CN101007794B - N,n'-二取代哌嗪类衍生物及其制备方法、药物组合物和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物设计学、药物化学和药物学领域。本发明基于钾离子通道晶体三维结构运用计算机虚拟筛选，以寻求能够激动或抑制钾离子通道活性的分子，并对所筛选出的化合物进行衍生，从而提供具有钾离子通道抑制活性的结构式如下图所示的N，N’-二取代哌嗪类衍生物和其药学上可接受的盐，本发明还涉及N，N’-二取代哌嗪类衍生物的制备方法及其药物组合物和用途。此类化合物可作为钾离子通道激动剂或钾离子通道抑制剂，通过激动或抑制钾离子通道活性，选择性地把K⁺移入或移出细胞，因此本发明化合物和药物组合物可用于有效治疗和/或预防与心血管系统生理、病理和药理学关系密切的心血脑管疾病的药物。

Description

N，N'-二取代哌嗪类衍生物及其制备方法、药物组合物和用途

技术领域

本发明涉及药物设计学、药物化学和药物学领域，更具体而言，本发明基于钾离子通道晶体三维结构运用计算机虚拟筛选，以寻求能够激动或抑制钾离子通道活性的分子，并对所筛选出的化合物分子进行衍生，从而提供具有钾离子通道抑制活性的新颖的N，N’-二取代哌嗪类衍生物，本发明还涉及N，N’-二取代哌嗪类衍生物的制备方法及其药物组合物和用途。

背景技术

钾离子通道是一种特殊的膜蛋白，存在于所有的细胞中，对钾离子具有高选择性和高通透性。钾离子通道参与了许多重要的细胞功能，如控制细胞的电流可兴奋性和兴奋/应答偶合等，通过这样的方式，钾离子通道调控神经和心脏的电流模式，释放神经递质，控制肌肉收缩和激素的分泌；在非电流兴奋性细胞中，钾离子通道则通过调控单通道的传导路径来体现其生理功能。与其它类型的离子通道相比，钾离子通道的亚型数目众多。倘若钾离子通道基因突变，会导致一些心脑血管疾病和神经系统疾病的发生，如心律不齐、长QT综合症(long QTsyndrome)、短时运动失调(episodic Ataxia)、肌肉萎缩症(myotonicmuscular dystrophy)和癫痫症(epilepsy)等。钾离子通道可进一步分为电压依赖的、配基(或受体)依赖的、ATP敏感的、钙激活的和钠激活的等不同的类型。仅电压依赖的钾离子通道就已经克隆出几十种亚型。其余类型的钾离子通道结构尚未完全清楚。它们均与心血管系统生理、病理和药理学有着密切的关系。

钾离子(K⁺)通道能随着膜电位的变化，或者随着阴离子和/或配位体的激活而选择性地把K⁺移入或移出细胞。K⁺通道的主要作用是保持静息膜电位；另一个作用是使敏感细胞中动作电位复极。钾离子通道代表了不同类型的离子通道蛋白，并且现在已经阐明几种毒素主要是通过阻滞一种或多种特殊K⁺通道来起作用。心脏细胞是以K⁺通道不同亚型的显著多样性为特征的。在一次动作电位过程中，因膜的除极而能够打开好几种类型的K⁺通道，这些不同通道运载的离子流总和会引起膜的复极而达到静息电位。一旦膜除极，这些类型通道之一的瞬时外向K⁺通道能够产生快速(在1-10毫秒)启动的一股离子流(I₁₀)，然后迅速(10-200毫秒)衰退(失活)。I₁₀对心脏动作电位的最初复极起着最显著的作用，并且能被几种非特异性药用化合物如氨基吡啶类化合物和Tedisamil-一种III类抗心律失常剂所阻滞。阻滞I₁₀导致心脏动作电位的延长。据认为延长心脏动作电位时程是抑制再活动性心房和心室心体失常的一种机理。目前可得到的第III类抗心律失常化合物，其中多数能够通过阻滞称作快速型延迟整流K⁺通道的一种单独的K⁺通道亚型起作用。

