CN101506227A - Ob折叠结构域 - Google Patents
Ob折叠结构域 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101506227A CN101506227A CNA2007800281075A CN200780028107A CN101506227A CN 101506227 A CN101506227 A CN 101506227A CN A2007800281075 A CNA2007800281075 A CN A2007800281075A CN 200780028107 A CN200780028107 A CN 200780028107A CN 101506227 A CN101506227 A CN 101506227A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- structure territory
- sheet structure
- pleated sheet
- modified
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y601/00—Ligases forming carbon-oxygen bonds (6.1)
- C12Y601/01—Ligases forming aminoacyl-tRNA and related compounds (6.1.1)
- C12Y601/01012—Aspartate-tRNA ligase (6.1.1.12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
本发明提供了具有想要的性质的经修饰的OB-折叠结构域;生产经修饰的OB-折叠结构域的文库的方法;通过此类方法生产的经修饰的OB-折叠结构域的文库;针对想要的生物学活性对此类经修饰的OB-折叠结构域的文库加以筛选的方法;以及从此类文库鉴定出的经修饰的OB-折叠结构域。本文提供了可从耐超高温热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)获得的、展示出经修饰的结合相互作用的经修饰的OB-折叠结构域。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求2006年5月26日提交的名称为“OB折叠结构域”的美国临时专利申请No.60/809,105的优先权,该申请通过引用整体并入本文。
发明背景
分子识别对生物过程来说是重要的,所述生物过程从高亲和性的蛋白质-配体相互作用到信号转导途径中更为瞬时的蛋白质-蛋白质识别事件。此类事件依赖于随着生物体进化而被改造为新作用的蛋白质的多功能性(versatility)。举例来说,为捕获外来抗原,来自免疫系统幼稚()文库(其含有大约107的变体)(1)的少量抗体识别抗原,并以中等亲和性与其结合。然后选择和成熟进一步引入突变,产生了清除抗原所需的紧密的、高度特异性的结合。以这种方式,可将结合模式的交错(staggering)阵列移植到基础抗体支架(scaffold)上,以隔离从小分子至整个细胞不等的靶标。
该策略可在实验室中复制,以产生非常大的抗体变体文库(>1010个不同克隆)(2,3),然后可针对与特定靶标的结合对所述文库加以选择。然后,扩增重复循环和针对结合进行的选择可以“发现”具有紧密和特异性的分子结合特性的试管抗体(test tube antibody)。这种体外手段还可用于其它支架。例如,通过噬菌体展示的随机化和选择已被用于研究和改善生长激素和生长因子调蛋白与其各自的受体的结合(4,5),已经从来自葡萄球菌A蛋白的三螺旋束(bundle)结构域的文库开发了“亲和体(affibodies)”(6,7)。这种常见的区域已经成为若干综述的主题(8-10)。
OB-折叠结构域是发现于多种蛋白质中的通常较小的结构基序,它们最初因为其寡核苷酸/寡糖结合性质而得名。OB-折叠结构域是五链封闭桶,OB-折叠结构域蛋白质的大部分都是用同一面来进行配体结合或者作为活性位点。不同的OB-折叠结构域使用该“折叠相关结合面”来结合寡糖、寡核苷酸、蛋白质金属离子和催化底物。在例如Arcus,Curr.Opin.Struct.Biol.,卷12:794-801(2002)和Theobald,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.,卷,32:115-33(2003)中对OB-折叠结构域进行了描述。加拿大专利公开文献No.2,378,871描述了具有结合性质的β-折叠片蛋白质。
本文提到的所有专利、专利申请、专利申请公开文件、科学出版物和其它出版物都通过引用整体并入本文。
发明内容
本发明提供了具有想要的性质的经修饰的OB-折叠结构域以及产生经修饰的OB-折叠结构域的文库的方法。本发明还提供了通过此类方法产生的经修饰OB-折叠结构域的文库以及针对想要的生物学活性对此类经修饰OB-折叠结构域的文库加以筛选的方法。此外,本发明提供了从此类文库鉴定的经修饰的OB-折叠结构域。本发明还提供了可从耐超高温热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)获得的、展示出经修饰的结合相互作用的、经修饰的OB-折叠结构域。较之天然存在的OB-折叠结构域,经修饰的OB-折叠结构域可与相同的底物结合,或者,较之天然存在的OB-折叠结构域,经修饰的OB-折叠结构域可与不同的底物结合,或者,较之天然存在的OB-折叠结构域,经修饰的OB-折叠结构域可与相同的底物和不同的底物结合。备选地,可制备这样的经修饰的OB-折叠结构域,其中,没有已知底物能与天然存在的OB-折叠结构域结合,而经修饰的OB-折叠结构域能与底物结合。
因此,在一个方面,本发明是经分离的经修饰OB-折叠结构域,其可从天然存在的OB-折叠结构域获得,其中,经修饰的OB-折叠结构域包含a)较之天然存在的OB-折叠结构域,在OB-折叠结构域结合面的β-链中的至少一个经修饰的氨基酸残基,或b)在OB-折叠结构域结合面的β-链中的至少一个经修饰的氨基酸残基和在OB-折叠结构域环区域的链中的至少一个经修饰的氨基酸残基,或c)在OB-折叠结构域环区域的链中的至少一个经修饰的氨基酸残基,并且,其中,所述经修饰的OB-折叠结构域较之天然存在的OB-折叠结构域而言具有改变的结合特性。在其中天然存在的OB-折叠结构域的结合伴侣(binding partner)已知的一种实施方式中,本发明是这样的经修饰OB-折叠结构域,其中,所述结构域特异性地与较天然存在的OB-折叠结构域不同的结合伴侣结合,或者与其天然存在的结合伴侣具有经修饰的结合。在另一实施方式中,经修饰的结合包含:较之相应的天然存在的OB-折叠结构域而言,经修饰的OB-折叠结构域与其天然存在的结合伴侣的解离常数降低至少大约25%,大约50%或者大约75%。在另一实施方式中,经修饰的结合包含:较之相应的天然存在的OB-折叠结构域而言,经修饰的OB-折叠结构域与其天然存在的结合伴侣的解离常数以至少大约2、大约3、大约4、大约5、大约6、大约8、大约10、大约15、大约20、大约25、大约50、大约100、大约200、大约500、大约1000、大约5000、大约10,000、大约50,000或者大约100,000的因子减少。在另一实施方式中,本发明是这样的经修饰的OB-折叠结构域,其中,天然存在的OB-折叠结构域存在于蛋白质或蛋白质类中,其选自葡萄球菌核酸酶蛋白质、细菌肠毒素、TIMP样蛋白质、血红素分子伴侣CcmE蛋白质、尾部-相关溶菌酶gp5、N末端结构域蛋白质、核酸结合蛋白质、无机焦磷酸酶、Mop样蛋白质、CheW样蛋白质、tRNA_抗(OB-折叠核酸结合结构域)、Telo_结合(端粒-结合蛋白α亚基,中央结构域)、SSB(单链结合蛋白质家族OB-折叠结构域)、DUF338OB-折叠结构域;DNA连接酶_aden(NAD依赖性DNA连接酶OB-折叠结构域)、Stap-Strp-毒素(葡萄球菌/链球菌毒素、OB-折叠结构域)、EIF-5a(真核起始因子5A羟丁赖氨酸,DNA结合OB-折叠结构域)、GP5_OB(GP5N末端OB-折叠结构域)、CSD、DNA_连接酶_OB、DUF388、EFP、eIF-1a、mRNA_cap_C、OB_RNB、噬菌体_DNA_结合(Phage_DNA_bind)、Rep-A_N、Rho_RNA_结合(Rho_RNA_bind)、核糖体_L2、核糖体_S12;核糖体_S17、RNA_pol_Rpb8、RuvA_N、S1、TOBE、TOBE_2和tRNA_结合(tRNA_bind)。在另一实施方式中,本发明是这样的经修饰的OB-折叠结构域,其中,天然存在的OB-折叠结构域来自嗜热生物。在又一实施方式中,本发明是这样的经修饰的OB-折叠结构域,其中,所述嗜热生物是耐超高温热棒菌。在另一实施方式中,本发明是这样的经修饰的OB-折叠结构域,其中,所述经修饰的氨基酸残基在结合面的β-链中。
经修饰的OB-折叠结构域的结合伴侣可选自核酸、寡糖、蛋白质、激素和小有机分子。
在另一方面,本发明是获得经修饰的OB-折叠结构域的方法,所述方法包括:a)获得编码天然存在的OB-折叠结构域或者编码包含结合面的链和/或环的链的其部分的核酸,以及b)改变所述核酸,使得其编码:较之天然存在的OB-折叠结构域而言,在结合面的β-链上的至少一个经修饰的氨基酸残基和/或在环的链上的至少一个经修饰的氨基酸残基,其中,获得经修饰的OB-折叠结构域,并且,其中,经修饰的OB-折叠结构域较之天然存在的OB-折叠结构域,具有改变的结合。在其中天然存在的OB-折叠结构域的结合伴侣已知的另一实施方式中,经修饰的结合包含:较之相应的天然存在的OB-折叠结构域而言,经修饰的OB-折叠结构域与其天然存在的结合伴侣的解离常数降低了至少大约25%,大约50%或者大约75%。在另一实施方式中,经修饰的结合包含:较之相应的天然存在的OB-折叠结构域而言,经修饰的OB-折叠结构域与其天然存在的结合伴侣的解离常数以至少大约2、大约3、大约4、大约5、大约6、大约8、大约10、大约15、大约20、大约25、大约50、大约100、大约200、大约500、大约1000、大约5000、大约10,000、大约50,000或者大约100,000的因子减少。在一种实施方式中,所述方法还包括改变编码经修饰的OB-折叠结构域的核酸,和/或改变编码包含经修饰的OB-折叠结构域的蛋白质的至少一个氨基酸的核酸。
在另一方面,本发明提供了产生用于展示的经修饰的OB-折叠结构域蛋白质的文库的方法,所述方法包括a)获得编码OB-折叠结构域或其部分的核酸,以及b)对核酸进行随机改变,由此产生编码经修饰的OB-折叠结构域的经改变的核酸的集合,所述经修饰的OB-折叠结构域具有至少一个随机化的氨基酸残基。在一种实施方式中,本发明提供了产生用于展示的经修饰的OB-折叠结构域蛋白质的文库的方法,其中,所述核酸编码OB-折叠结构域结合面的链和/或OB-折叠结构域环的链的至少一个氨基酸残基。在另一实施方式中,所述方法还包括:将编码经修饰的OB-折叠结构域的经改变的核酸的文库放进能在其表面展示所述经修饰的OB-折叠结构域的宿主细胞或病毒颗粒的群中。
在另一方面,本发明提供了经分离的核酸,其编码可从天然存在的OB-折叠结构域获得的经修饰的OB-折叠结构域,其中,所述经修饰的OB-折叠结构域包含:a)较之天然存在的OB-折叠结构域而言位于OB-折叠结构域结合面的β-链中的至少一个经修饰的氨基酸残基,或b)位于OB-折叠结构域结合面的β-链中的至少一个经修饰的氨基酸残基和位于OB-折叠结构域环区域的链中的至少一个经修饰的氨基酸残基,或c)位于OB-折叠结构域环区域的链中的至少一个经修饰的氨基酸残基,并且,其中,所述经修饰的OB-折叠结构域较之天然存在的OB-折叠结构域而言具有改变的结合特性。在其中天然存在的OB-折叠结构域的结合伴侣已知的另一实施方式中,改变的结合特性包含:较之相应的天然存在的OB-折叠结构域而言,经修饰的OB-折叠结构域与其天然存在的结合伴侣的解离常数降低了至少大约25%,大约50%或者大约75%。在另一实施方式中,改变的结合特性包含:较之相应的天然存在的OB-折叠结构域而言,经修饰的OB-折叠结构域与其天然存在的结合伴侣的解离常数以至少大约2、大约3、大约4、大约5、大约6、大约8、大约10、大约15、大约20、大约25、大约50、大约100、大约200、大约500、大约1000、大约5000、大约10,000、大约50,000或者大约100,000的因子减少。
在另一方面,本发明提供了包含下述核酸的宿主细胞或病毒颗粒,所述核酸编码上文所述的经修饰的OB-折叠结构域的核酸。在又一方面,本发明提供了包含下述核酸的组合物,所述核酸编码上文所述的经修饰的OB-折叠结构域的核酸。
在另一方面中,本发明提供了针对与结合伴侣的结合对经修饰OB-折叠结构域的文库加以筛选的方法,所述方法包括:a)获得在其表面展示经修饰的OB-折叠结构域的文库的宿主细胞或病毒颗粒的群;b)将所述宿主细胞或病毒颗粒的群与结合伴侣在适于结合伴侣与经修饰的OB-折叠结构域结合的条件下接触;以及c)确定结合伴侣与经修饰的OB-折叠结构域的结合。在一种实施方式中,宿主细胞或病毒颗粒是在其表面展示经修饰的OB-折叠结构域的噬菌体。
在另一方面,本发明提供了经修饰的OB-折叠结构域的噬菌体文库,其中,所述经修饰的OB-折叠结构域可从耐超高温热棒菌获得。
在另一方面,本发明提供了在细胞或病毒颗粒表面展示的经修饰的OB-折叠结构域。在一种实施方式中,所述细胞或病毒颗粒是噬菌体、细菌或酵母。
在另一方面,本发明提供了与固体支持物相连的经修饰的OB-折叠结构域。在一种实施方式中,所述支持物选自珠子(bead)、玻璃、玻片、芯片和明胶。
在另一方面,本发明提供了具有附件II中列出的且名为U1、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、S68、S81、pMB16、pMB17、pMB12、pMB18、pMB15、D05、D07、D09、D04、L14、L8、L4、L16、L34、L42、L6、L5或L44的序列的经修饰的OB-折叠结构域蛋白质。在另一方面,本发明提供了与附件II中列出的且名为U1、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、S68、S81、pMB16、pMB17、pMB12、pMB18、pMB15、D05、D07、D09、D04、L14、L8、L4、L16、L34、L42、L6、L5或L44的序列具有大约90%、大约95%、大约98%或大约99%的序列同源性的蛋白质。在另一方面,本发明提供了与附件II中列出的且名为U1、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、S68、S81、pMB16、pMB17、pMB12、pMB18、pMB15、D05、D07、D09、D04、L14、L8、L4、L16、L34、L42、L6、L5或L44的序列具有大约90%、大约95%、大约98%或大约99%的序列同一性的蛋白质。在上述所有方面,蛋白质可以是经分离的、经纯化的或者经分离和纯化的。
在另一方面,本发明提供了下述核酸,其编码附件II中列出的且名为U1、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、S68、S81、pMB16、pMB17、pMB12、pMB18、pMB15、D05、D07、D09、D04、L14、L8、L4、L16、L34、L42、L6、L5或L44的序列所示的蛋白质。在另一方面,本发明提供了下述核酸,其编码与附件II中列出的且名为U1、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、S68、S81、pMB16、pMB17、pMB12、pMB18、pMB15、D05、D07、D09、D04、L14、L8、L4、L16、L34、L42、L6、L5或L44的序列具有大约90%、大约95%、大约98%或大约99%的序列同源性的蛋白质。在另一方面,本发明提供了下述核酸,其编码与附件II中列出的且名为U1、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、S68、S81、pMB16、pMB17、pMB12、pMB18、pMB15、D05、D07、D09、D04、L14、L8、L4、L16、L34、L42、L6、L5或L44的序列具有大约90%、大约95%、大约98%或大约99%的序列同一性的蛋白质。在上述所有方面,核酸可以是经分离的、经纯化的或者经分离和纯化的。
附图简述
图1A-1C示出了来自链球菌超抗原SMEZ-2的OB-折叠结构域(25)。图1A展示了凹结合面。图1B是沿着N和C末端标示出的具有β片层和环的示意结构。2、4和5是被打断的-链,它们在其组分间具有凸起或环。图1C是该蛋白质的相应的拓扑图(24)。残基以圆圈表示,氢键以虚线表示。环被标示出,并且示出了剪切数Sr。
图2A-2B提供了用于aspRS-OB的文库构建的寡核苷酸的综述。图2A示出了aspRS-OB的二级结构元件,如寡核苷酸上面的框所示。箭头和下面的数字表示所用的引物。交叉字符表示随机化的密码子。片段1-4在第二个PCR步骤中被装配起来。在该图中示出了13mRL文库的装配(还见表4)。图2B示出了对用于IF5A-OB的文库构建的寡核苷酸的总览。针对11m、9m、2RL和2RL+2文库,不同文库的装配以三种独立方式进行。符号如图2A所示。
图3展示了来自耐超高温热棒菌的起始因子IF-5A(1BKB,(34))。IF-5A的该示意性连续剖面图示出了C末端处的OB折叠,其通过接头与N-末端结构域分开。β-链和α-螺旋分别以箭头和螺旋条带表示。β-链1-3形成了提出的OB折叠的单链DNA结合面。
图4展示了大肠杆菌(E.coli)asp-tRNA合成酶的晶体结构(1C0A,(37))。该示意性连续剖面图示出了aspRS的结构,其中示出了OB-折叠和C-末端酶结构域之间的关系。β-链和α-螺旋分别以箭头和螺旋条带表示。示出了结合面(36),其包含β-链1-3和位于β-链4和5之间的环4/5。
图5A-5C示出了对来自不同物种的aspRS OB折叠结构域的序列比对。图5A示出了OB折叠的二级结构(示于序列下面),β-链被标示出。具有箭头的残基是结合面上的保守残基,它们已在一些文库中被随机化。应当注意:人和酵母序列具有长N-末端,在每种情况下都不从残基1起始。右边的数字表示每个蛋白质中的氨基酸位置。图5B示出了对来自不同物种的IF-5A OB折叠结构域的序列比对。图5C示出了对来自耐超高温热棒菌(P aerophilum)(P.a.)、Pyrococcus kodakaraensis(P.kodak.)和大肠杆菌(Escherichia Coli)(E.coli)的aspRS-OB的序列比对。序列同一性由星号表示。OB-折叠的二级结构在序列下面示出:l=链4和5之间的环,环4/5。
图6是用于aspRS-OB及衍生物的噬菌体展示的pRPSP2的示意图。示出了噬菌体休克启动子(psp)、pelB前导序列、克隆位点(其含有NcoI/NotI限制性位点)、用于Western分析的c-myc标签以及编码pIII蛋白质的gIII基因。噬菌体展示的融合蛋白质由插入进克隆位点的基因的基因产物、c-myc标签和pIII蛋白质构成。pRPSP2还含有β-内酰胺酶基因,用于在氨苄青霉素上进行选择(图6中未示出)。
图7是对噬菌体展示的aspRS-OB的Western分析。左道(无插入)仅代表pIII的情况,因为空载体pRPSP2被用于制备TDP;中间的道示出了在VCSM13上展示的与PIII融合的aspRS-OB;右道示出了在gIII缺失噬菌体Vd3上的aspRS-OB。在存在SDS和BME时,煮沸1011TDPs,通过10%SDS-PAGE进行分离,接着转移到0.45um硝化纤维素膜上。使用小鼠抗c-myc抗体和HRP缀合的兔抗小鼠抗体来进行检测。
图8示出了用展示aspRS-OB的TDP和野生型VCS-M13噬菌体进行的假(mock)噬菌体实验,以通过与asp-tRNA的结合示出对来自aspRS的野生型OB折叠的功能性展示。将被固定的tRNA与VCS-M13(野生型噬菌体,无展示)和展示aspRS-OB的TDP一起孵育。VCS-M13:TDP之比>1000:1。洗涤之后,通过用RNaseA进行RNA消化来洗脱结合的颗粒。针对每种VCS-M13和TDP以及针对仅珠子的情况或被固定的tRNA的情况,通过除以输出和输入来计算回收因子。输入和输出数据见表6。
图9是从对asp-tRNA上的文库RL(黑圈、实线)和asp-tRNA(黑圈、点线)或溶菌酶(白圈、虚线)上的文库13mRL进行的第一轮至第六轮的选择得到的噬菌体的富集(作为-log(输出噬菌体/输入噬菌体))。
图10是对在asp-tRNA上选择的来自OBRL的选出克隆进行的序列分析的概览。12个克隆中,10个在第一位含有R或K,7个在第2位含有G,8个在第3位含有C,6个在第4位含有R。共有序列被认为是R/K GC R。
图11示出了通过单克隆噬菌体结合实验对选出的克隆与asp-tRNA的结合的分析。生物素化的asp-tRNA被固定到包被有链亲和素的磁珠上,与单克隆噬菌体样品一起孵育。通过RNA消化特异性地洗脱RNA结合的颗粒,通过细菌感染对所述颗粒加以计数。Y轴示出了回收因子,这是用输入噬菌体、仅来自珠子时的输出噬菌体以及来自tRNA的洗脱噬菌体的数量来计算的。实验一式两份重复进行,误差条代表±标准偏差。pIII:没有融合;OB3wt=野生型aspRS-OB;D07、D09是asp-tRNA上选择的来自13mRL的突变体;16、17是在asp-tRNA上选择的来自aspRS-OB RL的突变体pMB16和pMB17;L6和L33是在溶菌酶上选择的来自13mRL的突变体。
图12是对选择前后的来自aspRS-OB文库的序列的概览。A.选择前,U1-U6源自13mRL文库,U8、U9来自RL文库。B.来自13mRL的可溶未选择突变体。C.在asp-tRNA上选择的来自RL的突变体。D.在asp-tRNA上选择的来自13mRL的突变体。E.在溶菌酶上选择的突变体13mRL。asp-OB野生型序列在顶端给出,并且给出了残基数和定位。
