CN102429870A - 一种喜树碱类药物的新型肿瘤靶向树状聚合物纳米载体 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，涉及一种新型靶向纳米载体的制备及其在喜树碱类药物靶向传递系统中的应用。该系统可表示为：PAMAM-HA/drug，其中PAMAM为不同代数的聚酰胺-胺树状大分子，HA为不同分子量的透明质酸，drug为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康等喜树碱类抗癌药物一种或多种。该类载体用于包载喜树碱类药物，可起到延长药物血液循环时间，提高其生物利用度，减少药物非肿瘤部位浓集，降低其细胞毒性的作用，同时保护喜树碱类药物内酯环不被破坏，从而从多方面提高肿瘤治疗效率。本发明在促进喜树碱类药物的安全递送及肿瘤的有效治疗中具有重要意义。

Description

一种喜树碱类药物的新型肿瘤靶向树状聚合物纳米载体

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种新型肿瘤靶向树状聚合物纳米载体的制备及其在喜树碱类药物靶向递送中的应用。将喜树碱类药物用透明质酸修饰的树状聚合物包合后，有助于喜树碱类化合物以内酯环闭合的活性形式给药，与现有市售制剂相比，具有提高生物利用度、增强靶向性、降低毒副作用、延长药物半衰期，且可稳定储存等优点。

背景技术

喜树碱(Camptothecin，CPT)为一种吡咯[3，4-b]喹啉生物碱，1966年由Wall等人首次从我国特有的植物珙桐科喜树树干中分离而得。经研究发现喜树碱对头颈部肿瘤、膀胱癌和白血病等多种恶性肿瘤均有一定的疗效。其衍生物10-羟基喜树碱(Hydroxycamptothecin，OPT)对多种动物肿瘤有更明显的抑制作用，且毒性较小，但部分病人尚有尿血、尿急、尿频等毒副作用。直至1985年，Hsiang等人发现喜树碱及其衍生物是通过靶向性抑制拓朴异构酶(Topo I)的DNA合成而发挥抗癌作用的机理，至此，更多的喜树碱类衍生物应运而生，成为抗癌领域研究的新热点，而又一次引起人们的关注。

喜树碱类药物六元羟基内酯环的完整性是保证其为拓扑异构酶抑制剂的必需结构，然而内酯型为水难溶性药物，目前临床上采用碱化开环的方法将之制成钠盐水针及粉针，虽增加了其水溶性，但活性仅为内酯形式的1/10，疗效降低且半衰期短。同时，内酯型的脂溶性也非常低，制备脂质体或微乳等制剂也难以达到临床所需载药量。对于油水分配系数在-0.3到4.5之间的难溶性化合物，其脂质体载药量与包封率都很低。喜树碱类化合物众多中具有生物活性的化学组分都属于上述范畴，故制备的脂质体载药量和药脂比都较低，很难达到临床用量要求，而且药物易突释泄晶，稳定性差。

聚酰胺-胺树状大分子(Polyamide-amine dendrimer，PAMAM)作为一种新型的高分支、三维树状结构的大分子，与线性大分子相比，具有规整的结构、明确的分子量及分子尺寸，并可通过调控合成过程精确控制分子形状及功能团等，可以解决抗癌药物传输中生物屏障的多种问题：(1)内部的大量空腔可包裹小分子化合物，并在一定条件下将其释出，使负载的药物具有缓、控释性能，有利于药物在肿瘤部位作用更长的时间。同时对内部药物分子产生有明显的保护作用，可以防止体内环境对药物分子的降解，能避免药物活性丧失，有利于药物的贮藏和运输，而且可以防止药物分子的聚集，增加药物与生物膜的接触等。(2)高度支化的结构和独特的单分散特性，使分子表面具有极高的官能团密度，其末端官能团可与许多有机物、无机物发生化学反应。通过修饰引入疏水基团或靶向配体、抗体等，可提高生物相容性、生物利用度和主动靶向性。(3)利用PAMAM的纳米尺寸也可以使得药物在空隙较大的肿瘤部位达到被动的渗透与蓄积效应(EPR)，并可通过内吞、胞饮等方式进入细胞，因此可能增加药物对生物膜的透过性，尤其是出现耐药或有特殊屏障时。已有研究证明，PAMAM载药系统可在一定程度上克服肿瘤药物的耐药问题。(4)与脂质体、聚合物胶束等传统的纳米载体相比，还具有稳定性高、无免疫原性、低毒性、可通过尿和粪便排出体外等特性，是一类有前途的非病毒载体。

