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CN100488563C - 免疫原性降低的经修饰抗egfr抗体 - Google Patents

免疫原性降低的经修饰抗egfr抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及特别是欲施用于人的并尤其用于肿瘤治疗性应用的针对EGF受体(HER1)的抗体。该抗体为经修饰的抗体，其中所述修饰导致了抗体在施用于人受试者后引起免疫反应的趋势降低。本发明尤其涉及对不同形式的抗EGFR抗体425及其片段的修饰，以产生当体内使用时较任一未修饰的对应物而言，基本上没有免疫原性或具有较小免疫原性的Mab425变体。

Description

免疫原性降低的经修饰抗EGFR抗体
发明领域
本发明涉及特别是欲施用于人的并尤其用于肿瘤治疗性应用的针对EGF受体(HER1)的抗体。该抗体为经修饰的抗体，其中所述修饰导致了抗体在施用于人受试者后引起免疫反应的趋势降低。本发明尤其涉及对不同形式的抗EGFR抗体425及其片段的修饰，以产生当体内使用时较任一未修饰的对应物而言，基本上没有免疫原性或具有较小免疫原性的Mab425变体。本发明还涉及来自于所述未修饰抗体的T细胞表位肽，通过此T细胞表位肽可产生免疫原性降低的经修饰Mab 425变体。
发明背景
表皮生长因子受体(EGF受体或EGFR)(也称作c-erbB1/Her 1)和neu癌基因产物(也称作为c-erbB2/Her 2)均为EFG受体超家族的成员，属于受体酪氨酸激酶的大家族。它们在细胞表面与特异的生长因子或天然配体相互作用，如与EGF或TGF α相互作用，由此活化受体酪氨酸激酶。下游信号传递蛋白质的级联被活化后，这通常导致基因表达改变和生长速率增加。
C-erbB2(Her 2)为分子量约185,000的跨膜酪氨酸激酶，与EGF受体(Her 1)具有相当高的同源性，虽然至今尚未明确确定Her 2的特异性配体。EGF受体为分子量约170,000的跨膜糖蛋白，存在于许多种上皮细胞上。它由至少三个配体：EGF、TGF-α(转化生长因子α)和双调蛋白活化。表皮生长因子(EGF)和转化生长因子-α(TGF-α)均显示出可以结合EGF受体，并导致细胞增殖和肿瘤生长。这些生长因子不结合Her 2(Ulrich和Schlesinger，1990，细胞(Cell)61，203)。与因为其二聚体特性而诱导受体二聚体化的一些生长因子家族(例如PDGF)不同，单体生长因子如EGF含有两个受体结合位点，并因此可交联两个相邻的EGF受体(Lemmon等人，1997，EMBO J.16，281)。受体二聚体化对刺激生长因子受体内在的催化活性和自体磷酸化作用是必需的。应注意受体蛋白质酪氨酸激酶(PTKs)可进行同源和异源二聚体化。临床研究表明EGF受体和c-erbB2在某些类型的肿瘤中均过表达，尤其是在乳腺、卵巢、膀胱、结肠、肾、头和颈的癌以及肺鳞癌中(Mendelsohn，1989，癌细胞(Cancer Cells)7，359，Mendelsohn，1990，癌生物学(Cancer Biology)1，339)。因此，这些观察激励了靶向抑制人EGF受体或c-erbB2功能作为新的癌症治疗方法的临床前研究(参见例如Baselga等人，1996，J.Clin.Oncol.14，737；Fan和Mendelsohn，1998，Curr.Opin.Oncol.10，67).已报道了，例如抗EGF受体抗体及抗Her 2抗体在人癌症治疗中显示出富有成效的结果。因此，人源化的单克隆抗体4D5(hMAb 4D5，
Figure C02805156D0007134008QIETU
)已为商业产品。
已证实，抗EGF受体抗体在阻断EGF和TGF-α与受体结合的同时显示出可以抑制肿瘤细胞增殖。由于这些发现，已研发了许多的小鼠和大鼠单克隆抗EGF受体抗体，并试验了它们体外和体内对肿瘤细胞生长的抑制能力(Modjtahedi和Dean，1994，肿瘤学杂志(J.Oncology)4，277)。人源化的单克隆抗体425(hMAb 425)(US 5,558,864；EP 0531 472)和嵌合单克隆抗体225(cMAb 225)(Naramura等人，1993，Cancer Immunol.Immunother.37，343-349，WO 96/40210)均靶向EGF受体，并已在临床试验中显示出效力。
C225抗体被证实可体外抑制EGF-介导的肿瘤细胞生长，并在裸鼠中抑制人肿瘤的体内形成。而且，重要的是在异种移植的小鼠模型中该抗体表现出可以与某些化学治疗剂(即，阿霉素、紫杉醇和顺铂)协同作用以体内消除人肿瘤。Ye等人(1999，癌基因(Oncogene)18，731)已报道了人卵巢癌细胞可成功地用cMAb 225和hMAb 4D5的组合加以治疗。
有许多例子表明治疗蛋白的效率受限于针对所述治疗蛋白的干扰性免疫反应。已有若干种小鼠单克隆抗体表现出治疗多种人类疾病的前景，但在某些情况下由于诱导出相当程度的人抗鼠抗体(HAMA)反应而未能成功应用[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45：879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.135：1530-1535]。对于单克隆抗体，已发展了多种技术以试图减弱HAMA反应[WO 89/09622；EP0239400；EP 0438310；WO 91/06667]。这些重组DNA方法通常是减少最终的抗体构建体中小鼠的遗传信息，同时增加最终构建体中人的遗传信息。尽管如此，在一些情况下，所得的“人源化”抗体仍能引起患者的免疫反应[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2：449,456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 68：1417-1420]。
抗体不是唯一一类作为治疗剂施用的可引起免疫反应的多肽分子。即使是人源的并在人与人之间具有相同氨基酸序列的蛋白质仍可在人体中诱导免疫反应.明显的实例包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的治疗性应用(Wadhwa，M.等人(1999)临床癌研究(Clin.Cancer Res.)5：1353-1361)和干扰素α2的治疗性应用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94：300-305；Stein，R.等人(1988)新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)318：1409-1413)等。
诱导免疫反应的主要因素是在蛋白中存在可经由MHC II类分子的呈递作用激活T-细胞活性的肽(即所谓的T-细胞表位)。这种潜在的T-细胞表位通常定义为任何能够与MHC II类分子结合的氨基酸序列。可测定此种T-细胞表位以建立MHC结合。隐含地，＂T-细胞表位＂是指当其与MHC分子结合时可被T-细胞受体(TCR)识别的表位，并且至少原则上，这种表位可以通过与TCR相互作用而激活这些T-细胞以促进T-细胞反应。但是，通常都知道，可以将某些被发现可以结合MHC II类分子的肽保留在蛋白质序列中，因为此类肽在最终蛋白质所施用至的生物体内被识别为“自己”。
已知这些T-细胞表位肽中的某些可在肽、多肽或蛋白的细胞内降解过程中释放出来，随后由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递以引发T-细胞激活作用。对于MHC II类分子呈递的肽，然后这种T-细胞激活作用可，例如通过直接刺激B细胞产生抗体而引起抗体反应。
MHC II类分子为一组在T辅助细胞的选择和活化中起中心作用的高度多态性蛋白质。人类白细胞抗原群DR(HLA-DR)为该组蛋白质的主要同种型，也是本发明的主要集中点。但是，同种型HLA-DQ和HLA-DP行使相类似的作用，因此本发明同样适用于它们。MHC II类DR分子由α和β链组成，它们的C-末端插入并穿过细胞膜。虽然结合沟可容纳最多11个氨基酸，但每一异源-二聚体具有一个能结合长度在9至20个氨基酸之间的肽的配体结合结构域.配体结合结构域由α链的1至85位氨基酸和β链的1至94位氨基酸组成。最近证实DQ分子具有同源结构，预期DP家族的蛋白质亦非常相似。人类已知存在DR同种型的约70种不同的同种异型，对于DQ已知存在30种不同的同种异型且对于DP已知存在47种不同的同种异型。每一个体具有二至四个DR等位基因，两个DQ和两个DP等位基因。已解析了许多DR分子的结构，这些结构揭示了一个具有一些可结合肽的疏水残基(口袋残基)的疏水口袋的敞口肽结合沟[Brown等人，自然(Nature)(1993)364：33；Stern等人(1994)自然(Nature)368：215]。确定II类分子的不同同种异型的多态性促成了肽结合沟内用于结合肽的不同表面的大量多样性，并在群体水平上确保了在识别外源蛋白质并引起对病原生物体的免疫反应的能力方面有最大的灵活性。
在配体结合结构域内有相当多的多态性，其中在不同地理人群和种族群体中具有不同的＂家族＂。该多态性影响肽结合结构域的结合特性，因此DR分子的不同＂家族＂将对具有不同序列特性的肽存在特异性，虽然可能存在一些重叠。该特异性决定了Th-细胞表位的识别(II类T细胞反应)，其最终负责驱动对B细胞表位的抗体反应，其中所述B细胞表位存在于Th-细胞表位所来自的同一蛋白质上.这样，个体对蛋白质的免疫反应很大程度上受T细胞表位识别的影响，其随个体的HLA-DR同种异型的肽结合特异性而改变。因此，为了在世界人群中鉴定蛋白质或肽中的T细胞表位，就可能希望考虑到尽可能多样的HLA-DR同种异型集合的结合特性，由此覆盖尽可能高的世界人口百分率。
