CN101346061A

CN101346061A - 来自水稻的启动子序列及其应用方法

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Publication number: CN101346061A
Application number: CNA2006800486973A
Authority: CN
Inventors: 艾伦·G·戈德; 玛丽·迪堡; 阿莎克·K·施瓦特
Original assignee: Arcadia Biosciences Inc
Current assignee: Arcadia Biosciences Inc
Priority date: 2005-12-23
Filing date: 2006-12-21
Publication date: 2009-01-14
Anticipated expiration: 2026-12-21
Also published as: EP1968372B1; US20070157337A1; US7982093B2; DK1968372T3; US7560626B2; ZA200804960B; CA2633517A1; BRPI0620315A2; CA2633517C; CN101346061B; AU2006331544A1; WO2007075925A2; US20090288224A1; AR058863A1; EP1968372A2; PL1968372T3; BRPI0620315B1; ATE544862T1; WO2007075925A3; AU2006331544B2

Abstract

采用本发明提供的方法，水稻植物和它的种子可以被修饰通过可操作连接到编码区的启动子序列来表达目的编码区。其中的启动子序列是一个含有SEQ ID NO：1的离体水稻遗蛋白(OsAnt1)启动子序列。其中的目的编码区可编码一个氮利用蛋白，如丙氨酸氨基转移酶。本发明还指出开发水稻植物的这些方法可增加水稻植物的生物量和种子量。此外，产生的水稻植物可保持一个可观的生产量，同时减少了高水平氮利用的需要。

Description

来自水稻的启动子序列及其应用方法

技术领域

本发明涉及到来自水稻的启动子序列，这个启动子序列的应用方法和含有这个启动子序列的植物。

背景技术

农作物具有对无机氮肥料的依赖性，无机氮主要是以硝酸盐，铵盐的形式存在。每年，全世界范围内约有85～90MMt含氮肥料加入到土壤中。这个数量一直在上涨，1930年为1.3MMt，1960年为10.2MMt。到2050年，预计会增加到240MMt(Tilman et al.，1999，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.96：5995-6000).估计约有利用的氮50％到70％从植物的土壤中流失。因为NO₃ ^-是可溶的，而且不能在土壤基质中保留，过剩的NO₃ ^-经水浸出后可由微生物利用。

改善农作物氮利用率是很重要的，原因有两个。第一，商品肥料的应用说明了其中主要消耗与高产农作物的生产有关。第二，减少氮肥料在生态系统中的流失对环境有益处。对环境影响包括土壤质量的恶化，污染和卫生公害。

丙氨酸是植物中一个很普遍的氨基酸。丙氨酸由可逆反应中来自丙酮酸盐和谷氨酸盐的丙氨酸氨基转移酶催化合成的，如图1所示。丙氨酸是一种可以在其它特定环境条件下增加的氨基酸，如在干旱和缺氧的情况下(Muench and Good，1994，Plant Mol.Biol.24：417-427；Vanlerberge etal.，1993，Plant Physiol.95：655-658)。丙氨酸浓度在厌氧状态下的根组织部分大量的增加。例如，在厌氧状态下24h后，丙氨酸浓度在大麦根部增加了20倍。在稷中，丙氨酸氨基转移酶基因是经光照诱导，植物由缺氮状态恢复(Son et al.，1992，Arch.Biochem.Biophys.289：262-266).Vanlerberge等人(1993)指出在缺氮厌氧的藻类中，以氨水形式添加的氮有93％的N15标记直接并入丙氨酸中。因此，丙氨酸是植物应激反应中一个重要的氨基酸。

US 6,084,153指出了芸苔植物根部丙氨酸氨基转移酶的诱导作用，产生了氮的有效表现型。

WO 01/55433指出了芸苔细胞组织膨胀基因-26(btg26)的应用。细胞组织膨胀基因-26蛋白最近被命名为遗蛋白。(Tang et al.，2002，FEBSLett.516(1-3)：183-186).油菜由含有可操作连接btg26启动子的丙氨酸氨基转移酶基因的构造转化。转基因植物在根组织具有隆起的现象。

US2005/0044585显示出启动子LeAMT1，LeNRT1，GmNRT2，KDC1，PHT1，GOGAT，OsRAB5和ALF5的应用，这些启动子的基因表达具有对根的专一性，该表达为编码氮利用蛋白如，丙氨酸氨基转移酶，的基因表达。

水稻中氮利用率的增加在技术中是期望得到的。2006年，世界范围的种植水稻的栽培面积为151,730,000公顷，氮消耗估计为11,963MMt。因此，水稻中氮利用率的改进不仅仅减少植物生产的成本，而且可以减少氮肥料对于环境的有害影响，包括由过量氮流失引起的大量藻类的死亡和分解，导致世界上海洋死区的扩大。

发明内容

本发明的目的是提供一种来自于水稻的启动子序列，该启动子序列的应用方法和含有这些启动子序列的植物。

在一个实施例中，本发明提供了一种方法，通过该方法水稻被修饰来表达靶基因或采用可操作连接到编码区的一个启动子序列的目的编码区。在另一个实施例中，本发明也提供了增加生物量和种子量的水稻植物的生产方法。通过增加生物量和种子量，获得的水稻对环境有益处，可以维持一个可观的产量，同时减少了对高浓度氮的需求。

离体的的水稻遗蛋白(OsAnt1)启动子序列包含有SEQID NO：1和它的活性片段。

本发明还提供了一个基因构造，这个基因构造含有一个OsAnt1启动子序列，这个启动子序列含有SEQ ID NO：和编码靶蛋白的可操作连接目的编码区的活性片段。这个靶蛋白可以是氮利用蛋白，例如丙氨酸氨基转移酶。

本发明提供了一个载体，它含有一个带有OsAnt1启动子序列的基因构造，这个启动子序列含有SEQ ID NO：1和编码靶蛋白的可操作连接目的编码区的活性片段。这个靶蛋白可以是氮利用蛋白，例如丙氨酸氨基转移酶。