图13示出了针对溶菌酶的结合物的微筛(micropanning)预筛选。用溶菌酶(黑条带)或BSA(白条带)包被96孔板,将其与来自6轮选择后检出的克隆的单克隆噬菌体样品一起孵育。洗脱结合的噬菌体,通过细菌感染进行计数。Y-轴上的数字表示回收的噬菌体数,x轴上示出了克隆数,pIII表示没有融合(空载体),OBwt表示展示的野生型aspRS-OB。
图14示出了通过ELISA对选出的克隆与溶菌酶的结合的分析。BSA(白)、RNaseA(阴影)和雌鸟卵白溶菌酶(hen egg white lysozyme)(黑)被固定,并与单克隆噬菌体样品一起孵育。通过小鼠抗M13一抗和HRP缀合的抗小鼠二抗来检测结合的颗粒。实验一式两份进行,误差条代表±标准偏差。pIII:没有展示融合,OBwt,野生型aspRS-OB折叠。
图15A-15B示出了用在溶菌酶上选择的经纯化aspRS-OB突变体进行的下拉(pull down)测定。图15A:突变体作为GST-融合物被固定于谷胱甘肽珠上,并与溶菌酶一起孵育。洗涤之后,在SDS-PAGE上对珠子加以分析。道1:13mRL81(未选择的突变体,阴性对照),2:L5,3:L16,4:L4(L18),5:L8(L21),6:仅珠子(双阴性对照)。图15B:L6(道1中的可溶级分)被固定,并按照与上文相同的方式与溶菌酶一起孵育。加载珠子,用TBS(道2)、TBS-T(道3),TBS-T500mM NaCl(道4)洗涤之后在凝胶上加以分析。
图16示出了使用表面等离振子共振来测定选择的OB-折叠结构域L6与溶菌酶间结合的Kd的结合曲线。从该实验计算的Kd为3.6×10-5M。
图17示出了OBody-溶菌酶复合体的结构。OBody以草图示出(左边),其显示了二级结构元件。溶菌酶以草图示出(右边)。Arg39(来自OBody)显示为棍并且指向溶菌酶活性位点。该残基与溶菌酶的活性位点酸性残基——Glu35和Asp52形成了氢键(见图20)。
图18示出了针对OBody-溶菌酶复合体的蛋白质-蛋白质界面处的氢键相互作用的例子。残基作为棍状示出,并且被标示出(D36和Y37来自Obody;W63、D101和N103来自溶菌酶)。氢键作为点线示出。注意,D36至W63的H键在D36的主链羰基和W63的NH基团之间。
图19示出了OBody L8成为溶菌酶抑制剂的潜能。E35和D52是针对溶菌酶的活性位点催化残基,H60来自溶菌酶的天然抑制剂。His60制造了与溶菌酶Glu35之间的氢键,由此抑制了该酶。来自OBody的R39以相似方式与E35和D52都形成氢键。OBody的主链和溶菌酶的天然抑制剂作为C-α痕迹示出。为清楚计,针对溶菌酶的C-α痕迹被省略。
序列表简述
序列ID No. | 序列名称 |
1. | U1 |
2. | U2 |
3. | U3 |
4. | U4 |
5. | U5 |
6. | U6 |
7. | U7 |
8.. | U8 |
9. | U9 |
10. | S68 |
11. | S81 |
12. | pMB 16 |
13. | pMB 17 |
14. | pMB 12 |
15. | pMB 18 |
16. | pMB 15 |
17. | D05 |
18. | D07 |
19. | D09 |
20. | D04 |
21. | L14 |
22. | L8 |
23. | L4 |
24. | L16 |
25. | L34 |
26. | L42 |
27. | L6 |
28. | L5 |
29. | L44 |
30. | 寡聚体005 |
31. | 寡聚体006 |
32. | 寡聚体011 |
33. | 寡聚体012 |
34. | 寡聚体050 |
35. | 寡聚体054 |
36. | 寡聚体055 |
37. | 寡聚体056 |
38. | 寡聚体057 |
39. | 寡聚体058 |
40. | 寡聚体059 |
41. | 寡聚体060 |
42. | 寡聚体061 |
43. | 寡聚体062 |
44. | 寡聚体068 |
45. | 寡聚体028 |
46. | 寡聚体029 |
47. | 寡聚体032 |
48. | 寡聚体033 |
49. | 寡聚体034 |
50. | 寡聚体035 |
51. | 寡聚体074 |
52. | 寡聚体076 |
53. | 寡聚体078 |
54. | 寡聚体089 |
55. | 寡聚体051 |
56. | 寡聚体052 |
57. | 寡聚体053 |
58. | 寡聚体018 |
59. | 寡聚体019 |
60. | 寡聚体030 |
61. | 寡聚体031 |
62. | 寡聚体073 |
63. | 寡聚体075 |
发明详述
发明人发现,“OB-折叠结构域”或“OB-折叠”或“OB-折叠蛋白质结构域”(最初得名于观察到的其寡糖-寡核苷酸结合性质)可用作为分子识别结构域或支架,用于产生经修饰的OB-折叠结构域,以及用于制造经修饰的OB-折叠结构域的文库(可针对想要的生物学活性,例如,与想要的靶标结合以及改变的酶促性质,对其加以筛选)。虽然OB-折叠结构域最初得名于其寡糖-寡核苷酸结合性质,但是也已经在蛋白质-蛋白质界面上观察(Theobald等人,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.,卷32:115-33(2003))。因此,本发明一部分涉及OB-折叠结构域或其部分在产生具有想要的性质的经修饰的OB-折叠结构域的方法中的用途;产生经修饰的OB-折叠结构域的文库的方法;通过此类方法产生的经修饰的OB-折叠结构域的文库;针对想要的生物学活性筛选经修饰的OB-折叠结构域的此类文库的方法;以及从此类文库鉴定得到的经修饰的OB-折叠结构域。例如,可对经修饰的OB-折叠结构域的此类文库加以筛选,选出与特定目标靶(例如,核苷酸、蛋白质或碳水化合物)的结合相互作用增加或减少或酶活性增加或减少的经修饰的OB-折叠结构域或其部分。
在本文公开的一些阐释性的实例中,发明人已经证明了经修饰的OB-折叠结构域的噬菌体展示文库的产生(基于来自耐超高温热棒菌的天冬氨酸tRNA合成酶(AspRS)的tRNA反密码子结合结构域);产生的AspRS经修饰的OB-折叠结构域的稳定性;以及产生的AspRS经修饰的OB-折叠结构域的正确折叠。在本文公开的一些阐释性的实例中,发明人已经证明了AspRS经修饰的OB-折叠结构域在噬菌体表面上的功能性展示,由此允许针对具有想要的性质的经修饰OB-折叠结构域来筛选文库。如本文所表明的,发明人能够通过使用本文公开的组合物和方法生产、筛选和选择下述这样的经修饰的AspRS OB折叠结构域,其从其天然存在的状态的核酸结合结构域被转化为溶菌酶蛋白质结合分子。在本文公开的其它一些阐释性的实施方式中,来自耐超高温热棒菌的含有OB-折叠结构域的起始因子IF-5A被用于产生经修饰的OB-折叠结构域的文库。
蛋白质的OB-折叠结构域可用作为平台用于产生经修饰OB-折叠结构域或经修饰OB-折叠结构域的文库以及用于筛选分子识别事件,这一发现在诊断和治疗方法中可以应用,并且,如本文所述,较之本领域中已知的使用抗体或其它蛋白质支架的手段具有优势。如本领域技术人员能够理解的,本文公开的用于制备来自耐超高温热棒菌的AspRS或IF5A的经修饰的OB-折叠结构域的文库的方法可应用于本文所述和本领域已知的其它OB-折叠结构域上。如本领域技术人员能够理解的,本领域已知的其它展示和筛选方法可用于鉴定具有想要的性质的经修饰的OB-折叠结构域。还应想到,经修饰的OB-折叠结构域可被连到被固定的和/或固体表面上,并用于针对结合相互作用加以筛选。例如,OB-折叠蛋白质可与被固定的表面共价偶联,或者可使用亲和标签(例如,6xHis标签)将其结合到表面上。将蛋白质与表面共价偶联的方法是本领域技术人员已知的,可用于把蛋白质粘附(affix)到表面上的亲和标签是本领域技术人员已知的。此外,OB-折叠蛋白质可与固体表面(包括但不限于,珠子、玻璃、玻片、芯片和明胶)偶联。因此,可使用本领域技术人员已知的技术,使用一系列的OB-折叠蛋白质来制造固体表面上的阵列。例如,美国专利申请公开文本No.2004/0009530公开了制备阵列的方法。
一般性技术
除非另有指明,本发明的实施将使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的传统技术,这些都是本领域技术人员已知的。此类技术已在文献,例如Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版(Sambrook等人,1989)、Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,编著,1984)、Animal Cell Culture(R.I.Freshney,编著,1987)、Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir & C.C.Blackwell,编著)、Gene Transfer Vectors for Mammalian Celle(J.M.Miller & M.P.Calos,编著,1987)、Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人,编著,1987)、PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人,编著,1994)、Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人,编著,1991)、The Immunoassay Handbook(David Wild,编著,Stockton Press NY,1994)和Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff,W.H.Albert,和N.A.Staines,编著,Weinheim:VCH Verlags gesellschaft mbH,1993)以及Gennaro,等人2000,Remington:the Science and Practice of Pharmacy,第20版,Lipincott Williams and Wilkins:Baltimore,MD中被充分解释。
定义
在本文中使用时,术语“包含”及其同义词以其包括性的含义来使用,即,等同于术语“包括”及其相应同义词。
除非另有指明,在本文中使用时,单数形式“一个/种”和“这个/种”(“a”、“an”和“the”)包括复数指代。
具有含OB-折叠结构域这一特征的多种蛋白质是本领域已知的,并在本文中有所描述。如本文中更详细描述的,“OB-折叠结构域”包括共享保守折叠和结合面的结构特征的家族成员。OB-折叠结构域成员还共享序列相关性。应当考虑到,任何OB-折叠结构域或其部分都可用于产生经修饰的OB-折叠结构域。在本文中使用时,“天然存在的”OB-折叠结构域指没有经过遗传改造以含有核酸或氨基酸修饰的OB-折叠结构域。在本文中使用时,“经修饰的OB-折叠结构域”较之天然存在的OB-折叠结构域而言包含至少一处经修饰的氨基酸残基。修饰包括一个或多个残基的缺失、取代或添加或其组合,只要经修饰的OB-折叠结构域保留了折叠相关的结合面使得其可与结合伴侣相互作用即可。并不需要“经修饰的OB-折叠结构域”保留天然存在的OB-折叠结构域的精确结构特征。经修饰的OB-折叠结构域可在任何氨基酸残基处包含修饰,包括在结合面(结合面包括β-片层和邻近的环)、环链、核心区(蛋白质没有暴露给水性溶剂的疏水内部中的区域)的氨基酸残基处的修饰,并且还可包含在包含OB-折叠结构域的蛋白质的任何部分中的氨基酸修饰,只要经修饰的OB-折叠结构域保留了折叠相关的结合面使得其可与结合伴侣相互作用即可。在一些例子中,经修饰的OB-折叠结构域特征在于与天然存在的OB-折叠结构域不能结合的结合伴侣相结合的能力。在其它一些例子中,经修饰的OB-折叠结构域具有与其天然存在的结合伴侣的经修饰的结合。在一些例子中,OB-折叠结构域被分离,即,从其中含有所述结构域的天然存在的蛋白质的至少一部分中移除。在其它一些例子中,经修饰的OB-折叠结构域与非天然存在的蛋白质相联结(associated)。在其它一些例子中,经修饰的OB-折叠结构域与天然或非天然存在的蛋白质相联结,所述蛋白质不与天然存在的OB-折叠结构域相结合或仅仅非特异性的与天然存在的OB-折叠结构域相结合。在其它一些例子中,在天然存在的OB-折叠结构域不具有已知结合伴侣的情况下,可产生经修饰的OB-折叠结构域。应当知道,当针对与特定结合伴侣的结合来筛选经修饰OB-折叠结构域的文库时,针对天然存在的OB-折叠结构域的结合伴侣(如果有的话)可以并非在先已知的。
经修饰的OB-折叠结构域可被制备为:以改变的结合特性与天然存在的OB-折叠结构域的天然底物结合。此类改变的结合特征可在与天然存在的OB-折叠结构域相同的条件下显示出来。备选地,改变的结合特性可以是下列的一种或多种(但不限于此):热稳定结合(例如,在升高的温度下,较之天然存在的OB-折叠结构域而言,经修饰的OB-折叠结构域展示出与天然底物的更强的结合)、热不稳定结合(例如,在升高的温度下,较之天然存在的OB-折叠结构域而言,经修饰的OB-折叠结构域展示出与天然底物的更弱的结合)、在不同pH条件下的经修饰的结合(例如,经修饰的OB-折叠结构域较之天然存在的OB-折叠结构域而言在高pH下展示出与天然底物的更强的结合,或者,较之天然存在的OB-折叠结构域而言在高pH下展示出与天然底物的更弱的结合,或者,较之天然存在的OB-折叠结构域而言在低pH下展示出与天然底物的更强的结合,或者,较之天然存在的OB-折叠结构域而言在低pH下展示出与天然底物的更弱的结合),或在不同离子强度条件下的经修饰的结合(例如,经修饰的OB-折叠结构域较之天然存在的OB-折叠结构域而言在高离子强度下展示出与天然底物的更强的结合,或者,较之天然存在的OB-折叠结构域而言在高离子强度下展示出与天然底物的更弱的结合,或者,较之天然存在的OB-折叠结构域而言在低离子强度下展示出与天然底物的更强的结合,或者,较之天然存在的OB-折叠结构域而言在低离子强度下展示出与天然底物的更弱的结合)。经修饰的结合或改变的结合特性可包含:较之相应的天然存在的OB-折叠结构域而言,经修饰的OB-折叠结构域与其天然存在的结合伴侣的解离常数降低了大约至少25%,大约50%或者大约75%(即,经修饰的OB-折叠结构域可以以天然存在的OB-折叠结构域的至少大约1.33、2或3倍强进行结合)。在一种实施方式中,经修饰的结合包含:较之相应的天然存在的OB-折叠结构域而言,经修饰的OB-折叠结构域与其天然存在的结合伴侣的解离常数以至少大约2、大约3、大约4、大约5、大约6、大约8、大约10、大约15、大约20、大约25、大约50、大约100、大约200、大约500、大约1000、大约5000、大约10,000、大约50,000或者大约100,000的因子减少(即,经修饰的OB-折叠结构域可以以天然存在的OB-折叠结构域的至少大约2、大约3、大约4、大约5、大约6、大约8、大约10、大约15、大约20、大约25、大约50、大约100、大约200、大约500、大约1000、大约5000、大约10,000、大约50,000或者大约100,000倍强进行结合)。
经修饰的OB-折叠结构域的“文库”表示:较之天然存在的OB-折叠结构域而言包括高比例的经修饰OB-折叠结构域的OB-折叠结构域的集合。即,经修饰OB-折叠结构域的文库并不暗示:该集合仅含经修饰的OB-折叠结构域。经修饰的OB-折叠结构域的文库可含有一定百分比的未经修饰的或天然存在的OB-折叠结构域。所述文库可含有具有一个或更多或多个随机化氨基酸残基的OB-折叠结构域。例如,经修饰OB-折叠结构域的文库可含有在一个氨基酸残基(所述修饰可以是单一类型的修饰,例如,单氨基酸取代,或多种不同的修饰,例如,用两个或多个随机氨基酸取代单个氨基酸)或两个或多个氨基酸残基处(可以在一个或多个结构区域中,例如在结合面和/或环区域和/或核心区域中)的随机修饰。经修饰的OB-折叠结构域可含有其它修饰,或者包含经修饰的OB-折叠结构域的蛋白质可在氨基酸残基中具有修饰,只要折叠相关结合面可与结合伴侣相互作用即可。经修饰的OB-折叠结构域的“文库”并不暗示对所述集合的成员数量的任何特定的大小限制。文库可以含有少至大约10个变体,并可延伸至超过1020个变体的范围。在一些实施方式中,文库将具有多达大约108个变体,并且在一些实施方式中,文库将具有多达大约1012个变体。经修饰的OB-折叠结构域的“文库”指通过核酸改变编码的经修饰OB-折叠结构域的集合(即,在引入表达系统之前基因装配阶段)以及被引入表达系统、表达和/或展示的集合。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用,它们指任何长度的核苷酸的聚合形式,所述核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些术语包括单链、双链或三链DNA,基因组DNA,cDNA,RNA,DNA-RNA杂交体(hybrid)或包含嘌呤和嘧啶碱基或者其它天然的、经化学修饰的、经生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的主链可包含糖和磷酸酯基团(如可在RNA或DNA中一般发现的那样),或者经修饰的或被取代的糖或磷酸酯基团。备选地,多核苷酸的主链可包含合成亚基,例如,氨基磷酸酯的聚合物,因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。Peyrottes等人(1996)Nucleic Acids Res.24:1841-8、Chaturvedi等人(1996)Nucleic Acids Res.24:2318-23、Schultz等人(1996)Nucleic Acids Res.24:2966-73。硫代磷酸酯连接可用于替换磷酸二酯连接。Braun等人(1988)J.Immunol.141:2084-9、Latimer等人(1995)Molec.Immunol.32:1057-1064。此外,可通过合成互补链和在合适的条件下对链进行退火,或者通过使用DNA聚合酶用合适的引物从头合成互补链,来从化学合成的单链多核苷酸产物获得双链多核苷酸。提到多核苷酸序列(例如提到SEQ ID NO)还包括互补序列。
下文是多核苷酸的非限制性例子:基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、带支链的多核苷酸、质粒、载体、经分离的任何序列的DNA、经分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸,例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶(uracyl)、其它糖和连接基团(例如氟代核糖(fluororibose)和硫代酯(thioate))以及核苷酸支链。核苷酸序列可被非核苷酸组分打断。多核苷酸可在多聚化后被进一步修饰,例如,通过与标记组分缀合来进行。该定义包括的其它类型的修饰是帽,类似物对一个或多个天然存在的核苷酸的取代以及引入将多核苷酸与蛋白质、金属离子、标记组分、其它多核苷酸或固体支持物连到一起的手段。优选地,多核苷酸是DNA。在本文中使用时,“DNA”不仅包括碱基A、T、C和G,其还包括任何它们的类似物或这些碱基的经修饰的形式,例如甲基化的核苷酸、核苷酸间修饰(例如不带电荷的连接和硫代酯(thioate))、使用糖类似物以及经修饰的和/或备选的主链结构(例如聚酰胺)。
“处于转录控制下”是本领域中广泛知晓的术语,其表示多核苷酸序列(通常是DNA序列)的转录依赖于其与作用于转录起始或促进转录的元件的有效相连。“有效相连”指这样的并列,其中元件处于允许它们发挥作用的排列中。
“宿主细胞”包括下述各细胞或细胞培养物,其可以是或已经是编码OB-折叠结构域(在一些例子中,经修饰的OB-折叠结构域)的核酸的接受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代,并且所述后代可以因为天然的、偶然或刻意的突变和/或改变而不与最初的亲本细胞完全相同(在形态上或在总的DNA互补上)。宿主细胞包括用编码OB-折叠结构域的核酸体内或体外转染或感染的细胞。在一些例子中,宿主细胞能在其表面表达和展示OB-折叠结构域,例如,噬菌体展示。“表达”包括转录和/或翻译。
“编码”OB-折叠结构域或其部分的核酸是可被转录和/或翻译以产生OB-折叠结构域或其部分的核酸。此类核酸的反义链也被认为能编码OB-折叠结构域。
I.OB-折叠蛋白质结构域
在最一般的水平上,OB-折叠结构域是五条链的混合桶。见,例如,Arcus,2002,Cu rr.Opin.Struct.Biol.卷12:794-801。OB-折叠结构域在所有三种界中都被发现,如本文更详细讨论的,其在序列和结构数据库方面都被描绘过。一般而言,OB-折叠结构域具有折叠和功能性结合面的保守性。不同的OB-折叠结构域使用它们的折叠相关结合面,以多变地结合寡糖、寡核苷酸、蛋白质、金属离子和催化底物。
OB-折叠结构域具有大量特征,使得它们适合作为支架用于氨基酸位置的随机化和对具有想要的性质的经修饰OB-折叠结构域的选择。OB-折叠结构域通常是小且稳定的蛋白质,它们易于被生产和随机化。上文提到的Theobald等人,2003公开了OB-折叠结构域的长度范围在70至150个氨基酸之间。此外,OB-折叠结构域蛋白质的面(已经通过进化表明是多功能的(versatile))可用于随机化。OB-折叠结构域在全部三种界中普遍存在,因此,可能选择OB-折叠结构域适合特定应用。例如,本文描述了来自热稳定微生物的OB-折叠结构域,用于生产经修饰OB-折叠结构域的文库。可针对治疗应用对OB-折叠结构域加以选择,例如,可选出酶促性OB-折叠结构域,以生产具有新的酶活性的蛋白质。这些特征提供了比较为传统的抗体和蛋白质支架更好的优点。
