CN101475970A - 一种生产结晶d-核糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生产结晶D－核糖的方法，包括以下步骤：(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在含有淀粉、淀粉水解糖、单糖和二糖混合糖源组成的底物的发酵培养基中，通入空气，进行有氧发酵，然后从发酵产物中收集D－核糖清液；(2)将步骤(1)收集的D－核糖清液采用阳离子树脂和阴离子树脂脱盐处理，然后将脱盐后的溶液浓缩，得到浓糖；(3)将得到的浓糖采用化学法或色谱法分离精制得到结晶D－核糖。本发明的方法，得到的结晶D－核糖白度可达90％以上，HPLC纯度可达到99.5％以上，可以直接用作食品添加剂，也可方便地用于抗病毒、抗肿瘤药物的制备。
Description
技术领域
本发明涉及发酵生产D-核糖的方法，具体涉及微生物发酵法生产D-核糖的方法。
背景技术
D-核糖(D-ribose)是生物体内遗传物质核糖核酸(RNA)及若干辅酶和维生素的组成成分，在生理上是十分重要的物质，目前广泛应用于食品、医药、化妆品和饲料工业等领域。在医药工业，D-核糖一直是维生素B2的重要合成原料，也是合成抗病毒、抗肿瘤核苷类药物的重要原料，其作用日渐突出。另外，近年来还发现D-核糖可以提高体内ATP水平，具有抗疲劳、耐缺氧保健作用。
D-核糖的生产和制备最初是从天然物质中分离，例如用酶法水解核糖核酸后再进一步降解生成D-核糖。此方法收率极低，不适合工业化大生产。
六十年代出现了电解核糖核酸内酯来生产D-核糖，但由于使用了汞电极，造成严重的环境污染。而通过化学转化法，将D-阿拉伯糖、D-葡萄糖酸、D-木糖转化为D-核糖的方法也因工艺复杂、成本高、副产物多等原因而被淘汰。
发酵法生产D-核糖，起源于20世纪70年代，具有原料来源广、反应专一性强、反应条件温和和环境污染小等优点，在国内外受到普遍重视。有许多文献和专利公开了利用微生物发酵生产D-核糖的方法，其中报道生产D-核糖收率较高的有：日本的显野等(JP0203982)用亚硝基胍反复处理出发菌株，筛选到两株菌株RE5、RE13，发酵四天，D-核糖积累到100.3g/L和118.8g/L。邓崇亮等(CN 1122833)在2吨的发酵罐上培养70小时，可以积累D-核糖81.75g/L。
目前国内外D-核糖的专利技术都是以单一的高浓度葡萄糖为碳源底物，残糖高、转化率低、周期较长，难以得到高纯度的结晶D-核糖。以混合糖源为底物发酵合成D-核糖的研究大多停留在摇瓶或小试规模。另外虽然国内外D-核糖的提取精制专利也有许多，但是均没有解决产品质量问题，所提到的工艺得到的产品纯度都难以达到99.5％以上，不能满足用于食品添加剂、医药行业原料的要求。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种生产结晶D-核糖的方法，以克服以上技术存在的上述缺陷。
本发明的生产结晶D-核糖的方法，包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在含有淀粉、淀粉水解糖、单糖和二糖混合糖源组成的底物的发酵培养基中，通入空气，进行有氧发酵，然后从发酵产物中收集D-核糖清液；
所说的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为本领域公知的菌种，在US3970522中已有报道；
发酵培养基的配方为：KH2PO4：1.0～20.0g/L；K2HPO4：1.0～20.0g/L；玉米浆10.0～30.0g/L；酵母粉：1.0～20.0g/L；(NH4)2SO4：1.0～20.0g/L；MnSO4：0～5.0g/L；MgSO4：0～5.0g/L；消泡剂：0.1～10.0g/L；碳酸钙：10.0～30.0g/L；总糖：160.0～240.0g/L；
所说的消泡剂选自聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚(GPE)；
发酵条件：
接种量5.0～10.0％；罐温36.0±1.0℃；通风量：0.2～1.0vvm；罐压：0.02～0.08MPa；培养时间：40～60小时；