针对治疗性蛋白(如本发明的目的蛋白)的免疫反应通过MHC II类肽呈递途径进行。其间外来蛋白经吞噬和加工后与DR、DQ或DP型MHC II类分子结合以进行呈递。MHC II类分子由专门抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞、树突状细胞等表达。通过MHC II类肽复合体与T细胞表面的关联性T-细胞受体的相互作用，及与某些其他共同受体，如CD4分子的交联结合可诱导T-细胞进入激活状态。上述激活作用可导致细胞因子释放，进一步激活其他淋巴细胞如B细胞产生抗体或激活T杀伤细胞形成完整的细胞免疫反应。
肽与给定的MHC II类分子结合以备在APC表面呈递的能力依赖于多种因素，最主要的是肽的一级结构。这影响其蛋白酶剪切倾向及其在MHC II类分子的肽结合隙中的结合亲和性。在APC表面的MHC II类/肽复合体向能识别决定簇的特定T-细胞受体(TCR)呈递一个结合面，其中所述决定簇由肽和MHC II类分子的暴露残基共同提供。
本领域中有鉴定能结合MHC II类分子的合成肽的方法(例如WO98/52976和WO00/34317)。这种肽不是在所有情况下都行使T细胞表位的功能，特别是在体内会受加工途径和其他现象的影响。T-细胞表位鉴定是表位清除的第一步。鉴定及从蛋白中去除潜在T-细胞表位先前已有公开。本领域中已有检测T-细胞表位的方法，通常是通过计算机手段在经试验确定的T-细胞表位中扫描公认的序列基元，或利用计算机技术预测MHC II类结合肽，特别是DR-结合肽。WO98/52976和WO00/34317中公开了鉴定具有与人MHC II类DR同种异型亚群结合的潜在能力的多肽序列的计算机穿线方法(computational threadingapproaches)。这些教导中，通过在人源或非人源治疗性抗体或非抗体蛋白一级序列中进行明智的氨基酸替换以去除预测的T-细胞表位。
本领域中还使用了其它技术，这些技术利用重组MHC分子与合成肽组合形成的可与来自人或实验动物受试者外周血样本的T细胞克隆结合的可溶性复合体来实施[Kern，F.等人(1998)自然医药(Nature Medicine)4：975-978；Kwok，W.W.等人(2001)免疫学趋势(TRENDS in Immunology)22：583-588]，这些技术也可用于表位鉴定策略中。
如上所述及作为其结果，可能希望在给定的原则上具有治疗价值但最初具有免疫原性的多肽、蛋白质或免疫球蛋白中确定并去除或至少减少T细胞表位。
早先已提供了经修饰的Mab 425(US 5,558,864；EP 0531472)以及c225的嵌合和人源化变体(WO 96/40210)，但是这些方法在于通过标准方法从所述抗体的鼠形式制备其嵌合和人源化变体来降低免疫原性。此类教导没有认识到T细胞表位对蛋白质免疫原性特性的重要性，也没有考虑到按照本发明方案以特异的和受控的方式直接影响所述特性。
但是，仍继续需要具有增强特性的抗EGFR抗体。所需的增强包括所述治疗剂的表达和纯化的备选方案和形式，以及特别是对该免疫球蛋白生物特性的改良。尤其需要的是增强当施用于人受试者时的体内特征。鉴于此，极为希望提供在人受试者体内具有降低的或没有诱导免疫反应的能力的抗EGFR抗体，尤其是MAb 425。
发明概述
本发明提供了抗EGFR抗体的经修饰形式，优选地提供了MAb 425的经修饰形式，其中免疫特性通过减少或去除潜在T细胞表位数而改变。
本发明公开了在MAb 425一级序列中鉴定到的、由于具MHC II类结合潜力而是潜在T细胞表位的序列。
本发明还公开了分子的一级序列中根据本发明可以通过特定的氨基酸替代、添加或缺失进行改变而又基本上不影响生物学活性的特定位点。在只有同时丧失生物活性或抗体特异性/亲合性才能去掉免疫原性的情况下，可通过在所述抗体变体的氨基酸序列中做进一步的改造以恢复所述的参数。
本发明还公开了生产这种经修饰的抗体的方法，尤其是鉴定为减少或去除免疫原性位点而需要改变的T-细胞表位的方法。
预期根据本发明修饰的抗EGFR抗体在人体中的循环时间会延长，因此对慢性或复发性疾病，如多种适应症特别有益。本发明提供了预期可显示增强的体内特性的所述抗体蛋白质的修饰形式。这些经修饰的抗EGFR抗体分子可应用于药物组合物中。
总之本发明涉及如下内容：
针对EGF受体(Her 1)的修饰抗体或其片段，当暴露于给定物种的免疫系统并与未修饰的抗体比较时，所述修饰抗体或其片段较针对同一受体的任一最初的具免疫原性的未修饰抗体而言，基本上没有免疫原性或具有较小的免疫原性，其中修饰抗体-与最初的未修饰的抗体比较-不包含或包含数目减少的T细胞表位序列的和/或可结合来自所述未修饰抗体的肽的MHC同种异型；
如前所述的修饰抗体，其中所述最初存在的T细胞表位为MHC II类配体或显示出能通过呈递于MHC II类上刺激或结合T细胞的肽序列；
如前所述的修饰抗体，其中在任一最初存在的T细胞表位中改变了1-9个氨基酸残基，优选地改变了1个氨基酸残基；
如前所述的修饰抗体，其中氨基酸残基的改变为在特定位点处向最初存在的氨基酸残基添加另外的氨基酸残基或用之替换最初存在的氨基酸残基或将最初存在的氨基酸残基删除；
如前所述的修饰抗体，其中额外地进一步进行特定氨基酸的替换、添加或删除以恢复所述分子的生物活性；
如前所述的修饰抗体，其中氨基酸的改变是参考同源蛋白质序列和/或参考in silico模建技术而进行的；
如前所述的修饰抗体，其中所述最初的具免疫原性的未修饰抗体包含完全或部分来自非人源的序列；
如前所述的修饰抗体，其中所述最初的具免疫原性的未修饰抗体为除了那些不靠近CDR区的残基外包含来自相应的人参照构架序列的表面残基的嵌合抗体或非-人抗体(贴面化抗体，veneered antibody)；
如前所述的修饰抗体，其中所述最初的具免疫原性的未修饰抗体为鼠MAb 425，优选地包含如表5中所述的任一序列；
编码如上所述修饰抗体的重链和/或轻链的DNA序列；
药物组合物，其包含如上所定义的经修饰的抗EGFR抗体，任选地还包含可药用载体、稀释剂或赋形剂；
相应的药物组合物或药剂盒，其包含另外的药理学活性药物，优选地为细胞毒性剂，更优选地为化学治疗剂；
用于制备针对EGF受体(Her 1)的修饰抗体或其片段的方法，当暴露于给定物种的免疫系统并与未修饰的抗体比较时，所述修饰抗体或其片段较针对同一受体的任一最初的具免疫原性的未修饰抗体而言，基本上没有免疫原性或具有较小的免疫原性，其中所述方法包括以下步骤：(i)确定最初的具免疫原性的未修饰抗体或其部分的重链和/或轻链的氨基酸序列，(ii)用任一方法在该抗体的氨基酸序列中鉴定出一个或多个潜在的T细胞表位，此方法包括使用体外或in silico技术或生物学鉴定法确定肽与MHC分子的结合，(iii)设计在已鉴定的潜在T细胞表位中具有一个或多个氨基酸改变的新序列变体，以显著减少或消除T细胞表位的活性，此效果可以通过使用体外或in silico技术或生物学鉴定法测定肽与MHC分子的结合或通过肽-MHC复合体与T细胞的结合而确定，(iv)通过重组DNA技术构建此类序列变体，并试验所述变体，以确定一个或多个具有所希望特性的变体，以及(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)；
如前所述的方法，其中步骤(iii)是通过，任选地参考同源蛋白质序列和/或参考in silico模建技术，在任一最初存在的T细胞表位中替换、添加或删除1-9个氨基酸残基而进行的；
如前所述的方法，其中步骤(ii)是通过下列步骤实施的：(a)选择具有已知氨基酸残基序列的肽的一个区域；(b)依次从所选区域中采集具预定一致大小的并至少由三个氨基酸残基构成的重叠氨基酸残基片段；(c)对每一所述采集片段计算MHC II类分子结合分值，方法为对所述采集的氨基酸残基片段中的每一疏水氨基酸残基侧链赋值求和；以及(d)基于所计算的片段的MHC II类分子结合分值，鉴定出至少一个适于改变的所述片段，以改变肽的总MHC II类结合分值并且不实质性降低该肽的治疗性用途；
如前所述的方法，其中步骤(c)通过应用改进的评分函数及如下方式实施，其中所述评分函数的改进为在其中包括12-6范德华配体-蛋白质能量排斥项和配体构象能量项，而所述方式为(1)提供MHCII类分子模型第一数据库；(2)针对所述MHC II类分子模型提供所容许的肽主链的第二数据库；(3)从所述第一数据库选择一个模型；(4)从所述第二数据库选择一个容许的肽主链；(5)鉴定在每一采集片段中存在的氨基酸残基侧链；(6)确定每一采集片段中存在的所有侧链的结合亲和性值；以及对每一所述膜型和每一所述主链重复步骤(1)至(5)；
如前所述的方法，其中使用最初的具免疫原性的未修饰抗体，该未修饰抗体包含完全或部分来自非人源的序列；
如前所述的方法，其中所述最初的具免疫原性的未修饰抗体为除了那些不靠近CDR区的残基外包含来自相应的人参照构架序列的表面残基的嵌合抗体或非-人抗体(贴面化抗体)；
如前所述的方法，其中所述最初的具免疫原性的未修饰抗体为鼠抗体，优选地为鼠MAb 425；
13聚体(mer)T细胞表位肽的用途，优选地所述13mer T细胞表位的至少9个连续氨基酸残基肽的用途，其中所述肽具有潜在的MHC II类结合活性并产生自具有免疫原性的未修饰抗体，其用于制备当体内使用时与所述未修饰抗体相比基本上没有免疫原性或具有较小免疫原性的免疫原性改变的抗体，每一上述抗体和权利要求中的抗体。
根据本发明产生经修饰的抗EGFR抗体的本发明通用方法包括以下步骤：
(a)确定抗体或其部分的氨基酸序列；
(b)使用任一方法在该免疫球蛋白的氨基酸序列中确定出一个或多个潜在的T细胞表位，所述方法包括使用体外或in silico技术或生物学鉴定法确定肽与MHC分子的结合；
(c)设计在已确定的潜在T细胞表位中具有一个或多个氨基酸改变的新序列变体，以实质上减少或消除T细胞表位的活性，这一效果可通过使用体外或in silico技术或生物学鉴定法测定肽与MHC分子的结合而确定。构建此类序列变体时应避免由该序列变体产生新的潜在T细胞表位，否则再对此新的潜在T细胞表位进行改变以实质性减少或消除T细胞表位的活性；和
(d)根据熟知的重组技术，利用重组DNA技术构建此类序列变体，并试验所述变体，以确定一个或多个具有所希望特性的变体.