在氨基酸序列水平上，不同亚家族之间的同源性大约40％，同一亚家族之间的同源性大约70％。Kv通道由四个α亚基形成离子孔区，每个α亚基由六段高度保守的跨膜片断(S1-S6)和细胞内与细胞外的长短各异的C端和N端组成。S4片断与电压门控的钠离子通道具有较高的同源性，它同时具有亲水和亲脂的性质，而且每三个残基就有一个带正电荷的氨基酸，是钾离子通道电压门控激活的主要组成部分。端基氨基酸被认为是与电压依赖型失活有关。在S5和S6片断之间的连接深入至膜内，参与形成离子孔区，在钾离子通道中被称为H5区或孔区。孔区结构在钾离子选择性通道中是高度保守的，特别是序列(T/SXXTXGY(F)G)被当作是钾离子选择性特征序列。去掉G或Y后对离子选择性有很大的影响，如Shaker通道的选择性会完全丧失。Heginbotham等2对Shaker通道孔区的残基逐个进行突变，发现有4个残基十分关键，它们分别是TVGG，分别位于特征序列的1、5、6和8位，这些残基的突变会导致通道失去选择性。

1998年4月Doyle等3人在Science上发表了第一个离子选择性通道的晶体结构，该晶体结构的分辨率是3.2

，来源欲细菌Streptomyceslividans的钾离子通道。KcsA仅有两段跨膜结构，由孔区相连，但它的氨基酸序列同源性比之Kir通道(同样也是两段跨膜结构)要更接近电压门控钾通道，在孔区范围，KcsA的序列几乎与Kv通道相同。晶体结构显示KcsA通道是四聚体，四个相同的α亚基环绕中心孔区对称分布，每个亚基由大约30个氨基酸的孔区片断和伸出膜外的“小塔(turret)”将两段跨膜α螺旋(S1和S2)连接起来。通道的形状象一个倒置的圆锥形。TVGYG残基形成一个狭窄的选择性滤斗，在滤斗下面有一个直径大约10

的空穴，主链羰基指向空穴，侧链远离孔区，即螺旋的偶极矩集中在这里。含水的孔区通道长约18

，离子通道孔区总长约45

。2005年Stephen等在Science上发表了哺乳类电压依赖型Shaker家族的钾离子通道的晶体结构，该晶体结构的分辨率是2.9

这个结构包括完整的跨膜孔区和电压敏感区VS部位、中间的T1区域和参与氧化还原反应的β亚基。但是这些晶体结构外口的选择性过滤区域氨基酸残基是高度保守的。这为采用计算机虚拟筛选钾离子通道活性有效分子提供了可能。

本发明选择钾离子通道作为靶标，运用计算机辅助药物设计的手段对商业上可以购买到的ACD(http://www.mdl.com/)库中的化合物进行虚拟筛选，对打分较高、活性较好的化合物进行化学合成和衍生，以及生物活性测试。生物活性测试证明，我们获得化合物对钾离子通道具有很好的抑制活性。ACD库是Available Chemicals Directory的缩写，意为目前能购买的化学药品字典。MDL公司与世界上近千家化学药品公司有着密切的联系，不断更新数据库，并通过网络掌握各化学药品公司近期的产品和价格以及包装等情况。到目前为止，ACD库已包含近1,300,000万个化合物的信息，每个化合物均有常用理化性质数据、结构、价格、包装、生产厂家及联系方式(地址、电话、传真、或电子邮件等)(http://www.mdl.com/products/pdfs/acd_ds.pdf)，因此ACD是各研究机构、制药公司寻找、定购原料的信息源。

发明内容

本发明的目的是基于钾离子通道晶体三维结构运用计算机虚拟筛选，以寻求能够激动或抑制钾离子通道活性的分子，从而提供具有钾离子通道抑制活性的新颖的N，N’-二取代哌嗪类衍生物。

本发明的另一目的是提供N，N’-二取代哌嗪类衍生物的制备方法。

本发明的又一个目的是提供一种可以有效治疗或预防与钾离子通道密切相关的心血管系统疾病及其相关并发症的包含上述化合物的药物组合物。

本发明的再一目的是提供上述化合物和药物组合物在制备治疗或预防与钾离子通道密切相关的心血管系统疾病及其相关并发症的药物方面的用途。

本发明是基于钾离子通道晶体三维结构运用计算机虚拟筛选，以寻求具有钾离子通道活性有效的分子。1998年4月Doyle在Science上发表了第一个来源是细菌Streptomyces lividans的离子选择性通道的晶体结构。本发明的发明人利用钾离子通道的晶体结构，以及季铵离子(QA)、4-氨基喹啉和蝎毒、蛇毒、蜜蜂毒素等毒素与钾离子通道作用位点信息，选取了钾离子通道两个活性部位，运用分子对接程序DOCK4.0对其分别进行了三维数据库搜寻，以寻找可能的阻滞剂。本发明人搜寻的小分子三维结构数据库是ACD-3D小分子数据库，约有25万个化合物。由于高通量筛选新型钾离子通道抑制剂的技术，目前还存在一定的困难，虚拟筛选的作用就特别显著。运用这种方法，本发明人对ACD数据库进行虚拟筛选、排序打分，选出了22个潜在的配体。电生理分析显示，其中有6个化合物有高度的抑制活性，其抑制活性为TEA(四乙胺)的300-1000倍。生物分析结果显示，这些化合物是I_K特异性阻断剂。其中的N，N’-二取代哌嗪类化合物对I_K和I_A均有不同程度的抑制作用，其IC₅₀如表2所示。其中，1-苄基-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪在细胞外抑制选择性高，对I_K抑制为I_A的16.3倍(IC₅₀比率为16.3)。本发明人对1-苄基-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪进行衍生，以得到对钾离子通道激动或抑制活性更好的系列衍生物。

