CN102925527A - 一种金针菇、灵芝混菌发酵的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种金针菇、灵芝混菌发酵的方法，方法步骤：（1）分别制备金针菇、灵芝的发酵种子液；（2）制备混菌发酵培养基，该培养基由蔗糖、淀粉、马铃薯、玉米、黄豆组成；（3）将步骤（1）中制得的金针菇、灵芝发酵种子液共同接种于混菌发酵培养基中进行混菌深层培养，进而获得多糖、三萜类化合物等活性产物。优点：（1）实现了金针菇、灵芝菌丝体的混菌发酵培养；（2）培养基配方天然，使用方便：在混菌发酵培养基中，使用的均为天然粮食作物，无化学试剂，配制方便、简单，而且通常在发酵过程中，不必对pH值进行调节；（3）通过金针菇、灵芝混菌发酵，与金针菇、灵芝单菌发酵相比，胞外多糖、三萜类化合物产量均得以8%~35%的提高。

Description

一种金针菇、灵芝混菌发酵的方法

技术领域

本发明涉及一种混菌发酵的方法，具体涉及一种金针菇、灵芝混菌发酵的方法。

背景技术

金针菇（Flammulina velutipes）被称为“增智菇”，含有18种氨基酸，包括8种人体必需的氨基酸，富含锌、钙、磷、铁等多种矿物质，有促进人体智力、生长发育、提高机体免疫能力的作用，尤其在增强机体对运动负荷的适应能力、抗疲劳、消除疲劳等方面的作用强于蘑菇、香菇、木耳等食用菌。

灵芝（Ganoderma lucidum）含有多糖、三萜类化合物、多肽等十多种有效成分。灵芝不同于一般药物对某种疾病而起治疗作用，亦不同于一般营养保健食品只对某一方面营养素的不足进行补充和强化，而是在整体上双向调节人体机能平衡，调节人体新陈代谢机能，提高自身免疫能力和耐缺氧能力，促使内脏或器官机能正常化。

人工栽培金针菇、灵芝由于子实体生长周期长，受季节和原材料的限制，产量低，不能满足需要，目前研究主要集中在分别对金针菇、灵芝进行深层发酵工艺及活性物质功能上，但在发酵过程中普遍使用一些生化物质作为其发酵的培养基组分，这不仅造成培养基价格较贵，同时发酵后产物利用方面还存在安全性问题。

混菌发酵是指采用两种或多种微生物的协同作用共同完成某发酵过程的一种新型发酵技术，是纯种发酵技术的新发展，也是一种不需要进行复杂的DNA体外重组却可取得类似效果的新型发酵技术，可提高发酵效率甚至可形成新产品。上海师范大学王淑珍曾用灵芝、松茸混菌发酵，发现混菌发酵后，由于活性物质间的协同、增效、互补，及新产生的活性物质，其生理功能效果优于原来的单菌发酵产物。目前真菌混菌发酵技术及其相关产品尚有待于进一步研究。

发明内容

本发明的目的是要提供一种能促进、提高和改变发酵液中活性产物质量的金针菇、灵芝混菌发酵方法。

本发明的目的是这样实现的：该混菌发酵方法为：混菌发酵培养基由双糖、多糖、淀粉类粮食、蛋白质类粮食组成，所述的混菌发酵培养基包括：10~20g/L淀粉、15~25g/L马铃薯、10~20g/L蔗糖、10~30g/L玉米、1~10g/L黄豆；采用液体深层发酵技术，混菌培养金针菇和灵芝；以金针菇和灵芝为菌种，经马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化、液体发酵培养制备单菌发酵种子液，混合接种金针菇、灵芝于混菌发酵培养基，接种比例1:1~3:1，温度22~26℃，pH 4.5~5.5，培养时间是120~240h，混菌发酵后的菌丝和发酵液可用于发酵产物：生物量、多糖及三萜类化合物的提取与测定。

具体步骤如下：

（1）配制马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基：按照GB4789.15—2010《食品卫生微生物学检验 霉菌和酵母计数》配制，用于菌种的复苏及保存；

（2）菌种活化：取金针菇No. 5.65菌株和灵芝No. 5.786菌株分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上活化1~2次；

（3）分别制备单菌发酵种子液：取金针菇、灵芝活化后的菌块分别接种于液体培养基中，22~26℃发酵培养168~288h； 

（4）配制混菌发酵培养基：马铃薯去皮后切成约1cm³小块，玉米、黄豆粉碎至颗粒大小为100μm，培养基组成为10~20g/L淀粉、15~25g/L马铃薯、10~20g/L蔗糖、10~30g/L玉米、1~10g/L黄豆，加水配制；先将马铃薯、玉米、黄豆加水煮25min，再加入溶解好的淀粉和蔗糖，加水定容后灭菌；

