CN101757009B

CN101757009B - 三七皂苷Rgl在制备治疗肺间质纤维化药物中的应用

Info

Publication number: CN101757009B
Application number: CN2010100007356A
Authority: CN
Inventors: 詹合琴; 郭兰青; 张小毅; 尹雅玲; 海广范; 刘巨源; 刘俊扇
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2010-01-15
Filing date: 2010-01-15
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2030-01-15
Also published as: CN101757009A

Abstract

本发明提供了三七皂苷Rg1在制备治疗肺间质纤维化药物中的应用。本发明经药理试验验证，三七皂苷Rg1在体外能抑制人胚肺成纤维细胞的活性，有较好的剂量依赖性；体内能降低肺间质纤维化小鼠的肺系数和肺组织羟脯氨酸的含量；还能减轻肺间质纤维化小鼠的肺泡炎和肺间质纤维化程度；并且三七皂苷Rg1原料易得，能够通过常规方法制成各种常用剂型，如片剂、胶囊剂、注射剂等，制备方法简单。

Description

三七皂苷Rgl在制备治疗肺间质纤维化药物中的应用

技术领域

本发明涉及三七皂苷Rg1在制备治疗肺间质纤维化药物中的应用。

背景技术

特发性肺间质纤维化(Idiopathicpulmonary Fibrosis，IPF)是指不明原因引起的患者肺间质病变，以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱、最终导致肺间质纤维化为特征。肺间质纤维化常以呼吸功能永久丧失为最终结局，目前尚缺乏有效的防治手段，其严重威胁患者的生命和生活质量，急性患者病情发展迅速，即便是早期发现开始治疗，其5年生存率也很低；而慢性患者也大约只有15年左右的病程。

特发性肺间质纤维化和有明确病因的肺间质纤维化(如感染、毒物、药物、环境污染、粉尘等)的发病率和死亡率均较高，目前尚没有特效药物可用。我国肺间质纤维化的年发病率不详，但有年轻化和逐年增高的趋势，根据数地肺科医院的临床流行病学调查显示，肺间质纤维化的发病率每年约增加50％～60％，30岁以下的患者约占整个发病人群的10％。

近年来，特发性肺间质纤维化的临床治疗主要采用激素、免疫抑制剂、细胞毒类药物(如硫哇嚷吟、环磷酞胺等)和抗纤维化制剂(如秋水仙碱、D-青霉胺等)单用或联用，也尝试采用了一些中药、中草药和偏方治疗，但疗效几乎都没有确定性；而有些药物存在着严重的毒副作用(如激素类和细胞毒类药物等)。目前，对于肺间质纤维化的治疗及逆转其病理变化的发展还缺少可靠的药物，因此，研究和开发治疗肺间质纤维化的有效药物，对于改善患者的生存率和生存质量有着重要的社会和经济的双重价值。

三七是云南省盛产的名贵中药材，属五加科人参植物，目前已知三七中含有20多种不同成分，其中三七皂苷Rg1是主要成分之一。三七皂苷Rg1具有式I所示结构，分子量为801.01，水溶性好。

式I

本发明人在以往的研究中发现三七皂苷Rg1单体具有抗脑缺血、增加脑血流量、改善微循环和抗血栓等作用；近期又经研究发现该单体还具有良好的抗肺间质纤维化作用。我国IPF发病率较高，目前尚无完全有效的药物，而三七皂苷Rg1作用效果显著，副作用少，具有较强的发展前景。

发明内容

本发明的目的在于提供三七皂苷Rg1在制备治疗肺间质纤维化药物中的应用，特别是三七皂苷Rg1在制备治疗特发性肺间质纤维化药物中的应用。

本发明所述药物是指以三七皂苷Rg1为活性成分，与可药用载体制成的医疗上可接受的制剂，如片剂、胶囊剂及注射剂等。

其中，所述片剂按重量份计的配方为：三七皂苷Rg1100～300份、崩解剂8～150份、润滑剂5～15份；所述崩解剂为微晶纤维素(MCC)、低取代羟丙基纤维素或羧甲基淀粉钠；所述润滑剂为硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇。此外，还可以包括120～360份矫味剂，所述矫味剂为乳糖。

制备方法：将除润滑剂之外的原料混合均匀，用水润湿，过筛(16～20目)，干燥，然后再过筛(18～22目)，加入润滑剂，混合均匀后压片。

所述胶囊剂按重量份计的配方为：三七皂苷Rg1100～300份、润滑剂5～15份；所述润滑剂为硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇。此外，还可以包括矫味剂80～240份，所述矫味剂为乳糖。