本发明描述了水稻植物中靶基因表达的方法。该方法包括接触和引入一个水稻植物的靶基因，这个靶基因可操作连接到OsAnt1启动子序列，含有SEQ ID NO：1和它的活性片段，最后表达靶基因。这个靶基因可以编码一个氮利用蛋白，如丙氨酸氨基转移酶。此外，靶基因的表达可以靶向一个目的组织，例如，植物的根部。

本发明还描述了一种增加水稻植物生物量的方法，该方法包括接触和引入一个水稻植物的靶基因，这个靶基因可操作连接到OsAnt1启动子序列，含有SEQ ID NO：1和它的活性片段，最后表达靶基因。这个靶基因可以编码一个氮利用蛋白，如丙氨酸氨基转移酶。此外，靶基因的表达可以靶向一个目的组织，例如，植物的根部。

本发明描述了一个增加水稻种子量的方法。该方法包括接触和引入一个水稻植物的靶基因，这个靶基因可操作连接到OsAnt1启动子序列，含有SEQ ID NO：1和它的活性片段，最后表达靶基因。这个靶基因可以编码氮利用蛋白，如丙氨酸氨基转移酶。此外，靶基因蛋白的表达可以靶向一个目的组织，例如，植物的根部。

此外，本发明还描述了一个转化的水稻植物，它含有一个可操作连接到OsAnt1启动子序列靶基因，这个靶基因含有SEQ ID NO：1和它的活性段。这个靶基因可以编码氮利用蛋白，如丙氨酸氨基转移酶。

本发明描述了一个水稻种子，它含有一个可操作连接到OsAnt1启动子序列靶基因，这个靶基因含有SEQ ID NO：1和它的活性段。这个靶基因可以编码氮利用蛋白，如丙氨酸氨基转移酶。

本发明描述了由水稻获得的启动子序列，采用启动子序列的方法，一种水稻植物和含有启动子序列的水稻植物的一部分。

下面的说明是优选的实施例。

描述了水稻植物中命令目的编码区表达的启动子序列。这个启动子序列由含有SEQ ID NO：1和它的活性片段的水稻的遗蛋白启动子序列(OsAnt1)分离。

“目的编码区”包括在一个或多个植物组织中期望表达的任何基因。可在所描述的方法中利用的目的编码区的例子，包括编码一个或多个有关氮素同化，氮源利用或它们的一个组合的蛋白的核酸序列。其它例子可以是编码一个或多个有关氮摄取和利用的蛋白核酸序列。

“启动子”指的是一个DNA分子序列，这个序列可命令下游基因转录，它可操作连接或当融合了一个目的基因后，被引入一个细胞，这就使得该基因能高水平的表达。其中的启动子可以是全长启动子也可以是一个片段。“活性片段”指的是它最少是参考启动子活性的0.1％，10％更好，最好为25％，其中的启动子活性的测定是经技术中技工熟知的检测启动子活性的方法测试的，例如GUS报道基因水平的测定。DNA序列必须是有活性的，可通过合成不同片段和测试其表达或在某一区域引入点突变来测试它损失活性的方法来鉴别DNA的活性。启动子的异源片段或其它启动子序列可以结合进来，以介导启动子序列的活性。例如，CaMV 35S启动子或其它已知启动子序列可和此处描述的启动子结合起来，以介导目的编码区的表达。

此处描述的基因构造可包含所必须的翻译或转录的增强子。这些增强子区域对于技术中的技工是熟知的，它含有ATG起始密码子和毗邻顺序。这个起始密码子与编码序列的读码框是同相的，以确保整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可来自于许多种天然和合成的来源。翻译起始区域可由转录起始区域和结构基因提供。序列可来自于选择表达基因的启动子，可通过特别的修饰来增强mRNA的翻译。

此处描述的基因构造可进一步包括含有能够影响mRNA加工或基因表达的多腺苷酸化信号和其它调节信号的3’不可译区(或终止区)。适合的3’区域的非限制性的例子是3’转录非翻译区，它含有农杆菌肿瘤诱导质粒(Ti)基因，如胭脂碱合成酶(Nos gene)，植物基因如大豆储存蛋白基因，和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)基因的小亚基的多腺苷酸化信号。

“可操作连接“指的是目的序列的相互作用，直接或间接的执行预期的功能，如基因表达的间介作用和调节作用。可操作连接的序列的交互作用可以被介导的，如通过蛋白质的可操作连接序列的交互作用。

此处核苷酸分子的参考文献中使用的术语“外源”指的是来自于植物体外的核苷酸分子。一个外源核苷酸分子可为天然或非天然产生核苷酸序列。技术中熟练的技工认为一个外源核苷酸分子可为来自于除引入核苷酸分子的植物外的同一植物种或不同植物种的一个异源核苷酸分子。此外，它还可以是来自于非植物如真菌，酵母，细菌或其它非植物生物体的核苷酸分子。

因为单子叶植物转基因表达的水平普遍高于当被单子叶植物启动子而不是双子叶植物启动子驱动的表达，检测水稻基因组来鉴定btg26水稻同系物。采用blastn分析，芸苔btg26基因(Stroeher et al.，1995，PlantMol.Biol.27：541-551)的氨基酸序列对比TIGR水稻序列的测定(见例1)。水稻遗蛋白(OsAnt1)基因在水稻染色体9被鉴定，OsAnt1基因的ATG起始密码子上游(5’)的一个启动子序列也被鉴定(图2；SEQ ID NO：1)。采用这个启动子序列驱动目的编码区的表达。植物表达，例如，但不仅仅局限于此，AlaAT在OsAnt1启动子序列的控制之下增加了生物量，种子量和NUE(见例3)。

因此，描述了表达一个或多个靶基因或目的编码区的水稻植物的产生。进一步提供了增加水稻植物生物量的方法和增加植物种子量的方法。通过此处描述的方法，可能产生具有一个或多个所期望的性状或性质；例如，定向改变植物的遗传特性或植物的生理性能，或遗传和生理性能。此外，描述了采用OsAnt1启动子序列，产生具有在一个或多个期望基因或目的编码区表达的水稻植物的方法。

