CN101195543B - 植酸酶菌剂肥料及其生产方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植酸酶菌剂肥料及其生产方法与应用。它是由植酸酶菌株和发酵培养基组成，菌剂中活菌数≥1亿个/mL。本发明的植酸酶菌剂，可将土壤和畜禽粪便中的不能被植物吸收利用的植酸磷，转化为可被植物吸收的无机磷营养。植酸酶菌剂肥料可以促进植物对氮、磷、钾的吸收，促进植物的生长和发育。通过微生物的代谢活动，可改善土壤结构，调节土壤的活性，进一步改善土壤的性能，增加土壤的肥力。本发明的菌剂具有活菌数高、保存期长、生产工艺简单和易于实现自动化生产等优点，特别适用于蔬菜、果树、小麦、玉米等经济植物的施肥。

Description

植酸酶菌剂肥料及其生产方法与应用

技术领域：

本发明属于生态农业技术领域，涉及微生物制剂，特别是一种植酸酶菌剂肥料和生产方法以及采用植酸酶菌剂作为生物肥料来应用。

背景技术：

我国农业生产广泛使用化肥。我国是世界上使用化肥、农药数量最大的国家。广施化肥不仅造成了土壤污染，还通过农田径流加重了水体有机污染和富营养化污染，甚至影响到地下水和空气。超高量施用化肥也破坏耕地的土壤结构。降低农产品的品质，病虫害发生率提高。同时，化肥生产的超常发展，加速了矿质资源的耗竭。日渐成为威胁农业生产可持续发展的一大问题。

正确引导农民合理调整施肥结构、研制推广肥效明显无污染的新型肥料，以实现农业生产增产增收、改善农产品品质、恢复和提高土壤可持续生产能力，是当前农业生产发展方向。

植酸酶(myo-Inositol-hexaphosphate-phosphohyolrolase)可使植酸降解成肌醇和磷酸。刘丽丽等报道了植酸酶分泌菌株的筛选研究{天津师范大学学报，2006，26(2)19-22}。中国专利CN1552872A公开了一种耐热植酸酶及其基因的克隆和表达。刘丽丽，杨文博等报道了植酸酶基因工程菌菌株可制成微生物菌剂。{细菌耐热植酸酶基因的克隆及表达，微生物学通报，2004，36(4)：71-76}。但关于植酸酶菌剂肥料和生产方法以及采用植酸酶菌剂来提高土壤肥力，促进植物生长的应用，尚未见文献报道。

发明内容：

本发明的一个目的是提供一种植酸酶菌剂肥料。

本发明的另一个目的是提供一种植酸酶菌剂肥料的生产方法。

本发明的再一个目的是提供植酸酶菌剂应用于增加土壤肥力、促进植物生长和提高作物产量的方法。

本发明的技术内容如下：

一种植酸酶菌剂肥料，其特征在于它是由植酸酶菌株和发酵培养基组成，菌剂中活菌数≥1亿个/mL。

本发明所述的植酸酶菌剂肥料，其中的植酸酶菌株(芽孢杆菌Bacillus sp.)是植酸酶基因工程菌株(植酸酶基因工程菌株SDLTP02来源于博士论文数据库：刘丽丽，2000级，微生物学专业，资源细菌及工程研究方向，论文题目：磷细菌溶磷动力学的研究及酶解植酸基因工程菌的构建，2004年4月)。

本发明所述植酸酶菌剂肥料的发酵培养基各成分配比为：麸麸皮20-40％、葡萄糖5-20％、(NH₄)₂HPO₄ 5-20％、K₂HPO₄0.1-1％、MgSO₄·7H₂O 0.1-1％、NaCl 2-10％，其余为水。

优选的发酵培养基的各成分配比为：麸皮35g、葡萄糖2g、(NH₄)₂HPO₄10g、K₂HPO₄0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.1g、NaCl 2g，水100mL。

