CN101641368A - 高纯度可溶性血栓调节蛋白的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明的课题是得到实质上不含有能够在酸性下生成的可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白。根据本发明，提供可溶性血栓调节蛋白的制造方法，该方法是由含有或疑似含有能够在酸性下生成的可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白含有物制造实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的方法，该方法包括如下工序：将该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石；在能够分离该可溶性血栓调节蛋白的变性体的分离条件下进行线性或分段、或者线性和分段的组合的盐浓度的梯度洗脱，通过预先确认来得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分，或者通过一边确认洗脱级分，一边得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分。

Description

高纯度可溶性血栓调节蛋白的制造方法

技术领域

本发明涉及实质上不含有能够在酸性下生成的可溶性血栓调节蛋白的变性体的高纯度可溶性血栓调节蛋白的制造方法。

技术背景

血栓调节蛋白作为通过与凝血酶特异性结合来阻断凝血酶的血液凝固活性，同时显著促进凝血酶的蛋白C活化能的物质而被已知，还已知其具有强力的血液凝固阻断作用。已知其延长基于凝血酶作用的凝固时间以及抑制基于凝血酶作用的血小板聚集。蛋白C是在血液凝固-纤溶系统中起到重要的作用的维生素K依赖性的蛋白质，在凝血酶的作用下被活化，而成为活化蛋白C。已知该活化蛋白C在生物体内使血液凝固系统因子的活性型第V因子以及活性型第VIII因子失活，并且还已知其参与具有血栓溶解作用的纤溶酶原激活剂的产生(非专利文献1)。因此认为，血栓调节蛋白利用该凝血酶来促进蛋白C的活化，作为抗血液凝固剂或血栓溶解剂是有用的，另外还有动物实验的报告指出血栓调节蛋白在伴随凝固亢进的疾病的治疗、预防中是有效的(非专利文献2)。

以往，血栓调节蛋白是作为在以人为首的各种动物种的血管内皮细胞上表达的糖蛋白质而被发现得到的，其后，克隆成功。即，利用基因工程方法，从人肺cDNA文库中对含有信号肽的人血栓调节蛋白前体的基因进行克隆，并且对血栓调节蛋白的全基因序列进行解析，解明含有信号肽(通常例举出18个氨基酸残基)的575个残基的氨基酸序列(专利文献1)。信号肽被切断的成熟血栓调节蛋白由以下5个区域构成：从其成熟肽的N末端侧起的N末端区域(1-226号：表示认为信号肽为18个氨基酸残基时的位置，下同)、具有6个EGF样结构的区域(227-462号)、O型糖链增加区域(463-498号)、膜贯通区域(499-521号)、以及细胞质内区域(522-557号)，并且作为具有与全长的血栓调节蛋白相同的活性的部分(即最小活性单元)，已知在具有6个EGF样结构的区域之中主要是由从N末端侧起的第4、5、6号的EGF样结构构成的部分(非专利文献3)。

全长的血栓调节蛋白如果没有表面活性剂的存在则难以溶解，作为制剂，必须添加表面活性剂，相对于此，存在即使没有表面活性剂的存在也能很好地溶解的可溶性血栓调节蛋白。只要使可溶性血栓调节蛋白至少不含有膜贯通区域的一部分或全部来进行制备即可，例如，仅由N末端区域、具有6个EGF样结构的区域和O型糖链增加区域这3个区域构成(即，由序列编号1的第19～516位的氨基酸序列构成)的可溶性血栓调节蛋白可通过应用重组技术来获得，并且该重组可溶性血栓调节蛋白具有天然的血栓调节蛋白的活性(专利文献1)。此外，作为可溶性血栓调节蛋白的例子也有一些报告(专利文献2～9)。或者作为天然型也例举出了来自人尿的可溶性血栓调节蛋白等(专利文献10、11)。

顺便提及，在基因中，通过自然的变异或取得时的变异，如多数情况所确认的那样，在人中也发现了多形性变异，上述的由575个残基的氨基酸序列构成的人血栓调节蛋白前体的第473位的氨基酸为Val的和为Ala的是现在被确认的。在编码该氨基酸的碱基序列中，分别相当于在第1418位上的T变异和C变异(非专利文献4)。但是，在活性和物性方面，完全相同，能够判定两者实质上相同。

有报告指出血栓调节蛋白在DIC的治疗上具有效果(非专利文献5)。作为血栓调节蛋白的用途，除了上述以外，例如，还期待其用于急性冠状动脉综合征(ACS)、血栓症、末梢血管闭塞症、闭塞性动脉硬化症、血管炎、心脏手术继发的功能性障碍、脏器移植并发症、心绞痛、暂时性脑缺血发作、妊娠中毒症、糖尿病、肝VOD(Liver veno-occlusive disease；急性肝炎和骨髓移植后的肝静脉闭塞症)、深部静脉血栓症(DVT；Deepvenous thrombosis)等；以及成人呼吸窘迫综合症(ARDS；Adult respiratorydistress syndrome)的疾病的治疗和预防。

作为血栓调节蛋白的变性体，已知在冷冻干燥工序中生成的聚集体和在冷冻干燥状态下长期保存中生成的聚集体(专利文献12～16)。

考虑到在药品中的利用，作为以工业水平制造可溶性血栓调节蛋白的方法，例如已知如下方法：高纯度可溶性血栓调节蛋白的制造方法，该高纯度可溶性血栓调节蛋白实质上不含有血清衍生物和抗体衍生物，该方法的特征在于，作为精制工序，使用负载了针对血栓调节蛋白的抗体的亲和色谱法的方法，进而将通过亲和色谱法得到的该可溶性血栓调节蛋白在传导率为25～34ms/cm、pH为3～4的条件下与阳离子交换体接触，在该工序中，以流通级分的形式得到该可溶性血栓调节蛋白(专利文献17)；血栓调节蛋白的精制方法，该方法的特征在于，用凝血酶结合亲和色谱法预精制含有人尿血栓调节蛋白的试样，接下来利用以羟基磷灰石作为吸附剂的吸附色谱法进行精制(专利文献18)。

专利文献1：日本特开昭64-6219号公报

专利文献2：日本特开平2-255699号公报

专利文献3：日本特开平3-133380号公报

专利文献4：日本特开平3-259084号公报

专利文献5：日本特开平4-210700号公报

专利文献6：日本特开平5-213998号公报

专利文献7：WO92/00325号公报

专利文献8：WO92/03149号公报

专利文献9：WO93/15755号公报

专利文献10：日本特开平3-86900号公报

专利文献11：日本特开平3-218399号公报

专利文献12：日本特开平6-321085号公报

专利文献13：日本特许第3007785号公报

专利文献14：日本特开平11-171790号公报

专利文献15：W095/16460号公报

专利文献16：日本特许第3822383号公报

专利文献17：日本特开平11-341990号公报

专利文献18：日本特许第3745805号公报

非专利文献1：铃木宏治，医学のあゆみ，第125卷，901页(1983年)

非专利文献2：K.Gomi等，Blood 75.1396-1399(1990)

非专利文献3：M.Zushi等，J.Biol.Chem.，246，10351-10353(1989)

非专利文献4：D.Z.Wen等，Biochemistry，26，4350-4357(1987)

非专利文献5：S.M.Bates等，Br.J.Pharmacol.，144，1017-1028(2005)

发明内容

本发明的课题在于提供一种以高生产率制造实质上不含有可溶性血栓调节蛋白的变性体的血栓调节蛋白的方法。

本发明人在以工业水平制造可溶性血栓调节蛋白的过程中，还在利用包括于酸性下病毒灭活的工序的制造方法来制造可溶性血栓调节蛋白的过程中，发现了如下新课题：可溶性血栓调节蛋白置于酸性下的情况下生成该可溶性血栓调节蛋白的变性体，需要将其高效地去除。本发明人为了去除该可溶性血栓调节蛋白的变性体，对凝胶过滤色谱法(GFC)、尺寸排阻色谱法(SEC)等的利用进行了研究。但是，发现凝胶过滤色谱法(GFC)、尺寸排阻色谱法(SEC)的处理容量少，通常是柱容积的5％以下，因此需要增大柱容积或者需要进行多次循环。另外，作为提高效率的方法，可以考虑加快层析线速度的方法，但是加快线速度导致分离能力降低，因此认为该方法是不恰当的。另外，作为其他方法，还可以考虑提高处理蛋白质的浓度的方法，但是存在要增加用来提高蛋白质浓度的浓缩工序的问题以及以由高蛋白浓度带来的高粘性为主要原因的分离能力的降低等问题。

于是，本发明人基于上述新课题，认为为了以工业水平制造可溶性血栓调节蛋白，重要的是利用解决了上述问题的生产率高的方法来分离该可溶性血栓调节蛋白的变性体。本发明人为了解决上述新课题，利用各种色谱载体对各种条件进行了深入研究，结果通过使用阴离子交换体或羟基磷灰石作为载体，在各载体中发现了适当的条件，由此成功地发现了高效且稳定地分离该可溶性血栓调节蛋白的变性体的方法。

即，本发明可以给出如下技术方案。

〔A1〕可溶性血栓调节蛋白的制造方法，该可溶性血栓调节蛋白实质上不含有能够由可溶性血栓调节蛋白在酸性下生成的该可溶性血栓调节蛋白的变性体，其中，该方法包括如下工序：

(1)将含有或疑似含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石；以及

(2)在能够将该可溶性血栓调节蛋白和该可溶性血栓调节蛋白的变性体分离的分离条件下，得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的级分。

〔A2〕如上述〔A1〕记载的制造方法，该方法是制造实质上不含有能够由可溶性血栓调节蛋白在酸性下生成的该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的方法，其中，该方法包括如下工序：

(0)将该可溶性血栓调节蛋白置于pH为5以下的酸性下；

(1)将经上述工序(0)得到的含有或疑似含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石；以及

(2)在能够将该可溶性血栓调节蛋白和该可溶性血栓调节蛋白的变性体分离的分离条件下，得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的级分。

〔A2-2〕如上述〔A1〕记载的制造方法，该方法是制造实质上不含有能够由可溶性血栓调节蛋白在酸性下生成的该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的方法，其中，该方法包括如下工序：

(*)精制可溶性血栓调节蛋白；

(0)将该可溶性血栓调节蛋白置于pH为5以下的酸性下；

(1)将经上述工序(0)得到的含有或疑似含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石；以及

(2)在能够将该可溶性血栓调节蛋白和该可溶性血栓调节蛋白的变性体分离的分离条件下，得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的级分。

〔A2-3〕如上述〔A1〕、〔A2〕或〔A2-2〕任意一项记载的制造方法，其中，将该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石的工序是将该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体的工序。

〔A2-4〕如上述〔A1〕、〔A2〕或〔A2-2〕任意一项记载的制造方法，其中，将该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石的工序是将该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于羟基磷灰石的工序。

〔A3〕如上述〔A1〕～〔A2-4〕任意一项记载的制造方法，其中，相对于可溶性血栓调节蛋白含有物中的全蛋白，可溶性血栓调节蛋白的含量为80％以上。

需要说明的是，如上述〔A1〕～〔A2-4〕那样引用的项编号以范围来表示，在该范围内配置具有〔A2-2〕等分支编号的项的情况下，意味着具有〔A2-2〕等分支编号的项也被引用。下同。

〔A3-2〕如上述〔A1〕～〔A2-4〕任意一项记载的制造方法，其中，相对于可溶性血栓调节蛋白含有物中的全蛋白，可溶性血栓调节蛋白的含量为90％以上。

〔A3-3〕如上述〔A1〕～〔A2-4〕任意一项记载的制造方法，其中，相对于可溶性血栓调节蛋白含有物中的全蛋白，可溶性血栓调节蛋白的含量为95％以上。

〔A3-4〕如上述〔A1〕～〔A2-4〕任意一项记载的制造方法，其中，相对于可溶性血栓调节蛋白含有物中的全蛋白，可溶性血栓调节蛋白的含量为99％以上。

〔A4〕如上述〔A1〕～〔A3-4〕任意一项记载的制造方法，其中，工序(2)是通过进行线性或分段、或者线性和分段的组合的梯度洗脱来得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分的工序。