具有在一个或多个靶基因或目的的编码区表达的水稻植物的产生是采用本发明的OsAnt1启动子序列来完成的，这个启动子序列可以命令目的编码区表达。OsAnt1启动子序列使得水稻植物在一个或多个组织表达靶基因，其中在根组织部分特别适合。

技术中熟练的技工认为OsAnt1启动子序列的修饰在本发明的方法和构造中是有用的，以改进或修饰启动子序列的活性。OsAnt1启动子序列的选择区域可操作连接到一个单个靶编码区来改变连接的编码区的表达水平，或OsAnt1启动子序列可操作连接到一个或多个靶编码区，这样每个靶编码区的表达就可以协同调节。OsAnt1启动子序列可以具有任何适合的大小来作为启动子发挥功能。OsAnt1启动子序列可以通过技术中的标准方法来修饰，例如，不仅仅局限于此，诱变，染色体缺失，插入，置换，或切割，来改变可操作连接编码区表达的程度，或通过启动子序列改变表达的特异性。此外，OsAnt1启动子序列的放置相对于可操作连接的编码区是可以调节的(例，移动远一些或近一些)，以获得启动子表达的期望水平。

假定的OsAnt1启动子序列可在特定的环境或生理条件下命令目的编码区表达。例如，启动子序列在干旱胁迫，渗透胁迫，盐胁迫，温度胁迫，营养素缺失，或在特定发育条件下(如，但不仅仅局限于此)发芽，结果或产生种子时是有活性的。

本发明的目的编码区或靶基因可以是水稻植物中期望表达的任何核苷酸序列。本发明的方法和构造中采用的编码区的一般种类包括编码以下蛋白的核苷酸序列：编码结构蛋白；有关氮运输的蛋白；有关氮吸收的蛋白；有关氮运输和吸收的蛋白；有关氮利用的酶和蛋白；植物中杀虫剂和除草剂抗性的有关蛋白；植物线虫，病毒，昆虫或细菌抗性的有关蛋白；植物应激抗性的有关蛋白，例如，但不仅仅局限于此，渗透性，温度，pH，或氧气应激性；植物生长刺激和连续的有关蛋白；植物修复的有关蛋白；具有药特性或产生具有药特性化合物的编码酶的有关蛋白。

例如，目的编码区可编码一个氮利用蛋白，尤其是使氨水同化为氨基酸或在生物合成反应中采用形成的氨基酸反应的酶。这个蛋白质可选择自，但不仅仅局限于此，硝酸盐运载体(高或低的亲和力)，铵盐运载体，氨基酸运载体，丙氨酸脱氢酶，谷氨酰胺合成酶(GS)，天冬酰胺合成酶(AS)，谷氨酸合成酶(也叫作谷氨酸2：酮戊二酸氨基转移酶GOGAT)，门冬酰胺酶(ANS)，谷氨酸脱氢酶(GDH)，硝酸盐还原酶，天冬氨酸转氨酶(AspAT)，丙氨酸氨基转移酶(AlaAT)和其它已知的氨基转换酶。这些蛋白在专利申请号为2005/0044585的美国专利中有所描述，这个专利因为整体上引用而被合并于此。

靶基因或目的编码区可在水稻植物中天然的表达或者它是水稻植物的异源体。这个基因可来自于任何来源，包括病毒，细菌，植物或动物来源。较好的是，目的编码区对于OsAnt1启动子序列是异源的，OsAnt1启动子序列是可操作连接的，因为它不是来自于这个基因，是天然可连接的。

编码区可通过任何适合的途径被修饰来构建一个基因或具有期望特性的水稻植物。编码区可被修饰，并在植物系统中转录的和翻译。例如，编码目的蛋白的核苷酸序列可被修饰，这样它含有所有必须的多腺苷酸化序列，起始位点和终止位点，这些位点允许编码序列被转录为mRNA(信使RNA)，mRNA再在水稻植物中被翻译。此外，编码区可经修饰使得它的密码子选择与水稻植物天然基因更加相似(例，可采用优化序列的植物)。技术中已知的技能采用了这个核苷酸序列修饰和方法。

此处描述的构造包括目的编码区的OsAnt1启动子序列通过载体被有效的引入水稻植物，水稻植物细胞或植物原生质体中。本发明适合采用的克隆或表达载体的例子有质粒(如pAG001)，粘粒，病毒DNA或RNA和微型染色体。适合的植物载体在技术中是熟知的(见例Clark，M.，ed.(1997)Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual.Springer Verlag，ISBN：3540584056，此文献通过整体的引用而被合并于此)。

载体可含有一个或多个细菌或植物表达可选择的或可遮的标记或报道基因，这样，载体合并到水稻植物细胞或原生质体就可以被监控了。更好的是，这个选择的或可遮的标记可对照一个易探测的表现型，如其它有毒化合物(例，卡那徽素抗性)或以适合的底物(例，β葡萄糖苷酸酶(GUS)或荧光酶基因)培养植物的比色法或发光反应的抗性。这个报道基因在技术中是熟知的。

此处描述的构造可通过任何有用的方法引入到水稻植物或植物细胞中。大量的方法对于植物细胞的传递基因是可用的且是熟知的。此处最熟知的方法包括农杆菌或相似土壤细菌作为载体的应用，其中的农杆菌由目的构造或含有该构造的载体转化而来。植物的靶组织由转化的农杆菌共培养，转化的农杆菌在植物基因组中插入了目的核苷酸序列，如在U.S.Patent4,940,838(Schilperoort et al.；此专利因为整体上引用而被合并于此)所描述的和Horsch(1985，Science 227：1229-1231；此文献因为整体上引用而被合并于此)等人所描述的。本发明中有用的选择性的基因转移和转化方法包括但不仅仅局限于此，脂质体技术，电穿孔术或游离DNA的化学介导吸收，磷酸钙共沉淀技术，靶向微粒和微量或大量注射技术，DNA直接转化技术，还包括Ti质粒，Ri质粒或植物病毒载体。这些转化方法在技术中已经被证明。技术中熟练的技工认为选择的水稻植物，水稻之物细胞或原生质体转化的方法能够大量被证明，通过OsAnt1启动子序列-靶序列构造，或含有该构造的载体的性质来证明。