本发明所述植酸酶菌剂肥料的生产方法，其特征在于包括的步骤：

(1)取植酸酶基因工程菌株SDLTP02斜面菌种2-4环接入肉汤培养基中，在35-45℃，震荡培养24-36h，获得种子液；

(2)以5-20％种子液的接种量转接于发酵培养基中，35-45℃，培养24-48h，制成菌剂，低温保存，备用。

本发明所述的肉汤培养基的制备为：

称取蛋白胨5g、牛肉膏3g、NaCl 5g和MnSO₄·H₂O 5mg，用蒸馏水溶解，定容至1L，pH7.0-7.2。

本发明所述发酵培养基的制备方法为：称取麸皮20-40％、葡萄糖5-20％、(NH₄)₂HPO₄5-20％、K₂HPO₄ 0.1-1％、MgSO₄·7H₂O 0.1-1％、NaCl 2-10％，其余为水，pH7.0-7.2。

优选的制备方法为：称取麸皮35g、葡萄糖2g、(NH₄)₂HPO₄ 10g、K₂HPO₄ 0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.1g、NaCl 2g，水100mL。pH7.0-7.2。

本发明进一步提供了植酸酶菌剂肥料在提高植物光合速率方面的应用。

本发明更进一步提供了植酸酶菌剂肥料在促进植物生长方面的应用。

本发明同时也提供了植酸酶菌剂肥料在增加植物对氮、磷、钾吸收方面的应用。

本发明同时也详细描述了植酸酶菌剂肥料在提高植物产量方面的应用。

本发明所述的植物为：蔬菜、果树、小麦或玉米。

本发明所述的应用方法为：在容器内装入过筛的干燥掺混土壤，播种植物株，定期定量浇水，然后将植酸酶菌剂施于种子正下方2～3cm处，植酸酶液体菌剂的施用量：50～200mL/kg，3个月后收获，分别测定试验结果。

实验结果证实：施用一定剂量的植酸酶菌剂可将土壤中的大部分不能被植物吸收的植酸磷，转化为可被植物吸收的无机磷。特别是植酸酶菌剂可应用于小麦、玉米、苜蓿等经济植物。当施用菌剂后，小麦苗和玉米的光合作用速率明显加强；提高了小麦苗和玉米苗的干重；提升了玉米的根活力；促进了植物对氮、磷、钾的吸收，小麦苗和玉米苗的氮、磷、钾含量明显增加；提高了苜蓿的产量。

本发明采用天津师范大学微生物实验室保藏的植酸酶基因工程菌菌株SDLTPO2(植酸酶基因工程菌株SDLTP02来源于博士论文数据库：刘丽丽，2000级，微生物学专业，资源细菌及工程研究方向，论文题目：磷细菌溶磷动力学的研究及酶解植酸基因工程菌的构建，2004年4月)，相关的发明专利(耐热植酸酶基因的克隆及表达，专利号：CN1552872A)公开了一种耐热植酸酶及其基因的克隆和表达。

本发明的植酸酶菌剂与现有技术公开的各种菌剂相比所具有的积极效果在于：

本发明的植酸酶菌剂，可将土壤中的大部分不能被植物吸收的植酸磷，转化为可被植物吸收的无机磷。同时还可以促进植物对氮、磷、钾的吸收。微生物的生长代谢活动可改善土壤的活性。通过微调土壤的酸碱度，进一步改善了土壤的性能，延长了肥效。特别是植酸酶菌剂可应用于小麦、玉米等经济植物。

本发明的植酸酶基菌剂本身不含对环境有害的物质，制作成本低，是一种具有肥效好，可改善土壤活性的微生物肥料，能够创造出非常大的经济效益。

附图说明

图1植酸酶菌剂对小麦苗光合速率的影响。

图2植酸酶菌剂对小麦苗地上部分干重的影响。

图3植酸酶菌剂对小麦苗地上部分全氮、磷、钾含量的影响。

图4植酸酶菌剂对玉米苗光合速率的影响。

图5植酸酶菌剂对玉米苗地上部分干重的影响。

图6植酸酶菌剂对玉米苗地上部分全氮、磷、钾含量的影响。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明做进一步的描述。这些实施例仅是对本发明的典型描述，但本发明并不限于此。需加以说明的是：

本发明所采用的植酸酶基因工程菌株SDLTP02(植酸酶基因工程菌株SDLTP02来源于博士论文数据库：刘丽丽，2000级，微生物学专业，资源细菌及工程研究方向，论文题目：磷细菌溶磷动力学的研究及酶解植酸基因工程菌的构建，2004年4月)由天津师范大学微生物实验室保藏。公众参考上述文献可以自制。