需要说明的是，如上述〔A1〕～〔A3-4〕那样引用的项编号以范围来表示，在该范围内配置具有〔A3-2〕等分支编号的项的情况下，意味着具有〔A3-2〕等分支编号的项也被引用。下同。

〔A5〕如上述〔A1〕～〔A3-4〕任意一项记载的制造方法，其中，工序(2)是得到流通级分的工序，该工序中得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的级分。

〔A6〕如上述〔A1〕～〔A3-4〕任意一项记载的制造方法，其中，工序(2)是通过进行等度洗脱来得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分的工序。

〔A7〕如上述〔A1〕～〔A3-4〕任意一项记载的制造方法，其中，工序(1)中，使用pH为4～9的缓冲液，将该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体；工序(2)中，使用pH为5～9且盐浓度为0～1M的缓冲液，进行线性或分段、或者线性和分段的组合的梯度洗脱，(a)预先确认可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分的位置，得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分；或者(b)一边确认在洗脱级分中是否存在可溶性血栓调节蛋白，一边得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分。

〔A7-2〕如上述〔A7〕记载的制造方法，其中，工序(a)或(b)是工序(a)。

〔A7-3〕如上述〔A7〕记载的制造方法，其中，工序(a)或(b)是工序(b)。

〔A8〕如上述〔A1〕～〔A3-4〕任意一项记载的制造方法，其中，工序(1)中，使用pH为5～8且盐浓度为0.1～0.2M的缓冲液，将该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体；工序(2)中，通过使用pH为5～8且盐浓度为0.1～0.2M的缓冲液得到流通级分，从而得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的级分。

〔A9〕如上述〔A1〕～〔A3-4〕任意一项记载的制造方法，其中，工序(1)中，使用pH为6～9且磷酸盐浓度为8mM以下的缓冲液，将可溶性血栓调节蛋白含有物供给于羟基磷灰石；工序(2)中，使用pH为6～9且磷酸盐浓度为0～0.5M的缓冲液，进行线性或分段、或者线性和分段的组合的梯度洗脱，(a)预先确认可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分的位置，得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分；或者(b)一边确认在洗脱级分中是否存在可溶性血栓调节蛋白，一边得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分。

〔A9-2〕如上述〔A9〕记载的制造方法，其中，工序(a)或(b)是工序(a)。

〔A9-3〕如上述〔A9〕记载的制造方法，其中，工序(a)或(b)是工序(b)。

〔A10〕如上述〔A1〕～〔A3-4〕任意一项记载的制造方法，其中，工序(1)中，使用pH为6～9且磷酸盐浓度为5～20mM的缓冲液，将该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于羟基磷灰石；工序(2)中，通过使用pH为6～9且磷酸盐浓度为5～20mM的缓冲液得到流通级分，从而得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的级分。

〔A11〕如上述〔A1〕～〔A10〕任意一项记载的制造方法，其中，该方法在得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分之后，不包括使该级分的pH为4以下的工序。

〔A12〕如上述〔A1〕～〔A11〕任意一项记载的制造方法，其中，该方法在得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分之后，包括不使该级分的pH为4以下的浓缩工序和/或脱盐工序，该方法用于将该可溶性血栓调节蛋白制成药品原料。

〔A13〕如上述〔A1〕～〔A12〕任意一项记载的制造方法，其中，实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白中，可溶性血栓调节蛋白的变性体的含量为3％以下。

〔A14〕如上述〔A1〕～〔A13〕任意一项记载的制造方法，其中，该可溶性血栓调节蛋白是由转化细胞得到的，该转化细胞是通过将编码序列编号9或序列编号11记载的氨基酸序列的DNA转染至宿主细胞而制备的。

〔A15〕可溶性血栓调节蛋白的精制方法，该精制方法使该可溶性血栓调节蛋白实质上不含有能够由可溶性血栓调节蛋白在酸性下生成的该可溶性血栓调节蛋白的变性体，其中，该精制方法包括如下工序：

(1)将含有或疑似含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石；

(2)在能够将该可溶性血栓调节蛋白和该可溶性血栓调节蛋白的变性体分离的分离条件下，得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分，

或者，该精制方法在将该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石的工序中，制备该可溶性血栓调节蛋白含有物的缓冲液，以流通级分的的形式得到实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白。

〔A15-2〕如上述〔A15〕记载的精制方法，其中，该方法具有上述〔A1〕～〔A14〕任意一项记载的特征。

〔A16〕如上述〔A1〕～〔A15〕任意一项记载的制造方法，其中，实质上不含有可溶性血栓调节蛋白的变性体的血栓调节蛋白中，可溶性血栓调节蛋白的变性体的含量为3.0％以下。

〔B1〕血栓调节蛋白的制造方法，该方法是从含有或疑似含有能够在酸性下由可溶性血栓调节蛋白生成的该可溶性血栓调节蛋白的变性体的该可溶性血栓调节蛋白含有物来制造实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的血栓调节蛋白的方法，其中，该方法包括如下工序：

(1)将该血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石；

(2)在能够将该可溶性血栓调节蛋白和该可溶性血栓调节蛋白的变性体分离的分离条件下，得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分。

〔B2〕血栓调节蛋白的制造方法，该方法是从含有或疑似含有能够在酸性下由可溶性血栓调节蛋白生成的该可溶性血栓调节蛋白的变性体的该可溶性血栓调节蛋白含有物来制造实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的血栓调节蛋白的方法，其中，在将该血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石的工序中，制备该血栓调节蛋白含有物的缓冲液，以流通级分的形式得到实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白。

〔B3〕如〔B1〕记载的制造方法，其中，工序(1)中，将可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体，使用的缓冲液的pH为4～9；工序(2)中，使用pH为5～9、盐浓度为0～1M的缓冲液进行线性或分段、或者线性和分段组合的梯度洗脱，通过预先确认来得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分，或者通过一边确认洗脱级分，一边得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分。

〔B4〕如〔B1〕记载的制造方法，其中，工序(1)中，将可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体，使用的缓冲液的pH为4～5；工序(2)中，使用pH为5～9、盐浓度为0～1M的缓冲液进行线性或分段、或者线性和分段的组合的梯度洗脱，通过预先确认来得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分，或者通过一边确认洗脱级分，一边得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分。

〔B5〕如〔B2〕记载的制造方法，其中，缓冲液的pH为5～8、盐浓度为0.1～0.2M，将可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体，以流通级分的形式得到实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白。

〔B6〕如〔B1〕记载的制造方法，其中，工序(1)中，将可溶性血栓调节蛋白含有物供给于羟基磷灰石，使用的缓冲液的pH为6～9、该缓冲液的磷酸浓度为8mM以下；上述工序(2)中，使用pH为6～9、磷酸盐浓度为0～0.5M的缓冲液进行线性或分段、或者线性和分段的组合的梯度洗脱，通过预先确认来得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分，或者通过一边确认洗脱级分，一边得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分。

〔B7〕如〔B1〕记载的制造方法，其中，工序(1)中，将可溶性血栓调节蛋白含有物供给于羟基磷灰石，使用的缓冲液的pH为6～9、该缓冲液的磷酸浓度为1～4mM；上述工序(2)中，使用pH为6～9、磷酸盐浓度为1～40mM的缓冲液进行线性或分段、或者线性的分段组合的梯度洗脱，通过预先确认来得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分，或者通过一边确认洗脱级分，一边得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分。

〔B8〕如〔B2〕记载的制造方法，其中，缓冲液的pH为6～9、磷酸盐浓度为5～20mM，将可溶性血栓调节蛋白含有物供给于羟基磷灰石，以流通级分的形式得到实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白。

〔B9〕如〔B1〕～〔B8〕任意一项记载的制造方法，其中，在得到包含实质上不含有可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分之后，不使该级分的pH为4以下。

〔B 10〕如〔B 1〕～〔B8〕任意一项记载的制造方法，其中，在得到包含实质上不含有可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分之后，通过不使该级分的pH为4以下的浓缩工序或脱盐工序来制成药品原料。

〔B11〕如〔B1〕～〔B10〕任意一项记载的制造方法，其中，实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白中，可溶性血栓调节蛋白的变性体的含量为3％以下。

〔B12〕如〔B1〕～〔B11〕任意一项记载的制造方法，其中，实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白中，可溶性血栓调节蛋白的变性体的含量为1％以下。

〔B13〕如〔B1〕～〔B12〕任意一项记载的制造方法，其中，该血栓调节蛋白是由转化细胞得到的肽，该转化细胞是通过将编码序列编号9或序列编号11记载的氨基酸序列的DNA转染至宿主细胞而制备的。

通过使用本发明的制造方法，不需要用于提高处理蛋白质浓度的浓缩工序，不受处理容积限制，并且能够以高生产率分离该可溶性血栓调节蛋白的变性体，能够得到实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的高纯度可溶性血栓调节蛋白。

附图说明

图1表示实施例4中利用阴离子交换体线性梯度洗脱分离可溶性血栓调节蛋白的变性体的色谱图。

图2表示实施例5中利用阴离子交换体线性梯度洗脱分离可溶性血栓调节蛋白的变性体的色谱图。

图3表示实施例6中利用阴离子交换体线性梯度洗脱分离可溶性血栓调节蛋白的变性体的色谱图。

图4表示对实施例3中得到的高纯度精制品测定可溶性血栓调节蛋白的变性体含量的结果。

图5表示实施例8中利用阴离子交换体分段梯度洗脱去除可溶性血栓调节蛋白的变性体的色谱图。

图6表示实施例11中利用羟基磷灰石分段梯度洗脱去除可溶性血栓调节蛋白的变性体的色谱图。

图7表示实施例14中利用强阴离子交换体进行高纯度化和去除可溶性血栓调节蛋白的变性体的色谱图。

具体实施方式

已知本发明中的血栓调节蛋白(1)与凝血酶选择性结合、(2)具有利用凝血酶促进蛋白C的活化的作用。并且，本发明中的血栓调节蛋白的下述作用通常能得到认可：(3)延长基于凝血酶作用的凝固时间的作用和/或(4)抑制基于凝血酶作用的血小板聚集的作用，这正是所希望的。有时将这些血栓调节蛋白所具有的作用称为血栓调节蛋白活性。

作为血栓调节蛋白活性，优选具有上述(1)和(2)的作用，进一步优选具有全部的上述(1)～(4)的作用。

对于利用凝血酶促进蛋白C的活化的作用，可以利用例如以日本特开昭64-6219号公报为首的各种公知文献中明确记载的试验方法来容易地确认促进蛋白C的活化的作用的活性量和是否存在该作用。另外，对于延长基于凝血酶作用的凝固时间的作用和/或抑制基于凝血酶作用的血小板聚集的作用，也能够同样容易地加以确认。

作为本发明所记载的可溶性血栓调节蛋白的例子，可以举出在没有表面活性剂的存在下可溶于水的可溶性血栓调节蛋白。作为可溶性血栓调节蛋白的溶解性的优选例子，可以举出在水、例如注射用蒸馏水中(没有TritonX-100或聚多卡醇等表面活性剂的存在，通常为中性附近)溶解1mg/ml以上、或者10mg/ml以上，优选溶解15mg/ml以上、或者17mg/ml以上，进一步优选溶解20mg/ml以上、25mg/ml以上、或者30mg/ml以上，特别优选溶解60mg/ml以上，在某些情况下，可以分别举出溶解80mg/ml以上、或者100mg/ml以上。在判断可溶性血栓调节蛋白是否能够溶解时，可以如下理解：在溶解后，例如在白色光源的正下方，在约1000lux的亮度的位置，用肉眼观察时为澄清透明，以不含有可被明确确认那样程度的不溶性物质为直接指标。另外，也可以以过滤后有无残渣来进行确认。