制备方法：将除润滑剂之外的各种原料混合均匀，用水润湿，过筛(18～22目)，干燥，然后再次过筛(20～24目)，加入润滑剂，混合均匀后装入胶囊。

所述注射剂按重量份计的配方为：三七皂苷Rg1200～600份、氯化钠120～360份、注射用水500～1500份。

制备方法：将三七皂苷Rg1和氯化钠溶于注射用水中，搅拌溶解，过滤，在无菌条件下将滤液装入安瓶中。

本发明通过体外细胞试验以及小鼠体内试验，进一步说明了本发明的三七皂苷Rg1在制备治疗肺间质纤维化药物中的应用，特别是在制备治疗肺间质纤维化中的应用。

本发明的优点在于：

1、本发明提供了三七皂苷Rg1单体新的医疗用途，开拓了新的应用领域；三七皂苷Rg1单体对特发性肺间质纤维素化及各种原因所致肺间质纤维化均具有较好的治疗效果。

2、三七皂苷Rg1的药理作用明显，主要表现为：体外能抑制人胚肺成纤维细胞的活性，有较好的剂量依赖性；体内能降低肺间质纤维化小鼠的肺系数和肺组织羟脯氨酸的含量；还能减轻肺间质纤维化小鼠的肺泡炎和肺间质纤维化程度。

3、三七皂苷Rg1原料易得，且能够通过常规方法制成各种常用剂型，如片剂、胶囊剂、注射剂等，制备方法简单。

附图说明

图1为本发明中正常对照组的MRC-5细胞的形态。

图2～8依次为本发明中不同浓度(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L、320μmol/L)三七皂苷Rg1对MRC-5细胞作用24h后的细胞形态。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不用来限制本发明。

实施例1三七皂苷Rg1片剂的制备(1000片)

配方：三七皂苷Rg1(昆明制药厂，以下实施例均相同)100g、MCC 100g、硬脂酸镁5g。

制备方法：将三七皂苷Rg1、MCC混合均匀，用水润湿，然后过18目筛，干燥，再次过20目筛，然后加入硬脂酸镁，混合均匀，压片。

实施例2三七皂苷Rg1片剂的制备(1000片)

配方：三七皂苷Rg1100g、乳糖120g、羧甲基纤维素钠24g、硬脂酸镁5g。

制备方法：将三七皂苷Rg1、乳糖及羧甲基纤维素钠混合均匀，用水润湿，然后过18目筛，干燥，再次过20目筛，然后加入硬脂酸镁，混合均匀，压片。

实施例3三七皂苷Rg1胶囊剂的制备(1000粒)

配方：三七皂苷Rg1100g、乳糖80g、硬脂酸镁5g。

制备方法：将三七皂苷Rg1、乳糖混合均匀，用水润湿，然后过20目筛，干燥，再次过22目筛，然后加入硬脂酸镁，混合均匀，装入胶囊。

实施例4三七皂苷Rg1注射剂的制备(100瓶)

配方：三七皂苷Rg120g、氯化钠12g、注射用水1.5L。

制备方法：将三七皂苷Rg1、氯化钠溶于注射用水中，过滤，将滤液在无菌条件下装入安瓶中。

以下通过体外及体内药理实验，进一步说明本发明。

试验例1体外细胞实验

1、实验材料

1.1药品与试剂：胎牛血清(杭州四季青公司)、MEM培养液(Gibco公司)、胰酶(Gibco公司)、MTT(广州威佳生物科技有限公司)；三七皂苷Rg1(白色粉末，纯度＞98％，昆明制药厂)。

1.2供试细胞：人胚肺成纤维细胞(MRC-5细胞，上海中科院细胞库)。

MRC-5细胞在含有10％(体积百分数)新生小牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素的MEM培养液中贴壁生长，在37℃的温度下，5％(体积分数)CO₂的培养箱中培养，2天更换一次培养液，培养瓶铺满时用2.5g/L胰酶消化传代，细胞培养至对数期。

1.3仪器：CO₂培养箱(MCO-15AC，日本三洋)、Mk3型自动酶标仪(美国Thermro公司)、倒置显微镜(XDS-200D，上海蔡康光学仪器有限公司)。

1.4统计方法：采用SPSS-10进行统计学处理，计量资料均用x±s表示。

2、方法与结果

2.1配制三七皂苷Rg1药物原液：定量称取8.01mg(0.01mmol)三七皂苷Rg1，加入1mL MEM培养液，配制成1×10⁴μmol/L的三七皂苷Rg1药物原液，备用。