本发明提供具有如下结构式I表示的新型的N，N’-二取代哌嗪类衍生物或其药学上可接受的盐：

其中：

n＝0-1的整数；

R₁和R₂各自独立地表示氢、卤素、C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烃基、C3-C7环烃基、苄基、芳香基或5-7元杂环基；

所述的卤素为氟、氯、溴或碘；

所述的芳香基可以是苯基、取代苯基、萘基或联苯基；其中所述的取代苯基可以包括1～4个取代基，该取代基可选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基和C1-C4酰基之中；

所述的5-7元杂环基可含有1-3个选自氧、硫或氮的杂原子，和/或被结构式I中的苯基并合，和/或含有一个或多个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基、C1-C4酰基和芳香基的取代基。

本发明提供的N，N’-二取代哌嗪类衍生物药学上可接受的盐，具体地可列举与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸等有机酸或天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的盐，如钠、钾、钙、铝盐和铵盐；或与有机碱形成的盐，如甲胺盐、乙胺盐、乙醇胺盐等；或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成酯后的盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐，或与甲酸、乙酸，苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有机酸的盐。

本发明的结构式I的N，N’-二取代哌嗪类衍生物或其药学上可接受的盐的一个优选实施方案是1-取代苄基-4-〔2-(4-取代-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪类化合物或其药学上可接受的盐：

其中，n＝1；

R₁为氢或氟；

R₂的定义如上所述。

本发明的结构式I的N，N’-二取代哌嗪类衍生物或其药学上可接受的盐的另一个优选实施方案是1-取代苄基-4-〔2-(4-取代-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪类化合物或其药学上可接受的盐：

其中，n＝1；

R₁的定义如上所述；

R₂为氢或氯。

本发明的结构式I的N，N’-二取代哌嗪类衍生物或其药学上可接受的盐的又一个优选实施方案是1-(苯并[1，3]二氧戊环-5-亚甲基)-4-〔2-(4-取代-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪类化合物或其药学上可接受的盐：

其中，n＝1；

R₁为与苯并合的[1，3]二氧戊环；

R₂的定义如上所述。

本发明的结构式I的N，N’-二取代哌嗪类衍生物或其药学上可接受的盐的第四个优选实施方案是1-取代苯基-4-〔2-(4-取代-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪类化合物或其药学上可接受的盐：

其中，n＝0；

R₁和R₂的定义如上所述。

本发明提供结构式I的N，N’-二取代哌嗪类衍生物的制备方法，该方法步骤如下：

(1)在有机溶剂中，在碱的作用下，哌嗪单盐酸盐与结构式a的化合物反应，得到结构式b的化合物；

其中所述的有机溶剂为四氢呋喃、乙醚、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二氧六环、乙醇、甲醇或乙酸乙酯；所述的碱为有机碱或无机碱，其中有机碱为吡啶、三乙胺、4-二甲胺基吡啶(DMAP)或二异丙基乙胺，无机碱为碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠或氢氧化钾；R₁的定义如上所述；X为Cl或Br。

(2)结构式c的化合物与乙酸2-氯乙酯反应得结构式d的化合物；

(3)结构式d的化合物经水解、氯化得结构式e的化合物；

(4)上述步骤(1)得到的结构式b的化合物与步骤(3)得到的结构式e的化合物反应，分离后得到本发明的结构式I表示的N，N’-二取代哌嗪类衍生物。

在本发明所提供的制备方法中，所使用的原料哌嗪单盐酸盐，可通过哌嗪与过量氯化氢反应得二盐酸哌嗪，再与等当量的哌嗪反应得哌嗪单盐酸盐；结构式a的卤化物可以市购得到。

本发明提供的N，N’-二取代哌嗪类衍生物的制备方法具有反应条件温和、原料丰富易得、操作及后处理简单等优点。

本发明的N，N’-二取代哌嗪类衍生物药学上可接受的盐，可采用药学上常规的成盐方法来制备。

本发明的N，N’-二取代哌嗪类衍生物在计算机虚拟筛选以及钾离子通道结合实验，通过激活/抑制通道活性，可以有效地治疗和预防钾离子通道密切相关的心血管系统疾病及其相关并发症，例如高血压、冠心病症、心肌梗塞以及其他心脑血管疾病。在N，N’-二取代哌嗪类衍生物与钾离子通道相互作用的模型上，观察到所有化合物在10^-7-10^-5M浓度范围内对此模型均有作用。

