CN110499380B - 一种检测黄杆菌的引物对和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测黄杆菌的引物对和检测方法，属于生物技术及海洋科学技术领域，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。在本发明中，所述引物对根据SNP位点再结合扩展性SAP方法设计得到引物对，所述引物对对黄杆菌具有特异性，进一步利用本发明提供的检测方法能够定量检测样本中的黄杆菌。

Description

一种检测黄杆菌的引物对和检测方法

技术领域

本发明属于生物技术及海洋科学技术领域，尤其涉及一种检测黄杆菌的引物对和检测方法。

背景技术

海洋作为地球上巨大的资源宝库，含有数量极大的微型生物，这些生物是海洋生物量的主宰者，它们小则影响局部环境，大则影响全球变化。在海洋微生物中，有一个重要的科Flavobacteriaceae(黄杆菌科)，是Bacteroidetes(拟杆菌门)即CFB(Cytophaga-Flexibacter-Bacteroidetes)类群的一个分支。CFB类群在代谢浮游植物有机质方面起着重要的作用，CFB这类细菌形态多样，一般具有较强的运动性和粘附性，能附着在大颗粒物质上生存，可以降解一般细菌难以利用的大分子有机质，从而削弱了基于浮游植物的生物泵过程，促进海洋微生物碳泵的过程。由于其具有运动性和粘附性，在船及水下设施早期生物膜中发现大量黄杆菌。海洋早期生物膜中各种微生物的含量及动态变化过程对污损生物的附着有着一定的影响。因此在海洋污损研究过程中，对船及水下设施表面附着的早期生物膜中黄杆菌的研究对污损生物附着机制及规律的解决有重要意义。随着分子生物学的发展，由于16S rRNA基因在物种进化过程中具备高度保守性，人们积极利用16S rRNA基因来确定微生物门纲目种属等分类学信息。

分子标记种类有很多，第一代分子标记以限制性片段长度多态性(RFLP)为代表，是基于酶切位点多态性开发的分子标记。第二代分子标记以简单重复序列分析(SSR)为代表，是基于简单重复序列的多态性。第二代分子标记通过引物的特殊设计，能够扩增DNA上相应位置的序列，根据它们的多态性，进行下一步分析。第三代分子标记以单核苷酸多态性(SNP)为代表，是基于高通量测序为基础的新一代分子标记技术。SNP(single nucleotidepolymorphism)标记作为第三代分子标记，在分子遗传学、药物遗传学、法医学以及疾病的诊断和治疗等方面发挥着重要作用。与RFLP相比，SNP重复数目变化很大，能揭示比RFLP高得多的多态性。其信息量大，有利于大数据量的分析。SNP自身的特性决定了它更适合于对复杂性状与疾病的遗传解剖以及基于环境群体的基因水平上的多样性研究等，不同微生物种群的保守区域不同，其扩增产物在长度上就表现出差别。在以往的研究中，这两种技术常被用于人类疾病研究、植物、真菌多样性，SNP自身的特性决定了它们更适合于对复杂性状与疾病的遗传解剖以及基于环境群体的基因水平上的多样性研究等，不同微生物种群的保守区域不同，其扩增产物在长度上就表现出差别。在以往的研究中，这两种技术常被用于人类疾病研究、植物、真菌多样性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测黄杆菌的引物对和和检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种检测黄杆菌的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

本发明还提供了一种定量检测黄杆菌的方法，包括：

提取样本的宏基因组DNA，以所述宏基因组DNA为模版利用上述技术方案所述的引物对进行QPCR，得到扩增产物；利用以下公式计算黄杆菌的拷贝量：

DNA(copy/mL)＝[6.02×1023(copy·mol^-1)×C(ng·μL^-1)×10^-3]/[L(bp)×660(Dalton·bp^-1)]；

