细胞对抗压力和/或对抗凋亡的目的，可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物给药于个体。可以相信以本文所述的化合物治疗个体，类似于使个体经历毒物刺激作用(hormesis)(即，对生物体有益且可延长其寿命的温和压力)。
可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物给药于个体，以预防老化及与老化有关的后果或疾病，例如中风、心脏病、心脏衰竭、关节炎、高血压及阿尔茨海默病。其他可被治疗的病症包括例如与眼部老化关联的病症，例如白内障、青光眼及黄斑变性。也可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物给药于个体，用来治疗与细胞死亡关联的疾病，例如慢性疾病，以保护细胞不死亡的目的。例举性疾病包括那些与神经细胞死亡、神经元功能障碍、或肌肉细胞死亡或功能障碍关联的疾病，例如帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化、筋萎缩性侧索硬化(amniotropic lateral sclerosis)与肌肉营养不良；AIDS；暴发性肝炎；与脑退化相关的疾病，例如克-雅综合征(Creutzfeld-Jakobdisease)、色素性视网膜炎与小脑变性(cerebellar degeneration)；脊髓发育不良例如再生障碍性贫血；缺血性疾病(ischemic disease)例如心肌梗塞与中风；肝病例如酒精性肝炎、乙型肝炎与丙型肝炎；关节疾病例如骨关节炎；粥样动脉硬化；脱发；由UV光造成的皮肤损伤；扁平苔藓；皮肤萎缩；白内障；以及，移植物排斥。细胞死亡也可由手术、药物治疗、化学品接触或放射接触所造成。
也可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物给药于患有急性疾病，例如器官或组织受到伤害的个体，例如患有中风或心肌梗塞的个体，或罹患脊髓损伤的个体。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物也可用于修复酒精性肝(alcoholic’liver)。
心血管疾病
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗和/或预防心血管疾病的方法，其系通过将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物给药于有需要的个体。
可使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物治疗或预防的心血管疾病，包括心肌病或心肌炎；例如特发性心肌病、代谢性心肌病、酒精中毒性心肌病、药物引发的心肌病、缺血性心肌病及高血压性心肌病。也可使用本文所述化合物与方法治疗或预防的疾病，例如主动脉、冠状动脉、颈动脉、脑血管动脉、肾动脉、髂动脉、股动脉及腘动脉(popliteal arteries)等主要血管(major blood vessels)的粥样硬化病症(大血管疾病(macrovascular disease))。其他可被治疗或预防的血管疾病，包括那些与血小板聚集、视网膜小动脉、肾小球小动脉(glomerular arteriole)、神经滋养血管(vasa nervorum)、心小动脉，及眼部、肾脏、心脏与中枢及周围神经系统相关的毛细血管床。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物也可用于增加个体血浆内的HDL水平。
其他可以用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物治疗的病症，包括再狭窄(例如在冠状介入后)，及与异常高密度及低密度胆固醇水平有关的病症。
在一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可以作为组合疗法的一部分与另一种心血管药剂一起给药。在一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可以作为组合疗法的一部分与抗-心率失常药剂一起给药。在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可以作为组合疗法的一部分与另一种心血管药剂一起给药。
细胞死亡/癌症
可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物给药于最近已接受或可能将接受一定剂量辐射或毒素的个体。在一个实施方案中，辐射或毒素的剂量接受作为工作相关程序或医药程序的一部分，例如经给药作为预防措施(prophylactic measure)。在另一个实施方案中，非故意地接受辐射或毒素的接触。在这种情况下，优选在接触后尽快给药化合物，以抑制细胞凋亡及后续发展成急性辐射综合征。
沉默调节蛋白的调节性化合物也可用于治疗和/或预防癌症。在一些实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗和/或预防癌症。摄热量限制已经与年龄相关的病症(包括癌症)的发生率的减少相关联。于是，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性可用于治疗和/或预防年龄相关病症(例如癌症)的发生率。可使用沉默调节蛋白的调节性化合物治疗的例举性癌症为：脑部与肾脏的癌症；激素-依赖性癌症包括乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌与卵巢癌；淋巴瘤及白血病。在与固体肿瘤关联的癌症中，可将调节性化合物直接给药于该肿瘤。血液细胞的癌症(例如白血病)可通过将调节性化合物给药至血流中或骨髓中而进行治疗。也可治疗良性细胞生长例如疣。其他可被治疗的疾病包括自体免疫疾病，例如全身性红斑狼疮、硬皮病及关节炎，其中应将自体免疫细胞去除。也可通过给药沉默调节蛋白的调节性化合物，治疗与病毒感染(例如疱疹、HIV、腺病毒及HTLV-1)关联的恶性与良性病症。或者，可自个体获取细胞，经体外处理以去除一些不希望的细胞(例如癌细胞)，并再给药于相同或不同的个体。
也可将化学治疗剂与本文所述具有抗癌活性的调节性化合物，例如诱发细胞凋亡的化合物、减短寿命的化合物或使细胞对压力敏感的化合物共同给药。化学治疗剂本身可与本文所述可诱发细胞凋亡或减短寿命的化合物或使细胞对压力敏感的沉默调节蛋白-调节性化合物，和/或与其他化学治疗剂组合使用。除了常规化学治疗剂之外，本文所述的沉默调节蛋白的调节性化合物也可与反义RNA、RNAi，或其他抑制会造成不希望细胞增殖的细胞组成表达的聚核苷酸一起使用。
包含沉默调节蛋白的调节性化合物与常规化学治疗剂的组合疗法，可能优于本领域已知的组合疗法，因为该组合可使常规化学治疗剂在较低剂量下发挥更大功效。在优选的实施方案中，对于化学治疗剂或常规化学治疗剂的组合的有效剂量(ED50)而言，当与沉默调节蛋白的调节性化合物组合使用时，相较于单独的该化学治疗剂的ED50低至少2倍，且甚至更优选低5倍、10倍或甚至25倍。反之，对于此类化学治疗剂或此类化学治疗剂的组合的治疗指数(TI)而言，当与本文所述沉默调节蛋白的调节性化合物组合使用时，相较于单独的常规化学治疗程序的TI高至少2倍，且甚至更优选地高5倍、10倍或甚至25倍。
神经元疾病/病症
在一些方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗患有神经变性性疾病，及中枢神经系统(CNS)、脊髓或周围神经系统(PNS)的创伤或机械性损伤的患者。神经变性性疾病通常涉及人脑部质量与体积的减少，其可能由于脑细胞萎缩和/或死亡所致，这比健康人因老化所造成的人脑部质量与体积的减少影响更大。神经变性性疾病可在执行长期正常脑功能后，由于特定脑区域的渐进性退化(例如神经细胞功能不足及死亡)而逐渐演化成。或者，神经变性性疾病可具有快速发作(onset)，例如那些与创伤或毒素相关联的神经变性性疾病。脑部退化的实际发作可能较出现临床表达早许多年。神经变性性疾病的实例包括(但不限定于)阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(Huntington’s disease)(HD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS；罗杰里格氏病(Lou Gehrig’s disease))、弥散性路易体病(diffuse Lewy body disease)、舞蹈病-棘红细胞增多症、原发性侧索硬化、眼部疾病(眼神经炎)、化学疗法诱发的神经病变(例如来自长春新碱(vincristine)、紫杉醇、硼替佐米(bortezomib))、糖尿病诱发的神经病变及佛里德赖希共济失调(Friedreich’s ataxia)。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗这些病症及其他如下文所描述的病症。
AD为导致记忆丧失、异常行为、个性改变及思考能力衰退的CNS病症。这些丧失与特定类型的脑细胞死亡、及脑细胞间的连结与其支撑网络(例如神经胶质细胞)损坏有关。最早期症状包括丧失最近的记忆、错误判断及个性改变。PD为导致身体运动不受控制、僵硬、颤抖及运动障碍的CNS病症，与脑部制造多巴胺(dopamine)的区域中的脑细胞死亡关联。ALS(运动神经元疾病)为攻击运动神经元(CNS中将脑与骨骼肌连结的组分)的CNS病症。
HD为另一种造成运动不受控制、智力丧失及情绪失调的神经变性性疾病。泰-萨病(Tay-Sachs disease)与桑德霍夫病(Sandhoff disease)，其中GM2神经节苷脂与β-氨基己糖胺酶(hexosaminidase)的相关糖脂类底物累积于神经系统中并引发急性神经变性的糖脂储存疾病(glycolipid storage diseases)。
已熟知，细胞凋亡在免疫系统的AIDS病变方面起作用。然而，HIV-1也诱发可以用本发明的沉默调节蛋白的调节性化合物治疗的神经学疾病。
神经元丧失(neuronal loss)也为朊病毒病(prion diseases)(例如人类克-雅综合征、牛BSE(疯牛病)、绵羊与山羊的瘙痒病及猫的猫类海绵状脑病(FSE))的突出特征。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防由这上述朊病毒病引起的神经元丧失。
在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可用于治疗或预防任何涉及轴突病变(axonopathy)的疾病或病症。远端轴索病为一类由周围神经系统(PNS)神经元的某种代谢或毒性错乱所产生的周围神经病。其为神经对代谢或毒性紊乱的最通常响应，而因此可能由代谢性疾病例如糖尿病、肾衰竭、缺乏综合征例如营养不良及酒精中毒，或由毒素或药物的作用所造成。那些患有远端轴索病的患者通常呈现对称性手套-袜样感觉-运动紊乱。在受影响区域也发生深层腱反射及自主神经系统(ANS)功能丧失或缩减。
糖尿病性神经病变为与糖尿病关联的神经病症。可能与糖尿病性神经病变关联的较常见病症包括第三神经麻痹；单一神经病变；多发性单神经炎；糖尿病性肌肉萎缩；疼痛性多神经病(painful polyneuropathy)；自主神经病(autonomic neuropathy)；及胸腹神经病。
周围神经病变为用于对周围神经系统的神经损伤的医学术语，其可能是由神经疾病，或因全身性疾病的副作用所造成。周围神经病变的主要成因包括癫痫发作、营养缺乏及HIV，虽然糖尿病是最可能的成因。
在一个例举性的实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防多发性硬化(MS)，包括复发性MS与单症状MS，及其他脱神经髓鞘病症(demyelinating condition)，例如铬炎性脱神经髓鞘多神经病(chromic inflammatory demyelinatingpolyneuropathy)(CIDP)或与其关联的病症。
在又另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物也可用于治疗对神经的创伤，包括由于疾病、损伤(包括手术介入)或环境创伤(例如神经毒素、酒精中毒等)所造成的创伤。
增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物也可用于预防、治疗及缓解各种PNS病症的症状。术语“周围神经病变”涵括广范围的位于脑与脊髓外部的神经(即周围神经)已经受损的病症。周围神经病变也可指周围神经炎，或者如果涉及许多神经时，可使用术语多神经病(polyneuropathy)或多神经炎(polyneuritis)。
可以用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物治疗的PNS疾病包括：糖尿病、麻疯、进行性神经病性肌萎缩(Charcot-MarieTooth disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome)和壁神经丛神经病(Brachial Plexus Neuropathy)(颈与臂神经丛的第一胸根、神经干、索(cord)及周围神经组成的疾病)。
在另一个实施方案中，沉默调节蛋白的活化化合物可用于治疗或预防多聚谷氨酰胺疾病(polyglutamine disease)。例举性多谷胺酰胺疾病包括脊髓炎髓肌肉萎缩(肯尼迪病(Kennedy disease))、亨廷顿病(HD)、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩(dentatorubralpallidoluysian atrophy)(郝乌河综合征(Haw River syndrome))、脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia)第1型、脊髓小脑性共济失调第2型、脊髓小脑性共济失调第3型(马-约病(Machado-Joseph disease))、脊髓小脑性共济失调第6型、脊髓小脑性共济失调第7型及脊髓小脑性共济失调第17型。
在一些实施方案中，本发明提供一种治疗中枢神经系统细胞，以防止因响应于血液流向细胞减低所造成的伤害的方法。通常可被预防的伤害严重度，将大部分取决于血液流向细胞的减低程度及减少的持续时间。在一个实施方案中，可预防凋亡性或坏死性细胞死亡。在再一个实施方案中，可预防缺血所介导的伤害，例如细胞毒性水肿或中枢神经系统组织缺氧血症。在各实施方案中，中枢神经系统细胞可为脊髓细胞或脑细胞。
另一方面包括将沉默调节蛋白的活化化合物给药于个体，以治疗中枢神经系统缺血性病症。有许多中枢神经系统缺血性病症可由本文所述的沉默调节蛋白的活化化合物治疗。在一个实施方案中，局部缺血性病症为导致任何类型缺血性中枢神经系统损伤，例如凋亡性或坏死性细胞死亡、细胞毒性水肿或中枢神经系统组织缺氧的中风。中风可能冲击脑部任何区域，或由任何一般已知会导致中风发生的病因所造成。在本实施方案的另一选择中，中风为脑干中风。在本实施方案的另一选择中，中风为小脑中风。在本实施方案的又另一选择中，中风为栓塞性中风(embolic stroke)。在本实施方案的另一选择中，中风为出血性中风。在其他实施方案中，中风为血栓性中风。
在又另一方面，可给药沉默调节蛋白的活化化合物，以在中枢神经系统缺血性病症后减少缺血核心的梗塞大小。而且，也可有益地给药沉默调节蛋白的活化化合物，以在中枢神经系统缺血性病症后，减少缺血性半影或过渡区带的大小。
在一个实施方案中，组合药物疗法可包括用于治疗或预防神经变性性病症、或与这些病症关联的次生病症的药物或化合物。因此，组合药物疗法可包括一种或多种沉默调节蛋白的活化剂与一种或多种抗-神经变性剂。
血液凝结病症
在其他方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防血液凝结病症(或止血病症)。如可交换地用于本文，术语“止血”、“血液凝结”及“血液凝块(clotting)”是指控制流血，包括血管收缩与凝结的生理特性。血液凝结协助维持哺乳动物在受伤、炎症、疾病、先天缺陷、功能障碍或其他瓦解(disruption)后的循环完整性。而且，血块的形成在受伤的个案中不仅限于制流血(止血)，也可能在动脉粥样硬化疾病方面，因阻塞重要动脉或静脉而导致严重器官损伤及死亡。因此血栓是在错误时间及地点的形成的血液凝块。
于是，本发明提供目的在于抑制血液凝块形成，以预防或治疗血液凝结病症，例如心肌梗塞、中风、因周围动脉疾病的截肢或肺栓塞的抗凝结与抗血栓治疗。
如可交换地用于本文，术语“调制止血”及“调节止血”包括诱导(例如刺激或增加)止血，也包括抑制(例如减低或减少)止血。
在一方面，本发明提供通过给药增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，以减低或抑制个体中止血的方法。本文所公开的组合物或方法有用于治疗或预防血栓形成疾病。如用于本文，术语“血栓形成病症”包括以过量或不希望的凝血或止血活性，或凝固性过高的状态为特征的任何病症或病况。血栓形成疾病包括涉及血小板粘附(plateletadhesion)与血栓形成的疾病或病症，且可能显示为形成血栓的可能性增加，例如形成血栓数量增加、在低年龄期(early age)出现血栓、形成血栓的家族性倾向(familial tendency towards thrombosis)及在罕见部位(unusual site)形成血栓。
在另一个实施方案中，组合药物疗法可包括用于治疗或预防血液凝结病症，或与这些病症关联的次生病症的药物或化合物。因此，组合药物疗法可包括一种或多种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的活化剂，与一种或多种抗凝结或抗血栓形成剂。
体重控制
在另一方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防个体的体重增加或肥胖。例如，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可(例如)用于治疗或预防遗传性肥胖症、饮食性肥胖症、激素相关的肥胖症、与给药医药品有关的肥胖症，用于减轻个体体重或防止个体体重增加。有需要此类治疗的个体可为其已经肥胖、有可能变成肥胖、过重或有可能变成过重的个体。有可能变成肥胖或过重的个体，可(例如)基于家族历史、遗传学、饮食、活动程度、药物摄取或其各种不同组合来确定。
在其他的实施方案中，可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物给药于患有各种可通过促进个体的体重减轻而治疗或预防的其他疾病与病症。此类疾病包括(例如)高血压、血压过高、高血胆固醇、血脂异常、II型糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖不耐受性、高胰岛素血症、冠心病、心绞痛、充血性心脏衰竭、中风、胆结石、胆囊炎与胆石病、痛风、骨关节炎、阻碍性睡眠呼吸暂停与呼吸问题、一些类型癌症(例如子宫内膜癌、乳癌、前列腺癌与结肠癌)、妊娠并发症、雌性生殖健康变差(例如月经不规则、不孕、不规则排卵)、膀胱控制问题(例如压力失禁)；尿酸肾石病；精神性病症(例如忧郁、饮食失控(eating disorders)、体态变形与自尊降低)。最后，患有AIDS的患者会对于AIDS的组合疗法响应，而发展成脂肪代谢障碍或胰岛素抗性。
在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于抑制脂肪形成或脂肪细胞分化(于体外或体内)。此类方法可用于治疗或预防肥胖症。
在其他实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于减低食欲和/或增加饱食感，藉此造成体重减轻或避免体重增加。有需要此类治疗的个体可为已经过重、肥胖的个体，或有可能变成过重或肥胖的个体。该方法包含将一定剂量(例如呈丸剂(pill)的形式)每日或每二日或一周一次给药于个体。剂量(dose)可为“食欲减低剂量”。
在一个例举性的实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可以以治疗或预防体重增加或肥胖症的组合疗法进行给药。例如，可将一种或多种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的活化剂与一种或多种抗肥胖剂组合给药。
在另一个实施方案中，可给药增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，以减低由药物引发的体重增加。例如，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，能够与可以刺激食欲或造成体重增加(尤其是由于除了保留水份以外的因素造成的体重增加)药物通过组合疗法进行给药。
代谢病症/糖尿病
在另一方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可用于治疗或预防代谢病症，例如胰岛素抗性、糖尿病前期、II型糖尿病、和/或其并发症。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物的给药，可增加个体的胰岛素敏感性和/或减低胰岛素水平。有需要此类治疗的个体可为具有胰岛素抗性或其他II型糖尿病的前驱症状(precursor symptom)、具有II型糖尿病或有可能发展任何这些病症的个体。例如，个体可为具有胰岛素抗性，例如具有高胰岛素循环水平和/或相关联病症，例如高血脂症、脂肪生成障碍、高胆固醇血症、葡萄糖耐受性受损、高血糖水平、综合征X(syndrome X)的其他表征、高血压、动脉粥样硬化及脂肪代谢障碍的个体。
在一个例举性的实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可以以治疗或预防代谢病症的组合疗法进行给药。例如，可将一种或多种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的活化剂与一种或多种抗-糖尿病剂组合给药。
炎性疾病
在另一方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防与炎症关联的疾病或病症。可于引发炎症发作前、同时或之后给药增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物。当预防性使用时，化合物优选在任何炎症反应或症状之前提供。化合物的给药可预防或减弱炎症反应或症状。
在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可用于治疗或预防过敏及呼吸病症，包括哮喘、支气管炎、肺纤维化、过敏性鼻炎、氧气毒性、气肿、慢性支气管炎、急性呼吸窘迫综合征及任何慢性闭塞性肺病(COPD)。化合物可用于治疗肝炎感染，包括乙型肝炎及丙型肝炎。
此外，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗自体免疫疾病，和/或与自体免疫疾病关联的炎症，例如关节炎，包括类风湿性关节炎、银屑病关节炎和强直性脊柱炎以及器官-组织自身免疫疾病(例如雷诺得氏综合征(Raynaud′s syndrome))、溃疡性结肠炎、克罗恩病(Crohns Disease)、口粘膜炎、硬皮病、重症肌无力、移植排斥、内毒素休克、败血病、牛皮癣、湿疹、皮肤炎、多发性硬化、自身免疫甲状腺炎、葡萄膜炎、全身性红斑狼疮、阿狄森病(Addison′s disease)、自身免疫多腺疾病(polyglandular disease)(也称为自身免疫多腺综合征)及格雷夫斯病(Grave’s disease)。
在一些具体实施方案中，可单独采用一种或多种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白-调节性化合物，或与其他有用于治疗或预防炎症的化合物组合使用。
潮红
