CN104211808A

CN104211808A - 一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN104211808A
Application number: CN201310089727.7A
Authority: CN
Inventors: 苏云鹏; 刘晓斌; 周宇; 王猛; 邓磊修
Original assignee: SHANDONG XIANSHENG MAIDEJIN BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd; Jiangsu Simcere Pharmaceutical R&D Co Ltd; Jiangsu Simcere Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Simcere Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-06-05
Filing date: 2013-06-05
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2033-06-05
Also published as: CN104211808B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白的制备方法，包括步骤a.选用工程菌LZ-TRAIL95-pET25b-BL（DE3）CGMCC No.4953做为菌株进行发酵培养，还包括步骤：b.对发酵培养所得菌体进行洗涤、破碎；c.对破碎所得菌体物质进行硫酸铵沉淀处理；d.对硫酸铵沉淀处理所得菌体物质进行层析纯化处理；e.对层析纯化所得菌体物质进行脱盐和缓冲液更换处理。同现有技术相比较，采用本制备方法，可以实现TRAIL融合蛋白的工业化生产，为TRAIL融合蛋白的实际应用提供可能。

Description

一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白的制备方法。

背景技术

1995年，Wiley SR等报道从人表达标签序列文库（EST,expressed sequence tag）中筛选到一种编码抗肿瘤蛋白的基因，该基因编码的蛋白称为肿瘤坏死因子相关凋亡配体(tumor necrosis factor-relate d apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，又称凋亡素2配体(Apo2L)，属于肿瘤坏死因子超家族（Wiley SR,et al.,Immunity3:673-682,1995）。人TRAIL基因位于染色体3q26，全长1769bp，共编码281个氨基酸。TRAIL蛋白是一种II型跨膜蛋白，分子量为32.5KDa，理论等电点为7.63，其中C末端114-281位氨基酸构成了TRAIL蛋白的胞外区，发挥主要功能。

研究表明，TRAIL对多种恶性肿瘤具有抑制细胞生长和细胞毒作用，而人体的正常细胞则对TRAIL诱导的凋亡耐受（Ashkenazi A,et al.,J Clin Invest104:155-162,1999）。鉴于TRAIL蛋白在抗肿瘤领域的潜在临床应用价值，TRAIL作为抗肿瘤药物的开发受到了越来越多的关注。

TRAIL虽然在体内外实验以及临床实验中均显示了显著的抑制肿瘤细胞生长的作用，但是半衰期比较短，人体内半衰期仅有40分钟，严重影响了TRAIL蛋白在体内的疗效。

本发明的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白，其包含：人源亮氨酸拉链结构域；人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段。与野生型的TRAIL相比，TRAIL融合蛋白的稳定性显著增加，半衰期大幅延长，治疗效果显著提高，具有广泛的应用前景。

目前，TRAIL蛋白的表达主要采用酵母和大肠杆菌两种表达系统。酵母表达系统成本较高且容易造成TRAIL蛋白的基团修饰；大肠杆菌表达系统表达的TRAIL蛋白大多为包涵体，可溶性蛋白产量低，并且纯化过程繁琐复杂。因此，开发适用于规模化生产的TRAIL蛋白制备工艺，对TRAIL蛋白的临床应用意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供一种在大肠杆菌中表达的TRAIL融合蛋白的制备方法，此种制备方法实现了TRAIL融合蛋白的工业化生产，为TRAIL融合蛋白的实际应用提供可能。

本发明提供的TRAIL融合蛋白的制备方法，其特征在于包含以下步骤的层析纯化处理：

1）发酵上清液，上亲和层析柱，收集37.5mmol/l咪唑洗脱目的峰；

2）上阴离子交换层析柱，收集40%盐浓度目的峰；

3）上疏水层析柱，收集55%盐浓度目的峰；

4）上疏水层析柱，收集55%盐浓度目的峰。

本发明所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白包括：人源亮氨酸拉链结构域；人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段。

TRAIL（肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）是一种在本技术领域内被熟知的蛋白。TRAIL核苷酸序列GenBank登录号NM_003810。TRAIL蛋白的功能是作为死亡受体DR4(TRAIL-RI)和死亡受体DR5(TRAIL-RII)的配体，与其结合诱导凋亡或细胞死亡。人源TRAIL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示，其胞外区是从N端开始的第41位至第281位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No:7所示.