2.2MTT法测定三七皂苷Rg1对MRC-5细胞的抑制作用：取培养至对数生长期的MRC-5细胞，细胞计数约5×10³个/mL，接种于96孔板中，每孔液体100μL，细胞贴壁后倾去原液；然后加入含有0.5％(体积百分数)胎牛血清的MEM培养液，饥饿培养；24h后更换培养液，并加入药物原液，分别配制成终浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L和320μmol/L三七皂苷Rg1的七个不同浓度剂量组，同时设置正常细胞作为对照组(每组设置6个复孔)，继续培养24h；然后每孔加入15μL MTT，4h后倾去所有液体，加入115μL DMSO，使固体溶解，在37℃温度下静置0.5h；用自动酶标仪在570nm的波长下检测，630nm波长下参考；计算三七皂苷Rg1对MRC-5细胞抑制率和半数抑制浓度(IC₅₀)。

结果表明，三七皂苷Rg1对MRC-5细胞的IC₅₀为81.26μmol/L，抑制率结果如表1所示。

表1不同浓度的三七皂苷Rg1对MRC-5细胞的抑制率

注：抑制率＝(1-剂量组OD值/正常对照组OD值)×100％

2.3倒置显微镜下细胞形态学的观察：取培养至对数生长期的MRC-5细胞，细胞计数约1×10⁴个/mL，接种于96孔板中，每孔液体100μL，细胞贴壁后倾去原液；加入含0.5％(体积百分数)胎牛血清的MEM培养液，饥饿培养；24h后更换培养液，并加入三七皂苷Rg1药物原液，分别配制成终浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L和320μmol/L的三七皂苷Rg1七个不同浓度剂量组，同时设置正常细胞作为对照组(每组设置6个复孔)，继续培养24h后，在倒置显微镜下(10×20)拍照(如图1-8所示)。

观察结果表明：正常对照组(图1)和5μmol/L剂量组(图2)，MRC-5细胞呈条索状，细胞形态正常；10μmol/L剂量组(图3)和20μmol/L剂量组(图4)，MRC-5细胞部分变形，出现空泡、死亡；40μmol/L剂量组(图5)和80μmol/L剂量组(图6)，MRC-5细胞多数呈球形，细胞死亡明显；160μmol/L剂量组(图7)和320μmol/L剂量组(图8)，MRC-5细胞基本完全死亡，失去正常成纤维细胞形态。

体外实验结果表明，三七皂苷Rg1对MRC-5细胞具有抑制作用，且有良好的浓度依赖性。

试验例2小鼠体内试验

1、试验材料

1.1药品与试剂：三七皂苷Rg1(白色粉末，纯度＞98％，昆明制药厂)、博来霉素(BLM，日本化药株式会社)、强的松片(5mg/片，安阳玉威制药厂)、羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2供试动物：ICR小鼠，体重18～22g，共84只，随机分为正常对照组、模型组、阳性药物对照组(强的松)、三七皂苷Rg1高剂量组(100mg/kg)、中剂量组(50mg/kg)、低剂量组(25mg/kg)6组，每组14只。

1.3统计方法：采用SPSS-10进行统计学处理，计量资料均用x±s表示，采用方差分析，两两比较，方差齐者采用LSD法，方差不齐者采用Duttet法，P＜0.05者有显著性差异。

2、方法与结果

2.1肺间质纤维化模型的建立

采用BLM诱导法，按5mg/kg对ICR小鼠一次气管内给予博来霉素。

2.2给药方法

ICR小鼠于造模后第2天开始给药，正常对照组和模型组给予蒸馏水，三七皂苷Rg1高剂量组、中剂量组、低剂量组均按设置剂量给药，各组供试小鼠均按20mL/kg的容积进行腹腔注射；阳性对照组给予强的松，给药量6mg/kg，将药品溶解后，按20mL/kg灌胃给药；

实验药物均为每天给药1次，连续用药至所需天数。在用药后第7天处死一半小鼠，剩余小鼠于给药后第28天全部处死。

2.3肺系数测定

处死小鼠后打开胸腔，取全肺，用滤纸吸干血迹称体重和全肺重，按下式计算出肺系数，肺系数＝肺重(mg)/体重(g)。结果如表2所示。

表2三七皂苷Rg1用药7天后对小鼠肺系数的影响

注：^*P＜0.05，^**P＜0.01与模型组比较；^#P＜0.05，^##P＜0.01与阳性对照组比较；模型组与正常组比较^△P＜0.05，^△△P＜0.01