（5）制备混菌发酵种子液：取金针菇、灵芝单菌发酵种子液，接种于混菌发酵培养基中，培养液酸碱度pH 4.5~5.5，接种量配比为1:1~3:1，共计5%，22~26℃发酵培养144~240h；

（6）分离生物量：发酵液过滤收集菌丝，60℃烘干至质量恒定并称质量；

（7）胞外粗多糖提取与测定：发酵液过滤后离心取上清液，80~90 ℃水浴浓缩成原体积的0.2~0.25倍，加入4~5倍体积95%乙醇，4℃静置，浓缩液离心，用无水乙醇洗涤沉淀两次，烘干至恒重，得胞外粗多糖；

（8）胞内三萜类化合物的提取：取1 g菌丝加50 mL甲醇静置过夜后过滤，蒸干后加4 mL 95%乙醇溶解；

（9）胞外三萜类化合物的提取：取发酵液15mL，用3倍体积的水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇提取液，减压蒸干，加4mL 95%乙醇溶解。

有益效果，由于采用上述方案，使用的混菌发酵培养基组成均为粮食作物，培养基包括马铃薯、玉米、黄豆粉、淀粉和蔗糖，现有技术中的混菌发酵培养基均使用化学试剂，粮食培养基较化学试剂培养基的营养成分更全面，更有利于获得绿色、天然、安全的活性产物及功能性产品；促进、提高和改变了发酵液中活性产物质量，达到了本发明的目的。

优点：

（1）本发明首次实现了金针菇、灵芝菌丝体的混菌发酵培养；

（2）培养基配方天然，使用方便：在本发明的混菌发酵培养基中，使用的均为天然粮食作物，无化学试剂，配制方便、简单，而且通常在发酵过程中，不必对pH值进行调节；

（3）通过金针菇、灵芝混菌发酵，与金针菇、灵芝单菌发酵相比，胞外多糖、三萜类化合物产量均得以8%~35%的提高。

通过混菌发酵，与较单菌发酵相比，促进、提高和改变了发酵液中活性产物质量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明：

实施例1：

1、菌种：

    金针菇（Flammulina velutipes）：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为5.65；

灵芝（Ganoderma lucidum）：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为5.786，经诱变选育后，产多糖能力得以一定程度的提高。

2、培养基：

混菌发酵培养基所需原料包括蔗糖、淀粉、马铃薯、玉米、黄豆，购自超市，马铃薯去皮后切成约1cm³小块，玉米、黄豆粉碎至颗粒大小为100μm。组成为10~20g/L蔗糖、10~20g/L淀粉、15~25g/L马铃薯、10~30g/L玉米、1~10g/L黄豆，回水配制；先将马铃薯、玉米、黄豆加水煮25min，再加入溶解好的淀粉和蔗糖，用水定容后灭菌。

金针菇、灵芝混菌发酵培养和发酵产物的提取与测定

混菌发酵方法为：混菌发酵培养基由双糖、多糖、淀粉类粮食、蛋白质类粮食组成，采用液体深层发酵技术，混菌培养金针菇和灵芝；以金针菇和灵芝为菌种，经马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化、液体发酵培养制备单菌发酵种子液，混合接种金针菇、灵芝于混菌发酵培养基，接种比例1:1~3:1，温度22~26℃，pH 4.5~5.5，培养时间是120~240h，混菌发酵后的菌丝和发酵液可用于发酵产物：生物量、多糖及三萜类化合物的提取与测定。

所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基为在实验室中被广泛采用的培养基，所述的混菌发酵培养基即粮食培养基。

1、发酵工艺（培养瓶培养）

将金针菇No. 5.65菌株和灵芝No. 5.786菌株在24~28℃下保温培养活化菌种6~9天，取活化后的菌块接种于液体培养基中，25℃摇床培养7天，制备得金针菇、灵芝单菌发酵种子液，所述的液体培养基是实验室中用于培养金针菇、灵芝的普通液体培养基；按照接种量1:1~3:1接种于320mL混菌发酵培养基500mL摇瓶中，25℃摇床培养192h，发酵液过滤后，菌丝烘干至恒重得生物量，结果如下。

生物积累量（干g/100mL）：金针菇：4~6；灵芝：3~5；混菌：4~6。

    结果表明，采用上述含有不同浓度的玉米、黄豆混菌发酵培养基均能成功的进行金针菇、灵芝混菌发酵。

2、发酵工艺（10L发酵罐培养）

取金针菇、灵芝单菌发酵种子液，分别接种于含有混菌发酵培养基的10L发酵罐中进行发酵，混菌接种时接种量配比为1:1~3:1，共计5%，pH 4.5~5.5；温度24℃；时间：144~168h。发酵液过滤后，菌丝烘干至恒重得生物量，结果如下。