本发明的N，N’-二取代哌嗪类衍生物毒性很低。

本发明的药物组合物含有治疗有效量的上述结构式I的N，N’-二取代哌嗪类衍生物或其药学上可接受的盐，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

本发明的化合物和药物组合物可用于制备治疗或预防由钾离子通道调节引起的心脑血管疾病的药物。

本发明所提供的化合物和药用组合物可以是多种形式，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液或气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。该药物组合物还可以进一步包含气味剂、香味剂等。

本发明所提供的药物组合物其理想的比例是，式I化合物作为活性成分占总重量比65％～99.5％，其余部分为占总重量比0.5-35％，或更好为1-20％，或最好为1-10％的药学可接受的载体、稀释液或溶液或盐溶液。

本发明的药物组合物的各种剂型可按照药学领域的常规制备方法制备。

本发明的化合物和药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺、或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最佳优选日剂量为0.01-200mg/kg体重，一次性服用，或0.01-100mg/kg体重分次服用。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。

附图说明

图1为前300个结合能较小的化合物，其中，A是表示这300个化合物通过DOCK 4.0计算得到的结合能；B表示300个化合物用DOCK计算的结合能(BE₁)与Sybyl计算的结合能(BE₂)。

图2说明胞外使用1-苄基-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪(Ia)对大鼠海马神经元的影响。

图3说明胞内使用1-苄基-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪(Ia)对大鼠海马神经元的延迟整流钾离子通道的作用。

具体实施方式

在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数以及其余的说明，除另有说明外，都是以质量为说明依据的。

实施例1

计算机虚拟筛选：

1998年4月Doyle在Science上发表了第一个离子选择性通道的晶体结构，来源是细菌Streptomyces lividans的钾离子通道。利用钾通道的晶体结构，以及季铵离子(QA)、4-氨基喹啉和蝎毒、蛇毒、蜜蜂毒素等毒素与钾通道作用位点信息，选取了钾离子通道两个活性部位，运用分子对接程序DOCK4.0对其分别进行了三维数据库搜寻，以寻找可能的阻滞剂。所搜寻的小分子三维结构数据库是ACD-3D小分子数据库，约有25万个化合物。

实验方法：

(1)小分子化合物结构处理

小分子三维结构用于分子对接之前，还必须经过一系列的数据格式转换。首先将数据库中的三维结构以MDL/RDF格式输出，然后将相应的RDF文件转换成MDL/SDF格式，最后将SDF文件转换成SYBYL/MOL2数据格式(DOCK4.0附带了将MDL/SDF文件转换成SYBYL/MOL2格式的程序)。最后用分子模拟软件SYBYL中SPL程序对小分子数据库MOL2进行加氢、加电荷的处理，电荷采用的是Gasteiger-Marsili电荷。

(2)大分子结构处理

检查残基是否缺失、删除受体分子中的配体和所有水分子，给分子加全氢和Kollman_All类型电荷。

(3)活性位点的描述

考虑钾通道抑制剂作用位点，将TEA结合位点Tyr82周围8

范围内的氨基酸残基定义为外口活性口袋区域；将TEA另一结合口袋利用AutoMS程序计算钾通道活性部位的分子表面，然后利用sphgen程序产生描述活性位点的形状球集，分子对接程序利用这些球集加快对接时小分子与大分子活性部位的匹配速度。

(4)计算网格文件

利用Grid程序计算盒子内静电作用以及范德华作用能的网格文件。

(5)分子对接

利用DOCK4.0进行三维数据库搜寻对ACD库中25万个化合物进行粗筛，采用的参数为(10，10)，然后在对接结果中选择最好的5000个分子，采用参数(25，25)对这些分子进行更为细致的搜寻，最后选择其中300个结合能较大的分子进行进一步分析。