此处描述了一个转化的水稻植物包含一个可操作连接启动子序列的编码区。还描述了含有一个可操作连接OsAnt1启动子序列的水稻植物种子。根据本发明产生的转化的水稻植物和种子对于进一步的育种计划，具有一个以上期望特性的水稻植物的产生是有用的。例如，本发明的两个转化的水稻植物中，每个含有一个期望转基因，这两个基因采用已知的方法杂交来产生后代，产生的后代具有这两个转基因的特征。在这个方法中，可能产生具有在植物中表达的期望性状的转化水稻植物。

此外，技术中熟练的技工认为不同种类的植物普遍上或多或少都遵守基因操作，因此，对于通过此处描述的方法和构造先转化水稻植物的相关品种是有利的，接着通过杂交育种技术将靶基因的表达引入水稻植物。这些技术和相关的植物品种对于技术中熟练的技工是熟知的。

此处描述了采用技术中已知的方法收集转化的水稻植物种子，进一步用于转化植物和杂种的再生长。

此处描述的方法和构造产生了具有水稻植物中一个或多个期望基因表达的水稻植物和种子。此处描述了植物可能应用的广泛的多样性，包括但不仅仅局限于此，产生具有增加的应激耐受力的水稻植物，改进氮的吸收，改进氮的利用，改进氮的含量，改进期望化合物的氮的营养量和植物修复性质。特定的应用下面有进一步的描述。

此处描述的植物能够使缺乏营养的土壤富有营养。技术上熟知的是某个植物种，特别是农作物，吸收了土壤中的必须营养来维持生长，如氮，磷酸盐和钾。为了补充缺失的营养，有必要向土壤中施肥(一个奢侈的环境破坏的过程)或培养已知的在土壤中沉积所消耗营养的植物(例，三叶草和大豆的有关氮的消耗)。然而，这些选择的经济可行性很小。此处描述的方法可使得核苷酸序列靶向表达，包括在组织(例，根或根毛)里吸收营养(例，运输分子)以改进水稻植物从环境中吸收营养的能力。

此处描述的方法可用来产生水稻植物，来表达异源的或优化的天然营养利用基因或使得营养能够有效的利用编码区，这样，植物的正常生长和发挥机能就需求少量的营养(例，氮)。此外，采用此处描述的方法，来表达目的编码区，包括营养的利用和吸收，由有水稻植物在能直接吸收不同营养(例，根和叶)的植物组织中非正常的利用。在该方法中，产生了能够吸收不同营养源(如，不同的氮源)而茂盛生长的水稻植物。优化了植物氮效率的显著有用的靶基因包括：硝酸盐运载体(高或低的亲和力)，铵盐运载体，氨基酸运载体，丙氨酸脱氢酶，谷氨酰胺合成酶(GS)，天冬酰胺合成酶(AS)，谷氨酸合成酶(也叫做谷氨酸2：酮戊二酸氨基转移酶和GOGAT)，门冬酰胺酶(ANS)，谷氨酸脱氢酶(GDH)，硝酸盐还原酶，天冬氨酸转氨酶(AspAT)，丙氨酸氨基转移酶(AlaAT)，和其它已知的氨基转换酶。这个蛋白在专利申请号2005/0044585的美国专利中有所描述，这个专利因为整体上引用而被合并于此。

此处描述的技术可用于产生能通过迅速吸收由肥料提供的氮，同时储存氮以有效利用肥料的水稻植物，从而减少了含氮肥料的损失量等等。这使得对含氮肥料的需求量减少，将其应用到水稻来获得农作物产量，可与采用正常培养技术和根据本发明修饰的水稻植物获得的农作物产量做比较。其它农学上的优势还包括快速生长和水稻农作物产量，其中，采用一般的农作物培养技术使投入的含氮肥料维持在一定水平上。

产生了表达编码丙氨酸氨基转移酶(AlaAT)的可操作连接本发明OsAnt1启动子序列的寡核苷酸序列的转化的水稻植物。如图3所示，在OsAnt1启动子序列的控制下，表达AlaAT的转化植物对比对照植物，显示了较高的生物量干重且增加了种子量。结果表明，在OsAnt1启动子序列的控制下，表达异源AlaAT的水稻植物能够优化可用氮的利用，从而增加了植物的生物量，种子量或均增加。

因此，增加水稻植物生物量的方法包括所描述的提供一个带有可操作连接OsAnt1启动子序列目的编码区的水稻植物。目的编码区可编码包括优化植物氮效率的酶，如，它可以编码丙氨酸氨基转移酶(AlaAT)，编码区的表达适当的发生在植物根部。

还提供了一种方法来增加水稻植物的种子量，包括提供一个带有可操作连接本发明所述的OsAnt1启动子序列目的编码区的水稻植物。目的编码区可编码包括优化植物氮效率的酶，如，它可以编码丙氨酸氨基转移酶(AlaAT)。