对于步骤(b)中对潜在T-细胞表位的鉴定可依照本领域已公知的方法进行。在WO 98/59244；WO 98/52976；WO 00/34317中已公开了适当的方法，并优选用于鉴定Mab 425-衍生肽对MHC II类分子的结合倾向。在实施例部分公开了另一种非常有效的通过计算鉴定T-细胞表位的方法，它是本发明的优选实施方案。
实践中，可以制备多种抗EGFR免疫球蛋白变体，优选地MAb 425变体然后检测所需的免疫和功能特性。最优选通过重组DNA技术生产所述抗体变体，但也可以考虑利用其他的方法，包括化学合成抗体片段。
本发明涉及抗体类似物，其中，在可以导致所述蛋白中一个或多个潜在的T细胞表位的活性明显减弱或从所述蛋白中去除一个或多个潜在的T-细胞表位的位点替换至少一个氨基酸残基。对于表1中鉴定的任何潜在的MHC II类配体，特定位点的一个或多个氨基酸的替代可产生当作为治疗剂施用于人宿主时具有减弱的潜在免疫原性的MAb425。优选地，在预计可以实现基本上减弱或去除T-细胞表位活性的肽序列中的适当位点进行氨基酸替代。实践中，合适的位点优选为在MHC II类结合沟所提供的口袋之一中发生结合的氨基酸残基。
最优选的是在所述肽的称作P1或P1锚的位置改变在裂缝的第一口袋内的结合。公认地，肽的P1锚残基和MHC II类结合沟的第一口袋之间的结合相互作用的质量是整个肽的总结合亲和性的主要决定因素。在所述肽的这一位置的适当替代应当是替换为不易容纳到所述口袋中的残基，例如替换为更亲水的残基。所述肽中处于在MHC结合裂缝的其他口袋区域内结合的位置的氨基酸残基也被认为是落入本发明的范围内。
可以理解，由给定的潜在T-细胞表位内的单一氨基酸替代导致该表位去除的路线是最优选的。也可以在单一表位内进行组合替代，例如，这对于单独定义的表位间彼此重叠的情况特别适宜。此外，在给定的表位内的单氨基酸替代或在一个表位内的组合氨基酸替代也可以在非对应于MHC II类结合沟的＂口袋残基＂的位置，而是在所述肽序列内的任意位点进行。替代可参照同源结构或由本领域已知的in silico技术产生的结构方法，也可以根据本发明分子的已知结构特征进行。所有此类替代均落入本发明的范围内.
也可以考虑在上面所鉴定的肽之外进行氨基酸替代，特别是与在所列肽内进行的替代相结合的情况下。例如可以考虑利用某种改变恢复变体分子的结构或生物学活性。这种补偿性的改变和在抗-EGFR抗体中缺失或添加特定的氨基酸残基以得到具有所需活性的变体的改变，以及在任何本发明公开的肽中的改变均落入本发明的范围内。
本发明的范围涉及经修饰的抗-EGFR抗体，优选MAb425，含有上述经修饰的免疫球蛋白或其片段或其融合蛋白的组合物及其相关的组合物应认为也落入本发明的范围内。另一方面，本发明涉及编码经修饰的抗-EGFR抗体，优选MAb425的核酸。另一方面本发明涉及利用此经修饰的免疫球蛋白对人进行治疗的方法。
发明详述
应指出的是，此前和此后所用术语＂较小或降低的免疫原性＂为相对术语，涉及当暴露于同一物种体内时，各最初的源抗体与本发明的修饰抗体进行的免疫原性比较。这样，源抗体可为完全的非人抗体，如小鼠或大鼠抗体。但是，本发明也涉及已包含人序列的抗体，如嵌合或人源化抗体。在这些通过经典的标准方法获得的人工设计的抗体中，其一级结构中有一些序列仍具有免疫原性。也有可能的是在通过熟知的方法产生此类嵌合或人源化变体的同时产生了新的T细胞表位。甚至完全的人抗体或其片段对具有不同遗传免疫模式的某些人类个体或个体群而言仍可具有免疫原性。术语＂嵌合抗体＂是指重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于一类特定的抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而这些链的其它部分与来自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的抗体，及其片段，前提是它们具有所需的生物活性(例如：US 4,816,567；Morrison等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)81：6851-6855(1984))。制备嵌合和人源化抗体的方法也为本领域公知。例如，制备嵌合抗体的方法包括Boss(Celltech)和Cabilly(Genentech)在专利(US4,816,397；US 4,816,567)中描述的方法。＂人源化抗体＂为包含最少的来自非人免疫球蛋白的序列的非人(如啮齿动物)嵌合抗体。对其大部分而言，人源化抗体为人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者高变区(CDRs)的残基被具有所需特异性、亲和性和能力的来自非人物种(供者抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换。在某些情况下，人免疫球蛋白构架区(FR)的残基用相应的非人残基替换。通常，人源化抗体包含基本上所有的可变区(至少一个，一般是两个可变区)，其中所有或基本上所有的超变环对应于非人免疫球蛋白的超变环且所有或基本上所有的FR为人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地也包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般为人免疫球蛋白的Fc。例如Winter(US 5,225,539)和Boss(Celltech，US 4,816,397)描述了制备人源化抗体的方法。＂抗体片段＂包含完整抗体的一部分，优选地包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的实施包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv和Fc片段、diabodies、线性抗体、单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。＂完整＂抗体为包含结合抗原的可变区及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的抗体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应功能。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的称为＂Fab＂片段的抗原结合片段及一个残留的＂Fc＂片段，每一＂Fab＂片段包含一个抗原结合位点和一个CL和CH1区，＂Fc＂片段的名称反映了其易于结晶的能力。抗体的＂Fc＂区通常包含IgG1或IgG2抗体主类的CH2、CH3和铰链区。胃蛋白酶处理产生一个＂F(ab′)2＂片段，其具有两个抗原结合位点，并仍可交联抗原。＂Fv＂为最小的抗体片段，其包含完整的抗原-识别和抗原-结合位点。该区域由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域紧密地非共价连接形成的二聚体组成。＂单链Fv＂或＂scFv＂抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一的多肽链中。优选地，Fv多肽还在VH和VL结构域之间包含多肽接头，其使得scFv可以形成所需的抗原结合结构。单链Fv抗体可以例如从Pluckthun(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，纽约，269-315页(1994))，WO 93/16185；US 5,571,894；US 5,587,458；Huston等人，(1988，国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879)域Skerra和Plueckthun(1988，科学(Science)240，1038)的描述中已知。
术语＂T细胞表位＂根据本发明的理解是指这样的氨基酸序列，其可以结合MHC II类分子、可刺激T细胞和/或也可在与MHC II类的复合体中结合(不必可测得地活化)T细胞。此处及所附权利要求书中引用的术语＂肽＂为包括两个或多个氨基酸的化合物.氨基酸通过肽键(定义在下文中)连接。有20种不同的天然存在氨基酸参与肽的生物产生，它们可以以任何数目及任意顺序连接形成肽链或环。用于肽生物产生中的天然存在氨基酸均具有L-构型。可使用L-氨基酸、D-氨基酸、或两种不同构型的氨基酸的各种组合通过常规的合成法制备合成肽。某些肽仅包含为数不多的氨基酸单元。短肽，如具有少于10个氨基酸单元的短肽，有时称为“寡肽”。其它肽包含大量的氨基酸残基，例如高达100个或更多个残基，被称为“多肽”。按照惯例，认为“多肽”可为包含三个或多个氨基酸的任何肽链，而“寡肽”通常为特定类型的“短”多肽。因此，如此处所用，谈及“多肽”时也包括寡肽。而且任何谈及的“肽”都包括多肽、寡肽和蛋白质。氨基酸的每一不同排列都将形成不同的多肽或蛋白质。可形成的多肽数及因此形成的不同蛋白质数实际上是不受限的。
术语“经修饰的蛋白质/抗体“如本发明所用，描述的是具有较少的T细胞表位数并因此当暴露于给定物种的免疫系统时相对于亲本蛋白质而言引起降低的免疫原性的蛋白质/抗体。术语“未修饰的蛋白质”如本发明所用，描述的是“经修饰的蛋白质”的“亲本”蛋白质，其具有较多的T细胞表位，并因此当暴露于给定物种的免疫系统时相对于经修饰的蛋白质而言具有增强的免疫原性。
“α碳(Cα)”是肽链的碳-氢(CH)组分中的碳原子。“侧链”是Cα的侧基，其可包含简单的或复杂的基团或部分，且具有与所述肽的大小相比可显著变化的外形大小。
在接下来的段落中，本发明较详细描述了显示出具有高治疗价值的单克隆抗EGFR抗体425。但是，本发明不限于该抗体及其几种现有形式，本发明可延伸至具有非常相似特性的其它抗EGFR抗体，尤其是嵌合抗体225。
除非另外指出，在重链和轻链可变区中的所有氨基酸均按在Kabat等人，1991(Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Departmentof Health and Human Services)中所述编号。潜在的T细胞表位用表位的第一个氨基酸的线性编号来编号，其中所述表位的第一个氨基酸的线性编号为从重链和轻链的第一个氨基酸开始计数得到。
1.与小鼠亚组构架比较
将鼠425 VH(重链)和VK(轻链)的氨基酸序列与Kabat鼠重链和轻链亚组的共有序列比较。425VH可以被归于小鼠重链亚组IIB。与该亚组的共有序列比较显示在425VH中94位的丝氨酸非同寻常。在该位置的最常见残基为精氨酸。425VK可以被归于小鼠κ链亚组Vl。与该亚组的共有序列比较显示在425VK中45-47、60和100位的残基对该亚组而言非同寻常。氨基酸残基编号按Kabat进行。
2.与人构架比较
将鼠425VH(重链可变区)和VK(κ轻链可变区)氨基酸序列与人胚系VH(Tomlinson，I.M等人，(1992)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)227：776-798)和VK(Cox，J.P.L.等人，(1994)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)24：827-836)序列目录中的序列比较，并与人胚系J区序列(在“用于人的预防性和治疗性应用中的抗体分子的蛋白质工程”(ProteinEngineering of Antibody Molecules for Prophylactic and TherapeuticApplications in Man)，Clark，M.编辑，Academic Titles，Nottingham，UK一书中的13-44页，Routledge，E.G.等人，1991)比较。鼠425的重链和轻链序列可例如取自EP 0531 472。
所选的用于425VH的参照人构架为具有人JH6的VH1GRR。在目录中VH1GRR序列终止于残基88位。因此对于鼠序列94位的不寻常丝氨酸没有相应的残基。该胚系序列已在具有4个氨基酸变化的已重排成熟抗体基因中找到。所选的用于425VK的参照人构架为具有人JK2的L6/vg。该胚系序列已在没有氨基酸变化的已重排成熟抗体重链中找到。
3.＂贴面化＂序列的设计
确定参照人构架序列后，将425VH和VK构架中某些不一致的氨基酸残基改变为人参照构架序列中的相应氨基酸。被认为对抗体结构和结合关键的残基不包括在该过程中，且不进行改变。在此阶段仍保留的鼠残基主要是不位于表面的隐蔽残基，以及例如在最后的抗体中靠近CDR的N-末端残基(1-8个，优选地1-5个氨基酸残基)。该方法产生的序列大致类似于“贴面化”抗体，因为表面残基主要是人的，而隐蔽残基为原来的鼠序列。
4.肽的穿线分析(threading analysis)
使用本发明方法分析鼠425VH和VK序列和贴面化425VH和VK序列。将氨基酸序列分成所有可能的13聚体(mer)。将这些13mer的肽依次呈递给HLA-DR同种异型的结合沟模型，并且相对于每一等位基因将结合分值赋予每一个肽。针对肽的每一口袋结合侧链计算构象分值。该分值基于立体重叠、肽和结合沟中残基间的潜在氢键、静电相互作用以及肽和口袋残基间的有利接触。然后改变每一侧链的构象并再次计算分值。确定了最高的构象分值后，基于与沟结合的疏水残基、非沟的亲水残基和适合进入结合沟的残基数目计算结合分值。已知结合人MHC II类的肽得到高的结合分值，几乎没有假阴性。这样，在当前的分析中得到显著结合分值的肽被认为是潜在的T细胞表位。对425VH和425VK的肽穿线分析结果在表1中给出。潜在的T细胞表位通过13mer中第一个残基所在的线性编号提及。