依照本发明，一种TRAIL融合蛋白从N端至C端具有如下序列：（1）人源亮氨酸拉链序列；（2）根据情况可有一不多于10个氨基酸的连接区；（3）人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段，可以与死亡受体DR4(TRAIL-RI)或者死亡受体DR5(TRAIL-RII)相结合。

融合蛋白中的人源TRAIL多肽可以是天然TRAIL蛋白全长或者部分片段，长度足以与死亡受体DR4(TRAIL-RI)和死亡受体DR5(TRAIL-RII)结合。优选的是融合蛋白中的TRAIL多肽可以是TRAIL蛋白的胞外区，包含天然人源TRAIL蛋白胞外区的全长或者部分片段。

更加优选的是融合蛋白中的TRAIL多肽是一种TRAIL蛋白的可溶性片段，包含TRAIL蛋白胞外区的全长或者部分片段，不含有人源TRAIL蛋白的跨膜区以及胞内区。在一种实施方案中，本发明所述融合蛋白中的人源TRAIL多肽含有如SEQ ID No:2所示氨基酸序列。

作为优选，其中所述人源亮氨酸拉链结构域为人c-fos，c-jun，c-myc，max、mdx1或人matrilin蛋白所含有的亮氨酸拉链结构域。

在本发明的具体实施例中，其中所述人源亮氨酸拉链结构域含有如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。

在一种实施方案中，其中所述TRAIL融合蛋白包含SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。

在本发明的实施例中，具体提供一种重组了编码本发明所述的融合蛋白的DNA分子的大肠杆菌，所述大肠杆菌于2011年6月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4953。

本发明的层析纯化步骤1）中所述亲和层析柱介质为Ni-NTA；步骤2）中阴离子交换柱介质为Q Sepharose Fast Flow；步骤3）中疏水层析柱介质为Butyl Sepharose4FF；步骤4）中疏水层析柱介质为Phenyl Sepharose High Performance。

本发明的层析纯化中的发酵上清液通过以下步骤获得：

①选用工程菌LZ-TRAIL95-pET25b-BL21(DE3)CGMCC No.4953作为菌株进行发酵培养；

②对发酵培养所得菌体进行洗涤和破碎；

③对破碎所得菌体物质进行硫酸铵沉淀处理。

本发明对于工程菌发酵培养所得的菌体进行洗涤和破碎，具体步骤包括：在发酵所得菌体中加入含有DTT和溶菌酶的Tris-Cl溶液；使用高速剪切机和高压均质机破碎菌体；经离心后分离获得上清。DTT即DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇，分子式为C₄H₁₀O₂S₂，分子量为154.25。

发酵上清液经过层析纯化步骤之后，还需要对层析处理所得菌体物质进行脱盐和缓冲液更换处理，具体步骤：

①向层析纯化后蛋白溶液中加入柠檬酸-磷酸盐缓冲液，混匀；

②使用膜包进行流加超滤透析脱盐并置换缓冲液。

同现有技术相比较，采用本制备方法，可以实现TRAIL融合蛋白的工业化生产，为TRAIL融合蛋白的实际应用提供可能。

生物保藏说明

菌株LZ-TRAIL95CS，分类命名：大肠埃希氏菌，Escherichia coli.于2011年6月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.4953。

附图说明

图1显示的是融合蛋白结构示意图。

A–人源亮氨酸拉链结构域

B–连接区

C–TRAIL胞外区

图2显示的是LZ-TRAIL蛋白经Ni-NTA层析柱纯化后的SDS-PAGE鉴定结果。

泳道1：蛋白电泳Marker；

泳道2：Ni-NTA层析柱上样样品；

泳道3：层析流穿样品；

泳道4：15%Buffer B洗脱蛋白峰E1；

泳道5：15%Buffer B洗脱蛋白峰E2；

泳道6：100%Buffer B洗脱蛋白峰E3

箭头所示为目标蛋白。

图3显示的是LZ-TRAIL蛋白经Q Sepharose Fast Flow层析柱纯化后的SDS-PAGE鉴定结果。

泳道1：蛋白电泳Marker；

泳道2：Q Sepharose Fast Flow层析柱上样样品；

泳道3：层析流穿样品；

泳道4：24%Buffer C洗脱蛋白峰E1;