作为本发明的可溶性血栓调节蛋白，优选包含在人型血栓调节蛋白中作为血栓调节蛋白活性的中心位点而已知的序列编号1的第19～132位的氨基酸序列，但只要包含序列编号1的第19～132位的氨基酸序列，就没有特别限定。只要具有利用凝血酶促进蛋白C的活化的作用即具有血栓调节蛋白活性，该序列编号1的第19～132位的氨基酸序列也可以自然变异或人工变异，即，序列编号1的第19～132位的氨基酸序列中的一个或2个以上的氨基酸可以发生取代、缺失、添加。只要具有血栓调节蛋白活性，则对容许的变异的程度没有特别限定，例如作为氨基酸序列，可以例举出具有50％以上的相同性的氨基酸序列，优选70％以上的相同性，更优选80％以上的相同性，进一步优选90％以上的相同性，特别优选95％以上的相同性，最优选98％以上的相同性。将这样的氨基酸序列称为相同变异序列。对于这些变异，如后所述，采用通常的基因操作技术就能够容易获得。

序列编号3的序列是序列编号1的序列的第125位的氨基酸Val变异为Ala的序列，但作为本发明的可溶性血栓调节蛋白，也优选包含序列编号3的第19～132位的氨基酸序列。

如此，作为本发明的可溶性血栓调节蛋白，只要包含至少具有序列编号1或者序列编号3的第19～132位的序列或者这些序列的相同变异序列、至少具有血栓调节蛋白活性的肽序列，就没有特别限定，作为优选的实例，可以举出由序列编号1或者序列编号3各自的第19～132位或者第17～132位的序列构成的肽、或者由上述序列的相同变异序列构成的至少具有血栓调节蛋白活性的肽，更优选由序列编号1或者序列编号3的第19～132位的序列构成的肽。另外，也存在更优选由序列编号1或者序列编号3各自的第19～132位或者第17～132位的相同变异序列构成的至少具有血栓调节蛋白活性的肽的其他方式。

另外，作为本发明的可溶性血栓调节蛋白的另一方式，优选包含序列编号5的第19～480位的氨基酸序列，只要包含序列编号5的第19～480位的氨基酸序列，就没有特别限定。只要具有利用凝血酶促进蛋白C的活化的作用即具有血栓调节蛋白活性，该序列编号5的第19～480位的氨基酸序列也可以是其相同变异序列。

序列编号7的序列是序列编号5的序列的第473位的氨基酸Val变异为Ala的序列，但作为本发明的可溶性血栓调节蛋白，也优选包含序列编号7的第19～480位的氨基酸序列。

如此，作为本发明的可溶性血栓调节蛋白，只要包含至少具有序列编号5或者序列编号7的第19～480位的序列或者这些序列的相同变异序列、至少具有血栓调节蛋白活性的肽序列，就没有特别限定，作为优选的实例，可以举出由序列编号5或者序列编号7各自的第19～480位或者第17～480位的序列构成的肽、或者由上述序列的相同变异序列构成的至少具有血栓调节蛋白活性的肽，更优选由序列编号5或者序列编号7的第19～480位的序列构成的肽。另外，也存在更优选由序列编号5或者序列编号7各自的第19～480位或者第17～480位的相同变异序列构成的至少具有血栓调节蛋白活性的肽的其他方式。

另外，作为本发明的可溶性血栓调节蛋白的另一方式，优选包含序列编号9的第19～515位的氨基酸序列，只要包含序列编号9的第19～515位的氨基酸序列，就没有特别限定。只要具有利用凝血酶促进蛋白C的活化的作用即具有血栓调节蛋白活性，该序列编号9的第19～515位的氨基酸序列也可以是其相同变异序列。

序列编号11的序列是序列编号9的序列的第473位的氨基酸Val变异为Ala的序列，但作为本发明的血栓调节蛋白，也优选包含序列编号11的第19～515位的氨基酸序列。

如此，作为本发明的可溶性血栓调节蛋白，只要包含至少具有序列编号9或者序列编号11的第19～515位的序列或者这些序列的相同变异序列、至少具有血栓调节蛋白活性的肽序列，就没有特别限定，作为更优选的实例，可以举出由序列编号9或者序列编号11各自的第19～516位、第19～515位、第17～516位或者第17～515位的序列构成的肽、或者由上述序列的相同变异序列构成的至少具有血栓调节蛋白活性的肽，特别优选由序列编号9的第19～516位、第19～515位、第17～516位或者第17～515位的序列构成的肽。作为优选的实例，也可以举出它们的混合物。另外，也存在特别优选由序列编号11的第19～516位、第19～515位、第17～516位或者第17～515位的序列构成的肽的其他的方式。作为优选的实例，也可以举出它们的混合物。另外，作为优选的实例，也可以举出由这些序列的相同变异序列构成的至少具有血栓调节蛋白活性的肽。

如上所述，具有相同变异序列的肽也指作为对象的肽的氨基酸序列中可以取代、缺失、添加一个以上、即一个或2个以上的氨基酸、进而优选数个(例如1～20个、优选为1～10个、更优选为1～5个、特别优选为1～3个)氨基酸的肽。只要具有血栓调节蛋白活性，就对容许的变异的程度没有特别限定，例如，作为氨基酸序列，可以例举出具有50％以上的相同性的氨基酸序列，优选70％以上的相同性，更优选80％以上的相同性，进一步优选90％以上的相同性，特别优选95％以上的相同性，最优选98％以上的相同性。

另外，作为本发明的可溶性血栓调节蛋白，作为其优选的实例，还可以举出日本特开昭64-6219中由序列编号14的序列(462个氨基酸残基)构成的肽、由序列编号8的序列(272个氨基酸残基)构成的肽、或者由序列编号6的序列(236个氨基酸残基)构成的肽。

作为本发明的可溶性血栓调节蛋白，只要是至少具有序列编号1或序列编号3的第19～132位的氨基酸序列的肽，就没有特别限定，其中优选至少具有序列编号5或序列编号7的第19～480位的氨基酸序列的肽，更优选至少具有序列编号9或者序列编号11的第19～515位的氨基酸序列的肽。作为至少具有序列编号9或者序列编号11的第19～515位的氨基酸序列的肽，其更优选的实例可以举出由序列编号9或者序列编号11各自的第19～516位、第19～515位、第17～516位或者第17～515位的序列构成的肽。另外，作为更优选的实例，也可以举出由序列编号9或者序列编号11各自的第19～516位、第19～515位、第17～516位或者第17～515位的序列构成的肽的、序列编号9或者序列编号11各自的混合物。

对于上述混合物，作为从序列编号9或者序列编号11各自的从第17位开始的肽和从第19位开始的肽的混合比例，可例举出(30∶70)～(50∶50)，其优选的实例可以举出(35∶65)～(45∶55)。

另外，作为在序列编号9或者序列编号11各自的在第515位终止的肽和在第516位终止的肽的混合比例，可例举出(0∶100)～(90∶10)，根据情况可例举出(70∶30)～(90∶10)、(0∶100)～(30∶70)。

这些肽的混合比例可以通过通常的方法求出。

需要说明的是，序列编号1的第19～132位的序列相当于序列编号9的第367～480位的序列，序列编号5的第19～480位的序列相当于序列编号9的第19～480位的序列。

此外，序列编号3的第19～132位的序列相当于序列编号11的第367～480位的序列，序列编号7的第19～480位的序列相当于序列编号11的第19～480位的序列。

另外，序列编号1、3、5、7、9以及11各自的第1～18位的序列是完全相同的序列。

如后所述，本发明的这些血栓调节蛋白可以由转化细胞获得，该转化细胞是借助载体将编码这些序列编号1、3、5、7、9或11等的肽的DNA(具体地说，分别是序列编号2、序列编号4、序列编号6、序列编号8、序列编号10、或者序列编号12等的碱基序列)转染至宿主细胞而制备的。作为血栓调节蛋白，优选由转化细胞得到的血栓调节蛋白，该转化细胞是借助载体将编码序列编号9或序列编号11的氨基酸序列的DNA(具体地说，分别是序列编号10或序列编号12的碱基序列)转染至宿主细胞而制备的。

另外，这些肽只要具有上述的氨基酸序列即可，具有糖链或不具有糖链均可，在这点上没有特别限定。另外，在基因操作中，根据使用的宿主细胞的种类，糖链的种类、附加的位置和附加的程度不同，可以任意使用这些肽。对于糖链的结合位置和种类，已知日本特开平11-341990记载的事实，对于本发明的血栓调节蛋白，也存在在同样的位置附加同样的糖链的情况。如后所述，并非特定通过基因操作来获得，但通过基因操作来获得的情况下，作为表达时可以使用的信号序列，可以使用编码上述的序列编号9的第1～18位的氨基酸序列的碱基序列、编码序列编号9的第1～16位的氨基酸序列的碱基序列、其他公知的信号序列(例如人组织型纤溶酶原激活剂的信号序列)(国际公开88/9811号公报)。

将编码血栓调节蛋白的DNA序列导入宿主细胞的情况下，优选举出将编码血栓调节蛋白的DNA序列并入载体(特别优选能够在动物细胞中表达的表达载体)中来导入的方法。所谓表达载体，是由启动子序列、对mRNA赋予核糖体结合位点的序列、编码要表达的蛋白的DNA序列、剪接信号、转录终止的终止子序列、复制起始序列等构成的DNA分子，作为优选的动物细胞表达载体的例子，可以举出R.C.Mulligan等[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78.2072(1981)]报告的pSV2-X、P.M.Howley等[Methodin Emzymology，101，387，Academic Press(1983)]报告的pBP69T(69-6)等。

作为能够在制造这些肽时使用的宿主细胞，可以举出中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS-1细胞、COS-7细胞、VERO(ATCC CCL-81)细胞、BHK细胞、来自犬肾的MDCK细胞、仓鼠AV-12-664细胞等，以及作为来自人的细胞的HeLa细胞、WI38细胞、人293细胞。CHO细胞极为普遍而优选，在CHO细胞中，进一步优选DHFR-CHO细胞。

此外，在基因操作的过程和肽的制造过程中，多使用大肠杆菌等微生物，优选使用各微生物所适合的宿主-载体体系，在上述的宿主细胞中，也可以选择适宜的载体体系。在基因重组技术中使用的血栓调节蛋白的基因被克隆，并且公开了使用血栓调节蛋白的基因重组技术的制造例，另外，还已知用于得到其精制品的精制方法[日本特开昭64-6219号公报、日本特开平2-255699号公报、日本特开平5-213998号公报、日本特开平5-310787号公报、日本特开平7-155176号公报、J.Biol.Chem.，264：10351-10353(1989)]。因此，本发明中使用的可溶性血栓调节蛋白可通过使用上述的报告中记载的方法或者基于这些报告所记载的方法得以制造。例如，在日本特开昭64-6219号公报中，公开了包含质粒pSV2血栓调节蛋白J2的大肠杆菌K-12菌株DH5(ATCC保藏编号67283号)，该质粒pSV2血栓调节蛋白J2包含编码全长的血栓调节蛋白的DNA。另外，还可以使用将该菌株于1996年6月19日再次保藏于生命研(现独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)(日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮政编码305))的菌株(大肠杆菌DH5/pSV2TM J2)(FERMBP-5570)。以该编码全长的血栓调节蛋白的DNA作为原料，通过公知的基因操作技术，可以制备本发明的血栓调节蛋白。

本发明中使用的可溶性血栓调节蛋白采用现有公知的方法或基于这些方法来制备即可，可以参考例如上述山本等的方法[日本特开昭64-6219号公报]、或者日本特开平5-213998号公报。即，通过基因操作技术将来自人的血栓调节蛋白基因制成例如编码序列编号9的氨基酸序列的DNA，进而必要时也可以进行改变。作为该改变，例如，为了制成编码序列编号11的氨基酸序列的DNA(具体地说，由序列编号12的碱基序列构成)，按照[Methods in Enzymology，100：468(1983年)，Academic Press]所记载的方法，对编码序列编号9的氨基酸序列的第473位的氨基酸的密码子(特别是第1418位的碱基)进行位点部位特异性突变。例如，可以通过使用具有序列编号13所示的碱基序列的变异用合成DNA制成使序列编号10的第1418位的碱基T转换为碱基C的DNA。