表1：在鼠和贴面化425序列中潜在的T细胞表位
 
序列 潜在的T细胞表位数      13mer中第一个残基的编号及括号中为所结合的等位基因的数           
鼠425 VH 8 31(7)，35(17)，43(7)，46(8)，58(10)，62(12)，81(11)，84(16)               
贴面化425VH 7 31(7)，43(7)，46(8)，58(10)，62(11)，81(11)，84(16)                       
鼠425VK 9 1(8)，2(5)，17(5)，27(5)，43(16)，72(18)，75(10)，92(10)，93(17)    
贴面化425VK 4 27(5)，43(16)，92(8)，93(17)
5.潜在T细胞表位的去除
进行替换的氨基酸残基的编号同前述的Kabat。通过13mer中第一个残基所在的线性编号谈及潜在的T细胞表位。
从贴面化425重链可变区去除潜在T细胞表位所需的氨基酸替换如下：
在残基41处(Kabat编号41)用脯氨酸替换丙氨酸去除残基31位的潜在表位。
在残基45处(Kabat编号45)用脯氨酸替换亮氨酸去除残基43位的潜在表位。位置45处的脯氨酸发现存在于人胚系VH序列DP52中。
在残基48处(Kabat编号48)用丙氨酸替换异亮氨酸去除残基46位的潜在表位。
在残基68处(Kabat编号67)用缬氨酸替换丙氨酸去除残基58位的潜在表位。
在残基70处(Kabat编号69)用异亮氨酸替换亮氨酸去除残基62位的潜在表位。
在残基91处(Kabat编号87)用苏氨酸替换丝氨酸去除残基81位和84位的潜在表位。
从贴面化425轻链可变区去除潜在T细胞表位所需的氨基酸替换如下：
在残基35处(Kabat编号36)用组氨酸替换酪氨酸去除残基27位的潜在表位。
在残基50处(Kabat编号51)用丙氨酸替换苏氨酸去除残基43位的潜在表位。该残基在CDR2中。在人和鼠抗体中丙氨酸通常出现在该位置。消除该表位的备选替换为在位置45处(Kabat编号46)用丙氨酸替换亮氨酸。保守替换将不能消除该潜在表位。在一些抗体中发现丙氨酸位于该位置。
在残基94处(Kabat编号95)用脯氨酸替换异亮氨酸去除残基92位的潜在表位。Kabat残基95在CDRL3中。在小鼠抗体序列中该位置处脯氨酸是常见的，并且在该CDR外的变化不能消除此潜在表位。
在残基103处(Kabat编号104)用缬氨酸替换亮氨酸去除残基93位的潜在表位。
6.去免疫序列的设计
参考去除潜在的T细胞表位所需的变化并考虑对抗体结构和结合可能关键的构架残基，设计去免疫的重链和轻链可变区序列。除了基于贴面化序列的去免疫序列外，还对基于鼠序列的VH和VK各设计了另一序列，称为小鼠穿线肽形式(Mouse Peptide Threaded)(Mo PT)。对该形式而言，直接在鼠序列中进行改变以去除T细胞表位，但仅在CDR外进行被认为无害于结合的改变.在此形式的去免疫序列中没有尝试去除表面(B细胞)表位。
最初的去免疫VH包括上面第5节中的1至6替换并且不包括潜在的T细胞表位。设计了另外4个去免疫的VH序列，以检验所需的不同替换对抗体结合的影响。对最初的去免疫序列(425 VH1 GRR-VH-v1)进行的累积改变和仍然保留的潜在T细胞表位详见表2。包括小鼠的穿线形式用于比较。
表2：在去免疫的425VH中氨基酸的改变和潜在的表位
 
变体 累积的残基改变 潜在的T细胞表位
425 VH1GRR-VH-v1 没有 没有
425 VH1GRR-VH-v2 48A→I 46(8)
425 VH1GRR-VH-v3 45P→L 43(7)，46(8)
425 VH1GRR-VH-v4 67V→A，69I→L 43(7)，46(8)，58(10)，62(11)
425 VH1GRR-VH-v5 41P→A 31(7)，43(7)，46(8)，58(10)，62(11)                       
425 VH-MoPT NA 43(7)，46(8)
最初的去免疫VK包括上面第5节中的替换1至4并且不包括潜在的T细胞表位。另设计了4个去免疫的VK序列，以检验所需的不同替换对抗体结合的影响。版本2是版本1的备选物，其中使用了备选的替换以去除相同的潜在T细胞表位。对最初的去免疫序列(425 L6-vg-VK-vl)进行的累积替换和仍然保留的潜在T细胞表位详见表3。包括小鼠的穿线形式用于比较。
表3：在去免疫的425VK中氨基酸的改变和潜在的表位
 
变体 累积的残基改变 潜在的T细胞表位
425 L6-vg-VK-vl 没有 没有
425 L6-vg-VK-vl 51A→T，46L→A 没有
425 L6-vg-VK-vl 46A→L 43(16)
425 L6-vg-VK-vl 95P→I 43(16)，92(8)
425 L6-vg-VK-vl 36H→Y 27(5)，43(16)，92(8)
425 VK-MoPT NA 27(5)，43(16)，92(8)
表4：鼠MAb 425的VH和VK的最初序列和＂贴面化＂序列
425VH小鼠
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425VK小鼠
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425VH贴面化：
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425VK贴面化：
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表5：MAb425的重链和轻链可变区的去免疫序列
425去免疫的VH1
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SRVTITVDKSTSTAYMQLSSLTSEDTAVYYCASRDYDYDGRYFDYWGQGTTLTVSS
425去免疫的VK1
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425去免疫的VH2
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425 去免疫的VK2
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425去免疫的VH3
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425去免疫的VK3
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425去免疫的VH4
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SRATLTVDKSTSTAYMQLSSLTSEDTAVYYCASRDYDYDGRYFDYWGQGTTLTVSS
425去免疫的VK4
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425去免疫的VH5
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425去免疫的VK5
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425VH小鼠，穿线肽(Mo PT)
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425VK小鼠，穿线肽(Mo PT)
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如已提及的那样，本发明的修饰的抗EGFR抗体，优选地MAb 425，可用在药物组合物和药物药剂盒中，优选地用于治疗癌症。＂癌＂和＂肿瘤＂是指或描述的是哺乳动物的生理疾病，其典型特征在于不受调节的细胞生长。通过本发明的药物组合物，可治疗如胸部、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头和颈、卵巢、前列腺、脑、胰脏、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈和肝脏的肿瘤。
本发明的药物组合物可包含减轻或避免与本发明的联合治疗(“辅助治疗”)相关的副作用的药剂，其包括但不限于如减轻抗癌药的毒性作用的药剂，诸如骨重吸收抑制剂、心脏保护剂.所述辅助药剂可以防止或降低与化学治疗、放射治疗或手术相关的恶心和呕吐的发生率，或可以降低与施用骨髓抑制性抗癌药相关的感染的发病率。辅助药剂为本领域熟知。本发明的经修饰抗体还可与佐剂如BCG和其它免疫系统刺激剂一起施用。
而且，组合物可如上述包含化学治疗剂，其包括具细胞毒作用的放射性标记的同位素或其它细胞毒因子如细胞毒性肽(例如细胞因子)或细胞毒性药物等.用于治疗肿瘤或肿瘤转移的药物药剂盒是指一种包装及通常地有关在治疗肿瘤和肿瘤转移的方法中使用这些药剂的指导。在本发明药剂盒中的药剂一般配制为如此处所述的治疗性组合物，并因此可为适于在药剂盒中分装的多种形式中的任一种。这些形式可包括液体、粉剂、片剂、悬浮剂等剂型，用来提供本发明的拮抗剂和/或融合蛋白。在包装中，药剂可在适于根据本方法单独施用的分开容器中提供，或备选地在单一容器中组合为组合物形式提供。包装可包含根据此处所述治疗方法足够一次或多次给药的药剂量。本发明的药剂盒也包含对包装中所含物质的＂使用说明＂。可药用载体、稀释剂和赋形剂及其语法上的变形形式是指可施用于哺乳动物或在施用于哺乳动物后不会引起如恶心、眩晕、胃不适等不良生理学效应的物质。
其中溶解或分散有活性成分的药物组合物的制备在本领域是熟知的，不必受限于其剂型。一般，此类组合物制备为液体溶液或悬液的注射形式，但是，也可制备为在使用前适于在液体中形成溶液或悬液的固体形式。制品也可被乳化。活性成分可以以适用于此处所述治疗性方法的量与赋形剂混合，其中所述赋形剂为可药用的并与活性成分相容的。合适的赋形剂为例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等或它们的组合。此外，需要的话，组合物可包含增强活性成分作用的小量辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。本发明的治疗性组合物中包含的组分可以是可药用盐形式。
一般，抗EGFR抗体的治疗有效量为这样的量，当以生理可接受组合物形式施用时其足以达到约0.01μg/ml至约100μg/ml，优选地约1μg/ml至约5μg/ml，且通常约5μg/ml的血浆浓度。换句话说，该剂量可在约0.1mg/kg至约300mg/kg之间变化，优选地约0.2mg/kg至约200mg/kg，最优选约0.5mg/kg至约20mg/kg，每天一次或多次施用，施用一天或几天。通常，如果使用本发明免疫原性改变的抗体而不使用相应的未修饰形式，则可应用上述的较低剂量而获得相同的功效。
当例如必需或推荐与化学治疗剂联合治疗时，此活性剂的一般剂量为每千克体重每天10mg至1000mg，优选地约20至200mg，且更优选地50至100mg。
下列实施例以通用形式描述了根据本发明对存在于最初的免疫原性潜能未改变的抗体上的T细胞表位的鉴定方法。但是，所述表位序列的鉴定亦可通过上述已知的方法实施。
实施例
在确定蛋白质、多肽或免疫球蛋白的总体结构时有许多因素起到重要的作用。首先，肽键，即在链中将氨基酸连接在一起的键；为共价键。该键在结构上是平面的，实质上是一个取代的酰胺。“酰胺”指含有基团-CONH-的一组有机化合物中的任一化合物。
连接邻近氨基酸的Cα的平面肽键可如下描述：
Figure C02805156D00271
由于O＝C和C-N原子位于相对刚性的平面中，围绕这些轴不发生自由旋转。因此，由虚线图示性描述的平面有时称为＂酰胺＂或＂肽平面＂，其中有肽主链的氧原子(O)、碳原子(C)、氮原子(N)和氢原子(H)。Cα原子位于该酰胺平面的相对角。由于围绕肽或酰胺平面中的O＝C和C-N原子基本上没有旋转，多肽链因此包含一系列连接Cα原子的平面肽键。
在规定多肽或蛋白质的总体结构或构象时起重要作用的第二个因素是每一酰胺平面围绕共同Cα键的旋转角。术语＂旋转角＂和＂扭转角＂在后文中认为是同等术语。假定O、C、N和H原子保持在酰胺平面中(这通常为有根据的假设，虽然在一些构象中这些原子与平面存在一些轻微的偏离)，这些旋转角可以定义N和R多肽的主链构象，即存在于邻近残基间的结构。这两个角被称作为φ和ψ。这样一组角φi和ψi角有效地定义了多肽的二级结构，其中下标i表示多肽链的特定残基。在文献中规定了用于定义φ角、ψ角的规定，即酰胺平面为零度角时的参照点，以及对于给定多肽应定义哪个角是φ、哪个角是ψ。参见如Ramachandran等人，Adv.Prot.Chem.23：283-437(1968)，285-94页，在此引用作为参考.