但是仅仅利用纳米效应进行被动靶向的定位效果并不是很理想。而且整代PAMAM树状大分子表面有大量氨基基团，在生理pH条件下易质子化而带正电，因此不可避免具有一定细胞毒性。利用无毒、水溶性好的小分子配体对PAMAM进行修饰是降低其毒性、提高其生物相容性的有效方法之一。而且利用配体和肿瘤内受体的相互作用，可以达到更加高效的特异性作用，以弥补单纯被动靶向对特定组织或特定细胞靶向能力的不足，增强给药系统对肿瘤细胞的特异性。

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)在体内广泛存在，是一种带负电的线性糖胺聚糖，在润滑关节、连接结缔组织中发挥重要作用，并且在维持细胞外基质的结构以及调节细胞内活动等方面也有重要作用。CD44分子是一种广泛分布于细胞表面的糖蛋白，在淋巴细胞、成纤维细胞、间质和造血源性细胞以及多种恶性瘤细胞表面均能检测到它的表达，在细胞的黏附和转移过程中起着重要作用，是细胞表面上HA重要受体之一。最近的研究表明，HA与其特异性受体CD44之间的相互作用可以作为HA靶向治疗恶性瘤的研究基础。国内外已成功运用HA对药物进行化学修饰或将HA搭载于脂质体、纳米粒外表面实现药物良好高效的靶向低毒传递。

本发明将透明质酸接枝于树状聚合物表面，利用透明质酸的负电中和及其与肿瘤细胞表面CD44受体的相互作用，既可以降低聚合物的毒性，提高其生物相容性，又可以减少PAMAM与细胞表面的非特异性作用，降低药物在非肿瘤部位的滞留，从而多方面增加病灶局部的药物浓度，减轻喜树碱类药物的不良反应。同时，还可增加药物在体内的水溶性和稳定性，提高药物的缓释效果及生物利用度。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种生物相容性好、对肿瘤细胞具有靶向性、可降低药物毒副作用、增加抗癌疗效的树状聚合物纳米载体。

本发明目的之二在于用新制备的靶向载体包载喜树碱类药物，以减少喜树碱类药物内酯环开环，增加疗效并同时利用尺寸被动、受体主动作用达到药物的双重肿瘤靶向。

本发明的目的是这样实现的：

一种树状聚合物靶向载体，特点是该载体为纳米粒子，具有以下结构：位于中心核的是树状聚合物聚酰胺-胺PAMAM，最外端为透明质酸靶向基团，并通过物理包裹或静电结合包载合适的药物。

通式为PAMAM-HA/drug，其中PAMAM为2.0-5.0代聚酰胺-胺树状聚合物，HA为不同分子量的透明质酸，drug为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康等喜树碱类药物一种或多种。

上述纳米载体的制备方法是：取适量PAMAM-HA，溶于适量无水甲醇中，50℃下保温。另取喜树碱类药物适量溶于盐酸溶液中，经恒压滴液漏斗将药物溶液滴加到PAMAM-HA溶液中，滴加时间控制在30-45min，氮气保护条件下避光室温孵育24h。用二次蒸馏水透析24h，冻干得白色粉末PAMAM-HA/drug，低温避光保存。其中药物与树状聚合物载体PAMAM-HA的摩尔比为10∶1-5∶1，药物溶液的浓度为1-2mol/L，树状聚合物载体PAMAM-HA溶液的浓度为0.5-1mg/mL。

所述树状聚合物载体PAMAM-HA的制备包括以下步骤：

A)通过丙烯酸甲酯的迈克尔加成和乙二胺的氨解反应制备整数代的PAMAM分子；

B)聚酰胺胺与透明质酸以1∶4的官能团摩尔比反应，以1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)为缩合剂在二甲基亚砜溶剂中反应48h；