另一方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于减低其为病症的症状的潮红和/或潮热(hot flash)的发生率或严重度。例如，相关方法(subject method)包括使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白-调节性化合物(单独或与其他药剂组合)，以减低癌症患者的潮红和/或潮热的发生率或严重度。在其他实施方案中，该方法提供使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物以减低绝经及绝经后(post-menopausal)妇女的潮红和/或潮热的发生率或严重度。
另一方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用作减低作为另一种药物疗法的副作用病症的潮红和/或潮热(例如，药物-诱发性潮红)的发生率或严重度的疗法。在一些实施方案中，用于治疗和/或预防药物-诱发性潮红的方法包括将含有至少一种潮红-诱发性化合物与至少一种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物的制剂给药于有其需要的患者。在其他实施方案中，用于治疗药物所诱发的潮红的方法包括，分别给药诱发潮红的化合物与一种或多种沉默调节蛋白的调节性化合物，(例如)其中沉默调节蛋白的调节性化合物与潮红诱发剂未经配制于同一组合物中。当使用分别的制剂时，可将沉默调节蛋白的调节性化合物(1)在与潮红诱发剂的给药的同时，(2)在潮红诱发剂的间歇，(3)与潮红诱发剂的给药错开，(4)在潮红诱发剂给药之前，(5)接续于潮红诱发剂给药之后，及(6)以其各种不同组合进行给药。例举性潮红诱发剂包括(例如)烟酸、法洛昔芬(faloxifene)、抗忧郁剂、抗-精神病药、化学治疗剂、钙通道阻断剂及抗生素。
在一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于减少血管扩张剂或抗血脂药(包括降胆固醇血药剂与抗脂肪肝剂)的潮红副作用。在一个例举性的实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于减少与给药烟酸关联的潮红。
在另一个实施方案中，本发明提供具有减低潮红副作用的治疗和/或预防高血脂症的方法。在另一代表性的实施方案中，该方法涉及使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，以减少雷洛昔芬(raloxifene)的潮红副作用。在另一代表性的实施方案中，该方法涉及使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，以减少抗忧郁剂或抗精神病药的潮红副作用。举例而言，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于与5-羟色胺再吸收抑制剂(reuptake inhibitor)，或5HT2受体拮抗剂结合(分开或一起给药)。
在一些实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用作5-羟色胺再吸收抑制剂(SRI)的治疗的一部分以减少潮红。在又另一代表性的实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于减少化学治疗剂如环磷酰胺(cyclophosphamide)及他莫昔芬(tamoxifen)的潮红副作用。
在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于减少钙通道阻断剂如氨氯地平(amlodipine)的潮红副作用。
在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于减少抗生素的潮红副作用。例如，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可与左氧氟沙星(levofloxacin)组合使用。
眼部病症
本发明的一方面为用于抑制、减低或治疗视力损伤(vision impairment)的方法，该方法通过将治疗剂量的选自本文所公开化合物的沉默调节蛋白的调节剂或其药学上可接受的盐、前药或代谢衍生物给药于患者。
在本发明的一些方面，视力损伤是由于对视神经或中枢神经系统的伤害所造成。在特别的实施方案中，视神经伤害由高眼内压(例如由青光眼引起的高眼内压)所造成。在其他特别的实施方案中，视神经伤害由神经肿胀(swelling)(其往往与感染或免疫(例如自身免疫)反应(如在视神经炎中)所造成。
在本发明的一些方面，视力损伤由视网膜的伤害所造成。在特别的实施方案中，视网膜的伤害由于流向眼睛的血流中的障碍(例如，动脉粥样硬化、血管炎)所造成。在特别的实施方案中，视网膜的伤害是由于黄斑瓦解(disruption of macula)(例如，渗出性或非渗出性黄斑变性(maculardegeneration))所造成。
例举性视网膜的疾病包括，渗出性年龄相关的黄斑变性、非渗出性年龄相关的黄斑变性、视网膜电子假体和RPE移植年龄相关的黄斑变性、急性多病灶板状色素上皮病、急性视网膜坏死、遗传性黄斑变性(Best Disease)、视网膜分支动脉闭塞(branch retinal artery occlusion)、视网膜分支静脉闭塞(branch retinal vein occlusion)、癌症关联和相关的自身免疫视网膜病(CancerAssociated and related Autoimmune Retinopathies)、视网膜中央动脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、中心性浆液性脉络膜视网膜病变(central serouschorioretinopathy)、伊尔斯病(Eales disease)、黄斑上膜(epimacular membrane)、晶格退化(Lattice degeneration)、巨动脉瘤(macroaneurysm)、糖尿病性黄斑水肿、艾尔温-盖斯黄斑水肿(Irvine-Gass Macular Edema)、黄斑裂孔(macularhole)、视网膜下新血管膜(subretinal Neovascular Membranes)、弥散性单侧亚急性视神经视网膜炎(diffuse unilateral subacute neuroretinitis)、非假晶状体囊样黄斑水肿(nonpseudophakic cystoid macular edema)、眼假组织胞浆菌病综合征(presumed ocular histoplasmosis syndrome)、渗出性视网膜脱离、手术后视网膜剥离、增生性视网膜剥离、孔源性视网膜剥离、牵引性(tractional)视网膜剥离、色素性视网膜炎、CMV视网膜炎、成视网膜细胞瘤(retinoblastoma)、早产儿视网膜病、散弹状视网膜病(birdshot retinopathy)、背景性糖尿病性视网膜病、增生性糖尿病性视网膜病、血红蛋白病性视网膜病、普尔沙视网膜病(Purtscher Retinopathy)、瓦尔萨尔瓦视网膜病(ValsalvaRetinopathy)、青年性视网膜劈裂症(juvenile retinoschisis)、老年性视网膜劈裂症(senile retinoschisis)、泰尔松综合征(terson syndrome)及白点综合征(white dot syndromes)。
其他例举性疾病包括眼部细菌感染(例如，结膜炎、角膜炎、结核病、梅毒、淋病)、病毒感染(例如眼部单纯疱疹病毒(ocular herpes simplex Virus)、水痘带状疱疹病毒(varicella zoster virus)、巨细胞病毒视网膜炎(cytomegalovirus retinitis)、人类免疫缺陷病毒(HIV))以及次生于HIV或其他HIV-关联及其他免疫缺陷-关联性眼部疾病的进行性外部视网膜坏死。此外，眼部疾病包括真菌感染(例如念珠菌性脉络膜炎(Candida choroiditis)、组织胞浆菌病)、原生动物感染(例如弓形体病)及其他例如眼弓蛔虫病与肉样瘤病(sarcoidosis)。
本发明的一方面为用于抑制、减低或治疗个体进行以化学治疗药物(例如，神经毒性药物、升高眼内压力的药物例如类固醇(steroid))治疗时的视力损伤的方法，其通过将治疗剂量的本文所公开的沉默调节蛋白的调节剂给药于有此类治疗需要的个体。
本发明的另一方面为用于抑制、减低或治疗个体在进行手术包括眼部或其他于俯卧姿势(prone position)执行的手术，例如脊髓手术时的视力损伤的方法，其通过将治疗剂量的本文所公开的沉默调节蛋白的调节剂给药于有此类治疗需要的个体。眼部手术包括白内障、虹膜切开术和晶状体置换(lens replacement)。
本发明的另一方面为治疗(包括抑制与预防性治疗)年龄相关的眼部疾病，包括白内障、干眼症、年龄-相关的黄斑变性(AMD)、视网膜损害等的方法，其通过将治疗剂量的本文所公开的沉默调节蛋白的调节剂给药于有此类治疗需要的个体。
本发明的另一方面为预防或治疗因应激、化学伤害或照射所造成的对眼睛的损害，其通过将治疗剂量的本文所公开的沉默调节蛋白的调节剂给药于有此类治疗需要的个体。对眼睛的照射或电磁性损害可包括由CRT或暴露于阳光或UV所造成的那些损害。
在一个实施方案中，组合药物疗法(combination drug regimen)可包括用于治疗或预防眼部病症，或与此等病症关联的次生病症的药物或化合物。因此，组合药物疗法可包括一种或多种沉默调节蛋白的活化剂与一种或多种用于治疗或预防眼部病症的治疗剂。
在一个实施方案中，可将沉默调节蛋白的调节剂与用以减低眼内压力的疗法结合进行给药。在另一个实施方案中，可将沉默调节蛋白的调节剂与用于治疗和/或预防青光眼的疗法结合进行给药。在另一实施方案中，可将沉默调节蛋白的调节剂与用于治疗和/或预防视神经炎的疗法结合进行给药。在一个实施方案中，可将沉默调节蛋白的调节剂与用于治疗和/或预防CMV视网膜病的疗法结合进行给药。在另一个实施方案中，可将沉默调节蛋白的调节剂与用于治疗和/或预防多发性硬化的疗法结合进行给药。
线粒体-关联的疾病与病症
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗会因增加线粒体活性而获益的疾病或病症的方法。该方法包含将治疗上有效量的沉默调节蛋白的活化化合物给药于需要的个体。增加线粒体活性是指，维持线粒体的总体数量(例如线粒体的质量)的同时增加线粒体的活性、增加线粒体的数量并因此增加线粒体的活性(例如，通过刺激线粒体的生物源(biogenesis))，或其组合。在一些实施方案中，会因增加线粒体活性而获益的疾病或病症，包括与线粒体功能障碍关联的疾病或病症。
在一些实施方案中，用于治疗会因增加线粒体活性而获益的疾病或病症的方法，可包括确定患有线粒体功能障碍的个体。用于诊断线粒体功能障碍的方法，可包括分子遗传学、病理学和/或生物化学分析。与线粒体功能障碍关联的疾病或病症包括这样的疾病和病症，其中线粒体的呼吸链活性不足导致哺乳动物中此类疾病或病症的病理生理学的发展。会因增加线粒体活性而获益的疾病或病症一般包括(例如)，由自由基介导的氧化损伤导致的组织变性的疾病、细胞不适当地进行凋亡的疾病，及细胞无法进行凋亡的疾病。
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗会因增加线粒体活性而获益的疾病或病症的方法，该方法包括将一种或多种沉默调节蛋白的活化化合物与另一种治疗剂(例如可用于治疗线粒体功能障碍的药剂，或可用于减少与涉及线粒体功能障碍的疾病或病症关联的症状的药剂)组合给药于有需要的个体。
在一个例举性的实施方案中，本发明提供用于治疗会因增加线粒体活性而获益的疾病或病症的方法，通过将治疗上有效量的沉默调节蛋白的活化化合物给药于个体。例举性疾病或病症包括(例如)肌肉神经病症(例如佛里德赖希共济失调、肌肉营养不良、多发性硬化等)、神经细胞不稳定性病症(例如癫痫发作、偏头痛(migrane)等)、发育迟缓、神经变性病症(例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化等)、缺血、肾小管性酸中毒、年龄相关的神经变性与认知衰退、化学疗法疲劳、年龄相关或化学疗法诱发的绝经或月经周期或排卵不规则、线粒体性肌病、线粒体损害(例如钙累积、兴奋性中毒、接触一氧化氮、缺氧等)及线粒体失调。
肌肉营养不良指一类涉及神经肌肉组织构造与功能恶化的疾病，其往往导致骨骼肌萎缩及心肌功能障碍(myocardial dysfunction)，例如杜兴氏肌肉营养不良(Duchenne muscular dystrophy)。在一些实施方案中，沉默调节蛋白的活化化合物可用于减低肌肉执行功能能力的衰退速率，及用于增强患有肌肉营养不良患者肌肉的功能状态。
在一些实施方案中，沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗线粒体性肌病。线粒体性肌病范围从外眼部肌肉的轻微缓慢进行性衰弱，到严重致命的婴儿期肌病与多系统脑肌病(encephalomyopathy)。有些综合征已经确定，它们之间有些彼此重迭。影响肌肉的已确立的综合征包括进行性外眼肌麻痹、卡-塞综合征(Kearns-Sayre syndrome)(具有眼肌麻痹、色素性视网膜病、心脏传导缺陷、小脑共济失调与感觉神经性耳聋)、MELAS综合征(线粒体性脑肌病、乳酸性酸中毒与类中风事件(stroke-like episodes))、MERFF综合征(肌阵挛型癫痫(myoclonic epilepsy)、碎片状红纤维(ragged redfibers))、肢带分配衰弱(limb-girdle distribution weakness)及婴儿期肌病(良性、重度与致死)。
在一些实施方案中，沉默调节蛋白的活化化合物可用于治疗患有对线粒体的毒性损害，例如由于钙累积、兴奋性中毒、一氧化氮接触、药物诱导的毒性损害或缺氧造成的毒性损害的患者。
在一些实施方案中，沉默调节蛋白的活化化合物可用于治疗与线粒体失调(mitochondrial deregulation)关联的疾病或病症。
肌肉性能(Muscle Performance)
在其他实施方案中，本发明提供用于增强肌肉性能的方法，其通过给药治疗上有效量的沉默调节蛋白的活化化合物。例如，沉默调节蛋白的活化化合物可用于改善身体耐久力(例如，执行身体工作例如运动、身体劳役、运动活动等)、抑制或延迟身体疲劳、增加血液氧水平、增进健康个体的能量、加强工作能力与持久性、减少肌肉疲劳、减低压力、增强心脏与心血管功能、改善性能力、增加肌肉ATP水平和/或减少血液中的乳酸。在一些实施方案中，该方法包括给药一定量的增加线粒体活性、增进线粒体的生物生成和/或增加线粒体质量的沉默调节蛋白的活化化合物。
运动效能是指运动员的肌肉在参与运动活动时所能执行的能力。所增强的运动效能、强度、速度及持久力，是通过肌肉收缩强度的增加、肌肉收缩幅度的增加、介于刺激与收缩间的肌肉反应时间的缩短而进行测量。运动员指以任何程度参与运动，以及寻求能在其机能上达到增进强度、速度与耐久力水平的个人，例如健身者(body builder)、自行车运动员、长跑运动员、短跑运动员等。所增强的运动效能由能克服肌肉疲劳的能力、可保持较长时间活力的能力及具有更有效练习的能力显示。
在运动员肌肉性能的场所(arena)，期望产生允许在长期的更高耐性程度上进行比赛或训练的状况。
预期本发明的方法也有效于治疗肌肉相关的病理病症，包括急性肌肉减少症(acute sarcopenia)，例如肌肉萎缩和/或与烧伤、卧床、四肢固定(limbimmobilization)或大部分胸部(major thoracic)、腹部和/或整形外科手术关联的恶质病(cachexia)。
在一些实施方案中，本发明提供包含沉默调节蛋白的调节剂的新型饮食(dietary)组合物，其制备方法及使用该组合物以改善运动性能(performance)的方法。于是，本发明向涉及广泛定义的运动，包括需要持久力的运动与需要重复性肌肉运用的劳力的人们提供具有改善身体持久力和/或抑制身体疲劳的作用的治疗组合物、食品与饮料。此类饮食组合物可额外包含电解质、咖啡因、维生素、碳水化合物等。
其他用途
增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防病毒感染(例如流行性感冒病毒、疱疹病毒或乳头状瘤病毒感染)或作为抗真菌剂。在一些实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可以作为组合药物疗法的一部分与另一种用于治疗病毒性疾病的治疗剂一起给药。在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可作为组合药物疗法的一部分与另一种抗真菌剂一起给药。
可如本文所述进行治疗的个体包括真核生物，例如哺乳动物例如人类、羊类、牛类、马类、猪类、犬类、猫类、非人灵长类、小鼠及大鼠。可受处理的细胞包括真核细胞，例如得自前述个体的细胞，或植物细胞、酵母细胞及原核细胞例如细菌细胞。例如，可将调节性化合物给药于农场动物，以增强其能更长期承受农场状况的能力。
增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物也可用于，增加植物寿命、应激抗性及对于细胞凋亡的抗性。在一个实施方案中，将化合物施予植物(例如以周期性为基础)，或施予真菌。在另一个实施方案中，植物经遗传修饰以产生化合物。在另一个实施方案中，将植物与果实在采收与运送前先以化合物处理，以增加在运送期间对于损伤的抗性。也可将植物种子与本文所述的化合物接触，以(例如)使其防腐(preserve)。
在其他实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于调节酵母细胞的寿命。其中希望延长酵母细胞寿命的情况包括任何其中使用有酵母的工艺过程，例如啤酒、酸奶与烘焙物品(例如面包)的制造。使用具有延长寿命的酵母，可以减少酵母的使用量，或使酵母具有活性的时间更长。也可将用于重组制造蛋白质的酵母或其他哺乳动物细胞进行如本文所述的处理。
增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物也可用于增加昆虫寿命、应激抗性及对于细胞凋亡的抗性。在此实施方案中，化合物将被施用至有用的昆虫，例如蜜蜂及其他涉及植物授粉的昆虫。在一个具体的实施方案中，化合物将被施用至涉及繁殖蜂蜜的蜜蜂。一般而言，本文所述的方法可应用至任何生物体，例如具有商业重要性的真核生物。例如，可将本文所述的方法应用至鱼类(水产养殖)及鸟类(例如鸡与家禽)。
也可使用较高剂量的增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物作为杀虫剂，这是通过干扰发育期间沉默基因的调节以及细胞凋亡的调节。在该实施方案中，可通过本领域已知的方法将该化合物施用至植物，并确保该化合物对昆虫幼虫(且非对于植物)为生物可利用的。
至少就生殖与寿命间的联系的观点而言，可施用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，来影响诸如昆虫、动物及微生物等生物体的生殖作用。
4.测定
其他在本文中所构思的方法包括，用于鉴定可调节沉默调节蛋白的化合物或药剂的筛检方法。药剂可为核酸，例如适体(aptamer)。分析可以基于细胞或不含细胞的形式进行。例如，分析可包含，在沉默调节蛋白可被已知调节沉默调节蛋白的试剂所调节的条件下，用试验试剂培育(或接触)沉默调节蛋白，并在该试验试剂存在下监控或测定沉默调节蛋白相对于无该试验试剂存在下的调节程度。沉默调节蛋白的调节程度可通过测定其可将底物脱乙酰基化的能力而测得。例举性底物为可购自BIOMOL(PlymouthMeeting，PA)的乙酰化肽类。优选底物包括p53的肽类，例如那些包含乙酰化K382的肽类。尤其优选的底物为Fluor de Lys-SIRT1(BIOMOL)，即乙酰化肽Arg-His-Lys-Lys。其他底物为得自人类组蛋白H3与H4的肽类或乙酰化氨基酸。底物可为荧光性的(fluorogenic)。沉默调节蛋白可为SIRT1、Sir2、SIRT3或其部分。例如，重组型SIRT1可购自BIOMOL。反应可进行约30分钟，并(例如)以烟酰胺终止。可使用HDAC荧光活性分析/药物发现试剂盒(AK-500，BIOMOL Research Laboratories)测定乙酰化程度。类似的分析经描述于Bitterman等人(2002)J.Biol.Chem.277：45099。可将分析中的沉默调节蛋白的调节程度，与在一种或多种本文所述化合物(分开或同时)存在下(其可作为阳性或阴性对照组)的沉默调节蛋白的调节程度进行比较。用于分析的沉默调节蛋白可为全长沉默调节蛋白或其部分。因为在本文中已显示活化化合物似乎会与SIRT1的N-端作用，故用于分析的蛋白质包括沉默调节蛋白的N-端部分，例如SIRT1的大致为氨基酸1-176或1-255；Sir2的大致为氨基酸1-174或1-252部分。
在一个实施方案中，筛检试验包含(i)在无试验试剂存在下且适合沉默调节蛋白将底物脱乙酰化的条件下，使沉默调节蛋白与试验试剂及乙酰化底物接触；及(ii)测定底物的乙酰化程度，其中在该试验试剂存在下底物的乙酰化程度相对于无该试验试剂存在下较低则表示：该试验试剂刺激由沉默调节蛋白进行的脱乙酰化作用，而在该试验试剂存在下底物的乙酰化程度，相对于无该试验试剂存在下较高则表示：该试验试剂抑制由沉默调节蛋白进行的脱乙酰化作用。
用于鉴定可于体内调节(例如刺激)沉默调节蛋白的方法可包含(i)在第I类与第II类HDAC的抑制剂存在下，在无试验试剂存在下且适合沉默调节蛋白将底物脱乙酰化的条件下，使细胞与试验试剂及能够进入细胞的底物接触；及(ii)测定底物的乙酰化程度，其中在该试验试剂存在下底物的乙酰化程度，相对于无该试验试剂存在下较低则表示：该试验试剂刺激由沉默调节蛋白进行的脱乙酰化作用，而在该试验试剂存在下底物的乙酰化程度，相对于无该试验试剂存在下较高则表示：该试验试剂抑制由沉默调节蛋白进行的脱乙酰化作用。优选底物为乙酰化肽，也优选为荧光性，如本文中进一步描述的。该方法可进一步包含将细胞溶解，以测定底物的乙酰化程度。可将底物以范围介于约1μM至约10mM，优选地约10μM至1mM，甚至更优选从约100μM至1mM，例如约200μM的浓度加至细胞。优选底物为乙酰化赖氨酸，例如ε-乙酰基赖氨酸(Fluor de Lys，FdL)或Fluor deLys-SIRT1。第I类与第II类HDAC的优选抑制剂为曲古柳菌素A(trichostatinA)(TSA)，其可以范围介于约0.01μM至100μM，优选从约0.1至10μM，例如约1μM的浓度使用。细胞与测试化合物及底物的培育可进行约10分钟至5小时，优选约1-3小时。因为TSA抑制所有第I类与第II类HDAC，且一些底物(例如Fluor de Lys)对于SIRT2为较差的底物，对于SIRT3-7甚至更差，故此类分析可用于鉴定体内SIRT1调节剂。
5.药物组合物
本文所述的沉默调节蛋白的调节性化合物可以通过常规方法，使用一种或多种生理学或药学上可接受的载体或赋形剂进行配制。例如，沉默调节蛋白的调节性化合物及其药学上可接受的盐与溶剂合物可经配制，而通过例如注射(例如SubQ、IM、IP)、吸入或吹入(通过口或鼻部)或口服、口腔、舌下、经皮、鼻部、非经肠道或直肠给药来进行给药。在一个实施方案中，沉默调节蛋白的调节性化合物可局部地，位于标靶细胞存在的部位，即在特定组织、器官或体液(例如血液、脑脊髓液等)中进行给药。
沉默调节蛋白的调节性化合物可经配制用于各种给药方式，包括全身及局部或区域性给药。技术与制剂一般可见于Remington’s PharmaceuticalSciences，Meade Publishing Co.，Easton，PA。对于非经肠道给药，以注射为优选，包括肌肉内、静脉内、腹膜内及皮下。对于注射，可将化合物配制成液态溶液，优选生理学上可接受的缓冲液，例如汉克氏溶液或林格氏溶液中。此外可将化合物配制成固体形式，并于使用前立即再溶解或悬浮。也可包括冷冻干燥形式。