从表2可以看出：用药后7天，模型组与正常组比较有显著性差异(P＜0.01)，证明模型成功；三七皂苷Rg1中剂量组和高剂量组与模型组比较均有显著性差异(P＜0.01)，与阳性对照组比较也有显著性差异(P＜0.01)；结果表明，三七皂苷Rg1有良好的抗肺间质纤维化作用，且优于强的松。

2.4形态学研究

取右肺用10％甲醛溶液固定，取中肺叶制作肺组织病理标本，用石蜡冷冻两用切片机进行石蜡连续切片，间隔2张取1张，每个标本取4张切片，每2张为一组，分别进行HE和Masson染色，进行形态学观察和肺泡炎及肺间质纤维化评分。

2.4.1一般光镜观察正常组无肺泡炎及肺间质纤维化改变，肺泡结构完整；模型组肺泡壁破坏，形成肺大泡，部分实变，肺泡隔增宽明显，有纤维结缔组织增生，呈中重度肺间质纤维化改变，淋巴细胞浸润，病损范围广泛；阳性对照组肺泡隔增宽，有间质水肿，部分小鼠肺内有片状坏死，灶性脓肿，偶有纤维结缔组织增生，部分肺泡实变；三七皂苷Rg1组呈轻度肺间质纤维化改变，病损范围有限，少量淋巴细胞浸润。

2.4.2肺泡炎和肺间质纤维化程度评价HE染色和Masson染色后，进行光镜观察，根据以下判别标准，进行评分。肺泡炎和肺间质纤维化程度的判别标准(共4级)为：0级无明显改变；1级轻度改变，病变范围小于全肺的20％；2级中度改变，病变范围占全肺的20％～50％；3级重度改变，病变范围占全肺的50％以上。然后分别进行评分，0级计0分，1级计1分，以此类推；对每组小鼠分别评分，求平均值。结果如表3-4所示。

表3三七皂苷Rg1用药7天后对小鼠肺组织肺泡炎程度的影响

表4三七皂苷Rg1用药28天后对小鼠肺组织纤维化程度的影响

从表3-4可以看出，用药后7天肺泡炎程度和28天肺间质纤维化程度的模型组与正常组比较均有显著性差异(P＜0.01)，证明模型成功；用药后7天，三七皂苷Rg1中剂量组和高剂量组肺泡炎评分均低于与模型组，两者比较有显著性差异(P＜0.01)；用药后28天，三七皂苷Rg1中剂量组和高剂量组肺间质纤维化评分均低于与模型组，两者比较有显著性差异(P＜0.01)，与阳性对照药比较也有显著性差异(P＜0.05)；结果表明，三七皂苷Rg1能改善显著改善小鼠肺泡炎和肺间质纤维化的程度，有良好的抗肺间质纤维化作用，且效果优于强的松。

2.5肺组织羟脯氨酸(HyP)含量测定

用酸解法测定肺组织HyP含量，测定步骤按照试剂盒说明书进行。结果如表5所示。

表5三七皂苷Rg1用药28天后对小鼠肺组织羟脯氨酸含量的影响

从表5可以看出：模型组与正常组比较有显著性差异(P＜0.01)，证明模型成功；三七皂苷Rg1中剂量组和高剂量组均能降低羟脯氨酸含量与模型组比较均有显著性差异(P＜0.01)，与阳性对照药比较也有显著性差异(P＜0.01)；结果表明，三七皂苷Rg1有良好的抗肺间质纤维化作用，且效果优于强的松。

虽然，上文中已经通过一般性说明、具体实施方案以及活性实验等对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.三七皂苷Rg1作为唯一活性成分在制备治疗肺间质纤维化药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺间质纤维化为特发性肺间质纤维化。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物是指三七皂苷Rg1与可药用载体制成的片剂、胶囊剂及注射剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述片剂按重量份计的配方为：三七皂苷Rg1 100～300份、崩解剂8～150份、润滑剂5～15份；所述崩解剂为微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素或羧甲基淀粉钠；所述润滑剂为硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述片剂按重量份计的配方为：三七皂苷Rg1 100～300份、崩解剂8～150份、润滑剂5～15份、矫味剂120～360份；所述崩解剂为微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素或羧甲基淀粉钠；所述润滑剂为硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇；所述矫味剂为乳糖。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述胶囊剂按重量计的配方为：三七皂苷Rg1 100～300份、润滑剂5～15份；所述润滑剂为硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述胶囊剂按重量计的配方为：三七皂苷Rg1 100～300份、润滑剂5～15份、矫味剂80～240份；所述润滑剂为硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇；所述矫味剂为乳糖。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述注射剂按重量份计的配方为：三七皂苷Rg1 200～600份、氯化钠120～360份、注射用水500～1500份。