CN101724613B - 一种耐碱中温木聚糖酶xynam6及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐碱中温木聚糖酶XYNAM6及其基因和应用。本发明提供了一种来源于链霉菌属Streptomycesmegasporus DSM 41476的木聚糖酶XYNAM6，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述木聚糖酶的编码基因xynAM6。本发明的木聚糖酶的具有以下性质：最适pH5.5，最适温度70℃，比活为242.1U/mg；极好的蛋白酶抗性，有效的降低麦芽汁黏度以及易于工业化发酵生产。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于酿酒、食品、造纸、能源工业等。

Description

一种耐碱中温木聚糖酶XYNAM6及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐碱中温木聚糖酶XYNAM6及其基因、包含该基因的重组载体和应用。

背景技术

半纤维素由杂聚多糖组成，按组成主链占多数的糖来命名，称之为木聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖等。其中木聚糖是最具代表性的半纤维素，在硬木(15～30％)、软木(7～10％)及一年生植物(＜30％)中都大量存在(Collins et al.FEMS Microbiology Reviews.2005，29：3-23.)。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一类酶的总称，研究表明，在饲料中添加木聚糖酶，可以有效破坏木聚糖分子中的共价交联，显著降低阿拉伯木聚糖分子大小，从而降低食糜的粘度，改善饲料性能，降低因粘度增加而引起的抗营养作用(刘强和冯学琴，动物营养学报.1999，11：6-11.)。木聚糖酶在造纸工业的重要性在于它能够减少或取代有毒化学物质的使用。在酿酒工业中，木聚糖酶可以促进啤酒的澄清，提高烧酒、清酒的发酵效率和酒精产量(Ogasawara et al.J Brew Soc Jpn.1991，86：304-307.)。

链霉菌属于放线菌目的一个大属，广泛分布于有机物丰富、酸度和含水量适中的土壤中。链霉菌是最重要的抗生素生产菌，例如用于生产链霉素、四环素、红霉素、新霉素、卡那霉素和井冈霉素等。链霉菌还能产生多种具有生物活性的酶系，如：木聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶、几丁质酶等。目前已有一些链霉菌来源的木聚糖酶基因已经得到克隆并实现了异源表达(Li et al.Applied Microbiology andBiotechnology.2008，80：231-240)。

尽管如此，由于不同工业对木聚糖酶性质需求不同，因此，获得新型具有优良特性木聚糖酶的研究仍具有重大意义。克隆和分离具有耐碱中温的木聚糖酶可以更好的应用于酿酒，食品和造纸工业。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的耐碱中温木聚糖酶。

本发明的再一目的是提供编码上述耐碱中温木聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述耐碱中温木聚糖酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述耐碱中温木聚糖酶的应用。

本发明从链霉菌(Streptomyces megasporus DSM 41476)(购于德国微生物菌种保藏中心，其保藏号为：DSM 41476)中分离得到一种新的耐碱中温木聚糖酶XYNAM6。

本发明提供了一种耐碱中温木聚糖酶XYNAM6，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MRSHRVRTVRRLTRAVVAVSAAAATLAFGLAGTSQAAAPTLREAADATGRFIGTAVNDGLLNNSTYRNIAASEFDSVTAENAMKWEAVEPQRGQYNWAGGDRLVQFAQQNDQLVYGHTLVWHSQMPQWLQNGSFSNSELRTIMTDHVTTQVGRYRGDVQRWDVVNEAFNEDGSLRQSKFYQQLGESYIADAFRAARAADPNAKLFINDYNTEVRNAKSDGLFRLVQRLKSQGVPIDGVGFQNHLIVGNVNGSAIQQNLQRFADLGLEVVITELDIRMRTPSDSSKLQQQARDYRAVADACLAVSACSGITVWGISDRDSWVPDTFPGEGDACPWDGNYQPKPAYHALLTAFTDAAGDPGGPGEDPEDPEDPGEPGTGSCTAVFTVANRWATGSVVNVTVRTTQALNGWRAEFDLPSGVTVANGWNGGFSQSGARVTVTNAAYNGTVAAGGTFSFGFQTNGGAAQDGTAVSLGGQRCAAG

其中，该酶基因编码479个氨基酸，N端36个氨基酸为其预测的信号肽序列“mrshrvrtvrrltravvavsaaaatlafglagtsqa”(SEQ ID NO.3)。

