CN101368205A

CN101368205A - 扬子鳄微卫星dna标记

Info

Publication number: CN101368205A
Application number: CNA2008101225539A
Authority: CN
Inventors: 吴孝兵; 朱海涛; 晏鹏
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Anhui Normal University
Priority date: 2008-05-31
Filing date: 2008-05-31
Publication date: 2009-02-18

Abstract

本发明公开了扬子鳄微卫星DNA标记，包括扬子鳄微卫星(CT/AG)_n、(AC/GT)_n、(GATA)_n富集文库的构建，微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，得到25个含有微卫星重复序列的克隆，确定了10个多态性丰富的微卫星标记Asiu1、Asiu2、Asiu4、Asiu20、Asiu44、Asiu45、Asiu84、Asiu96、Asiu122、Asiu234；本发明可应用于扬子鳄不同地理种群的遗传多样性研究以及亲权鉴定的研究，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。

Description

扬子鳄微卫星DNA标记

技术领域

本发明涉及一种分子标记技术，特别涉及一种扬子鳄微卫星DNA遗传标记。

背景技术

微卫星DNA又称为短串连重复序列(STR)、简单重复序列(SSR)、简单序列长度多态性(SSLP)，是指基因组中以1-6个核苷酸为单位串联重复组成的核苷酸序列；其中，最常见的是双核苷酸重复是(AC/TG)n、(AG/TC)n。不同的生物个体由于重复单元的重复次数不同而显示出多态性。研究表明，可能是DNA复制过程中的“链滑”(strand slippage)现象造成微卫星DNA多态性信息容量(polymorphic information content，PIC)较高。微卫星DNA的高突变性、共显性表达及其在真核生物基因组中的普遍性，使其成为种群遗传学研究、种质资源鉴定、亲缘关系分析和图谱构建的优越的分子标记，与等位酶、RAPD等方法相比也有一定的优越性。由于微卫星具有数量多、在基因组内分布均匀、多态性信息丰富、易于检测等优点被作为优良的遗传标记(genetic marker)而得到广泛应用。根据重复单元的构成与分布，微卫星DNA序列被分为三种类型：单一型(pure)，复合型(compound)，间断型(interrupted)，例如：

单一型：CACACACACACACACACACA

复合型：CACACACACACAGAGAGAGA

间断型：CACATTCACACATTCATTCA

扬子鳄，又称鼍，俗称猪婆龙、土龙，英文名Chinese alligator，拉丁文名(Alligator sinensis)，主要分布在长江中下游地区，是中国特有的一种鳄，亦是世界上体型最小的鳄品种之一。它既是古老的，又是现在生存数量非常稀少、世界上濒临灭绝的爬行动物。在扬子鳄身上，至今还可以找到早先恐龙类爬行动物的许多特征。因此，人们称扬子鳄为“活化石”。因此，扬子鳄对于人们研究古代爬行动物的兴衰和研究古地质学和生物的进化，都有重要意义。已有学者采用不同的分子标记技术(包括线粒体控制区、AFLP、RAPD等)对扬子鳄的遗传多样性进行研究，但是上述遗传标记不能提供足够的遗传信息，如Wang等，2003：D-loop sequence variation of mitochondrial DNA in captiveChinese alligator.Acta Genetic Sinica，30，425-430；Wu等，2002：Geneticvariation in captive population of Chinese alligator，Alligator sinensis，revealed by random amplified polymorphic DNA(RAPD).BiologicalConservation，106，435-441；Yan等，2006：AFLP analysis of geneticvariation on captive-bred Chinese alligators:an application to selectindividuals for release.Zoo Biology，25(6)，479-490。为了进一步解决扬子鳄的种群内遗传变异和种群间的遗传分化，需要开发新的分子遗传标记。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于：分离克隆扬子鳄微卫星DNA标记，建立扬子鳄微卫星DNA的技术体系并利用这些分子标记进行扬子鳄的分类、遗传关系的分析。