以上的描述在任何方法中不局限于本发明；此外，所讨论的特性的组合对于本发明的结论不是完全必须的。

附图说明

图1：植物细胞氮源利用步骤图；

图2：OsAnt1的调节区域；

图3：产生OsAnt1pro-Gus构造的步骤图；

图4：产生OsAnt1pro-AlaAT构造的步骤图；

图5：由OsAnt1启动子命令的报道基因GUS的表达；

图6：由OsAnt1pro-AlaAT转化的水稻植物的平均生物量干重；

图7：由OsAnt1pro-AlaAT转化的水稻植物的平均种子重量；

图8：由OsAnt1pro-AlaAT转化的水稻植物平均生物量干重和平均种子重量的关系。

以下是对附图内容的解释，本发明的特征通过下列描述将变的更加直观，其中的参考文献作为附图：

图1显示的是植物细胞中氮利用的图示。硝酸盐(NO₃ ^-)被运送到植物细胞中，由硝酸盐还原酶(NR)转化成亚硝酸盐(NO₂ ^-)。亚硝酸盐从细胞质中易位到叶绿体中，由亚硝酸盐还原酶(NiR)还原为铵(NH₄ ⁺)。谷氨酰胺合成酶(GS)具有同化某物质和循环利用铵(NH₄ ⁺)的机能。一个酶偶联，谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合成酶(GOGAT)，催化了谷氨酰胺(Gln)到谷氨酸(Glu)的基因转变。谷氨酸是许多氨基酸的标准部件。此外，丙氨酸在可逆反应中由来自于丙酮酸和谷氨酸的丙氨酸氨基转移酶(AlaAT)合成。

图2所示的是本发明OSAnt1启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。这个序列采用NCBI数据库中的blastn查询来分离，采用芸苔btg26基因(Stroeher et al.，1995，Plant Mol.Biol.27：541-551)的核苷酸序列(366-3175bp)来鉴别水稻同源核苷酸序列(登陆号为AF323586)。这个序列接下来用在比对TIGR水稻序列的测定(见：tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)，如例1所示。水稻基因中，假定的TATA盒子由粗体显示，水稻基因组PCR扩增序列采用的引物有下划线。

图3所示的是产生基因构造OsAnt1pro-Gus步骤的图示，采用报道基因β葡萄糖苷酸酶与例2中描述的方法一致。

图4所示的是产生基因构造OsAnt1pro-AlaAT步骤的图示，与例2中描述的方法一致。

图5所示的是由本发明OsAnt1启动子命令GUS报道基因的表达。表达发生在由图3所示的基因构造OsAnt1pro-Gus转化的水稻植物的根培养的根尖部分的细胞膨胀区域内(panel A)；根培养的根毛部分(panel B)和侧根部分(panel C)，与例3中所描述的方法一致。黑色染色区域表明了GUS报道基因的表达。

图6显示的是图4所示的由基因构造OsAnt1pro-AlaAT转化的水稻的平均生物量干重值，对比例3给出的在同样的生长条件下的野生型水稻植物的平均生物量干重值。

图7显示的是图4所示的由基因构造OsAnt1pro-AlaAT转化的水稻的平均种子重量(克)，对比例3给出的在同样的生长条件下的野生型水稻植物的平均种子重量。

图8所示的是每个转基因植物的生物量干重(克)和总种子重量(克)的关系。

具体实施方式

下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明：

实施例1：OsAnt1启动子序列的分离和鉴定

btg26基因(Stroeher et al.，1995，Plant Mol.Biol.27：541-551；登录号S77096)的核苷酸顺序(bp 366-3175)用于采用blastn查询工具在NCBI中搜索核苷酸数据库。水稻序列(登陆号为AF323586)被鉴定，它的核苷酸顺序用于搜索TIGR水稻序列的测定(tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)。btg26的水稻同系物水稻遗蛋白(OsAnt1)在水稻染色体9被鉴别(登陆号为AP005570；98524-101189碱基对)。OsAnt1的起译密码子的973-bp序列上游由图2显示(SEQ ID NO：1)。OsAnt1基因的ATG起译密码子的403bps上游(5’)序列被选择用来分析。测定这序列是否可能具有作为一个启动子的功能，采用http://softberry.com/建立的TSSP植物启动子预测软件来分析该序列。分析预测了该序列是一个植物启动子序列。还测定了TATA盒子(图2粗体)和其它启动子序列要素最有可能存在的区域。

因为设计的OsAnt1启动子序列根据softberry分析被预测含有启动子元素，所以序列采用信号扫描软件(Prestridge，1991；http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/signal)分析了启动子基序，启动子基序可以是转录因子的识别位点。OsAnt1启动子中预测了五个不同的信号序列，包含ADR1，DBF-A，GAL4，HSTF和RAF转录因子结合位点。

采用BCM Search Launcher主页(search launcher.bcm.tmc.edu/)和BOXSHADE服务器(ch.embnet.org/software/BOX_form.html)的ClustalW 1.8多序列比对软件比较btg26启动子序列的核酸序列和油菜和拟南芥的核酸序列。保守核苷酸序列的检验显示了油菜和拟南芥细胞组织膨胀基因-26启动子序列与OsAnt1序列彼此非常相似。所有三个启动子的同一个特征是核苷酸序列中存在嘧啶束(CT)。这些嘧啶束范围在20-22个碱基，存在于所有三个启动子序列中可能存在的TATA盒子的上游。此外，OsAnt1序列在ATG起始密码子里存在第二个嘧啶束

水稻基因组DNA从cv.Kitaake中分离出来。选择了以下符合OsAnt1启动子区域的PCR引物(位于图2所示的带下划线部分)：

引物1：AGGAAGTGATTTTTAGCGTAGCTG(SEQ ID NO：2)；

引物2：ATGGCAGAAGAGAGAGAGAGAGAGG(SEQ ID NO：3)。

采用基因组DNA和以上引物引导降落PCR。产生一个975-bp片段。扩增的PCR片段连接pCR

II-TOPO载体转化为十大细胞大肠杆菌。最后的质粒命名为pT-riceOsAnt1pro。

序列分析显示出975-bp PCR片段编码一个命名为OsAnt1的启动子序列的启动子序列。比较了OsAnt1启动子和cv.Nipponbare(由数据库获得)的cv.Kitaake，显示出它们有99.9％相似度。假定的TATA盒子的起始密码子上游存在145bps。

实施例2：含有OsAnt1启动子序列的遗传构造

分别通过图3和图4所示的步骤产生了驱动β葡萄糖苷酸酶(GUS)报道基因(OsAnt1pro-Gus)或大麦AlaAT基因(OsAnt1pro-AlaAT)的含有OsAnt1启动子序列的遗传构造。