因此，成熟的耐碱中温木聚糖酶XYNAM6的理论分子量为47.6kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

AAPTLREAADATGRFIGTAVNDGLLNNSTYRNIAASEFDSVTAENAMKWEAVEPQRGQYNWAGGDRLVQFAQQNDQLVYGHTLVWHSQMPQWLQNGSFSNSELRTIMTDHVTTQVGRYRGDVQRWDVVNEAFNEDGSLRQSKFYQQLGESYIADAFRAARAADPNAKLFINDYNTEVRNAKSDGLFRLVQRLKSQGVPIDGVGFQNHLIVGNVNGSAIQQNLQRFADLGLEVVITELDIRMRTPSDS SKLQQQARDYRAVADACLAVSACSGITVWGISDRDSWVPDTFPGEGDACPWDGNYQPKPAYHALLTAFTDAAGDPGGPGEDPEDPEDPGEPGTGSCTAVFTVANRWATGSVVNVTVRTTQALNGWRAEFDLPSGVTVANGWNGGFSQSGARVTVTNAAYNGTVAAGGTFSFGFQTNGGAAQDGTAVSLGGQRCAAG

本发明的木聚糖酶XYNAM6在中性和碱性范围内均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本发明筛选到Streptomyces megasporus DSM 41476所产生的木聚糖酶，其最适pH值为5.5，在pH5.0～9.0的范围内维持50％以上的酶活性；最适温度为70℃，在50℃-80℃间均具有60％以上的酶活力；用胰蛋白、α-糜蛋白酶、蛋白酶K和枯草杆菌溶素A处理60分钟，酶活性维持在80％。

本发明提供了编码上述耐碱中温木聚糖酶xynAM6。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.4所示：

atgaggtcacaccgtgtacgcaccgtacgtcgtttaaccagagccgtcgtagccgtgtccgcggcggcggccaccctggccttcggtctcgccggcacgagccaggccgccgcccccaccctgcgggaggcggccgacgccaccggccgcttcatcggcacggcggtcaacgacgggctgctgaacaacagcacctaccggaacatcgccgcgagcgagttcgacagcgtcaccgccgagaacgccatgaagtgggaggcggtcgagccgcagcgcggccagtacaactgggccggcggcgaccggctggtgcagttcgcccagcagaacgaccaactcgtctacggccacaccctggtctggcacagccagatgccccagtggctgcagaacggctcgttctccaacagcgagctgcgcaccatcatgactgaccacgtcaccacccaggtcggtcgctaccgcggcgacgtccagcgctgggacgtggtcaacgaggcgttcaacgaggacggcagcctcaggcagagcaagttctaccagcagctcggcgagtcctacatcgccgacgccttccgggccgcccgcgccgcggacccgaacgccaagctcttcatcaacgactacaacaccgaggtccgcaacgcgaagagcgacggcctgttccggctggtgcagcggctgaagtcccagggcgtgcccatcgacggggtcggcttccagaaccacctcatcgtcggcaacgtgaacggctccgcgatccagcagaacctccagcgcttcgccgacctgggcctggaggtcgtgatcaccgagctggacatccggatgcggacgccctccgacagctccaagctccagcagcaggcccgggactaccgggcggtggccgacgcctgcctggcggtctccgcctgctccggcatcaccgtctggggcatcagcgaccgcgactcctgggtgccggacaccttccccggcgagggcgacgcctgtccctgggacggcaactaccagcccaagcccgcctaccacgcgctgctgaccgccttcaccgacgcagccggcgaccccggcggcccgggcgaggacccggaggatccggaggacccgggcgagcccggcaccggaagctgcaccgccgtcttcaccgtcgccaaccgctgggccaccggctcggtcgtcaacgtcaccgtccgcaccacccaggccctgaacggctggcgcgcggagttcgacctgccgtcgggcgtgaccgtggccaatggctggaacggaggcttctcccagagcggcgcccgcgtcaccgtcaccaacgccgcctacaacggcacggtcgcggccggcgggacgttctccttcggcttccagaccaacggcggcgcggcccaggacggcaccgccgtcagcctcggcggccagaggtgcgccgcgggctga

本发明通过PCR的方法分离克隆了木聚糖酶基因xynAM6，DNA全序列分析结果表明，木聚糖酶XYNAM6结构基因XYNAM6全长1440bp。其中，信号肽的碱基序列为：