本方法可用于任一蛋白质，其部分地基于如下发现：在人类中MHC II类分子结合沟的主要口袋1锚位置对特定的氨基酸侧链具有设计好的特异性。该口袋的特异性由MHC II类分子β链86位处的氨基酸的身份确定。该位点位于口袋1的底部并决定了可被该口袋容纳的侧链的大小。Marshall，K.W.，免疫学杂志(J.Immunol.)，152：4946-4956(1994).如果该残基为甘氨酸，则所有的疏水性脂肪族和芳族氨基酸(疏水脂肪族氨基酸为：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸，芳族氨基酸为：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)均可容纳于口袋中，优选芳族侧链。如果该口袋残基为缬氨酸，则该氨基酸的侧链伸入口袋中并限制了可容纳的肽侧链大小，以至于只能容纳疏水性脂肪族侧链。因此，在一个氨基酸残基序列中无论何处存在具有疏水性脂肪族或芳族侧链的氨基酸，在该处都有可能存在MHC II类限制的T细胞表位。但是，如果侧链为疏水性脂肪族侧链时，其与芳族侧链相比约两倍的可能性与T细胞表位相关(前提是口袋1型在世界人群中大约呈平均分布)。
将本发明具体化的计算法描绘出肽区域包含T细胞表位的可能性，见如下：
(1)扫描预定长度肽片段的一级序列，并确定存在的所有疏水性脂肪族和芳族侧链。(2)对疏水性脂肪族侧链赋予较芳族侧链大的值；优选地约是赋予芳族侧链的值的两倍，例如，给疏水性脂肪族侧链赋值为2，给芳族侧链赋值为1。(3)对肽中具预定统一长度的每一重叠氨基酸残基片段(窗口)，将经确定存在的值相加，并将特定片段(窗口)的总值赋予位于该片段(窗口)中间位置的某一单个氨基酸残基，优选地赋予大约位于该采集片段(窗口)中点的残基。对每一采集的重叠氨基酸残基片段(窗口)重复该过程。这样，肽的每一氨基酸残基都被赋予了与在该特定片段(窗口)中存在T细胞表位的可能性相关的值。(4)根据如上步骤3所述计算的并赋予的值可相对于被评定的全长氨基酸残基序列中的氨基酸坐标绘图。(5)具有预定值如值为1的各序列部分被认为可能包含T细胞表位，并且需要的话可对其进行改变。
本发明的该特定方面提供了一种通用方法，根据该方法可以描述可能包含T细胞表位的肽区域。在这些区域中进行肽修饰可能改变MHC II类结合特性。根据本发明的另一方面，通过使用考虑肽与MHC II类等位基因模型的相互作用的更复杂计算法可更精确地预测T细胞表位。
根据该特定方面，对肽中存在的T细胞表位的计算预测考虑到：基于所有已知MHC II类分子的结构构建至少42个MHC II类等位基因模型；使用这些模型计算鉴定T细胞表位的方法；对每一模型构建肽主链文库以允许在相关肽主链α碳(Cα)位置具有已知的变异性；在肽和MHC II类分子间相互作用关键的位置处，对与每一模型对接(dock)的每一主链，相对于20种氨基酸替代物中每一种构建氨基酸侧链构象文库；以及将这些主链和侧链构象文库与评分函数结合用于选择与特定MHC II类分子对接的特定肽的最佳主链和侧链构象并得出该相互作用的结合分值。
通过同源模建可以从Brookhaven蛋白质数据库(“PDB”)中的许多相似结构得出MHC II类分子的模型。这些可通过使用合并了模拟复性函数的半自动同源模建软件(Modeller，Sali A.& Blundell TL.，1993，分子生物学杂志(J.Mol Biol)234：779-815)，和用于能量最小化的CHARMm力场(可购自Molecular Simulations Inc.，San Diego，Ca.)进行。也可使用其它模建方法。
本方法明显不同于其它计算法，所述其它计算法在于使用通过实验得出的针对一小群MHC II类分子的结合沟中每一位置处每一备选氨基酸的结合数据文库(Marshall，K.W.等人，Biomed.Pept.Protiens Nucleic Acids，1(3)：157-162)(1995)；或者在于使用类似的实验性结合数据以定义结合沟中特定类型的结合口袋的结合特征(这又一次使用了相当少的MHC II类分子亚群)，然后‘混合和匹配’来自该口袋文库的口袋类型以人工产生更‘实际的’MHC II类分子(Sturniolo T.等人，自然生物技术(Nat.Biotech)，17(6)：555-561(1999))。这两种现有方法的主要不利之处在于，由于试验的复杂性并需要合成大量的肽变体，故只有少量的MHC II类分子可进行实验扫描。因此，第一种现有方法只能对少数MHC II类分子进行预测。第二种现有方法还假设在不同II类等位基因的背景下在一个分子中衬有相似氨基酸的口袋将具有相同的结合特性，这样该方法的另一不利之处在于只有那些所含口袋被包含在口袋文库中的MHC II类分子可得以‘真实’构建。使用此处描述的模建方法，可推导出任何数目和类型的MHC II类分子的结构，因此可特异性地选择出代表全球人群的等位基因。此外，可通过建立其它的模型而不需通过复杂的实验产生另外的数据来增加所扫描的MHC II类分子数。
主链文库的使用使得扫描的各种肽在结合特定的MHC II类分子时Cα原子处可进行变化。这又与上述备选的现有计算法不同，现有计算法在于使用简化的肽主链来观察在特定口袋中氨基酸的结合。这些简化的主链不可能代表在‘真实的’肽中存在的主链构象，从而导致肽结合预测的不准确性。本主链文库是通过叠加蛋白质数据库中与MHC II类分子结合的所有肽的主链并考虑到位于结合沟中的11个氨基酸的每一个的Cα原子间的均方根(RMS)差而构建的。虽然该文库可从小量合适的可获得的小鼠和人结构(目前为13种结构)推导出，但为了允许更大变异性的可能，将每一C＂-α位置的RMS数提高50％。然后确定每一氨基酸的平均Cα位置，并围绕该点绘制球，其半径等于在该位置处的RMS差加50％。该球代表所有允许的Cα位置。
自具有最小RMS差的Cα(上述口袋1中氨基酸残基的Cα，等同于结合沟中11个残基的位置2)起运作，将所述的球三维网格化，网格内的每个顶点作为该氨基酸的Cα的可能位置。将后续的酰胺平面(相应于与后续氨基酸的肽键)移动到这些Cα的每一个上面，将φ和Ψ角以设定的间隔逐步地转动以便于安置后续的Cα。如果后续的Cα落入对这一Cα而言‘可被允许的位置球’中，则此二肽的方向即可被接受，如果其落入所述球之外则所得的二肽不能被接受。对每一后续Cα位置均重复这一过程，使肽从所述的口袋1 Cα‘种子’开始生长，直到全部9个后续的Cα的位置均根据之前Cα的所有可能排列确定下来。然后对口袋1前的单个Cα重复上述步骤1次以上以构建定位于结合沟内的主链Cα位置文库。
生成的主链数目取决于几种因素：‘可被允许的位置球’的大小；对口袋1位点处′最初的球′网格化的细度；用于定位后续Cα的φ和Ψ角逐步旋转的细度。利用这一程序可以构建大的主链文库。主链文库越大越可能发现对MHC II类分子结合沟内的特定肽而言的最适主链。鉴于和结合结构域的氨基酸可能存在冲突，所以不是所有的主链均适合于与所有MHC II类分子模型‘对接’(docking)，故对每个等位基因建立亚文库以包含适合被该等位基因容纳的主链。利用所述的主链文库并结合MHC II类分子模型可以构建出由与每一容许主链对接的每一MHC II类分子结合沟的每一位点中的每一氨基酸的容许侧链构象所组成的详尽数据库。可以利用简单的立体重叠函数构建这一数据组，其中，主链与MHC II类分子对接，氨基酸侧链在所需位置被嫁接到主链上。将侧链上可旋转的键以设定的间隔逐步旋转，记录下依赖于该键的原子的最终定位。将所述原子与结合沟侧链原子间的相互作用记录下来，根据下述的标准确定是否接受这些位置：如此定位的所有原子的重叠总量不能超过预定值。因此，构象搜索的严谨度是在键的逐步旋转中所用的间隔及对总重叠的预定限度的函数。如果已知特定的口袋是刚性的，则后一值可较小，但若已知口袋侧链的位置相对灵活则严谨度可放松。这样便可以模拟结合沟口袋内灵活性的变化。针对与每一MHC II类分子对接后每一主链的所有位点上的所有氨基酸重复这种构象搜索以建立详尽的侧链构象数据库。
用适当的数学表达式评价MHC II类分子模型与肽配体构象的结合能量，所述的肽配体构象需通过扫描上述的主链/侧链构象大数据库根据经验获得。这样，通过对每一长度在9-20个氨基酸范围内变化(尽管对于每一次扫描长度是一定的)的可能肽进行下述计算，可以扫描蛋白以搜索潜在的T-细胞表位：选择MHC II类分子及适合于该分子的肽主链，将相应于所需肽序列的侧链移植到其上。对于氨基酸的每一容许构象(由上述数据库获得)，收集与主链上特定位点的特定侧链相关的原子身份和原子间距数据。沿主链对每一侧链重复此过程，利用评分函数推导肽得分.保留该主链的最佳得分，对所选模型的每一容许主链重复该过程。比较所有容许主链的得分，最高的得分被认为是该MHC II类模型中所需肽的得分。对每一模型用从扫描的蛋白得到的所有可能肽重复上述过程，列出肽相对于模型的得分。
在本发明中，用于结合亲和力计算的每种配体都是选自上述肽或蛋白的氨基酸片段。因此所述配体为来自已知序列的肽、多肽或蛋白的长度为约9到20个氨基酸的选定氨基酸链.此后术语“氨基酸”和“残基”视为等同的术语。将移植到选自上述主链文库的主链上的待检测肽中的连续氨基酸形式的配体，通过肽主链上C＂-α原子坐标定位到来自MHC II类分子模型库的MHC II类分子的结合裂缝中，并从容许构象的数据库中选择每一侧链的容许构象。相关的原子身份和原子间距也可以从这一数据库获得并用于计算肽结合分数。将对MHC II类结合口袋具有高亲和力的配体作为侯选者标记出来用于定点诱变。在标记的配体中(也由此在目的蛋白中)进行氨基酸替代，然后用评分函数重新测定以确定使结合亲和力降低到预定的阈值以下的变化。这些变化即可引入到目的蛋白中以去除T-细胞表位。肽配体与MHC II类分子结合沟的结合涉及非共价键相互作用，其包括但不限于：氢键、静电相互作用、疏水(亲脂)相互作用和范德华相互作用。它们被包括在下面将详细描述的肽评分函数中。应当理解，氢键是非共价键，其可在极性或带电的基团之间形成，由被两个其他原子共享的氢原子构成。氢供体中的氢带正电荷，而氢受体带有部分负电荷。为肽/蛋白相互作用的目的，氢键供体可以是连接氢的氮，或连接在氧或氮上的氢。氢键受体原子可以是没有连接氢的氧、没有连接氢并具有一或两个连接的氮或仅有一个连接的硫。某些原子，如连接了氢的氧或亚胺氮(如C＝NH)，既可以是氢受体也可以是氢供体。氢键的能量在3-7Kcal/mol，大大强于范德化键，但弱于共价键。氢键具有高度的方向性，且当供体原子、氢原子和受体原子共线时最强。静电键是在带有相反电荷的离子对间形成的，根据库仑定律这种相互作用的强度与原子间距离的平方成反比。离子对间的最佳距离是约2.8
Figure C02805156D0033110251QIETU
。在肽/蛋白相互作用中，可在精氨酸、组氨酸或赖氨酸和天冬氨酸或谷氨酸之间形成静电键。该键的强度依赖于电离基团的pKa和介质的介电常数，尽管其与氢键的强度类似。
亲脂相互作用是蛋白和肽配体之间发生的有利疏水-疏水相互作用。这种相互作用通常出现在埋于结合沟口袋中的肽的疏水性氨基酸侧链间，以使它们不暴露在溶剂中。将疏水残基暴露于溶剂中是非常不利的，因为周围的溶剂分子将被迫在彼此间形成氢键而形成笼状结构。所致的熵值降低是非常不利的。亲脂性原子可以是既非极性又不是氢受体的硫和非极性的碳原子。
范德华键是相距3-4
Figure C02805156D0033110251QIETU
的原子间的非特异性的力。它比氢键和静电键弱、特异性低。原子周围的电荷分布随时间变化，并且在任何瞬间电荷分布均是不对称的。这种瞬间的电荷不对称性诱导临近原子中的类似不对称性。在范德华接触距离中所导致的原子之间的吸引力达到最大，而在约
Figure C02805156D00341
到
Figure C02805156D00342
处迅速消失。相反，当原子间隔的距离小于此接触距离时，由于原子外部的电子云重叠使不断增强的斥力成为主导。尽管与静电和氢键相比，此吸引力相对较弱(约0.6Kcal/mol)，但所述斥力对于决定肽配体是否能与蛋白成功结合可能非常重要。