将如此制备的DNA并入例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，制成转化细胞，经适当选择，从培养该细胞所得到的培养液中可以制造出经由公知方法精制的血栓调节蛋白。如上所述，优选将编码序列编号9的氨基酸序列的DNA(序列编号10)转染至上述宿主细胞中。本发明中使用的血栓调节蛋白的生产方法并不限于上述的方法，例如，可以从生产血栓调节蛋白的组织或这些组织培养液等中提取精制，也可以根据需要进一步通过蛋白分解酶进行切断处理。

利用上述细胞培养方法制造本发明中的血栓调节蛋白的情况下，通过蛋白质的翻译后修饰，有时能够确认到N末端氨基酸的多样性。例如，有时序列编号9中的第17位、18位、19位或者22位的氨基酸会成为N末端。另外，例如为了使第22位的谷氨酸转换为焦谷氨酸，有时修饰N末端氨基酸。优选第17位或19位的氨基酸成为N末端，更优选第19位的氨基酸成为N末端。另外，也存在优选第17位的氨基酸成为N末端的其他方式。关于以上的修饰和多样性等，对于序列编号11来说，也可以举出同样的例子。

另外，在使用具有序列编号10的碱基序列的DNA制造血栓调节蛋白的情况下，有时确认到C末端氨基酸的多样性，有时会制造出短1个氨基酸残基的肽。即，存在第515位的氨基酸成为C末端，进而该第515位被酰胺化那样的C末端氨基酸被修饰的情况。因此，有时能够制造N末端氨基酸和C末端氨基酸富于多样性的肽或者它们的混合物。优选第515位的氨基酸成为C末端。另外，也存在优选第516位的氨基酸成为C末端的其他方式。关于以上的修饰和多样性等，对于具有序列编号12的碱基序列的DNA来说，也是同样的。

利用上述方法得到的血栓调节蛋白有可能是N末端和C末端的多样性得以确认的肽的混合物。具体可以举出由序列编号9中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或者第17～515位的序列构成的肽的混合物。

根据本发明，提供一种制造可溶性血栓调节蛋白的方法，该可溶性血栓调节蛋白实质上不含有能够由可溶性血栓调节蛋白在酸性下生成的该可溶性血栓调节蛋白的变性体。该制造方法只要包含如下两个工序就没有特别限定，所述工序为：(1)将含有或疑似含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石；以及(2)在能够将该可溶性血栓调节蛋白和该可溶性血栓调节蛋白的变性体分离的分离条件下，得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的级分。但是，优选在工序(1)之前包括工序(0)：将该可溶性血栓调节蛋白置于pH为5以下的酸性下，更优选在工序(1)之前包括(0)将该可溶性血栓调节蛋白置于pH为5以下的酸性下的工序并且包括(*)精制可溶性血栓调节蛋白的工序。在本发明的制造方法中，对工序(*)的位置没有特别限定，但优选在工序(1)之前进行工序(*)。

作为本发明的可溶性血栓调节蛋白能够在酸性下生成该可溶性血栓调节蛋白的变性体的酸性下的条件，可例举出例如pH为5以下，优选pH为4以下，更优选pH为3以下，作为该pH的下限，可例举出例如pH为1以上，优选pH为2以上，更优选pH为3以上。另外，作为在酸性下的时间，可例举出例如0.5小时以上、优选为1小时以上、更优选为2小时以上。另外，作为在酸性下的温度，可例举出例如室温、优选为15℃以下、更优选为8℃以下，作为该温度的下限，可例举出通常为0℃以上、优选为2℃以上、更优选为5℃以上。在上述的酸性下的条件下，变成可溶性血栓调节蛋白和该可溶性血栓调节蛋白的变性体的混合物。

作为利用本发明的方法制造的“实质上不含有可溶性血栓调节蛋白的变性体的血栓调节蛋白”中的可溶性血栓调节蛋白的变性体的含量的上限，优选为3.0％以下，更优选为2.0％以下，进一步优选为1.0％以下，特别优选为0.5％以下，作为其下限，可例举出0.01％以上，但优选为检出限以下。可溶性血栓调节蛋白的变性体的含量可以利用色谱法进行分析，例如，使用TSKgelG3000SWXL(7.8mmI.D.×30cm；TOSOH社)分析用尺寸排阻色谱法，以含有硫酸钠的磷酸缓冲液为移动相，供给150μl分析样品，以0.9ml/分钟的流速，测定280nm下的吸光度，由此进行分析，由可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体的峰面积可以求出可溶性血栓调节蛋白的变性体的含量。

能够由本发明的可溶性血栓调节蛋白在酸性下生成的该可溶性血栓调节蛋白的变性体在使用TSKgelG3000SWXL(7.8mmI.D.×30cm；TOSOH社)分析用尺寸排阻色谱法、以含有硫酸钠的磷酸缓冲液为移动相、供给150μl分析样品并以流速0.9ml/分钟进行分析时，以可溶性血栓调节蛋白的保持时间的约9成的保持时间(例如，可溶性血栓调节蛋白的保持时间为约9分钟时，可溶性血栓调节蛋白的变性体的保持时间约8分钟)进行检测。另外，能够由本发明的可溶性血栓调节蛋白在酸性下生成的该可溶性血栓调节蛋白的变性体在电泳的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)中发生移动，并在血栓调节蛋白的高分子侧被发现，在SDS-PAGE中没有检测出。

作为在本发明中使用的含有或疑似含有能够在酸性下生成的可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白含有物(以下有时简称为变性体含有物)，只要是含有可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体的物质，就没有特别限定，可例举出：使用含有血清成分的培养基或无血清培养基，对能够生产出可溶性血栓调节蛋白的细胞进行培养，从制备出的培养上清得到的可溶性血栓调节蛋白液体；优选的是：使用含有血清成分的培养基或无血清培养基，对能够生产出可溶性血栓调节蛋白的细胞进行培养，使用制备出的培养上清，经精制工序得到的该可溶性血栓调节蛋白液体，或者置于酸性下得到的该可溶性血栓调节蛋白液体；更优选的是：使用含有血清成分的培养基或无血清培养基，对能够生产出可溶性血栓调节蛋白的细胞进行培养，使用制备出的培养上清，经精制工序得到的该可溶性血栓调节蛋白液体。另外，也存在优选置于酸性下得到的该可溶性血栓调节蛋白液体的其他方式。

作为上述精制工序，只要是能够至少除去可溶性血栓调节蛋白以外的蛋白质的工序，就没有特别限定，可以举出如下工序：使用负载了针对血栓调节蛋白的抗体的亲和色谱法，在酸性下将该可溶性血栓调节蛋白洗脱并回收；或者在传导率为25～34ms/cm、pH为3～4的条件下使通过上述亲和色谱法得到的该可溶性血栓调节蛋白进一步与阳离子交换体接触，在该工序中，以流通级分的形式回收该可溶性血栓调节蛋白。

作为上述可溶性血栓调节蛋白含有物(变性体含有物)，只要其含有可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体，就没有特别限定，可例举出实质上不含有除可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体以外的蛋白的物质。具体地说，作为可溶性血栓调节蛋白相对于可溶性血栓调节蛋白含有物中的全蛋白的含量的下限，可以举出50％以上，优选为60％以上，更优选为70％以上，进一步优选为80％以上，特别优选为90％以上，最优选为95％以上，最最优选为99％以上。另外，有时也优选为99.9％以上。作为上述可溶性血栓调节蛋白的含量，可以举出可溶性血栓调节蛋白本身的含量，但有时也表示可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体二者合计的含量。在可溶性血栓调节蛋白的含量在表示可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体二者合计的含量的情况下，作为可溶性血栓调节蛋白相对于可溶性血栓调节蛋白含有物中的全蛋白的含量的下限，可例举出50％以上，优选为60％以上，更优选为70％以上，进一步优选为80％以上，特别优选为90％以上，最优选为95％以上，最最优选为99％以上。另外，有时也优选为99.9％以上。

上述可溶性血栓调节蛋白的含量可以使用色谱法进行测定，例如，使用AsahiPak C4P-50(4.6mmI.D.×15cm；昭和电工株式会社)分析用反相色谱法，利用含有0.1％三氟乙酸的蒸馏水(A液)和含有0.1％三氟乙酸的乙腈(B液)的移动相，供给150μl分析样品，以0.8ml/分钟的流速，将A液和B液的混合比从96∶4线性变化至48分钟后的0∶100，对洗脱液测定280nm下的吸光度，由此进行分析，可以根据可溶性血栓调节蛋白和其他蛋白质的峰面积求出上述可溶性血栓调节蛋白的含量。另外，还可以使用日本特开平11-341990号公报所记载的ELISA方法，测定可溶性血栓调节蛋白以外的蛋白质，由此求出可溶性血栓调节蛋白的含量。

在本发明中，优选在经过将该血栓调节蛋白置于pH为5以下的酸性下的工序之后，将含有或疑似含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的该血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石。作为酸性下的pH，上限优选pH为5以下，更优选pH为4以下，进一步优选pH为3以下，下限优选pH为1以上，更优选pH为2以上，进一步优选pH为3以上。

此外，作为在酸性下的时间，可举出例如0.5小时以上、优选为1小时以上、更优选为2小时以上。另外，作为在酸性下的温度，可举出例如室温、优选为15℃以下、更优选为8℃以下，作为在酸性下的温度的下限，可举出通常为0℃以上、优选为2℃以上、更优选为5℃以上。

作为在本发明中使用的盐，适合的盐是氯化物，最适合的盐是氯化钠。另外，对于羟基磷灰石来说，适合的磷酸盐是磷酸钠、磷酸钾。

作为能够将可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体分离的分离条件，可以举出线性或分段或者线性和分段的组合的梯度洗脱条件、在流通级分中可溶性血栓调节蛋白不洗脱的条件、或等度洗脱条件，优选线性或分段或者线性和分段的组合的梯度洗脱条件、或在流通级分中可溶性血栓调节蛋白不洗脱的条件，更优选线性或分段或者线性和分段的组合的梯度洗脱条件。另外，也存在优选在流通级分中可溶性血栓调节蛋白不洗脱的条件的其他方式。另外，有时也优选等度洗脱条件。

作为流通级分，可以举出将可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石后，可溶性血栓调节蛋白不吸附于阴离子交换体或羟基磷灰石上的级分。作为流通级分，只要实质上不含有血栓调节蛋白的变性体，就没有特别限定，例如可以举出1～20柱容积、1～50柱容积、或者1～100柱容积。

作为梯度洗脱条件，根据使用的柱进行适当设定即可。作为具体的条件，可举出后述的条件。另外，作为在流通级分中可溶性血栓调节蛋白不洗脱的条件，使用的缓冲液也可以根据使用的柱进行来适当设定。作为具体的条件，可举出后述的条件。另外，作为等度洗脱条件，只要根据使用的柱来适当设定即可。

阴离子交换体优选使用强阴离子交换体，即具有季铵基的阴离子交换体(例如SOURCEQ(GE Healthcare Bio-Sciences公司))，在供给变性体含有物之前，可以使用数柱容积的pH为4～9的缓冲液(对缓冲液的种类没有限定，例如，0.1M乙酸、pH4，或0.02M磷酸、pH7.3，或0.02M Tris、pH8)使阴离子交换体平衡化。平衡后，供给变性体含有物，并且在可溶性血栓调节蛋白洗脱之前，可以使用pH为4～9的缓冲液(对缓冲液的种类没有限定，例如，0.1M乙酸、pH4，或0.02M磷酸、pH7.3，或0.02MTris、pH8)对其进行清洗。使用pH为5～9、优选pH为7～8的缓冲液(对缓冲液的种类没有限定，例如，0.02M磷酸、pH7.3，或0.02M Tris、pH8)，在0～1M盐浓度下使吸附的变性体含有物梯度洗脱，由此使可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体分离洗脱。分离条件只要是能够将可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体分离的分离条件，就没有特别限定，作为梯度洗脱条件，可以举出线性或分段、或者线性和分段的组合的条件。优选该梯度洗脱的盐浓度为0～0.3M，更优选盐浓度为0.03～0.26M。洗脱缓冲液的量是2～40柱容积，优选为5～20柱容积。