ATGAGGTCACACCGTGTACGCACCGTACGTCGTTTAACCAGAGCCGTCGTAGCCGTGTCCGCGGCGGCGGCCACCCTGGCCTTCGGTCTCGCCGGCACGAGCCAGGCC(SEQ ID NO.6)。

成熟的木聚糖酶XYNAM6的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.5

gccgccccca ccctgcggga ggcggccgac gccaccggcc gcttcatcgg cacggcggtc aacgacgggctgctgaacaa cagcacctac cggaacatcg ccgcgagcga gttcgacagcgtcaccgccg agaacgccatgaagtgggag gcggtcgagc cgcagcgcgg ccagtacaactgggccggcg gcgaccggct ggtgcagttcgcccagcaga acgaccaact cgtctacggccacaccctgg tctggcacag ccagatgccc cagtggctgcagaacggctc gttctccaacagcgagctgc gcaccatcat gactgaccac gtcaccaccc aggtcggtcgctaccgcggcgacgtccagc gctgggacgt ggtcaacgag gcgttcaacg aggacggcagcctcaggcagagcaagttct accagcagct cggcgagtcc tacatcgccg acgccttccgggccgcccgcgccgcggacc cgaacgccaa gctcttcatc aacgactaca acaccgaggtccgcaacgcgaagagcgacg gcctgttccg gctggtgcag cggctgaagt cccagggcgtgcccatcgacggggtcggct tccagaacca cctcatcgtc ggcaacgtga acggctccgc gatccagcag aacctccagcgcttcgccga cctgggcctg gaggtcgtga tcaccgagct ggacatccgg atgcggacgc cctccgacagctccaagctc cagcagcagg cccgggacta ccgggcggtg gccgacgcct gcctggcggt ctccgcctgctccggcatca ccgtctgggg catcagcgac cgcgactcct gggtgccgga caccttcccc ggcgagggcgacgcctgtcc ctgggacggc aactaccagc ccaagcccgc ctaccacgcg ctgctgaccg ccttcaccgacgcagccggc gaccccggcg gcccgggcga ggacccggag gatccggagg acccgggcga gcccggcaccggaagctgca ccgccgtctt caccgtcgcc aaccgctggg ccaccggctc ggtcgtcaac gtcaccgtccgcaccaccca ggccctgaac ggctggcgcg cggagttcga cctgccgtcg ggcgtgaccg tggccaatggctggaacgga ggcttctccc agagcggcgc ccgcgtcacc gtcaccaacg ccgcctacaa cggcacggtcgcggccggcg ggacgttctc cttcggcttc cagaccaacg gcggcgcggc ccaggacggc accgccgtcagcctcggcgg ccagaggtgc gccgcgggct ga

成熟蛋白理论分子量为47.6kDa，将木聚糖酶基因xynAM6 cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Thermomonosporaalba ULJB1的木聚糖酶氨基酸序列一致性为50.5％。说明XYNAM6是一种新的木聚糖酶。

本发明还提供了包含上述耐碱中温木聚糖酶基因xynAM6的重组载体，优选为pPIC-xynAM6。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-xynAM6。

本发明还提供了包含上述耐碱中温木聚糖酶基因xynAM6的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/xynAM6。

本发明还提供了一种制备耐碱中温木聚糖酶XYNAM6的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYNAM6。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/xynAM6。

本发明还提供了上述耐碱中温木聚糖酶XYNAM6的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在酿酒、食品、造纸工业中应用新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适pH为5.5，在pH5.0～9.0都有较高的酶活性；pH稳定性好；具有极好的抗蛋白酶的能力。其耐碱中温性，可使其在需求碱性高温环境的工业生产上应用。本木聚糖酶可应用于酿酒工业，降低物料粘度，可以有利于淀粉酶作用于淀粉层，提高淀粉利用率，增加酒精的产率。还可以将造纸工业废料及农业废弃物中的木聚糖可被转化为D-木糖单体，而D-木糖又可被细菌、酵母及真菌转化成有价值的燃料。因此，本木聚糖酶在能源工业中的应用也显示出其巨大的潜力。水解产物(木糖和低聚木糖)可应用在食品行业，作为增稠剂、脂肪代替物和抗冻食品添加剂；在制药工业中木聚糖与其它物质结合使用，可以延缓药物成分的释放。