OB-折叠蛋白子结构域的通常结构为5条链的混合-桶,其展现出凹的-片层作为外结合面,其侧翼有两个可变环区域。在大多数情况下,所述的桶具有希腊钥匙拓扑结构,桶的一个末端加有α-螺旋帽(23)。-桶由其链的数量n以及剪切数S独特描述(26,27)。剪切数描述了链从桶的轴倾斜的程度。图1A-1C展示了S=10的-桶。这是在形式上是-片层的一部分(由此排除-凸起)的残基的数量,并且是沿着从A至A*的链被计数。对于OB-折叠来说有两种可能性(S=8或者S=10),这两种都被观察到。例如,与tRNA结合的天冬氨酰tRNA合成酶(aspRS)的OB-折叠结构域具有S=10,而冷休克OB-折叠结构域DNA结合结构域则具有S=8。OB-折叠结构域结合面在其中心具有链2和3,并且通过环1在底部左侧结合,通过环4在顶部结合,以及通过环2在顶部右侧结合(见图1A-1C)。在不同的OB-折叠结构域结构中,环2和4展示出了长度和序列上的宽广变化。见Arcus,2002,Curr.Opin.Struct.Biol.卷12:794-801。经修饰的OB-折叠结构域可在长度上有所变化。例如,环2通常在2至4个氨基酸之间变化,而环4则通常在3至10个氨基酸之间变化,在一些情况下,环4容纳有更大长度的插入,所述插入多至大约30个氨基酸。
对20种被测序基因组的调查表明OB-折叠结构域处于最普遍的生物学构造列表的第28位(27)。已经在多种不同的蛋白质(包括人、酵母和细菌)中发现了OB-折叠结构域。例如,在细菌超抗原(Sags)中,OB-折叠结构域能介导细菌对人免疫系统的攻击中的蛋白质-蛋白质相互作用(21和22)。在这些蛋白质中,其与宽范围的配体(包括蛋白质、寡核苷酸和寡糖)结合(23)。OB-折叠结构域蛋白质多样性的例子包括:在癌基因BRCA2中的单链DNA结合(Yang H.等人,2002Science,卷.297,1837-1848)、针对酵母蛋白质Cdc13的在染色体上的端粒末端结合(Lei M.等人,2003 Nature,卷426,198-203)以及在病原性细菌中的细胞表面寡糖结合(Stein P.E.等人,1994,Structure,卷2,45-47)。如蛋白质结构分类数据库(Structural Classification of Proteins database)(SCOP)(将蛋白质结构分类进相关“家族”和“超家族”的标准)所确定的,在九个相关超家族中都发现了OB-折叠结构域。属于同一“家族”的这些OB-折叠结构域在序列、结构和功能水平上具有进化相关性,并且看起来是来自共同祖先的后代。属于同一“超家族”的OB-折叠结构域“家族”基于相似的结构和功能特征(没有明确的序列相似性)是进化相关的。SCOP数据库包含已知结构的蛋白质(即,已经使用X-射线晶体学或高分辨率NMR实验确定了它们的结构)。本领域技术人员可基于结构相关性(即存在折叠相关的结合面),或者与本文描述的和本领域已知的已知OB-折叠结构域的结构相关性和序列相关性来确定其它的OB-折叠结构域。在超家族和家族中存在序列相似性,它们可用于鉴定其结构以前没有被确定为OB-折叠范围(OB-fold umbrella)内的其它蛋白质。见,例如,公众可获得的Pfam数据库(在<sanger.ac.uk/Software/Pfam>)。另一公众可获得的数据库是Superfamily(在<supfam.mrclmb.cam.ac.uk/SUPERFAMILY>),其使用源自SCOP的隐藏Markov模型来将蛋白质序列分类为超家族。例如,“核酸结合蛋白质”包含SCOP数据库中的超家族。在SCOP中的该超家族中目前有11个家族和66种单独的蛋白质结构。从这11个家族和66种结构,Superfamily数据库已经推理出了规则,以将21,158条蛋白质序列归为属于“核酸-结合蛋白质”超家族的OB-折叠蛋白质。类似地,CheW样超家族在SCOP中仅具有单个家族和两种蛋白质结构,而在Superfamily数据库中其已被扩展为包括898种蛋白质。
i.在SCOP对OB-折叠结构域加以归类
对于SCOP表征为全部β、具有桶、封闭或部分开放(其中n=5,以及S=10或S=8,希腊钥匙)的OB-折叠结构域的类而言,SCOP目前鉴定出了下述超家族(括号中的数字是SCOP参考号):
1.葡萄球菌核酸酶(50199)
对于葡萄球菌核酸酶而言,目前该家族仅有单个成员,虽然在数据库中针对葡萄球菌核酸酶有很多种结构。OB-折叠是封闭的β-桶,n=5,S=10。
2.细菌肠毒素(50203)
对于细菌肠毒素而言,该超家族中有两个家族:细菌AB5毒素(B亚基)和超抗原毒素的N-末端结构域。细菌AB5毒素包括来自大肠杆菌的热不稳定毒素、霍乱毒素和百日咳毒素。所有这些都具有封闭的β-桶拓扑结构,并且n=5,S=10,唯一例外在于霍乱毒素,其的桶略有开放。超抗原毒素和超抗原样毒素的N-末端结构域全是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的蛋白质,具有典型的n=5、S=10的封闭桶拓扑结构。这些生物基因组中编码了大量的这些蛋白质。近来根据“Standard Nomenclature for theSuperantigens Expressed by Staphylococcus.”Gerard Lina,Gregory A.Bohach,Sean P.Nair,Keiichi Hiramatsu,Evelyne Jouvin-Marche,和RoyMariuzza,for the International Nomenclature Committee forStaphylococcal Superantigens The Journal of Infectious Diseases 2004;189:2334-6对葡萄球菌蛋白质进行了重新命名。
3.TIMP样(50242)
TIMP样蛋白质是真核蛋白质,其目前被分成三个家族,全部都具有n=5、S=10的封闭桶拓扑结构:
a.金属蛋白质酶(metalloproteinase)的组织抑制剂,TIMP(50243)(在C-末端延伸中含有不规则的α+β亚结构域)
b.导蛋白样结构域(NTR/C345C模块)(89320)
c.聚集蛋白的层粘连蛋白结合结构域(63767)
4.血红素分子伴侣CcmE(82093)
对于血红素分子伴侣CcmE来说,在该超家族中标注了单个家族。代表性的结构来自大肠杆菌和腐化链球菌(S.putrefaciens)。
5.尾部-相关溶菌酶gp5的N-末端结构域(69255)
对于尾部-相关溶菌酶gp5N-末端结构域而言,有单种结构代表家族和该超家族。蛋白质来自噬菌体T4,且N-末端结构域是形成噬菌体的细胞穿刺装置(cell-puncturing device)的更大的蛋白质复合体的一部分。
6.核酸结合蛋白质(50249)
核酸结合蛋白质是大的超家族,其包括很多蛋白质。下述是家族划分和描述符:
a.反密码子结合结构域(50250),桶;封闭;n=5,S=10
b.RecG“楔”结构域(69259)
c.DNA解旋酶RuvA亚基,N-末端结构域(50259),桶;封闭;n=5,S=10
d.单链DNA结合结构域,SSB(50263),桶;封闭;n=5,S=10
e.Myf结构域(50277)
f.冷休克DNA结合结构域样(50282),桶;封闭;n=5,S=8
g.假设蛋白质MTH1(MT0001),插入结构域(74955)
h.DNA连接酶/mRNA加帽酶,结构域2(50307)
i.噬菌体ssDNA结合蛋白质(50315)(4),桶;开放;n*=5,S*=8,成员结构比来自细胞生物的那些更多样化
j.DNA复制启动子(cdc21/cdc54)N-末端结构域(89332)
k.RNA聚合酶亚基RBP8(50321),一式两份;含有两个不完全OB-折叠的串联重复;形成单个桶;n=8,S=10
7.无机焦磷酸酶(50324)
对于无机焦磷酸酶而言,该超家族中仅有一个家族。该家族具有非常深的谱系(lineage),因为有来自细菌、古生菌和真核生物的例子。
1.无机焦磷酸酶(50325),桶,封闭;n=5,S=8
1.无机焦磷酸酶(50326)
真核生物的酶在N-末端和C-末端都具有额外的二级结构
a.面包酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))(50327)
b.古细菌嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)(50328)
c.大肠杆菌(50329)
d.嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(50330)
8.MOP样(50331)
在MOP样的分组中有三个家族,全部都具有相似的功能性,并且全部都来自细菌。
a.钼酸盐/钨酸盐结合蛋白质MOP(50332)
b.BiMOP,一式两份的钼酸盐结合结构域(50335)
一式两份:两个具有交换的C-末端链的OB-折叠结构域的串联重复
c.ABC转运蛋白质,额外的结构域(50338),可能从biMOP结构域伸出(stem out)
9.CheW样(50341)
其由具有来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的两种结构CheW和CheA的单个家族代表。
ii.序列数据库Pfam和Superfamily
来自SCOP的描述与来自下述蛋白质的OB-折叠结构域相关,所述蛋白质的三维结构已经通过X-射线晶体学或NMR确定。基于序列相似性在数据库Pfam中以及基于源自SCOP的序列情况在数据库Superfamily中鉴定出的、随后应用到主序列数据上的额外OB-折叠蛋白质结构域也被本发明包括。本发明还包括本领域技术人员已知的其它OB-折叠结构域。
如下文所述,Pfam中有很多家族,它们一起代表OB-折叠结构域。
标注如下所示:
家族名称
标注
Pfam登录号
Pfam数据库中该家族蛋白质的总数
tRNA_anti
OB-折叠核酸结合结构域
登录号:PF01336
蛋白质数量:1351
Telo_结合(Telo_bind)
端粒结合蛋白质α亚基,中央结构域
登录号:PF02765
蛋白质数量:33
SSB
单链结合蛋白质家族
登录号:PF00436
蛋白质数量:415
DUF388
未知功能的结构域(DUF388)
登录号:PF04076
蛋白质数量:49
DNA_连接酶_aden
NAD依赖性DNA连接酶OB-折叠结构域
登录号:PF03120
蛋白质数量:190
Stap_Strp_毒素
葡萄球菌/链球菌毒素,OB-折叠结构域
登录号:PF01123
蛋白质数量:180
eIF-5α
真核起始因子5A羟丁赖氨酸,DNA-结合OB折叠
登录号:PF01287
蛋白质数量:104
Gp5_OB
Gp5N-末端OB结构域
登录号:PF06714
蛋白质数量:6
本文所述的、本领域已知的和以后鉴定的所有OB折叠结构域可用作为支架,以制备经修饰的OB-折叠结构域,以及制备经修饰OB-折叠结构域的文库,所述文库可用于筛选改变的结合特性和改变的功能特征。
iii.用于对氨基酸进行随机化的OB-折叠结合面
可基于任何OB-折叠结构域(包括本文所述的、本领域已知的和以后鉴定的那些)的结构,来制备经修饰的OB-折叠结构域和/或经修饰的OB-折叠结构域的文库。可基于本文所述和本领域已知的方法来制备经修饰的OB-折叠结构域的文库。例如,对于任何给定的OB-折叠结构域而言,编码一个或多个氨基酸残基(例如,外结合面的链中的氨基酸残基和/或环的链中的氨基酸残基和/或含OB-折叠结构域的蛋白质的其它部分中的氨基酸残基)的核酸可被靶向于氨基酸残基随机化(即,通过核酸修饰的氨基酸残基的随机突变)。在一些例子中,氨基酸残基随机化靶向OB-折叠结构域外结合面的链中的氨基酸残基。在其它一些例子中,氨基酸残基随机化靶向OB-折叠结构域内部的特定结构。例如,随机化可靶向OB-折叠结构域的结合面的链中存在的一个或多个氨基酸残基。OB-折叠结构域的结合面包括β-链1的C末端一半、β-链2、β-链3、β-链4的C末端一半和β-链5。参见图1A-1C。在另一例子中,核心OB-折叠结构域的β-链间的环中的氨基酸残基可被随机突变所靶向。在另一例子中,其中OB-折叠核心结构域(即,无机焦磷酸酶)侧翼的环区域中有大的插入,这些插入的环上的氨基酸残基可被选来进行随机化。本发明还包括下述经修饰的OB-折叠结构域,其具有是经修饰以产生蛋白质稳定性方面的改变的核心的部分(是氨基酸残基)。
II.生产经修饰的OB-折叠结构域以及展示方法
在实施例中本文所述的一些阐述性实施方式中,在其上引入了突变的两个嗜热OB-折叠蛋白质结构域——翻译起始因子IF-5A(S=8)和天冬氨酰tRNA合成酶aspRS(S=10)被用于制备经修饰OB-折叠结构域的文库,这通过对OB-折叠蛋白质结合面中的氨基酸残基进行随机化来实现。这两种蛋白质都来自超嗜热chrenarchaeon耐超高温热棒菌。使用具有处于被随机化的OB-折叠结构域的结合面中的特定氨基酸位置的长寡核苷酸,接着使用PCR进行基因装配,合成产生文库。针对其编码的蛋白质过表达的速率来对文库加以测试,估计文库所编码的可溶且热稳定的蛋白质的比例。本文表明,aspRS OB-折叠结构域(aspRS-OB)可在噬菌体表面展示并被选择。基于本文实施例中描述的aspRS支架,制备经修饰OB-折叠结构域的不同文库,对其进行噬菌体展示方法,以证明可产生能与不同底物(包括tRNA、蛋白质和纤维素配体)结合的经修饰的OB-折叠结构域。在本文公开的一种阐述性实施方式中,显示了经修饰的OB-折叠结构域(在其天然状态下是核酸结合结构域)和溶菌酶之间的结合相互作用。
如本领域技术人员将理解的,本领域中已知用于制备核酸修饰的多种方法可用于制备(编码)在一处或多处氨基酸残基处具有修饰的OB-折叠结构域。可使用本领域的标准方法,例如化学合成、重组方法来获得编码OB-折叠结构域的核酸,和/或其可获得自生物来源。感兴趣的核酸可被放置于对于在任何特定宿主细胞中其表达所必需的一种或多种的元件的控制之下。多种宿主细胞可用于拓展OB-折叠结构域,并且可用于在其表面展示经修饰的OB-折叠结构域的展示方法也是本领域已知并在本文中描述的。展示方法包括但不限于:噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体展示和mRNA展示。
i.展示方法
显示技术包括:用被固定的配体来筛选表达的蛋白质的大文库,以表征或发现各蛋白质与靶配体之间的新的相互作用。展示技术的最重要的特征是能将被筛选的蛋白质(表型)与编码它们的遗传信息(基因型)偶联到一起。在所有展示技术中,遗传信息都与被筛选的蛋白质同时被分离。这通常通过在生物实体(例如噬菌体、酵母或细菌)的表面展示蛋白质或蛋白质片段以及利用生物的复制系统以扩增文库来实现。作为这些体内系统的替代,还可体外进行整个过程,此类技术被称为核糖体展示或mRNA展示。在这些情况下,体外产生的转录物在细胞提取物中被翻译,在配体介导的对mRNA-核糖体-蛋白质复合体的分离发生之后,用RT-PCR来扩增遗传信息。
a.噬菌体展示
在丝状噬菌体表面展示外来的肽和蛋白质被称为“噬菌体展示”,现在这是研究分子相互作用的常用技术。通常待被筛选的蛋白质文库作为与位于噬菌体颗粒的一个末端的基因III蛋白质产物的融合物(fusion)被表达,或者作为与噬菌体颗粒表面上的gVIII蛋白质的融合物被表达。用此类噬菌体文库感染细菌允许非常高效的文库扩增(Griffith等人,1994)。典型的噬菌体展示方案包括:在细菌宿主中生产噬菌体颗粒,每个颗粒都展示基因文库的一个成员的基因产物(作为与其外壳蛋白的一种类型(gIII或gVIII蛋白质)的融合物)。经由用于与被固定的靶分子结合(“生物淘选”)的选择过程来获得噬菌体颗粒的文库,所述过程包括噬菌体文库与靶的结合,洗涤步骤以除去未结合的噬菌体以及对结合的颗粒的洗脱。通常需要若干轮淘选来选出具有想要的特性的分子,包括在细菌宿主中再扩增洗脱的噬菌体以及在被固定的靶上进行选择。在本文实施例中公开的一些阐述性实施方式中,噬菌体展示方法被用于展示和筛选经修饰的OB-折叠结构域。
b.细菌展示和酵母展示
细菌展示和酵母展示技术允许重组蛋白质在酵母细胞酿酒酵母(Boder和Wittrup,1997)或细菌(大肠杆菌、Staphylococcus carnosus)(Daugherty等人,1998,Wernerus等人,2003)表面的表达,所述重组蛋白质分别作为与a-凝集素酵母黏着受体或细菌外膜蛋白质(OMP)的融合物表达。
表达的融合蛋白质还含有标签序列,这允许通过流式细胞术对文库表面表达加以定量。与对配体的间接荧光标记组合,抗标签标记允许通过FACS(荧光激活细胞分选术)的细胞分选以及对相互作用的结合亲和性的测定(Feldhaus等人,2003,Wernerus等人,2003)。酵母表达载体较之其它展示技术有优势的特征在于:正确的翻译后修饰、对在细菌或体外展示系统中可能会遇到问题的哺乳动物蛋白质的加工和折叠。
c.核糖体展示和mRNA展示
核糖体展示和mRNA展示是能在体外对大蛋白质文库进行选择和进化(evolution)的技术。唯一所需的生物组分是含有体外产生的编码蛋白质序列的转录物翻译所需因子的细菌细胞提取物。在核糖体展示中,基因型和表型通过核糖体复合体连到一起,所述复合体由信使RNA(mRNA)、核糖体和被编码的蛋白质(用于选择)构成(Hanes和Pluckthun,1997)。mRNA展示方法利用嘌呤霉素来将mRNA连接到翻译的蛋白质上,因此允许纯化出含有基因型和表型信息的mRNA-蛋白质缀合物。选择之后,通过RT-PCR扩增经分离的mRNA或mRNA缀合物,它们可被转录和翻译用于另一轮选择(Lipovsek和Pluckthun,2004)。关于展示方法的参考文献包括下面列出的这些,其整体通过引用并入本文:Boder ET和WittrupKD(1997)Nat Biotechnol.15:553-7、Feldhaus MJ等人(2003)NatBiotechno_l.21:163-70、Griffiths,AD,等人(1994)EMBO Journal 13,3245-3260、Hanes J,Pluckthun A.,等人(1997)PNAS May13;94(10):4937-42和Lipovsek D,Pluckthun A.,(2004)J.ImmunologicalMeth.29051-67、Wernerus H,等人(2003)Appl Environ Microbiol.69(9):5328-35。
例如,展示方法公开在:Boder ET和Wittrup KD(1997)NatBiotechnol.15:553-7;Feldhaus MJ等人(2003)Nat Biotechnol.21:163-70;Griffiths,AD等人(1994)EMBO Journal 13,3245-3260;Hanes J,Pluckthun A.,(1997),PNAS May 13;94(10):4937-42;Lipovsek D等人(2004)J.Immunological Meth.290 51-67;和Wernerus H等人(2003)ApplEnviron Microbiol.69(9):5328-35。
III.用于筛选经修饰的OB-折叠结构域的可能靶标
天然存在的OB-折叠结构域的配体是多种多样的。对经修饰的OB-折叠结构域的文库的生产扩展了针对OB-折叠结构域的可能靶标的多样性。用于针对经修饰的OB-折叠结构域的文库进行筛选的可能靶标包括多种分子,包括,例如但不限于,核酸、蛋白质、肽、多肽、碳水化合物、寡糖和激素。
i.核酸
大量的OB-折叠结构域参与与单链DNA和RNA的结合。它们包括癌基因BRCA2的单链DNA结合结构域、来自人复制蛋白质A的若干结构域以及天冬氨酰和赖氨酰-tRNA合成酶的反密码子结合结构域。因此,单链DNA和tRNA可用作为筛选经修饰OB-折叠结构域的文库的配体靶标。
ii.蛋白质靶标
多种蛋白质可用于筛选经修饰OB-折叠结构域的文库,例如,酶、调节蛋白质、蛋白质和肽激素、转运蛋白质等。在本文公开的一些阐述性的实施方式中,溶菌酶被用作为蛋白质靶标。其它靶标包括但不限于:泛素、补体成分C4、纤维蛋白溶酶原前体、脱脂载脂蛋白A-II、血浆蛋白酶C1抑制剂、运甲状腺素蛋白和血清淀粉样P-成分。
iii.寡糖靶标
寡糖在所有生物的生物学中是构成整体所必需的部分。寡糖底物,例如但不限于,昆布己糖(laminarihexose)、甘露戊糖和木戊糖,可用作为靶标。
iv.激素
激素例如,类固醇激素(雌激素、睾酮和皮质醇)、儿茶酚胺(例如肾上腺素)和其它此类分子可用于针对OB-折叠结构域的文库进行筛选。目前没有证据表明,OB-折叠结构域用类固醇激素或其它辅因子作为天然配体。此外,传统上难于产生针对类固醇的高特异性抗体,并且凹结合面,例如OB-折叠结构域结合面在产生对特定激素的结合特异性方面可能被证明是更好的。
v.小有机分子
小有机分子(被定义为分子量等于或小于大约1000道尔顿的有机分子)也可用作为OB-折叠结构域的靶标。小有机分子可以是天然存在的分子或者是自然界没有发现过的合成分子。天然存在的小有机分子可与活的系统(例如类固醇激素;见上文)相关联,或者可非生物性存在。小有机分子包括但不限于,污染物或其它不想要的物质,例如DDT或多氯联苯(PCB’s)。小有机分子包括但不限药品和药物,例如阿霉素和紫杉醇。
IV.针对OB-折叠结构域的应用
如本文所述,OB-折叠结构域是多功能的分子识别平台。多种OB-折叠结构域是本领域已知、本文公开以及已在SCOP和其它数据库(例如Pfam和Superfamily)中鉴定出来的。此类OB-折叠结构域可用在下述方法中,所述方法用于制备经修饰的OB-折叠结构域以及经修饰的OB-折叠结构域的文库,可针对靶标,例如,核酸、蛋白质、激素、碳水化合物和寡糖对所述文库加以筛选。此类筛选方法可用于鉴定具有想要的性质的经修饰的OB-折叠结构域。例如,人OB-折叠结构域可用作为支架,用于生产经修饰的OB-折叠结构域的文库,可以针对可能在对人的治疗方面具有应用的人靶标对所述文库加以筛选。在另一例子中,酵母OB-折叠结构域可用作为支架,用于生产可能应用于生物技术或发酵应用的经修饰的OB-折叠结构域的文库。在还一个例子中,酶性OB-折叠结构域可用作为支架,用于生产具有新的酶性质的经修饰的OB-折叠结构域的文库。
经修饰的OB-折叠结构域的可能应用落入三个宽类别中:诊断试剂;治疗应用;和工具。
经修饰的OB-折叠结构域可用于宽广范围的分子生物学工具,其包括,例如,作为蛋白质纯化试剂的用途,用于对来自重组来源或天然来源(例如血清)的蛋白质进行亲和性纯化。在此类应用中,针对所选用蛋白质具有特异性结合亲和性的OB-折叠结构域将被固定到珠子上,然后用于对靶蛋白质进行亲和性纯化。其它应用包括:在用于Western印迹中的蛋白质检测中的用途;使用荧光标记的OB-折叠结构域进行的蛋白质检测;以及用于单链DNA和RNA的保护剂。在这些方面,OB-折叠结构域较之抗体的主要好处在于,可定制经修饰OB-折叠结构域的稳定性,以与试剂匹配。例如,热稳定OB-折叠结构域,例如,可从耐超高温热棒杆菌获得的那些,可比作为亲和性纯化试剂的抗体更有效。