泳道5：40%Buffer C洗脱蛋白峰E2；

泳道6：100%Buffer C洗脱蛋白峰E3。

箭头所示为目标蛋白。

图4显示的是LZ-TRAIL蛋白经Butyl Sepharose4FF层析柱纯化后的SDS-PAGE鉴定结果。

泳道1：蛋白电泳Marker；

泳道2：Butyl Sepharose4FF层析柱上样样品；

泳道3：层析流穿样品；

泳道4：45%Buffer A洗脱蛋白峰E1；

泳道5：100%Buffer A洗脱蛋白峰E2。

箭头所示为目标蛋白。

图5显示的是LZ-TRAIL蛋白经Phenyl Sepharose High Performance层析柱纯化后的SDS-PAGE鉴定结果。

泳道1：蛋白电泳Marker；

泳道2：Phenyl Sepharose High Performance层析柱上样样品；

泳道3：层析流穿样品；

泳道4：45%Buffer A洗脱蛋白峰E1；

泳道5：100%Buffer A洗脱蛋白峰E2。

箭头所示为目标蛋白。

图6显示的是LZ-TRAIL蛋白纯化后的SEC-HPLC（214nm）鉴定结果。

图7显示乳腺癌细胞MDA-MB231裸鼠荷瘤模型的肿瘤生长曲线。

图8显示乳腺癌细胞MDA-MB231裸鼠荷瘤模型的体重变化曲线。

图9显示的是融合蛋白和人源TRAIL蛋白给药后小鼠体内血药浓度变化曲线。

图10显示的是C18反相色谱柱检测图谱

具体实施方式

本发明公开了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）融合蛋白的制备工艺。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的目的是提供一种TRAIL融合蛋白的制备方法。

所述的TRAIL融合蛋白包括：人源亮氨酸拉链结构域；人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段。

TRAIL（肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）是一种在本技术领域内被熟知的蛋白。TRAIL核苷酸序列GenBank登录号NM_003810。TRAIL蛋白的功能是作为死亡受体DR4(TRAIL-RI)和死亡受体DR5(TRAIL-RII)的配体，与其结合诱导凋亡或细胞死亡。人源TRAIL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示，其胞外区是从N端开始的第41位至第281位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No:7所示。

所述TRAIL融合蛋白从N端至C端具有如下序列：（1）人源亮氨酸拉链序列；（2）根据情况可有一不多于10个氨基酸的连接区；（3）人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段，可以与死亡受体DR4(TRAIL-RI)或者死亡受体DR5(TRAIL-RII)相结合。

融合蛋白中的人源TRAIL多肽可以是天然TRAIL蛋白全长或者部分片段，长度足以与死亡受体DR4(TRAIL-RI)和死亡受体DR5(TRAIL-RII)结合。优选的是融合蛋白中的TRAIL 多肽可以是TRAIL蛋白的胞外区，包含天然人源TRAIL蛋白胞外区的全长或者部分片段。更加优选的是融合蛋白中的TRAIL多肽是一种TRAIL蛋白的可溶性片段，包含TRAIL蛋白胞外区的全长或者部分片段，不含有人源TRAIL蛋白的跨膜区以及胞内区。在一种实施方案中，本发明所述融合蛋白中的人源TRAIL多肽含有如SEQ ID No:2所示氨基酸序列。

在本发明的一个实施例中，其中所述人源亮氨酸拉链结构域含有如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，其中所述TRAIL融合蛋白包含SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。

上述TRAIL融合蛋白会形成由3个分子组成的寡聚体，这种寡聚体的形成是通过亮氨酸拉链结构域进行加强的。

在一个实施方案中，所述融合蛋白的DNA分子含有SEQ ID No:4所示的核苷酸序列。

在一实施方案中，TRAIL融合蛋白制备的具体步骤为：

1)选用工程菌LZ-TRAIL95-pET25b-BL（DE3）CGMCC No.4953做为菌株进行发酵培养。

2)将发酵菌体溶于Buffer A（20mM Tris、2mM DTT，pH8.0）中溶解，加入溶菌酶，分别使用高速剪切机和高压均质机破碎菌体。

3)破碎后菌液，经离心后分离上清，并向上清中缓慢加入3mol/L硫酸铵溶液，是硫酸铵终浓度为1.5mol/L，沉淀目的蛋白。离心，收集沉淀，重溶于Buffer A中。