所说的接种量指的是所接的种子体积与起始发酵液体积的比值；
所说的通风量指的是所通入的纯净空气体积与发酵液体积的比值；
优选的，发酵液经直接膜处理后得到的D-核糖清液或直接浓缩得到含量为10.0～50.0％的D-核糖溶液；
优选的，从发酵产物中收集D-核糖清液的方法，包括如下步骤：
将发酵液加酸调节pH至2.0～5.0，加热至50～100℃，然后用絮凝法、离心法、板框过滤法或膜过滤法去除发酵液中的菌体和残留固形物，得到D-核糖清液；
所说的絮凝法指的是，在发酵液中加入絮凝剂，如聚丙烯酰胺，然后过滤，收集清液；
所说的酸可以为无机酸如硫酸或盐酸等，也可以为有机酸如草酸或柠檬酸等；
所说的膜过滤所用的膜可以是有机膜或无机膜，可以是超滤膜或微滤膜；
(2)将步骤(1)收集的D-核糖清液采用阳离子树脂和阴离子树脂脱盐处理，然后将脱盐后的溶液浓缩，得到浓糖；
其中，所说的阳离子树脂去除阳离子，阴离子树脂去除阴离子；
经预处理得到的发酵清液可以视情况，加入活性炭进行脱色处理，活性炭的加入重量为发酵清液的0～5.0％，脱色的温度为60～95℃，脱色时间为10～60min；
所说的阳离子树脂可选但不限于牌号为732树脂、711树脂或D113树脂中的一种以上，可采用市售产品，如蚌埠市天星树脂有限责任公司的产品；
所说的阴离子树脂可选但不限于717树脂或331树脂中的一种以上，可采用市售产品，如上海汇珠树脂有限公司的产品；
(3)将得到的浓糖采用化学法或色谱法分离精制得到结晶D-核糖。具体描述如下：
化学法：将得到的浓糖与苯胺反应，并将得到的糖脎分离出来后再进行分解，然后通过减压蒸馏精制得到结晶D-核糖；
反应温度为0～25℃，反应时间为8～16小时，浓糖∶苯胺＝1∶0.5～2.5(重量比)；
色谱法：将得到的浓糖与氯化钠混合后用色谱分离树脂进行分离，收集所需的馏分，经脱盐后再用醇类或酮类试剂结晶得到结晶D-核糖；
浓糖∶氯化钠＝1∶0.1～0.5(重量比)；
所说的醇类试剂优选甲醇或乙醇；
所说的酮类试剂优选丙酮或丁酮。
通过本发明的方法，摇瓶规模的D-核糖的产量可达103.1g/L，45吨大规模生产的D-核糖的产量可达74.3g/L。得到的结晶D-核糖白度可达90％以上，HPLC纯度可达到99.5％以上(HPLC检验方法可采用中国药典2005版方法)，可以直接用作食品添加剂，也可方便地用于抗病毒、抗肿瘤药物的制备。
具体实施方式
实施例1
种子液的制备：
1)取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的冷冻管菌种，接种于一级种子空白斜面(培养基配比：山梨醇5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母膏20.0g/L，K2HPO4 2.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，NaCl 2.0g/L，琼脂20.0g/L，PH自然)，37.0℃培养20～26hr。取一级斜面种子接种于生产空白斜面(培养基配比：葡萄糖0.5g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母膏20.0g/L，K2HPO4 2.0g/L，KH2PO41.0g/L，NaCl 2.0g/L，琼脂20.0g/L，PH自然)，37.0℃培养20～26hr，制得生产斜面种子备用；
2)取上述生产斜面种子，接种于装有200/500mL液体培养基(葡萄糖20.0g/L，酵母膏2.0g/L，K2HPO4 3.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，PH自然)的种子瓶中，37.0℃培养14hr，制得摇瓶种子备用。
3)取上述生产斜面种子，接种于空白茄子瓶(培养基配比同生产斜面种子)，37.0℃培养23hr，制得生产茄子瓶种子备用；
4)取上述8个茄子瓶种子，接种于装有4吨培养基的5吨发酵罐中开始种子罐种子培养，接种量为2L茄子瓶菌悬液种子，培养基配比同摇瓶种子，37.0℃培养14hr，制得种子罐种子备用。
实施例2
混合糖源发酵：
