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CN105566136A - 一种从发酵液中分离提取4-羟基异亮氨酸的方法 - Google Patents

一种从发酵液中分离提取4-羟基异亮氨酸的方法 Download PDF

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陈宁
麻杰
徐庆阳
范晓光
谢希贤
张成林
李燕军
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Abstract

一种从发酵液中分离提取4-羟基异亮氨酸的方法，该方法首先通过双膜即微滤膜、超滤膜分离系统错流过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和色素，然后通过阳离子交换柱除去酮戊二酸等杂酸、粉末活性炭脱色、真空浓缩、冷冻结晶、离心收集产品、干燥成品操作步骤，得到纯度97.0％以上的4-羟基异亮氨酸结晶，收率达到65％以上。本发明采用微滤和超滤双膜过滤菌体蛋白，菌体蛋白去除彻底，过滤液澄清透明；采用阳离子离子交换工艺，高效去除难分离的酮戊二酸等杂质。

Description

一种从发酵液中分离提取4-羟基异亮氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种从发酵液中分离提取4-羟基异亮氨酸的方法，属于发酵法生产氨基酸的技术领域。
背景技术
4-羟基异亮氨酸(4-Hydroxyisoleucine，4-HIL)是一种主要存在于胡芦巴属植物种子中的L-异亮氨酸羟化物。4-HIL分子式C6H13NO3，分子量147.17，熔点大于200℃，沸点332℃，密度1.181g/cm3。研究表明4-羟基异亮氨酸具有葡萄糖浓度依赖的促进胰岛素分泌的活性以及促进肌细胞对血糖吸收、加速脂肪代谢、降血脂和保护肝功能的作用。因此，作为有效预防和治疗糖尿病及肥胖症的理想药物，4-羟基异亮氨酸具有广泛的应用前景和市场需求。
4-羟基异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法、酶催化法和生物法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制，分离纯化困难，收率低，产品纯度低，污染环境严重，大量制备成本高，难以实现工业化生产。目前，国内还没有直接发酵法生产4-羟基异亮氨酸，而以发酵法生产具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点。
随着生物技术的发展，在研究化学合成4-HIL的过程中尝试引入酶催化反应来简化一些步骤。例如，Wang等于2002年发明了八步法合成4-HIL，该方法以2-甲基乙酰乙酸乙酯为原料，在地霉菌的作用下得到(2S，3S)-3-羟基-2-甲基丁酸乙酯，再经过7步化学合成将其转变成4-HIL。这其中借助地霉菌转化2-甲基乙酰乙酸乙酯是最关键一步。该方法总收率为39％。进一步地，Fulcrand等提出六步化学-酶合成法合成4-HIL。第一步以溴乙酸叔丁酯为底物，在二苄胺的催化下得到二-N-苯甲基甘氨酸叔丁酯，经过开环色层分析等分离得到外消旋4-HIL内酯，最后在青霉素酰基转移酶作用下水解N-苯乙酰内酯衍生物得到4-HIL。上述方法需要复杂的多步反应，同时难以控制生成的L-异亮氨酸羟化物的立体结构。2009年，Kodera等首次在苏云金芽孢杆菌2e2AKU0251中发现有上述功能的氧化酶，即L-异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucinedioxygenase，IDO)。其研究小组将该酶蛋白纯化，详细的研究了酶学性质并找到其对应的基因序列，借助质谱和核磁共振等分析技术，他们发现IDO特异地催化L-Ile生成4-HIL。2010年，Smirnov等结合IDO催化过程特点，失活大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655的α-酮戊二酸脱氢酶和异柠檬酸裂解酶，在此基础上过表达IDO，首次将4-HIL的合成与三羧酸循环联系起来。用该菌株进行微生物转化，最终L-异亮氨酸转化率为82％。
近年来，II型糖尿病和肥胖症的快速发展，使得关于4-HIL的研究愈发受到青睐。目前主要采用葫芦巴种子提取法生产4-HIL，然而该方法提取效率低(0.091-0.6％)且采用该方法获得的4-HIL构型较多但仅(2S,3R,4S)-4-HIL具有生物学活性。有关化学法合成4-HIL的报道较多，但主要是以葡萄糖、薄荷酮或2-甲基乙酰乙酸乙酯为原料经多步化学反应生成，该方法反应条件苛刻、步骤多、分离困难、收率低，而且容易造成环境污染。酶法合成是以己醛、α-酮戊二酸化及L-谷氨酸为底物经4-羟基-3-甲基-2-酮基-戊酸醛缩酶和分支链氨基酸氨基转移酶两步催化合成，虽然该方法具有周期短等优点，但据报道因其转化率较低且产品中含有大量α-氨基丁酸等副产物而不能达到生产要求。
发明内容
本发明目的是提供一种新型的4-羟基异亮氨酸的分离提取工艺，改变现有生产工艺中存在的分离纯化困难，收率低，产品纯度低，污染环境严重，大量制备成本高等问题。