使用梯度洗脱条件的情况下，作为得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分的工序，可以举出例如：(a)预先确认可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分的位置，得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分；或者(b)一边确认洗脱级分中是否存在可溶性血栓调节蛋白，一边得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分。

具体说明工序(a)，可以举出如下工序：利用能够确认可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体的存在的分析方法(例如，下面的实施例7中所述的尺寸排阻色谱法)，预先确认实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的洗脱级分的位置，将该位置的洗脱级分回收。另外，具体说明工序(b)，可以举出如下工序：一边利用能够确认可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体的存在的分析方法(例如，下面的实施例7中所述的尺寸排阻色谱法)，确认洗脱级分含有该可溶性血栓调节蛋白且实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体，一边得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的该可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分。优选工序(b)。另外，根据情况有时也优选工序(a)。

此外，在供给变性体含有物之前，将变性体含有物在适当的缓冲液中进行置换，由此也可以以流通级分的形式得到实质上不含有血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白。作为流通级分，可以举出将可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体后，可溶性血栓调节蛋白不吸附在阴离子交换体上的级分。在利用可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体之间对柱的吸附力的差异的情况中，阴离子交换体可以优选使用强阴离子交换体，即具有季铵基的阴离子交换体，例如SOURCEQ、QSepharoseFF(GE Healthcare Bio-Sciences公司)、Sartobind(Sartorius公司)、Mustang(PALL社)。用于置换的适当的缓冲液优选为pH5～8、盐浓度0.1～0.2M的缓冲液，对缓冲液的种类没有限定，例如，可以使用0.02M磷酸、0.18M氯化钠、pH7.3。作为得到流通级分的方法，只要能够一边利用后述的实施例7所述的尺寸排阻色谱法等分析方法来确认级分含有该可溶性血栓调节蛋白且实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体，一边适当得到该级分即可。

另外，也可以使用等度洗脱条件。在该情况下也可以参照梯度洗脱条件和在流通级分中可溶性血栓调节蛋白不洗脱的条件，来设定适合的条件。

羟基磷灰石使用例如Macro-Prep(R)Ceramic HydroxyaPatiteTYPE1(BIO-RAD社))，在供给变性体含有物之前，可以使用数柱容积的pH6～9的磷酸浓度为8mM以下、优选为5mM以下、更优选为2mM以下的缓冲液(对缓冲液的种类没有限定，例如，5mM磷酸、0.2M氯化钠、pH7，或1mM磷酸、25mM TRIS、0.2M氯化钠、pH7.7，或2mM磷酸、20mM HEPES、0.17M氯化钠、pH7)对羟基磷灰石进行平衡化。供给的变性体含有物的缓冲液使用pH6～9的磷酸浓度为8mM以下、优选为5mM以下、更优选为2mM以下的缓冲液，平衡后，供给变性体含有物，并且在可溶性血栓调节蛋白洗脱之前，可以使用pH6～9的磷酸浓度为8mM以下、优选为5mM以下、更优选为2mM以下的缓冲液(对缓冲液的种类没有限定，例如，5mM磷酸、0.2M氯化钠、pH7，或1mM磷酸、25mM TRIS、0.2M氯化钠、pH7.7，或2mM磷酸、20mM HEPES、0.17M氯化钠、pH7)对其进行清洗。使用pH6～9、优选pH7～8的缓冲液，在0～0.5M的磷酸盐浓度下使吸附的变性体含有物梯度洗脱，由此使可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体分离洗脱。分离条件只要是能够将可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体分离的分离条件，就没有特别限定，作为梯度洗脱条件，可以举出线性或分段。优选该梯度的磷酸盐浓度为1～40mM，更优选的是，以分段进行，在8～10mM磷酸盐浓度下可以得到包含实质上不含有可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分。通过进一步提高磷酸盐的浓度，使可溶性血栓调节蛋白的变性体洗脱。

在使用梯度洗脱条件的情况下，作为得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分的方法，可以举出与用阴离子交换体分离可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体时的方法相同的方法。

此外，在供给变性体含有物之前，将变性体含有物在适当的缓冲液中进行置换，由此也可以以流通级分的形式得到实质上不含有血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白。作为流通级分，可以举出将可溶性血栓调节蛋白含有物供给于羟基磷灰石后，可溶性血栓调节蛋白不吸附在羟基磷灰石上的级分。利用可溶性血栓调节蛋白和可溶性血栓调节蛋白的变性体之间对柱的吸附力的差异。在该情况下，羟基磷灰石可以使用例如Macro-Prep(R)Ceramic HydroxyaPatite TYPE1(BIO-RAD社)。用于置换的适当的缓冲液是pH为6～9、磷酸盐浓度为5～20mM(优选pH为6～7、磷酸盐浓度为5～10mM)的缓冲液，对缓冲液的种类没有限定，例如，可以使用10mM磷酸、10mM氯化钠、pH7的缓冲液。作为得到流通级分的方法，只要能够一边利用后述的实施例7中记载的尺寸排阻色谱法等分析方法来确认级分含有该可溶性血栓调节蛋白且实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体，一边适当得到该级分即可。

另外，也可以使用等度洗脱条件。在该情况下也可以参照梯度洗脱条件和在流通级分中可溶性血栓调节蛋白不洗脱的条件，来设定适合的条件。

在本发明的制造方法中，将可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石，得到包含实质上不含有可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分后，优选不包括使该级分的pH为4以下的工序。另外，优选在其后的用于将该可溶性血栓调节蛋白制成药品原料的浓缩工序和/或脱盐工序中也不使pH为4以下。

作为使用含有血清成分的培养基或无血清培养基对能够生产出可溶性血栓调节蛋白的细胞进行培养并从制备出的培养上清精制可溶性血栓调节蛋白的优选的方法，可以举出以血栓调节蛋白活性、例如利用凝血酶促进蛋白C活化的活性为指标的精制方法，可以举出例如如下的精制方法：用离子交换柱的Q-琼脂糖凝胶FF对培养上清进行粗精制，将具有血栓调节蛋白活性的级分回收，接着，用亲和柱的抗小鼠血栓调节蛋白单克隆抗体进行精制，将血栓调节蛋白活性强的级分回收，用阳离子交换柱的SP-琼脂糖凝胶FF对回收级分进行精制，将流通级分浓缩，经凝胶过滤，得到血栓调节蛋白活性级分。利用该SP-琼脂糖凝胶FF进行精制后，在最佳的条件下使用本发明的阴离子交换体、优选强阴离子交换体即具有季铵基的阴离子交换体(例如SOURCEQ(GE HealthcareBio-Sciences公司)或本发明的羟基磷灰石(例如Macro-Prep(R)CeramicHydroxyaPatite TYPE1(BIO-RAD社))，由此能够简便地得到实质上不含有可溶性血栓调节蛋白的变性体的高纯度的血栓调节蛋白。

此外，用抗小鼠血栓调节蛋白单克隆抗体进行精制后，通过在最佳的条件下使用本发明的阴离子交换体、优选强阴离子交换体即具有季铵基的阴离子交换体(例如SOURCEQ(GE Healthcare Bio-Sciences公司))，能够将可溶性血栓调节蛋白的变性体和小鼠抗体衍生物、及使用含血清培养基的情况下的血清衍生物同时去除，能够简便地得到实质上不含有可溶性血栓调节蛋白的变性体的高纯度的血栓调节蛋白。

进一步通过不使利用上述例举出的方法得到的高纯度的血栓调节蛋白的pH为4以下的浓缩工序和/或脱盐工序，可以得到缓冲液得以交换的高纯度精制品。利用上述方法得到的可溶性血栓调节蛋白可用作药品原料。

此外，根据本发明，提供一种精制可溶性血栓调节蛋白的方法，该方法使该精制的可溶性血栓调节蛋白实质上不含有能够由可溶性血栓调节蛋白在酸性下生成的该可溶性血栓调节蛋白的变性体。该精制方法只要包括如下工序，就没有特别限定，所述工序为：(1)将含有或疑似含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石；以及(2)在能够将该可溶性血栓调节蛋白和该可溶性血栓调节蛋白的变性体分离的分离条件下，得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的级分。另外，作为该精制方法，可以举出具有上述本发明的可溶性血栓调节蛋白的制造方法所具有的特征的精制方法。

实施例

利用以下的实施例更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。

(实施例1)利用强阴离子交换体柱的粗精制

根据日本特开平11-341990号公报，通过基因操作技术，制备编码序列编号9记载的氨基酸序列的DNA，经转基因并入中国仓鼠卵巢细胞，对并入后的中国仓鼠卵巢细胞进行培养，得到培养液上清。将得到的411培养液上清用0.2μm的膜过滤器(Millipore社、Millipak 20)过滤。将过滤后的培养上清供给于用含150mM氯化钠的20mM Tris盐缓冲液(pH7.4)平衡化的Q-Sepharose(GE Healthcare Bio-Sciences公司)柱(直径44cm、高度26.3cm)。接着，用6柱容积的含有180mM氯化钠的20mM乙酸缓冲液进行清洗，进一步用8柱容积的含有180mM氯化钠的20mM Tris盐缓冲液(pH7.4)进行清洗，用含有300mM氯化钠的20mM Tris盐缓冲液(pH7.4)开始洗脱，得到从洗脱液在280nm下的吸光度的峰上升起的0.5柱容积容量的洗脱液作为粗精制品。需要说明的是，以760mL/分钟的流速进行实施。

(实施例2)利用单克隆抗体的精制

根据日本特开平11-341990号公报，制作以来自人肺的血栓调节蛋白为抗原的抗血栓调节蛋白单克隆抗体，与CNBr-activated Sepharose(溴化氰活化琼脂糖凝胶)4FastFlow(GE Healthcare Bio-Sciences公司)接触反应，偶联抗血栓调节蛋白单克隆，制成抗血栓调节蛋白单克隆结合Sepharose 4FastFlow。将实施例1中得到的洗脱级分中的16.51供给于用含0.3M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.3)平衡化的单克隆抗体柱(直径44cm、高度10.5cm)。流通6柱容积的含有1.0M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.3)，进一步流通3柱容积的0.1M乙酸缓冲液(pH5.0)进行清洗，用含有0.3M氯化钠的0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)开始洗脱，得到从洗脱液在280nm下的吸光度的峰上升到下降的洗脱液，在洗脱液中添加容量为洗脱液容积的1/10的0.5M磷酸缓冲液(pH7.3)，得到精制液。需要说明的是，以760mL/分钟的流速进行实施。

(实施例3)利用强阳离子交换体柱的精制

用1.0M甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.0)将实施例2中得到的精制液中的193ml调整成pH为3.5，将经调整的液体供给于用含0.3M NaCl的0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.5)平衡化的SP-SepharoseFF(GE HealthcareBio-Sciences公司)柱(直径16mm、高度12cm)。用含300mM NaCl的100mM甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.5)开始进行清洗，得到280nm下的吸光度的峰从上升到下降的流通级分，立即用0.5M磷酸缓冲液(pH7.3)中和至pH为7，得到高纯度精制品。需要说明的是，以3.3mL/分钟流速进行实施。通过使用上述AsahiPak C4P-50的色谱法或日本特开平11-341990号公报所记载的ELISA法等，获知该高纯度精制品的可溶性血栓调节蛋白的含量为99％以上。

(实施例4)利用阴离子交换体线性梯度洗脱的可溶性血栓调节蛋白的变性体的分离(1)

将实施例3中得到的高纯度精制品中的10ml用30ml纯净水进行稀释。将稀释后的40ml溶液供给于用含0.1M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH6)平衡化的sourrceQ30(GE Healthcare Bio-Sciences公司)柱(直径0.5cm、高度9.8cm)。用3柱容积的20mM磷酸缓冲液(pH6)清洗，以20mM磷酸缓冲液(pH6)的0.1M～0.3M氯化钠的线性梯度、洗脱容积为20柱容积的条件开始洗脱，从洗脱液在280nm下的吸光度的峰上升开始以1柱容积为单位进行分离。需要说明的是，以样品的加入和清洗时的流速为2.2mL/分钟、洗脱时的流速为0.3mL/分钟的条件进行实施。色谱图见图1。