在一个实施方案中，利用
Figure C02805156D0036140342QIETU
评分函数(SCORE1方法)评估结合常数(
Figure C02805156D0036140342QIETU
，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8(3)：243-256(1994)，该文献在此全文引入作为参考)。在另一个实施方案中，用评分函数(SCORE2方法)评估结合亲和力作为配体含有T-细胞表位的指示物(
Figure C02805156D0036140342QIETU
，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，12(4)：309-323(1998)，该文献在此全文引入作为参考)。但是上述文献中描述的
Figure C02805156D0036140342QIETU
评分函数是用于评估下述情况中配体对蛋白的结合亲和力的，即已知所述的配体可成功地与所述蛋白结合，且蛋白/配体复合物的结构已解析，这一结构已列于蛋白数据库(＂PDB＂)中。因此，利用已知的阳性结合数据对评分函数作了发展。为了区分阳性和阴性的结合体，需向方程中加入排斥项。此外，可通过以成对的方式计算亲脂相互作用，而非利用上述
Figure C02805156D0036140342QIETU
函数中基于面积的能量项来进行更理想的结合能量评估。因此，在一个优选实施方案中，用经修饰的
Figure C02805156D0036140342QIETU
评分函数评估结合能。在经修饰的
Figure C02805156D0036140342QIETU
评分函数中，在评估蛋白和配体之间的结合能(ΔGbind)时考虑了下述参数：由于配体的平移和转动熵的整体损失造成的结合能减低(ΔG0)；理想氢键的贡献(ΔGhb)，其中至少一个配对物是中性的；无扰离子相互作用的贡献(ΔGionic)；亲脂配体原子和亲脂受体原子之间的亲脂相互作用(ΔGlipo)；由于配体中内在自由度的冻结，即绕每一C-C键的旋转自由度降低而造成的结合能损失(ΔGrot)；蛋白和配体之间相互作用的能量(EVdW)。考虑到这些项给出等式1：
(ΔGbind)＝(ΔG0)+(ΔGhb×Nhb)+(ΔGionic×Nionic)+(ΔGlipo×Nlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(EvdW)
其中N是对于特定项符合的相互作用的数目，在一个实施方案中，ΔGo、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipo和ΔGrot是常数，其值分别为：5.4、-4.7、-4.7、-0.17和1.4。
Nhb项依照等式2计算：
Nhb＝Σh-bondf(ΔR，Δα)×f(Nneighb)×fpcs
f(ΔR，Δα)是罚函数，其解决氢键自理想情况的巨大偏离，其依照等式3计算：
f(ΔR，Δ-α)＝f1(ΔR)×f2(Δα)
其中：
如果ΔR<＝TOL              则f1(ΔR)＝1，或者
如果ΔR<＝0.4+TOL          则f1(ΔR)＝1-(ΔR-TOL)/0.4，或者
如果ΔR>0.4+TOL            则f1(ΔR)＝0
并且：
如果Δα<30°              则f2(Δα)＝1，或者
如果Δα<＝80°            则f2(Δα)＝1-(Δα-30)/50，或者
如果Δα>80°              则f2(Δα)＝0
Figure C02805156D0035141352QIETU
Figure C02805156D0035141357QIETU
Δα是氢键键角∠N/O-H..O/N与180°理想值的偏差
f(Nneighb)区分蛋白表面的凹凸部分，并因此赋予口袋中的极性相互作用比蛋白表面的极性相互作用更高的权重。这一函数根据下述等式4计算：
f(Nneighb)＝(Nneighb/Nneighb，0)α，其中α＝0.5
Nneighb为蛋白中与任意给定蛋白原子之间的距离小于5
Figure C02805156D0035112009QIETU
的非氢原子的数量。
Nneighb，0是常数＝25
fpcs是考虑到每氢键的极性接触表面面积的函数，由此可以区分强和弱的氢键，其值由下述的标准确定：
当
Figure C02805156D0036140320QIETU
时      fpcs＝β
当
Figure C02805156D0036140327QIETU
时      fpcs＝1
Apolar是极性蛋白-配体接触面的大小
NHB是氢键的数目
β是常数＝1.2
由于假定了相同的几何相关性，在实施经修饰的
Figure C02805156D0036140342QIETU
评分函数时，离子相互作用的贡献ΔGionic用与上述有关氢键的类似方式计算。
Nlipo项按下述的等式5计算：
Nlipo＝ΣlLf(lL)
根据下述标准，对于所有亲脂配体原子l和所有亲脂蛋白原子L，计算f(rlL)：
当rlL<＝R1时     f(rlL)＝1
当R2<rL>R1时     f(rlL)＝(rlL-R1)/(R2-R1)
当rlL>＝R2时     f(rlL)＝0
其中：R1＝rl vdw+rL vdw+0.5
      R2＝R1+3.0
      rl vdw是原子l的范德华半径
      rL vdw是原子L的范德华半径
Nrot项是氨基酸侧链中可旋转的键的数目，其被视为无环的sp3-sp3及sp3-sp2键的数目。末端-CH3或-NH3的旋转未考虑进去。
最终，项Evdw依照如下等式6计算：
Evdw＝ε1ε2((r1 vdw+r2 vdw)12/r12-(r1 vdw+r2 vdw)6/r6)，
其中：ε1和ε2是取决于原子身份的常数
      r1 vdw+r2 vdw是范德华原子半径
      r是原子对间的距离。
关于式6，在一个实施方案中，ε1和ε2常数被赋予如下原子值，分别为：C：0.245，N：0.283，O：0.316，S：0.316(即分别对于碳、氮、氧和硫原子)。对于式5和6，给予范德华半径如下原子值，分别为C：1.85，N：1.75，O：1.60，S：2.00。
应当理解上述等式中所有预定的值和给定的常数都是在现有的对蛋白配体相互作用的理解局限内具体相对于此处所用的计算类型确定的。因此，随着这种评分函数的进一步精练，这些值和常数也会因此而改变，任何能在蛋白和配体结合能的评估方面给出所需结果的适宜数值均可使用，而且，其也落入本发明的保护范围内。
如上所述，所述的评分函数应用于由上述侧链构象、原子身份和原子间距数据库中提取的数据。为本说明书的目的，该数据库中包含的MHC II类分子数是42个模型加上4个已解析的结构。从上述描述中可清楚地了解到，本发明的计算构建方法的模块性质意味着，可简单地添加新的模型，并利用肽主链文库和侧链构象搜索功能进行扫描以创建其它的可通过上述的肽评分函数处理的数据集。这使得被扫描的MHC II类分子库可以很容易地增加，或者如果可以获得相关数据，则可以替换结构和相关数据以创建现有等位基因的更精确的模型。
本发明的预测方法可以相对于包含大量已通过实验确定了其对不同MHC II类分子的亲和力的肽的数据集进行校准。将计算值与实验数据相比较，可确定一截断值，已知该值之上所有经实验确定的T-细胞表位都得以正确的预测。
应当理解，尽管上述评分函数与现有的一些复杂方法相比相对简单，但计算进行得非常迅速。还应当理解的是，其目的并不在于计算出对接到所选择的MHC II类蛋白结合沟内的每种肽的真正结合能本身。根本的目的在于获得相对的结合能数据以助于根据所选蛋白的一级结构(即氨基酸序列)预测T-细胞表位的定位。相对高的结合能或结合能高于选定的阈值意味着在配体中存在T-细胞表位.然后可以将所述配体进行至少一轮氨基酸替代，并再次计算结合能。由于计算可迅速进行，对肽序列的这些操作可在现有成本划算的计算机硬件上于程序用户界面中互动进行。由此不需要对计算机硬件进行大量投资。
本领域的技术人员应当了解，也可使用其他软件达到相同的目的。特别是可以使用能将配体对接入蛋白结合位点的更复杂的软件，并与能量最小化相结合。对接软件的例子包括：DOCK(Kuntz等，J.Mol.Biol.，161：269-288(1982))，LUDI(，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8：623-632(1994))和FLEXX(Rarey M.等，ISMB，3：300-308(1995))。分子建模和操作软件的例子包括：AMBER(Tripos)和CHARMm(Molecular Simulations Inc.)。使用这些计算方法将严重限制本发明方法的信息吞吐量，这是由于进行必要的计算所需的处理时间导致的。但是可行的方式为，将这些方法作为‘二级筛选’以获得关于通过本发明的方法发现为‘阳性结合体’的肽的更精确的肽结合能计算值。用于复杂的分子机械或分子动力学计算的处理时间的限制性是由进行所述计算的软件设计和目前计算机硬件技术的限制共同确定的。可以预期在将来，随着编写更高效的代码和计算机处理器速度的不断提高，在更易控制的时间构架内进行上述计算是可行的。有关用于大分子的能量函数的其他信息和有关在折叠蛋白结构内发生的多种相互作用的考虑可参考下述文献：Brooks，B.R.，等.，J.Comput.Chem.，4：187-217(1983)，有关蛋白-配体一般相互作用的信息参见：Dauber-Osguthorpe等，Proteins 4(1)：31-47(1988)，这些文献均全文引入作为参考。其他有用的背景资料也可参见Fasman，G.D.编，Prediction of ProteinStructure and the Principles of Protein Conformation，Plenum Press，New York，ISBN：0-306 4313-9。

Claims (16)

1.针对EGF受体(Her 1)的修饰抗体或其片段，与来源于鼠抗体425或225的最初免疫原性未修饰的抗体比较，所述修饰抗体或其片段包含数目减少的T细胞表位，由此当暴露于给定物种的免疫系统时较针对同一受体的任何最初的免疫原性未修饰的抗体而言，基本上没有免疫原性或具有较小的免疫原性，其中所述T细胞表位是MHC II类配体或是显示出能够通过呈递于MHC II类分子上刺激或结合T细胞的肽序列；其中，
所述修饰抗体不是人源化或嵌合Mab 425或Mab 225，并且其可以通过如下步骤获得：
(i)确定最初的免疫原性未修饰的抗体或其部分的重链和/或轻链的氨基酸序列，
(ii)通过(a)选择具有已知氨基酸残基序列的肽的一个区域；(b)依次从所选区域中采集具预定一致大小的并至少由三个氨基酸残基构成的重叠氨基酸残基片段；(c)对每一所述采集片段计算MHC II类分子结合分值，方法为对所述采集的氨基酸残基片段中的每一疏水氨基酸残基侧链赋值求和；以及(d)基于所计算的片段的MHC II类分子结合分值，鉴定出至少一个适于改变的所述片段以改变肽的总MHC II类结合分值并且不实质性降低该肽的治疗性用途，由此在该抗体的氨基酸序列中鉴定出一个或多个潜在的T细胞表位，
(iii)设计新序列变体，通过在任何最初存在的T细胞表位中替代1-9个氨基酸残基，在所述已鉴定的潜在T细胞表位之一中改变一个或多个氨基酸，
(iv)通过重组DNA技术构建此类序列变体，并试验所述变体，以确定一个或多个具有所希望特性的变体，以及
(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)。
2.根据权利要求1的修饰抗体或其片段，其中步骤(c)通过应用改进的
Figure C02805156C0002133417QIETU
评分函数及如下方式实施，其中所述
Figure C02805156C0002133417QIETU