本发明解决技术问题的技术方案：扬子鳄微卫星DNA标记，包括扬子鳄微卫星(CT/AG)_n、(AC/GT)_n、(GATA)_n富集文库的构建，微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，得到25个含有微卫星重复序列的克隆，确定了10个多态性丰富的微卫星标记Asiu1、Asiu2、Asiu4、Asiu20、Asiu44、Asiu45、Asiu84、Asiu96、Asiu122、Asiu234；Asiu1为464个核苷酸、Asiu2为356个核苷酸、Asiu4为469个核苷酸、Asiu20为529个核苷酸、Asiu44为155个核苷酸、Asiu45为276个核苷酸、Asiu84为533个核苷酸、Asiu96为327个核苷酸、Asiu122为297个核苷酸、Asiu234为310个核苷酸。

附图说明

图1、Asiu44位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图

图2、Asiu45位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图

图3、Asiu122位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图

图4、Asiu234位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图

图5、Asiu96位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图

图6、Asiu2位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图

图7、Asiu1位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图

图8、Asiu4位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图

图9、Asiu20位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图

图10、Asiu84位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图

在图1—图10中，1—20分别代表1—20个扬子鳄。

具体实施方式

下面结合附图进一步详述本发明。

1：扬子鳄微卫星DNA富集文库的构建：

a)基因组DNA的消化与连接：参照Sambrook等(2002，Molecular Cloning，3nd 463—471)的方法提取扬子鳄基因组DNA，并用Bsp 143I(购自Fermentas公司)限制性内切酶进行消化。消化后的产物加入接头SauLA(5’-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3’)，SauLB(5’-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3’)，10×ligation Buffer，T4 DNA ligase(购自Promega公司)于PCR仪16℃连接过夜。

b)以SauLA为引物，以上述连接产物为模板，进行PCR反应，在2.0％琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下<1kb的片段，并用凝胶回收试剂盒(购自Axygen公司)进行回收。

c)以回收的DNA为模板，进行PCR扩增并对其进行纯化，(纯化试剂盒购自Axygen公司)。

d)寡核苷酸杂交：3种链霉素标记的特异性的寡核苷酸探针[(CA)₁₂，(AG)₁₂，(GATA)₆]与上述纯化后的DNA 68℃杂交过夜。

e)磁珠富集：将杂交液加入已平衡好的磁珠(购自Promega公司)中，25℃温育20min，并轻轻摇动。温育结束后，将离心管放置到磁力架上，去除溶液，分别用洗液I(6×SSC，0.1％SDS)，洗液II(3×SSC，0.1％SDS)，洗液III(6×SSC)清洗；用预热到65℃双蒸水重悬磁珠，小心吸出含微卫星重复序列的双链DNA上清液。

f)以上述双链DNA为模板，进行PCR扩增。

2、含有微卫星序列的阳性克隆的筛选、测序及微卫星引物的设计：按照Sambrook等(2002，Molecular Cloning，3nd，96—99，103—105)的方法进行微卫星DNA文库的克隆：包括菌种复状、扩大培养、制备感受态细胞、倒平板、连接pMD18-T载体(购自Takara公司)、热激转化(42℃)以及菌落PCR，具体为：

g)菌种复状：取4℃冰箱中保存的E.coli DH 5α，用牙签挑取一个单克隆，加入5ml LB液体培养基，37℃振荡培养过夜。

h)扩大培养：取1个250ml的锥形瓶加入50ml LB液体培养基，将培养过夜的菌液倒于锥形瓶中，37℃振荡培养2-3h，期间不断测OD₆₀₀，当OD₆₀₀达到0.3-0.4之间时将锥形瓶取出，立即冰浴15min，停止培养。

i)制备感受态细胞：取5ml菌液加到预冷的5ml EP管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃；4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；倒出培养液，将EP管倒置于滤纸上1min，流尽残留培养基；用预冷的0.1mol/L CaCl₂3ml悬浮细胞，立即水浴30min，用枪头将细胞轻轻打匀；重复步骤b、c；再用预冷的0.1mol/L CaCl₂200μl悬浮细胞，用枪头打匀，此细胞即为感受态细胞。

j)倒平板：将LB固体培养基完全融化，冷却至50~60℃，配成LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基(比例为：LB固体培养基1L；Amp青霉素100mg；IPTG 24mg；X-Gal40mg)，混合均匀后倒在1只培养皿里，待培养基凝固后，置于37℃烘箱，晾干水蒸气。

k)连接载体：反应体系(10μl)包括Solμtion I(购自Takara公司)5μl，pMD 18-T vector(Takara公司)0.5μl，PCR产物3μl，ddH₂O 1.5μl，16℃连接3.5h。