针对上述问题，本发明课题组曾开发了一种4-羟基异亮氨酸提取工艺技术，该技术从发酵液中分离提取4-羟基异亮氨酸，首先将4-羟基异亮氨酸发酵液通过双膜即微滤膜、超滤膜分离系统错流过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和部分色素，然后通过阳离子交换柱除去酮戊二酸等杂酸、粉末活性炭脱色、真空浓缩、冷冻结晶、离心收集产品和干燥成品操作步骤，得到纯度97.0％以上的4-羟基异亮氨酸结晶，收率达到65％以上，具体步骤如下：
a、将4-羟基异亮氨酸发酵液经活菌灭活，用4mol/L的盐酸调节pH为4.0，进入微滤膜分离系统进行微滤，得到去除菌体的4-羟基异亮氨酸微滤液以及菌体蛋白；所述微滤膜分离系统采用金属膜分离系统，微滤膜孔径为50nm，操作温度为20～80℃，进膜压力与出膜压力差为0.01～0.1Mpa，过滤过程分多次利用纯化水顶洗，直至浓液中4-羟基异亮氨酸含量低于2.0g/L后停机，得到除去菌体的4-羟基异亮氨酸微滤液。
b、将经a步得到澄清的4-羟基异亮氨酸过滤液泵入超滤膜过滤器，对过滤液进行除蛋白和脱色处理，操作温度为20-50℃，操作压力为0.01-0.1MPa，得到4-羟基异亮氨酸过滤液。所述超滤膜过滤器采用中空纤维膜分离系统，截留分子量为6000，其操作条件为pH2-12，操作温度20-50℃，进膜压力与出膜压力差为0.01-0.1MPa，得到4-羟基异亮氨酸过滤液。
c、将b步获得的过滤液上732阳离子交换树脂吸附，吸附饱和后用去离子水反洗，之后采用2％-7％的氨水洗脱，收集pH为7.0-10.5的4-羟基异亮氨酸高流分洗脱液。
d、将c步获得高流分洗脱液加入洗脱液重量的0.05％-2％的活性炭脱色，温度30-60℃，搅拌脱色20-30min，过滤获得4-羟基异亮氨酸脱色液。
e、将d步获得的脱色液用盐酸调pH为7.0-8.0后进行减压蒸发至原体积液的10％-20％，获得含有大量4-羟基异亮氨酸晶体的悬混液；
f、将e步得到的4-羟基异亮氨酸晶体的悬混液放置于4℃结晶2-10h，过滤，获得4-羟基异亮氨酸晶体。
本发明的优点和积极效果：
与现有工艺相比，本发明的方法具有以下优点：
1、本发明采用微滤和超滤双膜过滤菌体蛋白，去除菌体蛋白效果较好，过滤液澄清透明；
2、本发明采用阳离子交换工艺，高效去除难分离的酮戊二酸等杂质；
3、本发明提供一种新型的4-羟基异亮氨酸生产工艺，得到的4-羟基异亮氨酸晶体
经氨基酸分析仪分析测定纯度达97.0％以上。
具体实施方式
实施例1
a、取4-羟基异亮氨酸发酵液25L(4-羟基异亮氨酸含量18.0g/L)于80℃加热10min以上，用盐酸调节pH为4.0，进入微滤膜分离系统进行微滤，得到去除菌体的4-羟基异亮氨酸微滤液以及菌体蛋白；所述微滤膜分离系统采用金属膜分离系统，微滤膜孔径为50nm，操作温度为30～40℃，进膜压力与出膜压力差为0.04Mpa，过滤过程分多次利用纯化水顶洗，直至浓液中4-羟基异亮氨酸含量低于2.0g/L后停机，得到除去菌体的4-羟基异亮氨酸微滤液。清液4-羟基异亮氨酸回收率达95.2％，菌体去除率大于99.9％，膜通量达到78L·(m2·h)-1。
b、将经a步得到澄清的4-羟基异亮氨酸过滤液泵入超滤膜过滤器，对过滤液进行除蛋白和脱色处理，得到4-羟基异亮氨酸过滤液。所述超滤膜过滤器采用中空纤维膜分离系统，截留分子量为6000，其操作条件为pH4.0，操作温度30℃，进膜压力与出膜压力差为0.08MPa，得到4-羟基异亮氨酸过滤液。
c、将b步获得的过滤液上732阳离子交换树脂吸附，吸附饱和后用去离子水反洗，之后采用5％的氨水洗脱，收集pH为7.0-10.5的4-羟基异亮氨酸高流分洗脱液。
d、将c步获得高流分洗脱液加入洗脱液重量的1.5％的活性炭脱色，温度60℃，搅拌脱色25min，过滤获得4-羟基异亮氨酸脱色液。
e、将d步获得的脱色液用盐酸调pH为7.2，进行减压蒸发至原体积液的12％，获得含有大量4-羟基异亮氨酸晶体的悬混液；
f、将e步得到4-羟基异亮氨酸晶体的悬混液放置于4℃结晶8h，过滤，获得4-羟基异亮氨酸晶体，称重293.0g，计算收率为65.1％，纯度为95.8％。
实施例2
取4-羟基异亮氨酸发酵液20L(4-羟基异亮氨酸含量20.3g/L)于80℃加热10min以上，用盐酸调节pH为4.0，按照实施例1的方法进行微滤除菌体和超滤除蛋白，采用3％的氨水洗脱树脂，收集pH为7.0-10.0的洗脱液，加入洗脱液重量的1.8％的活性炭脱色，温度55℃，搅拌脱色25min，过滤获得4-羟基异亮氨酸脱色液，用盐酸调pH为7.2后进行减压蒸发至原体积液的12％，得到4-羟基异亮氨酸晶体的悬混液，放置于4℃结晶4h，过滤，获得4-羟基异亮氨酸晶体，称重252.5g，计算收率为62.2％，纯度为96.5％。
实施例3
取4-羟基异亮氨酸发酵液28L(4-羟基异亮氨酸含量19.1g/L)于80℃加热10min以上，用盐酸调节pH为4.0，按照实施例1的方法进行微滤除菌体和超滤除蛋白，采用6％的氨水洗脱树脂，收集pH为7.5-10.5的洗脱液，加入洗脱液重量的1.5％的活性炭脱色，温度50℃，搅拌脱色20min，过滤获得4-羟基异亮氨酸脱色液，用盐酸调pH为7.2后进行减压蒸发至原体积液的15％，得到4-羟基异亮氨酸晶体的悬混液，放置于4℃结晶4h，过滤，获得4-羟基异亮氨酸晶体，称重322.5g，计算收率为60.3％，纯度为96.8％。