水稻OsAnt1pro-GUS构造

水稻OsAnt1pro-GUS构造通过采用以下引物，pT-RiceOsAnt1pro为模板来产生：

引物3：EcoRI-OsAnt1启动子序列GGAATTCAGGAAGTGATTTTT(SEQ IDNO：4)

引物4：NcoI-OsAnt1启动子序列CATGCCATGGATGGCAGAAGA(SEQ ID NO：5)

最终的PCR片段引入到植物二元载体pCAMBIA1305.1中，被EcoR1和Nco1降解成一个pCAMBIA1305.1-riceOsAnt1pro-GUS构造。引物3和引物4的末端序列EcoRI和NcoI序列，使得PCR片段插入pCAMBIA1305.1载体，用带有OsAnt1的启动子序列替代存在的CaMV35s启动子。NcoI(CCATGG)序列含有一个Met密码子，ATG，这个构成了GUS报道基因和使得GUS报道基因通过OsAnt1启动子序列表达。

水稻OsAnt1pro-AlaAT构造

水稻OsAnt1pro-AlaAT构造通过采用以下引物，pT-RiceOsAnt1pro为模板来产生：

引物3：EcoRI-OsAnt1启动子序列GGAATTCAGGAAGTGATTTTT(SEQ IDNO：4)

引物5：PstI-OsAnt1启动子序列AACTGCAGATGGCAGAAGA(SEQ ID NO：6)

最终的PCR片段被EcoR1和Pst1降解引入到植物二元载体pCAMBIA1300，产生了pCAMBIA1300-riceOsAnt1pro。

AlaAT DNA片段采用pAG001作为模板进行PCR扩增。pAG001在美国专利No.6,084,153有所描述，其中它被鉴定为pbtg26/AlaAT/nos。它含有连接大麦和胆脂碱合成酶终止子的btg26启动子。大麦AlaAT/nos基因终止子序列采用以下引物，pAG001为模板进行扩增：

引物6：PstIAlaAT序列AACTGCAGATGGCTGCCACCG(SEQ ID NO：7)

引物7：HindIII-NOS终止序列CCCAAGCTTCCCGATCTAGTA(SEQ ID NO：8)

最终的AlaAT/nos片段被Pst和HindIII降解引入到pCAMBIA1300-riceOsAnt1pro，产生了pCAMBIA1300-riceOsAnt1pro-AlaAT构造。

实施例3：

水稻植物经由含有OsAnt1的载体的转化

pCAMBIA1305.1-riceOsAnt1pro-GUS和pCAMBIA1300-riceOsAnt1pro-AlaAT通过电穿孔术(Sambrook et al.1989in Molecular Cloning，A Laboratory Manual Cold Spring Harbor，N.Y.：Cold Spring Harbor Laboratory Press)被转移到农杆菌菌株EHA105中(Hood et al.，(1993)Transgenic Res.2：208-218)。农杆菌细胞在含有50mg/l卡那徽素，28℃培养3天的固体AB培养基中划平板。由扁平小刀收集细菌，先于水稻组织转化之前，在液态共培养基(R2-CL，Table 1)中采用温和的漩涡式再悬浮培养。

水稻的转化

在转化试验中采用成熟的水稻种子(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)。种子去皮后，在50％加入0.1％吐温20的漂白剂中灭菌10min，再浸渍在70％(v/v)的乙醇中1min，然后用无菌蒸馏水清洗5次。灭菌后，种子在愈伤组织诱导培养基(NB，Table 1)中28℃避光培养3周。

表1.用于愈伤组织诱导，嫁接，共培养，静息，选择，再生和生根的培养基

3周后，将3-5mm长从子叶衍生愈伤组织中释放到培养基中的胚性结状片段浸渍到直径为100mm的含有25ml含有密度为3-5×10⁹细胞/ml(OD₆₀₀＝1)农杆菌细胞的液态共培养基(R2-CL，Table 1)的培养皿中培养10-15min。胚性片段由已灭菌的滤纸吸干，转移到固态共培养基(R2-CS，Table 1)中，25℃避光培养3天。共培养的胚性愈伤组织再被转移到静息培养基(R2-CS，Table 1)中，28℃避光培养1周。

1周后，将未污染的胚性片段分别转移到含有均霉素的选择培养基(R2S，Table 1)中来选择转化了的组织，28℃避光培养。接下来的3周在R2S培养基中选择培养，变为褐色且愈伤组织表面带有褐色隆起物的胚性片段被转移到NBS选择培养基中(表1)。共培养5周后，小隆起物发展成褐色球状组织，然后将它从愈伤组织中轻轻的挑起，在密封的培养皿中培养2周。2周后，这些球状组织便成了圆形的，紧密的淡黄色的愈伤组织。

将假定的转基因植物，抗均霉素愈伤组织轻轻的挑选出来，转移到再生培养基(PRN，Table 1)中再培养1周。所有的来自于单一共培养胚性结状片段的抗性愈伤组织被一起放入PRN皿中。带有光滑干燥表面奶白色分裂的愈伤组织被转移到再生培养基(RN，Table 1)中，避光培养2天，然后在光强度55μmol/m/sec的12/12-h(白天/黑夜)光周期条件下培养3周。在被转移到生长室的盆中之前，将从抗性愈伤组织中再生的绿芽分割开在含有生根培养基(R，Table 1)的试管中再培养1-2周来促进根和分蘖的生长。转基因植物在含有无污染盆栽混合物的直径为16cm的盆中生长为成熟期的植物。将植物在28℃和14/10h白天/黑夜光周期的条件下的生长室中培养。种植在盆中2周后，开始施肥，一周两次。混合肥料包括225g 20/20/20肥料，50g植物微量营养素，6.1g CuSO₄.5H₂O，140gFeEDTA，13.8g ZnSO₄.7H₂O，260g MgSO₄.7H₂O，3.7g H₃BO₃，共重712.4g。将2g的混合肥料溶解在8L的水中，一周向24株植物施肥两次。由OsAnt1启动子序列命令表达的分析