(6)对接结构处理

利用SYBYL中的Docking模块对DOCK4.0的结果进行优化，优化过程中保持大分子结构不动。最后按下式计算复合物的结合能：

E_binding＝E_R-L-E_R-E_L

其中E_R-L是复合物的能量，E_R是受体的能量，E_L是配体的能量。计算采用Tripos力场，GASTHUCK电荷，优化至能量梯度RMS小于0.5kcal/mol·

实验结果：

选取的300个化合物与钾离子通道的相互作用力，通过DOCK计算得到的结合能从-38.33至-22.76kcal/mol，通过Sybyl计算得到的结合能从-178.85至-72.15kcal/mol(如图1所示，图1为前300个结合能较小的化合物，其中，A是表示这300个化合物通过DOCK 4.0计算得到的结合能(■：总的结合能；●：范德华作用；▲：静电作用力)；B表示300个化合物用DOCK计算的结合能(BE₁)与Sybyl计算的结合能(BE₂)(▲：化合物1-6；■：化合物7-22；◆：化合物23-300。))，这两者的数据具有很大的一致性。而且同时也考虑了形状匹配、与钾离子通道形成H键的潜能和类药性等参数，选择了其中的22个化合物(编号为：01-22)做进一步的分析。通过AutoDock3.0计算得到22个化合物与钾离子通道的结合自由能。22个化合物的各种键合属性如表1所示。

表1：从300个候选化合物中挑选出来的22个化合物的结合能(千卡/摩尔)、排序和XlogP值：

^a使用DOCK计算得到的结合能(BE₁)和排序(R₁)

^b使用Sybyl计算得到的结合能(BE₂)和排序(R₂)

^c使用AutoDock计算得到的结合能(BE₃)和排序(R₃)

实施例2

1-苄基-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪的制备(Ia)

在常温下，通入新制备的干燥HCl气体至装有溶于50ml THF的8.6g(0.1mol)无水哌嗪的200ml三颈瓶中。在剧烈搅拌下，反应6h，撤去HCl气体，加入8.6g(0.1mol)无水哌嗪，常温反应2h后，剧烈搅拌下回流反应6h。冷却，过滤，滤饼用冷THF洗涤。干燥，得哌嗪单盐酸盐白色晶体22.4g(产率92.3％)。

将4.86g(0.02mol)哌嗪单盐酸盐、20mlTHF置入100ml茄形瓶中。在0-5℃下，滴加溶于20mlTHF的2.28g(0.018mol)苄氯，1h后滴毕。常温下反应过夜，回流2h，蒸干溶剂。然后，加入30ml水，再用饱和碳酸钾溶液调pH＝8-9，用二氯甲烷萃取(20ml×3)，合并有机层并用MgSO₄干燥，过滤，滤液浓缩后得N-苄基哌嗪淡黄色油状物2.15g(产率67.9％)。

将乙酸2-氯乙酯0.01mol(1.125g)与对氯苯亚磺酸钠0.01mol(1.99g)加入到20ml乙二醇二甲醚中，回流反应36小时，冷却，加入20ml水，用二氯甲烷(20ml×3)提取，合并有机层并用MgSO₄干燥，过滤，蒸去大部分溶剂，硅胶柱分离(二氯甲烷∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1∶20，体积比)，得乙酸2-(4-氯-苯磺酰基)乙酯白色晶体1.12g(产率44.4％)。

将0.01mol(2.52g)乙酸2-(4-氯-苯磺酰基)乙酯加入到20ml的75％乙醇中，加入20ml 40％氢氧化钠，回流8小时。蒸去部分溶剂，然后用二氯甲烷(20ml×3)提取，合并有机层并用MgSO₄干燥，过滤，滤液浓缩后得2-(4-氯苯磺酰基)乙醇灰色油状物：1.82g(产率82.4％)。

将1.0mmol(0.221g)2-(4-氯苯磺酰基)乙醇溶于5ml二氯甲烷中，加入五氯化磷0.5克，在冰水浴中反应2小时，常温反应过夜。1小时内滴加10ml冰水，然后用二氯甲烷(20ml×3)提取，有机层用MgSO₄干燥，过滤，柱层析分离(二氯甲烷∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1∶20，体积比)，得1-氯-4-(2-氯-乙磺酰基)-苯灰白色液体：0.21g(产率87.5％)。

向50ml反应瓶中加入1mmol(0.238g)1-氯-4-(2-氯-乙磺酰基)-苯、1mmol(0.176g)N-苄基哌嗪、1.5mmol(0.207g)K₂CO₃、10mg I₂和20mlTHF，回流反应3小时；然后停止反应，蒸去溶剂，加入20ml水，用二氯甲烷(20ml×3)提取，合并有机层并用MgSO₄干燥，过滤，滤液浓缩后，硅胶柱分离(二氯甲烷∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1∶4，体积比)，得1-苄基-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪白色晶体0.312g(产率82.3％)。