在装有20mL灭好菌的培养基250mL的三角瓶中接入摇瓶种子2.0mL，发酵培养基成分为：葡萄糖120.0g/L，蔗糖100.0g/L，玉米浆26.0g/L，(NH4)2SO4 9.0g/L，K2HPO4 2.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，酵母粉1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，MnSO4 0.5g/L，碳酸钙20.0g/L，PH 7.1。于37.0℃、260r/min回转式摇床培养72hr。发酵结束，用苔黑酚法检测D-核糖含量为103.1g/L，总糖重量转化率为46.86％。
实施例3
混合糖源发酵：
在装有3.5L培养基的7L发酵罐中，接入摇瓶种子200ml，开始发酵。发酵培养基成分为：葡萄糖100.0g/L，蔗糖100.0g/L，玉米浆26.0g/L，(NH4)2SO4 9.0g/L，K2HPO4 2.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，酵母粉1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，MnSO4 0.5g/L，碳酸钙20.0g/L，PH 7.0～7.2，葡萄糖与蔗糖单消，121.0℃消毒20min，其它料121.0℃消毒30min。于37.0℃、通气量0.5vvm、罐压0.04Mpa、搅拌转速500r/min培养58hr，发酵结束用苔黑酚法检测D-核糖含量为91.6g/L，总糖重量转化率为45.8％。
实施例4
混合糖源发酵
在装有20吨培养基的30吨发酵罐中，接入种子罐种子1.5吨，开始发酵。
发酵培养基成分为：葡萄糖100.0g/L，蔗糖70.0g/L，玉米浆26.0g/L，(NH4)2SO4 9.0g/L，K2HPO4 2.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，酵母粉1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，MnSO4 0.5g/L，碳酸钙20.0g/L，PH 7.2，葡萄糖与蔗糖单121.0℃消毒20min，其它料121.0℃消毒30min。于37.0℃、通气量0.5vvm、罐压0.04Mpa搅拌培养50hr，用苔黑酚法检测D-核糖含量为72.5g/L，D-核糖总量为1450.0kg，总糖重量转化率为42.65％。
实施例5
混合糖源发酵
在装有20吨培养基的30吨发酵罐中，接入种子罐种子1.5吨，开始发酵。
发酵培养基成分为：葡萄糖100.0g/L，蔗糖90.0g/L，培养基的其它组成、消毒条件及培养条件同实施例4，培养52hr发酵结束，用苔黑酚法检测D-核糖含量为83.1g/L，D-核糖总量为1662.0kg，总糖重量转化率为43.73％。
实施例6
混合糖源发酵
在装有20吨培养基的30吨发酵罐中，接入种子罐种子1.5吨，开始发酵。
发酵培养基成分为：加入5.3m3淀粉水解糖为碳源，培养基的其它组成、消毒条件及培养条件同实施例4，培养52hr发酵结束，用苔黑酚法检测D-核糖含量为77.0g/L，D-核糖总量为1540.0kg。
实施例7
混合糖源发酵
在装有45吨培养基的70吨发酵罐中，接入种子罐种子3.0吨，开始发酵。
发酵培养基成分为：加入12.0m3淀粉水解糖为碳源，培养基的组成与消毒条件同实施例4，37.0℃、通气量0.4vvm、罐压0.04Mpa搅拌培养48hr发酵结束，用苔黑酚法检测D-核糖含量为74.3g/L，D-核糖总量为3343.5kg。
实施例8
发酵液的提取
将实施例6得到的发酵液，加盐酸调PH至3.0，加热到70℃，趁热离心，除去菌体与固形物。离心清液加入离心清液重量1.0％的活性碳脱色30min后滤去活性碳，脱色清液经732阳离子树脂与717阴离子树脂脱盐，浓缩至D-核糖的含量为20.0％，折纯得D-核糖1386.0kg，重量收率90.0％。
实施例9
发酵液的提取