对于口服给药，药物组合物可采用例如通过常规方法，与药学上可接受的赋形剂例如粘合剂(binding agent)(例如，预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠)；或湿润剂(例如月桂基硫酸钠)制备的片剂、锭剂或胶囊的形式。片剂可通过本领域已熟知的方法包衣。用于口服给药的液体制剂可采用例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或它们可制成干燥产物，在使用前以水或其他适宜载体配制。此类液体制剂可通过常规方法，用药学上可接受的添加剂例如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂类)；乳化剂(例如卵磷脂或金合欢胶)；非水载体(例如爱丁油(ationd oil)、油性酯类、乙醇或分级植物油)；及防腐剂(例如对-羟基苯甲酸甲基酯或对-羟基苯甲酸酯丙基或山梨酸)制备。如果适当，该制剂也可含有缓冲盐、调味剂、着色剂与甜味剂。用于口服给药的制剂可适宜地配制，以使活性化合物受控的释出(controlled release)。
对于通过吸入(例如肺部递送)的给药，可方便地将沉默调节蛋白的调节性化合物以从经加压包装或喷雾器使用适宜的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合气体的气溶胶喷雾形式来递送。在经加压气溶胶的情况中，剂量单位可通过提供用于递送已计量的量的阀来决定。可配制用于吸入器或吹入器的例如明胶胶囊或药筒(cartridge)，其含有化合物与适宜粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
沉默调节蛋白的调节性化合物可经配制用于通过注射，例如通过单次快速静脉注射或持续输注的非经肠道给药。用于注射的制剂可以单位剂量形式提供，例如，以安瓿或多剂量容器(添加防腐剂)提供。组合物可采用诸如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，且可含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前可以用适宜载体，例如灭菌无热原水配制。
沉默调节蛋白的调节性化合物也可配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规的栓剂基质如可可脂或其他甘油酯类。
除了先前所述的制剂外，沉默调节蛋白的调节性化合物也可配制成长效制剂(depot preparation)。此类长效型制剂可通过植入(例如以皮下或肌肉内)，或经由肌肉内注射进行给药。因此，例如，可将沉默调节蛋白的调节性化合物用适宜的聚合物或疏水性材料(例如存在于可接受油类中的乳液)或离子交换树脂配制，或呈微溶性衍生物，例如呈微溶性盐。受控释出剂型也包括贴剂。
在一些实施方案中，本文所述的化合物可配制成用于递送至中枢神经系统(CNS)的制剂(见综述，Begley，Pharmacology & Therapeutics 104：29-45(2004))。用于药物递送至CNS的常规途径包括：神经外科策略(例如脑内注射或脑室内输注)；试剂的分子操作(例如制造包含具有对于内皮细胞表面分子的亲合性的转运肽与其本身能够穿越BBB的试剂组合的嵌合型融合蛋白质)目的在于开发一种BBB的内源性运送途径；设计用以增加试剂的脂溶度的药学策略(例如，将水溶性试剂结合(conjugation)至脂质或胆固醇载体上)；及通过高渗透力瓦解短暂破坏BBB完整性(由将甘露糖醇溶液灌流入颈动脉，或使用生物活性剂例如血管紧张肽所导致)。
脂质体为另一种可容易注射的药物递送系统。于是，在本发明方法中也可将活性化合物以脂质体递送系统的形式进行给药。脂质体为本领域人员已熟知的。脂质体可由各种磷脂例如胆固醇、磷酯酰胆碱类的硬脂胺形成。可用于本发明方法的脂质体包含所有类型脂质体，包括但不限定于小单层泡、大单层泡及多层泡。
另一种制造沉默调节蛋白的调节剂例如白藜芦醇或其衍生物的制剂(尤其是溶液)的方法是通过使用环糊精。环糊精是指α-、β-或γ-环糊精。环糊精详细描述于Pitha等人，U.S专利4,727,064中，其以参考文献引入本文。环糊精为葡萄糖的环状寡聚物；这些化合物与其分子能配合至环糊精分子的亲脂-搜寻空腔(lipophile-seeking cavity)中的任何药物形成包合复合物(inclusion complex)。
快速崩解或溶解剂型(dissolving dosage form)可用于医药活性剂的快速吸收，尤其是口腔与舌下吸收。快速溶解(fast melt)剂型对具有吞咽常见的固体剂型例如胶囊与片剂困难的患者(例如老年人及幼儿患者)有益。此外，快速溶解剂型克服了与例如咀嚼剂型关联的缺点，其中活性剂保持存在患者口中的时间，在确定味觉掩盖量及患者可能感受到活性剂的喉咙粗砂质感的程度方面起重要作用。
药物组合物(包括化妆品制剂)可包含约0.00001至100％，例如0.001至10％或0.1至5％重量的一种或多种本文所述的沉默调节蛋白的调节性化合物。在另一实施方案中，该药物组合物包含：(i)0.05至1000mg的本发明化合物或其药学上可接受的盐，和(ii)0.1至2g的一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方案中，将本文所述的沉默调节蛋白的调节性化合物混入含有一般适用于局部药物给药的局部载体，且包含本领域已知的任何此类物质的局部制剂中。可选择局部载体以使组合物呈所希望的形式，例如呈软膏、洗剂、乳膏、微乳剂、凝胶、油类、溶液等，且其可由天然存在或合成来源的材料组成。优选地，所选择的载体不会有害地影响活性剂或局部制剂的其他组分。用于本文的适宜局部载体实例包括水、醇类及其他无毒性有机溶剂、甘油、矿物油、硅酮、凡士林、羊毛脂、脂肪酸、植物油、对羟基苯甲酸酯类(parabens)、蜡类等。
制剂可为无色无味的软膏、洗剂、乳膏、微乳剂及凝胶。
沉默调节蛋白的调节性化合物可混入一般为半固体制剂的软膏中，其通常以凡士林或其他石油衍生物为基质。所使用的本领域技术人员所了解的具体软膏基质(base)，是能够提供最适药物递送，且优选可提供其他所希望特征以及例如柔软性或类似特征的基质。如果与其他载体或赋形剂共用，则软膏基质应为惰性、稳定、无刺激性且非致敏性的。
沉默调节蛋白的调节性化合物可混入洗剂中，其一般为要施用于皮肤表面而无摩擦(friction)的制剂，且通常为其中固体颗粒(包括活性剂)存在于水或醇类为基质的液态或半液态制剂。洗剂通常为固体的悬浮液，且包含水包油形态的液体油性乳液。
沉默调节蛋白的调节性化合物可混入乳膏中，其一般为粘稠性液体或半固态乳液，为水包油或油包水型。乳剂基质为可水洗，且含有油相、乳化剂与水相。油相一般由凡士林与脂肪醇，例如鲸蜡醇或硬脂醇所组成；水相通常(虽然并非必要地)在体积上较油相过量，且一般含有湿润剂。乳膏制剂中的乳化剂如于前述Reminton的文献中所说明的，一般为非离子性、阴离子性、阳离子性或两性表面活性剂。
沉默调节蛋白的调节性化合物可混入微乳剂中，其一般为两种不相混溶的液体(例如油与水)经由表面活性剂分子的界面膜稳定化的热动力学上稳定、各向同性的澄清的分散体(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology(New York：Marcel Dekker，1992)，第9卷)。
沉默调节蛋白的调节性化合物可混入凝胶制剂中，其一般为由小无机粒子组成的悬浮液(二相系统)，或基本上均匀分布于整个载体液体(单相凝胶)的大有机分子所组成的半固体系统。虽然凝胶一般使用水性载体液体，也可使用醇类与油类作为载体液体。
在制剂中也可包括其他活性剂，例如其他消炎剂、镇痛剂、抗微生物剂、抗真菌剂、抗生素、维生素、抗氧化剂及一般存在于防晒制剂中的阳光阻断剂，包括但不限定于邻氨基苯甲酸酯、二苯甲酮(尤其是二苯甲酮-3)、樟脑衍生物、肉桂酸酯(例如甲氧基肉桂酸辛酯)、二苯甲酰基甲烷(例如丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷)、对-氨基苯甲酸(PABA)及其衍生物，及水杨酸酯(例如水杨酸辛酯)。
在一些局部制剂(topical formulation)中，活性剂以该制剂的大约0.25重量％至75重量％，优选地为该制剂的大约0.25重量％至30重量％，更优选地为该制剂的大约0.5重量％至15重量％，且最优选地为该制剂的大约1.0重量％至10重量％的范围存在。
眼部疾病可通过(例如)全身性、局部眼内注射沉默调节蛋白的调节性化合物，或通过安插可释出沉默调节蛋白的调节性化合物的持续释出装置而治疗或预防。可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物在药学上可接受的眼载体中进行递送，以使化合物能保持与眼表面接触足够的时间以让化合物穿透角膜与眼睛的内部区域，例如前室、后室、玻璃体、房水、玻璃体液、角膜、虹膜/睫状、晶状体、脉络膜/视网膜及巩膜的时间。药学上可接受的眼载体可例如为软膏、植物油或包封材料。或者，可将本发明化合物直接注射入玻璃体液与房水中。在另一选择中，化合物可全身性给药(例如通过静脉内输注或注射)用于眼部的治疗。
本文所述的沉默调节蛋白的调节性化合物可储存于无氧环境中。例如，可将白藜芦醇或其同系物配制于供口服给药的不透气胶囊中，例如购自Pfizer，Inc.的Capsugel中。
可将例如经沉默调节蛋白的调节性化合物体外处理的细胞，根据用于将移植物给药于患者的方法进行给药，其可伴随例如给药免疫抑制药物例如环孢菌素A。关于医药配制的一般原理，读者可参考Cell Therapy(细胞疗法)：Stem Cell Transplantation，Gene Therapy与Cellular Immunotherapy(干细胞移植、基因疗法与细胞免疫疗法)，G.Morstyn和W.Sheridan编，剑桥大学出版，1996；及Hematopoietic Stem Cell Therapy(造血性干细胞疗法)，E.D.Ball，J.Lister和P.Law，Churchill Livingstone，2000。
沉默调节蛋白的调节性化合物的毒性与治疗功效，可通过用细胞培养物或实验动物进行的标准医药方法测定。LD50为对于50％种群为致死的剂量。ED50为对于50％种群为治疗上有效的剂量。毒性与治疗功效间的剂量比值(LD50/ED50)为治疗指数。优选具有高治疗指数的沉默调节蛋白的调节性化合物。虽然可使用具有毒副作用的沉默调节蛋白的调节性化合物，但应小心设计将此类化合物靶向至受影响组织位置的递送系统，以使得可以将对于未受感染细胞可能的伤害减至最低，并由此减少副作用。
来自细胞培养物测定及动物研究的数据，可用于配制在人类中使用的剂量范围。此类化合物的剂量可在其包括具有少或无毒性的ED50值的循环浓度范围内。剂量可在此范围内根据所使用的剂型及所利用的给药途径而有所变化。对于任何化合物，可最初根据细胞培养物测定评估治疗上有效的剂量。可在动物模型中调配剂量，以达到其包括如在细胞培养物所测定的IC50值(即，测试化合物达到对症状的一半-最大抑制作用的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更准确地测定可人类的有效剂量。可例如通过高效液相色谱法测量血浆中的浓度。
6.试剂盒
本发明也提供试剂盒，例如用于治疗目的的试剂盒，或用于调节细胞寿命或调节细胞凋亡的试剂盒。试剂盒可包括一种或多种例如以预先测量的剂量的沉默调节蛋白的调节性化合物。试剂盒可任选地包括用于将细胞与化合物接触的装置及使用说明书。该装置包括注射器、支架及其他用于将沉默调节蛋白的调节性化合物导入患者(例如患者的血管)中，或将其涂覆于患者皮肤的装置。
在另一个实施方案中，本发明提供一种物质组合物，其包含本发明的沉默调节蛋白的调节剂与另一种治疗剂(与用于组合疗法及联用组合物(combination composition)中的那些相同的治疗剂)，存在于独立的剂型中，但彼此互相关联。术语“互相关联”用于本文是指，将独立的剂型包装在一起，或不然相互依附，从而使得可以容易地明白这些独立的剂型欲被销售，且欲以相同方案的一部分给药。优选将该药剂与沉默调节蛋白的调节剂一起包装于泡罩包装或其他多室包装中，或作为可由使用者自行分开(例如，通过在两容器间的刻划线处撕开)的连结的、分开密封的容器(例如锡箔小袋等)中。
在又一个实施方案中，本发明提供试剂盒包含存在于独立的容器中的a)本发明沉默调节蛋白的调节性化合物；及b)另一种治疗剂，例如那些描述于说明书其他地方的治疗剂。
除非另有说明，本发明方法的实施将利用本领域普通技术人员所知的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA及免疫学的常规技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如：Molecular Cloning A Laboratorymanual(分子克隆实验室手册A)，第2版，Sambrook、Fritsch和Maniatis编著(Cold Sp Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning(DNA克隆)，第I与II卷(D.N.Glover编著，1985)；Oligonucleotide Synthesis(寡苷核酸合成)(M.J.Gait编著，1984)；Mullis等人U.S.专利No：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)(B.D.Hames & S.J.Higgins编著1984)；Transcription And Translation(转录与转译)(B.D.Hames & S.J.Higgins编著，1984)；Culture of Animal Cells(动物细胞培养)(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells AndEnzymes(固定化细胞与酶)(IRLPress，1986)；B.Perbal，Practical Guide ToMolecular Cloning(分子克隆的实施指南)(1984)；专题论文，Methods InEnzymology(酶学方法)(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer VectorsFor Mammalian Cells(哺乳动物细胞用基因转移载体)(J.H.Millerh和M.P.Calos编著，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology(酶学方法)，卷154和155(Wu等人编著)，Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(细胞与分子生物学的免疫化学方法)(Mayer和Walker编著，Academic Press，London，伦敦，1987)；Handbook of ExperimentalImmunology(实验免疫学手册)，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编著，1986)；Manipulating the Mouse Embryo(操作小鼠胚胎)(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
实施例
通过参照下列实施例更容易了解对本发明进行的一般描述，这些实施例仅为说明本发明一些方面及具体实施方案，而无意于以任何方式限制本发明。
实施例1.制备2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(3)的一般方法。
将2，3-二氨基苯甲酸(1；50mg，0.33mmol)、2-(三氟甲基)苯甲醛(2；57mg，0.33mmol)和焦亚硫酸钠(Na2S2O5，82mg，0.43mmol)溶于DMF(5mL)中，并于100℃搅拌17小时。将反应混合物冷却至室温，并用H2O稀释。将生成的混合物在室温下搅拌1小时并过滤。将收集的固体用水洗涤并干燥，得到2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸3，为淡褐色固体(75mg，产率：74％)。MS(ESI)计算值：C15H9F3N2O2：306.06；实测值：307[M+H]。
使用该一般方法，用合适的醛化合物代替上述方案中的2-(三氟甲基)苯甲醛2，制备任何1H-苯并[d]咪唑的4-羧基衍生物。
实施例2.N-(噻唑-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物208)的制备。
将2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(3；75mg，0.24mmol)与噻唑-2-胺(4；24mg，0.24mmol)和HATU(186mg，0.49mmol)一起溶于DMF(2mL)中。加入DIEA(81μL，0.49mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。将反应混合物用水稀释并过滤。将收集的固体进一步通过硅胶色谱法纯化，得到所需的产物，即N-(噻唑-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物208)，为白色固体(35mg，产率：38％)。MS(ESI)计算值：C18H11F3N4OS：388.06；实测值：389[M+H]。
使用该一般方法，通过用合适的羧酸和胺化合物分别代替3和4，制备表1中所示的任何酰胺衍生物。
实施例3.2-(6-(哌嗪-1-基)吡啶-3-基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺盐酸盐(化合物251)的合成。
步骤1)2-(6-氯吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(6)的制备
将2，3-二氨基苯甲酸(1；200mg，1.31mmol)、6-氯烟碱醛(5；186mg，1.31mmol)和Na2S2O5(324mg，1.7mmol)溶于DMF(10mL)中，并于100℃搅拌18小时。将反应混合物冷却至室温并用H2O稀释。将生成的混合物在室温下搅拌1小时并过滤。将收集的固体用水、MeOH洗涤，并干燥，得到2-(6-氯吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸6，为淡白色固体(340mg，产率：95％)。
步骤2)2-(6-氯吡啶-3-基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(7)的制备
将2-(6-氯吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(6；340mg，1.24mmol)与噻唑-2-胺(4；125mg，1.24mmol)和HATU(943mg，2.48mmol)一起溶于DMF(5mL)中。加入DIEA(0.41mL，2.48mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用水稀释，并通过过滤收集生成的固体。通过硅胶色谱法(戊烷/EtOAc)纯化，得到2-(6-氯吡啶-3-基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺7，为淡黄色固体(215mg，产率：52％)。MS(ESI)计算值：C16H10ClN5OS：355.03；实测值：356[M+H]。
步骤3)4-(5-(4-(噻唑-2-基氨基甲酰基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(8)的制备
将在DMSO(1.2mL)中含2-(6-氯吡啶-3-基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(7；30mg，0.084mmol)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(170；156.5mg，0.84mmo)的混合物在微波反应器中于140℃搅拌25min。将反应混合物冷却至室温，并用水稀释。通过过滤收集生成的固体，用水洗涤并在真空下干燥，得到4-(5-(4-(噻唑-2-基氨基甲酰基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯8，为淡黄色固体(20mg，71％)。MS(ESI)计算值：C25H27N7O3S：505.19；实测值：506[M+H]。
步骤4)2-(6-(哌嗪-1-基)吡啶-3-基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺盐酸盐(化合物251)的制备
将HCl的甲醇溶液(3N，2mL)中含4-(5-(4-(噻唑-2-基氨基甲酰基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(8；20mg，0.039mmol)的混合物在室温下搅拌18小时。过滤收集沉淀的固体，用MeOH洗涤并干燥，得到2-(6-(哌嗪-1-基)吡啶-3-基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺盐酸盐(化合物251)，为淡黄色固体(21mg)。MS(ESI)计算值：C20H19N7OS(m/z)：405.14；实测值：406[M+H]。
实施例4.2-(6-吗啉代吡啶-3-基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物247)的制备
将在DMSO(1.5mL)中的含2-(6-氯吡啶-3-基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(7；20mg，0.056mmol)和吗啉(48；49mg，0.56mmol)的混合物在微波反应器中在140℃下搅拌25min。将反应混合物冷却至室温，并用水稀释。过滤收集沉淀的固体并干燥。将该固体再溶于EtOAc中，并加入足量的石油醚以将产物再次沉淀出来。过滤收集该固体，用MeOH洗涤并干燥，得到2-(6-吗啉代吡啶-3-基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物247)，为淡黄色固体(13mg，57％)。MS(ESI)计算值：C20H18N6O2S：406.12；实测值：407[M+H]。
实施例5.2-(2-吗啉代吡啶-3-基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物250)的制备
根据上述一般方法，使用合适的醛化合物制备2-(2-氯吡啶-3-基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺9。将含该物质即2-(2-氯吡啶-3-基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(9；19mg，0.053mmo)和吗啉(48；46mg，0.53mmol)在DMSO(1.2mL)中的混合物在微波反应器中于140℃搅拌25min。将反应混合物冷却至室温，并用水稀释。过滤收集沉淀的固体并干燥。将该固体再溶于EtOAc中，并加入足量的石油醚以将产物再次沉淀出来。过滤收集该固体，用MeOH洗涤并干燥，得到2-(2-吗啉代吡啶-3-基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物250)，为白色固体(13mg，60％)。MS(ESI)计算值：C20H18N6O2S(m/z)：406.12；实测值：407[M+H]。
实施例6.2-(2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰氨基)吡啶1-氧化物(化合物329)的制备