C)反应混合液依次用过量的pH7.4磷酸缓冲盐和蒸馏水透析24h，冷冻干燥后得白色粉末，即PAMAM-HA，低温避光保存。

上述载体可用于喜树碱类药物的靶向传递。

本发明的靶向载体具有以下特点：

1.具有高的生物兼容性，低的免疫原性和细胞毒性；

2.核心结构大小精细可调，表面氨基和透明质酸数目可控；

3.被动靶向和主动靶向结合从而对肿瘤细胞具有高度靶向性能，进一步提高靶向效率，实现癌症的高效低毒治疗；

4.亲水高分子表面修饰能够延长纳米复合粒子的血液循环时间，增强药物的水溶性而增强其在血液中的稳定性；

5.树状聚合物载体对包裹于内部空腔的喜树碱类药物分子产生明显的保护作用，可以防止体内环境对药物分子的降解，能避免药物内酯环破裂而造成的活性丧失，有利于药物在贮藏和运输过程中的稳定性；

6.与脂质体等纳米粒子相比较，树状聚合物配体形成的纳米粒子在血液流通过程中不会因解离释放出药物而造成药物的渗漏和突释。

附图说明

图1本发明PAMAM G4.0-HA(6900)树状聚合物载纳米靶向载体系统示意图

其中D＝药物。

图2 HA(6900)、PAMAM G4.0、PAMAM G4.0-HA(6900)的H-NMR图谱，在3.5-5.0之间出现透明质酸的吸收峰，证明了靶向基团的接入。

图3 PAMAM G4.0、PAMAM G4.0-HA(6900)、HA(6900)的紫外扫描图谱，可看到PAMAM接枝透明质酸后吸收峰的偏移，证明了透明质酸的接入。

图4 PAMAM G4.0红外图谱。

图5 PAMAM G4.0-HA(6900)红外图谱，1000-500cm-1处的明显变化证明了结构的改变。

图6 PAMAM G4.0-HA(6900)稀溶液(0.05mol/L)动态散射图谱，可看出单分散性良好。

图7 PAMAM G4.0-HA(6900)包合拓扑替康后在不同离子强度释放介质中的体外释放曲线，从1到3溶液的离子强度逐步增强，分别为纯净水、生理盐水和与生理盐水同浓度的pH7.4磷酸缓冲盐。证明了药物和载体的结合和解离与电荷相互作用有关。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步详述：

实施例1

1.PAMAM的合成

A)原料的纯化

甲醇用碘粒干燥24h(加入后加热至66度保持有小液滴逐滴滴下，回流24h)后常压蒸馏，收集馏分为64-66℃；

丙烯酸甲酯用无水硫酸钠干燥24h(加入后加热至78度保持有小液滴逐滴滴下，回流24h)后常压蒸馏，收集馏分为77-79℃；

乙二胺用氢氧化钾干燥24h后减压蒸馏(压力在1000±50Pa)，收集45-47℃馏分。

B)PAMAM G0.5的合成

称取2.0068g 乙二胺(约0.033mol)于250mL的三口瓶中，在冰水浴、电磁搅拌、氮气保护条件下加入22.0103g甲醇，混合均匀后，用恒压滴液漏斗将22.9714g(约0.267mol)丙烯酸甲酯滴加到三口瓶中，滴加速度为1滴/s，继续搅拌15min，脱氧，将三口瓶放入35℃的恒温水浴中，反应24h。

反应24h后，对产品进行减压蒸馏，除去过量的丙烯酸甲酯和甲醇，即得到0.5G的聚酰胺-胺树状大分子。称重得产率。

C)PAMAM G1.0的合成

称取4.9933g(约0.012mol)0.5G的PAMAM于三口瓶中，将16.0020g甲醇滴入三口瓶中将0.5GPAMAM充分溶解，在冰水浴、氮气保护条件下电磁搅拌20min脱氧，然后将14.8447g(约0.247mol)乙二胺用恒压滴液漏斗滴入三口瓶中，滴加速度为1滴/s，继续搅拌15min。将三口瓶放25℃恒温水浴中反应24h。