1)热激转化：10μl连接液与100μl感受态细胞混匀于0.2ml EP管，冰浴30min；放入42℃水浴锅中热激转化90s，结束后冰浴5min；将转化后的产物转移至1.5ml EP管中，加入400μl LB液体培养基中，37℃振荡培养2.5h；取50μl菌液均匀涂布于LB/Amp/X-Gal/IPTG固体平板培养基；平板在37℃正放培养1h，以便琼脂吸收液体，然后倒置平板过夜。

m)菌落PCR：牙签挑取培养皿上的262白色单菌落放入1.5ml EP管，每个EP管加入LB液体培养基1ml，Amp青霉素0.1mg，37℃振荡培养至菌液混浊。PCR反应体系(25μl)包括10×PCR Buffer 3μl，dNTP Mix 5pmol，MgCl₂5pmol，M13上下游引物各10pmol(M13F：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’，M13R：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’)，菌液1μl，Taq DNA聚合酶1u(购自上海生工)，ddH₂O 14μl。反应程序：95℃预变性5min，以下31个循环，95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，最后72℃延伸10min，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

n)对阳性克隆测序，得到25个序列微卫星重复，根据侧翼序列设计25对卫星引物，同时对上游引物5’端分别FAM、HEX、TE进行标记。

3、利用扬子鳄微卫星DNA标记用于20个扬子鳄品种的分类，确定了10个多态性丰富的微卫星标记Asiul、Asiu2、Asiu4、Asiu20、Asiu44、Asiu45、Asiu84、Asiu96、Asiu122、Asiu234。Asiul为464个核苷酸、Asiu2为356个核苷酸、Asiu4为469个核苷酸、Asiu20为529个核苷酸、Asiu44为155个核苷酸、Asiu45为276个核苷酸、Asiu84为533个核苷酸、Asiu96为327个核苷酸、Asiu122为297个核苷酸、Asiu234为310个核苷酸。

o)参照Sambrook等(2002，Molecular Cloning，3nd，463—471)的方法提取20个扬子鳄基因组DNA。

p)分别用Asiu1、Asiu2、Asiu4、Asiu20、Asiu44、Asiu45、Asiu84、Asiu96、Asiu122、Asiu234 10个位点的10对引物，(引物序列见表1)使用PCR仪(PTC-200)扩增这20个扬子鳄的基因组DNA。

q)将PCR产物经ABI 377遗传分析仪(Applied Biosystem公司)进行基因分型(Genotyping)，使用Genotype 2.1软件(Applied Biosystem公司)判读等位基因片段的具体数值。

r)结果分析：使用Cervus3.0软件(Kalinowski等，2007：Revising how thecomputer program CERVUS accommodates genotyping error increases successin paternity assignment.Molecular Ecology，16，1099-1106.)计算期望杂合度和观察杂合度，使用Genepop3.4软件(Raymond和Rousset，1995：GENEPOP(version 1.2)：population genetics software for exact tests andecumenicism.Journal of Heredity，86，248-249.)计算哈代-温伯格以及连锁不平衡的值；以此来描述10个扬子鳄微卫星DNA多态位点的特征。

由附图1—10可看出，本发明的10个微卫星序列长度在供试的20个扬子鳄中都出现了多样性，由此可见，本发明的这10个微卫星标记能够用于扬子鳄的品种分类和遗传关系分析。

本发明提供了10个扬子鳄的新的微卫星位点及扩增这10个微卫星位点的引物序列和扩增方法，可应用于扬子鳄不同地理种群的遗传多样性研究以及亲权鉴定的研究，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。