生物积累量（干g/100mL）：金针菇：5.5~6.5；灵芝：4~5；混菌：5~6。

结果表明，在上述混菌发酵培养基条件下，均能进行金针菇、灵芝单菌和混菌发酵罐培养，且培养时间较培养瓶培养有所缩短。

3、胞外多糖的提取

发酵液过滤后4000r/min 离心取上清液，80℃水浴浓缩成原体积的0.2倍，加入5倍体积95%乙醇，4℃静置12h，浓缩液4000r/min离心，用无水乙醇洗涤沉淀两次，70℃烘干至恒重，得胞外粗多糖。

4、胞内三萜类化合物的提取

取1 g菌丝加50 mL甲醇静置12h后过滤，蒸干后加4 mL 95%乙醇溶解。

    5、胞外三萜类化合物的提取

取发酵液15mL，用3倍体积的水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇提取液，减压蒸干，加4mL 95%乙醇溶解。

6、活性成分积累

（1）胞外多糖的积累

胞外多糖（g/L）：金针菇：37 ~39；灵芝：27~29；混菌：41~43。

结果表明，混菌发酵胞外多糖含量比金针菇、灵芝单菌发酵均得以提高。

（2）三萜类化合物的积累

胞内三萜产量(×10^-2 mg/g)：金针菇：64~68；灵芝：72~78；混菌：86~90。

胞外三萜产量（×10^-2 g/L）：金针菇：66~70；灵芝：71~74；混菌：80~84。

结果表明，混菌发酵后胞内、胞外三萜产量比金针菇、灵芝单菌发酵均得以提高。

上述结果表明，采用混菌发酵培养基进行金针菇、灵芝混菌发酵后，胞外多糖、三萜类化合物均得以8%~35%的提高。

Claims (1)

1.一种金针菇、灵芝混菌发酵的方法，其特征是：该混菌发酵方法为：混菌发酵培养基由双糖、多糖、淀粉类粮食、蛋白质类粮食组成，所述的混菌发酵培养基包括：10~20g/L淀粉、15~25g/L马铃薯、10~20g/L蔗糖、10~30g/L玉米、1~10g/L黄豆；采用液体深层发酵技术，混菌培养金针菇和灵芝；以金针菇和灵芝为菌种，经马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化、液体发酵培养制备单菌发酵种子液，混合接种金针菇、灵芝于混菌发酵培养基，接种比例1:1~3:1，温度22~26℃，pH 4.5~5.5，培养时间是120~240h，混菌发酵后的菌丝和发酵液可用于发酵产物：生物量、多糖及三萜类化合物的提取与测定；

具体步骤如下：

（1）配制马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基：按照GB4789.15—2010《食品卫生微生物学检验 霉菌和酵母计数》配制，用于菌种的复苏及保存；

（2）菌种活化：取金针菇No. 5.65菌株和灵芝No. 5.786菌株分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上活化1~2次；

（3）分别制备单菌发酵种子液：取金针菇、灵芝活化后的菌块分别接种于液体培养基中，22~26℃发酵培养168~288h；

（4）配制混菌发酵培养基：马铃薯去皮后切成约1cm³小块，玉米、黄豆粉碎至颗粒大小为100μm，培养基组成为10~20g/L淀粉、15~25g/L马铃薯、10~20g/L蔗糖、10~30g/L玉米、1~10g/L黄豆，加水配制；先将马铃薯、玉米、黄豆加水煮25min，再加入溶解好的淀粉和蔗糖，加水定容后灭菌；

（5）制备混菌发酵种子液：取金针菇、灵芝单菌发酵种子液，接种于混菌发酵培养基中，共酵培养液酸碱度pH 4.5~5.5，接种量配比为1:1~3:1，共计5%，22~26℃发酵培养144~240h；

（6）分离生物量：发酵液过滤收集菌丝，60℃烘干至质量恒定并称质量；

（7）胞外粗多糖提取与测定：发酵液过滤后离心取上清液，80~90 ℃水浴浓缩成原体积的0.2~0.25倍，加入4~5倍体积95%乙醇，4℃静置，浓缩液离心，用无水乙醇洗涤沉淀两次，烘干至恒重，得胞外粗多糖；

（8）胞内三萜类化合物的提取：取1 g菌丝加50 mL甲醇静置过夜后过滤，蒸干后加4 mL 95%乙醇溶解；

（9）胞外三萜类化合物的提取：取发酵液15mL，用3倍体积的水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇提取液，减压蒸干，加4mL 95%乙醇溶解。