IR(KBr)：3448，1579，1479cm^-1。¹H NMR(CDCl₃)：2.62(t，8H)；2.55(t，2H)；3.75(t，2H)；3.84(s，2H)；7.25(m，5H)；7.50(m，2H)；7.83(m，2H)。HRMS(SCI)m/z calcd for M⁺，378.1169；found，378.1182。

实施例3

1-(4-氟苯基)-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪(Ib)的制备

用1-(4-氟苯基)-哌嗪代替1-苄基哌嗪，按实施例2所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例2，得到目标化合物1-(4-氟苯基)-4-〔2-(4-氯-苯砜基)-乙基〕-哌嗪。

IR(KBr)：1625cm^-1。¹HNMR(CDCl₃)ppm：2.55(t，4H，)；2.85(t，2H)；2.98(t，4H)；3.35(t，2H)；6.82(m，2H)；6.94(m，2H)；7.54(m，2H)；7.87(m，2H)。HRMS(SCI)m/z calcd for M⁺，382.0918；found，382.0922。

实施例4

1-(2-氟苯基)-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪(Ic)的制备

用1-(2-氟苯基)-哌嗪代替1-苄基哌嗪，按实施例2所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例2，得到目标化合物1-(2-氟苯基)-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪。

¹HNMR(CDCl₃)ppm：2.55(t，4H)；2.85(t，2H)；2.98(t，4H)；3.35(t，2H)；6.90(m，2H)；7.02(m，2H)；7.54(m，2H)；7.87(m，2H)。HRMS(SCI)m/zcalcd for M+，382.0918；found，382.0925。

实施例5

1-(苯并[1，3]二氧戊环-5-基甲基)-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪(Id)的制备

用苯并[1，3]二氧戊环-5-基甲基溴代替苄氯，按实施例2所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例2，得到目标化合物1-(苯并[1，3]二氧戊环-5-基甲基)-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪。

IR(KBr)：1580cm^-1。¹H NMR(CDCl₃)：2.56(t，8H)；2.85(t，2H)；3.85(t，2H)；3.98(s，2H)；5.88(s，2H)；7.10-7.22(m，3H)；7.50-7.83(m，4H)。HRMS(SCI)m/z calcd for M⁺，422.1067；found，422.1067。

实施例6

1-(二苯基甲基)-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪(Ie)的制备

用二苯基甲基溴代替苄氯，按实施例2所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例2，得到目标化合物1-(二苯基甲基)-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪。

IR(KBr)：1625cm^-1。¹H NMR(CDCl₃)：2.68(t，8H)；2.55(t，2H)；3.75(t，2H)；5.15(s，1H)；7.05-7.14(m，10H)；7.52(m，2H)；7.88(m，2H)。HRMS(SCI)m/z calcd for M⁺，454.1482；found，454.1491。

实施例7

1-苯基-4-(2-苯磺酰基-乙基)-哌嗪(If)的制备

用苯亚磺酸钠代替对氯苯亚磺酸钠，用1-苯基哌嗪代替1-苄基哌嗪，按实施例2所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例2，得到目标化合物1-苯基-4-(2-苯磺酰基-乙基)-哌嗪。

IR(KBr)：1605cm^-1。¹HNMR(CDCl₃)ppm：2.55(t，4H，)；2.85(t，2H)；2.98(t，4H)；3.35(t，2H)；6.82-7.14(m，5H)；7.54(m，2H)；7.87(m，2H)。HRMS(SCI)m/z calcd for M⁺，364.1012；found，364.1018。

实施例8

1-(4-氟苄基)-4-(2-苯磺酰基-乙基)-哌嗪(Ig)的制备

用苯亚磺酸钠代替对氯苯亚磺酸钠，用1-(4-氟苄基)哌嗪代替1-苄基哌嗪，按实施例2所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例2，得到目标化合物1-(4-氟苄基)-4-(2-苯磺酰基-乙基)-哌嗪。

IR(KBr)：1588cm^-1；¹HNMR(CDCl₃)ppm：2.55(t，4H，)；2.85(t，2H)；2.98(t，4H)；3.35(t，2H)；5.22(s，2H)；6.82(m，2H)；6.94(m，2H)；7.54(m，2H)；7.87(m，2H)；HRMS(SCI)m/z calcd for M⁺，396.1075；found，396.1081。