在氮气下，向N-(吡啶-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(10；100mg，0.26mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液中加入mCPBA(140mg，0.81mmol)。将混合物在室温下搅拌12小时。加入K2CO3饱和的水溶液(10mL)，并将混合物用CH2Cl2(3×10mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(CH2Cl2∶甲醇＝20∶1)纯化，得到2-(2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰氨基)吡啶1-氧化物(化合物329)(60.0mg，58％)，为无色固体。MS(ESI)计算值：C20H13F3N4O2：398.10；实测值：399[M+H]。
实施例7.N-(2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基)噻唑-4-甲酰胺(化合物332)的合成
步骤1)2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酸苄基酯(12)的制备
将2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(11；1.53g，5.0mmol)、叠氮化磷酸二苯酯(DPPA，1.39g，5.0mmol)和Et3N(0.75g，7.4mmol)的甲苯(15mL)溶液在室温下搅拌2小时，然后在回流下搅拌2小时。加入苄醇(0.54g，5.0mmol)，将生成的反应混合物在回流下再搅拌12小时。冷却至室温后，将混合物依次用柠檬酸水溶液(10％w/w)、饱和的NaHCO3和盐水洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，并在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)纯化，得到固体的2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酸苄基酯12(1.45g，70％)。MS(ESI)计算值：C22H16F3N3O2：411.12；实测值：412[M+H]。
步骤2)2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺(13)的制备
向搅拌的2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酸苄基酯(12；1.45g，3.5mmol)的甲醇(20mL)溶液中加入5％Pd/C(0.20g)。向反应混合物中充分地通入氮气，并然后在室温下在1 atm氢气下搅拌18小时。将混合物通过Celite(塞力特硅藻土)填料过滤，并将滤液在减压下浓缩，得到固体的2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺13(0.90g，3.25mmol，93％)。MS(ESI)计算值：C14H10F3N3：277.08；实测值：278[M+H]。
步骤3)N-(2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基)噻唑-4-甲酰胺(化合物332)的制备
将2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺(13；0.28g，1.0mmol)、噻唑-4-甲酸(14；0.15g，1.2mmol)、DIEA(0.42mL，2.4mmol)和HATU(0.79g，2.07mmol)在DMF(10mL)中的混合物在室温下搅拌12小时。加入饱和的NaHCO3水溶液(5mL)，并将混合物过滤。将残余物用乙酸乙酯(3×15mL)洗涤，并将水层用乙酸乙酯(3×15mL)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)，并在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)纯化，得到N-(2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基)噻唑-4-甲酰胺(化合物332)(0.30g，0.77mmol，77％)，为无色固体。MS(ESI)计算值：C18H11F3N4OS：388.06；实测值：389[M+H]。
实施例8.N-(吡啶-2-基)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺(化合物581)的制备
在惰性的N2气氛下，将含有2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺(13；332mg，1.20mmol)、2-氯吡啶(15；138g，1.22mmol)、Pd(OAc)2(120mg，0.53mmol)、BINAP(336mg，0.53mmol)和t-BuOK(150mg，1.34mmol)在甲苯(10mL)中的混合物在回流下搅拌12小时。将反应混合物在减压下浓缩，将生成的残余物用乙酸乙酯(3×15mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)纯化，得到N-(吡啶-2-基)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺(化合物581)(30mg，0.085mmol，7.1％)，为无色固体。MS(ESI)计算值：C19H13F3N4：354.11；实测值：355[M+H]。
实施例9.N-(吡啶-3-基甲基)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺(化合物)的制备
在惰性的N2气氛下，将含有2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺(13；120mg，0.43mmol)、烟碱醛(16；51mg，0.47mmol)和NaBH(OAc)3(143mg，0.67mmol)在1，2-二氯乙烷(10mL)中的混合物在室温下搅拌12小时。加入饱和的NaHCO3水溶液(10mL)，并将混合物用乙酸乙酯(3x15mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(梯度洗脱，石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1至1∶3)纯化，得到N-(吡啶-3-基甲基)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺(化合物)(70mg，0.198mmol，46％)，为淡黄色固体。MS(ESI)计算值：C20H15F3N4：368.12；实测值：369[M+H]。
实施例10.2-(4-吗啉代-2-(三氟甲基)苯基)-N-(吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物430)的合成
步骤1)4-氯-1-(二甲氧基甲基)-2-(三氟甲基)苯(18)的制备
在0℃下，向搅拌的4-氯-2-(三氟甲基)苯甲醛(17；4.20g，20.0mmol)的甲醇(25mL)溶液中加入原甲酸乙酯(3.60g，24.0mmol)。将生成的反应混合物温热至室温，并搅拌12小时。加入MeONa的甲醇溶液以调节pH＝10。减压除去溶剂，并将生成的残余物用水稀释。将混合物用乙酸乙酯(3×50mL)萃取，将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩，得到4-氯-1-(二甲氧基甲基)-2-(三氟甲基)苯18(3.20g，12.6mmol，63％)。
步骤2.4-(4-(二甲氧基甲基)-3-(三氟甲基)苯基)吗啉(19)的制备
在惰性的N2气氛下，将4-氯-1-(二甲氧基甲基)-2-(三氟甲基)苯(18；3.20g，12.6mmol)、Pd2(dba)3(0.30g，0.33mmol)、t-BuOK(3.50g，31.2mmol)和吗啉(48；1.09g，12.6mmol)在无水甲苯(50mL)中的混合物在回流下搅拌12小时。冷却至室温后，将混合物过滤，并将滤液在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)纯化，得到4-(4-(二甲氧基甲基)-3-(三氟甲基)苯基)吗啉19(0.40g，10.4％)。
步骤3.2-(4-吗啉代-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(20)的制备
将4-(4-(二甲氧基甲基)-3-(三氟甲基)苯基)吗啉(19；0.40g，1.31mmol)、2，3-二氨基苯甲酸(1；0.20g，1.31mmol)、Na2S2O5(0.33g，1.74mmol)在DMF(10mL)中的混合物在110℃(油浴)下搅拌18小时。冷却至室温后，将混合物用水(20mL)稀释，并搅拌30分钟。将混合物过滤；将滤饼用水(3×10mL)洗涤并干燥，得到2-(4-吗啉代-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸20(0.37g，72％)，为灰色固体。
步骤4.2-(4-吗啉代-2-(三氟甲基)苯基)-N-(吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物430)的制备
将2-(4-吗啉代-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(20；157mg，0.40mmol)、HATU(304mg，0.80mmol)、DIEA(207mg，1.60mmol)和3-氨基吡啶(173；37mg，0.40mmol)在DMF(2mL)中的混合物在室温下搅拌12小时。加入水(20mL)并搅拌30min。将混合物用乙酸乙酯(3×10mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法纯化，得到2-(4-吗啉代-2-(三氟甲基)苯基)-N-(吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物430)(64mg，34％)，为淡黄色固体。MS(ESI)计算值：C24H20F3N5O2：467.16；实测值：468[M+H]。
实施例11.2-(5-吗啉代-2-(三氟甲基)苯基)-N-(吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物450)的制备
使用上述实施例10中制备2-(4-吗啉代-2-(三氟甲基)苯基)-N-(吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺的相同的一般方法，除了使用5-氯-2-(三氟甲基)苯甲醛21作为起始物，得到2-(5-吗啉代-2-(三氟甲基)苯基)-N-(吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物450)。MS(ESI)计算值：C24H20F3N5O2：467.16；实测值：468[M+H]。
实施例12.2-(2-(哌啶-4-基氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物428)的合成
步骤1)4-(甲基磺酰氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(24)的制备
在冰水浴中，向N-Boc-4-羟基哌啶(22；25g，124mmol)和Et3N(20.7mL)的CH2Cl2(100mL)溶液中滴加甲磺酰氯23的CH2Cl2(20mL)溶液。将混合物在室温下搅拌18小时。然后将其用100mL的CH2Cl2稀释，并依次用饱和的NaHCO3水溶液(50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩，得到4-(甲基磺酰氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯24(45g，粗产率：＞100％)。然后将该物质不需进一步纯化用于下一步骤中。
步骤2)4-(2-甲酰基苯氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(26)的制备
将含有2-羟基苯甲醛(25；4.2g，34.5mmol)、4-(甲基磺酰氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(24；15.0g，～41mmol)、K2CO3(7.15g，51.7mmol)和四丁基碘化铵(500mg，催化量)在DMF(100mL)中的混合物在70-80℃下搅拌18小时。将溶剂DMF在减压下浓缩除去。将生成的残余物用EtOAc(100mL)稀释，并用水(50mL)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，并在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(戊烷/EtOAc＝1∶10)纯化，得到黄色油状的4-(2-甲酰基苯氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯26(2.89g，27％)。
步骤3)2-(2-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(27)的制备
使用上述用于制备苯并咪唑衍生物的相同的一般方法，使用2，3-二氨基苯甲酸1和4-(2-甲酰基苯氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯26，制备2-(2-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸27。MS(ESI)计算值：C24H27N3O5：437.20；实测值：438[M+H]。
步骤4)2-(2-(哌啶-4-基氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物428)的制备
使用上述相同的一般的酰胺偶合方法，使用2-(2-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸27和2-氨基噻唑4作为起始物。将生成的粗的酰胺偶合产物(0.2mmol)用4mL的25％TFA的CH2Cl2溶液处理，并在室温下放置8小时。将混合物在减压下浓缩，并将生成的残余物通过使用0.1％ TFA缓冲的乙腈水溶液的制备型HPLC纯化，得到2-(2-(哌啶-4-基氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物428)。MS(ESI)计算值：C22H21N5O2S：419.14；实测值：420[M+H]。
实施例13.2-(2-(吡咯烷-3-基氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物459)的合成
步骤1)3-(2-甲酰基苯氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(30)的制备
在冰水浴中，向N-Boc-3-羟基吡咯烷(28；2g，10.7mmol)和Et3N(2.2ml，16.0mmol)的CH2Cl2(5mL)溶液中滴加甲磺酰氯(1.84g，2.52ml，16.0mmol)的CH2Cl2(5mL)溶液。将混合物在室温下搅拌18小时。然后将其用50mL的CH2Cl2稀释，用饱和的Na2CO3(20mL)、盐水(20mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩，得到N-Boc-3-(甲基磺酰氧基)吡咯烷29(2.6g，92％)。将该物质不需进一步纯化用于下一步骤中。
将2-羟基苯甲醛(25；1.2g，9.8mmol)、N-Boc-3-(甲基磺酰氧基)吡咯烷(29；2.6g，9.8mmol)、K2CO3(2.0g，14.7mmol)和四丁基碘化铵(300mg，cat)在CH2Cl2(20mL)中于70-80℃搅拌18小时。在减压下浓缩除去DMF。将生成的残余物用EtOAc(100mL)稀释，用水(50mL)洗涤，干燥(MgSO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(戊烷∶EtOAc＝1∶10)纯化，得到676mg的油状的3-(2-甲酰基苯氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯30(产率：23％)。
步骤2)2-(2-(1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(31)的制备
将2，3-二氨基苯甲酸(1；350mg，2.3mmol)、3-(2-甲酰基苯氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(30；670mg，2.3mmol)和Na2S2O5(568mg，1.3mmol)在DMF(30mL)中的混合物在90℃下搅拌18小时。将混合物冷却至室温。将混合物用水(100mL)稀释，搅拌1小时，过滤，并用水洗涤。将滤饼真空干燥，得到822mg的标题化合物31(84％)。MS(ESI)计算值：C23H25N3O5：423.18；实测值：424[M+H]。
步骤3)3-(2-(4-(噻唑-2-基氨基甲酰基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)苯氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(32)的制备
向2-(2-(1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(31；150mg，0.36mmol)、噻唑-2-胺(4；35.5mg，0.36mmol)和HATU(202mg，0.53mmol)的DMF(5mL)溶液中加入DIEA(137mg，1.06mmol)。将混合物在室温下搅拌18小时。然后将其用水(20mL)稀释，并搅拌30min。通过过滤收集沉淀，并然后通过柱色谱法纯化，得到85mg的标题化合物32(产率：48％)。MS(ESI)计算值：C26H27N5O4S：505.18；实测值：506[M+H]。
步骤4)2-(2-(吡咯烷-3-基氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物459)的制备
将3-(2-(4-(噻唑-2-基氨基甲酰基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)苯氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯32在8mL的4M HCl/MeOH中的溶液在室温下搅拌2小时。将形成的沉淀过滤收集，并用甲醇洗涤，得到72mg的2-(2-(吡咯烷-3-基氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物459)(产率：96％)。MS(ESI)计算值：C21H19N5O2S：405.13；实测值：406[M+H]。
实施例14.2-(3-(2，3-二羟基丙氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物324)的制备
步骤1)4-甲基苯磺酸(2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲基酯(34)的制备
将(2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲醇(33；7.56mmol，1.0g)溶于20mL的二氯甲烷中。然后加入三乙胺(26.46mmol，3.687mL)，随后加入对甲苯磺酰氯(15.12mmol，2.88g)和催化量的4-二甲基氨基吡啶。将该反应在室温下搅拌18小时。将粗的反应混合物用二氯甲烷稀释，依次用饱和的碳酸氢钠水溶液、水洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。生成的残余物34不需进一步纯化用于下一步骤(89％粗产率)。
步骤2)2-(3-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(36)的制备
向4-甲基苯磺酸(2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲基酯(34；4.02mmol，1.15g)和3-羟基苯甲醛(35；4.824mmol，0.614g)在20mL的二甲基甲酰胺中的溶液中加入碳酸钾(10.05mmol，1.39g)。将该反应在50℃下搅拌18小时。将粗的反应混合物用水稀释(10mL)，用二氯甲烷(3X15mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将粗物质通过快速色谱法(戊烷/EtOAc)纯化。得到所需的产物36，产率为84％。
步骤3)2-(3-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(37)的制备
使用上述制备苯并咪唑的相同的一般方法，使用2，3-二氨基苯甲酸，制备2-(3-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺37。MS(ESI)计算值：C23H22N4O4S：450.14；实测值：451[M+H]。
步骤4)2-(3-(2，3-二羟基丙氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物324)的制备
向2-(3-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(37；50mg，0.111mmol)的THF溶液中滴加4NHCl，直至观察到沉淀。通过真空过滤收集沉淀，用无水乙醇洗涤。将产物(化合物324)在真空下干燥过夜。(产物为淡黄色，并且产率＝86％)。MS(ESI)计算值：C23H22N4O4S：410.10；实测值：411[M+H]。
实施例15.2-(2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物482)的制备
步骤1)4-甲基苯磺酸2-氯乙基酯(39)的制备
在典型的试验中，在0℃下，将对甲苯磺酰氯(TsCl，70.5g，0.37mol)缓慢地加入到2-氯乙醇(38；25.0g，0.31mol)的吡啶(100mL)溶液中。将反应混合物在0-5℃下搅拌18小时。加入冰水(300mL)，并将生成的混合物用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。将合并的有机层用1N HCl(3×100mL)、水(100mL×3)洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩，得到4-甲基苯磺酸2-氯乙基酯39(64.3g，88％)。
步骤2)2-(2-氯乙氧基)苯甲醛(40)的制备
将4-甲基苯磺酸2-氯乙基酯(39；27.0g，0.115mol)、2-羟基苯甲醛(25；14.0g，0.115mol)和K2CO3(31.7g，0.23mol)在DMF(100mL)中的混合物于45℃搅拌12小时。加入水(200mL)，将混合物用乙酸乙酯(3×150mL)萃取。将合并的有机层用饱和的盐水(3×50mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)纯化，得到2-(2-氯乙氧基)苯甲醛40(16.8g，0.091mol，79％)，为淡黄色固体。
步骤3)2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲醛(41)的制备