其中，C为扩增产物中DNA的浓度，L为扩增产物中DNA的的长度。

优选的，所述QPCR使用的体系每12μl包括：2×NPK62 Buffer 6μl，引物1.5μl，宏基因组DNA 4.25μl，Taq酶0.25μl。

优选的，所述引物中上游引物的浓度为2μM。

优选的，所述引物中下游引物的浓度为2μM。

优选的，所述QPCR的扩增程序包括：95℃4min；95℃30s，60℃40s，72℃40s，42cycles；72℃2min。

优选的，所述样本包括海洋生物膜。

本发明提供了一种检测黄杆菌的引物对和检测方法，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。在本发明中，所述引物对根据SNP位点再结合扩展性SAP方法设计得到引物对，所述引物对对黄杆菌具有特异性，进一步利用本发明提供的检测方法能够定量检测样本中的黄杆菌。

附图说明

图1为目标黄杆菌属序列的普通PCR验证结果，1：Marker B(上海生工)；2：Fl的PCR产物；

图2为引物QPCR实验的熔解曲线；

图3为两类涂层(铁红防锈漆和丙烯酸酯分别做成膜物)表面海洋生物膜样本中黄杆菌的QPCR定量结果，纵轴上面7个涂层的藤壶附着量较少(数字代表纳米材料编号)；纵轴下面7个涂层的藤壶附着量较多；中间两个为未加纳米材料的阴性对照；横轴代表测定的黄杆菌目标序列的拷贝数(浓度)。

具体实施方式

本发明提供了一种检测黄杆菌的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

在本发明中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下所示：

5'CCTTTGATACTGGTTGACTTGAGTAATABG3'，所述B为G或T或C。

在本发明中，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下所示：

5'GCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTT3'。

在本发明中，所述引物对根据黄杆菌16S rRNA的SNP位点再结合扩展性SAP方法设计得到，TGAGTAATACGGAAGTAGATA，序列中下划线为SNP位点。

本发明还提供了一种定量检测黄杆菌的方法，包括：

提取样本的宏基因组DNA，以所述宏基因组DNA为模版利用上述技术方案所述的引物对进行QPCR，得到扩增产物；利用以下公式计算黄杆菌的拷贝量：

DNA(copy/mL)＝[6.02×1023(copy·mol^-1)×C(ng·μL^-1)×10^-3]/[L(bp)×660(Dalton·bp^-1)]；

其中，C为扩增产物中DNA的浓度，L为扩增产物中DNA的长度。

在本发明中，所述样本优选包括海洋生物膜，本发明对所述海洋生物膜的获取方法没有特殊限定，采用常规获取海洋生物膜的方法即可。本发明对提取海洋生物膜的宏基因组DNA的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。

在本发明中，所述QPCR使用的体系优选每12μl包括：2×NPK62 Buffer6μl，引物1.5μl，宏基因组DNA 4.25μl，Taq酶0.25μl。在本发明中，所述引物中上游引物的浓度优选为2μM，所述引物中下游引物的浓度优选为2μM。

在本发明中，所述QPCR的扩增程序优选包括：95℃4min；95℃30s，60℃40s，72℃40s，42cycles；72℃2min。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

使用MAFFT对海洋生物膜微生物菌群中含量最高的28个属(表1)的16S rRNA全长基因序列和从Genbank数据库搜索得到的200条黄杆菌属的16S rRNA(有些是全长)基因序列进行比对，选出各自的代表性序列。通过使用MAFFT多序列比对工具，对黄杆菌属代表序列与海洋生物膜菌群各属代表性序列共2+30x2＝62条序列进行比对，初步找出了黄杆菌的SNP位点。之后对SNP位点进行黄杆菌属内可行性验证和属外可行性验证，找出了一个效果最好的SNP位点，位点TGAGTAATACGGAAGTAGATA(SEQ ID No.3)的同属代表性是99.5％和他属代表性是99.6％，根据这一SNP位点设计引物，具体序列和扩增子信息见表2。

表1实施例1中属代表序列选取结果

表2实施例中的两引物信息

实施例2

黄杆菌属微生物特异性引物对的验证

将实施例1设计好的两对引物进行PCR扩增实验，PCR反应体系(12μL)为：NPK02buffer(2×)(威海晓东生物)6μL，物种特异性引物1.5μL(同时包含上下游引物，浓度均为2μM)，模板1μL(海洋生物膜样本提取的宏基因组DNA作为模板DNA)，Taq酶0.25μL，dd H₂O3.25μL。