将实施例6得到的发酵液，加草酸调PH至3.0，加热到70℃并加入1.0％的活性碳保温脱色20min，降温至50.0℃，用板框除去菌体与固形物。压滤清液经732阳离子树脂与717阴离子树脂脱盐，浓缩至D-核糖的含量为20.0％，折纯得D-核糖1370.0kg，重量收率88.9％。
实施例10
膜过滤
取35L实施例6得到的发酵液，料液加热到70.0℃后置入陶瓷微滤过滤循环罐中，启动物料泵，调节入膜压力在0.3Mpa、出膜压力在0.2Mpa的状态，膜的过滤通量为165.0L/m2.hr；当料液体积在6.0L时，开始向储料罐中加入70.0℃的热水8.0L，当料液体积再次在5.0L时停止过膜工作，用苔黑酚法检测，过膜清液中D-核糖含量为5.92g/L，过膜浓缩液中D-核糖含量为1.10g/L。
实施例11
膜过滤
将实施例6得到的20吨发酵液加热到75.0℃后置入不锈钢微滤过滤循环罐中，启动物料泵，调节入膜压力在0.3Mpa、出膜压力在0.2Mpa的状态，膜的过滤通量为150.0L/m2.hr；当料液体积在2吨时，开始分次向储料罐中加入75.0℃的热水总共6吨，当料液体积再次在2吨时停止过膜工作，得过膜清液24吨，过程操作时间10hr，用苔黑酚法检测，过膜清液中D-核糖含量为63.0g/L，过膜浓缩液中D-核糖含量为8.5g/L，重量收率98.2％。
实施例12
膜过滤
将实施例7得到的45吨发酵液加热到75.0℃后置入不锈钢微滤过滤循环罐中，启动物料泵，调节入膜压力在0.3Mpa、出膜压力在0.2Mpa的状态，膜的过滤通量为170.0L/m2.hr；当料液体积在3吨时，开始分次向储料罐中加入75.0℃的热水总共12吨，当料液体积再次在3吨时停止过膜工作，得过膜清液54吨，过程操作时间6hr，用苔黑酚法检测，过膜清液中D-核糖含量为60.1g/L，过膜浓缩液中D-核糖含量为9.0g/L，重量收率98.8％。
实施例13
过滤清液脱盐浓缩
将实施例12得到的过膜清液以7.0t/hr的速度串联走732、717离子交换树脂，8hr后加入纯化水置换离交柱，当732、717树脂出口液中D-核糖含量低于0.3％时停止置换；在0.09Mpa的真空度条件下浓缩至D-核糖含量20.0％，折纯D-核糖为3176.3kg。
实施例14
D-核糖精制(化学法)
取例13制得的浓糖(折纯D-核糖40.0g)200g，室温下加入纯化水400mL，草酸调pH至4.0后依次加入体积浓度90％的乙醇200.0mL与苯胺30.0mL，搅拌15min，有絮状物出现，冷却至4.0℃，保温8hr后抽滤并用乙醇洗涤，得糖脎湿品72.0g；将湿糖脎加入600.0mL纯化水于60.0℃分解糖脎并在0.075Mpa的真空度下分别收集苯胺与D-核糖溶液；收集到的D-核糖溶液，浓缩，降温，加入1g晶种(从美国Sigma试剂公司购得)结晶，干燥得成品17.4g。重量收率43.6％，高压液相色谱检测D-核糖纯度99.6％。
实施例15
D-核糖精制(化学法)
取例13制得的浓糖(折纯D-核糖40.0g)200g，调pH至7.0，减压真空浓缩至90.0％的含量，加入甲醇、苯胺各100.0mL，搅拌30min，有絮状物出现，冷却至0℃，保温16hr后抽滤并用乙醇洗涤，得糖脎湿品90.0g；将湿糖脎加入800.0mL纯化水于70.0℃分解糖脎并在0.075Mpa的真空度下分别收集苯胺与D-核糖溶液；收集到的D-核糖溶液，浓缩，降温，加入1g晶种(从美国Sigma试剂公司购得)结晶，干燥得成品D-核糖22.0g。重量收率55.0％，高压液相色谱检测D-核糖纯度99.8％。
实施例16
D-核糖精制(色谱法)
取例13制得的浓糖(折纯D-核糖400.0g)2000g，加入氯化钠15.0g，并调pH至7.0，以400.0mL/hr的流速流经色谱柱，当色谱分离液中D-核糖的含量达到5.0％时开始收集分离液，随着分离时间的增加，分离液中D-核糖含量先升后降，当D-核糖含量低于3.0％时停止收集，将收集液经732阳离子树脂、D315阴离子树脂脱盐后减压真空浓缩至90.0％的含量，加入甲醇并冷却至15.0℃时加入1g D-核糖晶种(实施例16的产品)，继续冷却至0℃结晶，过滤干燥得成品D-核糖260.0g。收率65.0％，高压液相色谱检测D-核糖纯度为99.7％。
实施例17
D-核糖精制(色谱法)