表1引物特性表：位点，重复基序，引物序列，Mg²⁺，褪火温度。

位点	重复基序	引物序列(5’-3’)	Mg²⁺浓度	褪火温度
位点	重复基序	引物序列(5’-3’)	Mg²⁺浓度	褪火温度	Asiu1	(TG)₃₃	F：CTCTCCCCAAGGCAGTGCATATT*R：AGATGTCCGTTTCCCCCGCCTC	1.5mM	62℃
Asiu2	(TG)₁₅	F：CAGACCCTTGGAGAAAC*R：AGCTAACTGATCTGTGTA	1.5mM	55℃	Asiu1	(TG)₃₃	F：CTCTCCCCAAGGCAGTGCATATT*R：AGATGTCCGTTTCCCCCGCCTC	1.5mM	62℃
Asiu2	(TG)₁₅	F：CAGACCCTTGGAGAAAC*R：AGCTAACTGATCTGTGTA	1.5mM	55℃	Asiu4	(GA)₂GG(GA)₁₀A(AG)4	F：TCAGTTACAGGGTGGAGT*R：TGGGATACAAGGTGCTA	1.5mM	53℃
Asiu20	(TG)₂₂	F：GGCTCTGTCCCTGCTCAA*R：CTGCTCTTTCAGCTGTGGTC	1.5mM	61℃	Asiu4	(GA)₂GG(GA)₁₀A(AG)4	F：TCAGTTACAGGGTGGAGT*R：TGGGATACAAGGTGCTA	1.5mM	53℃
Asiu20	(TG)₂₂	F：GGCTCTGTCCCTGCTCAA*R：CTGCTCTTTCAGCTGTGGTC	1.5mM	61℃	Asiu44	(CA)₆ATG(AT)₂(CTAT)₅(AT)₃(GT)₁₀N₁₁(CA)₄T(ACC)₂	F：GGATCGCTCATTCATATAC*R：CACCCAACTTAGGAACTCACC	1.5mM	60℃
Asiu45	(AAAC)₂A(AC)₁₆	F：CCGGGTCTGGTTTGAAGCA*R：GGGCTAGAGTCCTTTGTG	2.0mM	55℃	Asiu44	(CA)₆ATG(AT)₂(CTAT)₅(AT)₃(GT)₁₀N₁₁(CA)₄T(ACC)₂	F：GGATCGCTCATTCATATAC*R：CACCCAACTTAGGAACTCACC	1.5mM	60℃
Asiu45	(AAAC)₂A(AC)₁₆	F：CCGGGTCTGGTTTGAAGCA*R：GGGCTAGAGTCCTTTGTG	2.0mM	55℃	Asiu84	(GT)₈	F：GTCGGATACATTGGCAGC*	1.5	57℃

		R：CTGTTTTGTGAGGGACC	mM
		R：CTGTTTTGTGAGGGACC	mM		Asiu96	(GA)₂₁	F：GTTCCTCTTTACCATTC*R：GCTAAGGCAAGTCATTCTC	1.8mM	55℃
Asiu122	(AC)₁₂	F：TCACTAATGTGCATGGATATGG*R：ATCCTCCTTATCTCTCTG	1.5mM	60℃	Asiu96	(GA)₂₁	F：GTTCCTCTTTACCATTC*R：GCTAAGGCAAGTCATTCTC	1.8mM	55℃
Asiu122	(AC)₁₂	F：TCACTAATGTGCATGGATATGG*R：ATCCTCCTTATCTCTCTG	1.5mM	60℃	Asiu234	(CA)₈	F：ACAGGGGAGATGGTGAC*R：TGGACTCTCTCTCTTGT	1.8mM	55℃

表1中F表示5’端引物，R表示3’端引物，*表示荧光修饰。

序列表

<110>安徽师范大学

<120>扬子鳄微卫星DNA标记

<160>10

<170>PatentIn Version 3.3

<210>1

<211>155

<212>DNA

<213>扬子鳄(Alligator sinensis)

<400>1

<210>2

<211>276

<212>DNA

<213>扬子鳄(Alligator sinensis)

<400>2

<210>3

<211>297

<212>DNA

<213>扬子鳄(Alligator sinensis)

<400>3

<210>4

<211>310

<212>DNA

<213>扬子鳄(Alligator sinensis)

<400>4

<210>5

<211>327

<212>DNA

<213>扬子鳄(Alligator sinensis)

<400>5

<210>6

<211>356

<212>DNA

<213>扬子鳄(Alligator sinensis)

<400>6

<210>7

<211>464

<212>DNA

<213>扬子鳄(Alligator sinensis)

<400>7

<210>8

<211>469

<212>DNA

<213>扬子鳄(Alligator sinensis)

<400>8

<210>9

<211>529

<212>DNA

<213>扬子鳄(Alligator sinensis)