附图说明

图1在毕赤酵母菌中表达的重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1：低分子量蛋白质Marker；2：纯化的重组木聚糖酶3：含有木聚糖酶基因的毕赤酵母菌培养上清液浓缩液；

图2重组木聚糖酶的最适pH。

图3重组木聚糖酶的pH稳定性。

图4重组木聚糖酶的最适温度。

图5重组木聚糖酶的热稳定性。

本发明从链霉菌(Streptomyces megasporus DSM 41476)(购于德国微生物菌种保藏中心，其保藏号为：DSM 41476)。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从链霉菌(Streptomyces megasporus DSM 41476)(购于德国微生物菌种保藏中心，其保藏号为：DSM 41476)。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)链霉菌Streptomyces megasporus DSM 41476培养基为改良的高氏培养基：可溶性淀粉20g/L，KNO₃ 1g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，琼脂15g/L，蒸馏水配制，pH7.2～7.4。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl，pH7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％ Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1 链霉菌Streptomyces megasporus DSM 41476产酶特性

将链霉菌Streptomyces megasporus DSM 41476经改良的高氏培养基培养后，涂布于产酶培养基((NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.01g/L，CaCl₂ 0.2g/L，木聚糖10g/L，琼脂糖15g/L，pH6.0)平板上，30℃培养1～2d，在产酶培养基平板可见透明圈产生。证明其具有木聚糖酶活性。

实施例2 链霉菌Streptomyces megasporus DSM 41476木聚糖酶编码基因xynAM6的克隆

提取链霉菌Streptomyces megasporus DSM 41476基因组DNA：

将在培养基中培养了二天的菌液10,000rpm离心10分钟，称取50mg菌泥加500μL无菌水清洗，离心取沉淀的菌体。沉淀的菌体重悬于500μL溶菌酶混合液，37℃温育1小时，再补加酶液100μL于45℃继续保温30分钟，至菌液透明后，加10％SDS至终浓度2％，搅拌约5分钟至菌液粘度显著下降，13,000rpm离心10分钟去碎片。上清液分别用等体积酚，酚:氯仿，氯仿依次抽提。取上层溶液加0.6～1倍体积的异丙醇常温沉淀10分钟。13,000rpm离心15分钟。沉淀用70％乙醇清洗，稍离心，将沉淀抽干后用30μL无菌水溶解，备用。

根据第十家族木聚糖酶基因的保守(WDVVNE和I(L)TELDI)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1：5′-TGGGACGTSGTSAACGAG-3′；

P2：5′-GGATGTCSAGYTCSGTGA-3′)。

以链霉菌Streptomyces megasporus DSM 41476总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约342bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1，usp2，usp3(上游特异性引物)，dsp1，dsp2，dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.木聚糖酶XYNAM6 TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。拼接后XYNAM6木聚糖酶基因全长1440bp，编码479个氨基酸和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明N端36个氨基酸为预测的信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为47.6kDa。

实施例3 重组木聚糖酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码木聚糖酶的基因xynAM6双酶切(EcoRI+NotI)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Streptomyces megasporus DSM 41476木聚糖酶基因xynAM6的重组质粒pPIC-xynAM6并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/xynAM6。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定木聚糖酶的活力。重组木聚糖酶的表达量为23.2U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。重组木聚糖的比活为242.1U/mg。

实施例4 重组木聚糖酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH5.5，70℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例5 重组木聚糖酶XYNAM6的性质测定

1、重组木聚糖酶XYNAM6的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例4纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中70℃下进行木聚糖酶活力测定。结果(图2)表明，重组酶XYNAM6的最适pH为5.5，在pH5.0～9.0有50％以上的相对酶活性。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH5.5缓冲液体系中70℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明木聚糖酶在pH 4.0-12.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在80％以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。

2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在70℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明其最适温度为70℃。酶的热稳定性性试验表明(图5)，在50～80℃的温度范围内进行酶促反应时能保持60％以上的活性。XYNAM6有良好的热稳定性，在60℃下温育1h，酶活没有损失，在70℃下温育1h，能保持60％以上的酶活。

3、木聚糖酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的木聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.5)缓冲液体系中，70℃下测定酶活性，计算出其在70℃下的K_m值。经测定，以燕麦木聚糖和桦木木聚糖为底物时的K_m值分别为1.68和2.33mg/mL，最大反应速度V_max分别为346.4和322.7μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对XYNAM6酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1和10mmol/L。在70℃、pH5.5条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂在浓度为1mmol时重组木聚糖酶的活力没有明显变化。但是Ag⁺、Hg²⁺几乎可以完全抑制其活力，而SDS也强烈抑制其活力。当Cu²⁺，Cr³⁺，Zn²⁺，and Pb²⁺浓度为10mmol时可以部分抑制XYNAM6酶活力。β-巯基乙醇在10mmol时能分别使重组酶活力增加到原来的1.4倍。