4)将沉淀重溶的蛋白溶液上Ni-NTA亲和层析柱，Buffer A平衡层析柱，Buffer B（20mM Tris、250mM Imidazole、2mM DTT、pH8.0）梯度洗脱目的蛋白，根据洗脱峰，收集15%Buffer B洗脱的目的蛋白。

5)上Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，Buffer A平衡层析柱，Buffer C（20mM Tris、500mM NaCl、2mM DTT、pH8.0）梯度洗脱目的蛋白，根据洗脱峰，收集40%Buffer B洗脱的目的蛋白。

6)将Buffer D（3M(NH₄)₂SO₄、20mM Tris、2mM DTT、pH8.0）按体积比1:1的比例缓慢加入到Q Sepharose Fast Flow洗脱液中，混合均匀。

7)上Butyl Sepharose4FF疏水层析柱，Buffer E（1.5M(NH₄)₂SO₄、20mM Tris、2mMDTT、pH8.0）平衡层析柱，Buffer A（20mM Tris、2mM DTT，pH8.0）梯度洗脱目的蛋白，根据洗脱峰，收集45%Buffer A洗脱的目的蛋白。

8)将Buffer D（3M(NH₄)₂SO₄、20mM Tris、2mM DTT、pH8.0）按体积比20:9的比例，缓慢加入到Butyl Sepharose4FF洗脱液中，混合均匀。

9)上Phenyl Sepharose High Performance疏水层析柱，Buffer E（1.5M(NH₄)₂SO₄、20mM Tris、2mM DTT、pH8.0）平衡层析柱，Buffer A（20mM Tris、2mM DTT，pH8.0）梯度洗脱目的蛋白，根据洗脱峰，收集45%Buffer A洗脱的目的蛋白。

10)使用超滤器对Solution D溶液（20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、0.5%GSH、50mM NaCl，pH5.5）进行超滤，收集于干热处理过的容器中。

11)向装有待透析蛋白溶液容器中加入Solution D搅拌，以QuattroFlow1200泵，以转速10平衡膜包。

12)以Watson-Marlow520S蠕动泵将Solution D泵入容器中，搅拌均匀，启动QuattroFlow1200泵，保持滤出和流加速度相等，进行蛋白溶液流加透析。

13)向蛋白溶液中补加Tween80，缓慢搅拌，混匀。

14)使用超滤器进行蛋白样品浓缩。

采用本发明方法进行制备，最终可得到纯度>98%的具有活性的可溶性TRAIL融合蛋白，该TRAIL融合蛋白可应用于制备抗肿瘤药物。

动物试验显示，人源TRAIL蛋白对照组对肿瘤的抑制率为35.8%，而本发明所述融合蛋白组肿瘤完全消失，且裸鼠状态明显好于给予人源TRAIL蛋白的阳性对照组，表明与TRAIL相比，本发明所述融合蛋白毒性更低。另外，本发明所述融合蛋白的体内消除速度明显低于TRAIL蛋白，说明融合蛋白与TRAIL相比半衰期明显延长。

下面将结合最佳实施例的详细描述和附图，进一步说明本发明前述的和其他的优点和特点。

实施例1：

发明人经过大量实验发现，构建的融合蛋白LZ-TRAIL95治疗肿瘤可达到完全消失的效果，且裸鼠状态明显好于给予人源TRAIL蛋白的阳性对照组，表明与TRAIL相比，融合蛋白LZ-TRAIL95毒性更低。另外，融合蛋白的体内半衰期为218分钟，显著高于人源TRAIL 蛋白。

融合蛋白LZ-TRAIL95含有3部分：交联区、LZ(亮氨酸拉链)和TRAIL胞外区。其中交联区含有2个半胱氨酸，在活性形式三聚体结构中，两两形成分子间二硫键，起到加固TRAIL三聚体的作用，其序列如下：

MEEDPCACESLVKFQAKVEGLLQALTRKLEAVSKRLAILENTVVGSTSEETISTVQEK QQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSN LHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARN SCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