经修饰的OB-折叠结构域的诊断应用包括,例如:在流体(例如血清、培养物上清液和被污染的水)中的蛋白质检测;基因型分型(很多OB-折叠蛋白质是单链DNA结合蛋白质,它们可被开发来检测特异性DNA或RNA基序,用于基因型分型等方法中)以及在一些小分子检测剂中。
既然重组抗体及其片段目前代表了正经历临床试验以用于诊断和治疗的所有生物蛋白质的大部分,那么抗体文库的替代品(例如经修饰的OB-折叠结构域的文库)就很有作为治疗剂的潜力。目前已经上市的重组抗体的例子是肿瘤学治疗剂赫赛汀(Herceptin),抗HER2抗体;Rutuxan(Rutuximab)抗CD20抗体;以及阿瓦斯丁(Avastin)抗VEGF抗体。经修饰OB-折叠结构域的人源化文库可被制备,可从中鉴定出具有合适的结合特性(能用于治疗领域)的特定的那些。
实施例
实施例1:材料和方法
化学物质和生物化学物质
标准寡核苷酸购自英杰生命科学公司(Invitrogen),所有的长随机化寡核苷酸来自MWG(马丁内斯公司(Martinsried),德国)。Pfx和taq聚合酶以及所有限制性酶来自英杰生命科学公司(Invitrogen)(Carlsbad,USA)。虾碱性磷酸酶(SAP)和T4连接酶来自罗切公司(Roche)(Basel,瑞士)。噬粒载体pRPSP2和噬菌体VCS-M13和VCSM-13d3(Vd3)来自J.Rakonjac博士(31,32)。包被有链亲和素的磁珠和 RNase抑制剂来自罗切公司(Roche),和雌鸟卵溶菌酶一样。牛血清清蛋白来自西格玛公司(Sigma)。生物素化的转移RNA是用来自安宾公司(Ambion)(USA)的MEGAscript体外转录试剂盒和来自罗切公司(Roche)的生物素RNA标记混合物来制备的。用于western分析的硝化纤维素膜来自丝莱澈&斯隆公司(Schleicher & Schuell)(Dassel,德国),所用的底物是来自皮尔斯公司(Pierce)(USA)的
生物信息学
使用Swiss-pdbViewer和Pymol(在pymol.sourceforge.net上)对结构进行观察、分析,或将其从PDB文件(33)转变为图。PDB进入(entry)1bkb(34)被用于对IF-5A的结构分析。对aspRS而言,使用aspRS同源物1b8a(35)、1eov(36)、1coa(37)的PDB文件。
aspRS-OB的结构模型从SwissModel(38-40)获得,这是通过提交来自耐超高温热棒菌的aspRS-OB的氨基酸序列来获得的。经由EBI服务网页(<www.ebi.ac.uk/services/>)使用ClustalW(版本1.8)在线进行比对。
克隆
按照Sambrook和Russell(41)来进行一般的克隆。通过PCR,使用寡核苷酸005和006(用于aspRS-OB)以及011和012(用于IF5A-OB),从耐超高温热棒菌IM2基因组DNA(NC003364,(42)),扩增出aspRS-OB(来自耐超高温热棒菌IM2的asp-tRNA合成酶,碱基1-327,氨基酸1-109,NCBI登录号NP_558783)和IF5A-OB(来自耐超高温热棒菌IM2的IF-5A,NP_560668,碱基208-399,氨基酸76-139)的野生型基因。寡核苷酸序列列于附件1中。用BamHI和EcoRI消化用于过表达的所有PCR产物,将其连接进pProEx-Htb中。pProEx-Htb产生了作为N-末端加上His6标签的融合蛋白质的蛋白质。为将aspRS-OB基因克隆进pJARA140中,通过PCR,使用寡核苷酸对050/044来扩增出aspRS-OB,用NcoI和NotI对其进行消化。在连接之前,还用同样的酶对pJARA140进行消化并且去磷酸化。为进行亚克隆,使用载体特异性引物来扩增选用的突变体基因,将其插入供体载体pDONR221,随后插入pDEST15,这二者均为克隆系统(英杰生命科学公司(Invitrogen))的部分。pDEST15允许蛋白质作为与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合物来表达。
大肠杆菌
大肠杆菌K12菌株XL1-blue(43)被用于对源自pPro_Ex的所有构建体进行克隆和质粒制备以及用于小规模的蛋白质合成,大肠杆菌JM101衍生物TG1用于克隆所有的pRPSP2构建体以及用于用VCS-M13辅助噬菌体产生的所有噬菌体。用pJARA131和pJARA112转化的大肠杆菌K561(产生大肠杆菌K1762,(44))用于制备VCS-M13d3辅助噬菌体,用于多价展示。大肠杆菌BL21(DE3)(诺华公司(Novagen))用于大规模蛋白质生产和纯化。
基因文库构建
通过在选定的位置掺入含有密码子NNK(N=A、C、G或T,K=T或G)的诱变性寡核苷酸来构建文库。通过PCR产生携带掺入的突变的AspRS-OB基因片段,然后将其装配成全长基因。引入随机化位置的长寡核苷酸列于表1中。在第一个PCR步骤中,使用相应的侧翼引物,并且掺入在选定位置随机化的寡核苷酸,来产生基因片段(30个循环,94℃1分钟,52.5℃ 30秒,68℃ 1分钟)。在第二个步骤中,通过重叠序列延伸PCR(25个循环,94℃ 1分钟,52.5℃ 30秒,68℃ 1分钟),将基因片段装配成全长基因。通过分光光度法来计算装配的产物的量,令其超过1011个分子,以确保在后续步骤中保持108的多样性。针对aspRS-OB和IF5A-OB分别使用载体特异性引物005/006或011/012,通过PCR(30个循环,94℃ 1分钟,52.5℃ 30秒,68℃ 1分钟)来扩增装配的产物,对所述产物进行消化,并连接进pProEx-Htb。对于aspRS-OB的噬菌体文库来说,使用引物050/044以克隆进pRPSP2(见下文)。将含有野生型基因或装配的文库的质粒转化进大肠杆菌XL1-Blue,在补充有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板上于37℃培养过夜。通过捡出单个菌落并在50μl LB/Amp中对其培养数小时来进行诊断性PCR。用1μl该培养物进行10μl PCR扩增(25个循环,94℃ 1分钟,52.5℃ 30秒,68℃ 1分钟),其中分别使用针对pProEx-Htb或pRPSP2的诊断引物。对所有制备性PCR反应使用Pfx聚合酶,而taq聚合酶仅用于诊断性PCR反应。图2A和2B示出了概括用于每种OB-折叠基因的装配策略的流程。
从文库的蛋白质过表达情况
对于每种文库而言,将经转化的细菌涂布到琼脂(含有LB-amp)上,捡出单个菌落,在Eppendorf Thermomixer中,以1200rpm振荡,将所述菌落在96深-孔板中的100μl LB-amp(50μg.ml-1)中于37℃培养过夜。通过加入900μl新鲜的LB-amp来稀释培养物,再培养60分钟,然后使用1mM异丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)在37℃诱导4小时。通过离心收集细菌细胞,将其重新悬浮于150μl Tris缓冲的盐水(TBS:50mM Tris-HCl,pH 7.5,150mM NaCl)中,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析(SDS-PAGE,15%聚丙烯酰胺)。表1是用于aspRS-OB和IF5A-OB文库构建的长寡核苷酸的列表。针对反义密码子,通过NNK:N=A/T/G/C,K=T/G或MNN:M=A/C来定义每种随机化的密码子。还见图3A和3B。
表1
通过冷冻-解冻和加入溶菌酶(0.5mg.ml-1)来裂解重新悬浮的细胞,并且在不可溶物质沉降后,还通过SDS-PAGE对可溶级分进行分析。通过使用5μl Ni-NTA树脂(强基因公司(Qiagen),德国)结合可溶蛋白质来进行小规模纯化步骤。用TBS洗Ni-NTA珠子,使用SDS-PAGE鉴定结合的蛋白质。
蛋白质表达和纯化
野生型OB-折叠结构域、aspRS-OB、IF5A-OB以及突变体IF5A-OB/A2和aspRS-OB/13mRL以毫克级表达并被纯化。在LB-amp(50μg.ml-1)中的大肠杆菌XL1-Blue的25ml过夜培养物被用于接种500mlLB-amp培养基。培养物在37℃被培养至OD600=0.6,通过1mM IPTG诱导4小时。通过离心收集细菌,将其贮藏于-20℃。将细胞重新悬浮于25ml TBS+10mM咪唑中,通过超声处理来裂解。在加热步骤中处理源自IF-5A的OB-折叠蛋白质,所述步骤包括在85℃温育30分钟。这使得大肠杆菌蛋白质的大部分变性。在Sorvall SS-34转子中以16,000rpm对经裂解的细胞加以30分钟的离心。为进行纯化,将裂解物上样到Ni-NTAHigh捕获柱(trap column)(爱默生药物公司(Amersham Pharmacia),瑞典)上。使用咪唑梯度从柱进行洗脱。针对不含咪唑的20mM Tris-HClpH7.5、150mM NaCl对经纯化的蛋白质进行透析,浓缩并通过大小排阻来进行第二次纯化步骤,其中使用 200柱(爱默生公司(Amersham))。
噬菌体文库制备
用于用噬菌体工作的一般流程按照Barbas等人(45)来进行。为制备噬菌体aspRS-OB-pIII-Vd3的贮备物(stock)用于选择,用具有处于pJARA140中的aspRS-OB的~6×109个大肠杆菌TG1细胞来接种200ml,2×YT-amp(50μg.ml-1)。将该培养物在37℃下振荡生长1小时,并且用大约1×1012个单位的Vd3辅助噬菌体在37℃下(不振荡)感染30分钟。然后洗涤细胞,在2×YT-amp中对其再进行4小时的培养。然后通过聚乙二醇(PEG)沉淀从培养物上清液浓缩出噬菌体,将其重新悬浮于TBS中,并贮藏于4℃。噬菌体效价被确定为3.0×1011TDP.ml-1。
为将aspRS-OB基因文库克隆进pRPSP2中,寡核苷酸对050/044被用于对装配的基因文库的PCR扩增。通过NcoI和NotI来消化PCR产物。使用大约10ug的经NcoI/NtI消化的噬菌体载体pRPSP2和插入片段(摩尔比为1:5)在1ml反应体系中进行连接,接着在旋转柱(罗切公司(Roche)或强基因公司(Qiagen),Hilden,德国)上纯化。通过电穿孔,将50ul洗脱物转化进10×50μl电感受态大肠杆菌TG1细胞,产生大约1×108个转化体。在100ml SOC培养基中,于37℃对经转化的细胞进行1小时的培养,之后加入400ml LB/Amp,再在37℃培养1小时。取样,以评估连接和转化效率,这通过在LB/Amp琼脂平板上涂布系列稀释液并通过诊断性PCR针对正确插入片段大小对各克隆加以分析来实现。随机捡出菌落,从对各克隆的诊断性PCR来测量正确插入片段的大小。正确大小的插入片段的数量为89%,菌落的数量被计算为9×107,从而产生了携带正确大小的插入片段的~8×107个不同克隆的多样性。一旦培养物达到OD600=0.4,就用大约5×1012pfu VCS-M13辅助噬菌体(斯莱特因公司(Stratagene))对培养物进行感染,在37℃无搅动下保持20分钟,然后振荡1小时。加入卡那霉素,至终浓度为50ug/ml培养物,并且将培养物在37℃培养过夜。沉降细菌,并且在溶解于20g PEG8000(西格玛公司(Sigma))和15g NaCl之后,将噬菌体在4℃沉淀过夜。通过离心沉淀噬菌体,将其溶解于5ml PBS中,滤经0.45过滤器,用于淘选。
制备生物素化的RNA靶标
使用MEGAscript试剂盒(安宾公司(Ambion),USA)和含有生物素-16-UTP的生物素RNA标记混合物(罗切公司(Roche),瑞士),通过体外转录,来产生经生物素标记的asp-tRNA。基于表达PCR(41),通过PCR将覆盖了来自耐超高温热棒菌的78bp asp-tRNA基因(基因_ID:1464263)和从pET28(英杰生命科学公司(Invitrogen))扩增出的150bp的DNA片段(在其3’端包括T7启动子区域,根据近来针对T7的启动子识别研究(42),这之后是GG,用于最优启动子活性)的合成寡核苷酸装配起来,来制造DNA模板。这导致产生了230bp的装配产物,将其用乙醇沉淀、干燥,并重新悬浮于不含RNase的H2O中,并且无需进一步克隆就用作为转录模板(41)。按照厂商手册(安宾公司(Ambion))来进行体外转录,其从25μl的反应体系产生了~5μg生物素化的asp-tRNA。
对aspRS-OB文库的选择
生物素化的asp-tRNA在从文库“RL”和“13mRL”进行选择中被用作为靶标,雌鸟卵溶菌酶(罗切公司(Roche),瑞士)被用于仅从“13mRL”进行选择。
为在RNA上进行选择,通过与包被有链亲和素的顺磁珠结合来固定生物素化的asp-tRNA。用400ul PBS-T(PBS,0.1%Tween)对10μl珠子洗2次,将其与100ng生物素化的asp-tRNA在RT、搅动和偶尔翻转下孵育30分钟。用PBS-T对珠子洗3次,之后与1ml的~1011cfu噬菌体文库RL或13mRL在PBS-T+0.5%BSA中一起孵育2小时。用PBS-T洗6次(对于第一轮淘选而言)和8次(对于随后的淘选轮次而言)之后,用PBS对珠子再洗2次,并将其与1ug(5个Kunitz单位)RNase A(来自牛胰腺(bovine pancrease),罗切公司(Roche))一起在37℃孵育30分钟,以消化RNA以及洗脱RNA结合的噬菌体。通过细菌感染来对洗脱的噬菌体颗粒加以计数,将其用于感染3ml新鲜的TG1培养物,以生产TDP用于下一轮的淘选。令培养物在37℃放置20分钟(其间不搅动),在振荡下孵育1小时,之后加入氨苄青霉素并培养过夜。将过夜培养物用于接种500ml预热的LB/Amp。辅助噬菌体感染和TDP生产按照与上文列出的噬菌体文库制备的流程相同的流程来进行。4轮淘选之后,对各克隆加以分析。
为在溶菌酶上进行选择,于4℃用2.5ml溶菌酶溶液(10ug/ml)(处于20mM NaCO3 pH9.0中)对4ml Immuno管(南克公司(Nunc),Denmark)进行包被过夜,并且在RT下用4ml处于PBS中的1%BSA封闭1小时。加入来自文库13mRL的噬菌体(~2.5×1011cfu,在2.5ml中),并且在RT下、轻柔搅动和偶尔翻转下,孵育2小时。通过用PBS-T0.1%BSA进行的8个洗涤步骤(对于第一轮选择而言,用PBS-T仅进行6次洗涤)和用PBS进行的2个洗涤步骤,在5分钟快速洗涤。通过与2.5ml洗脱缓冲液(0.2M甘氨酸-HCl,pH 2.2,溴酚兰)一起孵育10分钟来洗脱结合的噬菌体,并且立即使用500ul 1M Tris-HCl pH 9.0中和。对洗脱的噬菌体加以计数,用其去感染新鲜的3ml TG1,用于TDP扩增以及随后的淘选轮次。以与上文所述在asp-tRNA上进行淘选相同的方式来培养培养物和生产TDP。6轮选择和扩增之后,捡出并分析克隆。
用于噬菌体展示蛋白质检测的Western印迹
通过PEG沉淀将aspRS-OB的噬菌体样品浓缩至1×1011TDP/ml,取10μl与凝胶上样缓冲液(含有SDS和BME)组合,煮沸,并在10%SDS-PAGE凝胶上进行分离。转到硝化纤维素膜(Protran,丝莱澈&斯隆公司(Schleicher& Schuell),德国)上之后,使用小鼠抗c-myc一抗(Zymed,英杰生命科学公司(Invitrogen))以及与HRP相连的抗小鼠二抗(爱默生药物公司(Amersham-Pharmacia),瑞典)来检测aspRS-OB-pIII融合蛋白质。使用底物(皮尔斯公司(Pierce),USA)来观察。
噬菌体ELISA
进行噬菌体ELISA实验,针对与溶菌酶的结合来分析选出的克隆。用5ug/ml雌鸟卵溶菌酶、5ug/ml RNaseA或1% BSA(在PBS中)中在4℃对96孔ELISA板包被过夜。用TBS洗两次之后,用封闭缓冲液(TBS中的5%脱脂乳)在RT下对平板封闭1小时,之后加入处于2.5%脱脂乳-TBS-T中的噬菌体(109cfu/孔,源于VCS-M13d3)。在RT和搅动下对平板进行2小时孵育。用H2O洗10次后,加入在封闭缓冲液中稀释的小鼠抗M13蛋白质VIII,并且在RT孵育1小时。将平板用H2O洗四次,向孔中加入在封闭缓冲液中的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的兔抗小鼠免疫球蛋白质(皮尔斯公司(Pierce)),并且在RT下孵育1小时。用H2O洗四次孔,每孔加入50ul底物溶液(处于PBS 0.030% H2O2中的1mg/ml邻苯二胺)。大约15分钟后通过加入25ul 2.5M H2SO4来终止反应,在492nm记录吸光度。
为进行相对噬菌体定量(对展示的融合蛋白质的定量),直接用噬菌体样品来包被平板。用封闭缓冲液封闭之后,按照上文所述的流程,使用小鼠抗c-myc一抗(Zymed,英杰生命科学公司(Invitrogen))和HRP缀合的抗小鼠二抗来检测噬菌体。
单克隆噬菌体制备
为进行噬菌体结合实验,使用VCS-M13d3(Vd3)的gIII缺失变体(Rakonjac等人,1999)作为辅助噬菌体,制备作为多价展示的单克隆噬菌体样品。为进行微淘选预筛选,使用源自wtVCS-M13的单价噬菌体。按照通常的方案(Barbas III等人2001),从单个噬菌斑来制备辅助噬菌体VCS-M13和Vd3贮备物,不同之处在于,在TG1上培养VCS-M13,在大肠杆菌K1762(经质粒pJARA131(camr)和pJARA112(ampr)转化的K561)上的Vd3被用作为宿主菌株以提供pIII用于噬菌体装配。在65℃对Vd3样品加热20分钟,以从细菌宿主杀死λ-溶源体。
为制备在Vd3或VCS-M13上的噬菌体aspRS-OB的贮备物,在100mlLB/Amp上对经相应pRPSP2衍生物转化的大肠杆菌TG1进行培养,至OD600=0.4,并且分别用1012pfu Vd3或VCS-M13对其加以感染。在37℃无搅动下孵育20分钟后,再在振荡下孵育培养物1小时。加入卡那霉素(50ug/ml终浓度),对培养物孵育过夜。沉降细胞,使用PEG/NaCl按照现有的方案(Barbas III等人)以及如上文讨论的通过沉淀来纯化噬菌体。将TDPs重新悬浮于PBS中并用于分析。
asp-tRNA上的单克隆噬菌体结合实验
为测试噬菌体展示的蛋白质与asp-tRNA的结合,用单克隆噬菌体样品来在Vd3上以多价模式展示融合蛋白质。基本上按照上文所述的第一轮选择那样来进行该流程。将生物素化的asp-tRNA与包被有链亲和素的顺磁珠结合,应用TDP样品(109cfu/管)。孵育和洗涤步骤之后,通过加入RNaseA来消化RNA,并且通过细菌感染来对洗脱的TDP加以计数。
GST的“下拉”测定
将在溶菌酶上选择的突变体亚克隆进 pDEST15,用于作为GST-融合蛋白质表达。将构建体转化进大肠杆菌BL21(DE3),并且在3ml LB/Amp上对培养物进行培养。通过加入IPTG至终浓度为1mM来诱导细胞,并在37℃对细胞再进行4小时的培养。将细胞沉降,重新悬浮于300ul裂解缓冲液(Tris-HCl 7.5 150mM NaCl)中,并且通过超声处理裂解。将不可溶物沉降,并且将可溶级分与10ul连有谷胱甘肽的琼脂糖珠子(爱默生公司(Amersham))一起在4℃孵育1小时。2次用TBS-T洗涤步骤之后,将珠子与包括150ul溶菌酶(1mg/ml)和0.1% BSA的300ul TBS-T在4℃孵育1小时。使用不同的缓冲液来进行洗涤:TS(50mM Tris-HCl pH7.5,150mM NaCl)、TBS-T(20mM Tris-HCl pH7.5,150mM NaCl,0.1% Tween20)、TBS-T-500(TBS-T,500mM NaCl)。将珠子重新悬浮于凝胶上样缓冲液(含有SDS和BME)中,煮沸并通过SDS-PAGE来进行分析。
生物传感器结合分析
通过蛋白质的一级胺基团,将配体溶菌酶以30μg/mL(处于pH4.3的乙酸钠缓冲液中)偶联至CM5 Biacore传感器芯片上。用35μL的EDC:NHS的1:1混合物(可自柏克公司(Biacore)商购获得)以5μL/分钟激活芯片上可用的四个流动室(flow cell)中的第二个。通过连续注射10-20μL直到看到足够的反应为止,将溶菌酶偶联到被激活的表面上。通过注射乙醇胺-HCl来对芯片上留下的未偶联的活性基团进行灭活。为进行分析,以1:2系列稀释为6种浓度组织OB3 13mRL L6,所述稀释从在运行缓冲液中的370μM开始,还要加上仅有缓冲液的空白。使用第一个流动室作为参考,以随机顺序,25μL/分钟,对七份样品的每份都一式两份进行1分钟的分析。观察反应曲线,用BIAevaluation(柏克公司(Biacore))对其进行加工。对每种浓度的相对反应取均值并绘图,以使用Sigma Plot(希斯特软件公司(Systat Software,Inc.))确定Rmax和kD。
实施例2:来自耐超高温热棒菌的OB-折叠结构域
为研究OB-折叠结构域是否可用作为支架以产生具有特定结合和酶促性质的蛋白质,对各OB-折叠结构域蛋白质对穿过提出的结合面的突变的耐受性加以研究。选用来自耐超高温热棒菌,超嗜热crenarchaea(Tmax=104℃,Topt=100℃)的两种OB-折叠结构域。使用Superfamily数据(版本1.65(46)),遵循数据库搜索来进行该选择,以找到耐超高温热棒菌基因组中的OB-折叠蛋白质(42)。该数据库使用已知结构已被归入1294SCOP超家族(SCOP:蛋白质的结构分类)的所有蛋白质的文库,以开发隐藏的Markov模型,然后将其作为概图(profile),以在被测序的基因组中搜索可能含有相似折叠的蛋白质。该搜索产生了14个命中(hit),它们代表来自耐超高温热棒菌IM2的基因组的含有可能的OB-折叠结构域的蛋白质序列。
对这些序列中的每一条加以分析,以找到空间上与其它结构域分开并且因此预计独立稳定的OB-折叠蛋白质。还将序列与代表超家族的三维模型进行比对,或与可获得的同源三维蛋白质结构进行比对,以检查来自所述序列的OB-折叠预测的可靠性。这14条序列中,有8条满足标准(见表2)。八条候选序列中的六条属于RNA结合蛋白质的两个功能类:翻译起始因子(IF)和氨酰-tRNA合成酶(aaRS)。两条候选序列没有功能标注,并且被归类为“保守的假设蛋白质”。
