CN101407767A

CN101407767A - 一种通过发酵生产冬虫夏草的方法

Info

Publication number: CN101407767A
Application number: CNA2008102288465A
Authority: CN
Inventors: 贾景明; 吴春福; 杨静玉
Original assignee: Individual
Current assignee: Shandong Huipeng Investment Co Ltd
Priority date: 2008-11-17
Filing date: 2008-11-17
Publication date: 2009-04-15

Abstract

本发明属于医药技术领域，提供一种通过发酵生产冬虫夏草的方法。该方法采用MK722培养基将装有液体种子的三角烧瓶放到旋转式摇床上，液体种子培养中种子与培养基的比例1∶5－20，转速：50－300转/分，培养时间：50－200小时，培养温度：15－30℃，光照强度：0－58.4μmol·m^－2·s^－1，光照时间：1－24小时。液体种子培养50－200小时后，选取时要培养色泽清澈，菌丝体均匀一致，种子液中的种子直径约1－3mm大小，按液体种子与培养基比例1∶1－20接种量，接至0.2－5000L生物反应器中，在无菌条件下培养。培养温度：15－30℃，培养50－96小时，转速50－300转/分，光照时间：1－24小时，光照强度：0－58.4μmol·m^－2·s^－1。冻干形成冬虫夏草发酵物冻干粉。本发明易操作，生产成本低，不污染环境，达到了产业化水平。

Description

一种通过发酵生产冬虫夏草的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种通过发酵生产冬虫夏草的方法。具体的说是以微生物发酵技术为手段，通过在大型恒温光照往复式培养器内进行的冬虫夏草大规模培养并对培养物进行冻干的方法。

背景技术

冬虫夏草，是麦角菌科(Clavicepitaceae)真菌冬虫夏草菌(Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.)寄生在蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾(Hepialus armoricanus)幼虫上的子座和幼虫尸体的复合体。具有补肺益肾，止血化痰等功效。现代药理学表明冬虫夏草还具有抗癌、抗病毒、抗衰老等作用。虫草属菌中含有多种具有医疗保健功效的活性物质，其中腺苷(adenosine)和虫草素(cordycepin)是主要活性物质之一。冬虫夏草因其广泛的药理活性，从古代就已广泛用做民间的滋补品，但因其生长环境严格和寄生条件特殊，加上人为采挖过渡，天然资源稀少，价格昂贵。近年来关于冬虫夏草的研究主要集中于无性形的确定、人工栽培、液体深层发酵培养、化学成分以及药理作用的研究。经大量研究表明人工发酵培养得到的菌丝体，经毒理、药理和植化等研究，证明与天然虫草化学组成、药理作用基本一致，且一些成分的含量高于天然冬虫夏草，因此长期以来人们一直致力于深层发酵培养虫草菌丝体作为替代品。腺苷和虫草素是冬虫夏草的主要活性物质。腺苷，具有改善心脑血液循环、防止心律失常、抑制神经递质释放和调节腺苷酸环化酶活性等药理作用，目前已作为冬虫夏草的质控指标。虫草素即3′-脱氧腺苷，具有免疫调节、抗菌、抗病毒、抗癌以及抗衰老等作用。

目前国内关于冬虫夏草的液体培养的研究还基本上处于针对不同的代谢产物而进行的各种理化因子的考察，近几年来一些学者将生物转化的研究方法应用于冬虫夏草的液体培养，但关于考察前体物质对冬虫夏草发酵培养中对于次生代谢产物的影响还鲜有报道。

国内外已上市的冬虫夏草类保健品及药品均为天然提取的冬虫夏草菌丝体制剂。由于其具有很高的药用价值，深受患者喜爱。然而由于其成分复杂，有效成分含量低，大大影响了该药的临床疗效以及市场的进一步扩大。特别是天然冬虫夏草已作为濒临灭绝的植物种受到世界以及我国政府的重点保护，严禁采摘。为此各个国家都投入大量的人力物力研究冬虫夏草的替代产品。目前国际上公认的替代产品为人工培养冬虫夏草或北冬虫夏草菌丝体，筛选有效成分含量高的菌种进行人工培育，得到的菌丝体进行一些常规处理制成浸膏、胶囊或口服液。这仍属于中药传统的产业加工方式，生产周期长约为3个月左右。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过发酵生产冬虫夏草的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明包括液体种子培养、大规模发酵培养、冻干。

本发明依冬虫夏草菌丝体发酵培养生产技术，在MK722培养基上培养，很好地控制了菌球的生长和有效成分的产出，液体种子培养中种子与培养基的比例1∶5-20，转速：50-300转/分，培养时间：50-200小时，培养温度：15-30℃，光照强度：0-58.4μmol·m^-2·s^-1，光照时间：1-24小时。

大规模发酵培养中液体种子与培养基比例1∶1-20接种量，接至0.2-5000L生物反应器中，培养温度：15-30℃，培养时间：50-96小时，转速：50-300转/分，光照时间：1-24小时，光照强度：0-58.4μmol·m^-2·s^-1。

冻干过程是在发酵液中加入糖酐类0.1-5mg/ml和含硫氨基酸0.0001-12g/100g，在-20--70℃下冻干，进而形成冬虫夏草发酵物冻干粉。

从国内外已发表的文献和专利中未见运用MK722培养基和上述培养条件进行深层发酵培养虫草技术的报道。

冬虫夏草的培养工艺如下：

一、液体种子培养

1.MK722培养基组成：

薯粉1-4.75％，玉米粉0.1-1.5％，蛋白胨0.1-0.5％，KH₂PO₄0.1-0.5％，MgSO₄ 0.1-0.5％，维生素B₁ 0.001-0.005％，维生素B₂0.001-0.005％，(NH₄)₂SO₄ 0.01-0.10％，嘌呤类0.05-1％，酰胺类0.01-1％，其余为无菌蒸馏水，pH值为5.0-7.0。