实施例9

1-(2-氟苄基)-4-(2-苯磺酰基-乙基)-哌嗪(Ih)的制备

用苯亚磺酸钠代替对氯苯亚磺酸钠，用1-(2-氟苄基)哌嗪代替1-苄基哌嗪，按实施例2所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例2，得到目标化合物1-(2-氟苄基)-4-(2-苯磺酰基-乙基)-哌嗪。

IR(KBr)：1622cm^-1；¹HNMR(CDCl₃)ppm：2.55(t，4H)；2.85(t，2H)；2.98(t，4H)；3.35(t，2H)；5.26(s，2H)；6.90(m，2H)；7.02(m，2H)；7.54(m，2H)；7.87(m，2H)HRMS(SCI)m/z calcd for M⁺，396.1075；found，396.1077

实施例10

1-[2-(苯并[1，3]二氧戊环-5-磺酰基)-乙基]-4-苯基-哌嗪(Ii)的制备

用1-苯基哌嗪代替1-苄基哌嗪，用苯并[1，3]二氧戊环-5-亚磺酸钠代替对氯苯亚磺酸钠，按实施例2所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例2，得到目标化合物1-[2-(苯并[1，3]二氧戊环-5-磺酰基)-乙基]-4-苯基-哌嗪。

试验实施例

生物活性测试：

实验名称：大鼠海马CA1区锥体细胞的急性分离和全细胞膜片钳记录实验方法：取5-9天Spragur-Dawley新生大鼠，断头处死后取出全脑，置入0℃人工脑脊液中(ACSF^*)，用振动切片机切取厚约400-500μm的脑薄片，分出海马部分，移入含有proteaseXIII 1mg/ml的标准细胞外液(ES^*)中32℃孵育8分钟。取出后用新鲜外液冲洗2-3遍，将海马转入含胰蛋白酶抑制剂1mg/ml、牛血清白蛋白1mg/ml的外液中终止酶解，持续通氧静置备用。在解剖显微镜下分离出CAI区，采用3根口径(2-0.5mm)渐小的吸管轻轻吹打组织块，将含海马锥体细胞的上清液移入培养皿，吸去大部分悬浮液并换上新的标准细胞外液，即可开始记录。

实验采用Axopatch 200A放大器以全细胞膜片钳模式记录电流反应，室温在21-23℃。电极尖端内径为1-2μm，充灌内液后阻抗为3-5MΩ。钳制电压指令及膜电流的记录由pClamp 6.2软件通过DigiData1200A A/D转换接口控制，静息钳制电压在-50mv，采样频率为10-40KHz，滤波频率为1-10KHz。串联电阻补偿一般为75～85％，电容补偿为60～80％；通过P/4方法消除漏电流及残留的电容电流。在急性分离的大鼠海马CA1区锥体细胞上可记录到两种具有不同动力学特征的钾电流：快失活瞬间钾电流(I_A)和衰减非常缓慢的延迟外向整流钾电流(I_K)。实验采用电压方法分离总钾电流和I_K：钳制电压由-50mv首先超级化到-110mv，然后以10mv的电压步阶去极化到+60mv，即可记录出I_A和I_K的混合总电流；当钳制电压在-110mv的超极化后插入一-50mv、50ms的中间电压时，快速衰减的I_A成分可完全失活，这就分离到了I_K成分；总电流减去I_K即得到I_A ²。所用药物用含1μM TTX的外液配制以阻断钠通道。给药系统为Bio-Logic RSC-100 18管快速给药装置。所得数据的均值和标准误用x±S.E.M.表示。

待测化合物：Ia-Ii

实验结果：

(1)如图2所示，胞外使用1-苄基-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪对大鼠海马神经元的影响。图A左列图形显示I_K和I_A的分离：上方原始电流图为总钾电流IT，中间为I_K，下方为从IT减去I_K所得电流即I_A。右列图形分别为给药后的IT、I_K和I_A。激活IT所使用的电压为：超极化至-110mV，然后去极化至+60mV持续400ms；激活I_K的电压与IT的相似，但在去极化前加入一短暂50ms的-50mV去极化电压。图B为1-苄基-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪抑制I_K和I_A的浓度-效应曲线。I_A为峰值，而I_K则为去极化后300ms测量值。(n＝5～12)。

(2)如图3所示，在胞内使用1-苄基-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪对大鼠海马神经元的延迟整流钾离子通道的作用。图中纵坐标为I_K的相对值，横坐标为胞内给药时间胞内使用的化合物浓度在胞外对I_K的抑制均在75％左右。