克隆来自所选序列的OB-折叠结构域。从序列比对来鉴定结构域边界,并针对在大肠杆菌中的表达和溶解性来对所述结构域边界加以测试。最初选用来自天冬氨酰tRNA合成酶的OB-折叠结构域(aspRS-OB)和来自翻译起始因子IF-5A的OB-折叠结构域(IF5A-OB),因为它们表达良好,并且可溶还是热稳定的。
IF-5A蛋白质的另一优点在于Pfam数据库中高分辨率三维结构的可获得性(34),从中可可靠地选择暴露于表面的残基来进行随机化。IF-5A的这种结构(图3)显示了在C-末端具有OB-折叠并且被接头区域空间上分离的两个结构域,由此满足我们的选择标准。提出的结合面(β-链1-3)背离蛋白质中央并朝向溶剂。IF-5A的OB折叠具有S=8的剪切数,并且因此代表了OB-折叠结构域的一个亚类。
asp-tRNA合成酶的OB-折叠结构域(aspRS-OB)被选用为具有S=10的性质的OB-折叠蛋白质第二亚类的代表。来自耐超高温热棒菌的aspRS的三维结构尚不可获得,但是PDB中有针对来自其它生物的aspRS蛋白质的多种结构。图4展示了来自大肠杆菌的aspRS的晶体结构(37)。对来自耐超高温热棒菌aspRS的OB-折叠结构域及其大肠杆菌同源物的序列比对显示,OB-折叠结构域具有30%的序列同一性。aspRS蛋白质在其全长上20%相同(序列水平)。OB-折叠位于N-末端,并且在空间上与更大的C-末端结构域清楚地分开。结合面背离C-末端结构域,朝向溶剂。尽管N-末端OB-折叠结构域与tRNA结合并且构成反密码子识别结构域,与天冬氨酰-tRNA反密码子特异性结合(36),而C-末端构成蛋白质的酶促成分。表2显示了八条选自耐超高温热棒菌的、具有预测的OB折叠的序列。NP登录号与预测的大小和提出的剪切数一起给出。IF-5A的三维结构是可获得的。保守的假设蛋白质NP_559846的预测尺寸与完整蛋白质相对应。在这种情况下,难于精确预测OB-折叠结构域的边界。
表2
包含预测的OB-折叠的蛋白质标注 | NP数 | OB折叠的大小 | 剪切数(S) |
翻译起始因子IF-5A | (NP_560668) | 10kDa | 8 |
翻译起始因子IF-2的α亚基 | (NP_560442) | 12kDa | 8 |
翻译起始因子IF-1A | (NP_559055) | 14kDa | 8 |
天冬氨酰-tRNA合成酶 | (NP_558783) | 15kDa | 10 |
天冬酰胺酰-tRNA合成酶 | (NP_560397) | 14kDa | 10 |
赖氨酰-tRNA合成酶 | (NP_559586) | 18kDa | 10 |
保守的假设蛋白质 | (NP_560727) | 11kDa | - |
保守的假设蛋白质 | (NP_559846) | 29kDa | - |
这些OB-折叠结构域中的每种在所有界中都具有同源体,这提供了应用于不同生理学背景的机会(关于对来自不同物种的aspRS(图5A)和IF-5A(图5B)的序列比对,参见图5A-5B)。图5C显示了对来自耐超高温热棒菌、P.kodakaraensis和大肠杆菌的aspRS-OB的序列比对。序列中相同之处通过星号来表示。OB-折叠的二级结构示于序列下方:在链4和5之间的1+环,环4/5。
实施例3:选择用于随机化的残基
基于其三维结构,来选择两种OB-折叠结构域中用于随机化的残基。IF-5A的结构是可获得的。使用SwissModel(38-40),以及来自大肠杆菌(36,37)和Pyrococcus kodakaraensis(35)的可获得的结构作为结构模板,通过模造来产生来自耐超高温热棒菌的aspRS的OB折叠的结构。
在OB-折叠结构域的结合面,从β-链1-3选择暴露于表面的残基。鉴于aspRS和IF5A的OB-折叠结构域具有不同的剪切数,它们的结构也略有不同。具体而言,β-链4和5与这些链之间的环在一起的排列有所不同。在aspRS-OB的情况下,链4和5之间的环也被包括进来,在文库之一中用于随机化。因此,对于aspRS-OB而言,位于β-链1-4上和链4和5之间的环中的13个暴露于溶剂的残基被选用来进行随机化。这给出了突变位点的最大数为17个以及2017=1.3×1022个可能的突变体的理论可变性。
为了评估此类突变的耐受性,构建一组文库独立展现结合面的部分。对于IF5A-OB而言,构建这样的文库,其在β-链1-3(图8)上的9或11处位置上随机化,产生了两个文库,分别具有209=5.12×1011和2011=2×1014个变体的经计算的理论变异。生成两个小文库(每个400个变体),其通过随机化两个引入的残基(丝氨酸-天冬酰胺)(2RL)或通过使用另外的两个残基延伸环(2RL+2)来靶向链1和2之间的环。OB-折叠结构域中具体的选择的残基和其位置见图8和9。
实施例4:OB-折叠文库
构建一组文库,它们展现了每种OB-折叠结构域的被定义区域。对于aspRS-OB-折叠结构域而言,对β-链进行各突变,并将它们互相组合。链4和5之间的环在野生型OB-折叠结构域(即,天然存在的OB-折叠结构域)中和在完全随机化文库中被分别随机化。因此构建了五个具有不同大小并且随机化位置不同排列的文库(见表3A-3B)。
对于IF5A-OB而言,β-链1-3以及链1和2之间的环被靶向用于随机化。该环(链1和2之间)被靶向用于随机化,以评估其延伸随机化表面区域的潜力。在该区域显示出延伸的环的天然存在的OB-折叠蛋白质有若干例子,这表明该环可被延伸。采用用于aspRS-OB-折叠结构域的一种相似手段,通过PCR装配具有不同突变组的文库(见表3),将其克隆进表达载体,并在大肠杆菌中表达。捡出代表了携带突变的文库成员的克隆,针对正确大小的插入片段、作为加His6-标签的蛋白质的表达、溶解性和与Ni-NTA-树脂的结合对其加以分析。
表3A
aspRS-OB文库 | 随机化区域 | 文库的理论大小 | 突变数量 |
4m | β3 | 204=1.6×105 | 4 |
9m | β1-2 | 209=5.1×1011 | 9 |
13m | β1-3 | 2013=8.2×1016 | 13 |
4RL | 环4/5 | 204=1.6×105 | 4 |
13m4RL | β1-3+环4/5 | 2017=1.3×1022 | 17 |
表3B
IF5A-OB文库 | 随机化区域 | 文库的理论大小 | 突变数量 |
9m | β1-3 | 209=5.1×1011 | 9 |
11m | β1-3 | 2011=2.0×1014 | 11 |
2RL | 环1/2 | 202=400 | 2 |
2RL+2 | 环1/2 | 202=400 | 2 |
表3A-3B是针对aspRS-OB的基因文库的列表。后缀“m”表示覆盖β-链1-3的β-片层中的突变。后缀“RL”表示随机化的环区域(aspRS-OB的情况下是环4/5,IF5A-OB的情况下是环1/2)。
实施例5:文库装配
基本上基于重叠序列延伸PCR来装配文库,其中在想要的位置掺入了具有简并密码子的合成寡核苷酸。首先,通过普通PCR技术产生覆盖整个基因并且含有重叠区域的基因片段。通过掺入相应的含有随机化密码子的长寡核苷酸来产生随机化片段。使用等摩尔的这些基因片段组合在基因侧翼的引物,通过PCR来装配片段,从而扩增出掺入了随机化位置的全长基因。使用简并寡核苷酸的不同组合,产生在结合面的不同区域含有随机突变的若干文库。在aspRS-OB中,在β片层W28、E29、R31、I33、R35、V36、F38、V40、R42、F47、Q49、T51、K53上和环区域I85、A86、K87、S88中的残基处,产生多样性。文库RL(随机化的环)在β链-4和5之间的环区域中含有4个随机化的位置。RL文库的理论多样性是204=160000种不同的变体。转化之后,文库RL含有~107个克隆,其中94%具有正确大小的插入片段,从而得到了对文库多样性的完全覆盖。13mRL的理论多样性非常高,其具有~5×1022种变体。转化之后获得了108个克隆,其中89%具有正确的插入片段。在被测序的10个克隆中,8个具有想要的经突变序列,而2个克隆具有移码,这导致了无义翻译。13mRL文库中总的多样性被估计为~8×107种变体。
产生针对IF5A-OB的各文库。“9m”和“11m”文库每个都具有掺入基因中的不同的长寡核苷酸对。针对11m文库而言,可对环1/2进行4个氨基酸的延伸(Ser-Asn-Gly-Ala),以提供对随机化片段的充分覆盖。对于小文库2RL和2RL+2而言,使用覆盖相应区域的、含有掺入到基因中的随机化位置的一条寡核苷酸,来在环区域中产生随机化位点。具有9和11处突变的IF-5A文库的多样性被估计为1×107种变体,小文库的理论多样性(400种变体)被完全覆盖。
实施例6:OB-折叠突变体蛋白质的表达
天然存在的OB-折叠结构域在大肠杆菌(培养物的10-20mg.l-1)中都表达良好,并且在细胞裂解之后绝大部分可溶。热处理(85℃,15分钟)后它们仍保持可溶,并且与Ni-NTA珠子定量结合。克隆OB-折叠文库,并且将其作为N-末端加His6-标签的蛋白质表达。记录了一组蛋白质特性,它们展现了蛋白质稳定性和结构完整性。
将PCR文库克隆进表达载体,效率为90-95%(通过菌落PCR确定),并且基因在大肠杆菌中作为多聚组氨酸融合蛋白质表达。针对表达、溶解性和Ni-结合对48个或96个菌落进行了筛选。结果被概括于表4中。
表4
13m文库
4m和9m文库
4RL和13m4RL文库
对用于aspRS-OB的文库构建的概括示于表4中。对于每个文库而言,列出了PCR产生的基因片段、寡核苷酸和模板。通过掺入寡核苷酸的PCR生成了基因片段。然后使用基因侧翼引物(寡聚体005和006)通过重叠序列延伸PCR,将PCR产物装配成全长基因。还见图2A-2B。来自所有aspRS-OB文库的克隆中有大约一半在大肠杆菌中表达良好。β-片层上随机化的位置的数量(即,为了构建文库在结合面上被随机化的氨基酸位置的数量)看起来与表达变体的百分比相关。对于具有13处突变的两种文库(13mRL和13m)而言,突变体蛋白质中~45%表达良好。在β-片层1和2上含有9处突变的文库显示在52%的克隆中表达。仅靶向环4/5用于随机化的文库具有非常高的表达克隆数量(81%)。但是,在所述面和延伸的环上被随机化的位置的组合(13mRL+2)将表达克隆的数量降低至只有30%。
在IF5A-OB的情况下,在β-片层上具有突变的文库以相当低的水平表达(12%),其中9-25%是可溶的。相反,仅在环1/2中含有随机化位置的突变中的72-81%表达,其中~70%是可溶的。裂解后在80℃对所有IF5AOB突变体进行热处理。由此所有可溶的和Ni-结合的突变体也是热稳定的。
捡出一些突变体用于制备性表达和纯化。此外,还进行对aspRS-OB突变体的大规模纯化。表5显示了对表达、溶解性和Ni-NTA-结合实验的概括。
表5
对于每种文库而言,针对表达、溶解性和与Ni-NTA的结合筛选了32至192个菌落。表5显示了每种文库的表达克隆的数量、计算出的表达克隆的比例,并且展示了对表达OB-折叠突变体的溶解性和Ni-NTA结合性质的评估。
实施例7:分析噬菌体展示的aspRS-OB
对于作为支架用于文库产生的蛋白质结构域的重要标准是其在选用的展示系统上功能性展示的能力。本文公开的实验采用了噬菌体展示。为评估该技术用于选择aspRS-OB突变体的有效能力,对在丝状噬菌体M13表面上重组野生型aspRS-OB作为gIII融合物的展示进行了评估。通过Western印迹分析了在制备的噬菌体颗粒中pIII-aspRS-OB融合物的存在。使用asp-tRNA作为靶标配体,通过噬菌体结合测定,来研究展示的aspRS-OB的功能性展示。
将针对野生型aspRS-OB的基因克隆进噬粒载体pRPSP2(gIII基因的上游),产生了在N-末端与aspRS-OB并且在C-末端与pIII的融合蛋白质(见图6)。该噬粒载体含有处于噬菌体休克启动子(psp)控制下的gIII,该启动子会被辅助噬菌体对大肠杆菌宿主的感染而激活(31)。辅助噬菌体VCS-M13d3是gIII缺失突变体(44),其被使用,允许靶标蛋白质的多价展示。gIII蛋白质的所有拷贝(3-5个拷贝)将是与靶蛋白质aspRS-OB的融合物。多价展示被用于在结合测定中增加敏感性(48)。
将含有用于aspRS-OB的基因的构建体pRPSP2转化进大肠杆菌TG1细胞。通过Vd3辅助噬菌体来感染得到的培养物,产生转导颗粒(TDP)。收获这些重组噬菌体,使用位于aspRS-OB和pIII之间的c-myc抗原序列的抗体,通过western分析,针对靶标蛋白质的展示来对所述重组噬菌体加以测试(见下文中的图)。这表明针对融合蛋白质pIII-aspRS-OB的具有预计大小的强信号。
为测试展示的野生型OB-折叠在噬菌体表面是否仍然具有功能性,对被固定的asp-tRNA与展示aspRS-OB的该噬菌体样品进行噬菌体结合实验。将展示aspRS-OB的TDP样品与固定到磁珠上的asp-tRNA一起孵育。未结合的噬菌体被洗去,使用RNaseA通过tRNA消化来洗脱结合的噬菌体。然后通过细菌感染来对洗脱的噬菌体加以计数,将该数量与从仅与珠子一起孵育的样品上洗脱下来的数量加以比较。为表明结合的特异性,向TDP样品中加入>1000倍过量的VCS-M13wt,对洗脱的颗粒的数量进行计数。对每份样品来计算从tRNA洗脱的噬菌体与输入的噬菌体的比例。输入和结果被概括于下表中。
表6
较之仅噬菌体的情况(5.7×10-4,见图8),展示aspRS-OB的噬菌体(2.4×10-2)的回收是大约200倍高。这表明了展示的aspRS-OB与固定的asp-tRNA之间的显著亲和性。在没有展示的蛋白质的VCS-M13的情况下,从仅珠子的情况洗脱的颗粒较之从被固定的tRNA洗脱的颗粒的比例非常接近(1:1.42),这表明噬菌体是非特异性结合的。对于展示aspRS-OB的颗粒而言,该比例要高得多(1:190.48),这表明了该结构域对asp-tRNA的结合特异性。这些结果表明,aspRS-OB在噬菌体表面展示时功能上是完整的。
实施例8:文库选择
在asp-tRNA上的选择
在细菌aspRS反密码子结合结构域中β片层4和5之间的的环区域对于与tRNA的结合以及对反密码子中碱基的特异性识别来说是重要的(49)。因此asp-tRNA被认为是用于测试aspRS-OB文库有效能力的好的靶标。使用文库aspRS-OB RL,因为其含有对理论多样性的全部覆盖,因此含有预计于tRNA靶标良好结合的野生型aspRS-OB折叠序列的拷贝。即使没有突变体与tRNA结合,至少应当通过生物淘选过程选出野生型。像以前那样产生aspRS-OB RL基因文库,将其克隆进pRPSP2,产生~107个克隆,在噬菌体上单价展示。四轮淘选之后,观察到显著的富集,这由输出噬菌体对输入噬菌体的比例表示——这表明了靶特异性结合结构域的富集(图9)。从选择的级分中随机捡出克隆并对其进行测序。序列显示了用于与asp-tRNA结合的、环区域中4个氨基酸的共有序列R/K G C R(图10)。在12条序列克隆中,5条完全满足该共有序列,剩下7条中有3条符合4个氨基酸位置中的3个。所述共有序列与野生型序列(IAKS)显著不同,这表明,新的共有序列较之野生型结构域而言更强地结合asp-tRNA。这在使用单克隆噬菌体制备物的噬菌体结合实验中得到了验证,其中,两个克隆比野生型aspRS-OB对asp-tRNA的亲和性更高(图16)。对该实验而言,将展示相应的突变体结构域的噬菌体与固定的asp-tRNA一起孵育。结合的噬菌体被RNaseA特异性洗脱并被计数。回收率R被计算为[(输出/输入)B/(输出/输入)RNA],其中(输出/输入)表示回收的噬菌体(输出)除以输入噬菌体的数量的比例,下标“B”代表仅珠子的情况,下标“RNA”代表被固定的asp-tRNA的情况。结果表明我们已经从源于aspRS-OB突变体的噬菌体文库富集了对被固定的asp-tRNA的结合亲和性增强的共有序列(图10和11)。
以同样的方式,使用更大的文库“13mRL”(其较之“RL”具有大得多的多样性),针对被固定的tRNA来进行选择。富集模式示于图9中,这表明了5轮淘选之后的显著富集。序列分析被概括于图12中。选出的序列含有高比例的带正电荷氨基酸,这表明这些突变体是通过与带负电荷的asp-tRNA主链结合而被选出的。具有最大碱基数量的突变体(D07)被发现了三次,这表明了在选出的克隆库中的高丰度。在从选出的克隆D07和D09制备的被固定的asp-tRNA单克隆噬菌体样品上进行的噬菌体结合实验表明,以比野生型aspRS-OB结构域高数倍的数量回收了这些克隆,这表明了被展示的突变体与asp-tRNA的更强的结合。这些噬菌体结合实验并非精确测量,但是这表明了成功的选择过程,并且显示:aspRS-OB文库可用于使用噬菌体展示针对被固定的靶标来进行选择。图12中选出的克隆的完整序列列于附件II中,它们被命名为U1、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、S68、S81、pMB16、pMB17、pMB12、pMB18、pMB15、D05、D07、D09、D04、L14、L8、L4、L16、L34、L42、L6、L5或L44。
实施例9:在溶菌酶上的选择
溶菌酶被选用为靶标,用于表明从幼稚()文库选择与另一蛋白质结合的OB-折叠突变体结构域的原则验证。雌鸟卵白溶菌酶是小且稳定的蛋白质,其可商业获得,并且具有多种医学上重要的人同源物。在被固定的溶菌酶上进行四轮淘选之后,观察到结合的噬菌体的富集。再进行两轮淘选,之后随机捡出克隆,针对与溶菌酶的结合对其加以筛选。然后制备单克隆噬菌体样品,并且进行研究以在“微淘选”方案中表征在96孔ELISA板上固定的溶菌酶上的结合。对结合的噬菌体加以洗脱和计数。22个克隆中有9个表现出了超过pIII、OB野生型和BSA的背景的回收数(克隆L4、L5、L6、L8、L14、L15、L16、L18、L21,图13)。对这些克隆加以测序。这些克隆中有一些的序列是相同的(L14和L15;L4和L18;L18和L21),这将独特克隆的数量缩小到六条。这种冗余性表明:由于富集导致样品中具有相同序列的克隆比例高。再进行两轮淘选,对再6个克隆加以测序(L32、L33、L34、L42、L43、L44)。三条序列与以前的克隆的序列匹配(L32=L14=L15,L33=L8=L21=L43),而L44与L5在β片层区域相同,但是在环区域却显示出不同的模式。L34和L42是新的序列。可假设6轮之后选出的库中的克隆数量非常小,并且被图12的图E中显示的9条序列很大程度上覆盖。使用多价展示,以ELISA手段对克隆L14(L32、L15)、L8(L33、L21、L43)、L34、L4、L5和L6进行结合研究(图14)。结果显示,所有克隆与溶菌酶结合,而没有展示的aspRS-OB的颗粒则不(pIII)。其它阴性对照包括野生型aspRS-OB(OBwt)。所有被分析的克隆都以比RNaseA或BSA更高的数量(在ELISA实验中是较高的OD值)与溶菌酶结合,这表明了与溶菌酶结合的特异性。如图11所示,克隆L6和L33不结合tRNA。
实施例10:对经纯化突变体的表达和分析
将克隆L4(L18)、L5、L6、L16和L33(L21)亚克隆进表达载体,并作为GST融合蛋白质表达,用于在“下拉”测定中针对溶菌酶结合加以分析。如图15A-15B所示,被固定的突变体结合溶菌酶,而未选出的突变的13mRL81则不结合。这验证了选出的突变体与溶菌酶的结合。在存在不同缓冲液的情况下,研究L6与溶菌酶的结合。图15B显示,在用500mM NaCl洗涤之后,L6与溶菌酶结合。克隆L6表达并被纯化,使用表面等离振子共振(柏克公司(Biacore))来分析其在被固定的溶菌酶上的结合动力学。结合常数被计算为3.6×10-5M(图16)。
这些实验表明了含有随机化的密码子的大的合成的OB-折叠结构域文库的产生,并且表明,来自这些文库的经转录的突变体蛋白质是稳定的和折叠的。OB-折叠结构域的功能性展示在噬菌体表面上显示,由此允许针对选用的不同功能对文库进行有效筛选。表明了使用噬菌体展示从OB-折叠文库来选择经修饰的OB-折叠结构域。这些变体必须具有想要的性质,它们因为结合相互作用或酶活性被选出。如本文所表明的,来自耐超高温热棒菌的天冬氨酸tRNA合成酶(AspRS)的tRNA反密码子结合结构域被选用为OB-折叠支架,以表明OB-折叠用作为多样性载体的可应用性。结果表明,可通过应用本文公开的方法将该tRNA反密码子结合结构域转化为特异性的蛋白质结合分子。
引入蛋白质构架的每种突变可能能影响其折叠并且由此影响到其稳定性和溶解性。为理解蛋白质构架中对突变的耐受性,产生含有经突变区域的不同组或组合的文库,并且针对随机捡出的突变体的表达和溶解性对其加以筛选。计划并产生具有无限制多样性的文库。此类幼稚文库含有随机化导致的突变的所有可能组合。预计大量突变是无法被耐受的,这是因为在分子特定区域中不利的氨基酸组合导致的稳定性、折叠或溶解性的理由造成的。产生源于aspRS-OB的文库,其中在结合面中含有17个随机氨基酸位置,在β片层(β链1-3)上含有13个,在链4和5之间的环中含有4个。产生了这样的文库,其包含仅显示各β链或环区域的突变的组。
在针对表达和溶解性对经修饰的OB-折叠结构域的文库加以筛选之后,发现,在aspRS-OB的17-突变文库中,所有突变体中的~16%过表达并且可溶,并且通过NMR和CD谱所表明的,一些选出的突变体被证明是正确折叠的。这表明,该文库中有显著的一部分可用于针对感兴趣的靶标进行选择。AspRS-OB文库13mRL和RL作为噬菌体展示文库被构建。13mRL的实际多样性为~8×107个不同的克隆,这代表了17个随机位置的~5×1022种可能组合(理论多样性)的非常小的一部分。RL的多样性仅为1.6×105(4个随机位置),这预计转化之后被~1×107个克隆完全覆盖。对随机捡出的克隆的测序验证了文库的多样性。