<400>9

<210>10

<211>533

<212>DNA

<213>扬子鳄(Alligator sinensis)

<400>10

Claims

1.扬子鳄微卫星DNA标记，其特征在于：所述的微卫星标记编号分别为：Asiu1、Asiu2、Asiu4、Asiu20、Asiu44、Asiu45、Asiu84、Asiu96、Asiu122、Asiu234，

其核苷酸序列为：

Asiu44：

ggatcgctca ttcatatacc acacacacac aatgatatct atctatctat ctatctatat 60

atatgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtattcac taattcacac acataccacc cacctacagt 120

tatacatagg tgagttccta agttgggtgt tgtga 155

Asiu45：

tcctgaccac agcagctaag aaactgtgac aagggcaggg cttagatggg ccgggtctgg 60

tttgaagcat gtcccttaat cctcaattta aaataaacaa acaacacaca cacacacaca 120

cacacacaca cacacccttc acaaaggact ctagcccttt acagctcttc ctggctgaat 180

atctgatccc tgctacacct agatgcctca tgcctgggcc aaatccccat ccggtgcaga 240

ccagtattgt tcccccaaag tcagcagagc tatgca 276

Asiu122：

tcactaatgt gcatggatat ggatacacac acacacacac acacacaccc agggttgagg 60

gggtaagggt tagaatgcca gagagataag gaggatagga caagaaaaga gcaacatgtc 120

acatcagtgc taggcattat cctggaattg gatacatggc accttccatt cactcctcct 180

actatatttt gttgatgggg taccatgcaa cttggttgca tgtcatggac caactcaaga 240

atctggagcc acccacccta catggaaaca cgtacctgag ttgcaacaga gtctgtt 297

Asiu234：

gatcagaatt tatgatgggg aagggaccag ggctcagtaa catacaaccc aactcagagt 60

tacaaatgac ggtggtttta ttgaacaggg gagatggtga cacaatatct tattggttcc 120

ttcacacaca cacacacact ggcagtaggg gttaaagaga cttggtgcag gggctaaagt 180

ctgggacaag agagagagtc caaattggag gaggaaatgt gcaggtgata tctacctatc 240

ccatgctgga agttggtcct cgatggccag tcagggtctc cttcagctca gtgttgtcca 300

gaggggatcg 310

Asiu96：

aacaccaccc cttgaaagca gccatccctc agggagcaac tctgtaggcc aaaggttcct 60

ctttaccatt caacctcaag ccctgggtgc cattcaagct gagagagaga gagagagaga 120

gagagagaga gagagagaga gacctttcgg tagggaaagg agaatgactt gccttagcat 180

catgcttttc ccccctacag ctggacgata ccaccccttg aaagcggcca cccctcatgg 240

agcacttctg taggacaaag aacagtgtgg ctccactggg tgaccattgg tcgaagcttg 300

gggtctctgg ccaatctcta gaggatc 327

Asiu2：

ggtcatgagt tatcttatca tcgctctgtg gattgttgca tattccactg ctcattaacc 60

agggtgctaa cacttccctt agcaagtcac ctatttggag ggaagggtgt tggggagggg 120

tgagtcctga gatgccttta agaaactggt agctagcaag ttctgggtaa ccttcagacc 180

cttggagaaa cagggtgaag gaagggaaac agcacacagc ccagttctct gagaaggaaa 240

ggctttgagg aaactgctgc catgcgctac tccccttctc ttaatccgat gggaaaactg 300

agcacatctg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgta cacagatcag ttagct 356