实施例1：

取斜面菌种3环接入100ml的种子(肉汤)培养基中，37℃，震荡培养24h。将20ml的种子液(20％，体积)的接种量转接于100ml的发酵培养基中，37℃，培养48h，制成菌剂。菌剂中活菌数≥1亿个/mL，4℃下保存备用。

其中种子(肉汤)培养基的制备：称取称取蛋白胨5g、牛肉膏3g、NaCl 5g和MnSO₄·H₂O 5mg，用蒸馏水溶解，定容至1L，pH7.0-7.2。

发酵培养基的制备：称取麸皮35g、葡萄糖2g、(NH₄)₂HPO₄ 10g、K₂HPO₄ 0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.1g、NaCl 2g，水100mL，pH7.0-7.2。

菌剂的活菌数测量方法采用沈萍等提供的方法(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三版).北京：高等教育出版社，2003)。测定结果：菌剂中活菌数1.5亿个/mL。

实施例2：

取斜面菌种4环接入100ml的种子(肉汤)培养基中，40℃，震荡培养36h。将15ml的种子液(15％，体积)的接种量转接于100ml的发酵培养基中，40℃，培养24h，制成菌剂。菌剂中活菌数≥1亿个/mL，4℃下保存备用。

其中种子(肉汤)培养基的制备：称取称取蛋白胨5g、牛肉膏3g、NaCl 5g和MgSO₄·7H₂O 5mg，用蒸馏水溶解，定容至1L，pH7.0-7.2。

发酵培养基的制备：称取麸皮40g、葡萄糖5g、(NH₄)₂HPO₄ 15g、K₂HPO₄ 0.4g、MgS04·7H20 0.3g和NaCl 8g，水100mL，pH7.0-7.2。

菌剂的活菌数测量方法采用沈萍等提供的方法(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三版).北京：高等教育出版社，2003)。菌剂中活菌数1.5亿个/mL。

实施例3

用实施例1得到的植酸酶菌剂进行盆载小麦试验，于2006年3月1日～6月1日在天津师范大学进行。试验于3月1日播种，6月1日收获。试验用盆规格为28.2×30cm。每盆装过3.0mm筛干燥掺混土壤12.5kg，播种20粒，定植15株。定期定量浇水，各实验组实施水平严格一致。植酸酶菌剂施于种子正下方2～3cm处。

试验设5个实验组，每个实验组设置3次重复。各实验组分别为：

空白对照组(CK)

植酸酶菌剂(液体)施用量：50mL，100mL，150mL，200mL

(1)植酸酶菌剂对小麦光合速率的影响

分别于2006年4月1日10:00a.m.和6月1日10:00a.m.测定小麦苗光合速率。测定条件为光强700μmol·m^-2·s^-1，室温25℃。测定结果(测定方法参照Li-6400光合仪仪器使用说明书)见图1所示。图1植酸酶菌剂对小麦苗光合速率的影响。

从图1可以看出，施用菌剂后，小麦苗光合作用速率在2个月内明显加强。并随菌剂施用量增加，小麦苗光合速率相应提高，并显著高于对照组。

(2)植酸酶菌剂对小麦苗地上部分干重的影响

小麦苗干重于2006年6月1日测量(测定方法见：张志良，翟伟菁.植物生理学实验指导(第3版)，高等教育出版社，北京：2004-3第3次印刷.)。植酸酶菌剂对小麦苗地上部分干重的影响见图2和表1，图2植酸酶菌剂对小麦苗地上部分干重的影响。

表1植酸酶菌剂对小麦苗地上部分干重的影响

处理量(mL)	0-(CK)	50	100	150	200
						麦苗干重测定结果(g)	0.31cC	0.44bAB	0.50bB	0.53aA	0.37cC

从图2与表1分析，施用菌剂150mL时，小麦苗地上部分干重于对照组有极显著(0.01水平)差异。

(3)植酸酶菌剂对小麦苗全氮、全磷、全钾含量的影响(测定方法见：彭建伟，宋海星.植物科学实验中心，植物营养学实验技术：植物营养学实验指导)。

表2植酸酶菌剂对小麦苗地上部分全氮含量的影响

菌剂施用量(mL)	0(CK)	50	100	150	200
						麦苗全氮测定结果(％干重)	2.12bB	1.60cC	2.00bB	1.70cC	2.96aA