噬菌体展示是最常用的展示技术,其因此是对aspRS-OB支架的展示有利的。没有报道过在噬菌体表面对aspRS反密码子结合结构域的展示,也没有一般性地报道过任何其它OB-折叠结构域的展示。在噬菌体上展示蛋白质需要若干步骤,这可能影响到展示的蛋白质的完整性以及宿主细胞的生长。在细胞质中合成之后,蛋白质在细胞的还原环境中必须要是稳定的,并且应当不受与pIII噬菌体蛋白质融合的影响。然后通过氧化周质环境来靶向融合蛋白质,用于噬菌体装配,之后将整个噬菌体颗粒释放进培养基。对于任何蛋白质而言,这个过程包括在多个阶段与环境的相互作用,并且,在源于反密码子结合结构域的支架的情况下,与宿主核酸的结合也必须要被考虑。对在M13噬菌体上展示的aspRS-OB的检测(通过Western分析)表现出良好的表达。对aspRS-OB文库RL和更大的13mRL的检测(也是通过Western印迹)表明在噬菌体上的低效的多的展示。该观察可解释为在幼稚随机文库中高程度的不稳定突变体。这些数据表明对大肠杆菌胞质和周质中不利突变体的蛋白水解降解,这种效果在以前对来自A蛋白的Z-结构域的研究中也被观察到(50)。这还与来自表达和溶解性筛选的结果相关。在其它支架(碳水化合物结合结构域,(51);纤维素结合结构域,(52))中观察到了噬菌体展示文库的较弱信号。对其它文库的文库设计需考虑该因素,以增加展示的融合与降解的比例。这是幼稚随机文库的通常问题,而不是仅在OB-折叠中观察到的现象。
在asp-tRNA上的选择
在天然靶标asp-tRNA上的噬菌体结合和选择实验表明在M13噬菌体上对asp-OB和源自其的文库的成功的功能性展示。从小的RL文库获得了共有序列,其代表比野生型具有更高亲和性的突变体,如在单克隆淘选实验中所显示的。得到的共有序列R/K G C R与野生型序列不同,其含有2个带正电荷的氨基酸,表示了与带负电荷的RNA主链的结合。该环区域中甘氨酸的存在可确保了环的柔性,但半胱氨酸的功能尚不清楚。
未被选出的克隆的序列表现了aspRS-OB RL文库的多样性,来自选择后与共有序列匹配的克隆的序列表现了相应DNA密码子的变化,这表明是对表型的选择而非对基因型的选择。由于对多样性文库13mRL的非常有限的覆盖,不能从少量的在asp-tRNA上选出的克隆序列获得共有序列。这是意料之中的,因为实际多样性为大约108个克隆,而理论多样性为大约1022。因此,噬菌体文库的多样性覆盖仅是理论可能的极小部分。在所有被测序的克隆中都观察到了显著量的带正电荷残基(D07中9个,D05中5个,D09中6个),这表明通过与带负电荷的RNA主链的结合来针对带正电荷的残基进行的选择。两个突变体(D07、D04)中存在的基序R X G S表明环在tRNA结合中的重要作用,如对野生型aspRS-OB来说情况是这样。与单克隆噬菌体样品进行的结合实验显示了与asp-tRNA的更强的结合(较之野生型结构域而言)。这支持了下述结论:在与被固定的靶标结合的情况下,选择存在并表明,我们的OB-折叠支架非常适合在噬菌体上展示以及生物淘选过程。
在溶菌酶上的选择
在雌鸟卵溶菌酶选择13mRL文库。数轮淘选之后,分离出多个克隆,针对序列以及针对与靶标分子的结合对它们加以分析。在预筛选中,22个克隆中有6个在噬菌体ELISA实验中最终表现出可被检测到的与溶菌酶的结合。对14个克隆的序列的检查揭示,两条被检测了两次,一条甚至被检测了四次。这表明选用的部分中不同克隆的数量相当地小。9个不同克隆的序列指示出它们组成中的相似性。一些位置显示了一些令人感兴趣的相似性,例如,位置29,其在9个克隆的6个中都是酸性残基(D或E),而位置31在9条序列中的5条中都是缬氨酸,在位置35中有4个克隆中都出现了带正电荷的残基,而位置38在5种情况下都是芳香族残基(Y、F、W),最后,位置85在5个克隆中都是甘氨酸。此外,在β链3中,克隆L16和克隆L34中存在显而易见的ETET和PETE模式,在β链1中,L32、L2、L6、L5、L44中存在D V/LA/L。还注意到了L5和L44在β片层中形同,而环区域不同。除了L6之外,其它所有突变体都没有半胱氨酸。但是,没有获得更为明显的共有序列,这可能是由于对非常大的文库的覆盖较窄并且获得的序列数量很小。若干克隆被表达,并作为GST融合蛋白质被纯化,通过下拉实验对它们进行了分析,表明克隆与溶菌酶的结合。克隆L6甚至在存在500mM氯化钠时结合,这表明了相当的结合亲和性。克隆L6被表达并被纯化,通过表面等离振子共振,分析了其结合的动力学和热力学,显示出~3.6×10-5M的Kd。考虑到该幼稚文库的较小尺寸和组成,结合常数在μM的范围是非常显著的结果,其为通过亲和成熟流程来进行优化提供了优秀的起点。
实施例11:在与溶菌酶的复合体中OBody L8的三维结构
使用Gateway(英杰生命科学公司(Invitrogen))将L8克隆进pDONR221,然后将其亚克隆进表达载体pDEST15,所述pDEST15被转化进BL21(DE3)大肠杆菌细胞。这些细胞被接种进500mL自-诱导培养基,并且在2L带挡板的瓶中于37℃振荡。使用GSG亲和柱(GE生物科学公司(GE Biosciences))从细菌裂解物纯化出融合蛋白质GST-L8。使用rTEV蛋白酶除去GST标签,并通过大小排阻层析(S75 16/60,制备级,GE生物科学公司(GE Biosciences))将其与L8分开。然后再次通过大小排阻(S75 10/300,分析级,GE生物科学公司(GE Biosciences)),对L8进行第三次纯化,以改善在溶液中的单分散性。
将经纯化的蛋白质与原鸡(Gallus gallus)卵白溶菌酶(罗切公司(Roche))以大约1:1的摩尔比在TBS(25mM TRIS,pH7.5,137mMNaCl,3mM KCl)中组合,至L8的终浓度为37.5mg/mL,溶菌酶的终浓度为42.9mg/mL。使用定制筛选和沉滴(sitting drop)形式,针对480结晶条件来筛选溶液中的复合物。
单个大晶体从沉淀剂(7% MPEG 5K,0.2M HEPES pH7.8)和TBS中蛋白质的等混合物中生长出来。然后在尼龙环中收集该晶体,将其包被上cyro保护剂(cyroprotectant),在冷的N2气流(110K)下冷冻。使用旋转阳极X-射线发生器和给出2.8衍射的Mar345检测器,收集700张图像的数据组。使用DENZO来对图像加以索引,使用Scalepack来衡量数据。关于数据收集统计,参见表。使用分子置换(AMoRe)来解答结构,所述分子置换中包括溶菌酶(PDB进入号193L)和来自Pyrococcuskodakarensis天冬氨酰tRNA合酶(PDB进入号1B8A)的OB-折叠密码子识别结构域二者作为模型。在非对称单元中发现了两个溶菌酶分子以及一个OB-折叠结构域。基于第二个溶菌酶分子的位置,在非对称单元中复制复合体,从而放置第二个OB-折叠。使用COOT、CCP4和PHENIX将结构迭代建立并且精修。使用相同的晶体在SSRL收集第二数据集,至2.69分辨率。在同样的空间组中对其加以索引,使用来自前一结构的完整晶胞,通过分子置换来定相。使用COOT、CCP4和PHENIX来进行建立和精修。
表7.对于与溶菌酶的复合物中L8的X-射线晶体学结构的统计
Home来源的数据 | 同步加速器数据 | |
晶体性质 | ||
空间群 | P41212 | P41212 |
晶胞轴(a,b,c) | 76.585,76.585,166.150 | 76.759,76.759,166.344 |
晶胞角度(α、.β、γ) | 90,90,90 | 90,90,90 |
数据收集 | ||
分辨率 | 50-2.8(2.872-2.8) | 34.85-2.69(2.76-2.69) |
总反射 | 267,952 | 144,772 |
单一反射(uniquereflection) | 12,301 | 16,010 |
完全度 | 95.3(54.75) | 99.15(92.80) |
冗余性 | 21 | 9 |
R合并(Rmerge) | 4.2(59.0) | 7.3(54.3) |
Wilson B因子 | 85 | 65 |
镶嵌性(Mosaicity) | 0.6 | 0.6 |
I/σI | 50.14(1.6) | 32.50(4.22) |
分子置换 | ||
相关系数 | 66.2 | 71.2 |
R | 52.7 | 38.9 |
精修 | ||
分辨率 | 25-2.8(2.872-2.8) | 27.5-2.75(2.82-2.75) |
R | 26.5(35.0) | 22.5(26.5) |
R游离(Rfree) | 34.0(50.7) | 29.6(37.6) |
蛋白质原子 | 3338 | 3384 |
rmsd,键长 | 0.012 | 0.013 |
rmsd,键角 | 1.541 | 1.452 |
B因子,平均 | 66.942 | 51.146 |
表8.与溶菌酶的复合物中L8的蛋白质-蛋白质界面数据
附件I
寡核苷酸,用于PCR扩增来自耐超高温热棒菌的aspRS和IF-5A的野生型OB折叠。
寡聚体 | 5’-3’序列 |
050 | GGT GAC CTA CCA TGG CCC AGG TGG TGT ATC CTA AAA AGA CCC AC |
054 | TAC CCA ACC GGC AAC AAC |
055 | GTT GTT GCC GGT TGG GTA |
056 | CGC GCC CCC CTC CCT ATC |
057 | GAT AGG GAG GGG GGC GCG |
058 | ATC GGG GGT TTT TCC CGC |
059 | GCG GGA AAA ACC CCC GAT |
060 | TTT ACT GGC CTC AAC AAT |
061 | ATT GTT GAG GCC AGT AAA |
062 | GGT GTG GAG ATT TTC CCC |
068 | GAG GGG GGC GCG TTT GTG CAA GTC ACG CTC AAG G |
寡核苷酸,用于基于来自耐超高温热棒菌的aspRS-OB来对文库进行PCR装配。
028 | GGAGATAGCAACGGCGCGGTAATTCAGCTAATGGAC |
029 | CGCGCCGTTGCTATCTCCTGAAACGGAGAGTATTTG |
032 | GTGCCGATGAAATACGTC |
033 | GACGTATTTCATCGGCAC |
034 | CGCGCCGTTGCTATCTCC |
035 | GGAGATAGCAACGGCGCG |
074 | ATCTCCTGAAACGGAGAG |
076 | TAGCTGAATTACCGCGCC |
078 | CTCTCCGTTTCAGGAGA |
089 | GGCGCGGTAATTCAGCTA |
寡核苷酸,用于基于来自耐超高温热棒菌的IF5A-OB来对文库进行PCR装配。
附件II.多种Obody的氨基酸序列。序列编号与图10和图12中编号一致。
命名 | 氨基酸序列 |
U1 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVECLADTGIEKGVLVVDREGGACVRVHLQAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKGYKSGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
U2 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVGALRDLGLGKGVSVFDREGGAVVTVNLLAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKSRVGGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
U3 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVAALGDAGDSKTVTVNDREGGAPVHVQLDAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKYRLKGVEFPSEIWILNKAKPLPID |
U4 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVDPLLDRGLAKGVSVRDREGGASVPVTLLAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKQRYVGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
U5 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVKVLPDGGFCKYVRVEDREGGASVLVALSAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKLGHFGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
U6 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVISLSDRGGTKLVEVIDREGGAAVIVQLLAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKRLVNGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
U7 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVFXLLDXGMGKLVRVPDREGGAPVDVDLPAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKCGGGGGEIFPHEIWILNKGKPLPID |
U8 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVWELRDIGKVKFVVVRDREGFVQVTLKAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKVGALGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
U9 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVWELRDIGKVKFVVVRDREGFVQVTLKAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKGCDCGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
S68 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVRSLVDGGRVKAVNVQDREGGAKVEVLLEAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKGEWSGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
S81 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVKGLVDMGLLKGVTVGDREGGASVLVRLTAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKLVPQGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
pMB16 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVWELRDIGKVKFVVVRDREGFVQVTLKAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKRGCRGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
pMB17 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVWELRDIGKVKFVVVRDREGFVQVTLKAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKKGCRGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
pMB12 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVWELRDIGKVKFVVVRDREGFVQVTLKAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKRGCAGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
pMB18 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVWELRDIGKVKFVVVRDREGFVQVTLKAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKRSCRGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
pMB15 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVWELRDIGKVKFVVVRDREGFVQVTLKAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKLSLVGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
D05 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVQRLYDRGKRKSVSVVDREGGAPVTVCLRAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKWNCGXVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
D07 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVRKLRDRGPAKYVWVRDREGGATVRVRLQAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKRKGSGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
D09 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVWRLRDWGLAKTVRVKDREGGASVRVTLRAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKWWVWGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
D04 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVSCLCDAGKRKWVYVVDREGGAPVAVRLRAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKRAGSGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
L14 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVSDLLDAGRAKYVFVYDREGGAEVMVTLAAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKGWRDGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
L8 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVASLGDYGRVKIVKVSDREGGAAVPVYLEAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKGVGRGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
L4 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVGELADFGDMKTVAVRDREGGAEVPVTLLAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKGSTSGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
L16 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVASLVDGGPRKWVFVRDREGGAEVTVELTAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKGLRWGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
L34 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVVGLMDEGALKGVEVRDREGGAPVEVTLEAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKGYGSGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
L42 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVVDLVDLGRNKLVQVSDREGGARVLVNLAAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKIQRSGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