5、木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力测定如下：

用pH 7.00.1mol/L Tris-HCl将胰蛋白酶、α-糜蛋白酶配成1mg/mL的溶液；用pH7.5 0.1mol/L Tris-HCl将蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶A配成1mg/mL的溶液。将纯化的木聚糖酶与蛋白酶按10∶1(w/w)在配制蛋白酶溶液的缓冲液中处理1和2h后，按标准方法在最适温度和最适pH下检测已处理酶的剩余酶活。对照酶液用配制蛋白酶液的相应缓冲液处理相同的时间，以其酶活作为对照计算相对酶活。经过各种蛋白酶处理的XYNAM6酶活力变化结果表明，用不同的酶蛋白在最适反应温度下处理1h后XYNAM6的剩余酶活力为：94.2％(胰蛋白酶)，87.8％(α-糜蛋白酶)，95.3％(蛋白酶K)和86.3％(枯草杆菌溶素A)；当处理2h时酶活力还可保留80％以上。从以上结果可以看出：XYNAM6对这四种蛋白酶都有良好的抵抗能力。

6、木聚糖酶降解燕麦木聚糖产物的分析如下：

在500μL 1％的木聚糖中加入100μL纯化的酶液，最适温度下保温3～4h。用无水乙醇将酶蛋白沉淀，上清液用2500色谱仪，利用高效阴离子交换色谱-脉冲安培(HPAEC-PAD)检测方法，进行产物中糖种类的分析。分析结果表明：木聚糖酶XYNAM6降解燕麦木聚糖的产物主要是木糖，木二糖，和木三糖。产物中木糖含量为34.45％，木二糖含量为57.37％，木三糖的含量为8.18。降解桦木木聚糖的产物主要是木糖和木二糖。产物中木糖含量为39.20％，木二糖含量为60.80％。

7、添加木聚糖酶对大麦麦芽汁黏度和过滤速度的影响

大麦麦芽经粉碎机处理，过0.2mm筛网，溶于100mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。添加40或80U的重组木聚糖酶XYNAM6。然后分别在45、50、和60℃处理30min，70℃处理1h，最后煮沸5min灭活。实验对照为不添加木聚糖酶。用滤纸测定其过滤速度。取5ml过滤液用黏度剂测定其黏度数值。结果表明，添加40U的酶液处理，其与对照比较，过滤速度和黏度分别降低26.73％和25.58％；当酶量添加到80U，过滤速度和黏度下降的更多，分别为36.33％和35.51％。

序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>一种耐碱中温木聚糖酶XYNAM6及其基因和应用

<160>6

<210>1

<211>479

<212>PRT

<213>链霉菌(Streptomyces megasporus)

<400>1

MRSHRVRTVR RLTRAVVAVS AAAATLAFGL AGTSQAAAPT LREAADATGR

FIGTAVNDGL     60

LNNSTYRNIA ASEFDSVTAE NAMKWEAVEP QRGQYNWAGG DRLVQFAQQN

DQLVYGHTLV     120

WHSQMPQWLQ NGSFSNSELR TIMTDHVTTQ VGRYRGDVQR WDVVNEAFNE

DGSLRQSKFY     180

QQLGESYIAD AFRAARAADP NAKLFINDYN TEVRNAKSDG LFRLVQRLKS

QGVPIDGVGF     240

QNHLIVGNVN GSAIQQNLQR FADLGLEVVI TELDIRMRTP SDSSKLQQQA

RDYRAVADAC     300

LAVSACSGIT VWGISDRDSW VPDTFPGEGD ACPWDGNYQP KPAYHALLTA

FTDAAGDPGG     360

PGEDPEDPED PGEPGTGSCT AVFTVANRWA TGSVVNVTVR TTQALNGWRA

EFDLPSGVTV     420

ANGWNGGFSQ SGARVTVTNA AYNGTVAAGG TFSFGFQTNG GAAQDGTAVS

LGGQRCAAG      479

<210>2

<211>443

<212>PRT

<213>链霉菌(Streptomyces megasporus)