LZ-TRAIL95蛋白遇到的最大问题是二硫键错配，在非还原电泳表现为不均一条带。经Western blotting以及肽图证明各条带均为LZ-TRAIL95蛋白。添加多种药用辅料抗氧剂均不能解决这一问题。

为了解决LZ-TRAIL95二硫键错配的问题，将LZ片段N端两个Cys突变为Ser，构建LZ-TRAIL95CS蛋白的表达载体，其表达的LZ-TRAIL95CS蛋白序列如SEQ ID No.3所示，结果表明突变可以大大缓解LZ-TRAIL95的不均一化问题。

完全去除DTT前后，C18反相色谱柱检测图谱如图10所示，纯度90%。与LZ-TRAIL95相比，蛋白均一程度明显改善。分子筛鉴定表明，LZ-TRAIL95CS蛋白在分子筛中的保留时间要比BSA单体（68KD）保留时间短，见表1，说明LZ-TRAIL95CS的分子量大于68KD，是以活性形式三聚体存在。

表1：LZ-TRAIL95CS与BSA在SEC-HPLC保留时间对比结果

蛋白名称	出峰时间（min）
		LZ-TRAIL95CS	14.880
BSA	15.366

实施例2.构建融合蛋白表达载体

以上海旭冠生物科技发展有限公司合成的亮氨酸拉链（LZ，人源亮氨酸拉链结构域，密码子优化使之适合于在大肠杆菌内表达）片段为模板，通过PCR方法扩增出所需的DNA片段，在引物中所用引物LZ1和LZ2由上海生工生物工程技术有限公司合成。其中LZ1将第6位和第8位半胱氨酸突变为丝氨酸；LZ2除含有LZ片段的3’末端序列，还在其3’末端后加入编码GlySer接头肽的序列。

LZ1：5’

GGAATTCCATATGGAGGAAGACCCGTCGGCCTCGGAAAGCCTGGTGAAATTTC

LZ2：5’CGCGGATCCGACAACGGTGTTTTCCAGG

TRAIL片段是截取TRAIL全序列第95～281位氨基酸，用PCR方法从人胎肝库cDNA文库（购自Clontech LaNoratories Inc.USA）扩增，所用引物TRAIL1和TRAIL2由上海生工生物工程技术有限公司合成。经序列分析，所得DNA序列与GenBank登记的序列（NM_003810）所显示的TRAIL编码序列一致，即获得了TRAIL的DNA序列。

TRAIL1：5’CGGGATCCACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAG

TRAIL2：5’GGGAATTCTCATTAGCCAACTAAAAAGGCCCC

以NdeI和BamHI酶切LZ片段PCR扩增产物（工具酶皆购自Takara公司），以BamHI和EcoRI酶切TRAIL序列PCR扩增产物，以NdeI和EcoRI酶切pET25b空质粒（购自Novage公司）。上述酶切片段均以琼脂糖凝胶回收相应大小的片段，用T4DNA连接酶连接各片段，所得的重组质粒即为TRAIL融合蛋白的表达载体，命名为pET-LZ-TRAIL。融合蛋白结构如图1所示。

按常规方法将上述获得的pET-LZ-TRAIL质粒转化大肠杆菌BL21，[基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）]（购自北京全式金生物技术有限公司），从氨苄抗性菌落中分离质粒DNA，酶切鉴定，测序确认，所得的阳性克隆即为表达相应蛋白的工程菌LZ-TRAIL95CS，分类命名：大肠埃希氏菌，Escherichia coli.于2011年6月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.4953。

实施例3：TRAIL融合蛋白的制备

将工程菌LZ-TRAIL95-pET25b-BL（DE3）CGMCC No.4953接入一级培养瓶中培养8个小时，然后从一级培养瓶中按5%接种量接种至二级培养瓶中，培养10小时。发酵罐平衡后，接入二级种子液开始发酵。37°C培养，待菌体浓度OD_600nm≈30左右，降温至25°C，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，开始诱导，诱导时间为11小时。发酵完毕后，发酵液14000rpm离心10分钟，收集菌体，称重，每升发酵液得湿菌体125g，将洗好的菌体放置于-20°C冰柜中保存。