将2-(2-氯乙氧基)苯甲醛(40；2.5g，13.5mmol)、吡咯烷(172；1.9g，26.8mmol)、K2CO3(3.8g，27.2mmol)和NaI(0.6g，4.2mmol)的DMF(50mL)溶液在80℃下搅拌12小时。加入水(200mL)，将混合物用乙酸乙酯(3×150mL)萃取。将合并的有机层用盐水(3×50mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(二氯甲烷∶甲醇＝100∶1)纯化，得到2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲醛41(1.63g，7.43mmol，55％)，为淡黄色固体。
步骤4)2-(2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(42)的制备
将2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲醛(41；1.6g，7.3mmol)、2，3-二氨基苯甲酸(1；1.10g，7.3mmol)、Na2S2O5(2.0g，11.0mmol)在DMF(30mL)中的混合物在95℃(油浴)下搅拌18小时。加入水(30mL)，并将混合物过滤。将该固体用二氯甲烷/甲醇(50mL，v/v＝5/1)洗涤，干燥，得到2-(2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸42(1.80g，5.1mmol，70％)，为褐色固体。
步骤5)2-(2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物482)的制备
将2-(2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(42；0.30g，0.85mmol)、HATU(0.42g，1.1mmol)、DIPEA(0.22g，1.7mmol)和2-氨基噻唑(4；0.17g，1.7mmol)在DMF(15mL)中的混合物于50℃搅拌14小时。加入水(30mL)，将混合物搅拌30min。将混合物过滤，将滤饼通过色谱法(二氯甲烷∶甲醇∶氨＝60∶1∶0.3)纯化，得到2-(2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物482)(70mg，0.16mmol，18.8％)，为无色固体。MS(ESI)计算值：C23H23N5O2S：433.16；实测值：434[M+H]。
实施例16.2-(2-(二氟甲基)-4-氟苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(化合物559)的合成
步骤1)1-溴-2-(二氟甲基)-4-氟苯(44)的制备
在0℃下，向2-溴-5-氟苯甲醛(43；10g，43.5mmol)的CH2Cl2(100mL)溶液中加入三氟化(二乙基氨基)硫(“DAST”，10.5g，65.2mmol)的CH2Cl2(50mL)溶液。然后将反应混合物温热至室温，搅拌18小时。将混合物缓慢地倒入到NaHCO3水溶液中，分离各层。将水层用CH2Cl2萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将粗物质通过真空蒸馏纯化，得到1-溴-2-(二氟甲基)-4-氟苯44(7.9g，71.3％)。
步骤2)2-(二氟甲基)-4-氟苯甲醛(46)的制备
将异丙基溴化镁(30mL，1M的THF溶液，30mmol)滴加到冰冷却的1-溴-2-(二氟甲基)-4-氟苯(44；6g，26.7mmol)的THF(100mL)溶液中。然后将反应混合物温热至室温，搅拌3小时。加入二甲基甲酰胺(3.5ml，45.2mmol)，将该反应搅拌3小时。加入水，将混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法纯化，得到2-(二氟甲基)-4-氟苯甲醛45(3.2g，68.5％)。
步骤3)2-(2-(二氟甲基)-4-氟苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(46)的制备
使用上述制备苯并咪唑的相同的一般方法，使用2-(二氟甲基)-4-氟苯甲醛45和2，3-二氨基苯甲酸1作为起始物，得到2-(2-(二氟甲基)-4-氟苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸46。MS(ESI)计算值：C15H9F3N2O2：306.6；实测值：307[M+H]。
步骤4)2-(2-(二氟甲基)-4-氟苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物559)的制备
使用上述相同的一般的酰胺偶合方法，制备2-(2-(二氟甲基)-4-氟苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物559)。MS(ESI)计算值：C18H11F3N4OS：388.06；实测值：389[M+H]。
实施例17.2-(2-(二氟甲基)-4-吗啉代苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物551)的合成
步骤1)2-(二氟甲基)-4-吗啉代苯甲醛(49)的制备
将在50mL的DMSO中含有2-(二氟甲基)-4-氟苯甲醛(47；3.50g，20.1mmol)、吗啉(48；1.9g，22.1mmol)和K2CO3(5.5g，40.2mmol)的混合物于100℃搅拌4小时。将生成的反应混合物冷却至室温，用水(200mL)稀释。过滤收集沉淀的固体，并干燥，得到2-(二氟甲基)-4-吗啉代苯甲醛49(2.5g，52％)。
步骤2)2-(2-(二氟甲基)-4-吗啉代苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(50)的制备
使用上述制备苯并咪唑的相同的一般方法，使用2-(二氟甲基)-4-吗啉代苯甲醛49和2，3-二氨基苯甲酸1作为起始物，制备2-(2-(二氟甲基)-4-吗啉代苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(50)。MS(ESI)计算值：C19H17F2N3O3：373.12；实测值：374[M+H]。
步骤3)2-(2-(二氟甲基)-4-吗啉代苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物551)的制备
使用上述相同的一般的酰胺偶合方法，制备2-(2-(二氟甲基)-4-吗啉代苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物551)。MS(ESI)计算值：C22H19F2N5O2S：455.12；实测值：456[M+H]。
实施例18.2-(4-氯-2-(三氟甲基)苯基)-N-(3-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物490)的合成
步骤1)3-(吡咯烷-1-基甲基)苯胺(53)的制备
将1-(溴甲基)-3-硝基苯(51；5g，23.1mmol)与吡咯烷(2.3mL，27.72mmol)和K2CO3(4.8g，34.6mmol)一起溶于100mL的无水THF。将反应混合物在室温下搅拌18小时，然后过滤。将滤液在减压下浓缩，得到1-(3-硝基苄基)吡咯烷52。将该物质52溶于100mL的无水EtOH，加入10％ Pd/C(300mg)。将生成的反应混合物在1atm氢气下在室温下搅拌18小时。然后将混合物通过Celite填料过滤，并将滤液在减压下浓缩，得到2.81g的3-(吡咯烷-1-基甲基)苯胺53(70％)。
步骤2)2-(4-氯-2-(三氟甲基)苯基)-N-(3-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物490)的制备
使用上述相同的一般的酰胺偶合方法，由2-(4-氯-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸54和3-(吡咯烷-1-基甲基)苯胺53制备2-(4-氯-2-(三氟甲基)苯基)-N-(3-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物490)。MS(ESI)计算值：C26H22ClF3N4O：498.14；实测值：499[M+H]。
实施例19.2-(4-氟-2-(三氟甲基)苯基)-N-(4-(吗啉代甲基)噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物681)的合成
步骤1)4-(羟基甲基)噻唑-2-基氨基甲酸叔丁酯(57)的制备
将2-氨基噻唑-4-甲酸乙酯(55；10.0g，58.1mmol)与焦碳酸二叔丁基酯(BOC2O，12.67g，58.1mmol)连同10mg的4-(二甲基)氨基吡啶(DMAP)一起溶于150mL的无水THF中。将反应混合物于50℃搅拌4小时，然后在室温下搅拌18小时。然后将其在减压下浓缩，得到粘稠的油状物。加入戊烷，并通过过滤收集生成的结晶物质并干燥，得到10.5g的2-(叔丁氧基羰基氨基)噻唑-4-甲酸乙酯56。将该物质56(10.5g，38.5mmol)溶于300mL的无水THF中，并在干冰-乙腈浴中冷却。然后用10分钟的时间加入1M SuperHydrideTM(三乙基氢化硼锂)的THF(85mL)溶液。将生成的反应混合物于-45℃搅拌2小时。然后加入另一批的1M Super HydrideTM的THF(35mL)溶液，将反应混合物于-45℃再搅拌2小时。在45℃下将该反应通过加入50mL的盐水来终止。温热至室温后，将反应混合物在减压下浓缩。将生成的混合物用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法纯化，得到6.39g的4-(羟基甲基)噻唑-2-基氨基甲酸叔丁酯57(72％)。
步骤2)4-(吗啉代甲基)噻唑-2-胺(59)的制备
将4-(羟基甲基)噻唑-2-基氨基甲酸叔丁酯(57；2.0g，8.7mmol)与Et3N(1.82mL，13.05mmol)一起溶于25mL的CH2Cl2中，冷却至0℃。加入甲磺酰氯(0.85mL，10.88mmol)，并将生成的反应混合物于0℃搅拌60分钟。然后加入吗啉(48；3.0mL，35mmol)，将反应混合物在室温下搅拌18小时。将反应混合物在减压下浓缩。将生成的残余物溶于EtOAc中，并用稀的NaHCO3水溶液、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将该物质通过硅胶短柱过滤来纯化。将滤液浓缩，得到1.88g的4-(吗啉代甲基)噻唑-2-基氨基甲酸叔丁酯58。通过在室温下将4-(吗啉代甲基)噻唑-2-基氨基甲酸叔丁酯58用20mL的25％ TFA的CH2Cl2溶液处理18小时来除去Boc基团。通过浓缩并在高真空下干燥来除去所有的溶剂后，将生成的残余物用戊烷/EtOAc混合物处理，得到2.17g的白色固体的4-(吗啉代甲基)噻唑-2-胺59。
步骤3)2-(4-氟-2-(三氟甲基)苯基)-N-(4-(吗啉代甲基)噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物681)的制备
使用上述相同的一般的酰胺偶合方法制备2-(4-氟-2-(三氟甲基)苯基)-N-(4-(吗啉代甲基)噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物681)。MS(ESI)计算值：C23H19ClF3N5O2S：521.09；实测值：522[M+H]。
实施例20.N-(5-(吗啉代甲基)噻唑-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物780)的合成
步骤1)5-(吗啉代甲基)噻唑-2-胺(61)的制备
使用上述制备4-(吗啉代甲基)噻唑-2-胺的相同的合成顺序，使用2-氨基噻唑-5-甲酸乙酯60作为起始物制备5-(吗啉代甲基)噻唑-2-胺61。
步骤2)N-(5-(吗啉代甲基)噻唑-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物780)的制备
使用上述相同的一般的酰胺偶合方法，由2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸3和5-(吗啉代甲基)噻唑-2-胺61制备N-(5-(吗啉代甲基)噻唑-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物780)。MS(ESI)计算值：C23H20F3N5O2S：487.13；实测值：488[M+H]。
实施例21.(R)-2-(2-(二氟甲基)-4-(2，3-二羟基丙氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物556)的合成
步骤1)(S)-2-溴-5-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯甲醛(64)的制备
向2-溴-5-羟基苯甲醛(62；5g，0.025mol)的DMF(100ml)溶液中加入(R)-4-(氯甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊烷(63；4.87g，0.032mol)和K2CO3(7.0g，0.05mol)。将生成的反应混合物于150℃搅拌10小时，冷却至室温，用水稀释，然后用EtOAc萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(石油醚/EtOAc＝10∶1)纯化，得到所需的产物，即(S)-2-溴-5-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯甲醛64(4.1g，56％)。
步骤2)(S)-4-((4-溴-3-(二氟甲基)苯氧基)甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊烷(65)的制备
在室温下，向DAST(3.04g，0.019mol)在20ml CH2Cl2中的溶液中滴加(S)-2-溴-5-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯甲醛(64；4.0g，0.013mol)在8ml CH2Cl2中的溶液。将生成的反应混合物在室温下搅拌10小时。然后将其用CH2Cl2(50mL)稀释，用水洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。通过色谱法(石油醚/EtOAc＝5∶1)纯化，得到(S)-4-((4-溴-3-(二氟甲基)苯氧基)甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊烷65(3.3g，75％)。
步骤3)(S)-2-(二氟甲基)-4-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯甲醛(66)的制备
在-78℃下，向(S)-4-((4-溴-3-(二氟甲基)苯氧基)甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊烷(65；3g，0.089mol)的THF(30ml)溶液中加入n-BuLi(2.5M的己烷溶液，3.9ml，0.097mol)。将混合物在相同温度下搅拌1小时，并滴加DMF(0.929g，0.103mol)。在-78℃下再搅拌20min后，加入饱和的NH4Cl水溶液(30ml)。将生成的反应混合物温热至室温，用Et2O(3×15mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(石油醚/EtOAc＝5∶1)纯化，得到标题化合物，即(S)-2-(二氟甲基)-4-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯甲醛66(1.83g，72％)。
步骤4)(S)-2-(2-(二氟甲基)-4-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(67)的制备
向(S)-2-(二氟甲基)-4-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯甲醛(66；1.83g，6.40mmol)的DMF(150ml)溶液中加入2，3-二氨基苯甲酸(1；0.97g，6.40mmol)和Na2S2O5(1.82g，9.60mmol)。将反应混合物于110℃搅拌18小时。然后将其冷却至室温，用水稀释。通过过滤收集生成的固体，并干燥，得到(S)-2-(2-(二氟甲基)-4-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸67，为深黄色固体(0.84g，51％)。MS(ESI)计算值：C21H20F2N5O5：418.13；实测值：419[M+H]。
步骤5)(S)-2-(2-(二氟甲基)-4-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯基)-N-(3H-吡咯-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(68)的制备
将(S)-2-(2-(二氟甲基)-4-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(67；100mg，0.239mmol)与2-氨基噻唑(4；28.7mg，0.289mmol)、HATU(181.7mg，0.478mmol)和DIEA(61.8mg，0.289mmol)一起溶于10ml的DMF中。将生成的反应混合物在室温下搅拌12小时，用水稀释。过滤收集沉淀的固体并干燥。通过色谱法(EtOAc/己烷＝2∶1)纯化，得到(S)-2-(2-(二氟甲基)-4-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺68(77mg，65％)。MS(ESI)计算值：C24H22F2N4O4S：500.13；实测值：501[M+H]。
步骤6)(R)-2-(2-(二氟甲基)-4-(2，3-二羟基丙氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物556)的制备
向(S)-2-(2-(二氟甲基)-4-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(68；80mg，0.160mmol)的MeOH(10ml)溶液中加入浓HCl(1ml)和水(1ml)。将生成的反应混合物在回流下搅拌2小时。然后将其冷却至室温，加入足量的1N NaOH以调节pH＝8-9。将生成的混合物用EtOAc萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。通过色谱法(石油醚/EtOAc＝2∶1)纯化，得到(R)-2-(2-(二氟甲基)-4-(2，3-二羟基丙氧基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物556)(67mg，91％)。MS(ESI)计算值：C21H18F2N4O4S：
实施例22.6-吗啉代-N-(噻唑-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物628)的合成
步骤1)3-氨基-5-氯-2-硝基苯甲酸(77)的制备
在0℃下，向叔丁醇钾(38.9g，0.347mol)和乙酸铜(II)一水合物(0.9g，4.96mmol)在DMF(160ml)中的混合物中加入O-甲基羟基胺盐酸盐(8.3g，99.3mmol)和3-氯-6-硝基苯甲酸(69；10g，49.6mmol)的DMF(160ml)溶液。将生成的反应混合物于该温度下搅拌3小时。然后将其用水终止，用10％HCl酸化，用EtOAc萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将残余物溶于EtOAc中，用10％的NaOH水溶液萃取。将合并的水层用浓HCl酸化至pH＝3，然后用EtOAc萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩，得到3-氨基-5-氯-2-硝基苯甲酸70(6.5g，60.5％)，为棕红色固体。
步骤2)3-氨基-5-氯-2-硝基苯甲酸甲酯(71)的制备
将浓H2SO4(1.5ml)加入到3-氨基-5-氯-2-硝基苯甲酸(70；3.5g，16.2mmol)在MeOH(120ml)中的混合物中。将生成的反应混合物在回流下搅拌3天。然后将其用饱和的NaHCO3水溶液中和，用EtOAc萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。通过色谱法纯化，得到3-氨基-5-氯-2-硝基苯甲酸甲酯71(3.3g，88.5％)，为黄色固体。
步骤3)3-氨基-5-吗啉代-2-硝基苯甲酸甲酯(72)的制备
向3-氨基-5-氯-2-硝基苯甲酸甲酯(71；3.3g，14.35mmol)的DMF(66ml)溶液中加入吗啉(48；7.12g，81.78mmol)和K2CO3(11.28g，81.78mmol)。将生成的反应混合物于105℃搅拌4小时。然后将其过滤，用水(500ml)稀释，用EtOAc萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。经柱色谱法纯化，得到3-氨基-5-吗啉代-2-硝基苯甲酸甲酯72(2.1g，52.1％)，为棕黄色固体。
步骤4)2，3-二氨基-5-吗啉-4-基-苯甲酸甲酯(73)的制备
将3-氨基-5-吗啉代-2-硝基苯甲酸甲酯(72；2.1g，7.5mmol)的EtOH(100ml)溶液在室温下用5％Pd/C(200mg)氢化。3小时后，将反应混合物过滤，在减压下浓缩，得到2，3-二氨基-5-吗啉-4-基-苯甲酸甲酯73(1.3g，69.5％)，为棕黄色固体。
步骤5)6-吗啉-4-基-2-(2-三氟甲基-苯基)-1H-苯并咪唑-4-甲酸甲酯(75)的制备
向2，3-二氨基-5-吗啉-4-基-苯甲酸甲酯(73；600mg，2.39mmol)在EtOH(60ml)中的混合物中加入焦亚硫酸钠(373mg，1.96mmol)、H2O(2ml)和2-三氟甲基苯甲醛(74；990mg，5.69mmol)。将生成的反应混合物在回流下搅拌3小时。然后将其冷却至室温，在减压下浓缩。通过色谱法纯化，得到6-吗啉-4-基-2-(2-三氟甲基-苯基)-1H-苯并咪唑-4-甲酸甲酯75(670mg，69.2％)，为黄色固体。
步骤6)6-吗啉-4-基-2-(2-三氟甲基-苯基)-1H-苯并咪唑-4-甲酸(76)的制备
将在1M NaOH(27ml)中含有6-吗啉-4-基-2-(2-三氟甲基-苯基)-1H-苯并咪唑-4-甲酸甲酯(75；670mg，1.65mmol)的混合物于70℃搅拌30min。将反应混合物用10％ HCl水溶液中和。过滤收集生成的沉淀并干燥，得到6-吗啉-4-基-2-(2-三氟甲基-苯基)-1H-苯并咪唑-4-甲酸76(600mg，93％)，为淡黄色固体。
步骤7)6-吗啉代-N-(噻唑-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物628)的制备
使用之前详述的相同的一般的酰胺偶合方法，由6-吗啉-4-基-2-(2-三氟甲基-苯基)-1H-苯并咪唑-4-甲酸76和2-氨基噻唑4制备6-吗啉代-N-(噻唑-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物628)。MS(ESI)计算值：C22H18F3N5O2S：473.11；实测值：474[M+H]。
实施例23.N-(噻唑-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-甲酰胺(化合物341)的制备
步骤1)4-氨基-5-硝基-烟酸乙酯(78)的制备.