L6 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVEDLVDAGKTKWVFVCDREGGAQVIVELVAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKSRAVGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
L5 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVTDLVDAGTWKFVQVADREGGANVWVSLVAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKLPSYGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
L44 | VYPKKTHWTAEITPNLHGTEVVVAGWVTDLVDAGTWKFVQVADREGGANVWVSLVAGKTPDHLFKVFAELSREDVVVIKGIVEASKPGAAGVEIFPSEIWILNKAKPLPID |
参考文献
1.Rajewsky,K.1996.Clonal selection and learning in the antibodysystem.Nature 381:751-758.
2.Griffiths,A.D.,S.C.Williams,O.Hartley,I.M.Tomlinson,P.Waterhouse,W.L.Crosby,R.E.Kontermann,P.T.Jones,N.M.Low,T.J.Allison,等人1994.Isolation of high affinityhuman antibodies directlyfrom large synthetic repertoires.EMBO Journal 13:3245-3260.
3.Nissim,A.,H.R.Hoogenboom,I.M.Tomlinson,G.Flynn,C.Midgley,D.Lane和G.Winter.1994.Antibody fragments from a′singlepot′phage display library as immunochemical reagents.EMBO Journal 13:692-698.
4.Atwell,S.,M.Ultsch,A.M.De Vos和J.A.Wells.1997.Structuralplasticity in a remodelled protein-protein interface.Science 278:1125-1128.
5.Ballinger,M.D.,J.T.Jones,J.A.Lofgren,W.J.Fairbrother,R.W.Akita,M.X.Sliwkowski,and J.A.Wells.1998.Selection of heregulinvariants having higher affinity for the erbb3 receptor by monovalent phagedisplay.Journal of Biological Chemistry 273:11675-11684.
6.Gunneriusson,E.,K.Nord,M.Uhlen,和P.A.Nygren.1999.Affinitymaturation of a taq DNA polymerase specific affibody by helix shuffling.Protein Engineering 12:873-878.
7.Nord,K.,J.Nilsson,B.Nilsson,M.Uhlen,和P.A.Nygren.1995.Acombinatorial library of an alpha-helical bacterial receptor domain.Protein Engineering 8:601-608.
8.Binz,H.K.,P.Amstutz,和A.Pluckthun.2005.Engineering novelbinding proteins from nonimmunoglobulin domains.Nature Biotechnology23:1257-1268.
9.Binz,H.K.,和A.Pluckthun.2005.Engineered proteins as specificbinding reagents.Current Opinion in Biotechnology 16:459-469.
10.Hosse,R.J.,A.Rothe,和B.E.Power.2006.A new generation ofprotein display scaffolds for molecu lar recognition.Protein Science 15:14-27.
11.Sidhu,S.S.,H.B.Lowman,B.C.Cunningham,和J.A.Wells.2000.Phage display for selection of novel binding peptides.Methods inEnzymology 328:333-363.
12.Stemmer,W.P.C.1994.DNA shuffling by randomfragmentation and reassembly:In vitro recombination for molecularevolution.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 91:10747-10751.
13.Sidhu,S.S.2000.Phage display for selection of novel bindingpeptides.Methods in Enzymology 328:333-363.
14.Stemmer,W.P.C.1994.Rapid evolution of a protein in vitro byDNA shuffling.Nature 370:389-391.
15.Zhao,H.,和F.H.Arnold.1997.Optimisation of DNA shufflingfor high fidelity recombination.Nucleic Acids Research 25:1307-1308.
16.Zhao,H.,L.Giver,Z.Shao,J.A.Affholter,和F.H.Arnold.1998.Molecular evolution by staggered extension process(step)in vitrorecombination.[见注释].Nature Biotechnology 16:258-261.
17.Volkov,A.A.,和F.H.Arnold.2000.Methods for in vitro DNArecombination and random chimeragenesis.Methods in Enzymology 328:447-456.
18.Coco,W.M.,W.E.Levinson,M.J.Crist,H.J.Hektor,A.Darzins,P.T.Pienkos,C.H.Sq uires,和D.J.Monticello.2001.DNAshuffling method for generating highlyrecombined genes and evolvedenzymes.[see comment].Nature Biotechno-logy 19:354-359.
19.Hemminki,A.,S.Niemi,A.M.Hoffren,L.Hakalahti,H.Soderlund,和K.Takkinen.1998.Specificity improvement of arecombinant anti-testosterone Fab fragment by CDRIII mutagenesis andphage display selection.Protein Engineering 11:311-319.
20.Jermutus,L.,A.Honegger,F.Schwesinger,J.Hanes,和A.Pluckthun.2001.Tailoring in vitro evolution for protein affinity orstability.Proceedings of the National Academy of Scienees of the UnitedStates of America 98:75-80.
21.Hanes,J.,L.Jermutus,和A.Pluckthun.2000.Selecting andevolving functional proteins in vitro by ribosome display.Methods inEnzymology 328:404-430.
22.Boder,E.T.,和K.D.Wittrup.2000.Yeast surface display fordirected evolution of protein expression,affinity and stability.Methods inEnzymology 328:430-445.
23.Altamirano,M.M.,J.M.Blackburn,C.Aguayo,和A.R.Fersht.2000.Directed evolution of a new catalytic activityusing the a/b-barrelscaffold.Nature 403:617-622.
24.Arcus,V.2002.Ob-fold domains:A snapshot of the evolution ofsequence,structure and function.Current Opinion in Structural Biology 12:794-801.
25.Arcus,V.L.,T.Proft,J.A.Sigrell,H.M.Baker,J.D.Fraser,和E.N.Baker.2000.Conservation and variation in superantigen structureand activity highlighted by the three-dimensional structures of two newsuperantigens from streptococcus pyogenes.Journal of Molecular Biology299:157-168.
26.Murzin,A.G.1993.Ob(oligonucleotide/oligosaccharidebinding)-fold:Common structural and functional solution fornon-homologous sequences.EMBO Journal 12:861-867.
27.Qian,J.,B.Stenger,C.A.Wilson,J.Lin,R.Jansen,S.A.Teichmann,J.Park,W.G.Krebs,H.Yu,V.Alexandrov,N.Echols,和M.Gerstein.2001.Partslist:A web-based system for dynamically rankingprotein folds based on disparate attributes,including whole-genomeexpression and interaction information.Nucleic Acids Research 29:1750-1764.
28.Zhang,C.,和S.H.Kim.2000.A comprehensive analysis of thegreek key motifsin protein beta-barrels and beta-sandwiches.Proteins 40:409-419.
29.Murzin,A.G.,A.M.Lesk,和C.Chothia.1994.Principlesdetermining the structure of beta-sheet barrels in proteins.I.A theoreticalanalysis.Journal of Molecular Biology 236:1369-1381.
30.Murzin,A.G.,A.M.Lesk,和C.Chothia.1994.Principlesdetermining the structure of beta-sheet barrels in proteins.Ii.Theobserved structures.Journal of Molecular Biology 236:1382-1400.
31.Beekwilder,J.,J.Rakonj ac,M.Jongsma,和D.Bosch.1999.Aphagemid vector using the e.Coli phage shock promoter facilitates phagedisplay of toxic proteins.Gene 228:23-31.
32.Rakonjac,J.,G.Jovanovic,和P.Model.1997.Filamentousphage infection-mediated gene expression:Construction and propagationof the gIII deletion mutant helper phage R408d3.Gene 198:99-103.
33.Berman,H.M.,J.Westbrook,Z.Feng,G.Gilliland,T.N.Bhat,H.Weissig,I.N.Shindyalov,和P.E.Bourne.2000.The protein data bank.Nucleic Acids Research 28:235-242.
34.Peat,T.S.,J.Newman,G.S.Waldo,J.Berendzen,和T.C.Terwilliger.1998.Structure of translation initiation factor 5A frompyrobaculum aerophilum at 1.75 A resolution.Structure 6:1207-1214.
35.Schmitt,E.,L.Moulinier,S.Fujiwara,T.Imanaka,J.C.Thierry,和D.Moras.1998.Crystal structure of aspartyl-tRNA synthetase frompyrococcus kodakaraensis kod:Archaeon specificity and catalyticmechanism of adenylate formation.EMBO Journal 17:5227-5237.
36.Moulinier,L.,S.Eiler,G.Eriani,J.Gangloff,J.C.Thierry,K.Gabriel,W.H.McClain,和D.Moras.2001.The structure of anAspRS-tRNA(Asp)complex reveals a tRNA-dependent control mechanism.EMBO Journal 20:5290-5301.
37.Rees,B.,G.Webster,M.Delarue,M.Boeglin,和D.Moras.2000.Aspartyl tRNA-synthetase from Escherichia coli:Flexibility andadaptability to the substrates.Journal of Molecular Biology 299:1157-1164.
38.Guex,N.,和M.C.Peitsch.1997.SWISS-MODEL and theSwiss-PdbViewer:An environment for comparative protein modeling.Electrophoresis 18:2714-2723.
39.Peitsch,M.1995.Protein modeling by e-mail.Bio/Technology:658-660.
40.Schwede,T.,J.Kopp,N.Guex,和M.C.Peitsch.2003.SWISS-MODEL:An automated protein homology-modeling server.Nucleic Acids Research 31:3381-3385.
41.Sambrook,J.,和D.W.Russel.(2001)Molecular cloning alaboratory manual,3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork
42.Fitz-Gibbon,S.T.,H.Ladner,U.J.Kim,K.O.Stetter,M.I.Simon,和J.H.Miller.2002.Genome sequence of the hyperthermophiliccrenarchaeon pyrobaculum aerophilum.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 99:984-989.
43.Bullock,W.O.,J.M.Fernandez,和J.M.Short.1987.Xl1-blue-a high-efficiency plasmid transforming recA Escherichia-coli strain withbeta-galactosidase selection.Biotechniques 5:376-&.
44.Rakonjac,J.,J.Feng,和P.Model.1999.Filamentous phage arereleased from the bacterial membrane by a two-step mechanism involvinga short C-terminal fragment of pIII.Journal of Molecular Biology 289:1253-1265.
45.Barbas III,C.,D.Burton,J.Scott,和G.Silverman.(2001)Phage display a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York
46.Gough,J.,K.Karplus,R.Hughey,和C.Chothia.2001.Assignment of homology to genome sequences using a library of hiddenMarkov models that represent all proteins of known structure.Journal ofMolecular Biology 313:903-919.
47.Bogden,C.E.,D.Fass,N.Bergman,M.D.Nichols,和J.M.Berger.1999.The structural basis for terminator recognition by the Rhotranscription termination factor.Mo lecular Cell 3:487-493.
48.Hoogenboom,H.R.,A.P.de Bruine,S.E.Hufton,R.M.Hoet,J.W.Arends,和R.C.Roovers.1998.Antibody phage display technologyand its applications.Immunotechnology 4:1-20.
49.Brevet,A.,J.Chen,S.Commans,C.Lazennec,S.Blanquet,和P.Plateau.2003.Anticodon recognition in evolution-switching tRNAspecificity of an aminoacyl-tRNA synthetase by site-directed peptidetransplantation.Journal of Biological Chemistry 278:30927-30935.
50.Wahlberg,E.,C.Lendel,M.Helgstrand,P.Allard,V.Dincbas-Renqvist,A.Hedqvist,H.Berglund,P.A.Nygren,和T.Hard.2003.An affibody in complex with a target protein:Structure and coupledfolding.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnitedStates of America 100:3185-3190.
51.Gunnarsson,L.C.,E.N.Karlsson,A.S.Albrekt,M.Andersson,O.Holst,和M.Ohlin.2004.A carbohydrate binding module as adiversity-carrying scaffold.Protein Engineering Design & Selection 17:213-221.
52.Berdichevsky,Y.,E.Ben-Zeev,R.Lamed,和I.Benhar.1999.Phage display of a cellulose binding domain from Clostridiumthermocellum and its application as a tool for antibody engineering.Journal of Immunological Methods 228:151-162.