评分函数的改进为在其中包括12-6范德华配体-蛋白质能量排斥项和配体构象能量项，而所述方式为(1)提供MHC II类分子模型第一数据库；(2)针对所述MHC II类分子模型提供所容许的肽主链的第二数据库；(3)从所述第一数据库选择一个模型；(4)从所述第二数据库选择一个容许的肽主链；(5)鉴定在每一采集片段中存在的氨基酸残基侧链；(6)确定每一采集片段中存在的所有侧链的结合亲和性值；以及对每一所述模型和每一所述主链重复步骤(1)至(5)。
3.权利要求1或2的修饰的抗EGFR抗体，其中所述最初免疫原性未修饰抗体来源于鼠Mab 425。
4.权利要求3的修饰抗体，其中步骤(ii)的潜在T细胞表位选自表1。
5.根据权利要求1的修饰抗体或其片段，其中，所述修饰抗体具有选自以下的VH和VK序列：
VH1：
QVQLVQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSHWMHWVKQAPGQGPEWAGEFNPSNGRTNYNEKFK
SRVTITVDKSTSTAYMQLSSLTSEDTAVYYCASRDYDYDGRYFDYWGQGTTLTVSS
VK1：
QIVLTQSPATLSASPGERATMSCSASSSVTYMYWHQQKPGQSPRLLIYDASNLASGVPARFSGSG
SGTSYTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSHPFTFGQGTKVEIK
VH2：
QVQLVQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSHWMHWVKQAPGQGPEWIGEFNPSNGRTNYNEKFK
SRVTITVDKSTSTAYMQLSSLTSEDTAVYYCASRDYDYDGRYFDYWGQGTTLTVSS
VK2：
QIVLTQSPATLSASPGERATMSCSASSSVTYMYWHQQKPGQSPRALIYDTSNLASGVPARFSGSG
SGTSYTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSHPFTFGQGTKVEIK
VH3：
QVQLVQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSHWMHWVKQAPGQGLEWIGEFNPSNGRTNYNEKFK
SRVTITVDKSTSTAYMQLSSLTSEDTAVYYCASRDYDYDGRYFDYWGQGTTLTVSS
VK3：
QIVLTQSPATLSASPGERATMSCSASSSVTYMYWHQQKPGQSPRLLIYDTSNLASGVPARFSGSG
SGTSYTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSHPFTFGQGTKVEIK
VH4：
QVQLVQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSHWMHWVKQAPGQGLEWIGEFNPSNGRTNYNEKFK
SRATLTVDKSTSTAYMQLSSLTSEDTAVYYCASRDYDYDGRYFDYWGQGTTLTVSS
VK4：
QIVLTQSPATLSASPGERATMSCSASSSVTYMYWHQQKPGQSPRLLIYDTSNLASGVPARFSGSG
SGTSYTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSHIFTFGQGTKVEIK
VH5：
QVQLVQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSHWMHWVKQAAGQGLEWIGEFNPSNGRTNYNEKFK
SRATLTVDKSTSTAYMQLSSLTSEDTAVYYCASRDYDYDGRYFDYWGQGTTLTVSS
VK5：
QIVLTQSPATLSASPGERATMSCSASSSVTYMYWYQQKPGQSPRLLIYDTSNLASGVPARFSGSG
SGTSYTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSHIFTFGQGTKVEIK
6.根据权利要求5的修饰抗体，其中所述最初免疫原性未修饰的抗体是嵌合抗体。
7.根据权利要求5的修饰抗体，其中所述最初免疫原性未修饰的抗体为非-人抗体，其不靠近CDR区的表面残基来源于相应人参照构架序列(贴面化抗体)。
8.DNA序列，其编码根据权利要求1-7之任一项的修饰抗体的重链和/或轻链。
9.药物组合物，其包含如权利要求1-7之任一项的修饰的抗EGFR抗体，任选地还包含可药用载体、稀释剂或赋形剂。
10.权利要求9的药物组合物，其还包含其它的药理学有效药物。
11.权利要求10的药物组合物，其中所述药物为细胞毒性剂。
12.药剂盒，其包含(i)含有至少一种如权利要求1-7之任一项所定义的免疫原性改变的抗EGFR抗体的包装，以及(ii)含有至少一种细胞毒性剂的包装。
13.用于制备权利要求1-7之任一项的修饰的抗EGFR抗体的方法，其包括以下步骤：
(i)确定最初免疫原性未修饰的抗体的重链和/或轻链或其部分的氨基酸序列，
(ii)用任一方法，包括使用体外或in silico技术或生物学鉴定法确定肽与MHC分子的结合，以在该抗体的氨基酸序列中鉴定出一个或多个潜在的T细胞表位，
(iii)设计在已鉴定的潜在T细胞表位中具有一个或多个氨基酸改变的新序列变体，以显著减少或消除T细胞表位活性，此效果可以通过使用体外或in silico技术或生物学鉴定法测定肽与MHC分子的结合或通过肽-MHC复合体与T细胞的结合而确定，
(iv)通过重组DNA技术构建此类序列变体，并试验所述变体，以确定一个或多个具有所希望特性的变体，以及
(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)。
14.权利要求13的方法，其中步骤(iii)是通过在任一最初存在的T细胞表位中替换1-9个氨基酸残基而进行的。
15.权利要求13或14的方法，其中步骤(ii)是通过下列步骤实施的：(a)选择具有已知氨基酸残基序列的肽的一个区域；(b)依次从所选区域中采集具预定一致大小的并至少由三个氨基酸残基构成的重叠氨基酸残基片段；(c)对每一所述采集片段计算MHC II类分子结合分值，方法为对所述采集的氨基酸残基片段中的每一疏水氨基酸残基侧链赋值求和；以及(d)基于所计算的片段的MHC II类分子结合分值，鉴定出至少一个适于改变的所述片段，以改变肽的总MHC II类结合分值并且不实质性降低该肽的治疗性用途。
16.权利要求15的方法，其中步骤(c)通过应用改进的
Figure C02805156C0002133417QIETU
评分函数及如下方式实施，其中所述
Figure C02805156C0002133417QIETU
评分函数的改进为在其中包括12-6范德华配体-蛋白质能量排斥项和配体构象能量项，而所述方式为(1)提供MHC II类分子模型第一数据库；(2)针对所述MHC II类分子模型提供所容许的肽主链的第二数据库；(3)从所述第一数据库选择一个模型；(4)从所述第二数据库选择一个容许的肽主链；(5)鉴定在每一采集片段中存在的氨基酸残基侧链；(6)确定每一采集片段中存在的所有侧链的结合亲和性值；以及对每一所述模型和每一所述主链重复步骤(1)至(5)。
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Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100522242C (zh) * 2001-02-19 2009-08-05 默克专利有限公司 具有降低的免疫原性的人工蛋白质
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
ATE446317T1 (de) 2001-05-11 2009-11-15 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Spezifische bindungsproteine und ihre verwendung
CA2472937C (en) 2002-01-11 2014-06-17 Biomarin Pharmaceutical, Inc. Use of p97 as an enzyme delivery system for the delivery of therapeutic lysosomal enzymes
US20040109855A1 (en) * 2002-07-23 2004-06-10 Herman Waldmann Therapeutic antibodies with reduced side effect
CA2501818C (en) * 2002-10-10 2012-03-27 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Pharmaceutical compositions directed to erb-b1 receptors
EP1656391B1 (en) 2003-08-13 2010-10-13 Pfizer Products Inc. Modified human igf-1r antibodies
US8147832B2 (en) * 2003-08-14 2012-04-03 Merck Patent Gmbh CD20-binding polypeptide compositions and methods
JP2009532358A (ja) * 2006-03-31 2009-09-10 マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー 突然変異型ｅｇｆ受容体を発現する腫瘍の治療
JP2010513321A (ja) * 2006-12-22 2010-04-30 ノヴェリクス・セラピューティクス・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 少なくとも一種の上皮細胞増殖因子受容体特異抗体またはその誘導体を用いる糖尿病の治療
US7989173B2 (en) 2006-12-27 2011-08-02 The Johns Hopkins University Detection and diagnosis of inflammatory disorders
EP2124998B8 (en) * 2006-12-27 2015-05-06 The Johns Hopkins University Methods for detecting inflammation and auto-immune diseases
WO2008091701A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Dana-Farber Cancer Institute Use of anti-egfr antibodies in treatment of egfr mutant mediated disease
CN104151430A (zh) * 2007-03-01 2014-11-19 西福根有限公司 重组抗表皮生长因子受体抗体组合物
AU2008227123B2 (en) 2007-03-15 2014-03-27 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Treatment method using EGFR antibodies and src inhibitors and related formulations