将硝酸钾(20.5g，200mmol)加入到冰冷却的4-氨基吡啶-3-甲酸(77；27.6g，200mmol)在200mL浓H2SO4中的溶液中。将生成的反应混合物在室温下搅拌20分钟，然后在75℃下搅拌3小时。冷却至室温后，在搅拌下加入乙醇(540mL)。将生成的混合物于60℃搅拌18小时，然后慢慢地加入到冰冷却的乙酸钾溶液(800g在1500mL的H2O中)中。将生成的沉淀过滤收集，用水洗涤并干燥，得到4-氨基-5-硝基-烟酸乙酯78(14.6g，35％)。
步骤2)4，5-二氨基-烟酸乙酯(79)的制备
将在MeOH(500mL)中含有4-氨基-5-硝基-烟酸乙酯(78；15g，0.071mol)和10％ Pd/C(500mg)的混合物在1atm的氢气下在室温下搅拌18小时。将该反应混合物通过Celite填料过滤，并将滤液在减压下浓缩，得到4，5-二氨基-烟酸乙酯79(10g，80％)。
步骤3)2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-甲酸乙酯(80)的制备：
将在50mL的DMF中含有4，5-二氨基-烟酸乙酯(79；1.81g，10mmol)、2-三氟甲基苯甲醛(1.9g，11mmol)、Na2S2O5(9.5g，50mmol)的混合物于120℃搅拌18小时。冷却至室温后，将反应混合物倒入到100mL的冷水中。通过过滤收集生成的固体，用水洗涤并干燥，得到2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-甲酸乙酯80(2.35g，70％)。
步骤4)2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-甲酸(81)的制备：
将2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-甲酸乙酯(80；2.35g，7mmol)溶于10％的NaOH水溶液(40mL)和乙醇(20mL)中。将反应混合物在回流下搅拌30分钟。冷却至室温后，将反应混合物用5N HCl酸化。将生成的黄色固体过滤收集，用水洗涤，并干燥，得到2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-甲酸81(1.77g，85％)。
步骤5)N-(噻唑-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-3H-咪唑[4，5-c]吡啶-7-甲酰胺(化合物341)的制备
使用之前详述的相同的一般的酰胺偶合方法，由2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-甲酸81和2-氨基噻唑4制备N-(噻唑-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-甲酰胺(化合物341)。MS(ESI)计算值：C17H10F3N5OS：389.06；实测值：390[M+H]。
实施例24.2-(4-氟-2-三氟甲基-苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-甲酸噻唑-2-基酰胺(化合物693)的合成
步骤1)2-(4-氟-2-三氟甲基-苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-甲酸乙酯(83)的制备
将在硝基苯(50mL)中含有4，5-二氨基烟酸乙酯(79；0.9g，5mmol)和4-氟-2-(三氟甲基)苯甲醛(82；1.0g，5.2mmol)的混合物于220℃搅拌18小时。冷却至室温后，将反应混合物用乙醚稀释。通过过滤收集生成的固体，用乙醚洗涤，并干燥，得到2-(4-氟-2-三氟甲基-苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-甲酸乙酯83(600mg，39％)。
步骤2)2-(4-氟-2-三氟甲基-苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-甲酸噻唑-2-基酰胺(化合物693)的制备
使用之前详述的相同的一般方法，使用2-(4-氟-2-三氟甲基-苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-甲酸乙酯83作为合适的起始物制备2-(4-氟-2-三氟甲基-苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-甲酸噻唑-2-基酰胺(化合物693)。MS(ESI)计算值：C17H9F4N5OS：407.05；实测值：408[M+H]。
实施例25.6-甲氧基-N-(吡啶-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物632)的合成
步骤1)O-甲基羟基胺(84)的制备
将甲氧基胺盐酸盐在小的整体蒸馏装置中用过量的50％ KOH处理。将生成的混合物加热至80度，并将在45-50度蒸馏出来的馏分收集到含有KOH颗粒的接受烧瓶中。
步骤2)3-氨基-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(85)的制备
在室温下，用10分钟的时间将最新蒸馏的O-甲基羟基胺(3.00g，53.6mmol)和3-氨基-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(84；5.33g，27.0mmol)在DME(100mL)中的溶液滴加到搅拌下的tBuOH(7eq)和Cu(OAc)2(10mol％)在DME(50mL)中的混悬液中。在室温下搅拌4-8小时后，将其用水终止，并加入足量的浓HCl以调节pH＝3。将生成的混合物用EtOAc萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。通过色谱法(CHCl3-MeOH-AcOH＝8∶2∶0.1)纯化，得到深黄色固体的3-氨基-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸85(4.62g)。
步骤3)2，3-二氨基-5-甲氧基苯甲酸(86)的制备
将3-氨基-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(85；1.6g，7.5mmol)溶于甲醇(100mL)中，加入10％ Pd/C(300mg)。将生成的反应混合物在1atm的氢气下在室温下搅拌18小时。将反应混合物通过Celite填料过滤，并将滤液在减压下浓缩，得到2，3-二氨基-5-甲氧基苯甲酸86(0.7g)。
步骤4)6-甲氧基-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(87)的制备
将2，3-二氨基-5-甲氧基苯甲酸86(1.1当量)和2-(三氟甲基)苯甲醛74(1当量)和焦亚硫酸钠(3当量)在DMF中的混合物在回流下搅拌12小时。冷却至室温后，将反应混合物用水稀释。通过过滤收集生成的固体，并干燥，得到6-甲氧基-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸87，为深黄色固体(40％)。
步骤5)6-甲氧基-N-(吡啶-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物632)的制备
使用之前详述的相同的一般的酰胺偶合方法，由6-甲氧基-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸87和2-氨基吡啶89制备6-甲氧基-N-(吡啶-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物632)。MS(ESI)计算值：C21H15F3N4O2：412.11；实测值：413[M+H]。
实施例26.N-(6-(吡咯烷-1-基甲基)吡啶-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物620)的合成
步骤1)6-氨基吡啶-2-甲酸乙酯(91)的制备.
于0℃，向2-氨基-6-吡啶甲酸(90；6.0g，43.5mmol)在乙醇(150mL)中的溶液中加入SOCl2(12.0g，101mmol)。所得反应混合物在回流下搅拌12小时。冷却到室温后，减压浓缩反应混合物。加入足够饱和的Na2CO3水溶液调节pH＝9。减压浓缩混合物，并将二氯甲烷(150mL)加入到生成的残余物中。室温剧烈搅拌混合物30分钟，然后过滤。减压浓缩滤液，得到6-氨基吡啶-2-甲酸乙酯91(5.5g，76％)。
步骤2)6-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-2-甲酸乙酯(92)的制备
向6-氨基吡啶-2-甲酸乙酯(91；5.5g，33mmol)在t-BuOH(120mL)和丙酮(40mL)中的溶液中加入DMAP(0.08g，0.66mmol)和焦碳酸二叔丁基酯(10.8g，49.5mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。将溶剂经减压浓缩除去，并加入己烷/二氯甲烷(180mL，3∶1)的混合物。将生成的混合物冷却至-20℃持续2小时。所得固体通过过滤收集，并干燥，得到6-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-2-甲酸乙酯92(11.0g，91％)。
步骤3)6-(羟基甲基)吡啶-2-基氨基甲酸叔丁酯(93)的制备
在0℃，经30分钟向搅拌的6-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-2-甲酸乙酯(92；11.0g，33mmol)在THF(120mL)中的溶液在氮气氛下加入LiAlH4(3.80g，100mmol)在THF(60mL)中的溶液。在0℃搅拌反应混合物6小时，并在0℃通过添加水(2.0mL)和10％NaOH溶液(4.0mL)小心地淬灭。将反应混合物过滤，并将滤液干燥(Na2SO4)，并减压浓缩。生成的残余物通过色谱法(1∶1石油醚∶乙酸乙酯)纯化，得到6-(羟基甲基)吡啶-2-基氨基甲酸叔丁酯93(3.0g，41％)。
步骤4)甲磺酸(6-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-2-基)甲酯(94)的制备
于0℃经30分钟向6-(羟基甲基)吡啶-2-基氨基甲酸叔丁酯(93；3.0g，13.4mmol)和DIPEA(5.0g，40mmol)在乙腈(30mL)中的溶液中加入MsCl(2.0g，17.4mmol)，并在室温搅拌混合物2小时。反应通过添加饱和NaHCO3水溶液淬灭，并用乙酸乙酯(3×60mL)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并减压浓缩，得到基本定量产率的粗的甲磺酸(6-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-2-基)甲酯94。
步骤5)6-(吡咯烷-1-基甲基)吡啶-2-基氨基甲酸叔丁酯(96)的制备
将在乙腈(15mL)中含有甲磺酸(6-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-2-基)甲酯(94；1.30g，3.2mmol)、吡咯烷(95；0.46g，6.4mmol)和K2CO3(1.30g，9.6mmol)的混合物在室温搅拌12小时。加入饱和NaHCO3水溶液，并减压浓缩混合物。所得水层用EtOAc萃取。合并的有机层经干燥(Na2SO4)，并减压浓缩，得到6-(吡咯烷-1-基甲基)吡啶-2-基氨基甲酸叔丁酯96(0.75g，2.7mmol，62％，两步)。
步骤6)6-(吡咯烷-1-基甲基)吡啶-2-胺(97)的制备
于室温，向6-(吡咯烷-1-基甲基)吡啶-2-基氨基甲酸叔丁酯(96；750mg，2.7mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入TFA(4.0mL)。所得反应混合物在室温搅拌6小时，然后减压浓缩。并将足够的饱和Na2CO3水溶液加入所得残余物中调节至pH＝9。然后将混合物用乙酸乙酯(3×25mL)萃取。合并的有机层经干燥(Na2SO4)，并减压浓缩，得到6-(吡咯烷-1-基甲基)吡啶-2-胺97(440mg，92％)。
步骤7)N-(6-(吡咯烷-1-基甲基)吡啶-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物620)的制备
使用之前详述的相同的一般的酰胺偶合方法，由2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸3和6-(吡咯烷-1-基甲基)吡啶-2-胺97制备N-(6-(吡咯烷-1-基甲基)吡啶-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物620)。MS(ESI)计算值：C25H22F3N5O：465.18；实测值：466[M+H]。
实施例27.N-(5-(哌嗪-1-基甲基)吡啶-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物621)的合成
步骤1)6-氨基烟酸乙酯(99)的制备
在0℃下，向2-氨基-5-吡啶甲酸(98；5.0g，36.2mmol)的乙醇(100mL)溶液中加入SOCl2(8.6g，72.4mmol)。将生成的反应混合物在回流下搅拌12小时。冷却至室温后，将反应混合物在减压下浓缩，然后将足量的饱和NaHCO3水溶液加入到反应混合物中以调节pH＝9。通过过滤收集生成的固体，并干燥，得到6-氨基烟酸乙酯99(5.64g，94％)。
步骤2)6-(叔丁氧基羰基氨基)烟酸乙酯(100)的制备
向6-氨基烟酸乙酯(99；11.3g，68.3mmol)在t-BuOH(120mL)和丙酮(40mL)中的溶液中加入DMAP(0.17g，1.37mmol)和焦碳酸二叔丁基酯(30.0g，137mmol)。将生成的反应混合物在室温下搅拌18小时，然后在减压下浓缩。加入己烷/二氯甲烷混合物(180mL，3∶1)，将反应混合物冷却至-20℃持续2小时。通过过滤收集生成的固体并干燥，得到6-(叔丁氧基羰基氨基)烟酸乙酯100(17.0g，68％)。
步骤3)5-(羟基甲基)吡啶-2-基氨基甲酸叔丁酯(101)的制备
于0℃经30分钟向搅拌的6-(叔丁氧基羰基氨基)烟酸乙酯(100；10.0g，27.3mmol)的THF(40mL)溶液中加入LiAlH4(1.92g，50.5mmol)的THF(60mL)溶液。将生成的反应混合物于0℃搅拌6小时。然后在0℃下将该反应通过小心地加入水(1.0ml)和10％ NaOH溶液(2.0mL)来终止该反应。将生成的混合物过滤，并将滤液干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(二氯甲烷∶甲醇＝40∶1)纯化，得到5-(羟基甲基)吡啶-2-基氨基甲酸叔丁酯101(4.50g，74％)。
步骤4)甲磺酸(6-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-3-基)甲基酯(102)的制备
于0℃经30分钟向在THF(45mL)中含有5-(羟基甲基)吡啶-2-基氨基甲酸叔丁酯(101；4.5g，20.2mmol)和DIPEA(16.0g，121mmol)的混合物中加入MsCl(6.93g，60.5mmol)。将生成的反应混合物在室温下搅拌12小时。然后将混合物用水(2×5mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(10∶1石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到甲磺酸(6-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-3-基)甲基酯102(3.0g，61％)。
步骤5)4-((6-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-甲酸苄基酯(104)的制备
将甲磺酸(6-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-3-基)甲基酯(102；1.30g，5.4mmol)、哌嗪-1-甲酸苄基酯103；(1.42g，6.5mmol)、K2CO3(2.30g，16.1mmol)和NaI(0.08g，0.54mmol)在DMF(20mL)中的混合物于60℃搅拌2小时。将反应混合物过滤，并将滤液在减压下浓缩。加入水(30mL)，将混合物过滤。将收集的固体进一步用水洗涤，并干燥，得到4-((6-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-甲酸苄基酯104(2.20g，96％)。
步骤6)4-((6-氨基吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-甲酸苄基酯(105)的制备
在室温下，向4-((6-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-甲酸苄基酯(104；2.20g，5.20mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入TFA(3.4g，31.2mmol)。将生成的反应混合物在室温下搅拌12小时，然后在减压下浓缩。加入足量的饱和NaHCO3水溶液以调节pH＝9。然后将生成的混合物用二氯甲烷(3×25mL)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)，在减压下浓缩，得到4-((6-氨基吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-甲酸苄基酯105(1.50g，89％)。
步骤7)4-((6-(2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰氨基)吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-甲酸苄基酯(106)的制备
将2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(3；306mg，1.0mmol)和4-((6-氨基吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-甲酸苄基酯105进行之前详述的相同的一般的酰胺偶合方法，制备4-((6-(2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰氨基)吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-甲酸苄基酯106(280mg，45.6％)。
步骤8)N-(5-(哌嗪-1-基甲基)吡啶-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物621)的制备
向4-((6-(2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰氨基)吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-甲酸苄基酯(106；280mg，0.46mmol)的甲醇(20mL)溶液中加入Pd/C(0.1g，5％在碳上)。将反应混合物在1 atm的H2下搅拌12小时，然后通过Celite填料过滤。将滤液在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(二氯甲烷∶甲醇＝5∶1)纯化，得到N-(5-(哌嗪-1-基甲基)吡啶-2-基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物621)(28.0mg，13％)。MS(ESI)计算值：C25H23F3N6O：480.19；实测值：481[M+H]。
实施例28.  2-(5-氟-2-(三氟甲基)苯基)-N-(5-(吗啉代甲基)吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物624)的合成
步骤1)5-(吗啉代甲基)吡啶-2-基氨基甲酸叔丁酯(107)的制备
将在DMF(30mL)中含有甲磺酸(6-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-3-基)甲基酯(102；1.21g，5.0mmol)、吗啉(48；1.31g，15.0mmol)、K2CO3(2.10g，15.0mmol)和NaI(0.12g，0.75mmol)的混合物于80℃搅拌4小时。冷却至室温后，加入水(30mL)，将混合物用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1至1∶1)纯化，得到5-(吗啉代甲基)吡啶-2-基氨基甲酸叔丁酯107(1.40g，95％)。
步骤2)5-(吗啉代甲基)吡啶-2-胺(108)的制备
向5-(吗啉代甲基)吡啶-2-基氨基甲酸叔丁酯(107；1.40g，4.77mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入TFA(10.0mL)。将混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物在减压下浓缩。将足量的饱和的NaHCO3水溶液加入到生成的残余物中以调节pH＝9。将混合物用二氯甲烷(3×25mL)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)，在减压下浓缩，得到5-(吗啉代甲基)吡啶-2-胺108(0.85g，92％)。
步骤3)2-(5-氟-2-(三氟甲基)苯基)-N-(5-(吗啉代甲基)吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物624)的制备
使用之前详述的相同的一般的酰胺偶合方法，由5-(吗啉代甲基)吡啶-2-胺108和2-(5-氟-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸109制备2-(5-氟-2-(三氟甲基)苯基)-N-(5-(吗啉代甲基)吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物624)。MS(ESI)计算值：C25H21F4N5O2：499.16；实测值：500[M+H]。
实施例29.2-(5-氟-2-(三氟甲基)苯基)-N-(6-(吗啉代甲基)吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物686)的合成
步骤1)5-氨基吡啶-2-甲酸乙酯(111)的制备
在0℃下，向5-氨基吡啶-2-甲酸(110；8.4g，60.8mmol)的乙醇(100mL)溶液中加入SOCl2(14.5g，120mmol)。将混合物在回流下搅拌12小时。冷却至室温后，将反应混合物在减压下浓缩。加入足量的饱和的NaHCO3水溶液以调节pH＝9。将生成的混合物过滤，并将该固体在减压下干燥，得到5-氨基吡啶-2-甲酸乙酯111(7.5g，75％)。
步骤2)5-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-2-甲酸乙酯(112)的制备
向5-氨基吡啶-2-甲酸乙酯(111；7.5g，45mmol)在t-BuOH(60mL)和丙酮(20mL)中的混合物中加入DMAP(0.10g，0.9mmol)和焦碳酸二叔丁基酯(19.6g，90mmol)。将生成的反应混合物在室温下搅拌18小时，然后在减压下浓缩。加入己烷(150mL)，将混合物冷却至-20℃持续2小时。过滤收集沉淀的固体，并干燥，得到5-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-2-甲酸乙酯112(8.9g，53％)。
步骤3)6-(羟基甲基)吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯(113)的制备
于0℃经30分钟向搅拌的5-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-2-甲酸乙酯(112；8.9g，24.0mmol)的乙醚(200mL)溶液中加入LiAlH4(1.80g，48mmol)的乙醚(100mL)溶液。将生成的反应混合物于0℃搅拌3小时，然后通过小心地加入水(1.0ml)和10％ NaOH溶液(2.0mL)来终止该反应。将混合物过滤；将滤液干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩，得到6-(羟基甲基)吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯113(4.20g，78％)。
步骤4)甲磺酸(5-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-2-基)甲基酯(114)的制备
于0℃经30分钟向6-(羟基甲基)吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯(113；4.20g，18.8mmol)和DIPEA(7.0g，56.4mmol)的THF(20mL)溶液中加入MsCl(2.8g，24.4mmol)。将生成的反应混合物于0℃搅拌1小时，然后通过加入饱和的NaHCO3水溶液来终止。将混合物用乙酸乙酯(3×60mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩，得到甲磺酸(5-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-2-基)甲基酯114(5.50g)。将该物质不需进一步纯化用于下一步骤。
步骤5)6-(吗啉代甲基)吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯(115)的制备
将在乙腈(30mL)中含有甲磺酸(5-(叔丁氧基羰基氨基)吡啶-2-基)甲基酯(114；1.70g)、吗啉(48；1.0g，11.3mmol)和K2CO3(2.30g，16.9mmol)的混合物在室温下搅拌12小时。加入水(30mL)，将混合物用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1至1∶3)纯化，得到6-(吗啉代甲基)吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯115(1.20g，71％，两步)。
步骤6)6-(吗啉代甲基)吡啶-3-胺(116)的制备