<400>2

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AVEPQRGQYN      60

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QTNGGAAQDG TAVSLGGQRC AAG            443

<210>3

<211>36

<212>PRT

<213>链霉菌(Streptomyces megasporus)

<400>3

MRSHRVRTVR RLTRAVVAVS AAAATLAFGL AGTSQA          36

<210>4

<211>1440

<212>DNA

<213>链霉菌(Streptomyces megasporus)

<400>4

atgaggtcac accgtgtacg caccgtacgt cgtttaacca gagccgtcgt agccgtgtcc    60

gcggcggcgg ccaccctggc cttcggtctc gccggcacga gccaggccgc cgcccccacc    120

ctgcgggagg cggccgacgc caccggccgc ttcatcggca cggcggtcaa cgacgggctg    180

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aacgccatga agtgggaggc ggtcgagccg cagcgcggcc agtacaactg ggccggcggc    300

gaccggctgg tgcagttcgc ccagcagaac gaccaactcg tctacggcca caccctggtc    360

tggcacagcc agatgcccca gtggctgcag aacggctcgt tctccaacag cgagctgcgc    420

accatcatga ctgaccacgt caccacccag gtcggtcgct accgcggcga cgtccagcgc    480

tgggacgtgg tcaacgaggc gttcaacgag gacggcagcc tcaggcagag caagttctac    540

cagcagctcg gcgagtccta catcgccgac gccttccggg ccgcccgcgc cgcggacccg    600

aacgccaagc tcttcatcaa cgactacaac accgaggtcc gcaacgcgaa gagcgacggc    660

ctgttccggc tggtgcagcg gctgaagtcc cagggcgtgc ccatcgacgg ggtcggcttc    720

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tccgacagct ccaagctcca gcagcaggcc cgggactacc gggcggtggc cgacgcctgc    900

ctggcggtct ccgcctgctc cggcatcacc gtctggggca tcagcgaccg cgactcctgg    960

gtgccggaca ccttccccgg cgagggcgac gcctgtccct gggacggcaa ctaccagccc    1020

aagcccgcct accacgcgct gctgaccgcc ttcaccgacg cagccggcga ccccggcggc    1080

ccgggcgagg acccggagga tccggaggac ccgggcgagc ccggcaccgg aagctgcacc    1140

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accacccagg ccctgaacgg ctggcgcgcg gagttcgacc tgccgtcggg cgtgaccgtg    1260

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<210>5

<211>1332

<212>DNA

<213>链霉菌(Streptomyces megasporus)

<400>5

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aacgacgggc tgctgaacaa cagcacctac cggaacatcg ccgcgagcga gttcgacagc    120

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<210>6

<211>108

<212>DNA

<213>链霉菌(Streptomyces megasporus)

<400>6

atgaggtcac accgtgtacg caccgtacgt cgtttaacca gagccgtcgt agccgtgtcc    60

gcggcggcgg ccaccctggc cttcggtctc gccggcacga gccaggcc                 108

Claims (9)

1.一种耐碱中温木聚糖酶XYNAM6，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种耐碱中温木聚糖酶基因xynAM6，其特征在于，编码权利要求1所述的耐碱中温木聚糖酶XYNAM6。

3.如权利要求2所述的耐碱中温木聚糖酶基因xynAM6，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

4.如权利要求2所述的耐碱中温木聚糖酶基因xynAM6，其特征在于，所述耐碱中温木聚糖酶基因xynAM6包括信号肽序列，所述序列如SEQ ID NO.6所示。

5.包含权利要求2所述耐碱中温木聚糖酶基因xynAM6的重组载体。

6.包含权利要求2所述耐碱中温木聚糖酶基因xynAM6的重组载体pPIC-xynAM6，其特征在于，所述载体通过以下方法构建：

将表达载体pPIC9用EcoRI+NotI双酶切，同时将耐碱中温木聚糖酶基因xynAM6用EcoRI和NotI双酶切，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有木聚糖酶基因xynAM6的重组质粒pPIC-xynAM6。

7.包含权利要求2所述耐碱中温木聚糖酶基因xynAM6的重组菌株。

8.一种制备耐碱中温木聚糖酶XYNAM6的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求5的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYNAM6。

9.权利要求1所述耐碱中温木聚糖酶XYNAM6在酿酒，食品和造纸工业的应用。 

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