将发酵菌体溶于Buffer A（20mM Tris、2mM DTT、pH8.0）中溶解，加入溶菌酶，终浓度为0.1g/L，使用高速剪切机，9000rpm剪切30分钟，混匀菌体。然后使用高压均质机处理菌液，每次操作压力为40Mpa，处理15分钟，共处理3次。破碎后菌液，14000rpm 离心40分钟，收集上清液。

向上清液中缓慢加入3mol/L硫酸铵溶液，使硫酸铵溶液的终浓度为1.5mol/L，14000rpm离心15分钟，除去杂质沉淀，收集上清液；向上清液中再缓慢加入3mol/L硫酸铵溶液，是硫酸铵溶液的终浓度为1.5mol/L，14000rpm离心15分钟，弃去上清，收集沉淀。

使用Buffer A缓冲液重溶沉淀，得到复溶液。

QIAGEN Ni-NTA亲和层析：色谱柱型号：Index100/500，填料体积785ml，柱高10cm。Buffer A平衡层析柱，流速100ml/min，共平衡3-5个柱体积；以100ml/min流速上复溶液样品，上样完毕后，Buffer A以100ml/min流速冲洗层析柱1-2个柱体积，待280nm检测信号恢复水平后，Buffer C（20mM Tris、500mM NaCl、2mM DTT、pH8.0）冲洗层析柱5个柱体积，然后Buffer A再冲洗1-2个柱体积，待电导曲线恢复水平后，开始洗脱。使用15%Buffer B（20mM Tris、250mM Imidazole、2mM DTT、pH8.0）以100ml/min流速洗脱，收集洗脱峰，再使用100%Buffer B冲洗层析柱1-2个柱体积，最后使用6M GdmCl/8M Urea以100ml/min流速冲洗层析柱0.5个柱体积，清洗层析柱。

GE Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析：色谱柱型号：Index70/500，填料体积270ml，柱高7cm。Buffer A平衡柱子，流速80ml/min，平衡3-5个柱体积。Ni-NTA洗脱液上样，流速80ml/min；上样完毕后，Buffer A冲洗2-4个柱体积，待280nm检测信号恢复水平后，Buffer C开始洗脱。分别使用24%Buffer C、40%Buffer C、100%Buffer C梯度洗脱蛋白，流速80ml/min，收集40%Buffer C的洗脱峰。

GE Butyl Sepharose4FF疏水层析：色谱柱型号：XK50/20，填料体积135ml，柱高6.7cm。将Buffer D（3M(NH₄)₂SO₄、20mM Tris、2mM DTT、pH8.0）按体积比1:1比例缓慢加入到Q Sepharose Fast Flow洗脱液中，混合均匀，作为上样样品。Buffer E（1.5M(NH₄)₂SO₄、20mM Tris、2mM DTT、pH8.0）平衡层析柱，15ml/min，平衡3-5个柱体积。以流速15ml/min，将上样样品加入层析柱，上样完毕后，Buffer E冲洗1-2个柱体积，待280nm检测信号恢复水平，开始使用Buffer A洗脱。以10ml/min的流速，分别使用20%Buffer A、45%Buffer A、100%Buffer A梯度洗脱目的蛋白，收集45%Buffer A洗脱峰。

GE Phenyl Sepharose High Performance疏水层析：色谱柱型号：XK50/20，填料体积160ml，柱高8cm。将Buffer D按体积比20:9比例，缓慢加入到Butyl Sepharose4FF洗脱液中，混匀，得到上样样品。Buffer E平衡层析柱，流速10ml/min，冲洗3-5个柱体积。以流速10ml/min，将上样样品加入层析柱中，上样完毕后，Buffer E冲洗1-2个柱体积，待280nm检测信号恢复水平，开始使用Buffer A洗脱。以10ml/min流速，分别使用20%Buffer A、 45%Buffer A、100%Buffer A梯度洗脱目的蛋白，收集45%Buffer A洗脱峰。

蛋白溶液流加透析：提前一天，将所有容器进行干热除内毒素260°C处理2h，除菌除热源。使用1M NaOH清洗以下装置2Plus膜包夹具、QuattoFlow1200隔膜泵、Slice200膜包夹具和管路，冲洗时间不少于2h。使用超纯水冲洗进液管和回流管，回流管出水排掉，待pH试纸检测pH为7后，开始循环清洗，待滤出管清洗至pH为7时清洗结束。在清洗过程中，注意进液管、回流管和滤出管不得污染。使用超滤器对Solution D（20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、0.5%GSH、50mM NaCl，pH5.5）进行超滤，收集于干热处理过的容器中，待用。