向6-(吗啉代甲基)吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯(115；1.20g，4.1mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中加入TFA(6.0mL)。将生成的反应混合物在室温下搅拌12小时，然后在减压下浓缩。将足量的饱和的NaHCO3水溶液加入到残余物中以调节pH＝9。将混合物用乙酸乙酯(3×25mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩，得到6-(吗啉代甲基)吡啶-3-胺116(450mg，56％)。
步骤7)2-(5-氟-2-(三氟甲基)苯基)-N-(6-(吗啉代甲基)吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物686)的制备
使用之前详述的相同的一般的酰胺偶合方法，由6-(吗啉代甲基)吡啶-3-胺116和2-(5-氟-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸109制备2-(5-氟-2-(三氟甲基)苯基)-N-(6-(吗啉代甲基)吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物686)。MS(ESI)计算值：C25H21F4N5O2：499.16；实测值：500[M+H]。
实施例30.N-(5-甲基噻唑-2-基)-2-(4-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物703)的合成
步骤1)2，3-二氨基苯甲酸甲酯(118)的制备
将2-氨基-3-硝基苯甲酸甲酯(117；3.2g)溶于EtOAc(100mL)中，并加入10％ Pd/C(200mg)。将生成的反应混合物在1atm的氢气下在室温下氢化2天，并通过Celite填料过滤。将滤液在减压下浓缩，得到基本上定量产率的2，3-二氨基苯甲酸甲酯118。
步骤2)2-(4-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(119)的制备
将4-(三氟甲基)烟酸(88；1.00g，5.23mmol)与2，3-二氨基苯甲酸甲酯(118；0.86g，5.23mmol)、HATU(2.98g，7.84mmol)和DIEA(1.82mL，10.5mmol)一起溶于DMF(8mL)中。将反应混合物在室温下搅拌18小时。然后将其用EtOAc稀释，用水洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩，得到粗的2-氨基-3-(4-(三氟甲基)烟酰氨基)苯甲酸甲酯。将该物质溶于5mL的冰醋酸中，并于60℃搅拌18小时。将反应混合物于90℃再搅拌8小时。然后将其冷却至室温，在减压下浓缩。将生成的残余物用EtOAc稀释，用稀的NaHCO3水溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩，得到粗的2-(4-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸甲酯。将该物质溶于含有LiOH(0.4g)的MeOH(8mL)和H2O(8mL)中，在室温下搅拌18小时。将反应混合物在减压下浓缩，用6N HCl中和。通过过滤收集生成的固体并干燥，得到570mg的2-(4-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(由2，3-二氨基苯甲酸甲酯计算，产率为35％)119。MS(ESI)计算值：C14H8F3N3O2：307.06；实测值：308[M+H]。
步骤3)N-(5-甲基噻唑-2-基)-2-(4-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物703)的制备
使用上述相同的一般的酰胺偶合方法，将2-(4-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸119与2-氨基-5-甲基噻唑171进行偶合，得到N-(5-甲基噻唑-2-基)-2-(4-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物703)。MS(ESI)计算值：C18H12F3N5OS：403.07；实测值：404[M+H]。
实施例31.2-(2-(二氟甲基)-4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)-N-(吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-7-甲酰胺(化合物723)的合成
步骤1)2-溴-5-(2-吗啉代乙氧基)苯甲醛(121)的制备
向2-溴-5-羟基苯甲醛(62；3g，15mmol)和4-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐(120；5.6g，30mmol)在DMF(75mL)中的混合物中加入K2CO3(10.3g，74.6mmol)。反应2小时后在120℃下反应3小时(after reaction 2h at 120℃for 3h)，将反应混合物通过加入水来终止，用EtOAc萃取。将有机层经Na2SO4干燥，在减压下浓缩。经柱色谱法纯化，得到2-溴-5-(2-吗啉代乙氧基)苯甲醛121(3.3g，72％)，为褐色固体。
步骤2)4-(2-(4-溴-3-(二氟甲基)苯氧基)乙基)-吗啉(123)的制备
在0℃下，向2-溴-5-(2-吗啉代乙氧基)苯甲醛(121；4.7g，15mmol)的CH2Cl2(30mL)溶液中加入DAST(3.63g，22.5mmol)的CH2Cl2(15mL)溶液。将生成的反应混合物在回流下搅拌3天。将反应混合物倒入到饱和的NaHCO3水溶液中，用CH2Cl2萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。经柱色谱法纯化，得到4-(2-(4-溴-3-(二氟甲基)苯氧基)乙基)吗啉123(3.13g，63％)，为淡黄色油状物。
步骤3)2-(二氟甲基)-4-(2-吗啉代乙氧基)苯甲醛(124)的制备
在-78℃下向4-(2-(4-溴-3-(二氟甲基)苯氧基)乙基)吗啉(123；2.8g，8.38mmol)的THF(90mL)溶液中加入n-BuLi(1.6M的己烷溶液，7mL，11.2mmol)。将生成的反应混合物于相同温度下搅拌1小时，并滴加DMF(1.24g，17mmol)。在-78℃下将混合物再搅拌30分钟后，加入饱和的NH4Cl水溶液，将混合物用EtOAc萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。通过色谱法纯化，得到2-(二氟甲基)-4-(2-吗啉代乙氧基)苯甲醛124(1.6g，67％)，为棕黄色油状物。
步骤4)2-(2-(二氟甲基)-4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-7-甲酸(125)的制备
将2，3-二氨基苯甲酸(1；222mg，1.5mmol)和相应的2-(二氟甲基)-4-(2-吗啉代乙氧基)苯甲醛124进行上面详述的相同的一般方法，得到2-(2-(二氟甲基)-4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-7-甲酸125(300mg，48％)。
步骤5)2-(2-(二氟甲基)-4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)-N-(吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-7-甲酰胺(化合物723)的制备
使用之前详述的相同的一般的酰胺偶合方法，由2-(2-(二氟甲基)-4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-7-甲酸125和2-氨基吡啶89制备2-(2-(二氟甲基)-4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)-N-(吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-7-甲酰胺(化合物723)。MS(ESI)计算值：C25H21F4N5O2：499.16；实测值：500[M+H]。
实施例32.(R)-2-(4-(2，3-二羟基丙氧基)-2-(三氟甲基)苯基)-N-(吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物757)的合成
步骤1)(S)-4-((4-溴-3-(三氟甲基)苯氧基)甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊烷(127)的制备
将(S)-4-(氯甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊烷(63；3.3g，20.5mmol)加入到含有4-溴-3-(三氟甲基)苯酚(126；5g，20mmol)和K2CO3(8.30g，60mmol)在20mL的DMF中的混合物中。将生成的反应混合物于60℃搅拌6小时。冷却至室温后，将混合物倒入到水中，并用EtOAc萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(石油醚∶EtOAc＝50∶1)纯化，得到(S)-4-((4-溴-3-(三氟甲基)苯氧基)甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊烷(4g，56％)。
步骤2)(S)-4-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)-2-(三氟甲基)苯甲醛(128)的制备
在-78℃下，用30分钟的时间，将nBuLi的己烷溶液(6.76mL，1.6M的己烷溶液)滴加到(S)-4-((4-溴-3-(三氟甲基)苯氧基)甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊烷(127；3.20g，9mmol)的THF(50mL)溶液中。再搅拌10分钟后，用10分钟的时间滴加DMF(1.4mL)。将生成的反应混合物温热至室温，搅拌30min。然后将其用水终止，用EtOAc萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(石油醚∶EtOAc＝50∶1)纯化，得到(S)-4-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)-2-(三氟甲基)苯甲醛128(2.3g，84％)。
步骤3)(S)-2-(4-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(129)的制备
按照之前描述的相同的一般方法，将(S)-4-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)-2-(三氟甲基)苯甲醛128与2，3-二氨基苯甲酸1反应，制备(S)-2-(4-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸129。
步骤4)(R)-2-(4-(2，3-二羟基丙氧基)-2-(三氟甲基)苯基)-N-(吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物757)的制备
使用实施例25步骤5中所述的相同的反应顺序，将(S)-2-(4-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸129与2-氨基吡啶89反应，制备(R)-2-(4-(2，3-二羟基丙氧基)-2-(三氟甲基)苯基)-N-(吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物757)。MS(ESI)计算值：C23H19F3N5O4：472.14；实测值：473[M+H]。
实施例33.(S)-N-(3-(2，3-二羟基丙氧基)苯基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物725)的合成
步骤1)(R)-2，2-二甲基-4-((3-硝基苯氧基)甲基)-1，3-二氧杂环戊烷(132)的制备
将3-硝基苯酚(130；2.0g，14.37mmol)与无水碳酸钾(4.96g，35.93mmol)和(R)-4-(氯甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊烷(131；2.55mL，18.68mmol)一起溶于20mL的无水DMF中。将生成的反应混合物在微波反应器中在搅拌下于160℃加热4小时。将粗的反应混合物用水洗涤，过滤，用二氯甲烷(3x15mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过使用乙酸乙酯：戊烷洗脱的色谱法纯化，得到所需的产物132，为琥珀色油状物(52％)。
步骤2)(R)-3-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯胺(133)的制备
在氮气下，将Fe粉(2.38g，42.54mmol)和NH4Cl(2.38g，42.54mmol)混合，随后加入(R)-2，2-二甲基-4-((3-硝基苯氧基)甲基)-1，3-二氧杂环戊烷(132；1.8g，7.09mmol)和4∶1的异丙醇∶水(30mL∶10mL)的混合物。将反应混合物在回流下搅拌18小时。将粗物质通过Celite填料过滤，并将滤液在减压下浓缩。将生成的水层用二氯甲烷(3x15mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩，得到(R)-3-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯胺133(1.2g，79％产率)。该物质不需任何进一步纯化用于下一步骤中。
步骤3)(R)-N-(3-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰(134)的制备
将2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(3；75mg，0.24mmol)与(R)-3-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯胺(133；64.3mg，0.288mmol)和HATU(186mg，0.49mmol)一起溶于NMP(2mL)中。加入DIEA(81μL，0.49mmol)，将生成的反应混合物在室温下搅拌12小时。然后将温度升至60℃，将反应混合物再搅拌1小时。将反应混合物用水稀释并过滤。将收集的固体进一步通过硅胶色谱法纯化，得到所需的产物134，为黄色固体(51.5mg，42％)。
步骤4)(S)-N-(3-(2，3-二羟基丙氧基)苯基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物725)的制备
向(R)-N-(3-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(134；51.5mg，0.1mmol)在3mL的THF中的溶液中滴加4N HCl，直至观察到颜色改变，溶液变深，此时加入另外的1mL的HCL，并将溶液在室温下搅拌18小时。将反应混合物用MeOH稀释，然后在减压下浓缩。将生成的淡黄色悬浮液通过制备型HPLC纯化。得到所需的产物(化合物725)，为白色固体(32.5mg，64％)。MS(ESI)计算值：C24H20F3N3O4：471.14；实测值：472[M+H]。
实施例34.2-(3-(2，6-二甲基吗啉代)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物576)的合成
步骤1)2-(3-溴苯基)-1，3-二烷(136)的制备
将在甲苯(200mL)中含有3-溴苯甲醛(135；18.5g，100mmol)、丙-1，3-二醇(9.1g，120mmol)和TsOH(0.1g)的混合物在Dean-Stark水分离器中在回流下搅拌18小时。冷却至室温后，将混合物用5％的Na2CO3水溶液(200mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩，得到基本上定量产率的粗的2-(3-溴苯基)-1，3-二烷136，为黄色油状物(25g)。
步骤2)3-(2，6-二甲基吗啉代)苯甲醛(137)的制备
将在20mL的甲苯中含有2-(3-溴苯基)-1，3-二烷(136；2.0g，8.23mmol)、2，6-二甲基吗啉(122；1.14g，9.88mmol)、Pd2(dba)3(50mg)，NaOt-Bu(1.39g，14.0mmol)和BINAP(100mg)的混合物于回流下搅拌5小时。冷却至室温后，加入足够的冷的1N HCl(50mL)以调节pH＝1。将生成的反应混合物在室温下搅拌1小时。加入NaOH(水溶液)以调节pH＝11。将含水混合物用CH2Cl2(3x50mL)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)，在减压下浓缩。通过色谱法(石油醚∶EtOAc＝10∶1)纯化，得到3-(2，6-二甲基吗啉代)苯甲醛137，为黄色油状物(1.36g，产率：72％)。
步骤3)2-(3-((2，6-二甲基吗啉代)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(138)的制备
按照之前所述的相同的一般条件，将2，3-二氨基苯甲酸(1；0.94g，6.2mmol)和3-(2，6-二甲基吗啉代)-苯甲醛(137；1.36g，6.2mmol)进行反应，制备2-(3-((2，6-二甲基吗啉代)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸138，87％的产率(1.9g)。
步骤4)2-(3-(2，6-二甲基吗啉代)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物576)的制备
使用之前详述的相同的一般的酰胺偶合方法，由2-(3-((2，6-二甲基吗啉代)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸138和2-氨基噻唑4制备2-(3-(2，6-二甲基吗啉代)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物576)。MS(ESI)计算值：C23H25F2N5O3：433.16；实测值：434[M+H]。
实施例35.(R)-2-(2-(二氟甲基)苯基)-N-(3-(2，3-二羟基丙氧基)苯基)-6-氟-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物811)的合成
步骤1)5-氟-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)苯甲酸(140)的制备
将2-氨基-5-氟苯甲酸(139；1.0g，6.4mmol)溶于10mL的无水THF中，将生成的混合物冷却至0℃。然后在0℃下滴加2，2，2-三氟乙酸酐(3.6mL)。将生成的反应混合物在室温下搅拌16小时，然后在减压下浓缩。将残余物用冰冷却进行处理，将生成的沉淀过滤收集，用水洗涤并干燥，得到5-氟-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)苯甲酸140(1.3g，80％)。
步骤2)5-氟-3-硝基-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)苯甲酸(141)的制备
在0℃下，将5-氟-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)苯甲酸(140；1.29g，5.1mmol)以小份加入到发烟硝酸(7mL)中。将生成的反应混合物于0℃搅拌1小时，然后倒入到冰水(10mL)中。将生成的沉淀过滤收集，用水洗涤并干燥，得到5-氟-3-硝基-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)苯甲酸141(1.2g，80％)。
步骤3)2-氨基-5-氟-3-硝基苯甲酸(142)的制备
向5-氟-3-硝基-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)苯甲酸(141；1.2g，4.1mmol)的乙醇(20mL)溶液中加入10％氢氧化钠水溶液(20mL)。将生成的反应混合物于80℃搅拌3小时。冷却至室温后，将反应混合物在减压下浓缩。将生成的橙色固体用稀的HCl酸化，过滤并干燥，得到2-氨基-5-氟-3-硝基苯甲酸142(0.73g，90％)。
步骤4)2，3-二氨基-5-氟苯甲酸(143)的制备
将2-氨基-5-氟-3-硝基苯甲酸(142；0.73g)溶于甲醇(10mL)中。向该溶液中加入5％ Pd/C(0.1g)。将生成的反应混合物在1atm的氢气下于室温下搅拌18小时，然后通过Celite填料过滤。将滤液在减压下浓缩，得到2，3-二氨基-5-氟苯甲酸143，为褐色固体(0.59g，95％)。
步骤5)2-(2-(二氟甲基)苯基)-5-氟-1H-苯并[d]咪唑-7-甲酸(144)的制备
按照之前描述的相同的一般条件，将2，3-二氨基-5-氟苯甲酸(143；0.826g，5.29mmol)和2-(二氟甲基)苯甲醛144进行反应，制备2-(2-(二氟甲基)苯基)-5-氟-1H-苯并[d]咪唑-7-甲酸145，获得的产率为65％(0.7g)。MS(ESI)计算值：C15H9F3N2O2：306.6；实测值：307[M+H]。
步骤6)(S)-2-(2-(二氟甲基)苯基)-N-(3-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯基)-6-氟-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(147)的制备
按之前所述的方法，将2-(2-(二氟甲基)苯基)-5-氟-1H-苯并[d]咪唑-7-甲酸(145；250mg，0.82mmol)与(S)-3-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯胺146(按照实施例33，步骤1-2中对于133的方法进行制备，除了在步骤1)中使用(S)-4-(氯甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊烷)偶合。得到(S)-2-(2-(二氟甲基)苯基)-N-(3-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯基)-6-氟-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺147，48％的产率(200mg)。MS(ESI)计算值：C27H24F3N3O4：511.17；实测值：512[M+H]。
步骤7)(R)-2-(2-(二氟甲基)苯基)-N-(3-(2，3-二羟基丙氧基)苯基)-6-氟-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物811)的制备
将十滴浓HCl加入到(S)-2-(2-(二氟甲基)苯基)-N-(3-((2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基)苯基)-6-氟-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(147；200mg，0.391mmol)的甲醇(15mL)溶液中。将生成的反应混合物在室温下搅拌2小时，然后在减压下浓缩，得到(R)-2-(2-(二氟甲基)苯基)-N-(3-(2，3-二羟基丙氧基)苯基)-6-氟-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物811)(160mg，87％)。MS(ESI)计算值：C27H24F3N3O4：511.17；实测值：512[M+H]。
实施例36.2-(2-甲基吡啶-3-基)-N-(6-(吗啉代甲基)吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物814)的合成
步骤1)2-甲基烟碱醛(149)的制备
在-78℃下，向3-溴-2-甲基吡啶(148；10g，58.1mmol)的THF(150mL)溶液中加入n-BuLi(2.5M，25.6mL)。将反应混合物于该温度下搅拌1小时。然后加入DMF(1.30mL)，将生成的反应混合物于-78℃搅拌1小时。将该反应通过加入NH4Cl水溶液来终止。温热至室温后，将混合物用EtOAc萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法纯化，得到2-甲基烟碱醛149(2.18g，31％)。
步骤2)2-(2-甲基吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(150)的制备
在标准条件下，使用2-甲基烟碱醛(149；2.18g，18mmol)与2，3-二氨基苯甲酸1反应制备取代的苯并咪唑。通过使用色谱法纯化，得到所需的产物2-(2-甲基吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸150，随后由EtOAc重结晶(0.43g，11％)。
步骤3)2-(2-甲基吡啶-3-基)-N-(6-(吗啉代甲基)吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物814)的制备
按照之前详述的标准的酰胺偶合方法，将2-(2-甲基吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸150与6-吗啉代甲基吡啶-2-胺172(按照实施例29，步骤1-6中所述的进行制备，除了在步骤1)中使用6-氨基吡啶-2-甲酸乙酯)进行偶合，制备2-(2-甲基吡啶-3-基)-N-(6-(吗啉代甲基)吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物814)。MS(ESI)计算值：C24H24N6O2：428.20；实测值：429[M+H]。
实施例37.2-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(6-(吗啉代甲基)吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物815)的合成
步骤1)6-甲基烟碱醛(152)的制备
在-78℃下，向5-溴-2-甲基吡啶(151；10g，58.1mmol)的THF(150mL)溶液中加入n-BuLi(2.5M，25.6mL)。将反应混合物于该温度下搅拌1小时。然后加入DMF(1.30mL)，将生成的反应混合物于-78℃下搅拌1小时。将该反应通过加入NH4Cl水溶液来终止。温热至室温后，将混合物用EtOAc萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法纯化，得到6-甲基烟碱醛152(5.0g，72％)。