Claims (3)

1.一种从发酵液中分离提取4-羟基异亮氨酸的方法，该技术从发酵液中分离提取4-羟基异亮氨酸，首先将4-羟基异亮氨酸发酵液通过双膜即微滤膜、超滤膜分离系统错流过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和部分色素，然后通过阳离子交换柱除去杂酸酮戊二酸、粉末活性炭脱色、真空浓缩、冷冻结晶、离心收集产品和干燥成品操作步骤，得到纯度97.0％以上的4-羟基异亮氨酸结晶，收率达到65％以上，具体步骤如下：
a、将4-羟基异亮氨酸发酵液经活菌灭活，用盐酸调节pH为4.0，进入微滤膜分离系统进行微滤，得到去除菌体的4-羟基异亮氨酸微滤液以及菌体蛋白；
b、将经a步得到澄清的4-羟基异亮氨酸过滤液泵入超滤膜过滤器，对过滤液进行除蛋白和脱色处理，操作温度为20-50℃，操作压力为0.01-0.1MPa，得到4-羟基异亮氨酸过滤液；
c、将b步获得的过滤液上732阳离子交换树脂吸附，吸附饱和后用去离子水反洗，之后采用2％-7％的氨水洗脱，收集pH为7.0-10.5的4-羟基异亮氨酸高流分洗脱液；
d、将c步获得高流分洗脱液加入洗脱液重量的0.05％-2％的活性炭脱色，温度30-60℃，搅拌脱色20-30min，过滤获得4-羟基异亮氨酸脱色液；
e、将d步获得的脱色液用盐酸调pH为7.0-8.0后进行减压蒸发至原体积液的10％-20％，获得含有大量4-羟基异亮氨酸晶体的悬混液；
f、将e步得到的4-羟基异亮氨酸晶体的悬混液放置于4℃结晶2-10h，过滤，获得4-羟基异亮氨酸晶体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述a步所述微滤膜分离系统采用金属膜分离系统，微滤膜孔径为50nm，操作温度为20～80℃，进膜压力与出膜压力差为0.01～0.1Mpa，过滤过程分多次利用纯化水顶洗，直至浓液中4-羟基异亮氨酸含量低于2.0g/L后停机，得到除去菌体的4-羟基异亮氨酸微滤液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于b步所述超滤膜过滤器采用中空纤维膜分离系统，截留分子量为6000，其操作条件为pH2-12，操作温度20-50℃，进膜压力与出膜压力差为0.01-0.1MPa，得到4-羟基异亮氨酸过滤液。
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