US20090010966A1 (en) * 2007-06-21 2009-01-08 Angelica Therapeutics, Inc. Modified diphtheria toxins
ES2609915T3 (es) 2007-08-14 2017-04-25 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Anticuerpo monoclonal 175 direccionado al receptor de EGF y derivados y usos del mismo
CA2697032C (en) 2007-08-22 2021-09-14 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
WO2009110944A1 (en) * 2008-02-29 2009-09-11 Angelica Therapeutics, Inc. Modified toxins
HUE038432T2 (hu) 2008-06-25 2018-10-29 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Nyúl antitestek humanizálása egy univerzális antitest keret alkalmazásával
RU2652907C2 (ru) * 2008-06-25 2018-05-03 ИЭсБиЭйТЕК, ЭН АЛЬКОН БАЙОМЕДИКАЛ РИСЕРЧ ЮНИТ ЭлЭлСи Гуманизация антител кролика с использованием универсального каркаса антитела
RU2567006C2 (ru) * 2008-06-25 2015-10-27 ИЭсБиЭйТЕК, ЭН АЛЬКОН БАЙОМЕДИКАЛ РИСЕРЧ ЮНИТ ЭлЭлСи Гуманизация антител кролика с использованием универсального каркаса антитела
JP5719298B2 (ja) 2008-08-29 2015-05-13 シムフォゲン・アクティーゼルスカブＳｙｍｐｈｏｇｅｎ Ａ／Ｓ 組換え抗上皮増殖因子受容体抗体組成物
CN106995495A (zh) 2009-01-12 2017-08-01 希托马克斯医疗有限责任公司 修饰抗体组合物及其制备和使用方法
BRPI1011384A2 (pt) 2009-02-23 2016-03-15 Cytomx Therapeutics Inc pro-proteinas e seus metodos de uso
AU2010286361A1 (en) 2009-08-31 2012-03-15 Amplimmune, Inc. Methods and compositions for the inhibition of transplant rejection
MX352871B (es) * 2009-12-23 2017-12-13 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Método para disminuir inmunogenicidad.
US8790649B2 (en) 2010-10-29 2014-07-29 Immunogen, Inc. EGFR-binding molecules and immunoconjugates thereof
BR112013010569A2 (pt) 2010-10-29 2017-07-04 Immunogen Inc moléculas de ligação de egfr não antagonísticas e imunoconjugados das mesma
JP6208658B2 (ja) 2011-07-05 2017-10-04 バイオアシス テクノロジーズ インコーポレイテッド ｐ９７−抗体結合体および使用方法
ES2654111T3 (es) 2011-08-05 2018-02-12 Bioasis Technologies Inc. Fragmentos p97 con actividad de transferencia
JP2014533954A (ja) 2011-11-21 2014-12-18 イミュノジェン， インコーポレイテッド Ｅｇｆｒ抗体細胞傷害性薬物複合体による、ｅｇｆｒ療法に耐性である腫瘍の治療方法
WO2014022515A1 (en) 2012-07-31 2014-02-06 Bioasis Technologies, Inc. Dephosphorylated lysosomal storage disease proteins and methods of use thereof
BR112015022416A2 (pt) 2013-03-13 2017-10-24 Bioasis Technologies Inc fragmentos de p97 e seus usos
EP2968450A4 (en) 2013-03-15 2016-10-26 Angelica Therapeutics Inc MODIFIED TOXINS
EP3038657A2 (en) 2013-08-28 2016-07-06 Bioasis Technologies Inc. Cns-targeted conjugates having modified fc regions and methods of use thereof
AU2014318545A1 (en) 2013-09-12 2016-03-24 Halozyme, Inc. Modified anti-epidermal growth factor receptor antibodies and methods of use thereof
BR112016017933A2 (pt) 2014-02-03 2017-10-10 Bioasis Technologies Inc ?proteínas de fusão p97?
US10392605B2 (en) 2014-02-19 2019-08-27 Bioasis Technologies Inc. P97-IDS fusion proteins
JP6847664B2 (ja) 2014-05-01 2021-03-24 バイオアシス テクノロジーズ インコーポレイテッド Ｐ９７−ポリヌクレオチド複合体
EP3659625A1 (en) 2014-10-23 2020-06-03 Innate Pharma Treatment of cancers using anti-nkg2a agents
WO2017161206A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Halozyme, Inc. Conjugates containing conditionally active antibodies or antigen-binding fragments thereof, and methods of use
WO2018218633A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Beijing Percans Oncology Co. Ltd. Combination therapies for treating cancers
US20200339639A1 (en) * 2018-01-11 2020-10-29 Uti Limited Partnership Treatment of fragile x syndrome
WO2019195959A1 (en) 2018-04-08 2019-10-17 Cothera Biosciences, Inc. Combination therapy for cancers with braf mutation
WO2020136145A2 (en) 2018-12-26 2020-07-02 Innate Pharma Leucocyte immunoglobulin-like receptor neutralizing antibodies
WO2021118924A2 (en) 2019-12-12 2021-06-17 Ting Therapeutics Llc Compositions and methods for the prevention and treatment of hearing loss
CA3128035A1 (en) 2020-08-13 2022-02-13 Bioasis Technologies, Inc. Combination therapies for delivery across the blood brain barrier
EP4225792A1 (en) 2020-10-08 2023-08-16 Affimed GmbH Trispecific binders
WO2023007023A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Affimed Gmbh Duplexbodies
EP4426439A1 (en) 2021-11-03 2024-09-11 Affimed GmbH Bispecific cd16a binders

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) * 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
DK0531472T3 (da) * 1991-03-06 2003-12-01 Merck Patent Gmbh Humaniserede monoklonale antistoffer
EP0590058B1 (en) * 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
CU22615A1 (es) * 1994-06-30 2000-02-10 Centro Inmunologia Molecular Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos
JPH11507535A (ja) * 1995-06-07 1999-07-06 イムクローン システムズ インコーポレイテッド 腫瘍の成長を抑制する抗体および抗体フラグメント類
GB2339430A (en) * 1997-05-21 2000-01-26 Biovation Ltd Method for the production of non-immunogenic proteins
WO2000034317A2 (en) * 1998-12-08 2000-06-15 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins

Also Published As

Publication number Publication date
PT1361893E (pt) 2013-01-24
CA2438513A1 (en) 2002-08-29
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US20040096442A1 (en) 2004-05-20
US7132511B2 (en) 2006-11-07
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