(实施例5)利用阴离子交换体线性梯度洗脱的可溶性血栓调节蛋白的变性体的分离(2)

将实施例3中得到的高纯度精制品中的10ml用30ml纯净水进行稀释。将稀释后的40ml溶液供给于用含0.1M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7)平衡化的sourrceQ30(GE Healthcare Bio-Sciences公司)柱(直径0.5cm、高度9.8cm)。用3柱容积的20mM磷酸缓冲液(pH7)清洗，以20mM磷酸缓冲液(pH7)的0.1M～0.3M氯化钠的线性梯度、洗脱容积为20柱容积的条件开始洗脱，从洗脱液在280nm下的吸光度的峰上升开始以1柱容积为单位进行分离。需要说明的是，以样品的加入和清洗时的流速为2.2mL/分钟、洗脱时的流速为0.3mL/分钟的条件进行实施。色谱图见图2。

(实施例6)利用阴离子交换体线性梯度洗脱的可溶性血栓调节蛋白的变性体的分离(3)

将实施例3中得到的高纯度精制品中的10ml用30ml纯净水进行稀释。将稀释后的40ml溶液供给于用含0.1M氯化钠的20mM Tris缓冲液(pH8)平衡化的sourrceQ30(GE Healthcare Bio-Sciences公司)柱(直径0.5cm、高度9.8cm)。用3柱容积的20mM Tris缓冲液(pH8)清洗，以20mMTris缓冲液(pH8)的0.1M～0.3M氯化钠的线性梯度、洗脱容积为20柱容积的条件开始洗脱，从洗脱液在280nm下的吸光度的峰上升开始以1柱容积为单位进行分离。需要说明的是，以样品的加入和清洗时的流速为2.2mL/分钟、洗脱时的流速为0.3mL/分钟的条件进行实施。色谱图见图3。

(实施例7)实施例4～6的可溶性血栓调节蛋白的变性体含量的评价

使用TSKgelG3000SWXL(7.8mmI.D.×30cm；TOSOH社)分析用尺寸排阻色谱法，对各级分的可溶性血栓调节蛋白的变性体含量进行评价。柱用移动相平衡化，移动相使用含0.1M硫酸钠的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.3)，流速为0.9ml/分钟，供给各级分150μl，进行分析。另外，各级分的回收是通过测定280nm下的吸光度来算出的。实施例4～实施例6的结果列于下表1。另外，对在实施例3中得到的高纯度精制品也用上述方法测定了可溶性血栓调节蛋白的变性体含量，测定结果为7.0％(图4)。在实施例4～实施例6任意一个条件下，均能够以76％～81％的回收率得到实质上不含有可溶性血栓调节蛋白的变性体的高纯度可溶性血栓调节蛋白。

[表1]

(实施例8)利用阴离子交换体分段梯度洗脱的可溶性血栓调节蛋白的变性体的分离

将实施例3中得到的高纯度精制品中的70ml用210ml纯净水进行稀释。将稀释后的溶液供给于用含30mM氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.3)平衡化的sourceQ30(GE Healthcare Bio-Sciences公司)柱(直径0.5cm、高度20.5cm)。用3柱容积的含30mM氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.3)清洗，用含0.18M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.3)开始洗脱，得到从洗脱液在280nm下的吸光度的峰上升到6柱容积容量为止的洗脱液。使用TSKgelG3000SWXL(TOSOH社)分析用尺寸排阻色谱法，在实施例7的条件下评价洗脱液的可溶性血栓调节蛋白的变性体含量，结果可溶性血栓调节蛋白的变性体含量比率为0.0％，得到了实质上不含有可溶性血栓调节蛋白的变性体的高纯度可溶性血栓调节蛋白。洗脱液的回收率为89％。需要说明的是，以样品的加入和清洗时的流速为0.8mL/分钟、洗脱时的流速为0.4mL/分钟的条件进行实施。色谱图见图5。

(实施例9)利用基因操作技术对来自人的血栓调节蛋白基因进行制备及转基因，通过对经转基因而并入的中国仓鼠卵巢细胞进行无血清培养来得到含有可溶性血栓调节蛋白的培养上清

对于在为了得到含有可溶性血栓调节蛋白的培养上清的培养中使用的不含动物成分的无血清培养基，制备了种子培养基和灌流培养用培养基这两种。

种子培养基是在每1L的IS CHO-CD(液体培养基，产品目录编号91119-1L，制造商Irvine Scientific)中以HT supplement(液体，产品目录编号11067-030，制造商Invitrogen)为5mL、L-Glutamine 200mM(液体，产品目录编号25030-081，制造商Invitrogen)为40mL的比例进行无菌混合而制备出的。对于种子培养基来说，保存时为冷藏保存(2～8度)，使用时，在即将使用前在36℃恒温水浴槽中加热再进行使用。

灌流培养用培养基是在每1L的去离子超滤水中以ISCHO-CD-A3(粉末培养基，产品目录编号98688，制造商Irvine Scientific)为20.8g、食盐(等级：特级，制造商：和光纯药)为2.6g、碳酸氢钠食盐(等级：特级，制造商：和光纯药)为4.4g的比例添加并溶解后，用0.2μm过滤器(PVDF制造，制造商：Millipore)无菌过滤而制备出的。灌流培养用培养基在保存时、使用时均要冷藏保存(2～8度)。

在种子培养开始时，将冷冻保存的能生产出可溶性血栓调节蛋白的细胞(日本特开平11-341990号公报)在37度恒温水浴槽中快速融化，悬浮于种子培养基中，进行离心分离(2000rpm、2分钟、国产化学)，除去离心上清后，将细胞沉淀悬浮于100mL种子培养基中，分注到225cm2T型烧瓶培养容器(制造商：BD Biosciences)中，开始第1段的种子培养。第1段种子培养以在36度、5％二氧化碳培养箱内的静置培养的方式实施。第1段种子培养的浮游活细胞密度达到约8×10⁵cells/mL时，在第2段种子培养中继代培养。

第2段种子培养以后以搅拌培养来实施。对于搅拌培养中的种子培养的规模和搅拌培养容器，以第2段种子培养为400mL(玻璃制转瓶，制造商：柴田科学)、第3段种子培养为1.6L(玻璃制转瓶，制造商：柴田科学)、第4段种子培养为6L(玻璃制球形转瓶，制造商：柴田科学)的方式依次扩大继代培养液量。种子培养的浮游活细胞密度达到约8×10⁵cells/mL时，在下一段的种子培养中继代培养。在继代培养中，增加与从继代后的培养规模中减去继代前的培养规模得到的值相同量的种子培养用培养基以进行扩大。搅拌培养在36度、5％二氧化碳培养箱内利用磁力搅拌器(制造商：柴田科学)在搅拌速度为60～100rpm的条件下实施。

第4段种子培养的浮游活细胞密度达到约8×10⁵cells/mL时，将种子培养液分别输送至3台灌流培养槽(2L灌流培养装置，制造商：丸菱生物)，每台输送2L，开始灌流培养。

在灌流培养中供给至灌流培养槽中的灌流培养用培养基的定量输送是使用蠕动泵(制造商：Masterflex)以2L/天的流量进行的。

灌流培养中的细胞分离是利用设置在灌流培养槽内的旋转过滤器进行的。3台灌流培养槽分别使用了不同的旋转过滤器。第一台使用了不锈钢制筛网(FP-10，孔径10μm，制造商：富士过滤器工业)的旋转过滤器、第二台使用了不锈钢制筛网(FP-30，孔径30μm，制造商：富士过滤器工业)的旋转过滤器、第三台使用了聚酯PETP制筛网(孔径10μm，产品目录编号BB-8808571，制造商：Sartorius)的旋转过滤器。

通过显示灌流培养槽内的2L液面的液位传感器的动作，在培养液量为2L以上时，在培养槽内压力的作用下间歇地排出利用设置在灌流培养槽内的旋转过滤器进行了细胞分离的培养上清。间歇排出的培养上清被输送至冷藏保存的容器中，在2～8度冷藏保存。

对于灌流培养条件，控制槽内温度为35～37℃、溶解氧浓度为10％～90％、pH为6.8～7.6来进行培养。

灌流培养进行30天，这期间的活细胞平均密度为第一台17×10⁶cells/mL、第二台10×10⁶cells/mL、第三台18×10⁶cells/mL。

在3台灌流培养槽中，将从灌流培养第三天起至第30天为止得到的培养上清混合，用0.2μm过滤器(PVDF制，制造商：Millipore)过滤，过滤后的培养上清冷藏保存(2～8度)。

(实施例10)利用强阴离子交换体柱的精制

将由实施例9得到的培养液上清中的850ml供给至用含30mM氯化钠的20mM乙酸钠、120mM乙酸缓冲液平衡化的Q-SepharoseFF(GEHealthcare Bio-Sciences公司)柱(直径1.6cm、高度29cm)。接着，用12柱容积的含30mM氯化钠的20mM乙酸钠、120mM乙酸缓冲液(pH3.8)清洗，用含140mM氯化钠的20mM乙酸钠、40mM乙酸缓冲液(pH4.2)开始洗脱，向从洗脱液在280nm下的吸光度的主峰上升起的2柱容积容量的洗脱液中添加1/5柱容积容量的含10mM磷酸钾的1M HEPES缓冲液(pH8)，得到精制品。需要说明的是，以2mL/分钟的流速进行实施。

(实施例11)利用羟基磷灰石分段梯度洗脱的可溶性血栓调节蛋白的变性体的分离

将实施例10中得到的精制品中的20ml供给于用含0.17M氯化钠、2mM磷酸钠的20mM HEPES  缓冲液(pH7)平衡化的Macro-Prep(R)Ceramic HydroxyaPatite TYPE1(BIO-RAD社)柱(直径0.5cm、高度9.7cm)。用6柱容积的含0.17M氯化钠、2mM磷酸钠的20mMHEPES缓冲液(pH7)清洗，用含10mM氯化钠的8mM磷酸缓冲液(pH7)以4柱容积的洗脱容积进行洗脱，得到从洗脱液在280nm下的吸光度的峰上升到下降的洗脱液。需要说明的是，以0.4mL/分钟的流速进行实施。使用TSKgelG3000SWXL(TOSOH社)分析用尺寸排阻色谱法，在实施例7的条件下评价洗脱液的可溶性血栓调节蛋白的变性体含量，结果可溶性血栓调节蛋白的变性体含量比率为0.8％以下。柱用0.5M磷酸缓冲液(pH7)进行再生。色谱图见图6。

(实施例12)利用强阴离子交换体柱的粗精制(2)

将实施例9中得到的培养液上清5.21供给于用含150mM氯化钠的20mM Tris盐缓冲液(pH7.7)平衡化的CaptoQ(GE Healthcare Bio-Sciences公司)柱(直径1.6cm、高度26cm)。接着，用15柱容积的含0.18M氯化钠的20mM Tris盐缓冲液(pH7.7)进行清洗，用含0.3M氯化钠的20mM Tris盐缓冲液(pH7.7)开始洗脱，得到从洗脱液在280nm下的吸光度的峰上升起的2柱容积容量的洗脱液作为粗精制品。需要说明的是，以10mL/分钟的流速进行实施。

(实施例13)利用单克隆抗体的精制(2)

按照专利文献2制作单克隆抗体。将实施例12中得到的洗脱级分中的72mL供给于用含0.3M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.3)平衡化的单克隆抗体柱(直径5cm、高度11cm)。流通6柱容积的含1.0M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.3)，进而流通3柱容积的0.1M乙酸缓冲液(pH5.0)进行清洗，用含20mM氯化钠的0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)开始洗脱，得到从洗脱液在280nm下的吸光度的峰上升到下降的洗脱液，在洗脱液中添加容积容量为洗脱液的15％的0.3M磷酸缓冲液(pH7.3)，得到精制液。需要说明的是，以9.8mL/分钟的流速进行实施。通过使用上述AsahiPak C4P-50的色谱法或日本特开平11-341990号公报所记载的ELISA法等，获知该精制液的可溶性血栓调节蛋白的含量为99％以上。