表3植酸酶菌剂对小麦苗地上部分全磷含量的影响

菌剂施用量(mL)	0(CK)	50	100	150	200
						麦苗全磷测定结果(％干重)	0.51cC	0.54bcBC	0.57bAB	0.62aA	0.55bBC

表4植酸酶菌剂对小麦苗地上部分全钾含量的影响

菌剂施用量(mL)	0(CK)	50	100	150	200
						麦苗全钾测定结果(％干重)	5.11bB	4.79bcBC	5.00bB	4.48cC	5.88aA

图3，表2，表明施用菌剂提高了小麦苗全氮含量，且随处理水平的增加，全氮含量增加。根据图3表3分析，分别施用菌剂100mL、150mL，小麦苗全磷含量高于对照，且有极显著差异。上述小麦苗磷素含量增加，这与小麦苗吸收磷素量的增加有一定的关系。由图3表4可以看出，施用菌剂200mL，小麦苗全钾含量高于对照，且有极显著差异。

实施例4

用实施例1得到的植酸酶菌剂进行盆载玉米试验，于2006年5月1日～8月1日在天津师范大学进行。试验于5月1日播种，8月1日收获。试验用盆规格为28.2×30cm。每盆装过3.0mm筛干燥土壤12.5kg，播种10粒，定植5株。定期定量浇水，各实验组实施水平严格一致。菌剂施于种子正下方2～3cm处。

试验设5个实验组，每个实验组设置3次重复。各实验组分别为：

空白对照(CK)

植酸酶菌剂(液体)施用量(mL)：50，100，150，200

(1)植酸酶菌剂对玉米苗光合速率的影响

分别于2006年6月2日10:00a.m.和8月1日10:00a.m.测定玉米苗光合速率。测定条件为光强700μmol·m^-2·s^-1，室温26℃。测定结果(测定方法参照Li-6400光合仪仪器使用说明书)见图4所示。

由图4分析，各实验组内均有差异。其中8月1日测定值中，菌剂各水平，光合作用速率显著高于对照。但各实验组间光合速率平均表现相差不大。

(2)植酸酶菌剂对玉米苗地上部分干重的影响

表5植酸酶菌剂对玉米苗地上部分干重的影响

菌剂施用量(mL)	0(CK)	50	100	150	200
						玉米苗干重测定结果(g)	3.65bB	5.5946aAB	6.3528aA	5.4918aAB	7.1374aA

玉米苗干重测量于2006年8月1日进行。由图5，表5分析，菌剂不同水平处理实验，玉米苗地上部分干重均显著高于对照组。

(3)植酸酶菌剂对玉米苗根活力的影响

根系活力是指根系与呼吸强度、吸收能力、催化能力有关的能力指标，它能够很好地反映出根系的生长发育旺盛程度。根活力的测定方法采用TTC还原法(莱阳农学院植物生理学教研室主编.植物生理学实验指导，2005.张志良，瞿伟箐.植物生理学实验指导(第三版).北京：高等教育出版社，2003.)。在本试验条件下，各实验组玉米苗根系活力测定结果见表6。各实验组与对照组相比，有极显著差异。

表6植酸酶菌剂对玉米苗根活力(四氮唑还原强度)的影响

菌剂施用量(mL)	0(CK)	50	100	150	200
						根活力试验测定结果(μg/gh)	21.54bB	34.21abAB	46.01aA	25.62bB	34.03abAB

(4)植酸酶菌剂对玉米苗全氮、全磷、全钾的影响(测定方法见：彭建伟，宋海星.植物科学实验中心，植物营养学实验技术：植物营养学实验指导。

表7植酸酶菌剂对玉米苗地上部分全氮含量的影响

玉米苗全氮	1.18	1.02	1.20	0.91	0.90
						测定结果(％干重)	bAB	bcB	aA	cB	cB

表8植酸酶菌剂对玉米苗地上部分全磷含量的影响

菌剂施用量(mL)	0(CK)	50	100	150	200
						玉米苗全磷测定结果(％干重)	2.28cB	2.79aA	2.52bA	2.80aA	2.74abA