序列表
<110>奥克兰联合服务有限公司(Auckland Uniservices Ltd)
<120>OB折叠结构域
<130>James & Wells Ref;128161/49
<140>US No.60/809105
<141>2006-05-26
<160>63
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)
<400>1
<210>2
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>2
<210>3
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>3
<210>4
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>4
<210>5
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>5
<210>6
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>6
<210>7
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(29)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(33)..(33)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>7
<210>8
<211>109
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>8
<210>9
<211>109
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>9
<210>10
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>10
<210>11
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>11
<210>12
<211>109
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>12
<210>13
<211>109
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>13
<210>14
<211>109
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>14
<210>15
<211>109
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>15
<210>16
<211>109
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>16
<210>17
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(91)..(91)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>17
<210>18
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>18
<210>19
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>19
<210>20
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>20
<210>21
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>21
<210>22
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>22
<210>23
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>23
<210>24
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>24
<210>25
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>25
<210>26
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>26
<210>27
<2114>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>27
<210>28
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>28
<210>29
<211>111
<212>PRT
<213>耐超高温热棒菌
<400>29
<210>30
<211>31
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>30
<210>31
<211>33
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>31
<210>32
<211>31
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>32
<210>33
<211>33
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>33
<210>34
<211>44
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>34
<210>35
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>35
<210>36
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>36
<210>37
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>37
<210>38
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>38
<210>39
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>39
<210>40
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>40
<210>41
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>41
<210>42
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>42
<210>43
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>43
<210>44
<211>34
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>44
<210>45
<211>36
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>45
<210>46
<211>36
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>46
<210>47
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>47
<210>48
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>48
<210>49
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>49
<210>50
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>50
<210>51
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>51
<210>52
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>52
<210>53
<211>17
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>53
<210>54
<211>18
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<400>54
<2140>55
<211>78
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(17)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(20)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(26)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(31)..(32)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(37)..(38)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(41)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<2211>misc_feature
<222>(46)..(47)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(52)..(53)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(58)..(59)
<223>n是a、c、g或t
<400>55
<210>56
<211>57
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(21)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(26)..(27)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(33)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(38)..(39)
<223>n是a、c、g或t
<400>56
<210>57
<211>48
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(20)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(23)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(26)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(28)..(29)
<223>n是a、c、g或t
<400>57
<210>58
<211>75
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(21)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(26)..(27)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(33)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(41)..(42)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(48)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(50)..(51)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(56)..(57)
<223>n是a、c、g或t
<400>58
<210>59
<211>45
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(20)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(26)
<223>n是a、c、g或t
<400>59
<210>60
<211>54
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(20)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(26)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(28)..(29)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(35)
<223>n是a、c、g或t
<400>60
<210>61
<211>75
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(18)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(24)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(30)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(38)..(39)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(44)..(45)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(50)..(51)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(56)..(57)
<223>n是a、c、g或t
<400>61
<210>62
<211>42
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(20)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(23)
<223>n是a、c、g或t
<400>62
<210>63
<211>42
<212>DNA
<213>耐超高温热棒菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(20)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(23)
<223>n是a、c、g或t
<400>63
Claims (23)
1.经分离的经修饰的OB-折叠结构域,其可从天然存在的OB-折叠结构域获得,其中所述经修饰的OB-折叠结构域包含:
a)较之所述天然存在的OB-折叠结构域而言,在所述OB-折叠结构域结合面的β-链中的至少一个经修饰的氨基酸残基,或
b)在所述OB-折叠结构域结合面的β-链中的至少一个经修饰的氨基酸残基和在所述OB-折叠结构域环区域的链中的至少一个经修饰的氨基酸残基,或
c)在所述OB-折叠结构域环区域的链中的至少一个经修饰的氨基酸残基,
并且,其中,所述经修饰的OB-折叠结构域较之所述天然存在的OB-折叠结构域而言具有改变的结合特性。
2.权利要求1的经修饰的OB-折叠结构域,其中所述结构域特异性地与较所述天然存在的OB-折叠结构域不同的结合伴侣结合,或者与其天然存在的结合伴侣具有经修饰的结合。
3.权利要求1或权利要求2的经修饰的OB-折叠结构域,其中,所述天然存在的OB-折叠结构域存在于蛋白质或蛋白质类中,其选自葡萄球菌核酸酶蛋白质、细菌肠毒素、TIMP样蛋白质、血红素分子伴侣CcmE蛋白质、尾部-相关溶菌酶gp5、N末端结构域蛋白质、核酸结合蛋白质、无机焦磷酸酶、Mop样蛋白质、CheW样蛋白质、tRNA_抗(OB-折叠核酸结合结构域)、Telo_结合(端粒-结合蛋白α亚基,中央结构域)、SSB(单链结合蛋白质家族OB-折叠结构域)、DUF338 OB-折叠结构域;DNA-连接酶_aben(NAD依赖性DNA连接酶OB-折叠结构域)、Stap-Strp-毒素(葡萄球菌/链球菌毒素、OB-折叠结构域)、EIF-5a(真核起始因子5A羟丁赖氨酸,DNA结合OB-折叠结构域)、GP5_OB(GP5N末端OB-折叠结构域)、CSD、DNA_连接酶_OB、DUF388、EFP、eIF-1a、mRNA_cap_C、OB_RNB、噬菌体_DNA_结合、Rep-A_N、Rho_RNA结合、核糖体_L2、核糖体_S12;核糖体_S17、RNA_pol_Rpb8、RuvA_N、S1、TOBE、TOBE_2和tRNA_结合。
4.权利要求1或权利要求2的经修饰的OB-折叠结构域,其中所述天然存在的OB-折叠结构域来自嗜热生物。
5.权利要求4的经修饰的OB-折叠结构域,其中所述嗜热生物是耐超高温热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)。
6.权利要求1-5中任意一项的经修饰的OB-折叠结构域,其中所述经修饰的氨基酸残基在折叠相关结合面的β-链中。
7.权利要求1-6中任意一项的经修饰的OB-折叠结构域,其中所述经修饰的OB-折叠结构域的结合伴侣选自核酸、寡糖、蛋白质、激素和小有机分子。
8.获得权利要求1-7中任意一项的经修饰的OB-折叠结构域的方法,其包括:
a)获得编码天然存在的OB-折叠结构域或者编码包含结合面的链和/或环的链的其部分的核酸,以及
b)改变所述核酸,使得其编码:较之所述天然存在的OB-折叠结构域而言,在结合面的β-链上的至少一个经修饰的氨基酸残基和/或在环的链上的至少一个经修饰的氨基酸残基,其中,获得经修饰的OB-折叠结构域,并且,其中,所述经修饰的OB-折叠结构域较之所述天然存在的OB-折叠结构域,具有改变的结合。
9.权利要求8的方法,其还包括:改变编码所述经修饰的OB-折叠结构域的核酸,和/或改变编码下述蛋白质的至少一个氨基酸的核酸,所述蛋白质包含所述经修饰的OB-折叠结构域。
10.产生用于展示的经修饰的OB-折叠结构域蛋白质的文库的方法,所述方法包括:
a)获得编码OB-折叠结构域或其部分的核酸,以及
b)对所述核酸进行随机改变,由此产生编码经修饰的OB-折叠结构域的经改变的核酸的集合,所述经修饰的OB-折叠结构域具有至少一个随机化的氨基酸残基。
11.权利要求10的方法,其中所述核酸编码所述OB-折叠结构域结合面的链和/或OB-折叠结构域环的链的至少一个氨基酸残基。
12.权利要求10或权利要求11的方法,其还包括:将编码经修饰的OB-折叠结构域的经改变的核酸的文库放进能在其表面展示所述经修饰的OB-折叠结构域的宿主细胞群中。
13.经分离的核酸,其编码权利要求1-7中任意一项的经修饰的OB-折叠结构域。
14.宿主细胞,其包含编码权利要求1-7中任意一项的经修饰的OB-折叠结构域的核酸。
15.噬菌体,其包含编码权利要求1-7中任意一项的经修饰的OB-折叠结构域的核酸。
16.组合物,其包含编码权利要求1-7中任意一项的经修饰的OB-折叠结构域的核酸。
17.针对与结合伴侣的结合对经修饰OB-折叠结构域的文库加以筛选的方法,所述方法包括:
a)获得在其表面展示经修饰的OB-折叠结构域的文库的宿主细胞或病毒颗粒的群;
b)将所述宿主细胞或病毒颗粒的群与所述结合伴侣在适于所述结合伴侣与所述经修饰的OB-折叠结构域结合的条件下接触;以及
c)确定所述结合伴侣与所述经修饰的OB-折叠结构域的结合。
18.权利要求17的方法,其中所述宿主细胞或病毒颗粒是在其表面展示经修饰的OB-折叠结构域的噬菌体。
19.权利要求1-7中任意一项的经修饰的OB-折叠结构域的噬菌体文库,其中,所述经修饰的OB-折叠结构域可从耐超高温热棒菌获得。
20.在细胞或病毒颗粒表面展示的权利要求1-7中任意一项的经修饰的OB-折叠结构域。
21.权利要求20的经修饰的OB-折叠结构域,其中所述细胞或病毒颗粒是噬菌体、细菌或酵母。
23.与固体支持物相连的权利要求1-7中任意一项的经修饰的OB-折叠结构域。
24.权利要求23的经修饰的OB-折叠结构域,其中所述支持物选自珠子、玻璃、玻片、芯片和明胶。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US80910506P | 2006-05-26 | 2006-05-26 | |
US60/809,105 | 2006-05-26 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101506227A true CN101506227A (zh) | 2009-08-12 |
Family
ID=38778843
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2007800281075A Pending CN101506227A (zh) | 2006-05-26 | 2007-05-25 | Ob折叠结构域 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9181543B2 (zh) |
EP (1) | EP2029620B1 (zh) |
JP (1) | JP2009539346A (zh) |
CN (1) | CN101506227A (zh) |
AU (1) | AU2007268364B8 (zh) |
CA (1) | CA2653752A1 (zh) |
IL (1) | IL195494A (zh) |
NZ (1) | NZ573407A (zh) |
WO (1) | WO2007139397A1 (zh) |
ZA (1) | ZA200810836B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103145812A (zh) * | 2006-12-04 | 2013-06-12 | 巴斯德研究院 | Ob-fold作为支架用于工程化新的特异性结合物 |
CN105338995A (zh) * | 2013-04-22 | 2016-02-17 | 艾菲洛吉克公司 | 包含pli-ob变体的局部组合物 |
Families Citing this family (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2013200275B2 (en) * | 2006-12-04 | 2014-08-14 | Centre National De La Recherche Scientifique | OB-fold used as scaffold for engineering new specific binders |
EP2403864B1 (en) | 2009-02-27 | 2015-08-12 | Atyr Pharma, Inc. | Polypeptide structural motifs associated with cell signaling activity |
ES2638779T3 (es) | 2009-03-16 | 2017-10-24 | Pangu Biopharma Limited | Composiciones y procedimientos que comprenden variantes de splicing de histidil-tarn sintetasa que tienen actividades biológicas no canónicas |
US20100310576A1 (en) | 2009-03-31 | 2010-12-09 | Adams Ryan A | COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING ASPARTYL-tRNA SYNTHETASES HAVING NON-CANONICAL BIOLOGICAL ACTIVITIES |
WO2011072266A2 (en) * | 2009-12-11 | 2011-06-16 | Atyr Pharma, Inc. | Aminoacyl trna synthetases for modulating hematopoiesis |
WO2011072265A1 (en) | 2009-12-11 | 2011-06-16 | Atyr Pharma, Inc. | Aminoacyl trna synthetases for modulating inflammation |
US8828395B2 (en) | 2009-12-11 | 2014-09-09 | Atyr Pharma, Inc. | Antibodies that bind tyrosyl-tRNA synthetases |
US8980253B2 (en) | 2010-04-26 | 2015-03-17 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of cysteinyl-tRNA synthetase |
CA2797362C (en) | 2010-04-27 | 2020-12-08 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of isoleucyl trna synthetases |
CN108165537A (zh) | 2010-04-27 | 2018-06-15 | Atyr医药公司 | 与苏氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现 |
EP2563911B1 (en) | 2010-04-28 | 2021-07-21 | aTyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of alanyl trna synthetases |
EP2563912B1 (en) | 2010-04-29 | 2018-09-05 | aTyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of asparaginyl trna synthetases |
CA2797393C (en) | 2010-04-29 | 2020-03-10 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of valyl trna synthetases |
JP5976638B2 (ja) | 2010-05-03 | 2016-08-23 | エータイアー ファーマ, インコーポレイテッド | アルギニルtRNA合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見 |
AU2011248357B2 (en) | 2010-05-03 | 2017-02-23 | Pangu Biopharma Limited | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of seryl-tRNA synthetases |
US9034321B2 (en) | 2010-05-03 | 2015-05-19 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-alpha-tRNA synthetases |
JP6008841B2 (ja) | 2010-05-03 | 2016-10-19 | エータイアー ファーマ, インコーポレイテッド | メチオニルtRNA合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見 |
CA2798139C (en) | 2010-05-04 | 2019-09-24 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of p38 multi-trna synthetase complex |
CA2798301C (en) | 2010-05-04 | 2020-09-15 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glutamyl-prolyl-trna synthetases |
CN103200953B (zh) | 2010-05-14 | 2017-02-15 | Atyr 医药公司 | 与苯丙氨酰‑β‑tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现 |
WO2011146410A2 (en) | 2010-05-17 | 2011-11-24 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of leucyl-trna synthetases |
EP2575856B1 (en) | 2010-05-27 | 2017-08-16 | aTyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glutaminyl-trna synthetases |
CA2800281C (en) | 2010-06-01 | 2021-01-12 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of lysyl-trna synthetases |
CN103118695B (zh) | 2010-07-12 | 2016-08-03 | Atyr医药公司 | 与甘氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的发现 |
US8999321B2 (en) | 2010-07-12 | 2015-04-07 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glycyl-tRNA synthetases |
EP2593124B1 (en) | 2010-07-12 | 2017-04-26 | aTyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of aspartyl-trna synthetases |
KR20180059953A (ko) | 2010-07-12 | 2018-06-05 | 에이티와이알 파마, 인코포레이티드 | 히스티딜trna 합성효소의 단백질 단편에 관련된 치료적, 진단적, 및 항체 조성물의 혁신적 발견 |
US9029506B2 (en) | 2010-08-25 | 2015-05-12 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of tyrosyl-tRNA synthetases |
EP2624857B1 (en) | 2010-10-06 | 2017-08-02 | aTyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of tryptophanyl trna synthetases |
EP2469278A1 (en) * | 2010-12-21 | 2012-06-27 | Institut Pasteur | Reagentless fluorescent biosensors from nanofitins, rational design methods to create reagentless fluorescent biosensors and methods of their use |
US9714419B2 (en) | 2011-08-09 | 2017-07-25 | Atyr Pharma, Inc. | PEGylated tyrosyl-tRNA synthetase polypeptides |
US9816084B2 (en) | 2011-12-06 | 2017-11-14 | Atyr Pharma, Inc. | Aspartyl-tRNA synthetases |
WO2013086228A1 (en) | 2011-12-06 | 2013-06-13 | Atyr Pharma, Inc. | Pegylated aspartyl-trna synthetase polypeptides |
JP6169608B2 (ja) * | 2011-12-29 | 2017-07-26 | エータイアー ファーマ, インコーポレイテッド | アスパルチルtRNAシンテターゼ−Fcコンジュゲート |
MX356107B (es) | 2012-02-16 | 2018-05-15 | Atyr Pharma Inc | Histidil-arnt sintetasas para tratar enfermedades autoinmunes e inflamatorias. |
US9587235B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-07 | Atyr Pharma, Inc. | Histidyl-tRNA synthetase-Fc conjugates |
AU2018256435A1 (en) | 2017-04-20 | 2019-11-07 | Atyr Pharma, Inc. | Compositions and methods for treating lung inflammation |
EP3483180A1 (en) | 2017-11-14 | 2019-05-15 | Affilogic | Multi specific molecules |
EP3632924A1 (en) | 2018-10-07 | 2020-04-08 | Affilogic | Binders for inhibiting formation of multimeric proteins |
EP3878858A1 (en) | 2020-03-11 | 2021-09-15 | Affilogic | Variants of sac7d and their use in cancer therapy |
EP4043481A1 (en) | 2021-02-15 | 2022-08-17 | Affilogic | Compounds and methods for extending half life of biomolecules |
EP4059949A1 (en) | 2021-03-18 | 2022-09-21 | Affilogic | Anti-factor c3 sac7d variants and their medical use for treating complement-mediated disorders |
US20240166692A1 (en) | 2021-03-18 | 2024-05-23 | Affilogic | Anti-factor c3 sac7d variants and their medical use for treating complement-mediated disorders |
EP4190358A1 (en) | 2021-12-05 | 2023-06-07 | Affilogic | Polypeptide as carrier for intestinal barrier crossing |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US145008A (en) * | 1873-11-25 | Improvement in fog-signals | ||
US255548A (en) * | 1882-03-28 | Wardrobe or folding bed | ||
US103055A (en) * | 1870-05-17 | Jacob kinzer | ||
US9530A (en) * | 1853-01-11 | Improvement in porous cells for galvanic batteries | ||
SE9400088D0 (sv) | 1994-01-14 | 1994-01-14 | Kabi Pharmacia Ab | Bacterial receptor structures |
US6740734B1 (en) | 1994-01-14 | 2004-05-25 | Biovitrum Ab | Bacterial receptor structures |
US6818418B1 (en) | 1998-12-10 | 2004-11-16 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
US7115396B2 (en) | 1998-12-10 | 2006-10-03 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
DE19932688B4 (de) | 1999-07-13 | 2009-10-08 | Scil Proteins Gmbh | Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen |
AU2002213251B2 (en) | 2000-10-16 | 2007-06-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
EP1474161A4 (en) | 2002-01-16 | 2005-06-29 | Zyomyx Inc | TRANSGENIC BINDING PROTEINS |
GB0416651D0 (en) | 2004-07-26 | 2004-08-25 | Proteo Target Aps | Polypeptide |
ATE542830T1 (de) | 2006-12-04 | 2012-02-15 | Pasteur Institut | Als gerüst verwendeter ob-fold zur entwicklung neuer spezifischer bindemittel |
-
2007
- 2007-05-25 CN CNA2007800281075A patent/CN101506227A/zh active Pending
- 2007-05-25 EP EP07793950.2A patent/EP2029620B1/en active Active
- 2007-05-25 US US12/302,494 patent/US9181543B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-05-25 NZ NZ573407A patent/NZ573407A/xx not_active IP Right Cessation
- 2007-05-25 CA CA002653752A patent/CA2653752A1/en not_active Abandoned
- 2007-05-25 ZA ZA200810836A patent/ZA200810836B/xx unknown
- 2007-05-25 AU AU2007268364A patent/AU2007268364B8/en not_active Ceased
- 2007-05-25 WO PCT/NZ2007/000125 patent/WO2007139397A1/en active Application Filing
- 2007-05-25 JP JP2009511976A patent/JP2009539346A/ja active Pending
-
2008
- 2008-11-25 IL IL195494A patent/IL195494A/en active IP Right Grant
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103145812A (zh) * | 2006-12-04 | 2013-06-12 | 巴斯德研究院 | Ob-fold作为支架用于工程化新的特异性结合物 |
CN105338995A (zh) * | 2013-04-22 | 2016-02-17 | 艾菲洛吉克公司 | 包含pli-ob变体的局部组合物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2653752A1 (en) | 2007-12-06 |
AU2007268364A1 (en) | 2007-12-06 |
IL195494A (en) | 2014-11-30 |
AU2007268364B8 (en) | 2013-05-16 |
EP2029620A4 (en) | 2010-12-29 |
AU2007268364B2 (en) | 2013-01-17 |
US9181543B2 (en) | 2015-11-10 |
NZ573407A (en) | 2012-09-28 |
JP2009539346A (ja) | 2009-11-19 |
US20100048413A1 (en) | 2010-02-25 |
WO2007139397A1 (en) | 2007-12-06 |
IL195494A0 (en) | 2009-09-01 |
EP2029620B1 (en) | 2016-05-25 |
AU2007268364A8 (en) | 2013-05-16 |
ZA200810836B (en) | 2010-07-28 |
EP2029620A1 (en) | 2009-03-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101506227A (zh) | Ob折叠结构域 | |
Barderas et al. | The 2018 Nobel Prize in Chemistry: phage display of peptides and antibodies | |
CN101652386B (zh) | Ob-fold作为支架用于工程化新的特异性结合物 | |
US10253313B2 (en) | Universal fibronectin type III bottom-side binding domain libraries | |
CN103539851B (zh) | 基于泛素蛋白的人工结合蛋白的生产 | |
Smith et al. | Small binding proteins selected from a combinatorial repertoire of knottins displayed on phage | |
Doolan et al. | Conformation-dependent epitopes recognized by prion protein antibodies probed using mutational scanning and deep sequencing | |
US8592179B2 (en) | Artificial binding proteins based on a modified alpha helical region of ubiquitin | |
CN101970730A (zh) | 通过融合到pⅨ或pⅦ来设计和生成人从头pⅨ噬菌体展示文库,载体、抗体及方法 | |
EP2102239A2 (en) | Improved immunoglobulin libraries | |
Haque et al. | The use of phage display to generate conformation-sensor recombinant antibodies | |
WO2006058226A9 (en) | Modified dimeric streptavidins and uses thereof | |
EP3489396B1 (en) | Molecule library constructed on the basis of backbone structure of microprotein | |
Jiao et al. | Site-saturation mutagenesis library construction and screening for specific broad-spectrum single-domain antibodies against multiple Cry1 toxins | |
Li et al. | Single-chain variable fragment antibody-based ic-ELISA for rapid detection of macrolides in porcine muscle and computational simulation of its interaction mechanism | |
Perween et al. | A rapid novel strategy for screening of antibody phage libraries for production, purification, and functional characterization of amber stop codons containing single‐chain antibody fragments | |
Masuda et al. | The role of interface framework residues in determining antibody VH/VL interaction strength and antigen‐binding affinity | |
Béhar et al. | Whole‐bacterium ribosome display selection for isolation of highly specific anti‐Staphyloccocus aureus Affitins for detection‐and capture‐based biomedical applications | |
Zhang et al. | Construction of scFv phage display library with hapten-specific repertories and characterization of anti-ivermectin fragment isolated from the library | |
Chang et al. | Molecular evolution of cystine-stabilized miniproteins as stable proteinaceous binders | |
Mejias-Gomez et al. | Deep mining of antibody phage-display selections using Oxford Nanopore Technologies and Dual Unique Molecular Identifiers | |
CN110386986A (zh) | 人工改造蛋白质及其构建方法与应用 | |
Tonikian et al. | Selecting and purifying autonomous human variable heavy (VH) domains | |
Lu et al. | The rapid and highly parallel identification of antibodies with defined biological activities by SLISY | |
Ritter | Engineering antimicrobial peptides and enzymes: Realizing opportunities to combat antibiotic resistance through high-throughput, data-driven design and testing |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090812 |