Asiu1

tttgcagagg ttgcttgggt cctcatcttg aggagcaggg attaatcatt cagtgacact 60

gcaattacta tccgatggta gggcatttat ttggcattta acatgtcatt agagcaaata 120

actgtttctc tccccaaggc agtgcatatt gcaggaggcc aagctttgac ctggtggaag 180

attgcgcagt ggagctgccc cgtggcagca gcccttggtt cagcgacgtg caaagcttgc 240

tctagaaacc gtggagggtc tcagctgggc acggcgcctc cgctcgcacg gggagctctg 300

ccctgtgttg agcccaggga gcttctggtg tggatccctg agctgcttgg aaatgctctg 360

caaagcagga gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 420

gtgtgtgtgt gtgtgtacgg ggaggcgggg gaaacggaca tctt 464

Asiu4：

tagataagtt taaccctaag caaaaaaaga gtatctctta gtattttaga agacacacta 60

ctggttcaac aaccactagc tttggctagg aattaattga caaaacaaat tttattagaa 120

aagcatgact cgtcagatct taaacatgcc cgttgaaagc attccaaact tttctgtaag 180

aacttctcag ttacagggtg gagtcataat cagagagacc ccaccaaact atagacttga 240

aaacttaggt tcaagacctt gtttgaatgg atatttaatt atttattcaa agtacagtag 300

ctcaagcaga acatgagagg gagagagaga gagagagaga aagagagagt catacttaat 360

agtcctggtt cagccatcac ttgagttggg gtaaatagca ccttgtatcc caattgaagg 420

tatcctaacc accagggcta agtacagaca gctaaaaagc ctgaagctg 469

Asiu20

gagggcagac acagggctct gtccctgctc aatcccaccc ctgccccatt gttcttgaca 60

ggcgtttggc atgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtacgc 120

gcgtgcatgc gctttggcta ttgcatctct atatattcag agactttaac tgggtttgat 180

aaccacatat acttttatta acaataacta gaccacagct gaaagagcag ccttgatgtt 240

acctattcat tttaagggct ttgttgcatg ttacccttag gacctgctaa aggcagttaa 300

atcacaagtg catgacggcc gtcatgcagg taaaggttct tctcgttttt tttttttctt 360

tcatacatgg tccctgccct aggagccccc agggtgtgtt tcggggctct ttcctctgat 420

tgcccctggg acacagctgc accgggctcc agagcccagt catcagctct gtgccaggag 480

aagggaagag gccggggttg cactgcctcg ggcccctccc ccaccgtcc 529

Asiu84：

atatgggcgg cccttctctg gactcgcttg agcttttaaa aagtcagatg cttctggatt 60

catatcttgg ctgatatcta tattttacca tcctgtgctg tagaactcgg ttggccacct 120

tgaaagaggg cagagactag aatgagcgtg gagactgctc ttccccttca gggttgcaag 180

tggatatagt cggatacatt ggcagcagca atgccaagga tttgtatagc gtgaccctac 240

tgtggcttct caggagggaa tccacaattc caaaaaagtg ctgccgcttc agctcaagtg 300

gcgaagactt tgtgcttgct caggtttgaa ggctctggac ttgttcctag tgtgtgtgtg 360

tgtgtgcaat tacagggagt tgtggtccct cacaaaacag tcccttggag gacatgaact 420

ctggtggacc ccggaagttt gggctgagct tgtctaatga ggggaatatg tgatttgttg 480

aattaatatg tgcgattcga agcttggggt ctctggccaa tctctagagg atc 533

2.根据权利要求1所述的扬子鳄微卫星DNA多态位点，其特征在于所述的Asiu1、Asiu2、Asiu4、Asiu20、Asiu44、Asiu45、Asiu84、Asiu96、Asiu122、Asiu234十个位点的引物序列为：

Asiu1F：CTCTCCCCAAGGCAGTGCATATT

Asiu1R：AGATGTCCGTTTCCCCCGCCTC

Asiu2F：CAGACCCTTGGAGAAAC

Asiu2R：AGCTAACTGATCTGTGTA

Asiu4F：TCAGTTACAGGGTGGAGT

Asiu4R：TGGGATACAAGGTGCTA

Asiu20F：GGCTCTGTCCCTGCTCAA

Asiu20R：CTGCTCTTTCAGCTGTGGTC

Asiu44F：GGATCGCTCATTCATATAC

Asiu44R：CACCCAACTTAGGAACTCACC

Asiu45F：CCGGGTCTGGTTTGAAGCA

Asiu45R：GGGCTAGAGTCCTTTGTG

Asiu84F：GTCGGATACATTGGCAGC

Asiu84R：CTGTTTTGTGAGGGACC

Asiu96F：GTTCCTCTTTACCATTC

Asiu96R：GCTAAGGCAAGTCATTCTC

Asiu122F：TCACTAATGTGCATGGATATGG

Asiu122R：ATCCTCCTTATCTCTCTG

Asiu234F：ACAGGGGAGATGGTGAC

Asiu234R：TGGACTCTCTCTCTTGT。