以Watson-Marlow520S蠕动泵和清洗过的管路，向装有待透析蛋白溶液的玻璃容器中加入Solution D2L，搅拌，使用QuattroFlow1200泵，以转速参数10向膜包系统泵入Solution D，平衡膜包，后减小回流流速，使得进液管压力为1bar，滤出约300ml，暂停QuattroFlow1200泵。

将蛋白溶液小心倾倒入烧杯中，以Watson-Marlow520蠕动泵将Solution D泵入烧杯，搅拌均匀，启动QuattroFlow1200泵，保持滤出和流加速度相等，循环容液体积为2.5L，共流加溶液体积42L。

使用超滤器Slice200膜包夹具对流加透析后样品进行浓缩，搅拌，蠕动泵转速25rpm，进液管压力1bar，样品溶液冰浴，收获溶液体积1L。

使用Millipore一次性除菌滤器，过滤除菌，获得最终的蛋白样品。

实施例4：体内药效实验

皮下接种乳腺癌细胞MDA-MB231建立裸鼠荷瘤模型，模型建立后进行实验。实验分阴性对照组、阳性对照组(人源TRAIL蛋白的胞外区，其氨基酸序列如SEQ ID No:5所示)与试验低剂量组（LZ-TRAIL，即为LZ-TRAIL95CS蛋白5mg/kg）、试验高剂量组（LZ-TRAIL，10mg/kg）。每组7只裸鼠，肿瘤组织接种后长至0.1cm³每天皮下给药，按等摩尔剂量给药，给药剂量分别为100ug/只/次（LZ-TRAIL低剂量组）、200ug/只/次（LZ-TRAIL高剂量组）以及146ug/只/次（TRAIL，与高剂量组等摩尔给药），共给药10次。停药后观察5天，处死裸鼠，剥离肿瘤称重，计算每组平均瘤重和抑瘤率。抑瘤率以下式计算。

结果为TRAIL组抑制率为35.8%，而相应剂量的LZ-TRAIL组肿瘤完全消失，低剂量组也达到了94.5%的抑制率。肿瘤生长曲线以及裸鼠体重变化见图7、图8。

实施例5：TRAIL的体内半衰期检测

体内半衰期检测分为对照组（TRAIL）与试验组（LZ-TRAIL，即为LZ-TRAIL95CS蛋白），每组2只小鼠，采取尾静脉注射240μg蛋白。注射后按照给药后0min，10min,30min,60min,120min,240min,1440min时间点框内取血100μl。血中TRAIL/LZ-TRAIL浓度通过ELISA法进行鉴定。血药浓度曲线见图9。

以上结果显示，本发明所述TRAIL融合蛋白LZ-TRAIL95CS蛋白可以显著降低蛋白在体内的清除速度，可以增加蛋白在体内的稳定性，显著的提高治疗效果，具有广泛的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>江苏先声药物研究有限公司；江苏先声药业有限公司；山东先声麦得津生物制药有限公司

<120>一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白的制备方法

<160>7

<210>1

<211>44

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Met Glu Glu Asp Pro Ser Ala Ser Glu Ser Leu Val Lys Phe Gln Ala

1 5 10 15

Lys Val Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ala Val

20 25 30

Ser Lys Arg Leu Ala Ile Leu Glu Asn Thr Val Val

35 40

<210>2

<211>187

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile

1 5 10 15

Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile

20 25 30

Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys

35 40 45

Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg

50 55 60

er Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu

65 70 75 80

Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe

85 90 95

Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met

100 105 110

Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu

115 120 125

Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly

130 135 140

Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp

145 150 155 160

Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His

165 170 175

Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

180 185

<210>3

<211>233

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Met Glu Glu Asp Pro Ser Ala Ser Glu Ser Leu Val Lys Phe Gln Ala