表9植酸酶菌剂对玉米苗地上部分全钾含量的影响

菌剂施用量(mL)	0(CK)	50	100	150	200
						玉米苗全钾测定结果(％干重)	0.29aA	0.35aA	0.32aA	0.32aA	0.35aA

由图6，表7、8、9可以看出，施用菌剂100mL时，玉米苗全氮含量与对照组相比，有显著差异，差异显著(0.05水平)。施用菌剂后各实验组的玉米苗全磷含量均显著高于对照组。且差异极显著(0.01水平)。施用菌剂各处理，玉米苗全钾含量与对照组相比均有提高，各处理组的全钾含量，随处理量不同，玉米苗吸收钾元素增加。

实施例5

用实施例1得到的植酸酶菌剂进行盆载阿尔冈金紫花苜蓿试验，于2006年5月1日～7月1日在天津师范大学进行。试验于5月1日播种，7月1日收获。试验用盆规格为28.2×30cm。每盆装过3.0mm筛干燥土壤12.5kg。播种。定期定量浇水，各实验组实施水平严格一致。菌剂施于种子正下方2～3cm处。

试验设5个实验组，每个实验组设置3次重复。各实验组分别为：

空白对照(CK)

植酸酶菌剂(液体)施用量(mL)：50，100，150，200

表10植酸酶菌剂对苜蓿地上部分鲜重的影响

菌剂施用量(mL)	0(CK)	50	100	150	200
						苜蓿干重测定结果(g)	46.4dC	49.0dC	60.9aA	53.6cB	58.0bA

表11植酸酶菌剂对苜蓿地上部分干重的影响

菌剂施用量(mL)

0(CK)

50

100

150

200

苜蓿干重测定结果(g)

8.0cB

9.2bB

11.7aA

8.8bcB

9.3bB

实验结果表明，在植酸酶菌剂进行盆载阿尔冈金紫花苜蓿试验中植酸酶菌剂可以提高苜蓿的鲜重和干重，即可以提高苜蓿的产量。

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。

Claims (9)

1.一种植酸酶菌剂肥料，其特征在于它是由植酸酶菌株和发酵培养基组成，其中发酵培养基的各成分配比为：麸皮20-40％、葡萄糖5-20％、(NH₄)₂HPO₄5-20％、K₂HPO₄0.1-1％、MgSO₄·7H₂O 0.1-1％、NaCl 2-10％，其余为水；菌剂中活菌数≥1亿个/mL；其中的植酸酶菌株是植酸酶基因工程菌株SDLTP02。

2.如权利要求1所述的植酸酶菌剂肥料，其中发酵培养基的各成分配比为：麸皮35g、葡萄糖2g、(NH₄)₂HPO₄10g、K₂HPO₄0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.1g、NaCl 2g，水100mL。

3.一种植酸酶菌剂肥料的生产方法，其特征在于包括的步骤：

(1)取植酸酶菌株斜面菌种2-4环接入肉汤培养基中，在35-45℃，震荡培养24-36h，获得种子液；

(2)以5-20％种子液的接种量转接于发酵培养基中，35-45℃，培养24-48h，制成菌剂，低温保存，备用；其中的植酸酶菌株是植酸酶基因工程菌株SDLTP02。

4.如权利要求3所述的植酸酶菌剂肥料的生产方法，其中的发酵培养基的制备为：麸皮20-40％、葡萄糖5-20％、(NH₄)₂HPO₄5-20％、K₂HPO₄0.1-1％、MgSO₄·7H₂O 0.1-1％、和NaCl 2-10％，其余为水，pH 7.0-7.2。

5.权利要求1所述植酸酶菌剂肥料在提高植物光合速率方面的应用。

6.权利要求1所述植酸酶菌剂肥料在促进植物生长方面的应用。

7.权利要求1所述植酸酶菌剂肥料在增加植物对氮、磷、钾吸收方面的应用。

8.权利要求1所述植酸酶菌剂肥料在提高植物产量方面的应用。

9.如权利要求5-8任一项所述的应用，其中的植物为蔬菜、果树、小麦或玉米。

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