步骤2)2-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(6-(吗啉代甲基)吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物815)的制备
使用上述相同的标准条件，将6-甲基烟碱醛152与2，3-二氨基苯甲酸1进行偶合制备相应的取代的苯并咪唑153。使用相同的标准的酰胺偶合方法，将生成的2-(6-甲基吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸153与6-吗啉代甲基吡啶-2-胺172进行偶合，制备2-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(6-(吗啉代甲基)吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物815)。MS(ESI)计算值：C24H24N6O2：428.20；实测值：429[M+H]。
实施例38.2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(6-(吗啉代甲基)吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物816)的合成
步骤1)2-甲基异烟碱醛(156)的制备
在-78℃下，向2，4-二甲基吡啶(154；10g，93.3mmol)的THF(150mL)溶液中加入n-BuLi(2.5M，41.1mL)。然后在该温度下加入二乙胺(8.19g，112mmol)，随后加入DMF(10mL)。将生成的反应混合物于-78℃搅拌1小时。将该反应通过加入NH4Cl水溶液来终止。在温热至室温后，将混合物用CH2Cl2萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩，得到中间体烯胺155。
向NaIO4(40g)的水(200mL)溶液中加入上述烯胺中间体155的CH2Cl2(200mL)溶液。将反应混合物在室温下搅拌18小时。然后加入足够的2NNaOH以调节混合物的pH至8。然后将混合物过滤，分离，用CH2Cl2萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。通过色谱法纯化，得到2-甲基异烟碱醛156(4g，35％)。
步骤2)2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(6-(吗啉代甲基)吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物816)的制备
使用如上详述的相同的标准条件，将2-甲基异烟碱醛156与2，3-二氨基苯甲酸1进行偶合，制备2-(2-甲基吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸157，然后使用相同的标准的酰胺偶合方法，将其与6-吗啉代甲基吡啶-2-胺172进行偶合，制备2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(6-(吗啉代甲基)吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物816)。MS(ESI)计算值：C24H24N6O2：428.20；实测值：429[M+H]。
实施例39.2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物828)的合成
步骤1)2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(159)的制备
将2-(4-氯-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(54；500mg，1.46mmol)悬浮在CH2Cl2(15mL)中。加入甲醇(2mL)以增溶。向该反应溶液中滴加草酰氯(130μL，1.46mmol)。将该反应在室温下搅拌过夜后，将该反应浓缩。将残余物溶于EtOAc中，依次用饱和的NaHCO3，并然后用盐水洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶色谱法(EtOAc/戊烷)纯化，得到2-(4-氯-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸甲酯，为橙色固体(未示出结构)(390mg，产率：75％)。
将含有2-(4-氯-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸甲酯(390mg，1.10mmol)、1-三氟硼酸钾(potassium 1-trifluoroboratom)-乙基吡咯烷(158；212mg，1.11mmol)、Pd(OAc)2(22mg，0.03mmol)、XPhos(31mg，0.06mmol)和碳酸铯(1.0g，3.3mmol)的混合物的密封管抽真空并充入氮气两次。向混合物中加入THF/H2O(10∶1，4.4mL)。将悬浮液于80℃加热过夜，并冷却至室温。加入水(2mL)，并将该反应用CH2Cl2萃取两次。将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶色谱法(MeOH/CH2Cl2+1％ Et3N)纯化，得到2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸甲酯(未示出结构)，为黄色固体(544mg)。
将2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸甲酯(544mg)和LiOH(95mg，4mmol)溶于THF/H2O(1∶1，24mL)中。将该反应在室温下搅拌过夜，然后于50℃加热过夜。将溶剂真空除去。将残余物溶于水中，并使用1N HCl将pH调节至7-8。将混合物搅拌1小时后，过滤收集该固体，得到2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸159，为淡白色固体(170mg，2步产率：40％)。MS(ESI)计算值：C20H18F3N3O2：389.14；实测值：390[M+H]。
步骤2)2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物828)的制备
向2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(159；60mg，0.154mmol)、2-氨基噻唑(4；17mg，0.169mmol)和HATU(117mg，0.308mmol)的DMF(1.5mL)溶液中加入二异丙基乙胺(107μL，0.616mmol)。将该反应通过微波于140℃加热15分钟。将反应混合物用EtOAc稀释，依次用水和盐水洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤，并浓缩。通过制备型HPLC纯化，并随后用稀的HCl水溶液进行冷冻脱水，得到2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物828)的HCl盐，为棕黄色固体(24.3mg，产率：31％)。MS(ESI)计算值：C23H20F3N5OS：471.13；实测值：472[M+H]。
实施例40.N-(吡啶-2-基)-2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物838)的合成
使用上面实施例39中所述的相同的一般方法，将2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸159与2-氨基吡啶89进行偶合，制备N-(吡啶-2-基)-2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物838)。MS(ESI)计算值：C25H22F3N5O：465.18；实测值：466[M+H]。
实施例41.2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-N-(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物869)的合成
使用上面实施例39中所述的相同的一般方法，将2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸159与4-(吡咯烷-1-基甲基)苯胺160进行偶合，制备2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-N-(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物869)。MS(ESI)计算值：C31H32F3N5O：547.26；实测值：548[M+H]。
实施例42.2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-N-对-甲苯基-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物870)的合成
使用实施例39中所述的相同的一般方法，将2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸159与对氨基甲苯161进行偶合，制备2-(4-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-N-对-甲苯基-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物870)。MS(ESI)计算值：C27H25F3N4O：478.20；实测值：479[M+H]。
实施例43.2-(5-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物871)的合成
使用上面实施例39，步骤1和2中所述的相同的一般方法，除了使用2-(5-氯-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸163作为起始物，制备2-(5-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-N-(噻唑-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物871)。MS(ESI)计算值：C23H20F3N5OS：471.13；实测值：472[M+H]。
实施例44.N-(吡啶-2-基)-2-(5-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物872)的合成
使用上面实施例39，步骤1和实施例40中所述的相同的一般方法，除了使用2-(5-氯-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸163作为起始物，制备N-(吡啶-2-基)-2-(5-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物872)。MS(ESI)计算值：C25H22F3N5O：465.18；实测值：466[M+H]。
实施例45.2-(5-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-N-(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物873)的合成
使用上面实施例39，步骤1和实施例41中所述的相同的一般方法，除了使用2-(5-氯-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸163作为起始物制备2-(5-(吡咯烷-1-基甲基)-2-(三氟甲基)苯基)-N-(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物873)。MS(ESI)计算值：C31H32F3N5O：547.26；实测值：548[M+H]。
实施例46.2-(4-氯-2-(三氟甲基)苯基)-N-(6-吗啉代吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物868)的合成
步骤1)6-吗啉代吡啶-2-胺(165)的制备
将在DMSO(150mL)中含有4-氯-2-氨基吡啶(164；26g，0.20mol)、K2CO3(0.40mol)和吗啉(48；0.6mol)的混合物于190℃搅拌10小时。冷却至室温后，将反应混合物用水(300mL)稀释，将生成的混合物用乙酸乙酯(4x150mL)萃取。将合并的有机层用水(3x25mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下浓缩。将生成的残余物通过色谱法(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)纯化，得到6-吗啉代吡啶-2-胺165(17g，47％)，为白色固体。
步骤2)2-(4-氯-2-(三氟甲基)苯基)-N-(6-吗啉代吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物868)的制备
使用上述相同的一般的酰胺偶合方法，将6-吗啉代吡啶-2-胺165与2-(4-氯-2-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸54进行偶合，制备2-(4-氯-2-(三氟甲基)苯基)-N-(6-吗啉代吡啶-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(化合物868)。MS(ESI)计算值：C24H19ClF3N5O2：501.12；实测值：502[M+H]。
实施例47.生物活性
使用基于质谱的测定法来鉴定SIRT1活性的调节剂。该基于质谱的测定法利用如下的具有20个氨基酸残基的肽：Ac-EE-K(生物素)-GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG-K(5TMR)-EE-NH2(SEQ ID NO：1)，其中K(Ac)为乙酰化的赖氨酸残基，Nle为正亮氨酸。该肽在C端以荧光团(pluorephore)5TMR(激发540nm/发射580nm)标记。该肽底物的序列是以具有数处修饰的p53为基础的。此外，用正亮氨酸代替天然存在于序列中的甲硫氨酸残基，因为甲硫氨酸在合成及纯化期间，可能容易被氧化。
质谱测定法如下进行：将0.5μM肽底物和120μM βNAD+与10nMSIRT1在25℃在反应缓冲液(50mM Tris-乙酸盐pH 8，137mM NaCl，2.7mM KCl，1mM MgCl2，5mM DTT，0.05％BSA)中培养25分钟。可以将测试化合物加入上述的反应混合物中。将SirT1基因克隆到含有T7启动子的载体中，并将其转化到BL21(DE3)中。经与SIRT1培养25分钟后，加入10μL的10％甲酸以停止反应。密封反应混合物并冷冻用于后续的质谱分析。测定底物肽的质量能够精确地确定与脱乙酰化的肽(产物)相比的乙酰化(即起始物料)程度。
抑制沉默调节蛋白活性的对照实验如下进行：在反应开始时加入1μL的500mM烟酰胺作为阴性对照(例如允许测定的最大沉默调节蛋白的抑制)。活化沉默调节蛋白活性的对照实验如下进行：使用10nM的沉默调节蛋白，用1μL的DMSO代替化合物在测定法的线性范围内确定底物在给定时间点的脱乙酰化的量。该时间点与用于测试化合物的时间点相同，并且在线性范围内，端点表示速率改变。
对于上述测试，SIRT1蛋白按照如下方法进行表达并纯化。将SirT1基因克隆到含T7启动子的载体中，并将其转化到BL21(DE3)中。该蛋白质用1mM IPTG于18℃下诱导过夜进行表达，且表达的蛋白质为N-端His-tag融合蛋白质，并于30000×g下收获。用溶菌酶将细胞裂解在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM Tris[2-羧乙基]膦(TCEP)，10μM ZnCl2，200mM NaCl)中，并进一步以超声波处理10分钟以完全裂解。将蛋白质通过Ni-NTA柱(Amersham)纯化，并收集含有纯蛋白质的各级分，浓缩并经过分级柱(Sephadex S200 26/60球状)。收集含有可溶性蛋白质的峰，并通过离子交换柱(MonoQ)进行纯化。通过梯度溶液洗脱(200mM-500mM NaCl)得到纯蛋白质。将此蛋白质浓缩，并用透析缓冲液(20mM Tris-HCl，2mM TCEP)透析过夜。将蛋白质等分并冷冻在-80℃直到进一步使用。
使用如上所述的测定法鉴定活化的SIRT1的沉默调节蛋白的调节性化合物，并示于下面表1中。活化的化合物的EC1.5值以A(EC1.5≤1.0μM)、B(EC1.5 1-25μM)、C(EC1.5＞25μM)表示。活化最大百分比倍数(percentmaximum fold activation)由A(活化倍数＞200％)或B(活化倍数＜200％)表示。
表1
在另一个实施方案中，本发明的化合物选自上面表1中列出的下列编号中的任一化合物：202、203、208、226、243、247、254、262、269、287、288、289、290、295、300、302、304、312、313、315、316、317、319、321、323、327、328、340、343、344、345、346、354、356、357、358、359、360、361、362、368、369、370、371、372、376、377、379、380、381、382、394、395、396、398、399、409、411、412、413、414、430、432、440、446、448、451、452、455、456、457、458、461、464、465、478、479、480、481、492、493、494、495、514、515、516、531、540、541、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、573、574、575、589、590、591、592、593、594、595、596、601、603、604、620、622、623、628、629、630、631、640、641、642、643、644、645、646、647、672、674、675、677、678、679、680、681、689、690、691、692、698、699、700、701、706、717、718、719、720、721、722、723、724、725、734、735、736、737、740、741、742、743、744、745、746、749、751、767、768、769、770、774、775、776、782、785、786、789、798、811、817、818、819、820、824、825、827、829、831、832、833、834、836、839、840、841、845、847、849、851、852、853、854、855、862、863、865、866、867或868。
同等物
本发明尤其提供了沉默调节蛋白活化化合物及其使用方法。尽管已经讨论了主题发明的具体实施方案，但上述说明书是说明性的，不是限制性的。依据该说明书的综述，本发明的许多变化对本领域技术人员来说是显而易见的。本发明的全部范围应该参考权利要求书，以及其等同物，说明书以及其变体的全部范围来确定。
参考文献的引入
本文提到的所有出版物和专利(包括下面列出的那些条目)以它们的整体引入到本文中作为参考，如同每个单一的出版物或专利是具体地和单独地注明被引入作为参考那样。在出现矛盾的情况下，以本申请(包括本文任何定义)为准。
还以整体引入作为参考的是任何多核苷酸和多肽序列，参考与公共数据库的目录相互关联的登记号码，例如，由The Institute for GenomicResearch(TIGR)(www.tigr.org)和/或the National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov)保存的那些登记号码。

Claims (12)

1.式(II)的化合物或其盐： 
其中： 
Z11和Z12都为CR13，其中 
R13选自氢、卤素、-OH、-C≡N、氟取代的C1-C2烷基、-O-(氟取代的C1-C2烷基)、-S-(氟取代的C1-C2烷基)、C1-C4烷基、-(C1-C2烷基)-N(R14)(R14)、-O-CH2CH(OH)CH2OH、-O-(C1-C4)烷基、-O-(C1-C3)烷基-N(R14)(R14)、-N(R14)(R14)、-S-(C1-C4)烷基和C3-C7环烷基； 
R选自氢、-(C2-C4)烷基、-氟取代的(C1-C4)烷基， 
R4为氢； 
X选自： 其中 
代表X与R11键合的位置；和 
R15和R16独立地选自氢、C1-C4烷基； 
R11为杂环，其中R11任选被一至两个独立选自下列的取代基所取代：卤素、-C≡N、C1-C3烷基、氟取代的C1-C2烷基、=O、-O-C1-C4烷基、-(C1-C4烷基)-N(R14)(R14)、-N(R14)(R14)、和-C(O)-O-R14；其中 
每个R14独立地选自氢和-C1-C4烷基；或者 
两个R14与它们相连的氮原子一起形成4至8元饱和的杂环，其任选包含另一个选自下列的杂原子：N、S和O，其中： 
当R14为烷基时，该烷基任选被一个或多个-OH、-O-(C1-C4烷基)、氟、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2所取代，和 
当两个R14与它们相连的氮原子一起形成4至8元饱和的杂环时，该饱和的杂环在碳原子上任选被-C1-C4烷基或氟取代；并在任何可取代的氮原子上任选被-C1-C4烷基、氟取代的C1-C4烷基或-(CH2)2-O-CH3所取代；和 
R12选自含有至少五个环原子的碳环以及除了哌嗪、吲唑、三唑或吡唑并吡啶外的杂环，其中R12任选被一至两个独立地选自下列的取代基所取代：卤素、-C≡N、C1-C4烷基、C3-C7环烷基、氟取代的C1-C2烷基、-O-R14、-S(O)2-R14、-(C1-C4烷基)-N(R14)(R14)、-N(R14)(R14)、-O-(C2-C4烷基)-N(R14)(R14)、-O-苯基、苯基，和第二个杂环，并且当R12为苯基时，R12也任选被下列基团所取代：3，4-亚甲基二氧基，氟取代的3，4-亚甲基二氧基或-O-(饱和的杂环)，其中R12的任何苯基、饱和的杂环或第二个杂环取代基任选被下列取代基所取代：卤素；-C≡N；C1-C4烷基、氟取代的C1-C2烷基，其中： 
当X为每个Z11和Z12是CH，R11为任选取代的苯基，并且R和R4是H时，则R12不是吡啶基或喹啉基，
其中术语“碳环”指的是其中所有环原子是碳的环系，并且包括5-7元单环和8-12元双环，其中该单环或双环中的每一个独立地选自饱和环、不饱和环和芳香环； 
术语“杂环”指的是含有一个或多个选自N、O和S原子的杂原子的环系，并且包括4-7元单环和8-12元双环以及桥连的多环环系，其中该单环或双环中的每一个独立地选自饱和环、不饱和环和芳香环。 
2.权利要求1的化合物，其中X为
3.权利要求1的化合物，其中R11选自：
4.权利要求2的化合物，其中R11选自：
5.权利要求1至4中任一项的化合物，其中R12选自：
6.式(II)的化合物或其盐： 
其中： 
Z11和Z12都为CR13，其中 
R13选自氢、卤素、-OH、-C≡N、氟取代的C1-C2烷基、-O-(氟取代的C1-C2烷基)、-S-(氟取代的C1-C2烷基)、C1-C4烷基、-(C1-C2烷基)-N(R14)(R14)、-O-CH2CH(OH)CH2OH、-O-(C1-C4)烷基、-O-(C1-C3)烷基-N(R14)(R14)、-N(R14)(R14)、-S-(C1-C4)烷基和C3-C7环烷基； 
R选自氢、-(C2-C4)烷基、-氟取代的(C1-C4)烷基， 
R4为氢； 
X选自： 其中 
代表X与R11键合的位置；和 
R15和R16独立地选自氢和C1-C4烷基； 
R11选自：
每个R14独立地选自氢和-C1-C4烷基；或者 
两个R14与它们相连的氮原子一起形成4至8元饱和的杂环，其任选包含另一个选自下列的杂原子：N、S和O，其中： 
当R14为烷基时，该烷基任选被一个或多个-OH、-O-(C1-C4烷基)、氟、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2所取代，和 
当两个R14与它们相连的氮原子一起形成4至8元饱和的杂环时，该饱和的杂环在碳原子上任选被-C1-C4烷基或氟取代；并在任何可取代的氮原子上任选被-C1-C4烷基、氟取代的C1-C4烷基或-(CH2)2-O-CH3所取代；和 
R12选自含有至少五个环原子的碳环以及除了哌嗪、吲唑、三唑或吡唑并吡啶外的杂环，其中R12任选被一至两个独立地选自下列的取代基所取代：卤素、-C≡N、C1-C4烷基、C3-C7环烷基、氟取代的C1-C2烷基、-O-R14、-S(O)2-R14、-(C1-C4烷基)-N(R14)(R14)、-N(R14)(R14)、-O-(C2-C4烷基)-N(R14)(R14)、-O-苯基、苯基，和第二个杂环，并且当R12为苯基时，R12也任选被下列基团所取代：3，4-亚甲基二氧基，氟取代的3，4-亚甲基二氧基或-O-(饱和的杂环)，其中R12的任何苯基、饱和的杂环或第二个杂环取代基任选被下列取代基所取代：卤素；-C≡N；C1-C4烷基、氟取代的C1-C2烷基，其中： 
当X为每个Z11和Z12是CH，R11为任选取代的苯基，并且R和R4是H时，则R12不是吡啶基或喹啉基，
其中术语“碳环”指的是其中所有环原子是碳的环系，并且包括5-7元单环和8-12元双环，其中该单环或双环中的每一个独立地选自饱和环、不饱和环和芳香环； 
术语“杂环”指的是含有一个或多个选自N、O和S原子的杂原子的环系，并且包括4-7元单环和8-12元双环以及桥连的多环环系，其中该单环或双环中的每一个独立地选自饱和环、不饱和环和芳香环。 
7.权利要求6的化合物，其中X为
8.权利要求6或7的化合物，其中R12选自：
9.具有结构式III的化合物： 
其中： 
R3选自氢、氟、-OCH3和吗啉-4-基； 
R11选自：
R12选自： 并且 
当R11为或时，R12不是
10.权利要求9的化合物，其中R3为氢，R11为R12为 
11.药物组合物，其包含权利要求1至10中任一项的化合物或其药学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体。 
12.权利要求11的组合物在制备用于治疗患有或易患胰岛素耐受性、代谢综合征、糖尿病或其并发症的受治疗者或者增加受治疗者中胰岛素敏感性的药物中的用途。 
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