(实施例14)利用强阴离子交换体的高纯度化和可溶性血栓调节蛋白的变性体的去除

将实施例13中得到的精制液中的75mL供给于用含40mM氯化钠的0.1M乙酸缓冲液(pH4)平衡化的sourceQ30(GE Healthcare Bio-Sciences公司)柱(直径0.5cm、高度20.5cm)。流通2柱容积的含40mM氯化钠的0.1M乙酸缓冲液(pH4)，进而流通4柱容积的含50mM氯化钠的0.1M乙酸缓冲液(pH4)，并且进一步用3柱容积的含30mM氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.3)清洗，用含0.18M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.3)开始洗脱，得到从洗脱液在280nm下的吸光度的峰上升起的6柱容积的洗脱液。需要说明的是，以样品加入时的流速为1mL/分钟、清洗和洗脱时的流速为0.3mL/分钟的条件进行实施。使用TSKgelG3000SWXL(TOSOH社)分析用尺寸排阻色谱法，在实施例7的条件下评价洗脱液的可溶性血栓调节蛋白的变性体含量，结果可溶性血栓调节蛋白的变性体含量比率为0.1％，得到实质上不含有可溶性血栓调节蛋白的变性体的高纯度可溶性血栓调节蛋白。洗脱液的回收率为71％。色谱图见图7。

(实施例15)混入异种蛋白质(小鼠抗体衍生物和中国仓鼠卵巢细胞的细胞衍生物)量的评价

使用日本特开平11-341990号公报所记载的ELISA方法，对实施例13～14的洗脱级分进行评价。测定各洗脱级分在280nm下的吸光度，以吸光度为1的混入量进行评价，评价结果列于下表2。可以同时减少各成分的混入量。

[表2]