反应24h后，对产品进行减压蒸馏，除去多余的乙二胺及甲醇，即得到1.0G聚酰胺-胺树状大分子。称重计算产率。

重复B)、C)步骤，直到得到纯净的PAMAM G4.0。

2.透明质酸(分子量＝6900)的活化

2mmol透明质酸(分子量＝6900)加入到10mL二甲基亚砜(DMSO)中，50℃水浴加热磁力搅拌使其溶解，冷却至室温，分别加入14倍过量的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺(EDC)盐酸盐，搅拌使其在30℃下避光、氮气保护下充分接触反应1h。

3.PAMAM G4.0-HA(6900)的合成

称取1.38mmol 4.0代聚酰胺-胺溶于DMSO中，轻微加热搅拌，待溶解后冷却至室温，将活化后的HA溶液滴加到其中。混合液在室温下氮气环境中搅拌反应48h，将产物转移至截留分子量为8000的透析袋中，依次用200mL pH 7.4磷酸缓冲盐和蒸馏水透析24h。冷冻干燥后得白色粉末，低温保存。

4.药物的载入

取步骤3中合成的PAMAM G4.0-HA(6900)89.6mg，溶于50℃的无水甲醇10mL中，50℃下保温。另取喜树碱10mg溶于16mL 0.1mol/L的盐酸溶液中，经恒压滴液漏斗将药物溶液滴加到PAMAM G4.0-HA(6900)溶液中，氮气保护条件下避光搅拌反应24h。

用二次蒸馏水透析24h，冻干得白色粉末，低温保存。

实施例2

1.PAMAM的合成

A)原料的纯化

甲醇用碘粒干燥24h(加入后加热至66℃保持有小液滴逐滴滴下，回流24h)后常压蒸馏，收集馏分为64-66℃；

丙烯酸甲酯用无水硫酸钠干燥24h(加入后加热至78℃保持有小液滴逐滴滴下，回流24h)后常压蒸馏，收集馏分为77-79℃；

乙二胺用氢氧化钾干燥24h后减压蒸馏(压力在1000±50Pa)，收集45-47℃馏分。

B)PAMAM G0.5的合成

称取2.0068g 乙二胺(约0.033mol)于250mL的三口瓶中，在冰水浴、电磁搅拌、氮气保护条件下加入22.0103g甲醇，混合均匀后，用恒压滴液漏斗将22.9714g(约0.267mol)丙烯酸甲酯滴加到三口瓶中，滴加速度为1滴/s，继续搅拌15min，脱氧，将三口瓶放入35℃的恒温水浴中，反应24h。

反应24h后，对产品进行减压蒸馏，除去过量的丙烯酸甲酯和甲醇，即得到0.5G的聚酰胺-胺树状大分子。称重得产率。

C)PAMAM G1.0的合成

称取4.9933g(约0.012mol)0.5G的PAMAM于三口瓶中，将16.0020g甲醇滴入三口瓶中将PAMAM G0.5充分溶解，在冰水浴、氮气保护条件下电磁搅拌20min脱氧，然后将14.8447g(约0.247mol)乙二胺用恒压滴液漏斗滴入三口瓶中，滴加速度为1滴/s，继续搅拌15min。将三口瓶放25℃恒温水浴中反应24h。

反应24h后，对产品进行减压蒸馏，除去多余的乙二胺及甲醇，即得到1.0G聚酰胺-胺树状大分子。称重计算产率。

重复B)、C)步骤，直到得到纯净的PAMAM G4.0。

2.透明质酸(分子量＝9900)的活化

2mmol透明质酸(分子量＝9900)加入到10mL二甲基亚砜(DMSO)中，50℃水浴加热磁力搅拌使其溶解，冷却至室温，分别加入14倍过量的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺(EDC)盐酸盐，搅拌使其在30℃下避光、氮气保护下充分接触反应1h。

3.PAMAM G4.0-HA(9900)的合成

称取1.49mmol树状物溶于20mL DMSO中，轻微加热搅拌，待溶解后冷却至室温，将活化后的HA溶液缓慢滴加到其中。混合液在室温氮气环境中搅拌反应48h。，将产物转移至截留分子量为10000的透析袋中，依次用200mL pH7.4磷酸缓冲盐和蒸馏水透析24h。冷冻干燥后得白色粉末，低温保存。