由OsAnt1启动子序列命令表达的诱导作用采用由OsAnt1pro-GUS构造转化的水稻植物来检测。植物在盐基品红瓶中无菌条件下发芽水培。第2周龄的植物经过体内GUS活性染色，是通过在生根培养基注射含有0.2mMX-gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucuronic acid)的5mls50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)并在该培养基中培养1-24h来进行的。在生物解剖显微镜下观察根组织并拍摄照片，如图5所示。

图5黑色区域显示的是GUS报道基因的表达。这个表达不是由根尖OsAnt1启动子驱动的GUS报道基因表达的；而是在根尖后面的细胞扩张区域开始快速表达的。OsAnt1启动子序列命令GUS报道基因也在根毛处表达。离根尖很远处的许多成熟根部中，主根没有表达，但是侧根着色很重，说明了OsAnt1在这些侧根中命令表达了。

含有AlaAT构造的转化植物的分析

产生了58株OsAnt1/AlaAT/NOS转基因植物，测定它们成熟期的开花，分蘖数，种子量和生物量，记录为T0代植物。

测定成熟期的OsAnt1/AlaAT植物和对照植物的生物量干重，数据由图6表示。转基因OsAnt1/AlaAT植物的平均生物量高于对照植物的平均生物量。

收集来自于成熟阶段的OsAnt1/AlaAT植物和对照植物的种子，并测定种子总量。结果由图7表示，表明来自OsAnt1/AlaAT植物的高于对照植物的种子量。

图8所示的是每个转基因植物的生物量干重和种子总量的关系。显示出了本质上的线性相关性，表明了在OsAnt1/AlaAT植物中增加生物量能相应的增加了种子量。

这些结果表明OsAnt1/AlaAT转基因植物能够优化可用的营养素的利用，因此增加了植物的生物量，种子量或均增加。

此处列出的所有文献通过整体上的引用而被合并于此。

本发明描述了相关的一个或多个实施例。然而，许多变异和修饰不能脱离本发明的范围，这对于技术上熟练的技工来说是很显而易见的。

序列表

<110>戈德，艾伦G.

迪堡，玛丽

施瓦特，阿莎克K.

<120>来自水稻的启动子序列及其应用方法

<130>FP-1811/US

<140>PCT/US2006/048857

<141>2006-12-21

<150>60/753,848

<151>2005-12-23

<160>8

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>973

<212>DNA

<213>水稻

<400>1

aggaagtgat ttttagcgta gctgtgtttg tagcgtaatt gcgtaaagtc ctttcaattt 60

tgctatatct cactcgaaag attttttctt atctctcact cgattttctc actcaaattt 120

acagtgtatt ttcttgtaag ttacagtgta atttatgaaa cttacactgt aacttttgta 180

agttacactg taatttttga atcttcacat gtaaatttta aattttgtat tggatttggt 240

ctttttcttg aggatatggt aatttaatgt tcattatggt gtttcttaat tgctttttgc 300

tttttattat atctatcgga ttttaataca aagattaaaa atctgtgtga tacgattata 360

aaaatctttc gaaagatgta taggtactcc caagcccttt taagaaagtt tttcaagaca 420

aaagtttttg gatgaaaggt agttataggg aaaaaggaat gtgcgtttat gtttatttgc 480

attgcttatt ggcaaccaaa aactaatcta taagtaaatc ttttatatac gtgcgcttaa 540

taattcaaaa gcaaattcat gtaaaataaa atgcgatgaa gaaactttaa aaagttatca 600

aatttagatt ttattaaatt ttagtttaca agagcgctac gatgaaggct ttaaaaagat 660

gggaaaataa aacctttgac ctttctggac ttcaccaaac agctcacgct ttcggcttcg 720

tgccgtctcg tcccgtgcta ctgctacccc ctcctgaccc cacccgccac tccacgctcc 780

cttctcctcc ccttcccgtg acacacagtc cccactccac cgcctccgta taagtatccc 840

ttccttaccg ccggccagcc acagccaccg cctcccccac cccaccccga tcccctcccc 900

gccgtacggg cgcagaagga acccgtcttc tagaaggagg aggagggcta cctctctctc 960

tctctcttct gcc 973

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成物

<400>2

aggaagtgat ttttagcgta gctg 24

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成物

<400>3

atggcagaag agagagagag agagg 25

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成物

<400>4

ggaattcagg aagtgatttt t 21

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成物

<400>5

catgccatgg atggcagaag a 21

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成物

<400>6

aactgcagat ggcagaaga 19

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成物

<400>7

aactgcagat ggctgccacc g 21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成物

<400>8

cccaagcttc ccgatctagt a 21

Claims

1.一种离体的水稻遗蛋白(OsAnt1)启动子序列，其中含有SEQ ID NO：1或它的活性片段。

2.一种基因构造，其中含有权利要求1所述的可操作的连接到编码序列的靶蛋白OsAnt1启动子序列。

3.根据权利要求2所述的基因构造，其特征在于，所述的靶蛋白是一个氮利用蛋白。

4.根据权利要求3中所述的基因构造，其特征在于，所述的氮利用蛋白有以下选择，包括：高亲和力的硝酸盐运载体，低亲和力硝酸盐运载体，铵运载体，氨水运载体，氨基酸运载体，丙氨酸脱氢酶，谷氨酰胺合成酶，天冬酰胺合成酶，谷氨酸合成酶，谷氨酸2：酮戊二酸氨基转移酶，门冬酰胺酶，谷氨酸脱氢酶，硝酸盐还原酶，天冬氨酸转氨酶和丙氨酸氨基转移酶。

5.根据权利要求4所述的基因构造，其特征在于，所述的氮利用蛋白为丙氨酸氨基转移酶。

6.一种含有权利要求2所述的基因构造的载体。

7.一种在水稻植物中命令靶基因表达的方法，其包括：采用可操作连接一个含有SEQ ID NO：1或它的活性片段的OsAnt1启动子序列的靶基因接触水稻植物，将含有SEQ ID NO：1或它的活性片段的OsAnt1启动子序列的靶基因引入到植物中，其中OsAnt1启动子序列在植物中命令靶序列表达。