PCR反应循环参数：94℃3min，[94℃30s，60℃30s，72℃1min，37cycles]，72℃2min。

琼脂糖凝胶电泳：1％的琼脂糖凝胶，Marker B 4μL，扩增产物12μL+上样缓冲液3μL，缓冲液中加入适量EB。电压在110V，电流在40mA以上，每隔20min观察一次，约40min停止电泳。

通过凝胶成像仪观察引物的特异性，其电泳结果如图1所示，电泳条带基本与预测大小一致，表明所设计的特异性引物对具有对黄杆菌的特异性。将上述PCR扩增产物纯化送出测序得到序列，测序结果如表3所示。将表1序列在NCBI中进行BLAST验证，查找其相似序列，结果均为目标序列。

表3实施例中PCR产物单向测序结果

实施例3

海洋生物膜样本中黄杆菌的QPCR

海洋实地挂板实验，每周取样32个，连续取5次，共计160个海洋生物膜样本。利用Ezup柱式基因组提取试剂盒(B518251,上海生工)提取海洋生物膜样本中的宏基因组。从160个宏基因组DNA样本中随机取出10个样本，各取5微升灯亮混合得到一个混合宏基因组DNA，以此为模板使用Fl-f/Fl-r(SEQ ID No1～2)引物扩增制备QPCR的标准DNA，跑胶检测纯度并对扩增产物进行定量作为标准原液。使用Fl-f/Fl-r引物对对提取的基因组进行QPCR。QPCR总反应体系(12μL)为：2×NPK62 Buffer(威海晓东生物)6μL，引物(上下游各自终浓度为2μM)1.5μL，生物膜宏基因组DNA模板4.25μL，Taq酶0.25μL。QPCR反应条件为：Q-PCR反应程序是95℃4min，[95℃30s，60℃40s，72℃40s，42cycles]，72℃2min。QPCR熔接曲线见图2。QPCR的熔解曲线是衡量引物特异性的一个重要指标。本实施例的熔解曲线是一个主峰下有很多熔点非常接近的次峰。这是因为扩增出来的是一组大小和熔点都非常接近的DNA片段。图2显示了两对引物的质量尚可的熔解曲线。QPCR定量计算结果见图3。

由此可以得出，采用本发明提供的引物对再接合检测方法能够实现对海洋生物膜中的黄杆菌进行定量检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 哈尔滨工业大学（威海）

<120> 一种检测黄杆菌的引物对和检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctttgatac tggttgactt gagtaatabg 30

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcccccgtca attcctttga gttt 24

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgagtaatac ggaagtagat a 21

<210> 4

<211> 271

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtgatgatg tgtagtgtag cggtgaatgc atagatatta ctcagaatac cgattgcgaa 60

ggcagtctac tacgtatata ctgacgctca tggacgaaag cgtggggagc gaacaggatt 120

agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tggatactag ttgttgggat ttatctcagt 180

gactaagcga aagtgataag tgtcccacct ggggagtacg gtcgcaagat tgaaactcaa 240

aggaatggac gggggcaggt tcattccaaa g 271

Claims (6)

1.引物对在制备对海洋生物膜中的黄杆菌属进行定量检测的试剂中的应用，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种非疾病诊断目的的定量检测海洋生物膜中的黄杆菌属的方法，其特征在于，用于对船及水下设施表面附着的早期生物膜中黄杆菌属的定量检测，包括：

提取样本的宏基因组DNA，以所述宏基因组DNA为模板利用权利要求1所述应用中的引物对进行QPCR，得到扩增产物；利用以下公式计算黄杆菌属的拷贝量：

DNA(copy/mL)=[6.02×10²³(copy·mol^-1)×C(ng·μL^-1)×10^-3]/[L(bp)×660(Dalton·bp^-1)]；

其中，C为扩增产物中DNA的浓度，L为扩增产物中DNA的长度。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述QPCR使用的体系每12μl包括：2×NPK62 Buffer 6 µl，引物对1.5 µl，宏基因组DNA 4.25 µl，Taq酶0.25 µl。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物对中上游引物的浓度为2 µM。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物对中下游引物的浓度为2 µM。

6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述QPCR的扩增程序包括：95℃ 4min；95℃ 30 s，60℃ 40 s，72℃ 40s，42 cycles；72℃ 2 min。

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