通过生物活性测试表明，实施例中的N，N’-二取代哌嗪类衍生物对I_K和I_A均有不同程度的抑制作用，其IC₅₀如表2所示。其中，1-苄基-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪在细胞外抑制选择性最高，对I_K抑制为I_A的16.3倍(IC₅₀比率为16.3)。

表2：

n为受测试的神经元数目

Claims (12)

1.具有如下结构式I的N，N’-二取代哌嗪类衍生物：

其中：

n＝0-1的整数；

R₁和R₂各自独立地表示氢、卤素、C1-C6直链或支链的饱和烃基、芳香基或5-7元杂环基；

其中所述的卤素为氟、氯、溴或碘；

所述的芳香基是苯基、取代苯基、萘基或联苯基，其中所述的取代苯基包括1～4个取代基，该取代基选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、三氟甲基、羧基、C1-C4烷氧基和C1-C4酰基之中；

所述的5-7元杂环基含有1-3个选自氧、硫或氮的杂原子，且被结构式I中的苯基并合。

2.根据权利要求1所述的N，N’-二取代哌嗪类衍生物，其特征是，所述的N，N’-二取代哌嗪类衍生物是1-取代苄基-4-〔2-(4-取代-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪类化合物，其中，n＝1；R₁为氢或氟。

3.根据权利要求1所述的N，N’-二取代哌嗪类衍生物，其特征是，所述的N，N’-二取代哌嗪类衍生物是1-取代苄基-4-〔2-(4-取代-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪类化合物，其中，n＝1；R₂为氢或氯。

4.根据权利要求1所述的N，N’-二取代哌嗪类衍生物，其特征是，所述的N，N’-二取代哌嗪类衍生物是1-(苯并[1，3]二氧戊环-5-亚甲基)-4-〔2-(4-取代-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪类化合物，其中，n＝1，R₁为与苯并合的[1，3]二氧戊环。

5.根据权利要求1所述的N，N’-二取代哌嗪类衍生物，其特征是，所述的N，N’-二取代哌嗪类衍生物是1-取代苯基-4-〔2-(4-取代-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪类化合物，其中，n＝0。

6.根据权利要求1所述的N，N’-二取代哌嗪类衍生物，其特征是，所述的N，N’-二取代哌嗪类衍生物选自1-苄基-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪、1-(4-氟苯基)-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪、1-(2-氟苯基)-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪、1-(苯并[1，3]二氧戊环-5-基甲基)-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪、1-(二苯基甲基)-4-〔2-(4-氯-苯磺酰基)-乙基〕-哌嗪、1-苯基-4-(2-苯磺酰基-乙基)-哌嗪、1-(4-氟苄基)-4-(2-苯磺酰基-乙基)-哌嗪、1-(2-氟苄基)-4-(2-苯磺酰基-乙基)-哌嗪和1-[2-(苯并[1，3]二氧戊环-5-磺酰基)-乙基]-4-苯基-哌嗪之中。

7.一种权利要求1所述的N，N’-二取代哌嗪类衍生物的制备方法，该方法包括：

(1)在有机溶剂中，在碱的作用下，哌嗪单盐酸盐与结构式a的化合物反应，得到结构式b的化合物；

其中所述的有机溶剂为四氢呋喃、乙醚、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二氧六环、乙醇、甲醇或乙酸乙酯；所述的碱为有机碱或无机碱，其中有机碱为吡啶、三乙胺、4-二甲胺基吡啶或二异丙基乙胺，无机碱为碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠或氢氧化钾；R₁的定义如权利要求1所述；X为Cl或Br；

(2)结构式c的化合物与乙酸2-氯乙酯反应得结构式d的化合物，其中R₂的定义如权利要求1所述；

(3)结构式d的化合物经水解、氯化得结构式e的化合物；

(4)上述步骤(1)得到的结构式b的化合物与步骤(3)得到的结构式e的化合物反应，分离后得到结构式I表示的N，N’-二取代哌嗪类衍生物。

8.一种具有钾离子通道激动或抑制活性的药物组合物，其特征是，该组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的N，N’-二取代哌嗪类衍生物。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征是，所述的N，N’-二取代哌嗪类衍生物占该药物组合物总重量比的65％～99.5％。

10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其特征是，该组合物进一步包括一种或多种药学上可接受的载体。

11.权利要求1所述的N，N’-二取代哌嗪类衍生物在制备治疗或预防心血管系统疾病及其相关并发症的药物方面的用途。

12.权利要求8所述的药物组合物在制备治疗或预防心血管系统疾病及其相关并发症的药物方面的用途。

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