序列表

<110>旭化成制药株式会社

<120>高纯度可溶性血栓调节蛋白的制造方法

<130>F107165

<160>13

<210>1

<211>132

<212>PRT

<213>human

<400>1

Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly

1               5                   10                  15

Phe Pro Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro

            20                  25                  30

Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro

        35                  40                  45

Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala

  50                  55                  60

Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro

65                  70                  75                  80

Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu

               85                  90                  95

Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly

            100                 105                 110

Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile

        115                 120                125

Gly Thr Asp Cys

    130

<210>2

<211>396

<212>DNA

<213>human

<400>2

atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgacccg 60

tgcttcagag ccaactgcga gtaccagtgc cagcccctga accaaactag ctacctctgc 120

gtctgcgccg agggcttcgc gcccattccc cacgagccgc acaggtgcca gatgttttgc 180

aaccagactg cctgtccagc cgactgcgac cccaacaccc aggctagctg tgagtgccct 240

gaaggctaca tcctggacga cggtttcatc tgcacggaca tcgacgagtg cgaaaacggc 300

ggcttctgct ccggggtgtg ccacaacctc cccggtacct tcgagtgcat ctgcgggccc 360

gactcggccc ttgtccgcca cattggcacc gac tgt                          396

<210>3

<211>132

<212>PRT

<213>human

<400>3

Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly

 1               5                  10                  15

Phe Pro Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro

             20                  25                  30

Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro

         35                  40                  45

Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala

     50                  55                  60

Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu

                 85                  90                  95

Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly

            100                 105                 110

Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile

        115                 120                 125

Gly Thr Asp Cys

    130

<210>4

<211>396

<212>DNA

<213>human

<400>4

atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgacccg 60

tgcttcagag ccaactgcga gtaccagtgc cagcccctga accaaactag ctacctctgc 120

gtctgcgccg agggcttcgc gcccattccc cacgagccgc acaggtgcca gatgttttgc 180

aaccagactg cctgtccagc cgactgcgac cccaacaccc aggctagctg tgagtgccct 240

gaaggctaca tcctggacga cggtttcatc tgcacggaca tcgacgagtg cgaaaacggc 300

ggcttctgct ccggggtgtg ccacaacctc cccggtacct tcgagtgcat ctgcgggccc 360

gactcggccc ttgcccgcca cattggcacc gactgt                           396

<210>5

<211>480

<212>PRT

<213>human

<400>5

Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly

1               5                   10                  15

Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu

            20                  25                  30

His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala

        35                  40                  45

Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser

    50                  55                  60

Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly

65                  70                  75                  80

Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys

                85                  90                  95

Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr

            100                 105                 110

Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn

        115                 120                 125

Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu

    130                 135                 140

Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val

145                 150                 155                 160

Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg

                165                 170                 175

Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr

            180                 185                 190

Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro

        195                 200                 205

Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys

    2l0                 215                 220

Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro

225                 230                 235                 240

Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys

                245                 250                 255

Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala

            260                 265                 270

Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys

        275                 280                 285

Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly

    290                 295                 300

Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln

305                 310                 315                 320

His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys

                325                 330                 335

Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr

            340                 345                 350

Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro

        355                 360                 365

Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr

    370                 375                 380

Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu

385                 390                 395                 400

Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp

                405                 410                 415

Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile

            420                 425                 430

Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly

        435                 440                 445

Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys

    450                 455                 460

Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys

465                 470                 475                 480

<210>6

<211>1440

<212>DNA

<213>human

<400>6

atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgcaccc 60

gcagagccgc agccgggtgg cagccagtgc gtcgagcacg actgcttcgc gctctacccg 120

ggccccgcga ccttcctcaa tgccagtcag atctgcgacg gactgcgggg ccacctaatg 180

acagtgcgct cctcggtggc tgccgatgtc atttccttgc tactgaacgg cgacggcggc 240

gttggccgcc ggcgcctctg gatcggcctg cagctgccac ccggctgcgg cgaccccaag 300

cgcctcgggc ccctgcgcgg cttccagtgg gttacgggag acaacaacac cagctatagc 360

aggtgggcac ggctcgacct caatggggct cccctctgcg gcccgttgtg cgtcgctgtc 420

tccgctgctg aggccactgt gcccagcgag ccgatctggg aggagcagca gtgcgaagtg 480

aaggccgatg gcttcctctg cgagttccac ttcccagcca cctgcaggcc actggctgtg 540

gagcccggcg ccgcggctgc cgccgtctcg atcacctacg gcaccccgtt cgcggcccgc 600

ggagcggact tccaggcgct gccggtgggc agctccgccg cggtggctcc cctcggctta 660

cagctaatgt gcaccgcgcc gcccggagcg gtccaggggc actgggccag ggaggcgccg 720

ggcgcttggg actgcagcgt ggagaacggc ggctgcgagc acgcgtgcaa tgcgatccct 780

ggggctcccc gctgccagtg cccagccggc gccgccctgc aggcagacgg gcgctcctgc 840

accgcatccg cgacgcagtc ctgcaacgac ctctgcgagc acttctgcgt tcccaacccc 900

gaccagccgg gctcctactc gtgcatgtgc gagaccggct accggctggc ggccgaccaa 960

caccggtgcg aggacgtgga tgactgcata ctggagccca gtccgtgtcc gcagcgctgt 1020

gtcaacacac agggtggctt cgagtgccac tgctacccta actacgacct ggtggacggc 1080

gagtgtgtgg agcccgtgga cccgtgcttc agagccaact gcgagtacca gtgccagccc 1140

ctgaaccaaa ctagctacct ctgcgtctgc gccgagggct tcgcgcccat tccccacgag 1200

ccgcacaggt gccagatgtt ttgcaaccag actgcctgtc cagccgactg cgaccccaac 1260

acccaggcta gctgtgagtg ccctgaaggc tacatcctgg acgacggttt catctgcacg 1320

gacatcgacg agtgcgaaaa cggcggcttc tgctccgggg tgtgccacaa cctccccggt 1380

accttcgagt gcatctgcgg gcccgactcg gcccttgtcc gccacattgg caccgactgt 1440

<210>7

<211>480

<212>PRT

<213>human

<400>7

Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly

1               5                   10                  15

Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu

            20                  25                  30

His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala

        35                  40                  45

Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser

    50                  55                  60

Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly

65                  70                  75                  80

Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys

                85                  90                  95

Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr

            100                 105                 110

Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn

        115                 120                 125

Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu

    130                 135                 140

Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val

145                 150                 155                 160

Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg

                165                 170                 175

Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr

            180                 185                 190

Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro

        195                 200                 205

Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys

    210                 215                 220

Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro

225                 230                 235                 240

Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys

                245                 250                 255

Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala

            260                 265                 270

Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys

        275                 280                 285

Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly

    290                 295                 300

Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln

305                 310                 315                 320

His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys

                325                 330                 335

Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr

            340                 345                 350

Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro

        355                 360                 365

Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr

    370                 375                 380

Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu

385                 390                 395                 400

Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp

                405                 410                 415

Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile

            420                 425                 430

Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly

        435                 440                 445

Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys

    450                 455                 460

Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly Thr Asp Cys

465                 470                 475                 480

<210>8

<211>1440

<212>DNA

<213>human

<400>8

atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgcaccc 60

gcagagccgc agccgggtgg cagccagtgc gtcgagcacg actgcttcgc gctctacccg 120

ggccccgcga ccttcctcaa tgccagtcag atctgcgacg gactgcgggg ccacctaatg 180

acagtgcgct cctcggtggc tgccgatgtc atttccttgc tactgaacgg cgacggcggc 240

gttggccgcc ggcgcctctg gatcggcctg cagctgccac ccggctgcgg cgaccccaag 300

cgcctcgggc ccctgcgcgg cttccagtgg gttacgggag acaacaacac cagctatagc 360

aggtgggcac ggctcgacct caatggggct cccctctgcg gcccgttgtg cgtcgctgtc 420

tccgctgctg aggccactgt gcccagcgag ccgatctggg aggagcagca gtgcgaagtg 480

aaggccgatg gcttcctctg cgagttccac ttcccagcca cctgcaggcc actggctgtg 540

gagcccggcg ccgcggctgc cgccgtctcg atcacctacg gcaccccgtt cgcggcccgc 600

ggagcggact tccaggcgct gccggtgggc agctccgccg cggtggctcc cctcggctta 660

cagctaatgt gcaccgcgcc gcccggagcg gtccaggggc actgggccag ggaggcgccg 720

ggcgcttggg actgcagcgt ggagaacggc ggctgcgagc acgcgtgcaa tgcgatccct 780

ggggctcccc gctgccagtg cccagccggc gccgccctgc aggcagacgg gcgctcctgc 840

accgcatccg cgacgcagtc ctgcaacgac ctctgcgagc acttctgcgt tcccaacccc 900

gaccagccgg gctcctactc gtgcatgtgc gagaccggct accggctggc ggccgaccaa 960

caccggtgcg aggacgtgga tgactgcata ctggagccca gtccgtgtcc gcagcgctgt 1020

gtcaacacac agggtggctt cgagtgccac tgctacccta actacgacct ggtggacggc 1080

gagtgtgtgg agcccgtgga cccgtgcttc agagccaact gcgagtacca gtgccagccc 1140

ctgaaccaaa ctagctacct ctgcgtctgc gccgagggct tcgcgcccat tccccacgag 1200

ccgcacaggt gccagatgtt ttgcaaccag actgcctgtc cagccgactg cgaccccaac 1260

acccaggcta gctgtgagtg ccctgaaggc tacatcctgg acgacggttt catctgcacg 1320

gacatcgacg agtgcgaaaa cggcggcttc tgctccgggg tgtgccacaa cctccccggt 1380

accttcgagt gcatctgcgg gcccgactcg gcccttgccc gccacattgg caccgactgt 1440

<210>9

<211>516

<212>PRT

<213>human

<400>9

Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly

1               5                   10                  15

Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu

            20                  25                  30

His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala

        35                  40                  45

Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser

    50                  55                  60

Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly

65                  70                  75                  80

Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys

                85                  90                  95

Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr

            100                 105                 110

Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn

        115                 120                 125

Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu

    130                 135                 140

Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val

145                 150                 155                 160

Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg

                165                 170                 175

Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr

            180                 185                 190

Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro

        195                 200                 205

Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys

    210                 215                 220

Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro

225                 230                 235                 240

Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys

                245                 250                 255

Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala

            260                 265                 270

Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys

        275                 280                 285

Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly

    290                 295                 300

Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln

305                 310                 315                 320

His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys

                325                 330                 335

Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr

            340                 345                 350

Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro

        355                 360                 365

Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr

    370                 375                 380

Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu

385                 390                 395                 400

Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp

                405                 410                 415

Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile

            420                 425                 430

Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly

        435                 440                 445

Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys

    450                 455                 460

Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys

465                 470                 475                 480

Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro

                485                 490                 495

Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu

            500                 505                 510

Val His Ser Gly

        515

<210>10

<211>1548

<212>DNA

<213>human

<400>10

atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgcaccc 60

gcagagccgc agccgggtgg cagccagtgc gtcgagcacg actgcttcgc gctctacccg 120

ggccccgcga ccttcctcaa tgccagtcag atctgcgacg gactgcgggg ccacctaatg 180

acagtgcgct cctcggtggc tgccgatgtc atttccttgc tactgaacgg cgacggcggc 240

gttggccgcc ggcgcctctg gatcggcctg cagctgccac ccggctgcgg cgaccccaag 300

cgcctcgggc ccctgcgcgg cttccagtgg gttacgggag acaacaacac cagctatagc 360

aggtgggcac ggctcgacct caatggggct cccctctgcg gcccgttgtg cgtcgctgtc 420

tccgctgctg aggccactgt gcccagcgag ccgatctggg aggagcagca gtgcgaagtg 480

aaggccgatg gcttcctctg cgagttccac ttcccagcca cctgcaggcc actggctgtg 540

gagcccggcg ccgcggctgc cgccgtctcg atcacctacg gcaccccgtt cgcggcccgc 600

ggagcggact tccaggcgct gccggtgggc agctccgccg cggtggctcc cctcggctta 660

cagctaatgt gcaccgcgcc gcccggagcg gtccaggggc actgggccag ggaggcgccg 720

ggcgcttggg actgcagcgt ggagaacggc ggctgcgagc acgcgtgcaa tgcgatccct 780

ggggctcccc gctgccagtg cccagccggc gccgccctgc aggcagacgg gcgctcctgc 840

accgcatccg cgacgcagtc ctgcaacgac ctctgcgagc acttctgcgt tcccaacccc 900

gaccagccgg gctcctactc gtgcatgtgc gagaccggct accggctggc ggccgaccaa 960

caccggtgcg aggacgtgga tgactgcata ctggagccca gtccgtgtcc gcagcgctgt 1020

gtcaacacac agggtggctt cgagtgccac tgctacccta actacgacct ggtggacggc 1080

gagtgtgtgg agcccgtgga cccgtgcttc agagccaact gcgagtacca gtgccagccc 1140

ctgaaccaaa ctagctacct ctgcgtctgc gccgagggct tcgcgcccat tccccacgag 1200

ccgcacaggt gccagatgtt ttgcaaccag actgcctgtc cagccgactg cgaccccaac 1260

acccaggcta gctgtgagtg ccctgaaggc tacatcctgg acgacggttt catctgcacg 1320

gacatcgacg agtgcgaaaa cggcggcttc tgctccgggg tgtgccacaa cctccccggt 1380

accttcgagt gcatctgcgg gcccgactcg gcccttgtcc gccacattgg caccgactgt 1440

gactccggca aggtggacgg tggcgacagc ggctctggcg agcccccgcc cagcccgacg 1500

cccggctcca ccttgactcc tccggccgtg gggctcgtgc attcgggc              1548

<210>11

<211>516

<212>PRT

<213>human

<400>11

Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly

1               5                   10                  15

Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu

            20                  25                  30

His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala

        35                  40                  45

Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser

    50                  55                  60

Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly

65                  70                  75                  80

Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys

                85                  90                  95

Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr

            100                 105                 110

Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn

        115                 120                 125

Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu

    130                 135                 140

Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val

145                 150                 155                 160

Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg

                165                 170                 175

Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr

            180                 185                 190

Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro

        195                 200                 205

Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys

    210                 215                 220

Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro

225                 230                 235                 240

Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys

                245                 250                 255

Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala

            260                 265                 270

Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys

        275                 280                 285

Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly

    290                 295                 300

Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln

305                 310                 315                 320

His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys

                325                 330                 335

Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr

            340                 345                 350

Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro

        355                 360                 365

Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr

    370                 375                 380

Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu

385                 390                 395                 400

Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp

                405                 410                 415

Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile

            420                 425                 430

Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly

        435                 440                 445

Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys Hi s Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys

    450                 455                 460

Tle Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly Thr Asp Cys

465                 470                 475                 480

Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro

                485                 490                 495

Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu

            500                 505                 510

Val His Ser Gly

        515

<210>12

<211>1548

<212>DNA

<213>human

<400>12

atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgcaccc 60

gcagagccgc agccgggtgg cagccagtgc gtcgagcacg actgcttcgc gctctacccg 120

ggccccgcga ccttcctcaa tgccagtcag atctgcgacg gactgcgggg ccacctaatg 180

acagtgcgct cctcggtggc tgccgatgtc atttccttgc tactgaacgg cgacggcggc 240

gttggccgcc ggcgcctctg gatcggcctg cagctgccac ccggctgcgg cgaccccaag 300

cgcctcgggc ccctgcgcgg cttccagtgg gttacgggag acaacaacac cagctatagc 360

aggtgggcac ggctcgacct caatggggct cccctctgcg gcccgttgtg cgtcgctgtc 420

tccgctgctg aggccactgt gcccagcgag ccgatctggg aggagcagca gtgcgaagtg 480

aaggccgatg gcttcctctg cgagttccac ttcccagcca cctgcaggcc actggctgtg 540

gagcccggcg ccgcggctgc cgccgtctcg atcacctacg gcaccccgtt cgcggcccgc 600

ggagcggact tccaggcgct gccggtgggc agctccgccg cggtggctcc cctcggctta 660

cagctaatgt gcaccgcgcc gcccggagcg gtccaggggc actgggccag ggaggcgccg 720

ggcgcttggg actgcagcgt ggagaacggc ggctgcgagc acgcgtgcaa tgcgatccct 780

ggggctcccc gctgccagtg cccagccggc gccgccctgc aggcagacgg gcgctcctgc 840

accgcatccg cgacgcagtc ctgcaacgac ctctgcgagc acttctgcgt tcccaacccc 900

gaccagccgg gctcctactc gtgcatgtgc gagaccggct accggctggc ggccgaccaa 960

caccggtgcg aggacgtgga tgactgcata ctggagccca gtccgtgtcc gcagcgctgt 1020

gtcaacacac agggtggctt cgagtgccac tgctacccta actacgacct ggtggacggc 1080

gagtgtgtgg agcccgtgga cccgtgcttc agagccaact gcgagtacca gtgccagccc 1140

ctgaaccaaa ctagctacct ctgcgtctgc gccgagggct tcgcgcccat tccccacgag 1200

ccgcacaggt gccagatgtt ttgcaaccag actgcctgtc cagccgactg cgaccccaac 1260

acccaggcta gctgtgagtg ccctgaaggc tacatcctgg acgacggttt catctgcacg 1320

gacatcgacg agtgcgaaaa cggcggcttc tgctccgggg tgtgccacaa cctccccggt 1380

accttcgagt gcatctgcgg gcccgactcg gcccttgccc gccacattgg caccgactgt 1440

gactccggca aggtggacgg tggcgacagc ggctctggcg agcccccgcc cagcccgacg 1500

cccggctcca ccttgactcc tccggccgtg gggctcgtgc attcgggc              1548

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成DNA

<400>13

aatgtggcgg gcaagggccg a                                           21

Claims (14)

1.一种可溶性血栓调节蛋白的制造方法，该可溶性血栓调节蛋白实质上不含有能够由可溶性血栓调节蛋白在酸性下生成的该可溶性血栓调节蛋白的变性体，其中，该方法包括如下工序：

(1)将含有或疑似含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石；以及

(2)在能够将该可溶性血栓调节蛋白和该可溶性血栓调节蛋白的变性体分离的分离条件下，得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的级分。

2.如权利要求1所述的制造方法，该方法是制造实质上不含有能够由可溶性血栓调节蛋白在酸性下生成的该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的方法，其中，该方法包括如下工序：

(0)将该可溶性血栓调节蛋白置于pH为5以下的酸性下；

(1)将经上述工序(0)得到的含有或疑似含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体或羟基磷灰石；以及

(2)在能够将该可溶性血栓调节蛋白和该可溶性血栓调节蛋白的变性体分离的分离条件下，得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的级分。

3.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，相对于可溶性血栓调节蛋白含有物中的全蛋白，可溶性血栓调节蛋白的含量为80％以上。

4.如权利要求1～3任意一项所述的制造方法，其中，工序(2)是通过进行线性或分段、或者线性和分段的组合的梯度洗脱来得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分的工序。

5.如权利要求1～3任意一项所述的制造方法，其中，工序(2)是得到流通级分的工序，该工序中得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的级分。

6.如权利要求1～3任意一项所述的制造方法，其中，工序(2)是通过进行等度洗脱来得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分的工序。

7.如权利要求1～3任意一项所述的制造方法，其中，工序(1)中，使用pH为4～9的缓冲液，将该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体；工序(2)中，使用pH为5～9且盐浓度为0M～1M的缓冲液，进行线性或分段、或者线性和分段的组合的梯度洗脱，(a)预先确认可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分的位置，得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分；或者(b)一边确认在洗脱级分中是否存在可溶性血栓调节蛋白，一边得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分。

8.如权利要求1～3任意一项所述的制造方法，其中，工序(1)中，使用pH为5～8且盐浓度为0.1M～0.2M的缓冲液，将该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于阴离子交换体；工序(2)中，通过使用pH为5～8且盐浓度为0.1M～0.2M的缓冲液得到流通级分，从而得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的级分。

9.如权利要求1～3任意一项所述的制造方法，其中，工序(1)中，使用pH为6～9且磷酸盐浓度为8mM以下的缓冲液，将可溶性血栓调节蛋白含有物供给于羟基磷灰石；工序(2)中，使用pH为6～9且磷酸盐浓度为0M～0.5M的缓冲液，进行线性或分段、或者线性和分段的组合的梯度洗脱，(a)预先确认可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分的位置，得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分；或者(b)一边确认在洗脱级分中是否存在可溶性血栓调节蛋白，一边得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分。

10.如权利要求1～3任意一项所述的制造方法，其中，工序(1)中，使用pH为6～9且磷酸盐浓度为5mM～20mM的缓冲液，将该可溶性血栓调节蛋白含有物供给于羟基磷灰石；工序(2)中，通过使用pH为6～9且磷酸盐浓度为5mM～20mM的缓冲液得到流通级分，从而得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的级分。

11.如权利要求1～10任意一项所述的制造方法，其中，该方法在得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分之后，不包括使该级分的pH为4以下的工序。

12.如权利要求1～11任意一项所述的制造方法，其中，该方法在得到包含实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白的洗脱级分之后，包括不使该级分的pH为4以下的浓缩工序和/或脱盐工序，该制造方法用于将该可溶性血栓调节蛋白制成药品原料。

13.如权利要求1～12任意一项所述的制造方法，其中，实质上不含有该可溶性血栓调节蛋白的变性体的可溶性血栓调节蛋白中，可溶性血栓调节蛋白的变性体的含量为3％以下。

14.如权利要求1～13任意一项所述的制造方法，其中，该可溶性血栓调节蛋白是由转化细胞得到的，该转化细胞是通过将编码序列编号9或序列编号11记载的氨基酸序列的DNA转染至宿主细胞而制备的。

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