2.培养条件：

将装有液体种子的三角烧瓶放到旋转式摇床上，种子与培养液的比例1∶5-20，转速：50-300转/分，培养时间：50-200小时。培养温度：15-30℃，光照强度：0-58.4μmol·m^-2·s^-1，光照时间：1-24小时。

二、发酵培养

液体种子培养50-200小时后，选取时要培养色泽清澈，菌丝体均匀一致，种子液中的种子直径约1-3mm大小，按液体种子与培养基比例1∶1-20接种量，接至0.2-5000L生物反应器中，在无菌条件下培养。

1.发酵培养基组成：

同上种子液培养基组成。

2.培养条件：

培养温度：15-30℃，培养时间：50-96小时，转速：50-300转/分，光照时间：1-24小时，光照强度：0-58.4μmol·m^-2·s^-1。

3.检验：菌丝体均匀一致，虫草素含量0.05-2.6mg/g，腺苷含量0.001-2.0mg/g。

三、冻干

在发酵液中加入糖酐类0.1-5mg/ml和含硫氨基酸0.0001-12g/100g，在-20--70℃下冻干，形成冬虫夏草发酵冻干粉。

四、检测

1.色谱条件的选择：

色谱条件：泵：SHIMADZU LC-10Avp；检测器：SHIMADZUSPD-10Avp；色谱柱：DIAMONSIL C-18烷基硅胶柱(250×4.6)；5μl定量环；流动相：乙腈∶水∶甲醇(2∶85∶2)；测定波长：260nm；流速：1.0ml/min；柱温：40℃。

2.样品的测定：

精密称定约0.5g冻干粉，置磨口锥形瓶中，加入20ml 90％甲醇，回流提取30分钟，抽滤，残渣用90％甲醇洗涤2次，滤液水浴锅上浓缩，90％甲醇定容到5ml容量瓶中，0.45μm微孔滤膜过滤。所得供试品分别于0h、2h、4h、7h进样，读取峰面积，计算RSD。通过代入标准曲线计算样品虫草素和腺苷含量。

用本发明方法发酵培养技术生产冬虫夏草，不变性，成本低，周期短，形成的冬虫夏草冻干粉，腺苷和虫草素产量高，活性好，临床效果明显，极具市场竞争力。

具体实施方式：

实施例1：冬虫夏草的制备

一、液体种子培养

1.MK722培养基组成：

薯粉2％，玉米粉0.8％，蛋白胨0.4％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.4％，维生素B₁0.003％，维生素B₂0.004％，(NH₄)₂SO₄0.05％，嘌呤类0.65％，酰胺类0.2％，其余为无菌蒸馏水，pH值为6.5。

2.培养条件：

将装有液体种子的三角烧瓶放到旋转式摇床上，种子与培养液的比例1∶20，100转/分，培养100小时。培养温度：20℃，光照强度：40.7μmol·m^-2·s^-1。光照时间：4小时。

二、发酵培养

液体种子培养100小时后，选取时要培养色泽清澈，菌丝体均匀一致，种子液中的种子直径约1mm大小，按15％接种量，接至0.5L生物反应器中，在无菌条件下培养。

1.发酵培养基组成：

同上种子液培养基组成。

2.培养条件：

培养温度：20℃，培养85小时，转速150转/分，光照时间：4小时，光照强度：45.5μmol·m^-2·s^-1。

3.检验：

菌丝体均匀一致，虫草素含量1.1mg/g，腺苷含量0.04mg/g。

三、冻干

在发酵液中加入赋形剂糖酐类3mg/ml和含硫氨基酸2g/100g，在-45℃下冻干，形成冬虫夏草发酵冻干粉。

实施例2：不同嘌呤对冬虫夏草发酵中腺苷和虫草素产量的影响

1、黄嘌呤；

黄嘌呤

虫草素含量(mg/g)

腺苷含量(mg/g)

(0.5％)

1.72

0.05

2、腺嘌呤

3、盐酸腺嘌呤

4、鸟嘌呤

实施例3：不同酰胺对冬虫夏草发酵中腺苷和虫草素产量的影响

1、天冬酰胺

2、谷氨酰胺

3、烟酰胺

4、精酰胺

实施例4：野生冬虫夏草与冬虫夏草发酵物3批次样品中腺苷和虫草素产量的比较

Claims

1.一种通过发酵生产冬虫夏草的方法，其特征在于：该方法包括液体种子培养、大规模发酵培养、冻干。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：液体种子培养中种子与培养基的比例1∶5-20，转速50-300转/分，培养50-200小时，培养温度：15-30℃，光照强度：0-58.4μmol·m^-2·s^-1，光照时间：1-24小时。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的培养基为MK722培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的大规模发酵培养中液体种子与培养基比例1∶1-20接种量，接至0.2-5000L生物反应器中，培养温度：15-30℃，培养50-96小时，转速：50-300转/分，光照时间：1-24小时，光照强度：0-58.4μmol·m^-2·s^-1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：冻干过程是在发酵液中加入糖酐0.1-5mg/ml和含硫氨基酸0.0001-12g/100g，在-20--70℃下冻干，进而形成冬虫夏草发酵物冻干粉。