取例13制得的浓糖(折纯D-核糖600.0g)3000g，加入氯化钠22.0g，并调pH至7.0，以600.0mL/hr的流速流经色谱柱，当色谱分离液中D-核糖的含量达到4.5％时开始收集分离液，随着分离时间的增加，分离液中D-核糖含量先升后降，当D-核糖含量低于2.0％时停止收集，将收集液经732阳离子树脂、D331阴离子树脂脱盐后减压真空浓缩至90.0％的含量，加入乙醇并冷却至15.0℃时加入1gD-核糖晶种(实施例16的产品)，继续冷却至0℃结晶，过滤干燥得成品D-核糖420.0g。收率70.0％，高压液相色谱检测D-核糖纯度为99.6％。
Claims (9)
1.一种生产结晶D-核糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在含有淀粉、淀粉水解糖、单糖和二糖混合糖源组成的底物的发酵培养基中，通入空气，进行有氧发酵，然后从发酵产物中收集D-核糖清液；
(2)将步骤(1)收集的D-核糖清液采用阳离子树脂和阴离子树脂脱盐处理，然后将脱盐后的溶液浓缩，得到浓糖；
(3)将得到的浓糖采用化学法或色谱法分离精制得到结晶D-核糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基的配方为：KH2PO4：1.0～20.0g/L；K2HPO4：1.0～20.0g/L；玉米浆10.0～30.0g/L；酵母粉：1.0～20.0g/L；(NH4)2SO4：1.0～20.0g/L；MnSO4：0～5.0g/L；MgSO4：0～5.0g/L；消泡剂：0.1～10.0g/L；碳酸钙：10.0～30.0g/L；总糖：160.0～240.0g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的消泡剂选自聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚(GPE)；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵条件如下：
接种量5.0～10.0％；罐温36.0±1.0℃；通风量：0.2～1.0vvm；罐压：0.02～0.08MPa；培养时间：40～60小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)获得的发酵清液中加入活性炭进行脱色处理。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵液直接膜处理，得到D-核糖清液或直接浓缩得到D-核糖溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，从发酵产物中收集D-核糖清液的方法，包括如下步骤：
将发酵液加酸调节pH至2.0～5.0，加热至50～100℃，然后用絮凝法、离心法、板框框过滤法或膜过滤法去除发酵液中的菌体和残留固形物，得到D-核糖清液，所说的酸为无机酸或有机酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的阳离子树脂为732树脂、711树脂或D113树脂中的一种以；所说的阴离子树脂为717树脂或331树脂中的一种以上。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的化学法包括如下步骤：将得到的浓糖与苯胺反应，并将得到的糖脎分离出来后再进行分解，然后通过减压蒸馏精制得到结晶D-核糖；
反应温度为0～25℃，反应时间为8～16小时，浓糖∶苯胺＝1∶0.5～2.5(重量比)；
所说的色谱法包括如下步骤：将得到的浓糖与氯化钠混合后用色谱分离树脂进行分离，收集所需的馏分，经脱盐后再用醇类或酮类试剂结晶得到结晶D-核糖。
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2008
- 2008-01-04 CN CN 200810032281 patent/CN101475970B/zh active Active
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