1 5 10 15

Lys Val Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ala Val

20 25 30

Ser Lys Arg Leu Ala Ile Leu Glu Asn Thr Val Val Gly Ser Thr Ser

35 40 45

Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro

50 55 60

Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly

65 70 75 80

Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu

85 90 95

Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly

100 105 110

His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile

115 120 125

His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe

130 135 140

Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln

145 150 155 160

Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys

165 170 175

Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr

180 185 190

Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile

195 200 205

Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala

210 215 220

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

225 230

<210>4

<211>699

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

atggaggaag acccgtcggc ctcggaaagc ctggtgaaat ttcaggccaa agtggagggt 60

ctgttacagg ccctgacccg caaattggaa gcagtgagca aacgcttagc aatcctggaa 120

aacaccgttg tcggatccac ctctgaggaa accatttcta cagttcaaga aaagcaacaa 180

aatatttctc ccctagtgag agaaagaggt cctcagagag tagcagctca cataactggg 240

accagaggaa gaagcaacac attgtcttct ccaaactcca agaatgaaaa ggctctgggc 300

cgcaaaataa actcctggga atcatcaagg agtgggcatt cattcctgag caacttgcac 360

ttgaggaatg gtgaactggt catccatgaa aaagggtttt actacatcta ttcccaaaca 420

tactttcgat ttcaggagga aataaaagaa aacacaaaga acgacaaaca aatggtccaa 480

tatatttaca aatacacaag ttatcctgac cctatattgt tgatgaaaag tgctagaaat 540

agttgttggt ctaaagatgc agaatatgga ctctattcca tctatcaagg gggaatattt 600

gagcttaagg aaaatgacag aatttttgtt tctgtaacaa atgagcactt gatagacatg 660

gaccatgaag ccagtttttt cggggccttt ttagttggc 699

<210>5

<211>168

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>5

Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr

1 5 10 15

Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys

20 25 30

Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His

35 40 45

Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His

50 55 60

Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln

65 70 75 80

Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr

85 90 95

Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser

100 105 110

Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser

115 120 125

Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe

130 135 140

Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser

145 150 155 160

Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

165

<210>6

<211>281

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>6

Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys

1 5 10 15

Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala

20 25 30

Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys

35 40 45

Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr

50 55 60

Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val

65 70 75 80

Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser

85 90 95

Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro

100 105 110

Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly

115 120 125

Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu

130 135 140

Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly

145 150 155 160

His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile

165 170 175

His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe

180 185 190

Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln

195 200 205

Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys

210 215 220

Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile

245 250 255

Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala

260 265 270

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

275 280

<210>7

<211>241

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>7

Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys

1 5 10 15

Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser

20 25 30

Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val

35 40 45

Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln

50 55 60

Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln

65 70 75 80

Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn

100 105 110

Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His

115 120 125

Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile

130 135 140

Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr

145 150 155 160

Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr

165 170 175

Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser

180 185 190

Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe

195 200 205

Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His

210 215 220

Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val

225 230 235 240

Gly

Claims

1.一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白的制备方法，其特征在于包含以下步骤的层析纯化处理：

2）上阴离子交换层析柱，收集40%盐浓度目的峰；

3）上疏水层析柱，收集55%盐浓度目的峰；

4）上疏水层析柱，收集55%盐浓度目的峰。

2.根据权利要求1的制备方法，所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白包括：人源亮氨酸拉链结构域；人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段。

3.根据权利要求1的制备方法，步骤1）中所述亲和层析柱介质为Ni-NTA；步骤2）中阴离子交换柱介质为Q Sepharose Fast Flow；步骤3）中疏水层析柱介质为Butyl Sepharose4FF；步骤4）中疏水层析柱介质为Phenyl Sepharose High Performance。

4.根据权利要求1的制备方法，步骤1）中所述发酵上清液通过如下步骤获得：

②对发酵培养所得菌体进行洗涤和破碎；

③对破碎所得菌体物质进行硫酸铵沉淀处理。

5.根据权利要求4的制备方法，步骤②包含以下子步骤：在发酵所得菌体中加入含有DTT和溶菌酶的Tris-Cl溶液；使用高速剪切机和高压均质机破碎菌体；经离心后分离获得上清。

6.根据权利要求1-5的制备方法，其特征在于还需要对层析处理所得菌体物质进行脱盐和缓冲液更换处理，具体步骤：

②使用膜包进行流加超滤透析脱盐并置换缓冲液。