4.药物的载入

取步骤3中合成的PAMAM G4.0-HA(9900)95.7mg，溶于10mL的无水甲醇中，50℃下保温。另取喜树碱10mg，溶于16mL 0.1mol/L的盐酸溶液中，经恒压滴液漏斗将药物溶液滴加到PAMAM G4.0-HA(9900)溶液中，氮气保护条件下避光搅拌反应24h。

用二次蒸馏水透析24h，冻干得白色粉末，低温保存。

实施例3-4

除分别用PAMAM G3.0、PAMAM G5.0代替PAMAM G4.0外，其它同实施例1。

实施例5-6

除分别用PAMAM G3.0、PAMAM G5.0代替PAMAM G4.0外，其它同实施例2。

实施例7-8

除分别用10-羟基喜树碱代替喜树碱外，其它同实施例1、2。

实施例9-10

除分别用拓扑替康代替喜树碱外，其它同实施例1、2。

在上述实施例中，制得了粒径在50-300nm之间，基于树状聚合物的肿瘤靶向载体。上述实施例仅用于说明本发明但并不局限于此，应该理解在不脱离本发明的范围内还可以有多种变通或替换方案。

Claims (10)

1.一种用于包载喜树碱类化合物的靶向纳米载体，其特征在于该载体是以聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子为母核，与靶向性功能因子透明质酸实现化学偶联后得到，可与喜树碱类药物通过静电吸附或物理包裹而实现载药。

2.如权利要求1所述的纳米载体，其特征在于所述的聚酰胺-胺树状大分子，其代数是3-5代。

3.如权利要求1所述的纳米载体，其特征在于所述的靶向性功能因子可以是不同聚合度(n＝60-120)的小分子透明质酸。

4.如权利要求1所述的喜树碱类药物，可以是喜树碱、10-羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、拓扑替康或伊立替康等喜树碱类衍生物一种或多种。

5.如权利要求1所述的靶向纳米载体，其特征在于所述球形纳米粒的粒径为50-300nm，其粒径可通过采用不同代数的聚酰胺-胺和不同分子量的透明质酸来进行调控。

6.如权利要求1所述的树状聚合物纳米载体的制备方法，包括以下步骤：

第一步：以乙二胺作为核心，氨基端用发散法反复和丙烯酸甲酯(MA)迈克尔加成，再和乙二胺(EDA)胺解，得到以氨基结尾的整数代PAMAM分子；

第二步：第一步得到的聚酰胺-胺与透明质酸在1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)催化下反应，纯化后冻干得白色粉末，即PAMAM-HA，低温避光保存。

7.如权利要求6所述的树状聚合物载体的制备方法，其特征在于：第一步整数代树状聚合物的纯化，可于减压蒸馏过程中，在防爆球中加入少量浓硫酸，借助与乙二胺的成盐反应加速乙二胺的析出；且随着代数的增加，丙烯酸甲酯、乙二胺的过量倍数分别从初始的2倍、6倍呈几何倍数增加，半代、整代的反应时间分别从最初的24小时、18小时逐渐延长，以利于后续反应的最大进行及产品的最大纯化；第二步中PAMAM与透明质酸的投料比按官能团摩尔比1∶4折算，而EDC需过量14倍。

8.如权利要求1所述的喜树碱类药物载入方法是：取权利要求6中得到的PAMAM-HA，溶于适量甲醇中，并在一定温度下保温；另取适量药物溶于盐酸溶液，经恒压滴液漏斗缓慢滴加，氮气保护下室温孵育24小时；透析纯化，冻干得白色粉末PAMAM-HA/drug，低温避光保存。

9.如权利要求7所述的喜树碱类药物的包载方法，其特征在于：药物和纳米载体的比例要通过微柱离心法包封率的测定确定，使达到最大包合。

10.如权利要求5所述制备的包载喜树碱类药物的树状聚合物纳米载体可以冻干粉的方式储存或使用，或者经注射用水稀释并过滤除菌以用于静脉注射，或者以适当吸附剂吸附后掺入其它辅料进一步加工成颗粒剂、丸剂、胶囊或片剂。

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