8.根据权利要求7所述的在水稻植物中命令靶基因表达的方法，其特征在于，所述的靶基因编码一个氮利用蛋白有以下选择包括：高亲和力的硝酸盐运载体，低亲和力硝酸盐运载体，铵运载体，氨水运载体，氨基酸运载体，丙氨酸脱氢酶，谷氨酰胺合成酶，天冬酰胺合成酶，谷氨酸合成酶，谷氨酸2：酮戊二酸氨基转移酶，门冬酰胺酶，谷氨酸脱氢酶，硝酸盐还原酶，天冬氨酸转氨酶和丙氨酸氨基转移酶。

9.根据权利要求8所述的在水稻植物中命令靶基因表达的方法，其特征在于，所述的氮利用蛋白为丙氨酸氨基转移酶。

10.根据权利要求7所述的在水稻植物中命令靶基因表达的方法，其特征在于，所述的植物由权利要求5所述的基因构造转化。

11.根据权利要求7所述的在水稻植物中命令靶基因表达的方法，其特征在于，所述的靶基因的表达发生在植物的根部。

12.一种增加水稻植物生物量的方法，其包括：采用可操作连接一个含有SEQ ID NO：1或它的活性片段的OsAnt1启动子序列的靶基因接触水稻植物，将含有SEQ ID NO：1或它的活性片段的OsAnt1启动子序列的靶基因引入到植物中，其中OsAnt1启动子序列在植物中命令靶序列表达来获得增加生物量的水稻植物。

13.根据权利要求12所述的增加水稻植物生物量的方法，其特征在于，所述的靶基因编码一个氮利用蛋白有以下选择包括：高亲和力的硝酸盐运载体，低亲和力硝酸盐运载体，铵运载体，氨水运载体，氨基酸运载体，丙氨酸脱氢酶，谷氨酰胺合成酶，天冬酰胺合成酶，谷氨酸合成酶，谷氨酸2：酮戊二酸氨基转移酶，门冬酰胺酶，谷氨酸脱氢酶，硝酸盐还原酶，天冬氨酸转氨酶和丙氨酸氨基转移酶。

14.根据权利要求13所述的增加水稻植物生物量的方法，其特征在于，所述的氮利用蛋白为丙氨酸氨基转移酶。

15.根据权利要求12所述的增加水稻植物生物量的方法，其特征在于，所述的植物由权利要求5所述的基因构造转化。

16.根据权利要求12所述的增加水稻植物生物量的方法，其特征在于，所述的靶基因的表达发生在植物的根部。

17.一种增加水稻植物种子量的方法，其包括：采用可操作连接一个含有SEQ ID NO：1或它的活性片段的OsAnt1启动子序列的靶基因接触水稻植物，将含有SEQ ID NO：1或它的活性片段的OsAnt1启动子序列的靶基因引入到植物中，其中OsAnt1启动子序列在植物中命令靶序列表达来获得增加种子量的水稻植物。

18.根据权利要求17所述的增加水稻植物种子量的方法，其特征在于，所述的靶基因编码一个氮利用蛋白有以下选择包括：高亲和力的硝酸盐运载体，低亲和力硝酸盐运载体，铵运载体，氨水运载体，氨基酸运载体，丙氨酸脱氢酶，谷氨酰胺合成酶，天冬酰胺合成酶，谷氨酸合成酶，谷氨酸2：酮戊二酸氨基转移酶，门冬酰胺酶，谷氨酸脱氢酶，硝酸盐还原酶，天冬氨酸转氨酶和丙氨酸氨基转移酶。

19.根据权利要求18所述的增加水稻植物种子量的方法，其特征在于，所述的氮利用蛋白为丙氨酸氨基转移酶。

20.根据权利要求17所述的增加水稻植物种子量的方法，其特征在于，所述的植物由权利要求5所述的基因构造转化

21.根据权利要求17所述的增加水稻植物种子量的方法，其特征在于，所述的靶基因的表达发生在植物的根部。

22.一种转化的水稻植物，包含一个靶基因，其可操作连接到OsAnt1启动子序列，含有SEQ ID NO：1或它的活性片段。

23.根据权利要求22所述的转化的水稻植物，其特征在于，所述的靶基因编码一个氮利用蛋白有以下选择包括：高亲和力的硝酸盐运载体，低亲和力硝酸盐运载体，铵运载体，氨水运载体，氨基酸运载体，丙氨酸脱氢酶，谷氨酰胺合成酶，天冬酰胺合成酶，谷氨酸合成酶，谷氨酸2：酮戊二酸氨基转移酶，门冬酰胺酶，谷氨酸脱氢酶，硝酸盐还原酶，天冬氨酸转氨酶和丙氨酸氨基转移酶。

24.根据权利要求23所述的转化的水稻植物，其特征在于，所述的氮利用蛋白为丙氨酸氨基转移酶。

25.一种水稻植物种子，包含一个含有SEQ ID NO：1和它的活性片段的可操作连接到OsAnt1启动子序列的靶基因。

26.根据权利要求25所述的水稻植物种子，其特征在于，所述的靶基因编码一个氮利用蛋白有以下选择包括：高亲和力的硝酸盐运载体，低亲和力硝酸盐运载体，铵运载体，氨水运载体，氨基酸运载体，丙氨酸脱氢酶，谷氨酰胺合成酶，天冬酰胺合成酶，谷氨酸合成酶，谷氨酸2：酮戊二酸氨基转移酶，门冬酰胺酶，谷氨酸脱氢酶，硝酸盐还原酶，天冬氨酸转氨酶和丙氨酸氨基转移酶。

27.根据权利要求26所述的水稻植物种子，其特征在于，所述的氮利用蛋白为丙氨酸氨基转移酶。